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Introdução
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No Brasil o tipo de colonização e povoamento geraram locais
satisfatórios para o desenvolvimento de várias doenças (Koshiba &
Pereira, 1991).
As doenças parasitárias são vistas, ainda, como um problema
sem solução, principalmente nas áreas onde o desenvolvimento é
precário. Estas doenças podem afetar tanto o homem quanto os
animais, causando-lhes alterações sistêmicas devido a facilidade de
transmissão e desenvolvimento desses parasitas (Brunet et al.,
1998).
Dentre os principais helmintos de interesse médico e
veterinário está o Schistosoma mansoni, responsável pela
transmissão da esquistossomose mansônica (Hagan et al., 1998;
Brunet et al., 1998).
O Schistosoma mansoni é um trematoda digenético da família
Schistomomatidae, causador de uma doença parasitária endêmica
que afeta 8 milhões de pessoas no Brasil (Hagan et al., 1998).
Entretanto, um declínio no número de pessoas atingidas foi
observado devido ao sistema de quimioterapia adotado pelo PECE
(Programa Especial de Controle da Esquistossomose). Contudo, a
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esquistossomose continua sendo uma doença peri-urbana em
rápida expansão devido a abundância de água, fator essencial para
o ciclo dessa doença. (Hagan et al, 1998).
Esta espécie foi descrita por Sambon em 1907, baseando-se
na morfologia dos ovos, e por Silva em 1908, pelas características
do verme adulto. Portadores de esquistossomose mansônica
apresentam vermes adultos acasalados capazes de produzir de 150
a 3000 ovos/ dia por casal sexualmente ativo (Coelho, 1970). A
deposição de ovos do Schistosoma mansoni no fígado, intestino e
pulmões no hospedeiro induz ao aparecimento de uma reação
granulomatosa com subsequente fibrose (Warren, 1972a; 1978 e
Nash et al., 1982). O granuloma hepático pode apresentar um
volume até cem vezes maior que o ovo, bloqueando o fluxo
sanguíneo local e provocando hipertensão portal (Warren 1973;
1978).
Deste modo, verificamos que a esquistossomose mansônica é
uma doença cuja patologia está basicamente associada às reações
do hospedeiro ao ovo do parasita.
Um outro helminto de interesse clínico e científico é a
Syphacia obvelata. Este parasita é um nematodeo da família
Oxyuridae capaz de parasitar, também, homens e camundongos. É
considerado não patogênico por não causar danos macroscópicos e
sua presença só é detectada após a expulsão de ovos pelas fezes
(Neves, 1997).
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O ciclo de vida da Syphacia obvelata é direto e dura de 8 a 15
dias. Após a ingestão de ovos pelo hospedeiro, a larva cresce e se
modifica, tornando-se sexualmente madura entre 6 e 7 dias. Após a
fecundação, o macho morre e é eliminado pelas fezes. As fêmeas
grávidas migram do intestino para o reto e depositam os ovos na
região perianal morrendo logo em seguida. Os ovos depositados
tornam-se infectantes em poucas horas (Neves, 1997).
Durante a infecção por Syphacia obvelata é observada uma
defesa humoral, com presença de IgG específica contra o verme,
contribuindo para a modulação do sistema imune do hospedeiro.
Além disso, a parasitose por este helminto pode predispor,
transmitir ou favorecer o desenvolvimento de doenças bacterianas
e virais, e suprimir ou aumentar o crescimento tumoral (Sato et al.,
1995, Nakagawa et al., 1984).
Assim, de posse dessas informações, parece existir uma
relação hospedeiro-parasita bastante complexa nestas duas
parasitoses, devido a exposição contínua a antígenos. Dentro deste
contexto, o estudo e a compreensão de fatores que regulam ou
exarcerbam os processos inflamatórios e, ainda, dos fatores que
controlam o estabelecimento e a manutenção de mecanismos
imunorreguladores constituem aspectos essenciais a uma melhor
compreensão destas parasitoses.
Acredita-se que as linfocinas exerçam um papel fundamental
em inúmeros fenômenos inflamatórios e imunorregulatórios.
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Algumas destas linfocinas já foram descritas como sendo
importantes na esquistossomose:
- fator promotor da estimulação de eosinófilos – ESP (Kazura
et al., 1975)
- fator quimiotático para granulócitos (Dabes, 1985)
- fator inibidor da migração de leucócitos (Rouviex et al.,
1985)
- fator mitogênico – MF (Gazzineli et al., 1983)
Em nosso laboratório foi descrito por Noguiera-Machado et al.,
1983 um fator solúvel derivado de células mononucleares do
sangue periférico de portadores de esquistossomose mansônica em
fase crônica. Os autores observaram que este fator era capaz de
inibir a citotoxicidade de granulócitos humanos contra
esquistossômulos in vitro, em um ensaio dependente de
complemento (Nogueira-Machado et al., 1983). Os autores ainda
demostraram que o GIF (Fator Inibidor da Citotoxicidade de
Granulócitos) era capaz de modular a formação de granuloma de
fase aguda em camundongos entre 6 e 9 semanas de infecção,
parecendo, assim, estar envolvido nos fenômenos de
imunomodulação observados durante a esquistossomose
(Nogueira-Machado et al., 1988). Entretanto, a presença de GIF em
outras parasitoses causadas ou não por outros helmintos ainda não
foi estudada.
Recentemente, o papel de outras linfocinas nos processos de
imunorregulação tem sido descrito. A IL-10 inibe a produção de NO
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por macrófagos ativados com IFN (Gazzinelli et al., 1992, Cunha et
al., 1992, Bodgan et al., 1991). A capacidade da IL-10 em inibir a
produção de óxido nítrico e a morte de parasitas, como
Schistosoma mansoni e Leishmania, parece estar associado a
inibição da produção de TNF provocada por esta interleucina
(Moore et al., 1993). Sabe-se também que a sensibilização de
camundongos com ovos de parasitas e a presença de IL-12 antes
da infecção limita o tamanho do granuloma e reduz a fibrose
hepática (Cheever et al., 1998; Brunet et al., 1998). A IL-5 e IL-4 são
responsáveis pela eosinofilia e elevados índices de IgE observados
durante as infecções por helmintos, incluindo o Schistosoma
mansoni (Sher et al., 1991). Neste contexto, Brunet et al., 1998
verificaram que a neutralização ou ausência de IL-5 durante a
infecção aguda evita a eosinofilia, mas não afeta o tamanho do
granuloma e a fibrose, demonstrando que a IL-5 tem apenas um
papel secundário na patogênese da esquistossomose.
O IFN é um poderoso agente ativador de macrófagos para a
fagocitose de partículas. Também é ativador de neutrófilos, capaz
de exarcerbar nestes o “burst” respiratório (Abbas et al., 1995).
Além disso, já foi demonstrado que o IFN pode limitar a fibrose em
camundongos infectados por Schistosoma mansoni, sem contudo
afetar o tamanho do granuloma (Brunet et al., 1998).
A participação de células nos mecanismos de
imunorregulação também têm sido alvo de estudos. Sabe-se que
mudanças no metabolismo das células envolvidas nos processos de
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combate ao parasita ocorrem no intuito de reduzir a infecção, por
exemplo, por Escherichia coli (Nonoshiba et al., 1993). Entretanto,
pouco se sabe da participação de granulócitos nos circuitos
imunorregulatórios presentes nas parasitoses.
Os granulócitos são células fagocíticas capazes de gerar altos
níveis de ROS durante os processos inflamatórios ou
imunorregulatórios (Chaves at al, 1996). Dentre estes radicais, sob
o ponto de vista citotóxico, os mais importantes são o oxigênio
“singlet” e o radical hidroxil por participarem da peroxidação
lipídica e oxidação de proteínas.
Estas espécies reativas de oxigênio, denominadas ROS,
podem ser produzidas em um sistema dependente ou não de
enzimas. As vias não enzimáticas ocorrem por radiação ionizante
(Altman et al., 1970), fotólise (Pryor, 1976) e reações do oxigênio
com compostos orgânicos (Mead, 1976). As reações enzimáticas
incluem o citocromo P-450 (Sato e Omura,1978), reações da cadeia
respiratória (Nohl et al, 1979) e através da explosão respiratória de
células fagocíticas (Harman,1981; Babior, 1994; Chanock et
al.,1994).
Durante a fagocitose por granulócitos ocorre uma explosão
respiratória culminando com o aumento da metabolização da
glicose. No processo de obtenção de energia através deste açúcar
ocorre a formação de NADPH+H+, que será utilizado pela NADPH-
oxidase para a formação de espécies reativas de oxigênio. Esta
enzima possui parte de sua estrutura localizada na membrana e
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parte no citoplasma. Quando há uma transferência dos
componentes do citoplasma para a membrana ocorre a dissociação
de um dos componentes da membrana, tornando a enzima ativa
(Chanock et al., 1994; Babior, 1994). Depois de ativada esta enzima
catalisa a transformação de O2 em .O2- (Babior, 1994).
Apesar de ser uma espécie reativa, o superóxido é pouco
danoso quando comparado com as outras espécies reativas de
oxigênio que este pode gerar. (Cheeseman e Slater, 1993). Em pH
fisiológico o superóxido rapidamente se transforma em peróxido de
hidrogênio ou ainda em hidroxil, sob condições especiais como
presença de metais de transição através da reação de Haber-Weiss
(Rosen et al., 1995).
REAÇÃO DE HABER-WEISS
Além das espécies reativas de oxigênio (ROS), os granulócitos
também são capazes de gerar espécies reativas de nitrogênio
(RNS).
A formação de espécies reativas de nitrogênio (RNS) também
está envolvida na defesa do organismo contra patógenos. Esta
geração ocorre através de um complexo enzimático denominado
óxido nítrico sintase (NOS) (Bryant et al., 1992; Chen e Mehta,
1996). Durante a sua formação o nitrogênio é retirado da porção N-
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.O2- + .O2- + 2H+ H2O2 + O2
.O2- + Fe3+ Fe2+ + O2
Fe2+ + H2O2 HO. + HO- +Fe3+
terminal da L-arginina de acordo com a reação abaixo (Knowles e
Moncada, 1994):
Apesar de ser gasoso, na última década, o óxido nítrico vem
ganhando importância tanto na área imunológica quanto na de
neurotransmissão. Propõem-se enormes e variadas funções a esta
pequena molécula de apenas 40Da (Appleton et al., 1996).
A produção de NO dá-se pela óxido nítrico sintase, que possui
três isoformas: a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e a indutível
(iNOS). A nNOS recebeu esta denominação por ter sido
primeiramente observada no sistema nervoso (Bredt et al., 1991;
Nakane et al., 1993), porém agora já é encontrada em células
musculares, neutrófilos, ilhotas pancreáticas, endométrio e epitélio
gastrointestinal (Nathan e Xie, 1994).
Do mesmo modo a eNOS recebeu esta denominação: por ter
sido descrita primeiramente no endotélio, sendo que, atualmente,
também já é observada em outras células como plaquetas (Lamas
et al., 1992; Sessa et al., 1992).
A iNOS recebe esta nomenclatura porque sua expressão é
dependente de um estímulo, ou seja, a célula capaz de expressar
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H2N NH
NH
H2N+ COO-
+ N-OH
NH
H2N+ COO-
+H2N O
NH
H2N+ COO-
+H2N
+ NONADPH
O2
NADPH
O2
L-arginina Ng-hidroxi-L-arginina citrulina óxido nítrico
esta isoforma necessita de um sinal capaz de promover a
transcrição do gene responsável pela mensagem da iNOS. Ela foi
primeiramente descrita em macrófagos (Xie et al., 1992), não
sendo porém restrita a essa linhagem celular: também é
encontrada em outras células do sistema imune como
polimorfonucleares, por exemplo (Appleton et al., 1996).
Apesar da homologia existente entre as NOS (cerca de 90%),
elas possuem modos de ação diferentes. Assim, as isoformas nNOS
e eNOS são chamadas de constitutivas (cNOS). Essas formas
constitutivas dependem de calmodulina e Ca2+ para produzirem
óxido nítrico. A forma indutível, iNOS, é independente de Ca2+ pois
já possui a calmodulina ligada. Todas as isoformas necessitam de
co-fatores como nucleotídeo de adenina-flavina, mononucleotídeo
falvina, nicotidamida adenina de nucleotídeo fosfato e
tetrahidropterina. (Appleton et al., 1996).
Recentemente, uma nova abordagem tem sido feita para se
avaliar o balanço entre as espécies reativas de oxigênio (ROS) e
nitrogênio (RNS).
O óxido nítrico provém da óxido nítrico sinatase e está
envolvido na paralização da peroxidação lipídica (Darley-Usmar et
al., 1995). As espécies reativas de oxigênio são produzidas,
basicamente, de quatro maneiras: respiração mitocondrial, NADPH-
oxidase, xantina oxidase e oxidação de biomoléculas endógenas
(Rosen et al., 1995). Quando há um desequilíbrio na produção de
ROS, estas espécies reagem com o óxido nítrico e produzem
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peróxido nitrito. Este, por sua vez, é instável, capaz de formar
espécies ainda mais danosas as células que as RNS e ROS
separadamente (Ignarro et al., 1993, Van der Vliet et al., 1994,
Crow et al., 1995).
Assim, uma produção aumentada de espécies reativas, tanto
do oxigênio quanto do nitrogênio, pode causar lesões no organismo
(Chaves et al., 1996). Portanto, alterações metabólicas observadas
em algumas patologias podem ser decorrentes de uma não
compensação satisfatória do poder redutor celular, já que o
organismo em condições normais tende a manter-se em equilíbrio.
(Nogueira-Machado et al., 1995;Chaves et al., 1998).
O poder redutor celular é composto por sistemas enzimático e
um não enzimático, capazes de neutralizar os efeitos das espécies
reativas por utilização do sistema redox, pela transferência de
elétrons (Cadenas, 1995).
Dentre os principais compostos não enzimáticos estão, por
exemplo, o -tocoferol), ácido ascórbico e -caroteno (Cadenas,
1995).
O -tocoferol é conhecido como vitamina E. Está presente nas
membranas celulares, portanto, é um importante antioxidante
envolvido no controle da peroxidação lipídica. (Martinez-Cayuela,
1995). Todavia, esta neutralização gera um outro composto reativo,
o tocoferil, que é neutralizado pelo ácido ascórbico-GSH. O ácido
ascórbico parece também estar envolvido na neutralização de
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compostos reativos derivados de nitrogênio, como o óxido nítrico e
peroxidonitrito. (Van der Vliet et al., 1994).
A GSH (glutationa reduzida) pode ser oxidada por ação direta
com ROS, tornando-se oxidada (GSSH) (Proctor e Reynolds, 1984;
Cadenas, 1989), mas também parece estar envovida na
neutralização de óxido nítrico (Clancy et al, 1994; Kröncke et al.,
1997).
Dentre as enzimas envolvidas na neutralização de ROS estão
as superóxido desmutase, as catalases e as peroxidases, que em
sua maioria necessita de metais como manganês, sódio ou ferro
(Niwa et al., 1993).
Apesar de suas ações já serem bem estudas para a
neutralização de ROS, recentemente têm-se observado avanços nos
estudos do envolvimento destas proteínas na neutralização de RNS.
A catalase e a peroxidase, por exemplo, são capazes de neutralizar
H2O2, impedindo assim a formação de íons ainda mais danosos às
células. A expressão das catalases ainda é indutível pelo óxido
nítrico, demonstrando que esta enzima pare estar envolvida em
sistemas antioxidantes contra este óxido (Kröncke et al., 1997).
A superóxido desmutase, enzima capaz de neutralizar o
superóxido, também pode ter sua expressão induzida por óxido
nítrico. Ela também possui um papel importante na neutralização
deste óxido pois sua ação compromete a formação de peroxinitrito
(Nunoshiba et al, 1995; Sano et al, 1996, Kröncke et al., 1997).
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Torna-se pertinente ainda destacar que para o avanço dos
estudos sobre os mecanismos imunorreguladores presente nas
parasitoses, o auxílio de um modelo experimental em animais é
uma ferramenta de grande valia. Estes estudos podem contribuir
para um melhor entendimento das alterações observadas no
hospedeiro, decorrentes da ação dos parasitas.
Neste contexto, nosso trabalho tentará verificar,
primeiramente, se a produção de GIF (fator inibidor da
citotoxicidade de granulócitos) é exclusiva de células
mononucleares humanas ou células mononucleares de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni também podem
reproduzir o GIF. Além disso, verificaremos se este fator pode ser
detectado em outras helmintoses. Como passo adicional,
tentaremos correlacionar o efeito do GIF (produzido por células
mononucleares de camundongos infectados por Schistosoma
mansoni e Syphacia obvelata) sobre o balanço ROS/RNS e
ROS/RNS/CRP (poder redutor celular)devido ao envolvimento de
linfocinas, granulócitos e de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio nos mecanismos de inflamação e imunorregulação.
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Objetivos
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Objetivo Geral
Avaliar o efeito do GIF produzido por células mononucleares
de camundongos infectados por Schistosoma mansoni e Syphacia
obvelata em granulócitos humanos
Objetivos específicos
Avaliar se células mononucleares de camundongos infectados
por Schistosoma mansoni são capazes de produzir o GIF
Avaliar se o GIF pode ser produzido por células
mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata
Avaliar, comparativamente, o efeito do GIF produzido por
células mononucleares de camundongos infectados por
Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata na produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS) por granulócitos humanos,
através de quimoluminescência.
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Avaliar, comparativamente, o efeito do GIF produzido por
células mononucleares de camundongos infectados por
Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata na produção das
espécies reativas de nitrogênio (RNS) por granulócitos humanos,
avaliado pela reação de Griess.
Avaliar, comparativamente, o efeito do GIF produzido por
células mononucleares de camundongos infectados por
Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata no poder redutor de
granulócitos humanos (CRP), avaliado pela metabolização de MTT.
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Material e Métodos
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1-Reagentes
1- Monopaque- BION Ltda
2- Leukopaque- BION Ltda
3- MTT - 3-(4,5 dimethyazol-2yl)-2,5 diphenyltetrazolium
bromide - Sigma
4- Isopropanol - Vetec
5- Ácido clorídrico - Merk
6- Azul de Trypan - Sigma
7- RPMI 1640 - Sigma
8- Luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalozinedione) - Sigma
9- Sulfanilamida - Sigma
10- Naftiletilenodiamida - Sigma
11- Ácido fosfórico 85% - Sigma
12- Liquemine – Roche
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2- Obtenção de células
2.1- Células Humanas
Os granulócitos humanos foram obtidos através da
separação, descrita por Bicalho et al., 1981, do sangue periférico de
doadores selecionados pela Fundação HEMOMINAS.
2.2- Células de Camundongo
As células de camundongos foram obtidas de duas maneiras.
As células do sangue periférico (células mononucleares e
granulócitos) foram retiradas através de punção subclávica
enquanto o camundongo era mantido sob o efeito anestésico do
éter. Após a sua morte, o baço foi retirado para a futura obtenção
de células mononucleares deste órgão.
3- Separação de células humanas
O sangue, 4 ml, foi empilhado sobre o gradiente de dupla
densidade de Ficoll-Hypaque (densidade= 1,08 e 1,12,
respectivamente), 6mL, e submetido à centrifugação por 30
minutos a 100G. Feito isso, ocorreu uma separação dos
componentes do sangue, ficando o plasma na porção superior,
enquanto as hemácias permaneceram depositadas no fundo. Entre
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essas duas fases formaram-se dois anéis: um mais próximo do
plasma, rico em células mononucleares, e outro mais próximo às
hemácias, rico em granulócitos.
Os anéis foram retirados separadamente e colocados em
tubos de ensaio siliconizados para lavagem com solução salina
balanceada de Hank´s, pH=7,4. Ambos foram submetidos à
centrifugação por 30 minutos a 50G. Após este procedimento foi
retirado o sobrenadante e o material depositado foi ressuspenso
para nova centrifugação, por 15 minutos a 100G. Após as lavagens,
as células foram ressuspensas em 1,0 mL da solução salina
balanceada de Hank´s, pH=7,4, para os ensaios de
quimioluminescência e MTT; ou 1,0 mL de RPMI, pH=7.4, para a
dosagem de óxido nítrico. A viabilidade celular foi avaliada através
de exclusão por Azul de Trypan, mostrando-se, sempre, superior a
95%.
4-Separação de células de camundongo
4.1- Granulócitos
O sangue periférico (700L) foi colocado sobre 700L de
gradiente de dupla densidade Ficoll-Hypaque e, a partir desse
ponto, a separação deu-se do mesmo modo que em células
humanas.
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4.2- Células mononucleares
O baço foi esmagado sob uma peneira com poros de 1mm.
Esta peneira foi lavada para a retirada das células com 5mL de
solução salina NaCl 0.15M, para cada baço de camundongo
utilizado. Os 5Ml foram, então, empilhados sobre gradiente
monopaque para a separação das células mononucleares
presentes no baço. Após a centrifugação por 15 min a 100G, foi
retirado o anel rico em mononucleares. Esse anel foi lavado com
solução salina de Hank’s, pH 7.4, por 30 min a 50G. Após este
procedimento o sobrenadante foi retirado e as células foram
ressuspenssas em solução salina de Hank’s, pH 7.4, e centrifugadas
por 15 min a 100G. O “pellet” foi ressupenso em 1ml de solução
salina de Hank’s, pH 7.4. A viabilidade celular fio avaliada por
exclusão com Azul de Trypan e, sempre, se manteve superior à
95%.
5- Obtenção de GIF (Fator Inibidor da Citotoxicidade de
Granulócitos)
Células mononuclerares foram obtidas, tanto do sangue
periférico quanto do baço de camundongos, conforme descrito
anteriormente.
Pérolas de poliacrilamida conjugadas com SEA (Soluble Eggs
Antigen) ou SWAP (Soluble Worm Adult Proteins) de Schistosoma
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mansoni e antígeno de Syphacia obvelata foram incubadas com
células mononucleares, na proporção de 200 “beads” para 1x106
células, para produção de GIF. Essas células com “beads” foram
mantidas por 24h em estufa 5% de CO2 a 37ºC. Após a incubação, o
sobrenadante rico em GIF foi retirado após ter sido centrifugado por
15 minutos a 100G.
6- Ensaio de quimioluminescência
O volume de células obtidas na separação foi acertado para
1x106 granulócitos/100L. Uma solução de luminol 10-4M (500L) foi
acrescentado a 100L de granulócitos sendo colocado no
luminômetro.
As espécies reativas de oxigênio reagem com o luminol (5-
amino-2,3-dihidro-1,4phtalozinedione) produzindo um ânion
instável, o -aminoftalato, que libera um fóton de luz quando
retorna à sua forma eletrônica estável. A luz é diretamente
proporcional à quantidade de espécies reativas de oxigênio
produzidas. Essa reação ocorre no interior do aparelho (1250-
Luminometer, Bio Orbit) que é dotado de um sistema de catôdo e
ânodo, o qual permite a leitura dos fótons emitidos no comprimento
de onda de 425nm. O aparelho é dotado de impressora que faz o
registro de leitura de 1 em 1 minuto.
Após 10 minutos de leitura basal no luminômetro, o GIF
(200L) foi acrescentado aos granulócitos, no experimento teste,
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enquanto que no experimento controle foi acrescentado 200L de
solução salina balanceada de Hank´s pH=7,4, de modo que o
volume final fosse 700L. A leitura foi feita por mais 30 minutos, em
intervalos de 1 minuto, e os valores expressos em Unidade Relativa
de Luz/ segundo (RLU/s).
7- Ensaio de quantificação de óxido nítrico
A avaliação da produção de óxido nítrico foi feita através da
dosagem de nitrito, que é o metabólito estável desta produção
(Ignarro et al., 1993; Crow e Beckman, 1995). A dosagem de nitrito
foi feita através da Reação de Griess (Griess, 1864 e 1879).
Os granulócitos (1x106 em RPMI pH=7,4) foram incubados
com 200L de GIF (experimento teste), ou sem GIF (experimento
controle), por 24h em estufa de CO2 a 37ºC em tubos siliconizados.
Em todos os ensaios o volume final foi de 500L, ajustado com RPMI
pH=7,4. O sobrenadante foi retirado após centrifugação, 15
minutos a 100G, e distribuído em placas de 96 poços, 100L por
poço, em triplicata. O “pellet” foi ressuspenso em 200l de RPMI
pH=7,4 para análise imediata da viabilidade celular.
Aos 100L de sobrenadante dispostos na placa foi
acrescentado 100L de solução de Griess, formada por
sulfanilamida 1% em 2,5mL de ácido fosfórico e
nafitiletilenodiamida 0,1% em 2,5% de ácido fosfórico, na
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proporção de 1:1. A leitura da produção de nitrito foi feita em leitor
de ELISA, no comprimento de onda de 540nm.
A concentração de nitrito foi calculada por regressão linear,
usando-se a curva padrão obtida a partir da diluição seriada de
uma solução de nitrito de sódio 1mM em RPMI. Nesta curva padrão
r2, sempre, se mostrou superior a 0,98 (figura 1).
Figura 1- Curva padrão típica utilizada para cálculo da concentração de nitrito
nos experimentos de dosagem de óxido nítrico
A partir da curva padrão e dos valores de absorbância obtidos no leitor de ELISA a 570nm, a concentração de nitrito dos sobrenadantes dos granulócitos humanos, após 24 h de incubação, foi estimada através de regressão linear. Cálculos feitos no software MicroCal Origin 3.0.
24
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25-0 ,2
0 ,0
0 ,2
0 ,4
0 ,6
0 ,8
1 ,0
1 ,2
1 ,4
1 ,6
Abso
rbân
cia
(540
nm)
Co ncentração de nitr ito
8- Avaliação da capacidade redutora celular
Este ensaio foi avaliado através da metabolização de MTT [3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazollium bromide], um sal
de tetrazílo, segundo Malaquias et al.,1991, Silva-Teixeira, 1990 e
Gomez et al.,1994.
Nesse ensaio a redução do sal de tetrazólio requer a
participação de desidrogenases que utilizem o NADPH ou FADH2
como cofatores. Essa redução baseia-se no principio de colorimetria
onde o sal oxidado possui coloração amarela. Quando este sal é
reduzido por essas desidrogenases adquire coloração variando de
castanho a azul, dependendo da intensidade da metabolização
celular.
Granulócitos humanos (1x106 células em solução salina de
Hank’s pH 7.4) incubados ou não na presença de GIF, produzido por
células mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço
de camundongos, foram colocados em banho-maria a 37ºC por 30
minutos. Após essa primeira incubação, a solução de MTT (5mg/mL)
foi acrescentada (20L) e as células permaneceram por mais 2
horas na mesma incubação para a devida metabolização do sal.
Após 2 horas foi acrescentada uma solução de
Isopropanol/HCl 0,04N para que as células fossem rompidas e a
metabolização paralizada. Fez-se, então, uma homogeinização
através de vortex para que os cristais de formazan, derivados da
25
metabolização do MTT, fossem dissolvidos para a leitura em
espectrofotômetro (ausJENA) no comprimento de onda de 570nm.
9- Análise parasitológica
Os intestinos dos camundongos foram retirados e submetidos
a análises parasitológicas, pelo método de Hoffaman, para que só
fossem utilizados os sobrenadantes provenientes de células de
camundongos que não possuíssem parasitas ou que possuíssem
somente Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata.
10- Avaliação da viabilidade celular
A viabilidade dos granulócitos foi avaliada através do teste de
exclusão pelo Azul de Trypan (Oliveira-Lima e Dias da Silva,1970).
11- Análises estatísticas
O teste estatístico usado foi o Teste “t” Student, que é
normalmente utilizado em situações onde se deseja determinar o
nível de significância de um tratamento em relação a um grupo dito
controle. Essa teste é usado em casos de amostras pequenas onde
a distribuição é, presumidamente, normal.
26
Resultados
27
I- EFEITO DO GIF PRODUZIDO POR CAMUNDONGOS
INFECTADOS POR Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata
SOBRE GRANULÓCITOS HUMANOS: AVALIAÇÃO DA
CAPACIDADE CITOTÓXICA E PRODUÇÃO DE ESPÉCIES
REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS)
28
O GIF (fator inibidor da citotoxicidade de granulócitos) é um
fator solúvel, derivado de células mononucleares sob estimulação
antigênica, que foi primeiramente estudado em células humanas.
Esse fator foi capaz de inibir a citotoxicidade de granulócitos
humanos contra esquistossômulos in vitro na dependência de
complemento. Com o objetivo de melhor caracterizá-lo, resolvemos
avançar nossos estudos utilizando o modelo experimental em
camundongos.
Nosso primeiro passo foi verificar se células mononucleares
de camundongos eram capazes de sintetizar o GIF e se este teria o
mesmo efeito biológico do sintetizado pelas células humanas.
Células mononucleares (sangue periférico e baço) de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram
incubadas por 24 h com “beads” recobertas com SWAP ou SEA em
estufa 5% de CO2 a 37ºC. Após esse período, as células foram
centrifugadas e os sobrenadantes, isentos de células e antígenos,
foram recolhidos e testados. Para melhor atendermos ao nosso
29
objetivo inicial de comparação do efeito do GIF humano com o de
camundongo, reproduzimos o ensaio utilizado para o GIF humano, a
saber: ensaio citotóxico dependente de complemento.
Os resultados da figura 2 mostram que o sobrenadante de
células mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço
de camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram
capazes de inibir significativametne (P<0.05) a capacidade
citotóxica de granulócitos de camundongos (painel A).
Entretanto, sobrenadantes de células mononucleares de
camundongos não infectados por Schistosoma mansoni não foram
capazes de inibir significativamente (P>0.05) a citotoxicidade de
granulócitos de camundongos (figura 2, painel B).
30
Figura 2- Efeito do GIF sobre a capacidade citotóxica de granulócitos de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni contra esquistossômulos in
vitro.
NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células
31
E+Cci E+Cc E+Cc+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
10
20
30
40
50%
de
larv
as
mor
tas
E+Cci E+Cc E+Cc+G G+Sp G+Sb0
10
20
30
40
50
% d
e la
rvas
m
orta
sA
B
* *
NSNS
mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF
32
A partir desses resultados resolvemos testar se o GIF
produzido por células mononucleares de camundongos atuaria em
granulócitos humanos. Esse fato nos traria vantagens tanto no
manuseio como na maior facilidade de obtenção dos granulócitos.
Nossos resultados mostram que o GIF produzido por células
mononucleares de camundongos infectados por S. mansoni foi
capaz de inibir, significativamente (P<0,05), a citotoxicidade de
granulócitos humanos (figura 3, painel A).
Entretanto, sobrenadantes de células mononucleares de
camundongos não infectados por Schistosoma mansoni, não foram
capazes, também, de inibir significativametne (P>0.05) a
citotoxicidade de granulócitos humanos (figura 3, painel B). Esses
resultados nos mostram que a ação do GIF não é espécie específica.
Com base nestes achados, o nosso estudo, a partir deste momento,
consistirá em verificar o efeito do GIF produzido por células
mononucleares de camundongos em granulócitos humanos.
33
Figura 3- Efeito do GIF (sintetizado por células mononucleares de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni) sobre a capacidade citotóxica de
granulócitos humanos contra esquistossômulos in vitro
NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF
34
E+chi E+ch E+ch+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
10
20
30
40
50%
de
larv
as
mor
tas
E+chi E+ch E+ch+G G+Sp G+Sb0
10
20
30
40
50
% d
e la
rvas
m
orta
sA
B
* *
NSNS
Outro ponto tornava-se passível de estudo. Verificamos,
através das análises parasitológicas, que muitos camundongos
considerados controle estavam infectados por outro parasita:
Syphacia obvelata, que, como o Schistosoma mansoni, é um
helminto. Resolvemos verificar, então, se células mononucleares de
camundongos infectados por Syphacia obvelata eram capazes de
produzir o GIF.
Nossos resultados mostram que o sobrenadante de células
mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata
foi capaz de inibir significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de
granulócitos humanos (figura 4, painel A). Novamente,
sobrenadantes de células mononucleares de camundongos não
infectados por Syphacia obvelata não foram capazes, também, de
inibir significativamente (P>0.05) a citotoxicidade de granulócitos
humanos (figura 4, painel B).
35
Figura 4- Efeito do GIF produzido por camundongos infectados por Syphacia
obvelata sobre a capacidade citotóxica de granulócitos humanos in vitro.
NS= não significativo quando comparado ao controle*P<0,05 pelo Teste “t” Student quando comparado ao controleOs valores represemtam a média de três experimentos em triplicata + desvio padrãoE=esquistossômulos; Cci=complemento de camundongo inativado, Cc=complemento de camundongo, G=granulócitos de camundongo, Sp=sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos em ausência de GIF, Sb=sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos em ausência de GIF, Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos rico em GIF, Sb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos rico em GIF
36
E+chi E+ch E+ch+G G+Sp G+Sb0
10
20
30
40
50
% d
e la
rvas
m
orta
s
E+chi E+ch E+ch+G G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
10
20
30
40
50
% d
e la
rvas
m
orta
s
A
B
**
NS NS
Entretanto, o sobrenadante produzido pelas células
mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata
foi obtido através de estimulação com antígeno de verme adulto
(SWAP) ou ovo (SEA) do Schistosoma mansoni. Resolvemos, então,
estimular essas células com “beads” de poliacrilamida recobertas
com antígeno de Syphacia obvelata para verificarmos se este
também era capaz de inibir a reatividade de granulócitos. Assim,
células mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos
infectados por Syphacia obvelata foram incubadas com antígenos
de Syphacia obvelata por 24h a 37ºC e 5% de CO2. Após decorrido
este tempo, as células foram centrifugadas e os sobrenadantes
(isentos de células e antígenos) foram testados no ensaio de
quimioluminescência.
A figura 5 mostra que granulócitos incubados com
sobrenadantes ricos em GIF, produzidos tanto por células
mononucleares do sangue periférico (painel B) quanto do baço de
camundongos (painel C) infectados por Syphacia obvelata, foram
capazes de inibir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)
quando comparados com o controle. Para quantificarmos as
diferenças observadas na produção dessas espécies reativas
utilizamos o pico máximo da reação (RLU/s).
Nossos resultados mostram que granulócitos incubados com
sobrenadante rico em GIF de células mononucleares do sangue
periférico e do baço de camundongos, infectados por Syphacia
obvelata, foram capazes de inibir significativamente (P<0.05) a
37
produção de espécies reativas de oxigênio quando comparados
com o controle pelo Teste “t” de Student. (tabela 1).
Figura 5- Curva típica do efeito do GIF produzido por células mononucleares de
camundongos infectados por Syphacia obvelata e estimuladas com antígeno de
Syphacia obvelata sobre a produção de ROS de granulócitos humanos
G= granulócitos humanosHank’s= solução salina balanceada pH 7.4Sp*GIF= sobrenadante de células mononucleares do sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata rico em GIFSb*GIF= sobrenadante de células mononucleares do baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata rico em GIFRLU/s= unidade relativa de luz/segundo
38
10 20 30 400
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
pico
máx
imo
(RLU
/s)
tempo (min)
10 20 30 400
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
pico
máx
imo
(RLU
/s)
tempo (min)10 20 30 40
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
pico
máx
imo
(RLU
/s)
tempo (min)
C
A
B
G+Hank’s
G+Sp*GIFG+Sb*GIF
39
II- EFEITO DO GIF PRODUZIDO POR CAMUNDONGOS
INFECTADOS POR Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata
SOBRE O BALANÇO ROS/RNS E ROS/RNS/CRP EM
GRANULÓCITOS HUMANOS
40
Neste bloco de resultados os nossos estudos avaliarão,
comparativamente, o efeito do sobrenadante produzido por células
mononucleares de camundongo infectados por Schistosoma
mansoni e por Syphacia obvelata sobre o balanço ROS/RNS em
granulócitos humanos. A nosso ver, este estudo se faz pertinente
pois o envolvimento dessas espécies oxidantes (ROS e RNS) nos
mecanismos imunorregulatórios e inflamatórios é de grande
relevância, assim como é o papel de linfocinas e interleucinas na
regulação desses sistemas.
Nossos resultados mostram que o GIF produzido por células
mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de
inibir a produção de ROS significativamente, pelo Teste “t” de
Student (P<0.05), pelos dois parâmetros analisados, pico máximo
da reação (Unidade relativa de luz/ segundo - RLU/s) e a produção
total de ROS (área da integral sob a curva em cm2), como pode ser
observado na figura 6.
41
Figura 6- Efeito do GIF (camundongos infectados por Schistosoma mansoni)
sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por granulócitos
humanos
*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controleOs valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanosSp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoniSb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni
42
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
prod
ução
tota
l de
ROS
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
pico
máx
imo
(RLU
/s)
A
B
**
* *
O GIF produzido por células mononucleares do sangue
periférico e do baço de camundongos infectados por Syphacia
obvelata também foi capaz de inibir significativamente (P<0,05) a
produção de ROS pelos dois parâmetros analisados (figura 7- painel
A e B).
Assim, após termos observado o efeito do GIF sobre a
geração de ROS, passamos então ao estudo das outras espécies
oxidantes, já que capacidade oxidante é formada por espécies
reativas derivadas do oxigênio (ROS) e do nitrogênio (RNS). Para
tal, avaliamos também a produção de RNS através da dosagem do
seu metabólito estável, o nitrito.
Diferente do observado com a produção de espécies reativas
de oxigênio (ROS), nossos resultados mostram que o GIF produzido
por células mononucleares, tanto do baço quanto do sangue
periférico, de camundongos infectados por Schistosoma mansoni,
foi capaz de aumentar, siginificativamente (P<0,05), a produção de
RNS pelo Teste “t” de Student quando comparado com os níveis
basais (figura 8). A figura 9 mostra que o GIF produzido por
camundongos infectados por Syphacia obvelata foi, também, capaz
de aumentar significativamente (P<0.05) a produção de nitrito
quando comparado ao controle.
43
Figura 7- Efeito do GIF (células mononucleares de camundongos infectados por
Syphacia obvelata) sobre a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) por
granulócitos humanos.
*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata
44
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
pico
máx
imo
(R
LU/s)
**
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
prod
ução
tota
l de
ROS
**
A
B
Figura 8- Efeito do GIF (células mononucleares de camundongos infectados por
Schistosoma mansoni) sobre a produção de espécies reativas de nitrogênio
(RNS) por granulócitos humanos.
*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni
A pré incubação dos granulócitos com L-NAME e posteriormente com GIF
provocou uma inibição de aproximadamente 48% quando comparado com o
controle contendo apenas GIF, em estudos preliminares
45
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
5
10
15
20
25
conc
entra
ção
de n
itrito
(uM
)
*
*
Figura 9- Efeito do GIF (células mononucleares de camundongos infectados por
Syphacia obvelata) sobre a produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS)
por granulócitos humanos.
*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrãoG=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata
A pré incubação dos granulócitos com L-NAME e posteriormente com GIF
provocou uma inibição de aproximadamente 50% quando comparado com o
controle contendo apenas GIF, em estudos preliminares
46
*
*
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
5
10
15
20
25
conc
entra
ção
de n
itrito
(uM
)
Assim, na análise do balanço ROS/RNS, observamos que o GIF
(produzido tanto por células mononucleares de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni como por Syphacia obvelata)
provocou um aumento da produção de RNS e uma queda em ROS,
o que ocasionou uma alteração neste balanço, favorecendo a
produção de óxido nítrico (figura 10).
47
Figura 10- Avaliação do balanço ROS/RNS em granulócitos humanos na
presença ou ausência de GIF produzido por células mononucleares de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata
Schistosoma mansoni Syphacia
obvelata
*P<0,05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrão
G=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou por
Syphacia obvelata
48
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
pico
máx
imo
(RLU
/s)
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
5
10
15
20
25
conc
entra
ção
de n
itrito
(uM
)
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
pico
máx
imo
(R
LU/s)
* *
*
*
*
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0
5
10
15
20
25
conc
entra
ção
de n
itrito
(uM
)
**
*
ROS ROS
RNS RNS
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni ou por Syphacia
obvelata
49
Nosso próximo passo foi analisar a atuação do GIF sobre o
poder redutor celular (CRP). Nossos resultados mostram que
granulócitos incubados com GIF produzido por células
mononucleares tanto do sangue periférico quanto do baço de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni foram capazes
de inibir significativamente (P<0.05) o CRP quando comparado ao
controle (figura 11). O GIF produzido por células mononucleares
(sangue periférico e baço) de camundongos infectados por
Syphacia obvelata também foi capaz de inibir significativamente
(P<0.05) o CRP de granulócitos humanos (figura 12).
Assim, tendo em vista a hipótese do equilíbrio
oxidante/redutor proposto por Nogueira-Machado et al., 1995 e
Chaves et al., 1996, realizamos a análise do efeito do GIF sobre o
balanço ROS/RNS/CRP (poder redutor celular).
Na análise conjunta do balanço oxidante (ROS/RNS)/redutor
(CRP) verificamos uma diminuição significativa, P<0,05, de ROS e
CRP e um aumento significativo, P<0,05, da produção de RNS
(tabela 2). Esses resultados nos mostram um favorecimento da
relação ROS/RNS/CRP a favor de RNS que poderia indicar a atuação
do GIF como um agente imunomodulador e, também,
antinflamatório.
50
Figura 11- Análise do poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos sob
o efeito do GIF produzido por células mononucleares de camundongos infectados
por Schistosoma mansoni
*P<0.05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrão
G=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Schistosoma mansoni
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Schistosoma mansoni
51
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
D.O.
(570
nm)
**
Figura 12-Análise do poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos sob o
efeito do GIF produzido por células mononucleares de camundongos infectados
por Syphacia obvelata
*P<0.05, pelo Teste “t” de Student, quando comparado ao controle
Os valores representam três experimentos em triplicata + desvio padrão
G=granulócitos humanos
Sp*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
sangue periférico de camundongos infectados por Syphacia obvelata
Sb*GIF= Sobrenadante rico em GIF produzido por células mononucleares do
baço de camundongos infectados por Syphacia obvelata
52
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
D.O
.(57
0nm
)
G+Hank's G+Sp*GIF G+Sb*GIF0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25D.
O.(5
70nm
)
* *
53
54
Discussão
55
O termo helminto não designa um único grupo ou filo do reino
animal refere-se, porém, a dois grandes ramos ou filos: o dos
56
platelmintos, ou vermes chatos, e dos nematelmintos, ou vermes
cilíndricos (Smyth, 1969; Pessôa & Vianna-Martins, 1977).
Tanto o homem quanto os animais sofrem helmintoses
intestinais e somáticas. A grande importância dessas doenças é
devido a variedade de parasitas capazes de provocá-las e, ainda,
pela vasta disseminação dos mesmos (Pessôa & Vianna-Martins,
1977).
Neste contexto, o entendimento dos fatores que regulam as
reações ocasionadas por esses parasitas têm tomado grande
impulso na literatura. A utilização de modelos experimentais em
camundongos tem sido de grande valia na compreensão desses
fatores, uma vez que esses animais também são susceptíveis a
parasitoses. O camundongo é um bom hospedeiro para o estudo da
resistência adquirida da patologia, já que mostra um amplo
espectro de mudanças induzidas pelos antígenos dos parasitas
(Smyth, 1969).
O controle da intensidade da reação inflamatória estabelecida
durante a fase de cronificação das parasitoses depende de vários
fatores, dentre eles: o genótipo do indivíduo infectado (Abdel-Salam
et al., 1979,1981 e 1986; Bina et al., 1978; Lima-Pereira et al.,
1979), a atuação de linfócitos B e seus componentes solúveis no
soro (Ohta et al., 1991), o tipo de células inflamatórias mobilizadas
(células mononucleares fagocíticas, linfócitos T e B e granulócitos)
(Ottensen, 1979; Todd et al., 1979; Rocking et al., 1980) e
linfocinas (Pearce et al., 1991; Grzych et al., 1991; Xu et al., 1991).
57
Linfocinas são substâncias polipeptídicas produzidas por
linfócitos ativados que participam de uma variedade de reações
imunes. Elas regulam a ativação, crescimento e diferenciação de
várias populações de linfócitos e células inflamatórias (fagócitos
mononucleares, granulócitos e células NK) (Abbas et al., 1995). As
linfocinas agem sobre diferentes tipos celulares e frequentemente
em cooperação, uma influenciando a síntese ou ação da outra. A
sua ação é iniciada pela ligação a receptores específicos na
superfície de células alvo que podem ser as próprias células que as
secretaram (ação autócrina), células vizinhas (ação parácrina) ou
células distantes (ação endócrina). Desse modo, as linfocinas são
moléculas efetoras da imunidade mediada por células e são
também responsáveis por comunicações entre as células do
sistema imune (Arai et al., 1990, Balkwill et al., 1989, Nicola et al.,
1989).
Assim, a ação conjunta de granulócitos e linfocinas, nos
processos inflamatórios decorrentes das parasitoses, tem sido alvo
de inúmeros estudos. Dentre as linfocinas que atuam sobre
granulócitos podemos citar:
Fator promotor da estimulação de eosinófilos – ESP
(Kazura et al., 1975);
Fator inibidor da agregação de leucócitos (Rouveix et al.,
1985);
Fator inibidor da migração de leucócitos – LIF (Lima et al.,
1985);
58
Fator inibidor da aderência de leucócitos – LAIF (Nogueira-
Machado et al., 1985);
Fator quimiotático para granulócitos (Dabés et al., 1985);
Interferon gama - IFN ( Chaves et al., 1996);
Interleucina 10 – IL10 (Chaves et al., 1996);
Inteleucina 8- IL8 (Egan et al., 1996; Faccioli et al., 1998);
Inteleucina 1- IL1 (Chensue et al., 1989; Bresson-Hadni et
al., 1994);
Fator de necrose tumoral - TNF (Egan et al., 1996;
Bresson-Hadni et al., 1994).
Além desses, em nosso laboratório foi descrito por Nogueira-
Machado et al., 1983 um fator solúvel capaz de inibir a
citotoxicidade de granulócitos contra a larva do Schistosoma
mansoni in vitro, em um mecanismo dependente de complemento,
e por isto denominado GIF. Este fator foi primeiramente observado
em sobrenadantes de células mononucleares humanas
estimuladas com antígenos do Schistosoma mansoni (SEA, SWAP e
esquistossômulos).
De posse desses dados, o nosso estudo avaliará se células
mononucleares de camundongos infectados por Schistosoma
mansoni são capazes de produzir o GIF e se este tem o mesmo
efeito biológico apresentado pelo GIF sintetizado por células
humanas. Nossos estudos ainda serão estendidos afim de
averiguarmos se camundongos infectados por um outro helminto,
Syphacia obvelata, são capazes de produzir o GIF. Este estudo, ao
59
nosso ver, se faz pertinente pela frequência de infecção desses
animais por este parasita.
Assim, para atendermos ao nosso objetivo inicial de
comparação do GIF humano com o produzido por células
mononucleares de camundongos, reproduzimos o ensaio utilizado
na descoberta do GIF humano, a saber: o ensaio citotóxico
dependente de complemento.
Nossos resultados mostram que células mononucleares do
sangue periférico e do baço de camundongos infectados com
Schistosoma mansoni foram capazes de produzir o GIF. O efeito do
GIF foi avaliado pela inibição significativa (P<0.05) da capacidade
citotóxica de granulócitos de camundongos (figura 2 – painel A).
Utilizamos como controle camundongos não infectados e
verificamos que o sobrenadante das células mononucleares desses
animais não foram capazes de inibir a citotoxicidade de
granulócitos de camundongos (figura 2 – painel B). Esses resultados
estão de acordo com os resultados encontrados por Soares, 1991,
que verificou que o GIF só é produzido por estimulação antígeno
dependente.
A partir desses resultados, avaliamos se o GIF sintetizado por
células mononucleares de camundongos poderia atuar em
granulócitos humanos. A possibilidade desta hipótese nos traria
grandes avanços nos estudos desse fator solúvel devido à maior
facilidade na obtenção de granulócitos, além de permitir inferências
diretas do efeito do GIF sobre a função destas células nos processos
60
inflamatórios e imunorreguladores presentes na esquistossomose
humana.
Nossos resultados mostram que o GIF produzido por células
mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de inibir
significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de granulócitos
humanos (figura 3- painel A). Esses resultados estão de acordo com
os encontrados por Nogueira- Machado et al., 1983 avaliando o
efeito do GIF produzido por células mononucleares humanas sobre
granulócitos humanos. Estes dados nos permitem, ainda, confirmar
a nossa hipótese de que a ação do GIF não é espécie específica.
Então, de posse dos dados das figuras 2 e 3, passamos a
realizar nossos estudos sobre o GIF produzido por células
mononucleares de camundongos em granulócitos humanos.
Contudo, ao prosseguirmos nossos estudos, verificamos que
muitos camundongos considerados controles eram infectados por
um outro parasita a Syphacia obvelata que, como o Schistosoma
mansoni, é um helminto. Diante deste fato, resolvemos verificar se
células mononucleares de camundongos infectados por Syphacia
obvelata eram capazes, também, de produzir GIF.
Os resultados da figura 4 mostram que o sobrenadante de
células mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos
infectados por Syphacia obvelata foi capaz de inibir
significativamente (P<0.05) a citotoxicidade de granulócitos
humanos.
61
A análise conjunta das figuras 2, 3 e 4 nos mostra que, além
do GIF não ser espécie específica, o ele pode ser sintetizado por
camundongos infectados por outro helminto, Syphacia obvelata.
No entanto, um outro ponto se torna passível de discussão. A
produção de GIF por células mononucleares de camundongos
infectados por Syphacia obvelata foi obtido pela estimulação destas
com antígenos do verme adulto (SWAP) ou ovo (SEA) de
Schistosoma mansoni, ou seja, a produção de GIF, neste caso, deu-
se, possivelmente, através de uma reação cruzada (figura 4).
Assim, nosso próximo passo foi verificar se antígenos de Syphacia
obvelata eram capazes de provocar a produção de GIF por células
mononucleares de camundongos infectados por Syphacia obvelata.
A figura 5 mostra curvas típicas da produção de espécies
reativas de oxigênio (ROS) em ausência (painel A) ou presença de
GIF (painéis B e C). Para quantificarmos as diferenças observadas
na produção de ROS utilizamos o pico máximo da reação (RLU/s).
Nossos resultados mostram que o sobrenadante produzido por
células mononucleares de camundongos infectados por Syphacia
obvelata foi capaz de inibir significativamente (P<0.05) a produção
de ROS quando comparado com o controle (tabela 1). Verificamos
ainda que não existe diferença significativa entre as percentagens
de inibição quando comparamos o GIF produzido por camundongos
infectados por Schistosoma mansoni ou Syphacia obvelata (tabela
1).
62
Comparando os resultados das figuras 2, 3 e 4 e tabela 1
verificamos que a ação do GIF sobre granulócitos se mostrou
sempre inibitória, tanto pela análise da capacidade citotóxica
quanto pela produção de ROS.
Prosseguindo nossos estudos sobre a ação do GIF, produzido
por células mononucleares de camundongos infectados por
Schistosoma mansoni e Syphacia obvelata, avaliamos agora seu
efeito sobre o balanço entre as espécies reativas de oxigênio (ROS)
e as espécies reativas de nitrogênio(RNS).
Achamos que o estudo correlacionado entre o efeito do GIF
sobre o equilíbrio ROS/RNS pode nos trazer informações relevantes
quanto ao efeito biológico deste fator solúvel, uma vez que a
disponibilidade das espécies reativas de oxigênio (ROS) pode ser
um fator determinante na ação do óxido nítrico como molécula
citotóxica ou citoprotetora.
Neste contexto, os granulócitos formam um dos mais
importantes mecanismos de defesa contra infecções (Nagel et al.,
1986). Essas células, sendo fagocíticas, estão envolvidas na defesa
inespecífica e na inflamação, sofrendo alterações morfológicas e
bioquímicas que permitem o controle da infecção. Dentre as
alterações metabólicas decorrentes desse processo, a explosão
respiratória tem um papel fundamental pois leva à produção de
espécies reativas de oxigênio (Babior, 1994). O aumento da
produção dessas espécies altamente tóxicas pode levar ao
comprometimento da resposta inflamatória. Nesse contexto, Gallin,
63
1981, descreveu alterações da resposta quimiotática decorrentes
do aumento da produção de radicais livres. Ainda, o aumento da
produção de ROS pode estar envolvido na deficiência do sistema de
defesa do hospedeiro.
Nossos resultados mostram que, em granulócitos humanos, o
GIF produzido por células mononucleares de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de inibir
significativamente (P<0.05) a produção das espécies reativas de
oxigênio pelos dois parâmetros analisados: produção total de ROS
(integral sob a área da curva em cm2) (figura 6- painel A) e o pico
máximo da reação (figura 6 – painel B).
Os granulócitos humanos também tiveram sua produção de
espécies reativas de oxigênio inibida significativamente (P<0.05)
pelo GIF produzido por células mononucleares de camundongos
infectados por Syphacia obvelata, pelos dois parâmetros
analisados: produção total de ROS (integral sob a área da curva em
cm2) (figura 7-painel A) e pico máximo da reação (RLU/s)(figura 7 –
painel B).
Nossos resultados demonstram que o GIF foi capaz de inibir a
produção de ROS podendo, então, minimizar os danos causados por
estas espécies oxidantes. Com esses resultados, acoplados aos
trabalhos de Nogueira-Machado et al., 1983 e1988, no qual os
autores verificaram que o GIF é um fator solúvel encontrado na fase
crônica da esquistossomose e que este é capaz de modular o
granuloma de fase aguda, podemos sugerir o envolvimento do GIF
64
nos processos de modulação das reações inflamatórias através da
sua ação inibitória sobre a produção de ROS.
Porém, o estudo da produção de espécies reativas de
oxigênio revela somente em parte o poder oxidante celular, já que
este é composto de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Os
mecanismos que envolvem o óxido nítrico, desde a sua produção
até sua atuação, têm envolvido inúmeros estudos.
A toxicidade do óxido nítrico é dependente da sua
concentração e do microambiente no qual ele é produzido. Embora
seja considerado por muitos autores como uma molécula pouco
reativa, o óxido nítrico é capaz, assim como o íon superóxido, de
gerar moléculas de maior reatividade, conhecidas como espécies
reativas de nitrogênio, que, assim como o próprio óxido nítrico,
desempenham importante papel nas reações inflamatórias e no
combate às infecções por bactérias, fungos e parasitas atuando
como moléculas citotóxicas (Crow & Beckman, 1995).
O óxido nítrico é capaz de reagir com o oxigênio molecular
levando à formação de um poderoso oxidante, o dióxido de
nitrogênio (.NO2). O .NO2 gerado em soluções aquosas aeróbicas, ao
contrário do observado na fase gasosa, não se decompõe em
quantidades iguais de NO2- (nitrito) e NO3- (nitrato) (Fukuto et al.,
1995). Na ausência de substratos oxidáveis, o dióxido de nitrogênio
é capaz de se combinar com o óxido nítrico levando à formação de
N2O3, o qual é capaz de “nitrosar” a água levando à liberação de
dois moles de nitrito (Crow & Beckman, 1995). Isto faz do nitrito o
65
principal produto da oxidação do óxido nítrico (Ignarro et al., 1993),
sendo assim amplamente utilizado como indicador indireto dos
níveis da produção do óxido nítrico (Green et al., 1982; Ignarro et
al., 1993; Marzinzig et al., 1997).
Nossos resultados mostram que, diferentemente do ocorrido
com a produção de ROS (figura 6 e 7), o GIF produzido por células
mononucleares, tanto do sangue periférico quanto do baço, de
camundongos infectados por Schistosoma mansoni foi capaz de
aumentar significativamente (P<0.05) a produção de RNS,
comparado com os níveis basais (figura 8), pelo Teste “t” de
Student. O GIF produzido por camundongos infectados por Syphacia
obvelata também foi capaz de aumentar significativamente
(P<0.05) a produção de nitrito quando comparado com o controle
(figura 9).
A geração de espécies reativas de nitrogênio é, na maioria
das situações, decorrente da interação do próprio óxido nítrico com
moléculas que tenham caráter de radical. Dentre estas moléculas,
passíveis de reação com o óxido nítrico, o oxigênio molecular e
seus intermediários reativos são particularmente importantes.
Logo, a disponibilidade de espécies reativas de oxigênio pode ser
um fator determinante na ação do óxido nítrico como molécula
citotóxica, sugerindo a possibilidade de um balanço entre as
espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. A relação entre óxido
nítrico e espécies reativas de oxigênio deve ser considerada um
importante parâmetro nas reações que potencialmente envolvam
66
tais moléculas. Uma relação 1:1 de .O2- e .NO leva à produção de
peroxidonitrito e induz à peroxidação lipídica. Por outro lado, um
excesso de .NO pode inibir a peroxidação lipídica por neutralizar os
radicais peroxil (Darley-Usmar et al., 1995). Torna-se evidente que
o balanço entre o óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio,
especialmente o superóxido, nos sítios de injúria, pode afetar ou
até mesmo determinar se o resultado do desafio imunológico segue
para o reparo ou para a inflamação.
Neste contexto, os resultados da figura 10 mostram que o
GIF, produzido por células mononucleares tanto de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni como por Syphacia obvelata,
aumentou a produção de RNS em relação a ROS, alterando o
balanço ROS/RNS por favorecer a produção de óxido nítrico.
Assim, nossos resultados sugerem que o GIF, em decorrência
da alteração dos sistemas oxidantes ( ativação de RNS e inibição de
ROS), estabeleceu um desequilíbrio favorável às reações de
neutralização da citotoxicidade das células, atuando como
modulador da ação citotóxica do óxido nítrico, podendo agir, assim,
como um agente imunomodulador e um potente antinflamatório
fisiológico.
Entretanto, esse aumento de RNS em relação a ROS poderia
estar sendo compensado por um aumento simultâneo da
capacidade redutora celular. Portanto, estas inferências a respeito
do balanço ROS/RNS só se fazem pertinentes caso a capacidade
redutora destas células se mostre ineficiente na neutralização
67
dessas espécies oxidantes. Assim, a avaliação dos efeitos dos
radicais livres deve levar em consideração tanto a reatividade
destas moléculas como também o potencial de defesa e reparo
celular (Nogueira-Machado et al., 1995; Chaves et al., 1996).
Para avaliarmos o poder redutor dos granulócitos utilizamos,
neste trabalho, o ensaio de metabolização de MTT (um sal de
tetrazólio). Os sais de tetrazólio fazem parte de um grande grupo
de compostos orgânicos heterocíclicos que podem ser reduzidos.
Em geral, quando esses sais são reduzidos formam-se cristais
geralmente insolúveis denominados cristais de formazan. Os sais
de tetrazólio foram inicialmente preparados em 1894 e desde então
são importantes indicadores tanto do sistema redox biológicos
como de viabilidade celular (Altman, 1976). Mosman, 1983, foi o
pioneiro na descrição da utilização desses sais em ensaios de
viabilidade e proliferação celular.
Embora ainda não estejam completamente elucidados, os
mecanismos de redução biológica dos sais de tetrazólio envolvem
componentes mitocondriais e não mitocondriais. A descoberta do
envolvimento de componentes mitocondriais foi proposta por Slater
et al., 1963 que utilizaram um sistema dependente de succinato,
inibindo especificamente a cadeia transportadora de elétrons. O
envolvimento de desidrogenases não mitocondriais ou flavinas
oxidases na metabolização de MTT foi proposto por Altman, 1976 e
por Burdon et al., 1993. Foi ainda demonstrado que NADH e NADPH
são melhores substratos que o succinto, e que o inibidor da cadeia
68
de transporte de elétrons, rotenone, não afeta a redução do MTT.
Assim, existem propostas atuais para que a metabolização de MTT
ocorra em outros compartimentos celulares que não sejam
exclusivamente mitocondriais. Liu et al., 1997 demostraram que,
além da mitocôndria, vesículas perinucleares podem reduzir MTT
(algumas destas vesículas foram identificadas como
lisossomos/endossomos).
Além de ser amplamente usado como avaliador do estado
funcional de leucócitos polimorfonucleares, o ensaio de
metabolização do MTT também pode ser usado na avaliação do
estado funcional de granulócitos, já que a capacidade de reduzir
estes sais reflete o grau de estimulação de vários agentes.
Baehner et al., 1976, afirmaram que a metabolização desses sais
está diretamente associada à atividade redutora de granulócitos.
Existem indícios de que em granulócitos o MTT é também
metabolizado em vacúolos fagocíticos (Natan et al., 1969) ou no
retículo liso (Humbert et al., 1973)
Neste estudo a metabolização de MTT foi utilizada para
avaliarmos o poder redutor celular (CRP) de granulócitos humanos,
segundo a técnica desenvolvida em nosso laboratório por Silva-
Teixeira e Nogueira-Machado, 1990.
Na análise do CRP de granulócitos humanos, nossos
resultados mostram que tanto o GIF produzido por células
mononucleares (sangue periférico e baço) de camundongos
infectados por Schistosoma mansoni (figura 12) quanto por
69
Syphacia obvelata (figura 13) foi capaz de inibir significativamente
(P<0.05) o CRP de granulócitos.
A necessidade da manutenção do equilíbrio entre os sistemas
oxidante e redutor foi primeiramente sugerido por Nogueira-
Machado et al., 1995, no estudo de três patologias. Seus resultados
mostraram que tanto na esquistossomose humana (infecção
helmíntica imunomodulada), como no pênfigo foliáceo sul
americano (patologia virótica autoimune com lesão tissular grave) e
na periodontia juvenil (doença provocada por bactérias) a
modificação no teor de ROS formados correspondeu à modificação
na capacidade redutora celular, mantendo em todos os casos
estudados um equilíbrio metabólico.
Chaves et al., 1996, avaliaram o balanço metabólico entre a
produção de ROS e a capacidade redutora celular de granulócitos
de doadores (não portadores de doenças) utilizando mediadores
farmacológicos (linfocinas, zimozan e éster de forbol (PDB)). Seus
resultados mostraram que granulócitos estimulados por zimozan,
PDB e IFN- apresentaram um aumento concomitante das
capacidades oxidante e redutora. Entretanto quando granulócitos
foram incubados em presença de aminofilina (bloqueador da
fosfodiesterase do AMP cíclico) e IL-10 (interleucina 10) foi
verificada uma diminuição da geração de espécies oxidantes.
Entretanto, esta foi acompanhada pela diminuição do poder
redutor.
70
Nossos resultados estão de acordo com os encontrados por
Nogueira-Machado et al., 1995. Observamos que o GIF foi capaz de
inibir a produção de ROS e CRP não alterando assim a relação
ROS/CRP encontrada pelos autores na esquistossomose (tabela 2).
Se compararmos ainda nossos resultados com os encontrados por
Chaves et al., 1996, podemos inferir que o GIF atuaria da mesma
maneira que a IL-10, inibindo simultaneamente a produção de ROS
e CRP, não alterando também o balanço ROS/CRP (tabela 2).
Todavia, nossos resultados diferem do estudo de Nogueira-
Machado et al., 1995 e Chaves et al., 1996 pela inclusão de outro
compartimento oxidante, as espécies reativas de nitrogênio (RNS).
Assim, na avaliação conjunta do balanço ROS/RNS/CRP, verificamos
um desequilíbrio nesta relação favorecendo a produção de RNS em
detrimento a ROS e CRP (tabela 2). Contudo, este desequilíbrio
provocado pelo GIF se torna extremamente favorável para a
manutenção da integridade celular e tecidual, pois sabe-se que o
aumento de RNS em relação a ROS e CRP faz com que estas
espécies passem a atuar como moléculas citoprotetoras. Assim,
podemos sugerir, através destes estudos, que o GIF, tanto
produzido por camundongos infectados por Schistosoma mansoni
quanto por Syphacia obvelata, seja um fator solúvel que atue
como um agente imunomodulador, além de poder, futuramente,
ser um agente antiinflamatório fisiológico.
71
Resumo
72
Doenças parasitárias são tidas como um dos principais
problemas na sociedade atual, principalmente nos países em
desenvolvimento como o Brasil.
A esquistossomose atinge cerca de 8 milhões de brasileiros. É
uma doença bastante estudada e caracterizada, mas um problema
longe do fim.
Parasitoses também atingem animais. No meio científico um
helminto bastante disseminado é a Syphacia obvelata. Sua infecção
é dita assintomática e, por isto, de difícil diagnóstico.
Este estudo trata da influencia de um fator solúvel, o GIF
(fator inibidor da citotoxicidade de granulócitos), no balanço
oxidante/redutor de granulócitos humanos.
O GIF foi descrito por Nogueira-Machado et al., 1983. Além de
inibir a citotoxicidade, os autores também relataram que o GIF era
capaz de inibir a formação do granuloma de fase aguda em
camundogos. Para esse estudo o GIF foi produzido por células
mononucleares de camundongos infectados por Schistosoma
mansoni ou Syphacia obvelata.
Os resultados obtidos permitem influir que o GIF pode ser
produzido durante a infecção por esses dois parasitas. Esse fator
solúvel foi capaz de inibir a produção das espécies reativas de
oxigênio e aumentar a produção de espécies reativas de nitrogênio.
Na avaliação conjunta do balanço oxidante (ROS/RNS)/redutor,
observamos que houve uma diminuição de ROS e do poder redutor
73
e um aumento de RNS. Esse aumento de RNS seria um indicador de
ação citoprotetora.
Podemos então sugerir que o GIF posa atuar como agente
imunomodulador e, futuramente, ser um agente antinflamatório.
74
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