Mecanismo Molecular de la Activación de la Síntesis de Fosfolípidos por la

Proto-oncoproteína c-Fos

Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Químicas

Lic. en Química Andrés M. Cardozo Gizzi

Directora de Tesis Dra. Beatriz L. Caputto

Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba

(CIQUIBIC) – CONICET

Depto. De Química Biológica – Facultad de Ciencias Químicas

Universidad Nacional de Córdoba

Córdoba, Junio de 2015

Comisión de Tesis

Dr. Alfredo Cáceres

Dra. Graciela Panzetta

Dr. Marcos Villarreal

Evaluador Externo

Dr. Diego De Mendoza

Agradecimientos

En primer lugar, quisiera agradecer a las Instituciones involucradas: el CONICET, que

me brindó el apoyo económico; la Facultad de Ciencias Químicas, donde me formé como

estudiante de grado y postgrado; la Universidad Nacional de Córdoba, bajo cuyo paraguas

protector nos encontramos y a la Agencia (ANPCyT) por la financiación recibida. En segundo

lugar, al CIQUIBIC (entendido como un todo), por dejarme ser parte de esta gran familia.

Porque en todo momento supe que se podía contar con lo que hiciera falta, que siempre iba

a haber una mano amiga dispuesta a ayudar. Una mención especial merecen los

responsables de la sala de Microscopía; Cecilia, Carlos y Marcelo, que siempre me apoyaron

en lo que requerí. En tercer lugar, a mi comisión de Tesis, por seguirme estos años y

brindarme sus consejos.

A mi directora de Tesis, que confió (y aún lo hace) plenamente en mí, por apoyar cada

proyecto, cada idea, jugándosela cada vez que lo necesité. Por sus consejos y afecto. Porque

para ella no hay imposibles. A mis compañeros de laboratorio, porque nuestra relación

transciende lo laboral, porque me llevo muchos recuerdos, muchos lindos momentos

compartidos. Porque me soportan todos los días, y hacen que mis días malos sean más

soportables también. En especial a Gabriel, que fue quien me formó cuando empecé, porque

es un docente de alma que me tuvo paciencia y sabe mucho pero mucho.

A mi familia, que me hizo la persona que hoy soy. A mi papá y mis hermanos, por

estar siempre. A mi mamá que ya no puede verme. Sé que hubiera estado orgullosa. A mi

familia política por todo su cariño. A mis amigos, por su incondicionalidad, por tantas risas y

algunas lágrimas… y por todas las que vendrán.

Al último pero no la última, a Luli, por su permanente apoyo, amor y por nuestros

proyectos compartidos. Porque es mi asesora principal. Por todo lo que significa para mí.

A todos Uds., eternamente gracias.

“Termina siempre así, con la muerte. Pero antes, hubo vida. Escondido

debajo del bla, bla, bla, bla. Y todo sedimentado bajo los murmullos y el

ruido. El silencio y el sentimiento, la emoción y el miedo. Los demacrados,

caprichosos destellos de belleza. […] Más allá, está el más allá. Yo no me

ocupo del más allá. Por tanto, que esta novela dé comienzo. En el fondo, es

sólo un truco. Sí, es sólo un truco.”

Jep Gambardella – La grande bellezza

A la memoria de mi madre.

Contenido

ABREVIATURAS UTILIZADAS

RESUMEN

INTRODUCCIÓN 1

Membranas biológicas 2

Vías de síntesis de fosfolípidos 3

Lipinas 5

CDS – Vía del CDP-DAG 7

PIS 8

Biosíntesis de PIPs 9

PI4Ks tipo II 11

PI4Ks tipo III 12

c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 con una función no genómica adicional 13

c-Fos como activador de la síntesis lipídica 14

Regulación de la función de c-Fos como activador de la síntesis de fosfolípidos 16

c-Fos en el crecimiento tumoral 16

c-Fos y un estado activado de la síntesis de lípidos 17

OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO 18

RESULTADOS 21

Efecto de c-Fos en la síntesis de PIPs in vivo 22

Las actividades CDS y PIK pero no la de PIS son activadas por c-Fos 22

Las actividades de CDS1 y PI4KIIα son claves para la activación del marcado

radioactivo de PtdInsP y PtdInsP2 promovido por FBS, no así la de PI4KIIβ 29

CDS1 y PI4KIIα pero no PI4KIIβ participan en una asociación física con c-Fos 32

El domino BD sería el responsable de la activación de la síntesis de PIPs 35

La región N-terminal es la responsable de la asociación con CDS1 37

La región N-terminal es capaz de competir con c-Fos salvaje por su unión a la enzima

PI4KIIα 39

Activación de la actividad PAP por c-Fos 45

El BD de c-Fos sería el responsable de la actividad incrementada de Lipin 1 48

Fra-1, miembro de la familia Fos, a diferencia de c-Jun es capaz de activar a Lipin 1 49

Lipin 1 interacciona físicamente con c-Fos y Fra-1 pero no con c-Jun 50

c-Fos modifica la actividad de Lipin 1 al incrementar su capacidad catalítica 53

El dominio N-terminal de c-Fos es responsable de la asociación a Lipin 1 56

La región aa: 47-90 dentro del N-terminal de c-Fos estaría involucrado en la

asociación Lipin 1/c-Fos 58

DISCUSIÓN 60

La activación de la síntesis de fosfolípidos por c-Fos es un fenómeno no genómico 61

c-Fos es capaz de activar tanto a CDS1 como a Lipin 1 62

¿Para qué son necesarios los lípidos cuya síntesis c-Fos incrementa? 65

Un mecanismo compartido para la activación de la síntesis 67

La naturaleza intrínsecamente desestructurada de c-Fos y su asociación a múltiples

enzimas blanco 69

Fra-1 también incrementa la síntesis de lípidos 75

Conclusiones finales 77

MATERIALES Y MÉTODOS 78

BIBLIOGRAFÍA 93

ABREVIATURAS UTILIZADAS

aa: Aminoácidos

AP-1: Proteína Activadora-1

ASO: Oligonucleótido Anti-Sentido específico para c-Fos

BD: Dominio Básico de proteínas tipo AP-1

bZip: Dominio funcional de proteínas tipo AP-1 que comprende a BD y LZ

CDS: CDP-Diacilglicerol Sintasa

CDP-DAG: Citidina Difosfato – Diacilglicerol

CFP: Proteína Fluorescente Cyan

DAG: Diacilglicerol

DGK: Diacilglicerol Quinasa

FBS: Suero Fetal Bovino

FLIM: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

FRET: Transferencia de Energía Resonante de Förster

G3P: Glicerol-3-Fosfato

GlcCerS: Glucosilceramida Sintasa

IDPs: Proteínas Intrínsecamente Desestructuradas

IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

LZ: Dominio cierre de leucinas de proteínas tipo AP-1

NGF: Factor de Crecimiento Nervioso

PA: Ácido Fosfatídico

PAP: Fosfatasas de Ácido Fosfatídico

PBD: Dominio Polibásico de Lipin 1

PI4K: Fosfatidilinositol-4-quinasa

PIPs: Polifosfoinosítidos

PIS: Fosfatidilinositol Sintasa

PtdCho: Fosfatidilcolina

PtdEth: Fosfatidiletanolamina

PtdIns: Fosfatidilinositol

PtdInsP2: Fosfatidilinositol bifosfato

PtdSer: Fosfatidilserina

RE: Retículo Endoplásmico

TAG: Triacilglicerol

YFP: Proteína Fluorescente Amarilla

RESUMEN

La proto-oncoproteína c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 cuya función fue

descripta hace más de 25 años (Curran & Morgan 1987). En su función canónica, c-Fos forma

heterodímeros funcionales con proteínas de las familias Jun, ATF o JDP, que se unen a

regiones específicas del ADN y promueven la transcripción de múltiples genes blanco (Hess et

al. 2004). Esta actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de

crecimiento de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes

involucrados en el crecimiento celular. Evidencias previas del laboratorio han demostrado

que la proteína c-Fos, de manera independiente de su actividad como factor de transcripción

tipo AP-1, activa la síntesis de fosfolípidos al asociarse al retículo endoplásmico (Caputto et

al. 2014). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar la actividad no genómica de c-Fos

por la es capaz de activar la síntesis de lípidos, y en particular el mecanismo molecular por el

cual c-Fos ejerce este efecto.

Encontramos que para alcanzar el incremento en el marcado radioactivo de todas las

especies de fosfolípidos analizadas, c-Fos afecta positivamente solo etapas metabólicas

específicas. Utilizando homogeneizados de células NIH3T3 quiescentes, encontramos que c-

Fos recombinante activa in vitro la actividad de CDP-diacilglicerol sintasa, Lipin 1 y

fosfatidilinositol 4-quinasa tipo II pero no fosfatidilinositol sintasa. La constante cinética

Vmax se incrementó para todas las enzimas analizadas mientras que no se observó ningún

efecto en Km, una medida de la afinidad de la enzima por su sustrato.

Más aún, hemos probado la activación in vitro en un sistema purificado que contiene

sólo a c-Fos, Lipin 1 y membranas modelo compuestas de micelas mixtas de Triton X-100/PA.

En este sistema altamente simplificado, encontramos que c-Fos incrementa la actividad

enzimática de Lipin1 sin modificar la afinidad de esta por las membranas modelo.

En orden de explicar el mecanismo de activación enzimática, realizamos ensayos de

interacción proteína-proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y de

microscopía FRET establecimos una interacción física entre c-Fos y las enzimas que activa

mientras que esta no se produce con aquellas enzimas cuya actividad c-Fos no regula.

El empleo de mutantes de deleción permitió determinar que la región involucrada en

la activación enzimática es diferente de la región responsable de la unión a enzimas

específicas, y que estas regiones de asociación/activación son comunes a todas las enzimas

estudiadas. Mientras que la región de activación es el dominio básico de c-Fos, la región de

asociación se encuentra en el N-terminal de la proteína.

Los resultados apoyan nuestra hipótesis de un mecanismo compartido en la

activación de la síntesis de fosfolípidos en el que c-Fos se asocia físicamente con las enzimas

responsables de la síntesis de fosfolípidos que es capaz de activar modificando su eficiencia

catalítica sin alterar la afinidad de la enzima blanco por su sustrato. A su vez, refuerzan el

concepto de una proteína que posee dos funciones diferenciales como lo son la de su

actividad como factor de transcripción y la capacidad de incrementar actividades enzimáticas

claves per se, para de esta forma sostener eventos de proliferación o diferenciación celular.

CAPITULO I

INTRODUCCIÓN

Introducción

2

Membranas biológicas

Las membranas de células eucariotas son una compleja mezcla de glicerolípidos,

esfingolípidos, proteínas y colesterol (Singer & Nicolson 1972) cuya síntesis requiere la

actividad sincronizada de múltiples pasos metabólicos que son coordinados en varios niveles.

Los lípidos son las especies moleculares cuantitativamente más importantes de las

membranas celulares (Spector & Yorek 1985). Entre la vasta diversidad de lípidos existentes,

los más abundantes son los glicerofosfolípidos [fosfatidilcolina (PtdCho),

fosfatidiletanolamina (PtdCho), fosfatidilinositol (PtdIns), fosfatidilserina (PtdSer) y

cardiolipina] (van Meer et al. 2008). La estructura de todos ellos deriva del glicerol-3-fosfato

(G3P), que se esterifica en las posiciones sn-1 y sn-2 con dos ácidos grasos, para dar ácido

fosfatídico (PA), y en el grupo fosforilo con alcoholes de bajo peso molecular como colina o

etanolamina (Fig. 1). Aunque los glicerofosfolípidos son clasificados de acuerdo a la

estructura de su cabeza polar (por ejemplo colina o inositol), cada clase de fosfolípido en

realidad consiste en numerosas especies moleculares que contienen la misma cabeza polar

pero se diferencian por las cadenas de los ácidos grasos que cada uno contiene (Wenk 2005).

En consecuencia, las membranas celulares son formadas por cientos de moléculas de

glicerofosfolípidos diferentes. Para alcanzar esta complejidad, las células eucariotas

necesitan invertir importantes recursos: aproximadamente 5% de sus genes están

involucrados en la síntesis de lípidos (Sud et al. 2007). La mayoría de los glicerofosfolípidos

están presentes en todas las membranas celulares, pero la abundancia relativa varía

significativamente de una organela a la otra. La síntesis de lípidos estructurales está limitada

espacialmente, por lo que el metabolismo lipídico local es el primer determinante de la

composición única de las distintas organelas (van Meer et al. 2008).

La biogénesis de membrana es un proceso complejo, fundamental para el

crecimiento, la proliferación y la diferenciación celular. Estos procesos acoplan señales de

crecimiento ambientales con respuestas nucleares para generar cambios funcionales y

morfológicos en la célula (Hermansson et al. 2011), que en conjunto necesitan de lípidos para

la expansión de membrana. Los lípidos requeridos son provistos por el sistema de

Introducción

3

endomembranas; en particular el retículo endoplásmico (RE), el principal sitio de síntesis de

la mayoría de los fosfolípidos, y el complejo de Golgi (Fagone & Jackowski 2009).

Fosfolípidos, junto con colesterol y proteínas integrales de membrana son

sintetizados en el RE e incorporados a membrana pre-existente. Membranas nacientes

surgen desde los sitios de salida del RE y se mueven por transporte vesicular hacia la

membrana plasmática pasando a través del complejo de Golgi, donde ocurren una serie de

modificaciones post-traduccionales en la carga y las proteínas asociadas a membrana. La

composición lipídica también es ajustada en el complejo de Golgi, especializado en la síntesis

de esfingomielina, glucosilceramida y glicoesfingolípidos complejos (Futerman & Riezman

2005). Adicionalmente, el transporte no vesicular tiene un rol relevante en la distribución y

tráfico intracelular lipídico. Los intercambios de monómeros lipídicos, tanto espontáneos

(lentos) como mediados por proteínas que transfieren lípidos (mucho más rápidos), son

incrementados enormemente por sitios de contacto directo con membranas, definidos como

pequeñas intersecciones entre el RE y prácticamente todas las otras organelas celulares (Lev

2010). La biogénesis de membrana es también sostenida con la inactivación de ciertas

fosfolipasas frente a determinados estímulos, volviendo más lento el recambio permanente

de un abundante rango de fosfolípidos (Manguikian & Barbour 2004, Bao et al. 2006).

Vías de síntesis de fosfolípidos

Los glicerofosfolípidos constituyen las unidades estructurales mayoritarias de las

membranas biológicas. Serán el principal objeto de estudio de esta Tesis, por lo que nos

centraremos en la descripción de sus vías de síntesis (Fig. 1). El PA es un precursor central

para la biogénesis de membrana (Brindley 1984, Carman & Han 2009). Como puede

observarse en la Fig. 1, el PA se encuentra en un punto único de ramificación: puede ser

transformado por una fosfatasa a diacilglicerol (DAG), un precursor común a toda la vía de

Kennedy, o alternativamente puede ser derivado a la vía de síntesis del fosfatidilinositol y sus

derivados fosforilados por la enzima limitante de la vía, CDP-diacilglicerol sintasa (CDS)

(Athenstaedt & Daum 1999).

Introducción

4

Figura 1. Vías de síntesis de fosfolípidos en células de mamífero. G3P, glicerol-3-fosfato; 1-acil-3-G-P, 1-acilglicerol-3-fosfato; PA, ácido fosfatídico; DAG, diacilglicerol; TAG, triacilglicerol; CDP-DAG, citidina difosfato diacilglicerol; PtdIns, fosfatidilinositol; PIPs, polifosfoinosítidos; PG, fosfatidilglicerol; CL, cardiolipina; PtdEth, fosfatiletanolamina; PtdSer, fosfatidilserina; PtdCho, fosfatidilcolina; P-Etanolamina, fosfoetanolamina; CDP-Etanolamina, citidina difosfato etanolamina; P-Colina, fosfocolina; CDP-Colina, citidina difosfato colina. R representa una cadena acilo de 14-24 carbonos de longitud, con 0-6 dobles enlaces. Metabolitos claves se encuentran en color rojo. Las enzimas que catalizan cada uno de los pasos metabólicos son: GPAT, glicero fosfato aciltransferasa; AGPAT, acilglicerolfosfato aciltransferasa; PAP, fosfatasa de ácido fosfatídico; CDS, CDP-diacilglicerol sintasa; PIS, fosfatidilinositol sintasa; CLS, cardiolipina sintasa; EPT, CDP-etanolamina: diacilglicerol etanolaminafosfotransferasa; CPT, CDP-colina: diacilglicerol fosfotransferasa; EK, etanolamina quinasa; ET, CTP: fosfoetanolamina citidiltransferasa; CK, colina quinasa; CCT, CTP: fosfocolina citidiltransferasa; PEMT, fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa; PSD, fosfatidilserina decarboxilasa; PSS, fosfatidilserina sintasa. Adaptado de Cardozo Gizzi & Caputto 2013.

Introducción

5

En comparación con sus precursores y sus metabolitos, los niveles de PA son bajos en

células en crecimiento a pesar del considerable flujo metabólico a través de PA requerido

para sostener la síntesis de fosfolípidos. Además de su rol biosintético, tanto PA como DAG

son también importantes en cascadas de transducción de señales (Stace & Ktistakis 2006). El

PA se encuentra implicado en regulación de la transcripción, activación del crecimiento

celular, biogénesis de membrana, secreción extracelular y transporte vesicular mientras que

el DAG se encuentra principalmente involucrado en la activación de proteína quinasa C (PKC),

aunque también se ha descripto la activación de otras quinasas también importantes en

señalización celular como por ejemplo proteína quinasa D o quinasas de DAG β and γ (Brose

et al. 2004, Wang et al. 2006, Carrasco & Merida 2007).

Inicialmente se caracterizaron bioquímicamente dos grupos distintos de fosfatasas de

PA (PAP), PAP-1 y PAP-2. Estas últimas se denominaron posteriormente LPP (lipid phosphate

phosphases o fosfatasas del fosfato de lípidos) debido a que no son específicas para PA. Su

actividad es independiente de Mg+2 y sus principales funciones están relacionadas a la

transducción de señalas a nivel de la membrana plasmática (Pascual & Carman 2013). En

cambio, las enzimas con actividad PAP-1 fueron clonadas y denominadas Lipinas.

Lipinas

Las Lipinas son enzimas PAP dependientes de Mg+2, que están involucradas en la

síntesis de novo de fosfolípidos y lípidos neutros (Harris & Finck 2011). A diferencia de la

mayoría de las enzimas de la vía de Kennedy, las Lipinas no son proteínas integrales de

membrana sino que se unen a membrana de forma periférica, por lo que necesitan

translocar desde el citosol hacia el RE para participar en la síntesis de glicerolípidos (Coleman

& Lee 2004, Csaki & Reue 2010).

El dominio polibásico de Lipin 1 (PBD) es un segmento compuesto por nueve residuos

básicos consecutivos que está involucrado en la unión selectiva a PA, lo que promueve la

translocación de la enzima a membranas. El dominio PBD de Lipin 1 es también su principal

señal de localización nuclear. Ha sido propuesto que el rol dual de PBD es regulado a partir

de los niveles de PA: un contenido elevado de PA en las membranas citoplásmicas antagoniza

Introducción

6

la localización nuclear de Lipin 1 (Ren et al. 2010). Existen evidencias de que la Lipinas dentro

del núcleo juegan un rol en la regulación directa de directa de la transcripción de genes

involucrados en la oxidación de ácidos grasos (Harris & Finck 2011). Por ejemplo, se ha

demostrado que Lipin 1 interacciona directamente con el receptor PPARα, un factor de

transcripción clave para el metabolismo de lípidos en el hígado, y con su co-activador PGC-1α

(Finck et al. 2006). Debido a que Lipin 1 no poseen una secuencia de unión a ADN

reconocible, la evidencia indica que Lipin 1 incrementaría la actividad de estos complejos de

factores de transcripción al reclutar otras proteínas co-activadoras con la habilidad de

modificar enzimáticamente la cromatina (Siniossoglou 2013).

En los últimos años las Lipinas han sido intensamente estudiadas dado su rol clave en

la síntesis de fosfolípidos (Pascual & Carman 2013). Su actividad se encuentra sujeta a

estrictos mecanismos de regulación, dados principalmente por múltiples fosforilaciones.

Estas son mediadas por varias quinasas, por ejemplo quinasas dependientes de ciclinas

(Grimsey et al. 2008) y mTOR (Huffman et al. 2002, Harris et al. 2007), que inducen su

disociación de la membrana. La fosforilación de las Lipinas altera su localización subcelular y

las proteínas con las que interactúa, cambiando indirectamente la actividad PAP al impedir

que se encuentre con el sustrato y/o directamente al disminuir el reconocimiento o la

afinidad por el sustrato (Harris & Finck 2011, Eaton et al. 2013). El reconocimiento por el

dominio PBD del PA di-aniónico promueve la asociación a membrana, mientras que la

fosforilación mediada por mTOR inhibe dicho reconocimiento (Eaton et al. 2013). La Lipin 1

hiper-fosforilada se asocia a las proteínas citosólicas 14-3-3 lo que facilita su retención en el

citosol (Peterfy et al. 2010). Por otro lado, el complejo transmembrana CTDNEP1-NEP1R1

(que es el ortólogo del Nem1p–Spo7p de levaduras) es capaz de defosforilar a Lipin y

consecuentemente actúa en la vía de activación de Lipin. Sin embargo, aún no está

esclarecido si para ser desfosforilada por el complejo CTDNEP1-NEP1R1, la Lipin que se

encuentra citosólica debe llegar a la región perinuclear (donde reside el complejo) o si Lipin 1

puede ser también defosforilada en el citosol por fosfatasas desconocidas (Han et al. 2012).

En conclusión, Lipin 1 es capaz de regular la síntesis de lípidos en múltiples niveles. Al

regular el destino de PA a través de su actividad PAP, puede controlar directamente la

Introducción

7

síntesis de fosfolípidos, mientras que puede hacerlo indirectamente al modular la actividad

de factores de transcripción relevantes para el metabolismo de lípidos. Ambas actividades

poseen claras separaciones espaciales: mientras que la actividad PAP de las Lipinas se ejerce

en las membranas nucleares/reticulares, la actividad como activador co-transcripcional

ocurre dentro del núcleo.

CDS – Vía del CDP-DAG

Como se mencionó anteriormente, el PA puede ser sustrato de la familia de Lipinas

que lo convierten en DAG o, en cambio, ser sustrato de la enzima CDP-DAG sintasa (CDS)

que cataliza la conversión PA a CDP-DAG (Heacock & Agranoff 1997). El CDP-DAG es el

precursor de PtdIns y sus derivados fosforilados, además de fosfatidilglicerol o cardiolipina.

La biosíntesis y metabolismo de PtdIns es de considerable interés debido a la participación de

este lípido y sus derivados fosforilados en la traducción de señales (Di Paolo & De Camilli

2006). Esta enzima tiene un rol clave entonces en la síntesis de fosfolípidos en general y en la

de polifosfoinosítidos (PIPs) en particular. La enzima es integral de membrana y es la

limitante de la vía (Heacock & Agranoff 1997). Recientemente se cristalizó el homólogo de

CDS del organismo procariota Thermotoga maritima (Liu et al. 2014).

Dos isoformas han sido identificadas en mamíferos, CDS1 y CDS2, las cuales han sido

descriptas localizando en el RE (Saito et al. 1997, Volta et al. 1999, Inglis-Broadgate et al.

2005). El ARNm de CDS2 muestra un patrón de expresión ubicua en ratón, en tanto el ARNm

de CDS1 se ha encontrado en cerebro, ojo, músculo liso, riñón y testículo. En ojo, CDS1 está

altamente expresada en la capa de fotorreceptores de retinas de adulto, lo que sugiere un rol

de CDS1 en la fototransducción de señales a través de la formación de PIP2 en mamíferos

(Inglis-Broadgate et al. 2005). Este rol fue también probado en invertebrados: en la

fototransducción en Drosophila se requiere de la enzima CDS para la regeneración de

PtdInsP2; los animales mutantes para esta enzima sufren una degeneración retinal mediada

por luz (Volta et al. 1999). En otro reporte, la mutación de CDS2 en pez cebra produce

defectos específicos en angiogénesis y en la formación de vasos sanguíneos, que fueron

atribuidos a la depleción de los niveles de PtdIns(4,5)P2 en células endoteliales estimuladas

por el factor de crecimiento VEGF. En estos estudios se concluyó que la actividad de la

Introducción

8

enzima CDS era necesaria para mantener una reserva de PtdIns(4,5)P2 para señalización

celular (Pan et al. 2012).

Ambas isoformas de CDS son inhibidas tanto por PtdInsP como por PtdInsP2, en un

mecanismo clásico de inhibición por un producto final de la vía (Saito et al. 1997, D'Souza et

al. 2014). Más allá de estos reportes, no hay otras pruebas de mecanismos regulatorios

endógenos para esta enzima. Existe un estudio que mostró cómo drogas antidepresivas

inducen la actividad de CDS, incrementando así la disponibilidad de CDP-DAG y facilitando la

síntesis de PtdIns (Aboukhatwa & Undieh 2010), y que postuló entonces la importancia de

esta enzima en cascadas de señalización mediadas por este lípido y sus derivados fosforilados

en células neurales en humanos.

PIS

La segunda enzima de la vía de síntesis de PIPs se denomina CDP-diacilglicerol:myo-

inositol 3-fosfatidil-transferasa o fosfatidilinositol sintasa (PIS). Cataliza la condensación de

una molécula de myo-inositol y una de CDP-DAG para formar PtdIns. Un único gen que

codifica para esta enzima fue clonado y caracterizado en mamíferos (Tanaka et al. 1996,

Lykidis et al. 1997). PIS es una proteína de 213 aminoácidos (aa) que se expresa

uniformemente en todos los tejidos humanos analizados. Estos estudios confirmaron además

que PIS es responsable tanto de la actividad de síntesis de PtdIns como así también de la de

recambio de myo-inositol en una molécula de PtdIns ya formada (Lykidis et al. 1997).

Estudios en pez cebra con una mutante para este gen indican que la falta de síntesis

de novo de PtdIns genera estrés crónico del RE lo que conduce por ejemplo a esteatosis

hepática (Thakur et al. 2011) y a daño e inflamación de la mucosa intestinal (Thakur et al.

2014). A su vez, esta mutante posee defectos estructurales del cristalino ocular y un reducido

número de fotorreceptores (Murphy et al. 2011).

Un trabajo reciente mostró que PIS se localiza no solo en el RE, donde co-localiza con

CDS1 y CDS2, sino también en un compartimento vesicular altamente móvil en donde estas

últimas enzimas quedan excluidas. Estas vesículas emergen desde la red membranosa del RE

en forma dependiente de la GTPasa pequeña Sar1 y es donde se concentra la mayor

Introducción

9

actividad PIS. Es importante remarcar que estas vesículas que contienen PIS no son

simplemente vesículas de transporte que se dirigen al aparato de Golgi, ya que no se

observa fusión de las mismas con esta organela. En cambio, se postula que este

compartimento hace contactos con una gran cantidad de membranas permitiendo así el

intercambio directo de lípidos (Kim et al. 2011). En un estudio posterior de otro grupo se

confirmó la existencia de estas estructuras altamente móviles que contienen PIS pero

también CEPT (la última enzima en la vía de síntesis de PtdCho) y dependen de otra GTPasa

pequeña llamada Rab10 para formar este compartimiento que es o bien un extremo que

crece o que ha emergido desde el RE (English & Voeltz 2013).

Biosíntesis de PIPs

Los PIPs son molecularmente diversos debido a la fosforilación variable de sus grupos

hidroxilo del anillo inositol (Fig. 2). La configuración de las siete especies de PIPs conocidos es

controlada rápida y reversiblemente por una batería de quinasas y fosfatasas que

interconvierten PIPs y que debido a ello resultan críticas para la localización y función de

cada uno de los distintos isómeros (Sasaki et al. 2009). Asimismo, se han identificado un gran

número de módulos de proteínas capaces de reconocer a isómeros específicos de PIPs (Czech

2003, Wenk & De Camilli 2004). Esto ha definido un paradigma en la regulación mediada por

PIPs en donde los mismos controlan una variedad de fenómenos de señalización y tráfico

celular al reclutar proteínas reguladoras hacia complejos de señalización ubicados en

membranas celulares (Balla & Balla 2006). De esta forma, los PIPs están involucrados en el

transporte vesicular, secreción y endocitosis (Balla et al. 2009), la organización de

citoesqueleto (Janmey 1994, Gilmore & Burridge 1996) y la estimulación de las cascadas de

proteína quinasas (Noh et al. 1995, Franke et al. 1997, Downward 2004). Las distintas clases

de PIPs son además importantes para definir la identidad de las organelas (van Meer et al.

2008).

Introducción

10

PI4Ks

Las fosfatidilinositol-4-quinasas (PI4Ks) fosforilan al anillo de inositol en la posición D4

para producir PtdIns4P. A la fecha, en base a la estructura de sus dominios y la sensibilidad a

inhibidores, se han identificado cuatro PI4K en mamíferos que se clasifican como tipo II:

PI4IIα y PI4IIβ; y tipo III: PI4IIIα y PI4IIIβ (Balla & Balla 2006). Las PI4K tipo III tienen un

dominio quinasa C-terminal similar a PI3Ks y son sensibles a los mismos inhibidores como por

ejemplo wortmanina (Balla 1998). Por otro lado, la región catalítica de las PI4K tipo II se

diferencian sustancialmente de las otras, son insensibles a wortmanina pero en cambio son

sensibles a adenosina. Cada isoenzima localiza en un compartimiento celular específico en un

tejido específico, sugiriendo que cada una de ellas produce PtdIns4P requerido en una

función celular diferente.

Figura 2. Estructura y formación de PIPs. El fosfatidilinositol está formado por un esqueleto de glicerol (recuadro azul), dos cadenas acilo en las posiciones sn1 y sn2 (recuadros en rojo) y una molécula de myo-inositol (recuadro verde). Los grupos hidroxilo pueden ser fosforilados en las posiciones 3,4 y 5, lo que permite la formación de hasta siete especies distintas de PIPs. La producción de cada una de estas especies depende de las acciones muy reguladas de las quinasas y fosfatasas de estos lípidos. Las distintas especies pueden ser interconvertidas según se indica con las flechas. Adaptado de D'Souza & Epand 2014.

Introducción

11

PI4Ks tipo II

Se discutirán las características de ambas isoformas, α y β, en forma conjunta. Tanto

PI4KII α como β se encuentran fuertemente unidas a membranas, debido a la palmitoilación

de un segmento conservado de cisteínas que se encuentra dentro del dominio catalítico. A

pesar de tener una secuencia de palmitoilación muy similar, una fracción más importante de

PI4KIIβ respecto de PI4KIIα no se encuentra palmitoilada y consecuentemente se encuentra

en el citoplasma (Jung et al. 2008). PI4KIIβ es más soluble y menos activa que PI4KIIα, pero

puede asimismo ser movilizada y activada al haber un estímulo como por ejemplo el del

factor de crecimiento PDGF (Wei et al. 2002).

Tanto PI4KIIα como PI4KIIβ se expresan en forma ubicua en tejidos humanos.

Northern blot de tejidos humanos han mostrado que el contenido de ARNm de PI4KIIβ es

mayor en hígado mientras que para PI4KIIα es mayor en el cerebro (Minogue et al. 2001,

Balla et al. 2002). A nivel subcelular, análisis inmunoquímicos y de fraccionamiento

subcelular han mostrado que PI4KIIα en su forma palmitoilada se ubica en las membranas del

RE, trans-Golgi y endosomas (Wang et al. 2003, Waugh et al. 2003).

PI4KIIα y PI4KIIβ son proteínas de un peso molecular cercano a 55 kDa. La

comparación de secuencias entre las dos isoformas revela un alto grado de similitud en el

dominio catalítico C-terminal con una homología significativamente menor en la región N-

terminal, que comprende los primeros 100 residuos aminoacídicos. PI4KIIα en el N-terminal

posee una región rica en prolinas, mientras que PI4KIIβ no la tiene y en cambio muestra una

región acídica. El N-terminal de PI4KIIα es necesario para enviarla hacia membranas

específicas, incluyendo vesículas positivas para GLUT4 (Xu et al. 2006). Aún no está

esclarecido el rol del N-terminal de PI4KIIβ, si bien se estableció que sufre en esta región una

fosforilación, esta no influye en su asociación a membranas o actividad. Más aún, los últimos

160 aa en el C-terminal parecen ser los determinantes en la diferencia de solubilidades,

estado de palmitoilación o redistribución dependiente de estímulo (Jung et al. 2008). En

cambio, se ha sugerido que la región N-terminal divergente media interacciones proteína-

proteína específicas.

Introducción

12

Respecto de las funciones biológicas atribuidas a estas enzimas, ha sido descripto

que PI4KIIα es necesaria para la producción de PtdIns4P en el aparato de Golgi y la red trans-

Golgi y que esto regula el reclutamiento a membranas de adaptadores de clatrina como por

ejemplo los complejos proteicos adaptadores tipo I (Wang et al. 2003, Wang et al. 2007) y

tipo III (Craige et al. 2008). Otro estudio demostró que la mayor parte de la actividad PI4K en

el cerebro proviene de PI4KIIα, donde además se la encontró asociada a vesículas sinápticas y

se la relacionó con la neurotransmisión (Guo et al. 2003). En cambio, PI4KIIβ podría estar

asociada a señalización intracelular, ya que se la encontró asociada in vivo al complejo de

membrana TCR-CD3 (Srivastava et al. 2006).

PI4Ks tipo III

Existen dos tipos de quinasas tipo III: PI4KIIIα (~230 kDa) y PI4KIIIβ (~92 kDa)

(Nakagawa et al. 1996, Nakagawa et al. 1996). Ambas contienen un dominio quinasa C-

terminal similar al de las PI3Ks, y ambas son sensibles a wortmanina.

La enzima PI4KIIIα es la principal responsable de la generación del PtdIns4P de

membrana plasmática (Balla et al. 2005, Balla et al. 2008), a pesar de que su localización

inicialmente había sido descripta en la interface RE/Golgi (Nakagawa et al. 1996). A diferencia

de la isoforma β, que se expresa en forma ubicua, la isoforma α se encuentra expresada

principalmente en cerebro, aunque se detectaron niveles bajos en varios otros órganos

(Zolyomi et al. 2000).

La información disponible al presente permite inferir que PI4KIIIβ regula, mediante la

formación de PtdIns4P, el tráfico desde Golgi hacia membrana plasmática (Bruns et al. 2002,

Godi et al. 2004). Esta enzima se localiza principalmente en el Golgi (Godi et al. 1999),

aunque también se ha descripto que transloca desde el citosol al núcleo, si bien se desconoce

la función precisa que allí ejerce (de Graaf et al. 2002).

Introducción

13

c-Fos es un factor de transcripción tipo AP-1 con una función no genómica adicional

Células que se encuentran en un proceso activo de proliferación o en eventos de

expansión de la membrana demandan la biogénesis de membrana en forma masiva, por lo

que es razonable esperar que la homeostasis de las organelas sea diferente de aquellas

células que no se están dividiendo o creciendo activamente. Sin embargo, la naturaleza de

los eventos que regulan estos procesos todavía es pobremente entendida. Desde un punto

de vista simplista los mecanismos que regulan la síntesis lipídica pueden ser divididos en dos:

una al nivel de la transcripción y la traducción de las enzimas involucradas (regulación génica)

y otra al nivel post-transcripcional (regulación no-genómica). En mamíferos, la familia de

factores de transcripción SREBPs, actúa a nivel central controlando la expresión de

receptores de lipoproteínas de baja densidad junto con los genes para la síntesis de novo de

colesterol y ácidos grasos (Nohturfft & Zhang 2009).

En cambio, diversos mecanismos no-genómicos existen y aparecen como respuestas

rápidas frente a cambios en la necesidad de síntesis de fosfolípidos (Cardozo Gizzi & Caputto

2013). Dentro de estas respuestas no genómicas a la demanda de síntesis de lípidos, nos

concentraremos en aquellas producidas por la proteína de interés central para esta tesis: c-

Fos. Esta proteína fue descripta como un miembro de la familia de factores de transcripción

inducibles denominado Proteína Activadora 1 (AP-1) hace más de 25 años (Curran & Morgan

1987). El contenido celular de c-Fos se encuentra estrictamente regulado: mientras que en

células quiescentes se encuentra al límite de detección, su expresión es rápida y

transitoriamente inducido frente a diversos estímulos como por ejemplo factores de

crecimiento, estimulación sensorial o liberación de neurotransmisores (Kovary & Bravo 1992,

Ginty et al. 1994, Hughes & Dragunow 1995, Caputto & Guido 2000, Maggiolini et al. 2004) .

Un trabajo pionero de Hunt y colaboradores mostró como después de la estimulación

sensorial se inducía rápidamente la expresión de c-Fos en neuronas espinales de rata (Hunt

et al. 1987). A partir de allí, múltiples estudios publicados proveyeron evidencia de que

condiciones tanto fisiológicas como patológicas son capaces de inducir la expresión de c-Fos

y otros miembros de su familia de factores de transcripción en el sistema nervioso central

junto con otros tipos celulares.

Introducción

14

AP-1 es un factor de transcripción homo- o heterodimérico compuesto por proteínas

que pertenecen a la familias de Fos, Jun, ATF o JDP (Shaulian & Karin 2001). Todos los

miembros AP-1 poseen un dominio bZip, que consiste en un dominio básico (BD) adyacente a

un motivo de cierre de leucinas. El BD está implicado en la unión secuencia-específica del AP-

1 al ADN mientras que los residuos conservados de leucinas permiten la dimerización y

consecuentemente la formación de los dímeros AP-1 transcripcionalmente activos (Neuberg

et al. 1989). Mientras que la familia Jun existe como homo o heterodímeros, la familia Fos,

que no puede homodimerizar, forma heterodímeros estables principalmente con las

proteínas Jun. (Hess et al. 2004). Debido a que la dimerización es un pre-requisito para la

unión al ADN, c-Fos no se asocia al ADN por sí mismo (Halazonetis et al. 1988).

La actividad AP-1 ha sido involucrada en la transformación de señales de crecimiento

de corta duración en cambios de larga duración al regular la expresión de genes blanco

involucrados en el crecimiento celular como por ejemplo colagenasa (Angel et al. 1987),

metaloproteasa-3 (Kerr et al. 1990), metalotioneina IIA (Lee et al. 1987) o de genes críticos

para la re-entrada al ciclo celular como ciclina D1 (Brown et al. 1998). Cuando el

correspondiente estimulo cesa, c-Fos se degrada rápidamente, con una vida media que va

desde el minuto a la hora, dependiendo del tipo celular (Basbous et al. 2008, Adler et al.

2010).

c-Fos como activador de la síntesis lipídica

c-Fos ejerce un rol relevante en la regulación del crecimiento, diferenciación así como

también en procesos de transformación celular (Curran & Franza 1988, Cohen & Curran

1989). Estudios de nuestro laboratorio han establecido que c-Fos tiene dos funciones que lo

sitúan como capaz de regular el crecimiento celular no solo con su actividad como factor de

transcripción sino también al actuar como un activador de la biosíntesis de lípidos en

procesos celulares tanto normales como patológicos que demandan altas tasas de biogénesis

de membrana. La activación de la síntesis de lípidos ha sido observada en diferentes tipos

celulares: in vivo en células ganglionares retinales y fotorreceptoras estimuladas por luz

(Guido et al. 1996, Bussolino et al. 1998), en fibroblastos que se encuentran proliferando

Introducción

15

(Bussolino et al. 2001), en células PC12 inducidas a diferenciar (Gil et al. 2004, Crespo et al.

2008), en tumores del sistema nervioso central y periférico (Silvestre et al. 2010, Gil et al.

2012) y en tumores mamarios humanos malignos (Motrich et al. 2013).

En la retina, se observó que ante la estimulación lumínica de pollos se produce un

incremento tanto en expresión de c-Fos como en la síntesis de lípidos en células ganglionares

de la retina (Guido et al. 1996, Bussolino et al. 1998). Al bloquear específicamente la

expresión de c-Fos se bloquean las modificaciones inducidas por luz en la síntesis de

fosfolípidos. Debido a que la liberación de neurotransmisores ocurre en luz en células

ganglionares, se interpretó que el pico en la expresión de c-Fos responde a la necesidad de la

célula de incrementar la tasa de síntesis de membrana para restablecer el reciclado de

vesículas sinápticas ante la liberación de neurotransmisores (de Arriba Zerpa et al. 1999,

Caputto & Guido 2000).

La biogénesis de membrana requiere del suministro coordinado de todos sus

componentes integrales. En este sentido, fue notable como en células ganglionares el

marcado isotópico realizado tanto in vivo (3H-glicerol o 32P-ortofosfato) como in vitro (32P-γ-

ATP) mostró consistentemente que la marcación de todos los fosfolípidos analizados se

incrementó de manera similar, de un modo dependiente de c-Fos, en luz con respecto a

oscuridad. Resultados concordantes fueron encontrados en células PC12 inducidas a

diferenciar con factor de crecimiento nervioso (NGF) a un fenotipo similar a neuronas

simpáticas. c-Fos activa el marcado metabólico general tanto de fosfolípidos (Gil et al. 2004)

como de glicolípidos (Crespo et al. 2008). Al bloquearse la expresión de c-Fos se detiene

tanto la activación de síntesis de lípidos como así también la neuritogénesis. Análisis por TLC

de los extractos lipídicos luego del marcado isotópico de estas células con 14C-Galactosa o

con 32P-ortofosfato mostraron un incremento del 50-60% en todos los glicolípidos marcados

con 14C y de PtdCho, que también se marca en este ensayo. Asimismo, todos los fosfolípidos

marcados con 32P también mostraron resultados similares. Estos resultados son compatibles

con una estimulación global de la maquinaria de síntesis de lípidos en la respuesta a NGF

mediada por c-Fos.

Introducción

16

Regulación de la función de c-Fos como activador de la síntesis de fosfolípidos

La capacidad de c-Fos para activar la síntesis lipídica en el citoplasma requiere de la

asociación de c-Fos al RE (Bussolino et al. 2001), el sitio de síntesis cuantitativamente más

importante de la célula. Esta asociación al RE está regulada por el estado de fosforilación de

los residuos de tirosina 10 y 30 de c-Fos. Células quiescentes tienes cantidades muy

pequeñas de c-Fos que, además, se encuentra fosforilado en dichos residuos y por tanto

disociado del RE. Al inducir a las células a proliferar, se promueve la expresión de c-Fos

conjuntamente con la desfosforilación de esta proteína, lo que resulta en su asociación a las

membranas del RE y en la activación de la síntesis de lípidos (Portal et al. 2007).

c-Src fue identificada como la primer quinasa y TC45-PTP como la primer fosfatasa

que actúan sobre los residuos de tirosina de c-Fos (Ferrero et al. 2012). Estudios de

fraccionamiento subcelular y de marcado con 32P-ATP evidenciaron que c-Fos fosforilado es

incapaz de unirse a membranas y en consecuencia no activa la síntesis de fosfolípidos. La

regulación de esta modificación post-traduccional reversible se encuentra en la etapa de

desfosforilación. La inducción de las células con mitógenos promueve la concomitante

translocación de TC45-PTP desde el núcleo hacia el citoplasma, su activación y la formación

del complejo transitorio c-Fos/TC45 que resulta en la desfosforilación de c-Fos (Ferrero et al.

2012). Diferentes estudios han demostrado la activación de c-Src con el estímulo celular,

(revisado en Hunter 2009). Sin embargo, en el modelo celular empleado, no se observó un

incremento en la fosforilación de c-Fos frente al estímulo, lo que indicaría que la actividad de

c-Src basal es suficiente para mantener las pequeñas cantidades de c-Fos presente en células

quiescentes en su estado fosforilado. Es importante remarcar que la fosforilación en tirosina

tiene un efecto represor de la actividad no genómica de c-Fos mientras que la fosforilación

en serinas/treoninas tiene un efecto trans-activador de su actividad como AP-1.

c-Fos en el crecimiento tumoral

Existe abundante información acerca de los eventos genómicos que se encuentran

detrás del crecimiento exacerbado característico de células tumorales (Hanahan & Weinberg

2011). En cambio, son escasos los estudios respecto de los cambios pleiotrópicos que

Introducción

17

necesariamente acompañan el crecimiento tumoral. En este contexto, altas tasas de

proliferación correlacionan estrictamente con una elevada expresión de c-Fos junto con altas

tasas de síntesis de fosfolípidos en modelos tumorales. Bloqueando específicamente la

síntesis de fosfolípidos dependiente de la expresión de c-Fos se reduce significativamente la

proliferación en cultivo de células T98G, que derivan de un glioblastoma multiforme humano.

Más aún, al tratar ratones atímicos xeno-transplantados con estas células en el lugar de la

lesión con un oligonucleótido ARNm antisentido (ASO) específico para c-Fos, se impide el

crecimiento tumoral que de otro modo se desarrolla en el 90% de los animales control (Gil et

al. 2012). Resultados concordantes fueron encontrados en ratones NPcis, un modelo animal

de la enfermedad humana Neurofibromatosis tipo I, que a los 5-6 meses de edad generan

espontáneamente tumores del sistema nervioso central y periférico con una penetrancia del

100%. Los tumores ya formados crecen significativamente más lento que en los controles

cuando los ratones NPcis son tratados con ASO para c-Fos. Finalmente, ratones NPcis

homocigotas nulos para c-Fos no desarrollan tumores, en contraste con el 71.4% de sus

hermanos de camada Fos +/+ que si lo hacen (Silvestre et al. 2010).

c-Fos y un estado activado de la síntesis de lípidos

No solo patologías asociadas a tumores muestran c-Fos asociado al RE, en la médula

espinal de ratas sensibilizadas para desarrollar encefalomielitis alérgica en la que se

promueve gliosis, se induce la expresión de c-Fos y este se encuentra asociada al RE (Cammer

et al. 1989). La actividad no genómica de c-Fos promueve un estado activado de síntesis de

fosfolípidos que se ha probado como necesario en modelos de crecimiento, proliferación y/o

diferenciación celular para sostener estos procesos. En un reporte reciente, se estudiaron

cambios globales en la transcripción inducidos por c-Fos de una manera independiente a su

actividad AP-1. Se encontró que estos eran la consecuencia de la síntesis nuclear

dependiente de c-Fos de PtdIns(4,5)P2 (Ferrero et al. 2014), un lípido involucrado en la

remodelación de cromatina (Viiri et al. 2012). De esta manera, c-Fos integra ambas

funciones, tanto como i) activador de la síntesis lipídica (Caputto et al. 2014) como ii) un

modulador transcripcional (Angel & Karin 1991).

CAPITULO II

OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO

Objetivos e Hipótesis de Trabajo

19

Los ejemplos planteados hasta aquí apuntan a la existencia de un mecanismo

compartido que permite un aumento en el abastecimiento de lípidos y nos permite formular

la siguiente hipótesis causa-consecuencia: 1) La expresión de c-Fos es rápidamente inducida

por factores externos, que llevan a 2) un incremento tanto en la actividad AP-1 como en la

activación de la síntesis de fosfolípidos que en consecuencia sostienen 3) proliferación o

diferenciación celular. El tiempo y la localización de estas dos funciones dentro de la célula

son distintos. c-Fos nuclear es necesario en etapas iniciales para desencadenar los

correspondientes programas génicos, participando entonces en preparar a las células para

crecer, mientras que c-Fos citoplásmico es necesario para mantener una tasa elevada de

síntesis lipídica tanto en etapas del crecimiento iniciales como tardías (Gil et al. 2004, Ferrero

et al. 2012, Gil et al. 2012, Cardozo Gizzi & Caputto 2013).

Distintos reportes del grupo han ido avanzando en el conocimiento de los fenómenos

dependientes de c-Fos. El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar el mecanismo

molecular por el cual c-Fos es capaz de activar la síntesis de lípidos: la manera en que

consigue incrementar el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas.

En fibroblastos NIH 3T3 quiescentes estimulados a reingresar al ciclo celular, se

produce la rápida inducción transcripcional de c-Fos, en el orden de minutos (Greenberg &

Ziff 1984). Se producen dos ondas de expresión de c-Fos que son necesarias para que genere

concomitantemente la estimulación en la incorporación de 32P-ortofosfato a fosfolípidos in

vivo (Bussolino et al. 2001). La primera onda de marcado radioactivo incrementado de lípidos

tiene un pico a 7,5 minutos post-estímulo y regresa a niveles del control a los 15 minutos; la

segunda onda empieza a los 30 minutos y se mantiene elevada al menos hasta 120 minutos,

el tiempo más largo examinado. Los lípidos que incorporan 32P durante la primera onda son

PIPs, predominantemente segundos mensajeros ubicuos, mientras que en la segunda onda

los productos radioactivos mayoritarios son los principales lípidos constituyentes de

membranas. La vida media del ARNm de c-Fos es muy corta en la primer onda, de solo 10

minutos, en tanto es de alrededor de 85 minutos en la segunda onda (Bussolino et al. 2001).

Este antecedente fue el disparador de esta tesis doctoral, ya que nos propusimos

estudiar en detalle este fenómeno. El modelo de estudio empleado a lo largo de la tesis será

Objetivos e Hipótesis de Trabajo

20

entonces la mencionada línea celular y particularmente la transición G0/G1 inducida por el

agregado de suero fetal bovino (FBS) al 20% a células que se encuentran quiescentes luego de

permanecer 48 horas deprivadas de factores de crecimiento. Se utilizará este sistema como

modelo para estudiar la respuesta celular a un rápido requerimiento de síntesis de lípidos

frente a un estímulo externo. Se pretende resolver estos interrogantes mediante un enfoque

conjunto de técnicas bioquímicas clásicas junto con microscopía confocal de fluorescencia.

En otros modelos celulares ya se había observado que c-Fos activa el marcado

radioactivo de todos los lípidos analizados. Sin embargo, no se conocía si este efecto estaba

dado por la activación de todas las vías metabólicas involucradas o si en cambio c-Fos actuaba

sobre etapas específicas. Uno de los objetivos específicos fue el de establecer qué etapas

metabólicas c-Fos está afectando a partir del estudio de las mismas in vitro. La hipótesis es

que c-Fos sólo afecta etapas claves, ¿pero cómo lo hace? Nos propusimos estudiar las

posibles interacciones directas con las enzimas cuyos pasos metabólicos c-Fos incrementa.

Para hacerlo, la idea fue emplear co-inmunoprecipitaciones por su robustez pero también

avanzar en el empleo de microscopia de fluorescencia para obtener información espacial y

temporal del fenómeno.

Otro de los objetivos planteados fue el de establecer la región de c-Fos involucrada en

la función no genómica, conociendo por resultados anteriores que la región básica,

involucrada en la unión al ADN, también parecía clave en la función no genómica. El enfoque

empleado fue genético, generando mutantes de deleción de c-Fos y estudiar la pérdida de

función de las mismas en la activación de la síntesis lipídica.

Por último, queda planteado el interrogante de cómo se activan vías metabólicas para

dar como producto lípidos distintos. El PA es un intermediario clave en la síntesis de

glicerofosfolípidos ya que puede derivado tanto a la vía de PIPs como a la vía de Kennedy que

dará lugar finalmente a PtdCho, PtdEth y PtdSer. En el mencionado reporte (Bussolino et al.

2001), se indicó que existen las dos ondas de activación del marcado radioactivo de lípidos

que depende de c-Fos en donde los lípidos que incorporan 32P durante la primera onda son

diferentes a los de la segunda. Esto despertó un interés por parte mía para continuar

estudiando el destino final de PA en este sistema y su dependencia en la expresión de c-Fos.

CAPITULO III

RESULTADOS

Resultados

22

Efecto de c-Fos en la síntesis de PIPs in vivo

Cuando ingresé al laboratorio, la Dra. Marianne Renner había comenzado durante el

desarrollo de su tesis doctoral a dilucidar algunos aspectos de esta activación dependiente de

c-Fos. En la Fig. 3 se puede ver como se produce un acentuado incremento en el marcaje de

PtdIns y PtdInsP2 en las células luego de sólo 7,5 minutos de estímulo. Dicho incremento se

ve abolido frente al agregado a las células de un ASO que impide la traducción de la proteína

c-Fos. El experimento demuestra la relevancia biológica del fenómeno de la activación

dependiente de c-Fos para que la célula ajuste la síntesis de PIPs. Es concordante también

con estudios que indican que la expresión de c-Fos es necesaria para que células quiescentes

reingresen al ciclo celular (Robbins et al. 1990).

En la mencionada Fig. 3 se observa en la esquina inferior derecha el nombre de

Renner, ML reconociendo su trabajo. En próximas figuras, se continuará aclarando si el

trabajo fue hecho por otro miembro del laboratorio, en conjunto conmigo o si algunos

resultados fueron luego confirmados por mí. En los casos en los que no se coloque ningún

nombre, se trata de experimentos realizados íntegramente por mí.

Las actividades CDS y PIK pero no la de PIS son activadas por c-Fos

El incremento en el marcaje radioactivo de PIPs implica una más activa tasa de

síntesis o de recambio por sobre la de degradación de estos productos lipídicos. Nos

propusimos estudiar los distintos pasos metabólicos que conducen a la formación de los

mismos. En particular, se midieron las actividades enzimáticas en homogenatos celulares

totales de los tres primeros pasos de síntesis de PIPs utilizando precursores específicos de

cada etapa metabólica marcados radioactivamente, en presencia o ausencia de c-Fos

purificado obtenido en forma recombinante en E. Coli. Los homogenatos totales utilizados

como fuente de enzimas son de células NIH 3T3 quiescentes, que poseen niveles no

detectables c-Fos endógeno.

Resultados

23

Figura 3. Efecto del bloqueo de la expresión de c-Fos sobre el marcado radioactivo de PtdInsP y PtdsInsP2. a) y b) Células NIH 3T3 quiescentes fueron pulsadas con 32P-ortofosfato y luego mantenidas en quiescencia (primera columna) o estimuladas con FBS al 20% durante 7.5 minutos (segunda a cuarta columna). Las células fueron cosechadas y cuantificadas para el marcado radioactivo de PtdInsP (a) o PtdInsP2 (b) a partir de la correspondiente TLC del extracto lipídico. Oligonucleótido ARNm sentido (S) como control (tercera columna) u oligonucleótido ARNm anti-sentido (AS) contra c-Fos (cuarta columna) fueron adicionados al medio de cultivo previo al estímulo. c) WB de muestras de células utilizadas en a) y b) fue revelado utilizando anticuerpos anti-c-Fos y anti-α-tubulina (control de carga). Nótese la disminución en la expresión de c-Fos al cultivar las células en presencia de AS. *p<0,005 determinado con ANOVA de una vía con Tukey post-test. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

24

Luego de establecer las condiciones de linealidad de las distintas enzimas, se

realizaron ensayos con agregados crecientes de c-Fos purificado para establecer cuál o cuáles

actividad/es esta proteína es capaz de modificar. Como puede observarse en la Fig. 4, con el

agregado de 0,5 ng c-Fos/µg proteína total de homogeneizado, CDS tiene un pico en su

actividad de alrededor del 60% por encima del control que contiene solo el vehículo. Este

aumento se ve disminuido hasta alrededor del 30% por encima del control con mayores

cantidades de c-Fos. La actividad PIK requiere de mayores concentraciones de c-Fos (1 ng c-

Fos/µg proteína total) para alcanzar una activación del 60%. Sin embargo, hasta una

concentración de 3 ng c-Fos/µg proteína total (la más alta concentración de c-Fos ensayada)

sigue incrementándose el porcentaje de activación. En tanto, no se observó un incremento

en la actividad PIS a ninguna de las concentraciones de c-Fos ensayadas.

Figura 4. Curvas de activación dependiente de c-Fos para las actividades enzimáticas de CDS, PIS y PIK. Actividad in vitro de las enzimas CDS (círculos abiertos), PIS (cuadrados cerrados) y PIK (triángulos cerrados) en homogenatos totales de células NIH 3T3 quiescentes en función de la cantidad de c-Fos recombinante adicionado al medio de ensayo. Las actividades enzimáticas fueron determinadas según se describe en Materiales y Métodos, incubando los tubos durante 20 minutos para el caso de la actividad CDS y 10 minutos para los otros dos. Los Resultados son el promedio ± DE de un experimento representativo realizado en duplicado de un total de tres experimentos realizados. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

25

Es realmente interesante que a concentraciones inferiores de c-Fos se active CDS,

sugiriendo que los requerimientos para la activación del primer paso metabólico son

distintos del tercero.

A continuación, se realizaron curvas de tiempo de las actividades enzimáticas a medir,

lo cual consiste en determinar la formación del producto de cada paso metabólico en

incubaciones a distintos tiempos; con o sin el agregado de c-Fos recombinante, usando 0,5

ng c-Fos/µg proteína total para CDS y 1 ng c-Fos/µg proteína total para las otras dos

actividades enzimáticas ensayadas. La actividad de CDS fue lineal hasta 60 minutos de

incubación (Fig. 5a). La actividad PIS fue lineal hasta 15 minutos, el tiempo más largo

ensayado (Fig. 5b). La formación de PtdInsP (actividad PIK) presenta una rápida cinética, por

lo que aún determinando la actividad a 25 °C no se obtuvo una clara zona de linealidad (Fig.

5c). En todos los tiempos analizados, se produjeron cantidades incrementadas de CDP-

DAG cercanas al 50% con el agregado de c-Fos. Esencialmente el mismo resultado se obtuvo

para PIK. En contraste, no se obtuvieron diferencias significativas en la actividad PIS en los

distintos tiempos analizados ni en las distintas concentraciones de c-Fos recombinante

ensayadas. Estos experimentos establecieron claramente que c-Fos es capaz de promover

una activación general de la vía al incrementar la actividad del primer y tercer paso

metabólico involucrado. Asimismo, la no activación de PIS estaría indicando la especificidad

de la activación enzimática.

Resultados

26

Figura 5. Curvas de tiempo para la actividad enzimática de CDS, PIS y PIK con la adición de c-Fos. Actividad in vitro en homogenatos de células NIH 3T3 quiescentes de las enzimas bajo estudio con o sin el agregado de c-Fos recombinante (círculos cerrados o abiertos, respectivamente) en función del tiempo de incubación. Se emplearon 0,5 ng c-Fos/µg proteína total para CDS y 1 ng c-Fos/µg proteína total para las otras dos actividades enzimáticas ensayadas. Las actividades enzimáticas fueron determinadas según se describe en Materiales y Métodos. Los Resultados son el promedio ± DE de un experimento representativo realizado en duplicado de un total de tres experimentos realizados. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. 2011.

Resultados

27

Finalmente, se realizaron curvas de concentración de sustrato de las enzimas que son

activadas por c-Fos (Fig. 6) con el objetivo de establecer los parámetros cinéticos, Km y

Vmax, de las enzimas en presencia y ausencia de c-Fos. El ajuste de los datos a curvas de

Michaelis-Menten permitió determinar los Km y Vmax de CDS y PIK, cuyos resultados se

encuentran en la Tabla 1. Estos estudios cinéticos son nuestro primer acercamiento al

mecanismo molecular mediante el cual c-Fos consigue el efecto de activación. En los dos

casos analizados, se observó el mismo comportamiento: el agregado de c-Fos recombinante

produjo incrementos en la velocidad máxima de la reacción de alrededor del 100% por

encima del control, sin que se produzcan cambios estadísticamente significativos en los Km.

Esto indica: i) que c-Fos incrementa la capacidad catalítica de las enzimas involucradas en la

activación sin que ello implique un cambio en la afinidad de la enzima por su sustrato y ii) son

las primeras evidencias de que existe un mecanismo compartido en la activación de las

distintas enzimas involucradas. Los pasos metabólicos estudiados catalizan reacciones

totalmente distintas: CDS transfiere un nucleótido (CTP) hacia el grupo fosfato del PA

mientras que PI4KIIα transfiere un fosfato desde ATP hacia el grupo alcohol del anillo de

inositol.

Es importante destacar que la mayor concentración de c-Fos exógena adicionada (1

ng/µg proteína total) es comparable a una concentración cercana a 105 moléculas de c-Fos

por célula. Esta concentración es la que se encuentra en fibroblastos cuando la expresión de

c-Fos es inducida, según fuera calculada por Kovary & Bravo (1991).

Resultados

28

Figura 6. Curvas de concentración de sustrato de las actividades enzimáticas de CDS y PIK. Actividad in vitro en homogenatos de células NIH 3T3 quiescentes de las enzimas bajo estudio con o sin el agregado de c-Fos recombinante (círculos cerrados o abiertos, respectivamente) en función de la concentración de sustrato adicionado exógenamente. Las actividades enzimáticas fueron determinadas según se describe en Materiales y Métodos, incubando los tubos durante 20 minutos para el caso de la actividad CDS y 10 minutos para el de PIK. Los resultados son el promedio ± DE de un experimento representativo realizado en duplicado de un total de tres experimentos realizados. El recuadro interior son gráficos de Lineweaver-Burk para el cálculo de Km y Vmax. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

29

Tabla 1. Parámetros cinéticos de las enzimas de la vía de síntesis de PIPs que son activadas por el agregado de c-Fos recombinante, calculados a partir de los datos de la Fig. 6.

Constantes cinéticas de la enzima CDS

Constantes cinéticas de la enzima PIK

Km (µM) Vmax (nmol producto/

mg proteina total min)

Km (µM) Vmax (pmol producto/

mg proteina total min)

Control 1,3±0,2 15,8±0,7 254±30 4,0±0,5

+c-Fos 1,6±0,3 34,3±1,6 331±57 8,5±0,6

Las actividades de CDS1 y PI4KIIα son claves para la activación del marcado radioactivo de

PtdInsP y PtdInsP2 promovido por FBS, no así la de PI4KIIβ

En esta instancia, se había establecido que al estimular fibroblastos a reingresar al

ciclo celular se produce un rápido incremento en el marcaje radioactivo de PIPs que requiere

de la expresión de c-Fos. La hipótesis inicial es que c-Fos media este efecto al activar etapas

metabólicas específicas, la primera y la tercera para el caso de la vía de síntesis de PIPs. Para

confirmar el rol de enzimas particulares en la síntesis de PtdInsP y PtdInsP2 in vivo, decidimos

estudiar el marcado de estos lípidos en células en cultivo previamente tratadas con

pequeños ARN de interferencia (siRNA) para deprimir la expresión de las enzimas en estudio.

Respecto de la formación de PtdInsP a partir del PtdIns, se ha observado que en

homogenatos totales de células NIH 3T3 se puede abolir prácticamente en su totalidad la

actividad PI4K con el inhibidor adenosina, que es específico para PI4K tipo II (de Graaf et al.

2002). Aún más, la vía predominante de fosforilación de PtdIns es iniciada por este tipo de

quinasas en muchas células de mamíferos (Fruman et al. 1998) y en particular la enzima

PI4KIIα se ha descripto como la más activa (Balla et al. 2002). Por tanto, se decidió utilizar las

dos isoformas (α y β) de esta familia de enzimas como blanco para disminuir su expresión. En

concreto, se trató a las células con siRNA contra CDS1, PI4KIIα y PI4KIIβ.

Resultados

30

Figura 7. La disminución en la expresión de CDS1 y PI4KIIα pero no de PI4KIIβ suprime el incremento en el marcado radioactivo de PtdInsP y PtdInsP2 in vivo. Células NIH 3T3 fueron transfectadas con siRNA contra las enzimas en estudio para deprimir la expresión de las mismas. Tras establecer la quiescencia, las células fueron pulsadas con 32P-ortofosfato para luego ser estimuladas con FBS al 20% durante 7.5 minutos. a) y b) muestran el marcado in vivo de PtdInsP y PtdsInsP2 (respectivamente) para cada caso analizado. c) WB de homogenatos celulares utilizados en a) y b) fueron revelados para cada una de las enzimas en estudio utilizando anticuerpos específicos (Abcam) en las condiciones indicadas (siRNA). En cada caso, puede observarse la disminución de la expresión de la correspondiente enzima en las células tratadas con el siRNA. Se reveló además contra α-tubulina como control de carga en cada caso. El control consistió en células a las que se les adicionó solo el reactivo de transfección. Adicionalmente, se examinaron células trasfectadas con un siRNA que no tiene ningún blanco, y no se observaron diferencias respecto del mencionado control (no mostrado). Los resultados son la media de dos experimentos independientes ± DE. **p<0,01, *p<0,05 determinado mediante análisis de la varianza de dos vías usando Bonferroni post-test. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

31

Al estimular las células con FBS, se observa el esperando incremento en el marcado

de PtdInsP y PtdInsP2 (Fig. 7). Este incremento se ve suprimido en células tratadas con siRNA

contra CDS1 o PI4KIIα. En cambio, disminuir la expresión de PI4KIIβ no tiene efecto alguno en

el fenómeno. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de CDS1 y PIKIIα en la

activación de la síntesis de PIPs a tiempos cortos en células NIH 3T3 que reingresan al ciclo

celular. Es importante remarcar en este punto que según se observa en la Fig. 3, dicha

activación es dependiente de la expresión de c-Fos.

Es interesante destacar que en un reporte reciente se vio que mientras CDS1 no

muestra una especificidad o preferencia por las cadenas laterales del sustrato (posiciones sn-

1 y sn-2 de PA), CDS2, la segunda isoforma de esta enzima, tiene una marcada preferencia

por 1-estearoil-2-araquidonil PA como sustrato, así como también una inhibición de su

actividad por parte del PtdInsP2 con estas cadenas de los ácidos grasos en particular

(D'Souza et al. 2014). Estudios de otros laboratorios demuestran que el PtdIns formado a

partir de la vía de síntesis de novo contiene principalmente cadenas del resto acilo saturadas

o mono-insaturadas (Holub & Kuksis 1971, Luthra & Sheltawy 1976). En cambio, el ciclo de

PtdIns involucra la ruptura de PtdIns(4,5)P2 en la membrana plasmática y la re-síntesis de

PIPs por parte de enzimas, entre ellas DGKε (Lung et al. 2009) o PtdIns4P-5-quinasa (Shulga

et al. 2012), que tienen una importante especificidad por el sustrato, lo cual resulta en un

enriquecimiento cíclico del PtdIns de cadenas acilo particulares, siendo las principales 1-

estearoil-2-araquidonil (18:0 sn−1/20:4 sn−2). Esto último induce a pensar que CDS2 estaría

involucrada principalmente en el ciclo del PtdIns mientras que CDS1, que no exhibe ninguna

especificidad por la cadena lateral, en la síntesis de novo de PtdIns (D'Souza & Epand 2014).

La enzima CDS cuya actividad incrementada depende de la expresión de c-Fos y que además

al deprimir la expresión de la misma se impide el incremento en la marcación de PtdInsP2,

sería entonces la involucrada en la síntesis de novo.

Resultados

32

CDS1 y PI4KIIα pero no PI4KIIβ participan en una asociación física con c-Fos

Los experimentos mostrados hasta aquí plantearon el interrogante sobre la forma en

que c-Fos logra la activación de enzimas específicas. Un posible mecanismo es mediante una

interacción directa con las enzimas que activa. Para estudiar esta alternativa, inicialmente se

realizaron experimentos de coinmunoprecipitacion en homogenatos totales de fibroblastos

NIH 3T3 transfectados para expresar las enzimas bajo estudio con un rótulo que permita

dirigir un anticuerpo especifico contra el mismo. Concordantemente con lo observado en la

activación de enzimas particulares (Figs. 4 y 5), c-Fos coinmunoprecipitó con CDS1 y PI4KIIα

pero no con PIS1 o PI4KIIβ (Fig. 8). Estos estudios sugirieron que c-Fos está modulando la

actividad de estas enzimas a través de una interacción física, lo cual permitiría la activación

específica de las mismas.

La técnica de coinmunoprecipitación es muy robusta ya que si al bajar una proteína

con un anticuerpo especifico y luego revelar la existencia en el inmuno-complejo de una

segunda proteína, se está probando que ambas participan en un complejo. Sin embargo, esta

Figura 8. CDS1 y PI4KIIα pero no PI4KIIβ coinmunoprecipitan con c-Fos. Células NIH 3T3 fueron transfectadas para expresar PIS1-myc, PI4KIIα-myc, CDS1-YFP ó PIKIIβ-YFP y estimuladas con FBS al 20% durante 1 hora para inducir la expresión de c-Fos endógeno. Lisados de estas células fueron inmunoprecipitados usando anti-GFP (Roche) o anti-myc (Sigma), ambos producidos en ratón. Se muestra en la parte superior el WB revelado utilizando anti-c-Fos (Santa Cruz,

producido en conejo) y en la parte inferior los inmunoprecipitados obtenidos para cada enzima revelados usando anti-GFP (Sigma) o anti-myc (Santa Cruz) ambos producidos en conejo. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

33

técnica tiene sus limitaciones. En primer lugar, al tratarse de homogenatos totales, no se

brinda ninguna información espacial del fenómeno. Más aún, la disrupción del entorno

natural en que se encuentran las proteínas de interés puede promover interacciones que no

están presentes en una célula intacta. Por último, que ambas proteínas se encuentren en el

mismo inmuno-complejo no descarta la posibilidad de terceras proteínas que actúen como

proteínas puente.

Para superar estas limitaciones, decidimos estudiar la interacción proteína-proteína

usando microscopía FRET por emisión sensibilizada (Elangovan et al. 2003). Dicha técnica se

basa en la transferencia de energía desde un donor fluorescente excitado hacia un aceptor

(fluorescente o no) por medio de un fenómeno no radiativo. Este fenómeno, denominado

FRET o transferencia de energía de Förster, por quien estableciera los principios que lo rigen,

depende fuertemente de la distancia. En términos prácticos, donor y aceptor deben

encontrarse a no más de 10 nm de distancia para que ocurra el fenómeno de FRET, para el

caso de la utilización de proteínas fluorescentes como par aceptor-donor. Esta distancia es

típica de una interacción directa entre dos proteínas, por lo que esta técnica permite medir

interacciones proteína-proteína (Vogel et al. 2006). El FRET agota la población del estado

excitado del donor, disminuyendo su emisión mientras que causa la emisión (sensibilizada)

del aceptor. La forma de medir el fenómeno consiste en fusionar las proteínas de interés a

proteínas fluorescentes, usando un par o combinación que permita la transferencia de

energía. En este caso en particular empleamos a la proteína fluorescente cyan (CFP) como

donor y a la proteína fluorescente amarilla (YFP) como aceptor (Piston & Kremers 2007). Para

realizar el experimento de FRET, se transfectaron las células con los plásmidos

correspondientes al tiempo que se deprivaban a estas de factores de crecimiento. Luego de

establecerse la quiescencia, se indujeron las células durante 7,5 minutos con FBS para

generar la transición G0/G1 y situarnos en el momento de más alta síntesis de PIPs (Bussolino

et al. 2001). Este estímulo es necesario para desencadenar los fenómenos celulares que

aseguran la interacción de ambas proteínas. Sin embargo, el estímulo también promueve la

rápida traducción de c-Fos endógeno, que podría competir con el c-Fos fusionado a CFP por

Resultados

34

Figura 9. Microscopia FRET revela la interacción entre c-Fos/CDS1 y c-Fos/PI4KIIα. a) Donor de FRET, CFP (izquierda), Aceptor de FRET, YFP (centro) e imagen de Eficiencia de FRET (derecha). Se co-transfectaron las células para que expresen cada una de las enzimas bajo estudio fusionadas a ECFP junto con c-Fos-EYFP y estas fueron examinadas por microscopía confocal. Se muestran imágenes representativas de cada uno de los casos. El control negativo es CDS1-ECFP/YFP y se muestra en la fila inferior. La imagen de Eficiencia de FRET fue generada con el programa ImageJ, usando una escala pseudocoloreada que representa la eficiencia en una escala que incrementa de azul a blanco, como se muestra en la barra de la esquina inferior derecha. El valor máximo (pixeles blancos) corresponde al control positivo ECFP-EYFP, una quimera de ambas proteínas fluorescentes unidas por un segmento flexible de 18 aa, cuya máxima eficiencia de FRET se utiliza para normalizar la escala (no mostrado). b) Eficiencia promedio de FRET ± DE. Los resultados, obtenidos tras analizar 25 células en cada caso, provienen de un experimento representativo de un total de al menos tres. *p<0,001 determinado por ANOVA de una vía con post-test de Dunnett. La barra blanca en la esquina superior izquierda representa 10 µm. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. 2011.

Resultados

35

la unión de las enzimas y disminuir los valores de FRET. Para contrarrestar esto, se incubó a

las células durante el estímulo (y desde 45 minutos antes) con cicloheximida a una

concentración de 50 µg/mL, que impide la traducción al nivel del ribosoma. De esta forma, se

permiten los eventos post-traduccionales necesarios para la activación de algunas enzimas al

tiempo que se inhibe la síntesis de c-Fos endógeno.

Las condiciones de FRET indican que las proteínas de interés se encuentran a una

distancia menor a 10 nm, actuando entonces como una regla molecular; en tanto que al ser

una técnica de microscopía, permite obtener información respecto de la localización

subcelular de la interacción. Los resultados correlacionan con lo observado anteriormente en

las coinmunoprecipitaciones: tanto CDS1 como PI4KIIα pero no PI4KIIβ participan de una

interacción física con c-Fos (Fig. 9). Si bien se observa un acumulamiento de c-Fos dentro del

núcleo, la asociación ocurre peri-nuclearmente, aparentemente asociado al RE según puede

verse en las imágenes de eficiencia de FRET (Fig. 9). Es importante mencionar que c-Fos

experimenta un transporte activo entre el núcleo y el citoplasma, y que esta proteína es

capaz de experimentar ciclos de entrada y salida al núcleo (Malnou et al. 2007). El RE es,

como se dijo anteriormente, el principal sitio de síntesis de fosfolípidos y el sitio subcelular

donde se ha encontrado previamente a c-Fos asociado (Bussolino et al. 2001) por lo que el

sitio de asociación enzima/c-Fos se corresponde con la hipótesis de que c-Fos interacciona

directamente con enzimas específicas para activar la síntesis metabólica de fosfolípidos en el

RE.

El domino BD sería el responsable de la activación de la síntesis de PIPs

Para determinar cuál o cuáles son los dominios de c-Fos requeridos para esta función

no genómica, construimos inicialmente mutantes de deleción de la proteína y ensayamos su

capacidad para activar la síntesis de PIPs in vitro. Puede observarse una representación

esquemática de las mutantes empleadas en la Fig. 10c. La mutante NB (aa: 1-160) es capaz

de activar la síntesis de PtdInsP y PtdInsP2 mientras que NA (aa: 1-138) no lo hace (Figs 10 a y

b). La diferencia entre ambas mutantes son únicamente los 21 aa del dominio básico (BD)

que NB incluye y NA no. Por otro lado, la mutante de deleción ΔBD, a la que solo le faltan los

21 aa correspondientes al BD respecto de c-Fos salvaje, es incapaz de activar la síntesis de

Resultados

36

Figura 10. Activación in vitro de la síntesis de PtdInsP y PtdInsP2 por la proteína c-Fos o sus mutantes. a) y b) El marcado radioactivo con 32P-ATP de PtdInsP y PtdInsP2 (respectivamente) fue determinado in vitro utilizando homogenatos de células quiescentes en presencia de c-Fos o sus mutantes obtenidos en forma recombinante. Los resultados son expresados con respecto a un control en el que sólo se adicionó vehículo. Las proteínas recombinantes se ensayaron a una concentración de 1 ng/µg proteína total en el homogenato. Los resultados son el promedio de un experimento representativo de un total de tres realizado en triplicado ± DE. *p<0,01 determinado por ANOVA de una vía usando el post-test de Dunnett. c) Representación esquemática de las mutantes de deleción o puntuales empleadas en a) y b). Se muestra además la secuencia del BD, con los residuos básicos en rojo. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

PIPs (Fig. 10 a y b). Esta evidencia se suma a la ya obtenida en la línea celular PC12, un

modelo de diferenciación neuronal en la que se encontró que el BD de c-Fos era necesario

para la activación generalizada de la marcación radioactiva de fosfo- y glico-lípidos en el

proceso de elongación de neuritas (Gil et al. 2004, Crespo et al. 2008).

El BD se compone de 21 residuos, doce de los cuales son básicos y por lo tanto

poseen carga positiva a pH fisiológico. Como se mencionara en la Introducción, este dominio

Resultados

37

está directamente involucrado en la unión al ADN, que por sus fosfatos posee una fuerte

carga negativa. Sin embargo, la unión al ADN es altamente específica y los heterodímeros AP-

1 solo interaccionan con secuencias definidas. En la Fig. 10c puede verse la secuencia de este

dominio donde se han resaltado los residuos básicos en rojo. Decidimos realizar mutantes

puntuales sobre estos residuos básicos, en particular sobre lisina-139, arginina-144 y

arginina-146, reemplazándolas por asparagina, un aminoácido polar que tiene un grupo

carboxamida como su cadena lateral. Los resultados indican que la arginina-146 es

indispensable para conseguir la activación de la síntesis lipídica, ya que al mutarla se suprime

el efecto. Las otras dos mutantes ensayadas, K139N y R144N, son capaces de incrementar el

marcado radioactivo de lípidos a niveles comparables con c-Fos salvaje a pesar de tener una

carga positiva menos (Fig. 10 a y b), lo que indicaría que el efecto no es únicamente una

cuestión de carga.

La región N-terminal es la responsable de la asociación con CDS1

Habiendo establecido el dominio involucrado en la activación de la síntesis de PIPs,

fue de interés establecer cuál era el dominio de asociación con la enzima CDS1, elegida como

modelo de estudio. Para ello se fusionaron las mismas mutantes esquematizadas en la Fig.

10c a la proteína fluorescente CFP y se analizó por microscopía FRET la transferencia de

energía a CDS1-YFP. Según puede observarse en la Fig. 11, tanto la mutante NA como NB

retienen la capacidad de unión a CDS1 a pesar de no contar con la porción C-terminal de la

proteína c-Fos salvaje. Ello, sumado a que la mutante LZC (160-380) es incapaz de unirse a la

enzima, indicaría que la región C-terminal de c-Fos no está involucrada en el fenómeno. Por

otro lado, la mutante ΔBD, a pesar de no poseer capacidad como activadora de la síntesis de

PIPs, sigue asociándose a CDS1, lo cual descartaría que el BD esté involucrado en esta

asociación. Aún más, el hecho que tanto NA como NB se asocien a la enzima, apuntaría a la

región N-terminal (aa: 1-138) como la implicada en la interacción, ya que es la región mínima

compartida. En conclusión, la interpretación más sencilla de los resultados obtenidos hasta

aquí es que el dominio N-terminal de c-Fos interacciona con CDS1 mientras que el dominio

de activación es el BD, lo que indica que, sorpresivamente, la unión y la activación de CDS1 se

deben a regiones diferentes de c-Fos.

Resultados

38

Figura 11. El dominio N-terminal es el responsable de la asociación de c-Fos a la enzima CDS1. a) Donor de FRET, CFP (izquierda), Aceptor de FRET, YFP (centro) e imagen de Eficiencia de FRET (derecha). Se co-transfectaron las células para que expresen cada una de las enzimas bajo estudio fusionadas a ECFP junto con c-Fos-EYFP y estas fueron examinadas por microscopía confocal. Se muestran imágenes representativas de cada uno de los casos. El control negativo es CDS1-ECFP/YFP (no mostrado). La imagen de Eficiencia de FRET fue generada con el programa ImageJ, usando una escala pseudocoloreada que representa la eficiencia en una escala que incrementa de azul a blanco, como se muestra en la barra de la esquina inferior derecha. El valor máximo (pixeles blancos) corresponde al control positivo ECFP-EYFP, una quimera de ambas proteínas fluorescentes unidas por un segmento flexible de 18 aa, cuya máxima eficiencia de FRET se utiliza para normalizar la escala (no mostrado). b) Eficiencia promedio de FRET ± DE. Los resultados, obtenidos tras analizar 25 células en cada caso, provienen de un experimento representativo de un total de al menos tres. *p<0,001 determinado por ANOVA de una vía con post-test de Dunnett. La barra blanca en la esquina superior izquierda representa 10 µm. Adaptado de Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. (2011).

Resultados

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La región N-terminal es capaz de competir con c-Fos salvaje por su unión a la enzima

PI4KIIα

Dado el hallazgo de que la región N-terminal es la responsable de la asociación a la

enzima CDS1 pero no de la activación de la misma (ya que el dominio de activación se localiza

en el BD) se decidió utilizarlo para una posible intervencion en el metabolismo celular. La

idea consiste en establecer si la región N-terminal por si misma puede competir por el sitio

de unión de la enzima con c-Fos y de esta forma, al impedir la asociación, evitar el

incremento en la actividad enzimática. El objetivo último de esta intervención en el

metabolismo es establecer una posible estrategia para detener la proliferación celular que,

como se dijo, depende del estado activado de síntesis de fosfolípidos. A partir de la

evidencia obtenida hasta aquí, diseñamos un experimento de competencia, utilizando a la

enzima PI4KIIα para esta prueba de concepto. Estos experimentos se realizaron en conjunto

con el Dr. Cesar Prucca, que comenzaba entonces una estancia post-doctoral en el

laboratorio con el objetivo de desarrollar esta estrategia anti-tumoral mediante el bloqueo

específico de la actividad no genómica de c-Fos.

Para hacer estos experimentos de competencia utilizamos otra forma de determinar

la ocurrencia de FRET llamado FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy o

Microscopía de tiempo de vida media de fluorescencia). El método de emisión sensibilizada

se basa en la intensidad de la imagen para poder cuantificar una eficiencia “aparente” en la

transferencia de energía y por lo tanto depende de la concentración de los fluoróforos, que

debe ser tenida en cuenta para normalizar la señal. En cambio, la técnica de FLIM mide el

tiempo de vida media de fluorescencia (τ), el cual no depende de la concentración de

fluoróforos, el microscopio empleado o las condiciones de adquisición. Este método se

encuentra entre los mas robustos y confiables para medir FRET, ya que se basa en un

parámetro físico cuantificable directamente (Sun et al. 2013). Toda población de fluoróforos

que es excitada por un pulso de luz reside en el estado electrónico excitado un tiempo

determinado antes de decaer al estado basal. Para decaer, emite energía en forma radiativa

o bien puede disipar esa energía en forma no radiativa. En presencia de un aceptor de FRET,

la población de fluoróforos excitados posee una nueva vía para transmitir o disipar la

Resultados

40

energía. En consecuencia, el tiempo de vida media en el estado excitado es menor respecto

de una población de fluoróforos que no tienen disponible un aceptor. En otras palabras, el

tiempo de vida media del fluoróforo emisor disminuye ante la ocurrencia de FRET. El cambio

en el tiempo de vida media con o sin el aceptor (o el delta τ) indica la eficiencia de FRET en

forma cuantitativa, siendo este un parámetro muy robusto para establecer una interacción

proteína-proteína. Una de las principales desventajas de este método es que la adquisición

de datos confiables depende de colectar múltiples imágenes sucesivas para así tener los

fotones necesarios para hacer un análisis, y por lo tanto es mas lento que la técnica de

emisión sensibilizada. La otra desventaja es que requiere instrumentación especializada y

costosa. Para mas detalles, ver la sección Materiales y Métodos.

El experimento se desarrolla de la siguiente manera: se toman las imágenes de FLIM

para un campo en particular y a continuación se obtienen las imágenes para los canales de

CFP, YFP y λ660 (el fluoróforo con el que se marcó a NA-myc). Las imágenes de FLIM se

toman excitando únicamente al donor de FRET, CFP, utilizando un láser modulado y un

detector para el mismo, ya que se estudia el delta τ en la fluorescencia del donor. Las

imágenes confocales de los tres canales en cambio permiten tener la información espacial

para las tres proteínas, para luego hacer análisis de ubicación subcelular y co-localización.

Analizamos entonces la ocurrencia de FRET como una disminución en el tiempo de

vida media de fluorescencia del donor utilizando un enfoque novedoso, el análisis de fasor

(Digman et al. 2008). En este enfoque, la información de FLIM se representa de forma que el

decamiento de fluorescencia de cada pixel de la imagen genera un punto en un gráfico de

fasores (o phasor plot) (Fig. 12). El gráfico de fasores es un gráfico en el que se representan

las coordinadas s y g de cada fasor, un vector que representa el tiempo de vida media. Existe

un fasor por cada pixel en la imagen que representa entonces el tiempo de vida media de ese

pixel (ver Materiales y Métodos para la descripción de un fasor). Se utiliza un cursor en el

gráfico de fasores, de forma que al seleccionar los fasores que están dentro de este cursor, se

“pintan” los pixeles en la imagen que se corresponden con estos fasores (Fig. 13, en este caso

se “pintan” de violeta los pixeles que se encuentran en el cursor negro redondo del gráfico

de fasores). El fasor que finalmente se asocia con una célula es el fasor promedio (o el que

Resultados

41

engloba mas cantidad de pixeles de la imagen). La cuantificación de FRET en el gráfico de

fasores se logra al analizar el corrimiento entre las especies del donor y el donor en presencia

del aceptor. Siguiendo el método descripto en Digman et al. (2008), se determinaron los

fasores de la autofluorescencia de la célula (af) a partir de células sin transfectar y del donor

sólo (Dunq) para calcular una trayectoria de eficiencia de FRET variable (0-100%) (Fig. 12). El

enfoque del fasor no tiene ajustes o modelos.

Se comenzó por confirmar la interacción c-Fos/PI4KIIα (Fig. 13) que se había

observado por emisión sensibilizada (Fig. 9). Cómo puede verse en una célula representativa

(Fig. 13a) el cursor ubicado en 13-25% de eficiencia de FRET selecciona la gran mayoría de los

pixeles. Luego, se estableció que el dominio N-terminal de c-Fos es también el responsable

de la asociación a la enzima PI4KIIα, ya que según puede verse en la Fig. 13d, la eficiencia de

FRET para NA-CFP/PI4KIIα-YFP es estadísticamente igual a la de c-Fos / PI4KIIα. Finalmente

se estudió la interacción c-Fos / PI4KIIα en presencia de NA-myc, es decir el N-terminal de c-

Fos con un rótulo de myc que permite localizarlo al hacer una inmunocitoquímica contra este

epítope. Como puede verse en la Fig. 13c, ahora el cursor que indica una eficiencia de FRET

menor al 8% es el que engloba la mayor parte de los fasores. Según se observa en la

cuantificación de la eficiencia de FRET, la expresión por parte de la célula de esta mutante de

c-Fos es capaz de interferir o competir con la interacción entre c-Fos / PI4KIIα.

Figura 12. Diagrama representativo del enfoque del fasor y cálculos de eficiencia de FRET. Se empieza por establecer el fasor promedio del donor sólo (Dunq) y el fasor promedio de la autofluorescencia de la célula (af). Se genera una trayectoria que indica un corrimiento hacia tiempos de vida medios menores y que se corresponden con la eficiencia de FRET. Adaptada de Giral et al. (2012).

Resultados

42

Resultados

43

El análisis posterior de la fluorescencia en los tres canales aportó nueva información

(Fig. 14). La enzima PI4KIIα se observa teniendo una amplia distribución extranuclear y se

encuentra asociada a membranas de distintas organelas/vesículas en forma particulada

concordantemente con la bibliografía que la señala asociada a RE, Golgi y endosomas

(Waugh et al. 2003, Minogue et al. 2006). Por otro lado, c-Fos-CFP se observa tanto dentro

como fuera del núcleo, a diferencia de NA-myc que aparece concentrado en forma peri-

nuclear, excluido del núcleo y asociado aparentemente a membranas. Es posible que la

fusión de c-Fos a CFP genere una acumulación de esta quimera en el núcleo, que ya no se

observa con el pequeño rótulo de myc para el caso de la mutante NA. Precisamente en la

estructura donde localiza NAmyc es donde se da una triple co-localización de las proteínas en

estudio. Es de esperar que allí sea donde se produzca la competencia por la unión de PI4KIIα.

Sin embargo, en las imágenes de FLIM, la ocurrencia de FRET se da en toda la región

extranuclear, que es la que marca el cursor (Fig. 13) y no en esta región en particular. Dos

posibles explicaciones a este resultado surgen rápidamente: 1) la resolución espacial del FLIM

no es suficiente para observar una región precisa o 2) la interacción c-Fos/PI4KIIα se produce

en multiples localizaciones citoplásmicas más allá de la acumulación en alguna región

particular.

Figura 13. NA-myc compite con la unión de c-Fos salvaje con PI4KIIα. (a, b y c) Un experimento de FLIM-estrategia del fasor en células NIH 3T3 muestra la imagen de intensidad de fluorescencia, el gráfico del fasor y la localización en la imagen de FLIM (máscara violeta) de los pixeles que se encuentran dentro del área de selección (circulo negro en el gráfico de fasores). Se observan dos subconjuntos de fasores, y los correspondientes pixeles se seleccionan en la máscara de la imagen de FLIM como pixeles violetas: pixeles en el rango <8% y 13-25% de eficiencia de FRET. En a y b) el cursor de selección 13-25% de eficiencia de FRET selecciona al menos el 80% de los pixeles totales, en tanto en c) el cursor de eficiencia de FRET <8% selecciona al menos el 80% de los pixeles totales. Es importante destacar que se dispuso un umbral de intensidad que descarta los pixeles dentro del núcleo, para así excluirlos del análisis. d) Cuantificación de la eficiencia de FRET tomando un total de 15 células para cada caso. *p< 0,01 usando ANOVA y post-test de Dunnett. Nótese como NAmyc es capaz de disminuir la eficiencia de FRET y por lo tanto la interacción c-Fos/PI4KIIα.

Resultados

44

Figura 14. Localización subcelular de c-Fos, PI4KIIα y la mutante de c-Fos NA expresadas en forma exógena. Imágenes confocales de células NIH 3T3 quiescentes estimuladas por 7,5 minutos con 20% FBS. Las células habían sido transfectadas para expresar c-Fos-CFP, PI4KIIα-YFP y la mutante de c-Fos, NA-myc. Las células fueron a posteriori marcadas con un anticuerpo anti-myc y un anticuerpo secundario. Se observan tres campos representativos mostrando células triple-positivo (filas). En cada caso, se observa un recuadro que aparece aumentado y pseudo-coloreado en el recuadro inferior. En la primera columna en el recuadro puede verse la co-localización parcial de c-Fos-CFP (verde) con NAmyc (azul) para dar cyan. En la segunda columna en el recuadro puede verse la co-localización parcial de c-Fos-CFP (verde) con PI4KIIα (rojo) para dar amarillo. En la tercera columna en el recuadro puede verse la co-localización parcial de PI4KIIα (rojo) con NAmyc (azul) para dar magenta.

Resultados

45

Es interesante destacar que a partir de estas observaciones, el Dr. César Prucca

continuó con experimentos de proliferación de células tumorales en cultivo sobreexpresando

la mutante NA y observó que se limita la proliferación, dando los primeros indicios de que

esta estrategia podría funcionar para controlar la proliferación exarcerbada de las células

tumorales. En particular, se utilizaron tres sistemas: 1) células transfectadas para expresar

NAmyc, 2) líneas celulares estables que expresan NA al ser inducidas con mifepristona y 3)

profección (adición de proteínas en lípidos catiónicos a las células) de la mutante NA. En

todos los casos, la presencia de NA disminuyó la tasa de proliferación de las células

tumorales respecto de los controles (Resultados no mostrados). Las consecuencias de esto se

analizarán en la sección Discusión.

Activación de la actividad PAP por c-Fos

El PA es un intermediario clave en la síntesis de glicerofosfolípidos ya que puede ser

convertido por la enzima CDS en CDP-DAG para continuar hacia la vía de PIPs y cardiolipina o

alternativamente ser convertido por una enzima PAP a DAG, intermediario común a toda la

vía de Kennedy que dará lugar finalmente a PtdCho, PtdEth y PtdSer. Hasta aquí hemos

establecido que c-Fos logra una activación general de la vía de síntesis de PIPs mediante una

interacción física directa y la consecuente activación de CDS1 y PI4KIIα. Resultados previos de

la Dra. Marianne Renner indican que c-Fos también es capaz de incrementar la actividad PAP

en homogenatos totales de células NIH 3T3 quiescentes, derivando PA entonces hacia la vía

de Kennedy al formar DAG, intermediario común de todos los productos lipídicos de esta vía

(Fig. 15a). Esto último podría explicar los cambios en las especies marcadas radioactivamente

en la segunda onda de la transición G0/G1. La actividad PAP que se incrementa por c-Fos en

dichos homogenatos corresponde a PAP I, ya que no se detectó la formación de producto

bajo condiciones de reacción adecuadas para medir PAP II (Tesis Doctoral Marianne Renner,

2003).

La activación de PAP I dependiente de la expresión de c-Fos también había sido

descripta en células ganglionares de la retina de pollo. Al suprimir la expresión de c-Fos

mediante un ARN antisentido contra esta proteína inyectado en la retina de los animales, se

Resultados

46

cancela la activación de PAP I estimulada por luz (de Arriba Zerpa et al. 1999). Si bien los

resultados mostraron claramente que la activación PAP I es dependiente de c-Fos, dado la

complejidad del sistema experimental in vivo utilizado, resultaba muy difícil avanzar en los

estudios del mecanismo molecular involucrado en esta activación.

Dada una reciente publicación en donde se reporta la purificación de la enzima Lipin 1

(Han & Carman 2010), con actividad PAP I, se decidió poner a punto un sistema de ensayo in

vitro con componentes purificados donde analizar el rol de c-Fos sobre la actividad de esta

enzima. En el sistema empleado la membrana modelo está formada por micelas del

detergente no iónico Tritón X-100. Este detergente forma micelas de tamaños relativamente

homogéneas de un radio cercano a 6 nm para micelas hidratadas (Lichtenberg et al. 1983,

Thomas et al. 1999). A dichas micelas se les adiciona PA de forma de obtener un máximo de

10 mol% de PA, de esta manera no se alteran las características propias de las micelas de

Tritón X-100 (Lin & Carman 1990). Las micelas mixtas de Tritón X-100/PA resultantes permite

analizar la actividad PAP en un ambiente que simula la superficie de membranas celulares

(Carman et al. 1995).

El gen Lpn1 da lugar a tres transcritos distintos (Lipin 1α, Lipin 1β y Lipin 1γ) por

procesamiento alternativo del ARN. Cada una de las isoformas posee una localización

subcelular particular así como una actividad PAP diferenciada. Lipin 1α aparece

predominantemente nuclear mientras que Lipin 1β (que posee 33 residuos extra) reside

mayormente en el citoplasma/ER (Peterfy et al. 2005). En cambio, Lipin 1γ se encuentra

asociada a gotas lipídicas a través de un dominio hidrofóbico específico de esta isoforma

(Wang et al. 2011). Se escogió para el estudio a la enzima Lipin 1β dada su localización

subcelular. De aquí en adelante, Lipin 1β será simplemente Lipin 1.

Se purificó hasta homogeneidad la enzima Lipin 1 expresada recombinante en E. Coli,

y se obtuvo una banda del peso molecular aparente esperado de 110 kDa en SDS-PAGE. Se

ensayó su actividad en micelas mixtas de Tritón X-100/PA con el agregado de

concentraciones crecientes de c-Fos purificado (Fig. 15b). En este sistema purificado, el

agregado de c-Fos recombinante incrementa la actividad PAP de Lipin 1 hasta cerca del 40%

por encima del control. Este ensayo presenta claras ventajas respecto del realizado

Resultados

47

ensayando la actividad PAP en homogenatos totales, en donde existen una vasta cantidad de

proteínas celulares conjuntamente con la compleja composición de membranas biológicas.

Aunque no son directamente comparables debido, entre otros motivos, a que las condiciones

del ensayo son diferentes (Pasquare et al. 2004) se pueden establecer algunas conclusiones

parciales. Por ejemplo en el ensayo de micelas mixtas los únicos componentes presentes son

c-Fos, Lipin 1 y las membranas modelo compuestas por micelas mixtas de Tritón-100/PA, lo

cual descarta que otras proteínas puedan estar involucradas en la activación de la enzima por

c-Fos.

Figura 15. Efecto de la adición de c-Fos sobre la actividad PAP. a) Actividad PAP in vitro en homogenatos celulares totales de células NIH 3T3 quiescentes en función del agregado de c-Fos recombinante. b) Actividad PAP de Lipin 1 purificada sobre micelas mixtas de Tritón X-100/PA conteniendo 9.1 mol% y 1 mM de PA en función del agregado de c-Fos recombinante. La actividad enzimática está expresada con respecto al control (referenciado como el 100%) que contiene vehículo en lugar de c-Fos. Los resultados son el promedio ± DE de un experimento representativo hecho en triplicado de al menos tres realizados.

Resultados

48

Es decir que se confirma que el fenómeno de activación se debe exclusivamente a c-

Fos actuando sobre algún aspecto de la enzima. Intentaremos acercarnos a dicho aspecto en

próximos experimentos a partir de este sistema simplificado.

Teniendo en cuenta que c-Fos no puede homodimerizar y de que no existe en el

sistema otra proteína tipo AP-1, esta es una nueva evidencia de que c-Fos ejerce su acción en

forma monomérica y en forma no genómica. En la Discusión profundizaré el análisis de esta

última afirmación.

El BD de c-Fos sería el responsable de la actividad incrementada de Lipin 1

Para definir cuáles son los residuos aminoacídicos implicados en la activación de la

enzima, se determinó la actividad enzimática de Lipin 1 en el sistema purificado en presencia

de las mutantes empleadas en la Fig. 10c. Al igual que para el caso de la vía de PIPs (Fig. 10),

aquellas mutantes que contienen el BD son capaces de incrementar la formación de

producto mientras que aquellas que no lo poseen no (Fig. 16). El caso más claro es la

mutante ΔBD, a la que sólo le faltan los 21 residuos del mencionado dominio y que en

consecuencia no incrementa la actividad de Lipin 1. Así como el BD probó ser relevante para

la activación de la síntesis de PIPs (Fig. 10), se observa lo mismo en este caso. Sin embargo,

se trata ahora de una enzima diferente, medida en un sistema purificado sobre membranas

modelo; lo cual refuerza la importancia del BD de c-Fos en el mecanismo de activación. Otro

Figura 16. Efecto de las mutantes de deleción o puntuales de c-Fos sobre la actividad PAP de Lipin 1. Actividad PAP de Lipin 1 purificada ensayada sobre micelas mixtas de Tritón X-100/PA como en la Fig. 15b con o sin el agregado de 100 nM de la mutante indicada. Los resultados son el promedio ± DE de un experimento representativo hecho en triplicado de un total de tres realizados. *p<0,01 determinado con ANOVA de una vía con post-test de Dunnett.

Resultados

49

punto a considerar es que al tratarse de un sistema purificado, puede descartarse que el BD

esté interactuando con otra proteína o actuando como puente hacia una tercera proteína

para generar el efecto de activación, lo que indicaría de que se trata de un efecto del BD por

sí mismo. Es importante remarcar además que el agregado de la mutante R146N no

incrementa la actividad respecto del control (Fig. 16), por lo que la significancia de este

residuo no es exclusiva en la activación de la vía de síntesis de PIPs.

Fra-1, miembro de la familia Fos, a diferencia de c-Jun es capaz de activar a Lipin 1

Dado el rol del BD de c-Fos en la activación enzimática de Lipin 1, decidimos estudiar

si otras dos proteínas que forman complejos de tipo AP-1 y que comparten un dominio BD, c-

Jun y Fra-1, también promueven la activación. Las proteínas AP-1 poseen un dominio BD,

responsable de la asociación al ADN, junto a un dominio llamado “cierre de leucinas”,

responsable de la heterodimerización, que en conjunto se denomina “bZip”. La Fig. 17

muestra un esquema de las tres onco-proteínas con sus dominios bZip correspondientes,

junto con un alineamiento de las secuencias de sus BD. Fra-1 es un miembro de la familia Fos

que posee un BD altamente conservado con respecto a c-Fos aunque la homología total de

las dos proteínas es inferior al 44%. Por el contrario, c-Jun tiene una secuencia muy

divergente, y esa divergencia de secuencia incluye al domino bZip en su totalidad. Cuando se

adicionó Fra-1 obtenido en forma recombinante en lugar de c-Fos al sistema micelar, se

incrementó la actividad PAP de Lipin 1 en una medida similar al aumento provocado por el

agregado de c-Fos (Fig. 17c). La similitud de ambos BD refuerza la idea de la participación de

este dominio no solo en su unión secuencia-especifica al ADN sino también en la activación

enzimática. En tanto c-Jun, que tiene un BD con baja homología respecto de las otras dos

proteínas (e incluso una densidad de carga inferior), no promueve un incremento en la

actividad de Lipin 1 cuando es adicionada al sistema purificado en lugar de c-Fos (Fig. 17c).

Resultados

50

Lipin 1 interacciona físicamente con c-Fos y Fra-1 pero no con c-Jun

Hasta aquí, hemos establecido que c-Fos incrementa la actividad Lipin 1 a través de su

dominio BD, en homogenatos totales pero también en un sistema purificado diseñado

específicamente para ensayar la actividad de esta enzima. Esto planteó el interrogante

respecto a si Lipin 1 y c-Fos participan en una asociación física como forma de alcanzar el

estado activado de la enzima. Para responderlo, se analizó por microscopía FRET por emisión

sensibilizada la posible interacción utilizando ahora el par de FRET mTurquoise2/ SYFP2. En la

bibliografía se encuentran descriptas las mutaciones puntuales de CFP y YFP que resultan en

proteínas fluorescentes que resultan más brillantes y resistentes al fotoblanqueo (Kremers et

al. 2006, Goedhart et al. 2012), denominadas mTurquoise2 y SYFP2, y que son entonces

mejores herramientas para microscopía de fluorescencia.

Figura 17. Efecto de c-Fos, Fra-1 y c-Jun en la actividad PAP de Lipin 1. a) Representación esquemática de Fra-1, c-Fos y c-Jun. Se indica en negro el BD y en gris el cierre de leucinas de las tres proteínas que se encuentran alineadas. El bZip se conforma por el BD y el cierre de leucinas. El cierre de leucinas permite la dimerización para formar dímeros AP-1 activos y el BD funciona asociándose a secuencias blanco de ADN pero también activando a enzimas blanco. b) BDs de las tres proto-oncoproteínas. La línea indica “identidad” y los dos puntos indican una substitución conservativa. Notese la alta homología entre los BDs de Fra-1 y c-Fos pero no así con el BD de c-Jun. c) Actividad PAP de Lipin 1 purificada sobre micelas mixtas de Tritón X-100/PA como se indica en la leyenda de la Fig. 15b con el agregado de c-Fos o Fra-1 o c-Jun purificados.

Resultados

51

Se fusionaron c-Fos, c-Jun o Fra-1 a la proteína fluorescente mTurquoise2 y se estudió

una posible interacción con Lipin 1-SYFP2 en células NIH 3T3 quiescentes luego de ser

estimuladas durante 1 hora con 20% FBS en presencia de cicloheximida, un inhibidor de la

síntesis de proteínas a nivel ribosomal. Se eligió este tiempo de estímulo porque así como a

7,5 minutos post-estímulo se produce el pico en la síntesis de PIPs, a 1 hora post-estímulo el

análisis indica que los lípidos marcados son mayoritariamente los principales constituyentes

de membrana (Bussolino et al. 2001). Por lo tanto, al estimular las células por 1 hora, nos

situamos en las condiciones a priori más favorables para observar el fenómeno de

interacción. Como un control positivo, se utilizó c-Fos/ PI4KIIα, una interacción que ya se

había establecido (Figuras 9 y 13), si bien en ese caso la células habían sido estimuladas

durante 7,5 minutos. Se encontró que tanto c-Fos como Fra-1 interaccionan físicamente con

Lipin 1 mientras que c-Jun no lo hace (Fig. 18); lo cual correlaciona con nuestra hipótesis de

que las onco-proteínas que activan a la enzima son capaces de interaccionar con ella.

La interacción aparece localizada fuera del núcleo, si bien tanto c-Fos como Lipin 1

localizan también dentro del mismo. Las enzimas analizadas en la vía de síntesis de PIPs son

extra-nucleares, en cambio según bibliografía, Lipin 1 se ubica tanto en RE como en núcleo,

donde cumple funciones diferentes. Su actividad PAP 1 se encuentra asociada al RE mientras

que su función como co-activador transcripcional se produce en el núcleo (Siniossoglou

2013). c-Fos ejerce su actividad genómica en el núcleo, mediante su actividad como factor de

transcripción de tipo AP-1, pero también de manera independiente a esta al incrementar la

síntesis de PtdInsP2 y promoviendo de esta forma cambios transcripcionales globales (Ferrero

et al. 2014). Sin embargo, c-Fos ejerce su efecto no genómico principalmente en el

citoplasma, asociado al RE (Caputto et al. 2014). Según se observa en la Fig. 18, la interacción

c-Fos/Lipin 1 se produce peri-nuclearmente, probablemente asociado al RE. Por lo tanto, si

bien las dos proteínas localizan en ambos compartimientos, la asociación y

consecuentemente la activación parecen ocurrir únicamente a nivel del RE.

Resultados

52

Figura 18. Microscopia FRET revela la interacción entre c-Fos/Lipin 1 y Fra-1/Lipin 1, pero no entre c-Jun/Lipin 1. Donor de FRET, mTurquoise2 (izquierda), Aceptor de FRET, SYFP2 (centro) e imagen de Eficiencia de FRET (derecha). Se co-transfectaron las células para que expresen c-Fos, Fra-1 o c-Jun fusionadas a mTurquoise2 junto con Lipin 1-SYFP2 y estas fueron examinadas por microscopia confocal. Se muestran imágenes representativas de cada uno de los casos. Como control negativo se utilizó mTurquoise2/Lipin 1 (fila superior) y como control positivo c-Fos-mTurqoise2/PI4KIIα (segunda fila). La imagen de Eficiencia de FRET fue generada con el programa ImageJ, usando una escala pseudocoloreada que representa la eficiencia en una escala que incrementa de azul a blanco, como se muestra en la barra de la esquina inferior derecha. . El valor máximo (pixeles blancos) corresponde al control positivo SYFP2-mTurquoise2, una quimera de ambas proteínas fluorescentes unidas por un segmento flexible, cuya máxima eficiencia de FRET se utiliza para normalizar la escala (no mostrado). b) Eficiencia promedio de FRET ± DE. Los resultados, obtenidos tras analizar 25 células en cada caso, provienen de un experimento representativo de un total de al menos tres. *p<0,001 determinado por ANOVA de una vía con post-test de Dunnett. La barra blanca en la esquina superior izquierda de a) representa 10 µm.

Resultados

53

c-Fos modifica la actividad de Lipin 1 al incrementar su capacidad catalítica

Considerando que Lipin 1 interacciona con c-Fos y es activada por esta proteína,

decidimos examinar la cinética de su activación en el sistema simplificado como estrategia

para obtener información acerca del mecanismo molecular de esta activación. La capacidad

catalítica incrementada de Lipin 1 en presencia de c-Fos puede deberse a un incremento en

la capacidad para unirse a membranas, un incremento en la eficiencia catalítica de la enzima

(eficiencia del sitio activo) o una combinación de ambos factores. Para resolver este

interrogante, se realizaron ensayos enzimáticos utilizando micelas mixtas de Tritón X-100/PA

(Fig. 19).

Como se mencionó anteriormente, Lipin 1 es una enzima soluble que primero debe

asociarse a membranas para, una vez unida, buscar sobre la superficie a su sustrato PA para

así catalizar la reacción como fosfatasa. Este proceso depende entonces de interacciones en

solución con las membranas y de interacciones de superficie con los lípidos presentes sobre

la membrana. Un modelo cinético que describe esta situación ha sido formulado y se

denomina “modelo de dilución de superficie” (Carman et al. 1995). Usando este modelo, se

realizaron dos tipos de experimentos: i) manteniendo la concentración de superficie de PA

constante a 9.1 mol% mientras se incrementa su concentración molar y ii) manteniendo la

concentración molar de PA fija a 1 mM mientras se modifica su concentración de superficie

(o mol%).

Los experimentos de tipo i) permiten determinar la primera etapa en donde la enzima

que se encuentra soluble se une a las membranas modelo en una transición desde la solución

hacia la superficie para formar el complejo enzima-micela mixta. Esta asociación depende de

la concentración de solución (o molar) del lípido (Lin & Carman 1990). Debido a que la

concentración de superficie de PA está fija, al incrementar la concentración molar de PA es

necesario incrementar la concentración molar de Tritón X-100 en la misma proporción. En

consecuencia, se está incrementando el número total de micelas, que además tienen la

misma composición. Los experimentos de tipo ii) en cambio permiten el estudio de cómo la

enzima unida a la membrana modelo encuentra PA en la superficie de esta membrana para

poder llevar a cabo la reacción enzimática.

Resultados

54

Esta etapa depende de la concentración de superficie de PA. En este caso, como la

concentración molar de PA está fija, se incrementa la concentración molar de Tritón X-100

para así diluir la concentración de superficie de PA. En la práctica, se está incrementando

fuertemente el número de micelas, que tienen en su superficie progresivamente menos

PA (Carman et al. 1995, Han & Carman 2010). Expresado en otra manera, podríamos decir

que la enzima está “viendo” menor cantidad de PA sobre la superficie de la micela. En ambos

tipos de experimentos, la concentración de superficie de c-Fos se mantuvo constante a 9,09

x10-6 mol%, de forma que el cociente entre el contenido molar de c-Fos y la concentración

molar total de lípidos se mantenga constante. En otras palabras, el cociente entre el número

de moléculas de c-Fos y el número total de micelas mixtas presentes en el ensayo se

conserva. Cuando se examinó cada punto experimental, encontramos que el porcentaje de

Figura 19. Dependencia del agregado de c-Fos en la actividad PAP de Lipin 1 con en la concentración molar y de superficie de PA. La actividad PAP de Lipin 1 se midió en función de la concentración molar de PA (a) y de la concentración de superficie de PA (b) con o sin el agregado de c-Fos. Para los experimentos en a), la relación molar de PA a Tritón X-100 fue mantenida en 9.1 mol%. Para los experimentos en b), la concentración molar de PA se mantuvo en 1 mM, y la concentración de Tritón X-100 fue variada para obtener las concentraciones de superficie indicadas. En ambos tipos de experimentos la concentración de c-Fos se mantuvo constante en 9,09x10-6 mol%, lo que significa que el cociente entre c-Fos a lípido total se mantiene constante. Esta concentración es la misma que en la Fig. b en 100 nM de c-Fos, donde se obtuvo la mayor activación.

Resultados

55

activación con respecto al control es constante en alrededor del 40% en todas las

condiciones ensayadas (Fig. 19).

Bajo las condiciones de tipo i), se observó una cinética de tipo Michaelis-Menten; en

tanto en los experimentos de tipo ii) se observó un comportamiento cinético cooperativo de

tipo alostérico (ecuación de Hill). Utilizando regresiones no lineales utilizando estos modelos,

fue posible determinar los parámetros cinéticos a partir de los datos de la Fig. 19, y se

encuentran mostrados en la Tabla 2. Se encontró en los experimentos de tipo i) que, a pesar

de que la constante kcat se incrementa cerca del 50% (Fig. 19a), c-Fos no promovió una

unión más eficiente de Lipin 1 a las membranas modelo, dado que las diferencias en Ks no

fueron estadísticamente significativas (Tabla 2). El parámetro Ks es una medida de la afinidad

de la enzima por las membranas, es decir una medida de las interacciones de la enzima en

solución con las micelas. Análisis de los datos a partir de la ecuación de Hill de los

experimentos de tipo ii) se encontró que el parámetro Km no es modificado

significativamente frente a la adición de c-Fos (Fig. 19b). El parámetro Km puede ser

considerado como la afinidad de enzima por su sustrato. La probada cooperatividad de Lipin

1 (Han & Carman 2010), reflejada en el número de Hill, no se ve alterada tampoco. En

cambio, la kcat de la reacción se ve positivamente modificada por c-Fos, e incrementa

alrededor de 40%. Los experimentos realizados revelaron que la eficiencia catalítica de Lipin

1 es modificada por c-Fos sin que ello implique alterar la asociación de Lipin a las micelas,

reflejada en Ks, o su interacción específica con PA, reflejada en Km.

Los resultados son concordantes con otros obtenidos previamente para otras enzimas

Tabla 2. Parámetros cinéticos de Lipin 1 empleando micelas mixtas de Triton X-100/PA con o sin el agregado de c-Fos recombinante, calculados con el programa GraphPad Prism 5 a partir de los datos de la Fig. 19a y b. Se usaron las ecuaciónes de Michelis-Menten o de Hill, respectivamente, para ajustar los datos.

Constantes cinéticas con respecto a la concentración molar de PA

Constantes cinéticas con respecto a la concentración de superficie de PA

Ks (mM) kcat(s-1) Km (mol%) kcat(s

-1) No. Hill

Control 0,22±0,03 20,3±0,7 4,7±0,6 28,7±3,0 2,0±0,3

+c-Fos 0,26±0,04 29,9±1,6 4,4±0,5 39,4±2,5 2,2±0,2

Resultados

56

activadas por c-Fos y que muestran que se produce un incremento en la capacidad catalítica

sin modificar la afinidad por el sustrato. Pero además aquí la utilización del sistema

purificado permite su análisis en un sistema muy simple en donde es posible establecer

conclusiones en forma directa.

En los últimos años, múltiples reportes han descripto nuevas proteínas que

interaccionan con Lipin 1, alterando su distribución subcelular a través de modificaciones

post-traduccionales y/o al asociarse directamente con la misma, regulando así sus funciones

celulares (Huffman et al. 2002, Harris et al. 2007, Grimsey et al. 2008, Liu & Gerace 2009). c-

Fos interacciona con Lipin 1 (Fig. 18), pero la co-transfección con c-Fos no cambia la

localización subcelular de Lipin 1 respecto a la transfección sólo de la enzima (Resultados no

mostrados), lo cual indicaría que c-Fos no cambia la localización de la enzima sino que logra

activarla donde esta localiza. Asimismo, c-Fos tampoco modifica su afinidad por la membrana

modelo estudiada, ya que no cambia los parámetros Ks o Km de la enzima. Hasta donde llega

nuestro conocimiento, este es el primer estudio que reporta una proteína que interacciona

con Lipin 1 que modifica su actividad directamente, y no su localización subcelular o afinidad

por membranas, aunque el mecanismo preciso de esta activación no está esclarecido

completamente.

El dominio N-terminal de c-Fos es responsable de la asociación a Lipin 1

Los experimentos en la Fig. 16 nos indican que el BD de c-Fos es el responsable de la

activación promovida sobre Lipin 1. En cambio, el domino responsable de la asociación a

Lipin 1 es desconocido en este punto. Para explorar este interrogante, se utilizaron las

diferentes mutantes de deleción que se esquematizaron previamente en la Fig. 10,

fusionadas a mTurqouise2 para estudiar una posible interacción con Lipin 1 mediante

microscopía FRET. Las mutantes NA (aa: 1-138, sin el BD) y ΔBD (solo le faltan los aa: 139-

160) mantienen la asociación a Lipin 1, descartando de este modo que el BD sea el

responsable de esta. La mutante LZC, que comprende el C-terminal de c-Fos, no se une a la

enzima, sugiriendo que esta porción no participa en el fenómeno. La región mínima

compartida por las mutantes capaces de unirse a Lipin 1 es nuevamente el N-terminal de c-

Fos.

Resultados

57

Figura 20. El dominio N-terminal es el responsable de la asociación de c-Fos a la enzima Lipin 1. Donor de FRET, mTurquoise2 (izquierda), Aceptor de FRET, SYFP2 (centro) e imagen de Eficiencia de FRET (derecha). Se co-transfectaron las células para que expresen a c-Fos o alguna de sus mutantes fusionadas a mTurquoise2 junto con Lipin 1-SYFP2 y estas fueron examinadas por microscopía confocal. Se muestran imágenes representativas de cada uno de los casos. Se utilizó como control negativo mTurquoise2/Lipin 1 (no mostrado). La imagen de Eficiencia de FRET fue generada con el programa ImageJ, usando una escala pseudocoloreada que representa la eficiencia en una escala que incrementa de azul a blanco, como se muestra en la barra de la esquina inferior derecha. El valor máximo (pixeles blancos) corresponde al control positivo SYFP2-mTurquoise2, una quimera de ambas proteínas fluorescentes unidas por un segmento flexible, cuya máxima eficiencia de FRET se utiliza para normalizar la escala (no mostrado). b) Eficiencia promedio de FRET ± DE. Resultados obtenidos tras analizar 25 células en cada caso son de un experimento representativo de un total de al menos tres. *p<0,001 determinado por ANOVA de una vía con post-test de Dunnett. La barra blanca en la esquina superior izquierda de a) representa 10 µm.

Resultados

58

La región aa: 47-90 dentro del N-terminal de c-Fos estaría involucrado en la asociación Lipin

1/c-Fos

Dado que la región N-terminal de c-Fos se asocia pero no activa a Lipin 1 (Figuras 20 y

16, respectivamente), decidimos estudiar la porción mínima de esta región que conserva la

capacidad para unirse a esta enzima. El Dr. César Prucca gentilmente cedió las mutantes

conteniendo diferentes porciones de los primeros 138 residuos de c-Fos fusionadas a la

proteína fluorescente mTurquoise2 y que utilizamos para establecer la región mínima

necesaria para la asociación. Estas mutantes se encuentran representadas en la Fig. 21c. Las

tres mutantes pequeñas, de 46 residuos de longitud (NA 1-46, NA 47-92, NA 93-138), no

mostraron asociación a Lipin 1 (Fig. 21b). Sorpresivamente, tanto los primeros 92 residuos

como la región aa: 47-138 alcanzaron eficiencias de FRET comparables con la de c-Fos

salvaje. Una posible explicación a este resultado es que la región aa: 47-92 (la región mínima

compartida por las dos mutantes capaces de interaccionar con Lipin 1) esté involucrada en el

fenómeno de asociación pero que esta región no sea suficiente por sí misma para asegurar la

unión a la enzima. Otra explicación posible es que la región aa: 47-92 sea suficiente para la

asociación, pero el impedimento estérico debido al gran volumen de la proteína fluorescente

que se encuentra a continuación del péptido de solo 46 residuos de longitud impida la

asociación a la enzima. El perfil hidrofóbico de c-Fos muestra dos segmentos que poseen los

valores más altos de hidrofobicidad de toda la proteína entre los residuos 50-68 y 76-86 (Ver

Discusión, Fig. 23). La hidrofobicidad parece tener un rol de importante para la asociación.

Dado que tanto los primeros como los últimos 46 residuos (aa: 1-46 y aa: 93-138,

respectivamente) son también requeridos para la asociación, podría ser que estos residuos

actúan simplemente como espaciadores o conectores flexibles que permiten aliviar la

tensión estérica entre las secciones hidrofóbicas asociadas a la enzima y la proteína

fluorescente citoplásmica. Alternativamente, estas regiones de c-Fos (aa: 1-46 y aa: 93-138)

podrían poseer características particulares, lo que será discutido en la próxima sección

conjuntamente con el hecho de que todas las enzimas activadas interactúan específicamente

con la región N-terminal.

Resultados

59

Figura 21. Microscopía FRET revela la importancia de la región de c-Fos aa: 47-93 para la asociación con Lipin 1. a) Donor de FRET, mTurquoise2 (izquierda), Aceptor de FRET, SYFP2 (centro) e imagen de Eficiencia de FRET (derecha). Se co-transfectaron las células para que expresen a las mutantes pequeñas de la región N-terminal de c-Fos fusionadas a mTurquoise2 junto con Lipin 1-SYFP2 y estas fueron examinadas por microscopía confocal. Se muestran imágenes representativas de cada uno de los casos. Se utilizó como control negativo mTurquoise2/Lipin 1 (no mostrado). La imagen de Eficiencia de FRET fue generada con el programa ImageJ, usando una escala pseudocoloreada que representa la eficiencia en una escala que incrementa de azul a blanco, como se muestra en la barra de la esquina inferior derecha. El valor máximo (pixeles blancos) corresponde al control positivo SYFP2-mTurquoise2, una quimera de ambas proteínas fluorescentes unidas por un segmento flexible, cuya máxima eficiencia de FRET se utiliza para normalizar la escala (no mostrado). La barra blanca en la esquina superior izquierda de a) representa 10 µm b) Eficiencia promedio de FRET ± DE. Resultados obtenidos tras analizar 25 células en cada caso son de un experimento representativo de un total de al menos tres. *p<0,001 determinado por ANOVA de una vía con post-test de Dunnett. c) Representación esquemática de la región N-terminal, que incluye una sección altamente hidrofóbica (aa: 47-92, representado con un patrón ondulado), y de las distintas mutantes pequeñas del N-terminal empleadas en a).

CAPITULO IV

DISCUSIÓN

Discusión

61

La activación de la síntesis de fosfolípidos por c-Fos es un fenómeno no genómico

La activación de la síntesis de fosfolípidos podría ser en principio una consecuencia de

la actividad de c-Fos como factor de transcripción tipo AP-1, al incrementar por ejemplo la

expresión de enzimas de síntesis de los mismos. Los primeros experimentos de marcación de

fosfolípidos totales en células de la retina de pollo indicaron la dependencia de la expresión

de c-Fos para el incremento en el marcado radioactivo en respuesta a la luz (Guido et al.

1996, Bussolino et al. 1998). Es importante discutir en este punto las evidencias

experimentales encontradas fundamentalmente en esta Tesis y en otros trabajos del grupo

que muestran como c-Fos realiza esta función no canónica en un nivel no genómico.

La primera evidencia directa de esto fueron los experimentos realizados in vitro en los

cuales se midió la incorporación de 32P desde 32P-ATP a fosfolípidos totales (Gil et al. 2004) o

en particular a PtdInsP y PtdInsP2 (esta Tesis, Fig. 10) utilizando como fuente de enzima

homogenatos totales u homogenatos libres de la fracción nuclear de células quiescentes que

contienen niveles despreciables de c-Fos endógeno. En estos experimentos, se adicionó en

forma exógena 32P-γ-ATP junto con c-Fos purificado, para que luego las enzimas presentes en

el homogenato celular incorporaran fosfato radioactivo a fosfolípidos, que se extrajeron y

cuantificaron. El agregado de c-Fos recombinante incrementa el marcado radioactivo de

fosfolípidos in vitro alrededor del 100% por encima del control. Lo que es clave en los

experimentos de marcación radioactiva in vitro es que, en células quiescentes, los niveles

endógenos de los otros miembros AP-1 tampoco son detectables. c-Fos es incapaz de

estimular la transcripción en ausencia de c-Jun (Chiu et al. 1988), lo que descarta una

activación de la síntesis lipídica a partir de mecanismos regulatorios genómicos en este

sistema. Por otro lado, c-Jun purificado ensayado en los experimentos antes mencionados no

tuvo un efecto en la tasa de síntesis de fosfolípidos (Gil et al. 2004) o en particular en la

activación de Lipin 1 en un sistema purificado (Fig. 17), apuntando hacia la especificidad del

fenómeno de activación.

La segunda línea de evidencia de que el efecto que estudiamos se produce de manera

no genómica se obtuvo a partir de la utilización de mutantes de deleción de c-Fos en los

Discusión

62

mencionados ensayos de marcación de fosfolípidos in vitro, donde el ejemplo más claro

surge de la mutante NB (aa: 1-160). Esta mutante es capaz de activar la síntesis de

fosfolípidos y en particular de PIPs (Fig. 10), así como de activar a Lipin 1 (Fig. 16) a niveles

comparables con la proteína c-Fos completa. Sin embargo, la mutante NB no contiene

dominio de cierre de leucinas, indispensable para la heterodimerización y consecuente

formación de un dímero AP-1. Dado entonces que NB no puede actuar como factor de

transcripción, pero aun así activa la síntesis de fosfolípidos, ello confirma la función no

genómica de c-Fos. Más aún, la mutante NB ha sido capaz de sostener in vivo la

diferenciación o la proliferación celular en células deprivadas de factores de crecimiento (Gil

et al. 2004, Gil et al. 2012). La utilización de mutantes ha establecido también que la función

anti-apoptótica de c-Jun, antagonizando a MEKK en células PC12, está dada de forma no

genómica ya que no depende de su dimerización o unión al ADN (Leppa et al. 2001), lo cual

indica que las funciones no genómicas de los miembros AP-1 no son exclusivas de c-Fos.

La confirmación última de que la activación de la síntesis lipídica se trata de un efecto

independiente de la transcripción ha sido descripta en esta Tesis doctoral, en el ensayo de la

actividad PAP de Lipin 1 en micelas mixtas. En este sistema altamente simplificado, sin más

componentes que las membranas modelo, Lipin 1 y la propia onco-proteína, c-Fos es capaz

por sí mismo de generar un efecto sobre la actividad catalítica de la enzima (Fig. 15b). En

definitiva, las distintas líneas de evidencia convergen en establecer que este fenómeno de

activación es claramente no genómico.

c-Fos es capaz de activar tanto a CDS1 como a Lipin 1

Al comenzar esta Tesis, se había determinado previamente que c-Fos es capaz de

incrementar el marcado radioactivo de todas las especies de fosfolípidos analizadas

(Bussolino et al. 2001, Gil et al. 2004), si bien los pasos metabólicos particulares permanecían

sin examinar. Para profundizar entonces sobre las etapas metabólicas que pudieran ser

afectadas por c-Fos utilizamos como modelo de estudio la inducción de células quiescentes a

re-ingresar al ciclo de celular mediante el agregado de FBS al 20% al medio de cultivo, lo cual

dispara una serie de eventos celulares que estudiamos en la ventana de la primera hora post-

Discusión

63

estímulo. En particular, estudiamos el marcado radioactivo de las dos ondas consecutivas de

síntesis de lípidos en esta ventana temporal. Estas ondas poseen características distintas ya

que mientras que en la primera se marcan fundamentalmente PIPs en la segunda, en cambio,

se marcan mayoritariamente los principales constituyentes de membrana, como por ejemplo

PtdEth (Bussolino et al. 2001). En este sentido, en la primera parte de esta Tesis se estableció

que para incrementar el marcado de PIPs c-Fos actúa sobre la enzima CDS1 (la primera de la

vía) y sobre PI4KIIα (que cataliza el tercer paso metabólico). El fenómeno se probó de

relevancia biológica, ya que al deprimir la expresión de c-Fos, se inhibe el incremento en el

marcado (Fig. 3). Más aún, se estableció que las mencionadas enzimas están necesariamente

implicadas en el proceso, ya que al deprimir la expresión de CDS1 o de PI4KIIα se anulaba el

efecto de activación de la síntesis al estimular a las células (Fig. 7).

Claramente, CDS1 tiene un rol destacado en la síntesis de fosfolípidos y en la

regulación de este metabolismo. La enzima CDS de Drosophila (que posee un único gen para

la enzima) ha sido descripta como clave para coordinar el crecimiento celular y el acúmulo de

grasas ya que al aumentar la disponibilidad de PtdIns, incrementa la actividad de la vía de la

insulina, lo que induce el crecimiento celular (Liu et al. 2014). La vía de la insulina es una vía

de señalización conservada desde mamíferos hasta Drosophila que depende del suministro

de PtdIns y regula numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el metabolismo lipídico

(Teleman 2010). Las moscas que son mutantes nulos para CDS poseen un menor tamaño de

células y órganos conjuntamente con un acumulamiento de lípidos neutros (Liu et al. 2014).

Esto viene de la mano de otros reportes, donde en el mencionado organismo se involucra a

CDS en vías de señalización celular vinculadas a PIPs (Wu et al. 1995) o incluso en células de

mamífero donde afecta las respuestas de cascadas de señalización inducidas por citoquinas

pro-inflamatorias específicas (Weeks et al. 1997). Por otro lado, numerosos estudios

genéticos y bioquímicos llevados a cabo en levaduras y células de mamíferos señalan a Lipin

1 como un regulador crucial para el metabolismo lipídico y la fisiología celular (Csaki & Reue

2010, Harris & Finck 2011, Pascual & Carman 2013, Siniossoglou 2013). Por ejemplo, un

estudio implicó a Lipin 1 en la síntesis de fosfolípidos que acompaña la expansión de

membranas del RE en la diferenciación de linfocitos B (Fagone et al. 2007).

Discusión

64

Está claro que la regulación de la actividad de Lipin y CDS determina la distribución

del esqueleto de glicerol entre las dos ramas de las vías metabólicas (Fig.22). Por lo tanto,

podrían determinar el destino de los intermediarios lipídicos, por un lado hacia la

formación de PIPs (hacia vías de señalización mediadas por estos lípidos), o en cambio a la

formación de TAG (como forma de almacenamiento de energía) y fosfolípidos de membrana

como PtdCho o PtdEth necesarios para la expansión de membranas celulares. Hemos

mostrado en los Resultados que c-Fos es capaz de activar tanto la conversión de PA a CDP-

Figura 22. Esquema simplificado de las vías de síntesis de novo de glicerofosfolípidos. El glicerol-3-P (G3P) es convertido a través de una serie de acilaciones con ácidos grasos en PA (no mostrado). PA es un intermediario clave que es usado, al ser convertido en DAG por las Lipinas, para la síntesis de los principales fosfolípidos PtdCho, PtdEth y PtdSer (vía de Kennedy) y en consecuencia la biogénesis de membrana. EL DAG producido también es utilizado en la síntesis de triacilglicerol, lípido neutro de reserva por excelencia. En la otra rama, PA es convertido en CDP-DAG por CDS, que dará finalmente PIPs, involucrados en señalización celular. Adaptado de Siniossoglou 2013.

Discusión

65

DAG (activando CDS1, hacia la vía de PIPs, Figs. 4,5 y 6) como a DAG (activando Lipin 1, hacia

la vía de Kennedy, Figs. 15 y 16). Los cambios en la activación de estas dos enzimas pueden

en principio explicar las diferencias en las especies marcadas en las dos ondas. No existe una

manera fácil de determinar cómo c-Fos podría incrementar una etapa metabólica en favor de

la otra para generar un flujo metabólico hacia una vía en particular. No está claro como c-Fos

podría generar este efecto, pero sí que la interrelación entre CDS, Lipin 1 y c-Fos está

involucrada en el fenómeno, según se desprende de las vías de síntesis de fosfolípidos

presentados en la Fig. 22.

¿Se activa primero una enzima y luego otra? Un punto que quedó pendiente fue el

de establecer la dinámica de la activación mediante FRET en células estimuladas,

siguiéndolas en el tiempo. ¿Es una cuestión temporal, de localización o una combinación de

ambas? Mientras que CDS es una proteína integral de membrana, Lipin 1 debe translocar

hacia las membranas para catalizar la reacción enzimática. Ello ya impone una limitación

temporal. Por otro lado, en los ensayos in vitro, CDS requiere menores concentraciones de c-

Fos respecto de Lipin 1 para activarse (Figs. 4 y 15a, respectivamente). Si bien ambos ensayos

no son directamente comparables, por las condiciones diferentes del ensayo, podrían estar

indicando una tendencia. Si la afinidad de CDS por c-Fos fuera mayor que la de Lipin, se

podría activar a menores concentraciones de c-Fos, y por lo tanto a tiempos cortos post-

estímulo cuando la concentración de c-Fos es menor. A la hora post-estimulo, la mayor

concentración de c-Fos permitiría la activación de Lipin. Esta es sólo una de las posibles

explicaciones, teniendo en cuenta la cuestión temporal y de afinidad, sin embargo, hay

muchas otras consideraciones a tener en cuenta y que seguramente serán interesantes

explorar.

¿Para qué son necesarios los lípidos cuya síntesis c-Fos incrementa?

Es demasiado simplista a esta altura pensar que el aumento en la síntesis lipídica

sólo puede ser para generar nueva membrana que directamente se utilice para la expansión

de membranas necesaria para el crecimiento celular. Si bien el ensayo in vitro de marcación

de fosfolípidos a partir de 32P-γ-ATP no distingue entre síntesis de novo o recambio parcial,

Discusión

66

también se hicieron experimentos in vivo utilizando como precursor 3H-glicerol y analizando

los fosfolípidos marcados, y este ensayo da cuenta exclusivamente de la síntesis de novo, en

donde se mostró la dependencia de la expresión de c-Fos para su activación (de Arriba Zerpa

et al. 1999). Entonces c-Fos activa la síntesis de novo de los principales fosfolípidos, pero esto

no implica la producción neta de membranas. Por ejemplo, las altas tasas de síntesis de

PtdCho en células en G1 del ciclo celular se ven acompañadas de altas tasas de degradación

del mencionado lípido mediado por la fosfolipasa independiente de calcio A2 (iPLA2)

(Manguikian & Barbour 2004) y la esterasa diana de neuropatía (Zaccheo et al. 2004, Glynn

2005), generando un balance durante esta etapa. La acumulación neta de PtdCho se da al

llegar a la fase S, donde una reducción en el recambio lo permite (Jackowski 1994). Sin

embargo, esta fase de alto recambio es necesaria para la proliferación celular. De hecho, la

inhibición de iPLA2 en células de cáncer de ovario produce un arresto de la proliferación en la

fase S, que puede ser rescatado con el agregado exógeno de ácido lisofosfatídico (LPA),

producto de la degradación de PtdCho por esta enzima (Song et al. 2007). LPA ha probado

tener funciones de crecimiento y supervivencia en este tipo particular de células (Fang et al.

2002).

En el caso de c-Fos, hemos probado cómo aumenta la síntesis de fosfolípidos

mediando etapas claves. Pero, ¿podría c-Fos también incrementar la actividad de

fosfolipasas? Evidencias encontradas en monocapas como modelo de membranas indican

que c-Fos modula la actividad de tres clases de fosfolipasas (Borioli et al. 2002), al menos en

este sistema simplificado. Interesantemente, varios lípidos bioactivos que se producen

durante el metabolismo de glicerofosfolípidos como PA, DAG, PtdIns(4,5)P2 y ácido

araquidónico, pueden regular vías de señalización celular (Oude Weernink et al. 2007). El

metabolismo lipídico es muy complejo y aún no se entiende acabadamente como funciona

pero claramente la regulación del mismo tiene consecuencias sobre la crecimiento celular,

proliferación, supervivencia y apoptosis al actuar sobre vías de señalización (Huang & Freter

2015) y que van más allá de la simple acumulación de membrana. A pesar de no comprender

todavía el fin último de los fosfolípidos cuya síntesis c-Fos induce, las consecuencias

celulares de c-Fos han sido puestas de manifiesto en numerosos estudios, ya que al deprimir

Discusión

67

la expresión de c-Fos se reduce el marcado radiactivo de fosfolípidos y ello conlleva a la

detención de la diferenciación (Gil et al. 2004) y de la proliferación (Gil et al. 2012). Hemos

estudiado la forma en que c-Fos consigue la activación de la síntesis, pero queda abierta la

pregunta de los mecanismos que estos lípidos desencadenan para sostener finalmente la

proliferación.

Un mecanismo compartido para la activación de la síntesis

Un aspecto que emerge del cuerpo de resultados de esta Tesis es el mecanismo con el

que c-Fos activa en forma general la síntesis de glicerofosfo- y glico- lípidos. En todos los

casos estudiados, la activación de enzimas particulares tiene puntos en común: un aumento

en la Vmax sin modificar el Km. Este fue el caso para CDS1, PI4KIIα, Lipin 1, pero también para

glucosilceramida sintasa (GlcCerS), la primera enzima en la vía de síntesis de glicolípidos

(Crespo et al. 2008). Mientras que algunas enzimas son activadas, otras no lo son, y en todos

los casos estudiados, la activación involucra una asociación física directa entre c-Fos y la

enzima activada. Los resultados obtenidos sostienen la existencia de un mecanismo común

para la activación de la síntesis de lípidos mediada por la proto-oncoproteína c-Fos.

El mecanismo común comienza por la localización subcelular de los participantes del

fenómeno en estudio, así como c-Fos se encuentra asociado a las membranas del RE

(Bussolino et al. 2001), también lo están las enzimas que es capaz de activar. Es para destacar

que el RE es la principal organela donde transcurre la biosíntesis de lípidos (Bell et al. 1981,

van Meer et al. 2008) y aparece como un sitio de activación en común para todas las

enzimas con las que c-Fos interactúa. Está claro que CDS1 localiza en el RE (Inglis-Broadgate

et al. 2005), así como Lipin 1 (Peterfy et al. 2005, Grimsey et al. 2008). En cambio la enzima

PI4KIIα se encuentra en múltiples compartimientos, se localiza en el trans-Golgi (Wang et al.

2003), membranas del sistema endosomal (Salazar et al. 2005) así como intermediarios de

tráfico especializados como por ejemplo vesículas sinápticas (Guo et al. 2003). Sin embargo,

un reporte muestra sólida evidencia bioquímica de que existe una fracción minoritaria pero

muy activa enzimáticamente que localiza en el RE (Waugh et al. 2003), donde podría ser

activada por c-Fos (Clayton et al. 2013). En esta última revisión, se cita de este modo al

Discusión

68

reporte producto de los resultados de la primera parte de la presente Tesis doctoral que

fueran publicados en la revista Mol. Biol. Cell (Alfonso Pecchio, Cardozo Gizzi et al. 2011).

Por otro lado, aunque la enzima GlcCerS normalmente se clasifica como una enzima

residente en Golgi, también se la ha detectado en membranas de pre-Golgi/RE (Futerman &

Pagano 1991, Kohyama-Koganeya et al. 2004). Más aún, GlcCerS es única entre las enzimas

glicolípido glicosiltransferasa en el sentido de que el sitio catalítico se orienta hacia la cara

citoplásmica en vez de la cara luminal del RE (Kohyama-Koganeya et al. 2004). En conclusión,

la activación de la síntesis de lípidos por c-Fos se logra al incrementar la actividad de enzimas

particulares que translocan o son componentes integrales del retículo endoplásmico. La

única excepción encontrada hasta aquí es PI4P5K (PtdIns4P-5-quinasa), que se ubica

principalmente en el núcleo (Boronenkov et al. 1998, Mellman et al. 2008). Se mostró que c-

Fos activa a esta enzima en matrices nucleares, promoviendo la formación de PtdIns(4,5)P2 y

consecuentemente cambios transcripcionales globales independientes de la actividad AP-1

de c-Fos (Ferrero et al. 2014).

Una pregunta que queda abierta en la presente Tesis es si existen determinantes en

las enzimas que permitan su interacción con c-Fos, ya que no hemos apuntado a establecer

las regiones involucradas en las enzimas activadas. Todavía es incierta la región de Lipin 1β

involucrada en la asociación con c-Fos. Existen descriptos en Lipin 1 una organización en

forma de dominios conservados que comprende al amino terminal (N-LIP) con una función

desconocida y un dominio C-terminal (C-LIP) que contiene el dominio catalítico, una

secuencia tipo HAD. Sumados a estos dominios, se encuentra además el dominio PBD

involucrado en la unión de PA y algunas otras regiones más de alta homología con los otros

miembros de la familia, junto con extensivas regiones no conservadas. Es por lo tanto de

interés estudiar a futuro si la región de interacción es un dominio conservado en Lipin 2 y 3.

¿Se trata de una activación PAP I general o está restringida a Lipin 1? En la vía de síntesis de

PIPs encontramos que la isoforma α pero no la β de PI4KII se asocia y es activada por c-Fos

(Figs. 8 y 9). La comparación de secuencias entre estas isoformas muestra, como se

mencionó en la Introducción, una región catalítica C-terminal muy conservada mientras que

en la región N-terminal (los primeros 100 residuos) existe una muy baja homología e incluso

Discusión

69

se ha postulado que esta región interviene en asociaciones proteína-proteína específicas.

Podría entonces tratarse de una región que la isoforma α posee pero no la β o, por otro lado,

podría tratarse simplemente de que estas dos proteínas no localizan en los mismos

compartimientos subcelulares. Para el caso de Lipin 1 y Lipin 2, se estableció que ambas no

sólo tienen un patrón de localización diferencial sino también un patrón de expresión

temporal diferente (Grimsey et al. 2008). Estos ejemplos ponen de manifiesto que la

existencia de más de una enzima que cataliza los mismos pasos metabólicos no significa que

sus funciones sean redundantes.

La naturaleza intrínsecamente desestructurada de c-Fos y su asociación a múltiples enzimas

blanco

¿Cómo es que c-Fos es capaz de activar enzimas que no comparten similitudes

estructurales obvias entre ellas? La respuesta puede encontrarse en la naturaleza

intrínsecamente desordenada de c-Fos (Campbell et al. 2000, Gaggiotti et al. 2009).

Pertenece a la familia de proteínas intrínsecamente desestructuradas (IDPs), proteínas que

contienen extensas regiones que no poseen una estructura 3D definida en su estado nativo

(Dyson & Wright 2005). Este tipo de proteínas tienen una plasticidad conformacional que les

permite el reconocimiento y unión a múltiples proteínas blanco con una combinación única

de interacciones de alta especificidad y baja afinidad (Dyson & Wright 2005, Wright & Dyson

2009, Liu & Huang 2014). La existencia de IDPs está cambiando el paradigma de secuencia-

estructura-función. Las IDPs no poseen una única estructura y se adaptan a diferentes roles,

si bien se ha encontrado que las proteínas relacionadas a señalización celular y en particular

a cáncer se encuentran enriquecidas en regiones desordenadas (Iakoucheva et al. 2002).

El orden o desorden de una proteína está definido al nivel de la secuencia de sus

aminoácidos, lo que ha permitido el desarrollo de predictores de desorden basados en la

secuencia. Podría decirse en base a la bibliografía que estos predictores poseen una

exactitud general cercana al 80% al comparar los resultados de probabilidad de desorden con

la información experimental (He et al. 2009).

Discusión

70

Figura 23. Perfil de hidrofobicidad y de probabilidad de desorden de c-Fos. Representación esquemática de c-Fos. BD (aa: 139-159, en negro) es el segmento compuesto por 21 residuos responsable de la unión secuencia-especifica al ADN y de la activación de enzimas blanco. LZ (aa: 165-193, en gris) es el dominio que permite la dimerización y consecuentemente la formación de AP-1 activos. El N-terminal (primeros 138 residuos) es el responsable de la interacción proteína-proteína con enzimas de síntesis de fosfolípidos. El dominio aa: 47-92, tiene un rol importante en esta función y está representado con patrón ondulado. En la parte inferior se observa el resultado de predictores de probabilidad de desorden y de hidrofobicidad basados en análisis de la secuencia. En rojo se observa la representación de la probabilidad del desorden en función del número de residuo obtenido con PONDR-FIT (Xue et al. 2010). El valor de corte es 0,5 lo que significa que residuos por encima de ese valor son desordenados. En azul se observa la representación de hidrofobicidad en función del número de residuo obtenida a partir de la escala Kyte & Doolittle. Nótese que en la región aa: 47-92 existen dos segmentos altamente hidrofóbicos que solapan con una región ordenada, según se discute en el texto.

Discusión

71

En la sección Resultados, hemos mostrado como el N-terminal de c-Fos es

responsable de la asociación específica pero no la activación de CDS1, PI4KIIα y Lipin 1. Para

encontrar nuevas perspectivas, hemos ingresado la secuencia de c-Fos en diferentes

predictores de desorden. Para todos los predictores utilizados, se encontró

consistentemente un perfil similar al mostrado en la Fig. 23 para la región N-terminal. Si bien

toda la proteína c-Fos es una IDP, y esto incluye su N-terminal, hemos observado que la

probabilidad de desorden cae significativamente en la región alrededor de aa: 45-80 (Fig. 23),

punto que discutiremos a continuación.

Algunos de los predictores que utilizamos son clasificadores que han sido

entrenados con secuencias ordenadas y desordenadas de bases de datos como PONDR-VLXT

(Romero et al. 2001); otros, como como IUPred, se basan en propiedades físico-químicas

tales como la capacidad de polipéptidos de formar contactos estabilizadores (Dosztanyi et al.

2005). Los valores de probabilidad se calculan residuo por residuo, tomando una ventana o

rango de aminoácidos vecinos. La Fig. 23 muestra una representación de probabilidad de

desorden utilizando PONDR-FIT (Xue et al. 2010) junto con un perfil hidrofóbico utilizando la

escala de Kyte y Doolite (1982). PONDR-FIT utiliza una red neuronal artificial para predecir

cuales residuos son desordenados. La idea detrás de la utilización de redes neurales es dar

diferente peso y combinar de manera no lineal distintos tipos de atributos como la

composición general de aminoácidos, la complejidad de la secuencia o características de los

mismos aminoácidos como carga o hidropatía (He et al. 2009).

Mientras que la repulsión de cargas favorece el desplegado, el incremento en la

hidrofobicidad favorece el plegado, según las presupuestos del primer modelo predictor

(Uversky et al. 2000). En otras palabras, regiones hidrofóbicas tienden a ser ordenadas

mientras que regiones con cargas netas difícilmente podrán compactarse y establecer una

estructura única, sino que por lo contrario tenderán a tener múltiples configuraciones.

Gráficos de carga neta total en función de hidropatía permiten distinguir proteínas

desordenadas de aquellas que no lo son. También se desarrolló un algoritmo para predecir

residuo por residuo la probabilidad de desorden a partir de esta idea (Prilusky et al. 2005).

Discusión

72

Este simple modelo funciona notoriamente bien aun teniendo en cuenta los desarrollos

actuales (Uversky 2013).

La alta hidrofobicidad de la región de c-Fos aa: 47-92 ya ha sido señalada en la sección

Resultados, donde se la vinculó a la asociación con Lipin 1 (Fig. 21). Puede verse en la Fig. 23

como la mencionada región forma un segmento hidrofóbico que según el predictor tiene

mayor tendencia al orden. Las regiones con mayor propensión al orden han sido apuntadas

como dominios funcionales dentro de IDPs, y se piensa que participan en el reconocimiento

molecular de los múltiples blancos de unión (Hsu et al. 2013). Según los resultados

obtenidos, la región intermedia del N-terminal (aa: 47-92) está involucrada de una manera

compleja con la asociación a Lipin 1 (Fig. 21) pero también a PI4KIIα, según indican resultados

preliminares del Dr. César Prucca. Nuevos experimentos utilizando mutantes de esta región

podrían esclarecer su rol y a la vez brindar información acerca de si es un fenómeno

secuencia-especifica o si, como suponemos, se trata de un efecto debido a las propiedades

globales del segmento en cuestión.

Fue establecido que el dominio BD de c-Fos experimenta una transición desorden a

orden al unirse al ADN como un complejo AP-1, formando una alfa hélice que interacciona

directamente con el ADN (Patel et al. 1990, Glover & Harrison 1995). La idea detrás de esto

es que proteínas que son desestructuradas en su estado nativo pueden adoptar una

estructura definida bajo ciertas condiciones, que incluyen la presencia de un ligando, un

cambio en el pH o la presencia de cationes o sales específicos (Wright & Dyson 2009).

Aunque todavía resta por establecerse si existe una transición “desorden a orden” acoplada a

la asociación del N-terminal de c-Fos a las enzimas blanco. Es posible pensar que el plegado

de c-Fos al unirse a su enzima blanco podría ser relevante para la formación del complejo c-

Fos/enzima. Sin embargo, el plegado en respuesta una unión no es universal y existen

ejemplos de IDPs que preservan un alto nivel de desorden aún unidas a su blanco, un

fenómeno denominado “fuzziness” o “estructuras difusas” (Hazy & Tompa 2009).

En cualquier caso, está definido que la interacción con distintas proteínas puede

involucrar una misma región, como sería el caso del N-terminal para la unión de c-Fos a

múltiples enzimas blanco para ser activadas. En cambio, la región BD tiene una función

Discusión

73

directa tanto en la actividad AP-1 como en la activación en si misma de enzimas puntuales,

por lo que c-Fos utiliza la misma región para realizar acciones muy distintas. Proponemos a c-

Fos como una proteína IDP capaz de múltiples funciones (o moonlighting por su

denominación en inglés). La manifestación última de la naturaleza IDP de c-Fos es su

promiscuidad para unirse a múltiples blancos, como c-Jun o Lipin 1 para citar solo dos

ejemplos, y así poder ejercer como un proteína moonlighting (Tompa et al. 2005, Jeffery

2009).

Existen diversos mecanismos para que una proteína multi-tarea pase de una función a

otra, tales como una regulación en su localización subcelular o capacidad para unirse a

ligandos. En este sentido, vale la pena mencionar que una fosforilación en los residuos de

tirosina 10 y 30 vuelve a c-Fos incapaz de asociarse al RE y consecuentemente de activar la

síntesis de lípidos (Ferrero et al. 2012). La región aa: 47-92 se encuentra flanqueada por dos

regiones flexibles desestructuradas (Fig. 23). En base a los Resultados obtenidos, parece

razonable pensar que la fosforilación en las tirosinas 10 y 30 afecta de alguna manera la

región aa: 47-92 que posiblemente es la responsable de interaccionar con las enzimas

blanco. Se ha señalado que regiones desordenadas dentro de una proteína facilitan la

fosforilación (Liu & Huang 2014) dado que la fosforilación se da predominantemente en estas

regiones (Iakoucheva et al. 2004). Más aún, los niveles de fosforilación son mucho más

dinámicos durante el ciclo celular para IDPs (Tyanova et al. 2013), regulando de esta forma el

accionar de proteínas claves para la progresión del ciclo. La fosforilación en tirosinas es sólo

una de las formas de regular las actividades de c-Fos, otro ejemplo resulta de la acción de las

quinasas de serinas/treoninas ERK y RSK que fosforilan a c-Fos luego de estímulos

mitogénicos en su dominio de trans-activación C-terminal promoviendo un incremento en su

estabilidad y capacidad como factor de transcripción (Murphy et al. 2002, Murphy & Blenis

2006). Es importante resaltar que las distintas fosforilaciones generan efectos opuestos,

mientras que la fosforilación en tirosinas reprime su actividad como activador de la síntesis

lipídicas, la fosforilación en ser/treo incrementa su actividad AP-1.

Otra característica determinada por la naturaleza IDP de c-Fos es su comportamiento

interfacial. c-Fos es una proteína anfitrópica que a partir de su naturaleza flexible ejerce una

Discusión

74

actividad de superficie. Estudios biofísicos han mostrado que c-Fos tiene una gran afinidad

por membranas y una marcada capacidad para detectar y responder a cambios en la

composición y estado de fase de lípidos en una monocapa (Borioli et al. 2001, Gaggiotti et al.

2009). Todo ello apoya la idea de que c-Fos tiene las características moleculares (alta

actividad de superficie, capacidad para detectar y responder a lípidos y desorden intrínseco

que permite cierta promiscuidad en sus asociaciones) (Borioli 2011) para llevar a cabo un rol

regulatorio en la síntesis de glicerolípidos. En un contexto celular, c-Fos puede ser imaginado

detectando la composición lipídica, asociándose específicamente a membranas del RE y

encontrando su camino hacia enzimas blanco para finalmente activarlas in situ (Cardozo Gizzi

& Caputto 2013).

La región N-terminal de c-Fos media la asociación con CDS1, PI4KIIα y Lipin 1. En la

Fig. 14 se observa una localización de NA-myc (mutante que comprende todo el N-terminal,

aa: 1-138) exclusivamente peri-nuclear, en tanto en la Fig. 13 se probó como NA-myc es

capaz de competir por la unión de PI4KIIα con c-Fos. Es posible que la sobre-expresión de NA

bloquee la interacción c-Fos/enzima para todos los casos en donde se observó que la región

N-terminal es la involucrada en la unión. Nuestra hipótesis es que c-Fos activa a las enzimas

exclusivamente en esta localización subcelular, en el RE, por lo que la presencia de la

mutante NA allí sería capaz de competir y generar el efecto de detener la activación general

de la síntesis de fosfolípidos. En relación a lo anterior, la sobre-expresión de la mutante NA

puede detener la proliferación de células T98G en cultivo, resultados obtenidos por el Dr.

Cesar Prucca en su proyecto post-doctoral que se continuó a partir de los Resultados de la

primera parte de esta Tesis. Esto último es una prueba más de que la activación de lípidos

dependiente de c-Fos es requerida por la célula para sostener la proliferación, pero además

indica que el N-terminal de c-Fos es clave para ello y aparece como un posible blanco

terapéutico. Anteriormente ya se utilizaron estrategias para disminuir los efectos de c-Fos al

impedir su expresión mediante el uso de ARN antisentido (Mercola et al. 1987, Edwards et al.

1988, Ledwith et al. 1990). Sin embargo, la mutante NA aparece como atractiva por bloquear

únicamente el rol no genómico de c-Fos, compitiendo con la proteína endógena por la unión

de sus enzimas blanco.

Discusión

75

Fra-1 también incrementa la síntesis de lípidos

Ya se ha establecido que Fra-1 está involucrado en la proliferación de células de

cáncer de mama al incrementar el marcado radioactivo de fosfolípidos (Motrich et al. 2013),

si bien el mecanismo por el cual lo hace es desconocido. En esta Tesis hemos encontrado

que, al menos para la actividad PAP-1, Fra-1 es capaz de incrementar la actividad enzimática

en la misma medida que c-Fos. Ya se discutió la homología del BD de ambas proteínas y de la

relevancia de este dominio a partir de experimentos con mutantes de deleción. Por otro

lado, también se encontró una unión directa entre Fra-1 y Lipin 1, por lo que es razonable

pensar en que el mecanismo de activación de Fra-1 posee características comunes con el de

c-Fos. Esto nos lleva a especular acerca de las regiones de Fra-1 que podrían mediar la

interacción con la mencionada enzima.

En términos generales, existen dos regiones altamente conservadas entre c-Fos y Fra-

1: el dominio bZip (que comprende el BD) y los últimos 70 residuos en C-terminal de ambas

proteínas. Sin embargo, existe una tercera región de similitud entre la secuencia primaria de

ambas proteínas, los aa: 54-84 de c-Fos y los aa: 31-61 de Fra-1 (Fig. 24). Esta región

comprende para el caso de c-Fos en forma casi completa el dominio que se ha identificado

como necesario para la asociación a Lipin 1 (Fig. 21), la región comprendida por aa: 47-90 de

la que se ha venido discutiendo su función. Por lo tanto, la tercera región de homología entre

c-Fos y Fra-1 se trataría de la que está involucrada, al menos en el caso de c-Fos, en la

interacción con las enzimas blanco. Predictores de desorden e hidropatía también indican

que esta región de Fra-1 comparte las características de la región equivalente de c-Fos. Es un

segmento altamente hidrofóbico, ligeramente más corto que el de c-Fos, en donde PONDR-

FIT predice una región ordenada flanqueada por regiones desordenadas. Es interesante

remarcar que si bien no existe una conservación a nivel de secuencia, la región ordenada aa:

31-61 de Fra-1 tiene a cada lado regiones desestructuradas como se da en c-Fos. Estudios a

futuro podrían confirmar si este es efectivamente el dominio de interacción, y si existe un

mecanismo de activación compartido por las dos proto-oncoproteínas.

Discusión

76

Más importante aún sería determinar las consecuencias celulares de ello. Podemos

especular que la expresión de c-Fos, Fra-1 o de ambas proteínas en un modelo celular en

particular podría determinar el resultado final en la maquinaria de biogénesis de membrana.

Por ejemplo, el mencionado rol de Fra-1 en la proliferación de células de cáncer de mama se

debe a un incremento en la expresión en este tipo celular que ha sido descripto

extensivamente (Belguise et al. 2005, Song et al. 2006, Logullo et al. 2011). En nuestro

laboratorio se encontró que más del 95% de las muestras de carcinoma de mama ductal

expresan Fra-1 pero también c-Fos, a diferencia de lo que ocurre en tejido normal donde no

se encuentran ninguna de las dos proteínas (Motrich et al. 2013).

Figura 24. Alineamiento las secuencias de c-Fos y Fra-1. Se destacan tres regiones conservadas: 1) N-terminal (recuadro rojo), bZip (recuadro azul) y C-terminal (recuadro violeta). * indica aminoácido conservado, : alta homología, . baja homología. La escala que en el recuadro inferior derecho indica grado de conservación y va desde verde (no conservado) a rosa fuerte (máxima conservación).

Discusión

77

Conclusiones finales

La regulación de la síntesis lipídica para las diferentes etapas del crecimiento y la

proliferación celular es un proceso clave que debe ser finamente regulado debido a que

involucra la actividad sincronizada de múltiples pasos metabólicos que se orquestan en

varios niveles. Sin duda, un mecanismo clave para alcanzar la regulación global de la

biogénesis de membrana es a través de factores de transcripción que actúan en forma

coordinada para regular la expresión de enzimas responsables de la síntesis lipídica como las

que ocurren durante la división celular (Nohturfft & Zhang 2009). Sin embargo, dado que la

biosíntesis de lípidos involucra numerosas etapas metabólicas, la regulación de la síntesis

requeriría de complejos y variados mecanismos regulatorios. A pesar de ello, a la luz de los

resultados de muchos laboratorios, se observa que al regular únicamente etapas limitantes

se altera toda la vía.

En este sentido, la evidencia obtenida en esta Tesis doctoral indica que al incrementar

la capacidad catalítica de enzimas clave, c-Fos incrementa la disponibilidad de los principales

lípidos. Esto apunta a un posible mecanismo molecular de activación compartido por las

distintas enzimas a las que c-Fos se asocia físicamente. Hemos avanzado en el conocimiento

del cómo es que c-Fos actúa a nivel no genómico, pero se abre el interrogante del “para

qué”. No está claro en este punto el fin de la activación de la síntesis de lípidos, pero si sus

consecuencias últimas: el sostenimiento del crecimiento o la proliferación celular. Quizás

estudios en esta dirección nos indiquen en un futuro como limitar la proliferación irrestricta

de células tumorales, al interferir con la activación lipídica que es promovida por c-Fos.

CAPITULO V

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

79

Materiales

Los reactivos radioactivos son de PerkinElmer. Los lípidos son de Avanti Polar Lipids.

La Lipofectamina 2000, los medios y reactivos de cultivo son de Invitrogen. Los reactivos de

biología molecular, kits, enzimas de restricción, etc. son de Promega. Los demás reactivos

son de máxima pureza adquiridos en Sigma, Merck o equivalente. Se harán aclaraciones

cuando sea pertinente.

Cultivos celulares

Todos los experimentos fueron realizados con la línea celular derivada de

fibroblastos de ratón NIH 3T3 adquiridas al American Type Culture Collection, USA. Esta línea

fue crecida en cápsulas de Petri descartables de diferentes tamaños según cada experimento

(multicelda de 24, cápsulas de 35, 60 o 100 mm de diámetro). Las células fueron crecidas

hasta alcanzar más del 90% de confluencia en cada caso. Para la adquisición de imágenes en

experimentos de microscopía fueron crecidas sobre cubreobjetos de vidrio redondos

previamente tratados con ácido y enjuagados exhaustivamente. Los cultivos se sembraron a

baja densidad y se dejaron proliferando a 37°C durante 48 horas en presencia de 5% de CO2

en DMEM suplementado con 10% v/v suero de ternero bovino (Gibco). Una vez alcanzada la

confluencia, las células se arrestaban al reemplazar el medio de cultivo con DMEM. Se

dejaron las células con este medio durante 48 horas más. En los experimentos de

estimulación se adicionó FBS para llevar al 20 % final durante los tiempos especificados en

cada experimento.

Marcado metabólico de PtdInsP y PtdInsP2

Células quiescentes fueron pulsadas con 25 µCi/mL de 32P-ortofosfato 15 minutos

antes de cosecharlas. Para el experimento del bloqueo específico de la expresión de c-Fos al

producirse el estímulo, ARNm anti-sentido (Morpholino oligonucleótidos, Gene Tools) contra

c-Fos (5´-TGC-GTT-GAA-GCC-CGA-GAA-3´) (Bussolino et al. 1998) o un oligonucleótido de

Materiales y Métodos

80

secuencia aleatoria que no tiene blanco en células de ratón fueron adicionados al medio a

una concentración de 1 µg/mL medio cultivo, 30 minutos antes del pulsado radioactivo.

En cambio, para deprimir la expresión de las enzimas blanco se utilizaron dúplex de

ARN pequeño de interferencia (Dharmacon). En todos los casos, 240 pmol de ARN total

fueron transfectados a cada pocillo en una placa multicelda de 6 con Lipofectamina de

acuerdo al protocolo del fabricante. Después de 24 horas, las células fueron transfectadas

una segunda vez de la misma forma y fueron cultivadas por 48 horas más en medio libre de

suero antes de realizar el marcado metabólico. Para corregir por posibles diferencias en el

número de células en los distintos pocillos en los ensayos con ARN pequeño de interferencia,

se corrió en paralelo un pocillo que no se marcó radioactivamente y que se utilizó para WB.

El mencionado WB se reveló contra las distintas enzimas para así poner de manifiesto si

había funcionado el tratamiento con ARN pequeño de interferencia. Por densitometría se

estableció además la intensidad de la banda de α-tubulina, utilizada como control de carga

para normalizar las cuentas radioactivas obtenidas con la proteína total sembrada.

Luego del pulsado, se estimuló a las células durante 7,5 minutos con FBS al 20%.

Luego del estímulo, se enjuagó cuidadosamente con dos lavados de PBS frío antes de

cosechar las células en agua. Los ensayos se hicieron en duplicado en un total de tres

experimentos independientes como mínimo.

Marcado de PtdInsP y PtdInsP2 in vitro

La capacidad de marcado radioactivo de 32P-PtdInsP y 32P-PtdInsP2 de células

quiescentes fue determinado in vitro según Gil et al. (2004) en tubos de Khan de vidrio. El

buffer de reacción contenía HEPES 64 mM (pH 7,4), NaCl 140 mM, KCl 4,5 mM, MgCl2 0,5

mM, glucosa 5,6 mM, 3 µCi de 32P-ATP (actividad específica 3000 Ci/mmol). Se determinó la

marcación en presencia de c-Fos o sus mutantes de deleción obtenidos en forma

recombinante y purificados, utilizando 1 ng c-Fos recombinante/µg proteína total

resuspendido en 3 µL de buffer de elusión, que contiene imidazol 500 mM /urea 8 M. A los

incubados control se les adicionó en cambio 3 µL de buffer de elusión. Las reacciones, que

tenían un volumen final de 80 µL, fueron iniciadas con la adición de 100 µg de homogenato

Materiales y Métodos

81

celular total al medio de ensayo, incubadas por 1 hora a 37 °C y terminadas por la adición de

20 volúmenes de cloroformo/metanol 2:1. Los ensayos se hicieron por triplicado en al menos

tres experimentos independientes.

Purificación de PtdInsP y PtdInsP2 y cromatografía en capa delgada

Para la obtención de los mencionados fosfolípidos tanto desde el marcado metabólico

o el marcado in vitro, se utilizó el método de Folch (Folch et al. 1957). Tras la adición de 20

volúmenes de cloroformo/metanol 2:1, la fase orgánica fue particionada por el agregado de

agua (0,2 volúmenes). Luego de vorterear por 3 segundos, se centrifugó durante 2 minutos a

1.500 rpm para separar las fases y se lavó la fase inferior (orgánica) 5 veces con 1 mL de fase

superior teórica (metanol/agua/cloroformo 48:47:3, v/v/v) para eliminar el precursor

radioactivo soluble. Finalmente, se extrajo cuidadosamente la fase inferior mediante pipeta

Pasteur y se transfirió a un nuevo tubo de vidrio. Se secó esta fase bajo flujo de nitrógeno

para luego resuspender en 50 µL de cloroformo/metanol 2:1.

Los extractos lipídicos fueron separados en placas cromatográficas delgadas de Sílica

Gel 60 utilizando la metodología descripta en Catz & Sterin-Speziale (1996). Las placas de

sílica fueron tratadas con una solución de oxalato de potasio al 1% en metanol/agua 2:3 y

calentadas posteriormente a 110 °C durante al menos 30 minutos previo a ser utilizadas para

remover humedad residual. Las placas fueron desarrolladas en dos corridas consecutivas en

un sistema monodimensional utilizando cloroformo/metanol/ácido acético/agua 25:15:8:2

para la primera corrida, luego de la cual las placas fueron secadas a temperatura ambiente y

desarrolladas en el mismo sistema de solventes pero en las proporciones 25:15:16:2.

Fosfolípidos de referencia fueron sembrados en carriles junto a las muestras y

visualizadas con vapores de iodo en una cuba dispuesta para este fin, para de esta forma

identificar los productos obtenidos. La radioactividad de los lípidos individuales fue

cuantificada por exposición de la placa de sílica a una pantalla de fósforo y posteriormente

procesada para su visualización por PhosPhorImager (Molecular Dinamycs) utilizando el

scanner especifico FLA-3000 (Fijifilm).

Materiales y Métodos

82

Clonado de mutantes de c-Fos

Mutantes de deleción de c-Fos: Las diferentes mutantes se construyeron mediante el diseño

de oligonucleótidos específicos que abarcaron a los diferentes dominios de c-Fos salvaje, y

con estos oligonucleótidos se realizaron reacciones de PCR y clonado direccional a partir de

la secuencia de un vector que codifica para c-Fos de rata con un rótulo de 6 x histidinas con

codones optimizados para procariotas (Abate et al. 1991). Los productos de PCR obtenidos se

verificaron en geles de agarosa, se purificaron con columnas de purificación y se ligaron al

vector de expresión procariota pET15b (Novagen) utilizando los sitios de restricción NdeI y

BamHI.

Mutagénesis sitio dirigida: La generación de mutantes puntuales de c-Fos se realizó mediante

procedimientos diferentes. Estas secuencias se construyeron por una estrategia denominada

“Superposición Extendida” u “OE-PCR” (Higuchi et al. 1988). Brevemente, consiste en la

utilización de 4 oligonucleótidos, 2 conteniendo la mutación puntual deseada y que además

son 100% complementarios entre sí (“mutagénicos”), y los otros 2 restantes que se unen a

los extremos de la secuencia de c-Fos salvaje (“No mutagénicos”). Los oligonucleótidos

mutagénicos son usados en una primera reacción de PCR con su correspondiente

oligonucleótido no mutagénico, para obtener 2 productos de PCR conteniendo cada uno de

ellos la mutación deseada. Estos productos de PCR se corren en un gel de agarosa y se

purifican adecuadamente y debido a que estos complementan perfectamente sus extremos,

se mezclan y se realiza una tercera reacción de PCR, con los oligonucleótidos no mutagénicos

como cebadores de la reacción. Finalmente se obtiene amplificada a la secuencia completa

de c-Fos pero ahora con la mutación introducida. Las etapas finales son las mismas que para

los clonados anteriores.

Expresión y purificación de c-Fos, Fra-1, c-Jun y sus mutantes

Se siguió el protocolo descripto en Borioli et al. (2001). Una colonia de BL21 (DE3)

conteniendo el plásmido fue inoculada a 5 mL de medio LB suplementado con ampicilina

(100 µg/mL), y se incubó durante la noche a 37 °C. Dos mL del cultivo saturado se inocularon

Materiales y Métodos

83

a 100 mL de LB que se creció con agitación constante de 250 rpm a 37 °C hasta que la

absorbancia a 600 nm alcanzó 0,5. Entonces se le agregó al cultivo 1 µM de concentración

final de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y se lo incubó por 4 horas más a 37 °C. El

cultivo inducido para la expresión de c-Fos fue cosechado por centrifugación a 5,000 x g por

10 minutos a 4 °C. El sedimento se re-suspendió en 2 mL de buffer conteniendo 20 mM de

Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl y 5 mM imidazol (buffer de unión). Las bacterias

resuspendidas fueron incubadas con lisozima durante 15 minutos a temperatura ambiente y

luego lisadas adicionalmente con 5 pulsos de sonicación a la máxima potencia durante 1

minuto en hielo, para evitar que aumente la temperatura del lisado. El lisado fue

centrifugado a 12,000 x g por 15 minutos a 4 °C. El sedimento contiene a la proteína en

forma mayoritaria, que permanece insoluble en cuerpos de inclusión. Se resuspendió en

buffer de unión pero que ahora además contiene urea 6 M. Se lo incubó durante una hora a

4 °C por agitación constante favoreciendo la solubilización de los cuerpos de inclusión. Se

centrifugó nuevamente a 12,000 x g por 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue pasado por

un filtro de 0,4 µm y luego a través de una columna de afinidad de Níquel-Sefarosa de 600 µL

(suspensión acuosa). Se procedió al lavado primero con 3 mL de buffer de unión y luego con

2 mL de buffer de lavado conteniendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 20 mM

imidazol y urea 6 M. La proteína fue eluída en fracciones de 0,4 mL en un total de 2 mL con

buffer conteniendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 500 mM imidazol y urea 6 M.

Se determinó la concentración de proteína por el método de Bradford (Bradford 1976). Las

preparaciones, que tenían una concentración cercana a 1 mg/mL, se guardaron a 4 °C por

hasta un mes.

Anticuerpos empleados

Se emplearon los siguientes anticuerpos: anti-myc (ratón, M4439), anti-tubulina (ratón,

DM1A), anti-GFP (conejo, G1544), son de Sigma. Anti-c-Fos (ratón, sc-52) y anti-myc (conejo,

sc-789) de Santa Cruz. Anti-CDS1 (conejo, Ab-84019), anti-PI4KIIα (conejo, Ab-71824) y β

(conejo, Ab-71823) son de Abcam. Anti-GFP de Roche (ratón, #1-814-460).

Materiales y Métodos

84

Inmunoprecipitaciones

Las inmunoprecipitaciónes se realizaron según se describió previamente (Bonifacino

& Dell'Angelica 2001). Brevemente, cultivos celulares de NIH 3T3 (aproximadamente 250 μg)

arrestados y transfectados con la proteína de interés, se estimularon (Ver Cultivos celulares)

y lavaron dos veces con PBS 10mM frío. Luego se agregó 500 μl de buffer de lisis (50 mM

TrisHCl pH: 7,5, 1% v/v Tritón X-100, 300 mM NaCl, cóctel inhibidor de proteasas Complete

(Roche) y 0,05% P/v azida sódica) y fueron dejados en hielo durante 20 minutos. Después de

este tiempo se recolectaron los lisados y se pusieron en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL,

se agitaron con vortex al máximo durante 3 segundos y se dejaron en hielo durante 15

minutos más. Los lisados fueron pre-absorbidos con el agregado de 10 μl de proteína G-

Sepharosa (GE Healthcare) durante una hora en un rotor de 360º a 4ºC, y después de este

tiempo fueron nuevamente centrifugados a 13.200 rpm a 4ºC. El sobrenadante fue

cuidadosamente transvasado a un nuevo tubo. Se separó el 20% del volumen obtenido para

posterior análisis por WB (homogenato total) y el resto del lisado fue sometido a la co-

inmunoprecipitación. Se agregó 25 μl de proteína G-Sepharosa previamente conjugada con

aproximadamente 1 μg de anticuerpo policlonal correspondiente a cada caso (ver

Resultados). Las inmunoprecipitaciones se dejaron en un rotor 360º a 4ºC durante 4 horas.

Luego de este tiempo los inmunocomplejos fueron centrifugados 30 segundos a 4.200 rpm y

lavados con buffer de lavado (50 mM TrisHCl pH: 7,5, 0,1% v/v Tritón X-100, 300 mM NaCl,

cóctel inhibidor de proteasas Complete y 0,05% P/v azida sódica). Este procedimiento se

realizó 4 veces y después se hizo un lavado final con PBS para remover el detergente

remanente que puede interferir en la siguiente etapa de WB. Las muestras se calentaron a

100 C° durante 5 minutos y se sembraron para el posterior SDS-PAGE.

SDS-PAGE y Western Blot

Cápsulas de Petri conteniendo las células se lavaron cuidadosamente 3 veces con PBS

10 mM frío y se cosecharon con un volumen mínimo de agua milliQ (o Buffer de lisis, según lo

especifique algún procedimiento) conteniendo además cóctel inhibidor de proteasas

Complete. Después de cuantificar proteínas por Bradford, y dependiendo del anticuerpo y/o

Materiales y Métodos

85

proteína a detectar, una cantidad de proteínas que variaba entre 10 µg a 150 µg fue

calentada durante 5 minutos a 100 ºC en presencia de Buffer de siembra de proteínas

(sample buffer) conteniendo 20 % del agente reductor 2-β mercaptoetanol, para ser

posteriormente sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Todos los

geles SDS-PAGE se realizaron en concentración 12% final de acrilamida. Después de la

electroforesis y habiéndose separado las proteínas de diferente peso molecular, las mismas

fueron transferidas (70 minutos, 300 mA) a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm de

poro e incubadas durante al menos una hora con buffer de bloqueo (5% leche descremada

en PBS). Luego de este tiempo las membranas estaban listas para ser incubadas con los

anticuerpos primarios correspondientes según cada caso. Como anticuerpos secundarios se

usaron IRDye 800 y 680 anti-ratón o anti-conejo (LI-COR), según corresponda. Para revelar las

bandas se utilizó un scanner fluorescente en infrarrojo Oddysey (LI-COR). El peso molecular

de cada banda fue calculada por extrapolación a un estándar de pesos moleculares sembrado

en cada gel (BioRad).

Expresión y purificación de Lipin 1

Se siguió el protocolo descripto en Han & Carman (2010). Una colonia de Rosetta2

(DE3) conteniendo el plásmido de la Lipin 1β humana fue inoculado a 5 mL de medio LB

suplementado con kanamicina (30 µg/mL) y cloroanfenicol (50 µg/mL), y se incubó durante la

noche a 37 °C. Dos mililitros del cultivo saturado se inocularon a 500 mL de medio fresco que

se creció con agitación constante de 250 rpm a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm

alcanzó 0,5. Entonces se le agregó al cultivo 1 µM de concentración final de IPTG y se lo

incubó por 3 horas más a 37 °C. El cultivo inducido para la expresión de Lipin 1 fue cosechado

por centrifugación a 5,000 x g por 10 minutos a 4 °C. El sedimento se re-suspendió en 20 mL

de buffer conteniendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl y 5 mM imidazol. Las

bacterias resuspendidas fueron lisadas a través de dos pasajes en un Emulsiflex a 15,000 p.s.i.

y el lisado centrifugado a 12,000 x g por 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue pasado a

través de una columna de afinidad de Níquel-Sefarosa de 1 mL (suspensión acuosa). Se

procedió al lavado con 25 mL con buffer conteniendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM

Materiales y Métodos

86

NaCl, 45 mM imidazol, 7 mM 2-mercaptoetanol y 10% v/v glicerol. La enzima, que posee un

rótulo de 6 histidinas en línea, fue eluída en fracciones de 0,5 mL en un total de 3 mL con

buffer conteniendo 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, 7 mM 2-

mercaptoetanol y 10% glicerol. Después de establecer cuáles eran las alícuotas más

concentradas, se las mezcló y se determinó la concentración de proteína por el método de

Bradford (Bradford 1976). Las preparaciones de enzimas, que tenían una concentración

cercana a 1 mg/mL, se guardaron en pequeñas alícuotas a -70 °C.

Preparación del reactivo de verde de malaquita-molibdato

Un reactivo coloreado para detectar fosfato inorgánico libre fue preparado según

Mahuren et al. (2001) con algunas modificaciones, y se compone de 3 volúmenes de verde

de malaquita 0,1 mM y un volumen de molibdato de amonio 34 mM en HCl 5 M. Luego de

mezclar los componentes, se deja en agitación por lo menos durante 30 minutos, se filtra y se

guarda protegido de la luz. El reactivo así preparado se usó dentro de una semana de

preparado.

Preparación de las micelas mixtas de Tritón X-100/PA

PA en cloroformo/metanol (2:1) fue transferido a un tubo de ensayo de vidrio, secado

bajo un flujo de N2 y finalmente mantenido in vacuo durante 1 hora. Tritón X-100 fue

adicionado al PA justo después del buffer de ensayo para preparar las micelas mixtas. El

vortereo aplicado extensivamente asegura la formación de micelas. El contenido mol% de PA

en las micelas mixta fue calculado de acuerdo a la fórmula:

mol%PA = 100 x [PA (molar)]/ ([PA (molar)]+ [Triton X-100(molar)])

En forma similar, el mol% de c-Fos recombinante fue calculado como:

mol%c-Fos = 100 x [c-Fos (molar)]/ ([PA (molar)]+ [Triton X-100(molar)])

Materiales y Métodos

87

La concentración total de PA en las micelas mixtas se mantuvo por debajo del 15% para

asegurar que la estructura de la misma sea similar a la de micelas de Tritón X-100 puras

Lichtenberg et al. (1983).

Actividades enzimáticas

En todos los casos se utilizó como fuente de enzima homogenatos totales de NIH 3T3.

Los incubados tuvieron 100 µg proteína total en un volumen final de 80 µL.

CDS

La reacción se llevó a cabo según Lykidis et al. (1997). El buffer de reacción contenía

Bis Tris-HCl (pH 6,5) 100 mM H3-CTP (actividad específica 14,5 Ci/mmol), PA 2 mM

(suspensión acuosa sonicada en buffer), MgCl2 10 mM. La reacción se comenzó con el

agregado de MgCl2. La reacción fue incubada a 37 °C durante los tiempos indicados.

PIS

La reacción se llevó a cabo según Lykidis et al. (1997). El buffer de reacción contenía

Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM, MgCl2 50 mM, MnCl2 2 mM, CDP-DAG 1 µM sonicado en buffer y

3.3 mM myo-[H3]inositol (actividad específica 30 Ci/mmol). La reacción se desarrolló durante

tiempos variables a 37 °C.

PI4K

La reacción se llevó a cabo según Wong et al. (1997) con algunas modificaciones. El

buffer de reacción contenía Hepes (pH 7,5) 20 mM, MgCl2 20 mM, ATP 20 µM, PtdIns 70 µM

y PtdSer 35 µM sonicados en buffer y γ-32P-ATP 10 µCi (actividad específica 3000 Ci/mmol)

incubando la reacción a 25 °C durante tiempos variables.

PAP

La actividad PAP se midió según Pasquare et al. (2001) con algunas modificaciones. El

buffer de reacción contenía Tris-maleato (pH 6,5) 50 mM, L-α-dipalmitoil-C14-PA 0,75 µCi

Materiales y Métodos

88

(actividad específica 100-200 mCi/mmol) y dioleoil-PA 0,3 mM como dispersión en agua y

MgCl2 1 mM. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante tiempos variables.

Actividad de Lipin 1 en micelas mixtas de Tritón X-100/PA

La actividad PAP de Lipin 1 purificada fue medida según Han & Carman (2000)

mediante la determinación de la liberación de fosfato inorgánico proveniente del PA por la

acción enzimática en micelas mixtas preparadas como se indicó anteriormente. El buffer de

reacción contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM

L-α-PA purificado de huevo de gallina, 10 mM Tritón X-10 y 50 ng enzima en un volumen

total de 0,1 mL. La mezcla de reacción fue incubada durante 20 minutos a 37 °C, momento en

que se terminó la reacción enzimática con el agregado de 0,5 mL HCl 0,1 M en metanol, 1 mL

de cloroformo y 1 mL de agua milliQ. Tras 3 segundos de agitación en vortex, se procedió a

separar las fases por centrifugación durante 2 minutos a 2,000 x g de los tubos de ensayo de

vidrio. Se tomaron 300 µL de la fase acuosa superior y se mezcló con 600 µL del reactivo de

verde de malaquita-molibdato, el reactivo pasa de amarillo a verde. Tras esperar 15 minutos,

se midió la absorbancia a 650 nm. Como blanco se utilizó 300 µL de agua milliQ, que no

muestra diferencias con la fase superior de un tubo en el que el incubado a 37 °C fue

omitido.

Transfecciones transitorias de ADN plasmídico

Los plásmidos utilizados se encuentran descriptos en la Tesis doctoral de Dr. Alfonso

Pecchio (2008). Para el caso de Lipin 1, se partió del plásmido cedido gentilmente por el Dr.

Carman y que fue utilizado en la publicación de Wang, H (2011). A partir de dicho plásmido,

se subclonó en el vector pSYFP2-N1 empleando los sitios Nhe y XhoI, dado que el vector de

origen (pEGFP-N1) y el de destino poseen los mismos sitios de clonado y marco de lectura.

La introducción de los diferentes plásmidos a las células para los experimentos de FRET

utilizadas se realizó mediante la utilización de lípidos catiónicos comerciales, Lipofectamina

2000. Las condiciones no difirieron significativamente del protocolo del fabricante, pero se

Materiales y Métodos

89

hicieron cambios considerables respecto a las cantidades de ADN utilizadas. Los diferentes

plásmidos usados necesitaron optimizarse individualmente para obtener niveles de

expresión aceptables. Para el caso de c-Fos y sus mutantes, se emplearon 0,8 µg de ADN por

pocillo en un multiwell de 24. En cambio, para las enzimas se utilizó la cantidad descripta en

la Tabla 3. Para las co-transfecciones, se adicionaron ambas cantidades de ADN en la mezcla

con Lipofectamina 2000.

Tabla 3. Cantidades de ADN plasmídico empleadas en la transfecciones transitorias para FRET

Enzima µg ADN/pocillo

CDS1 2

PIS1 1,4

PI4KIIα 1

PI4KIIβ 1

Lipin 1 1,6

Adquisición de imágenes confocales para FRET

La imágenes para los análisis de FRET fueron tomadas usando microscopios

confocales Olympus FV1000, Olympus FV300 o Zeiss Pascal equipados en todos los casos con

un láser de Argón multilínea (458, 488 y 514 nm). La fluorescencia de CFP (donor) fue

detectada utilizando excitación a 458 nm, y una ventana de detección de 465-495 nm. La

fluorescencia de YFP (aceptor) fue detectada utilizando excitación a 514 nm y una ventana de

detección de 530-560 nm. Las imágenes fueron adquiridas utilizando objetivos 60X apertura

numérica = 1,42 con un zoom digital de 3X, 512x512, ajustando el pinhole de forma de tomar

fetas ópticas de 0.8-1 µm. Las condiciones de adquisición se ajustaron para minimizar el

fotoblanqueo y tiempo de escaneo pero maximizando la relación señal/ruido en las distintas

condiciones. Una vez ajustadas las mismas, se procedió a tomar el conjunto de imágenes de

todo el experimento con las mismas condiciones en el mismo día.

Materiales y Métodos

90

FRET (Förster Resonance Energy Transfer) por Emisión Sensibilizada

Para el análisis de imágenes célula por célula realizada post-adquisición se utilizó el

programa de distribución libre ImageJ (http://rsbweb. nih.gov/ij/). Se utilizó el algoritmo

previamente descripto en Elangovan et al. (2003) para remover el sangrado espectral del

donor (SED) y la excitación directa del aceptor (EDA) que contaminan la señal de FRET. Con

ese propósito se usaron siete imágenes: dos imágenes de referencia marcadas sólo para el

donor y otras dos imágenes de referencia marcadas sólo para el aceptor (Dex/Dem y

Dex/Aem); y tres imágenes con doble marca proveniente de células co-transfectadas

(Aex/Aem, Dex/Dem, Dex/Aem). La imagen Dex/Dem muestra la fluorescencia apagada o

quenched del donor (qD) y corresponde al canal del donor (D), mientras que la imagen

Aex/Aem indica la fluorescencia del aceptor y corresponde al canal del aceptor (A). La

imagen Dex/Aem corresponde a la imagen de FRET no corregida (uFRET), que es procesada

segun el algoritmo de Elagonvan para generar la imagen de precisión de FRET (PFRET),

mostrando los niveles de transferencia de energía corregidos:

PFRET = uFRET - qD x SED – A x EDA (1)

La eficiencia aparente de FRET:

E = 1 – qD/uD (2)

se expresa como la fracción de fluorescencia del donor en la ausencia de FRET o unquenched

donor (uD). Este último parámetro se calcula como:

uD= qD +PRET (3)

como una aproximación de la Eq. B.19 en Elangovan et al. (2003). ImageJ fue usado para

calcular este parámetro. Luego de sustraer el ruido de fondo o background, se aplicó una

máscara independiente a las imágenes qD, uFRET y A para excluir del análisis pixeles

Materiales y Métodos

91

saturados o pixeles por debajo de un umbral determinado. Los valores de eficiencia de FRET

promedio fueron calculados desde regiones de interés de acuerdo a:

E = 1 −��

������(4)

en un análisis pixel por pixel. De esta forma, se puede lograr la separación de pixeles que

contienen señal significativa de aquellos que sólo representan mayoritariamente ruido de

fondo para el cálculo de FRET. La imágenes de E resultantes fueron pseudocoloreadas con

ImageJ en donde la intensidad del pixel se representa mediante una escala de color: blanco

es el valor máximo normalizado de pSYFP2-mTurquoise2 mientras que azul corresponde al

valor mínimo, 0.

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) en el dominio de la frecuencia

Un microscopio confocal Olympus FV-1000 equipado con un módulo de FastFlim

FlimBox (ISS) fue utilizado para los estudios de FLIM. FLIMBox es un hardware de frecuencia

digital capaz de análisis multi-armónico (Colyer et al. 2008). Un láser de diodo a 445 nm

modulado con un frecuencia de 20 MHz fue usado para la excitación de CFP (donor), con una

excitación cruzada muy baja de YFP (aceptor). La emisión de fluorescencia de CFP fue

colectado en una ventana espectral de 470-495 nm. Una solución de fluoresceína en

Cumarina 6 disuelta en etanol (pico de excitación y emisión: 460 y 505, respectivamente) que

tiene un tiempo de vida media de fluorescencia de 2,5 ns fue usada como estándar para

calibrar la respuesta instrumental. Se siguió el protocolo establecido en Sun et al. (2012).

Las imágenes fueron obtenidas en 256x256 con 20 µs/pixel y promediando 25-50

imágenes tomadas consecutivamente. La información de FLIMBox conteniendo la

información de intensidad y de tiempo de vida fueron adquiridas y procesadas utilizando el

programa Sim-FCS, desarrollado en el Laboratory for Fluorescence Dynamics. Se utilizó la

estrategia del fasor, una representación de vectores (Clayton et al. 2004, Digman et al. 2008),

para cuantificar el tiempo de vida del donor (Verveer et al. 2000, Caiolfa et al. 2007). El fasor

Materiales y Métodos

92

representa el decaimiento de fluorescencia en un espacio transformado de Fourier. La fase y

la modulación son medidas en cada pixel de una imagen y son usados para determinar las

coordinadas del fasor en ese pixel, para así establecer el tiempo de vida de fluorescencia del

donor. El fasor es entonces un vector, cuyas coordinadas polares son s y g, relacionadas

directamente con la fase y modulación, los parámetros físicos que se miden directamente. Es

importante destacar que la estrategia del fasor no requiere de un modelo de ajuste, sino que

expresa el decaimiento de fluorescencia en términos de las coordinadas polares. En los

experimentos utilizamos la componente del segundo armónico, que corresponde a 40 MHz.

El fasor asociado con una célula obtenida a través de este sistema se determinó

como un promedio de la imagen celular. El fasor de autofluorescencia fue determinado

tomando las imágenes de FLIM de células no transfectadas. Se determinó el fasor del donor

en ausencia y presencia del aceptor. Para cada experimento, se colectaron múltiples

imágenes del donor en ausencia del aceptor para tomar un valor fasor promedio, que fue

asignada a la posición del donor en ausencia del aceptor. El FLIM puede de esta forma medir

el acortamiento en el tiempo de vida media que resulta de FRET (Wouters & Bastiaens 1999).

La cuantificación de FRET en el gráfico del fasor se alcanza al medir el corrimiento del fasor

entre las dos especies: el donor en ausencia y en presencia del aceptor. Según se describe en

Digman et al. (2008) a partir de los fasores de autofluorescencia y del donor en ausencia del

aceptor se calcula la trayectoria de eficiencia variable de FRET (0-100%). Esto permite

determinar la eficiencia de FRET del fasor promedio de cada célula de donor en presencia del

aceptor.

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