MARIANA POSTAL AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DAS CITOCINAS...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS MARIANA POSTAL AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DAS CITOCINAS Th1 (TNF-α, INF-γ, IL-12) E Th2 (IL-4, IL-6, IL-10) EM PACIENTES COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO: ASSOCIAÇÕES COM MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS Campinas 2016
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MARIANA POSTAL
AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DAS CITOCINAS Th1 (TNF-α, INF-γ,
IL-12) E Th2 (IL-4, IL-6, IL-10) EM PACIENTES COM LÚPUS
ERITEMATOSO SISTÊMICO: ASSOCIAÇÕES COM
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS
Campinas
2016
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MARIANA POSTAL
AVALIAÇÃO LONGITUDINAL DAS CITOCINAS Th1 (TNF-α, INF-γ,
IL-12) E Th2 (IL-4, IL-6, IL-10) EM PACIENTES COM LÚPUS
ERITEMATOSO SISTÊMICO: ASSOCIAÇÕES COM
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E LABORATORIAIS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na Área de Concentração em Clínica Médica.
ORIENTADORA: Profª Drª Simone Appenzeller
COORIENTADORA: Profª Drª Lilian Tereza Lavras Costallat
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA POSTAL, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. SIMONE APPENZELLER.
Campinas
2016
3
4
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO [MARIANA POSTAL]
ORIENTADOR: PROF. DRA. SIMONE APPENZELLER
COORIENTADOR: PROF. DRA. LILIAN TEREZA LAVRAS COSTALLAT
MEMBROS:
1. PROF. DR. SIMONE APPENZELLER
2. PROF. DR. EDUARDO FERREIRA BORBA NETO
3. PROF. DR. ALEXANDRE WAGNER SILVA DE SOUZA
4. PROF. DR. MANOEL BARROS BERTOLO
5. PROF. DR. IBSEN BELLINI COIMBRA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 05/02/2016
5 AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos a minha orientadora Dra. Simone Appenzeller por sua
competência, apoio e inspiração no amadurecimento dos meus conhecimentos ao longo
desses anos que foram fundamentais para execução e conclusão deste trabalho.
Agradeço aos colegas do laboratório de Reumatologia pelas parcerias insubstituíveis na
execução deste trabalho.
À minha família agradeço o apoio, o afeto, o reconhecimento e a compreensão em todas
minhas escolhas e decisões.
Ao meu noivo Thomas, agradeço pela atenção, pelo carinho e compreensão em todas as
etapas deste trabalho.
Aos pacientes e indivíduos saudáveis que aceitaram participar desta pesquisa.
Agradeço à banca examinadora pela disposição em participar e contribuir neste
trabalho.
À FAPESP, agradeço pelo suporte e incentivo financeiro.
6
“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos capazes de
resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo.”
(Albert Einstein)
7 Resumo
Este estudo teve como objetivo avaliar, durante o período de 2 anos, os níveis séricos de
citocinas Th1 e Th2 em pacientes com LES e controles sadios, associando essas
citocinas com atividade de doença e as diferentes manifestações clínicas e laboratoriais
apresentadas pelos pacientes. E ainda, avaliar se havia variação dos níveis séricos de
citocinas Th1 e Th2 e se as mesmas pudessem ser consideradas biomarcadores. Foi um
estudo longitudinal, aberto com grupo controle onde foram selecionados pacientes
consecutivos com LES acompanhados na Unidade de Reumatologia do Hospital de
Clínicas/UNICAMP. Manifestações clínicas, laboratoriais e medicação em uso foram
avaliadas. A atividade de doença foi determinada pelo [SLE Disease Activity Index
(SLEDAI)] e o dano cumulativo pelo [Lupus International Collaborating
Clinics/American College of Rheumatology Damage Index (SDI)]. Os níveis séricos das
citocinas foram dosados pelo método Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Foram incluídos 218 (210 mulheres) pacientes com LES, com média de idade de 42,62
anos [desvio padrão (DP)± 11,98 anos]. O grupo controle, com distribuições de idade e
sexo similares ao grupo de pacientes, foi constituído por 46 (40 mulheres) voluntários
sadios com média de idade de 40,04±13,54. Observou-se que, apenas a IL-6 permanece
significativamente aumentada em pacientes com LES quando comparada a controles
sadios, nos quatro tempos de avalição. Na avaliação dos dados pareados, observou-se
flutuação significativa apenas nos níveis de INF-γ (p=0,026), IL-12 (p<0,001), IL-4
(p=0,001) e IL-10 (p<0,001). Observou-se que em todos os tempos, os níveis séricos de
IL-10 estavam associados e correlacionados com a atividade de doença. INF-γ, IL-4 e
IL-10 estavam associados com manifestações NP em pacientes com LES. Observou-se
uma diferença significativa na progressão de perda de volume cerebral (p=0,028) e de
perda de volume de corpo (p<0,001) entre pacientes com LES e controles sadios.
Observou-se uma associação entre IL-12 e progressão de atrofia cerebral (p=0,008) e
uma correlação direta entre os níveis séricos de IL-12 e porcentagem de perda de
volume cerebral (rs=0,3; p=0,015). Não foram observadas associações entre progressão
de atrofia e as outras citocinas estudadas ou manifestações clínicas e laboratoriais. De
acordo com nossos resultados, concluiu-se que IL-10 pode ser considerada biomarcador
para atividade de doença e nefrite no LES. INF-γ, IL-4 e IL-10 podem identificar
pacientes com envolvimento SNC. IL-12 pode ser um biomarcador para dano cerebral
no LES.
Palavras-chave: autoimunidade, citocinas, biomarcadores, lúpus eritematoso sitêmico
8 Abstract The aim of this study was to evaluate, during the period of two years, the sera levels of
Th1 cytokines and Th2 in SLE patients and healthy controls, associating these cytokines
with disease activity and the different clinical and laboratory manifestations presented
by SLE patients, and also, to assess whether there was a variation in the sera of Th1 and
Th2 cytokines levels and if they could be considered potential biomarkers. It was an
open, longitudinal study with a control group. Consecutive SLE patients followed at the
Rheumatology Unit (Hospital de Clínicas/UNICAMP) were recruited. Clinical,
laboratory and medication were assessed. Disease activity was determined by [SLE
Disease Activity Index (SLEDAI)] and the cumulative damage by [Lupus International
Collaborating Clinics/American College of Rheumatology Damage Index (SDI)]. Sera
cytokines levels were performed by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Two hundred and eighteen (210 women) SLE patients, with a mean age of 42.62 years
[standard deviation (SD) ±11.98 years] were included. The control group, with similar
age and sex distributions consisted of 46 (40 women) healthy volunteers with a mean
age of 40.04±13.54. It was observed that IL-6 remained significantly increased in SLE
patients compared to healthy controls over time. In the paired analyses, significant
fluctuation in IFN-γ (p=0.026), IL-12 (p<0.001), IL-4 (p=0.001) and IL-10 (p<0.001)
levels were observed. There were no significant fluctuation in the sera TNF-α and IL-6
levels. It was observed that sera IL-10 levels were associated and correlated with
disease activity, at follow up. INF-γ, IL-4 and IL-10 were associated with NP
manifestations in SLE patients. A significant difference was observed in the progressive
loss of brain volume (p=0.028) and corpus callosum volume (p<0.001) of SLE patients
compared to healthy controls. There was an association between IL-12 and progressive
brain atrophy (p=0.008) and a direct correlation between sera IL-12 levels and
percentage loss of brain volume (rs=0.3; p=0.015) was observed. No association
between progressive brain atrophy and other cytokines or clinical and laboratory
manifestations were observed. To sum up, there is a significant fluctuation in sera IFN-
γ, IL-12, IL-4 and IL-10 levels in SLE patients. IL-10 may be considered a biomarker
for disease activity and nephritis in SLE. IFN-γ, IL-4 and IL-10 can identify patients
with CNS involvement. IL-12 may be considered a biomarker for brain damage in SLE.
Keywords: Autoimmunity, cytokines, biomarkers, systemic lupus erythematosus
9 LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Critérios revisados para a classificação de LES.............................................16
Tabela 2. Síndromes neuropsiquiátricas segundo o ACR..............................................19
Tabela 3. Score do SLEDAI dos pacientes com LES incluídos no estudo, nos 4 tempos
de avaliação.....................................................................................................................36
Tabela 4. Frequência das manifestações clínicas observadas nos pacientes com LES nos
quatro tempos de avaliação..............................................................................................37
Tabela 5. Frequência das manifestações laboratoriais observadas nos pacientes com
LES nos quatro tempos de avaliação...............................................................................38
Tabela 6. Medicações em uso pelos pacientes com LES nos quatro tempos de
avaliação..........................................................................................................................39
Tabela 7. Flutuação dos níveis séricos das citocinas Th1 e Th2 nos pacientes com LES,
de acordo com os tempos de análise................................................................................43
Tabela 8. Flutuação dos níveis séricos das citocinas Th 1 e Th2 nos controles sadios, de
acordo com os tempos de análise....................................................................................44
Tabela 9. Resultados dos testes de Mann-Whitney e das correlações de Spearman entre
os níveis séricos de IL-10 e atividade de doença em cada tempo de análise...................45
Tabela 10. Manifestações NP observadas nos pacientes com LES até a data do primeiro
exame de RM e depois até o segundo exame de RM......................................................47
Tabela 11. Volume cerebral, do corpo caloso e do ventrículo de pacientes com LES e
controles sadios, na 1ª RM e na 2ª RM (após 1 ano).......................................................48
Tabela 12. Associações entre presença de atrofia cerebral e de corpo caloso com
citocinas, manifestações clínicas, laboratoriais e de tratamento.....................................49
10 LISTA DE FIGURAS
Figura1. Subpopulações de linfócitos T helper (Th) e as citocinas produzidas por cada
subpopulação...................................................................................................................23
Figura 2. Fluxograma de inclusão e exclusão de indivíduos nesse estudo.....................28
Figura 3A/B/C. Níveis séricos de citocinas Th1 em pacientes com LES e controles
sadios...............................................................................................................................40
Figura 3D/E/F. Níveis séricos de citocinas Th2 em pacientes com LES e controles
sadios...............................................................................................................................41
11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
aCL- Anti-cardiolipina
ACR- American College of Rheumatology
Anti-dsDNA- Anti-DNA de fita dupla
Anti-Sm- Anti-Smith
APC- Células apresentadoras de antígenos
AVC- Acidente vascular cerebral
BAI- Inventário de ansiedade de Beck
BDI- Inventário de depressão de Beck
BHE-Barreira hematoencefálica
CMV- Citomegalovírrus
DNA- Ácido dexoxirribonucléico
DP- Desvio padrão
EBV- Epstein-Bar
ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ENA- Anticorpos contra antígenos extraídos do núcleo
FAN- Fator antinuclear
FCM- Faculdade de Ciências Médicas
HAS-Hipertensão arterial sitêmica
HC- Hospital de Clínicas
HLA- Antígeno leucocitário humano
IFNAR- Receptor de Interferon
INF-γ - Interferon gama
IL- Interleucina
BAI- Inventário de ansiedade de Beck
BDI – Inventário de depressão de Beck
LA- Anticoagulante lúpico
LCR- Líquido cefalorraquidiano
LES- Lúpus eritematoso sistêmico
LES NP- Lúpus neuropsiquiátrico
NK-células Natural Killer
NMDA- Anticorpos contra o receptor N-metil-d-aspartato
NP- Neuropsiquiátrico
OR- Odds Ratio
RNA- Ácido ribonucléico
12 RPM- Rotação por minuto
SLEDAI- Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index
SDI- Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American College of
Rheumatology Damage Index
SNC- Sistema nervoso central
TCLE- Termo de consentimento livre e esclarecido
Th- Linfócitos T helper
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
UNICAMP- Universidade Estadual de Campinas
UV- Radiação ultravioleta
13 Sumário
Resumo ............................................................................................................................. 7
Abstract ............................................................................................................................. 8
1. Introdução e revisão da literatura ............................................................................... 15
1.1 Definição .............................................................................................................. 15
1.2 Epidemiologia ....................................................................................................... 15
1.3 Critérios classificatórios do LES .......................................................................... 15
1.5 Patogênese ............................................................................................................ 19
1.5.1 Susceptibilidade genética .............................................................................. 19
1.5.2 Fatores ambientais ........................................................................................ 20
1.5.3 Produção de autoantígenos ........................................................................... 20
1.5.4 Sistema neuroendócrino ................................................................................ 21
1.5.5 Produção de autoanticorpos ......................................................................... 21
1.5.6 Hiperatividade de células B e T .................................................................... 22
2. Justificativa ................................................................................................................. 26
3. Objetivos ..................................................................................................................... 26
3.1 Objetivo geral ....................................................................................................... 26
4. Pacientes e Métodos ................................................................................................... 26
4.1 Delineamento do estudo ....................................................................................... 26
4.2 Seleção dos pacientes ........................................................................................... 27
4.2.1 Critérios de inclusão ..................................................................................... 27
4.2.2 Critérios de exclusão ..................................................................................... 27
4.3 Seleção dos indivíduos sadios não aparentados ................................................... 27
Figura 2. Fluxograma de inclusão e exclusão de indivíduos nesse estudo ................. 28
4.4 Termo de consentimento livre e esclarecido ........................................................ 28
4.5 Análise clínica-laboratorial................................................................................... 28
4.6 Análise de atividade de doença e dano ................................................................. 29
4.7 Avaliação neurológica .......................................................................................... 30
4.7.1 Avaliação dos transtornos de humor e ansiedade ......................................... 30
4.8 Tratamento ............................................................................................................ 30
4.9 Investigação com Ressonância Magnética ........................................................... 30
4.9.1Análise das Imagens: ...................................................................................... 31
4.10 Determinação dos níveis séricos das citocinas .................................................. 32
14
4.10.1 Técnica de ELISA ........................................................................................ 32
4.10.2 Obtenção de resultados ............................................................................... 34
4.11 Análise estatística .............................................................................................. 34
5. Resultados ................................................................................................................... 35
5.1 Capítulo 1 Avaliação longitudinal das citocinas Th1 (TNF-α, INF-γ, IL-12) e Th2
(IL-4, IL-6, IL-10) em pacientes com LES: associações com manifestações clínicas e
laboratoriais ............................................................................................................... 35
5.1.1 Dados demográficos ...................................................................................... 35
5.1.2 Características clínicas, laboratoriais e tratamento ..................................... 35
5.1.3 Dosagem dos níveis séricos das citocinas Th1 e Th2 .................................... 39
5.1. 4 Avaliação dos dados pareados ..................................................................... 42
5.1.5 Análise de preditores de dano cumulativo .................................................... 46
5.2 Capítulo 2 Análise de progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso e
associação com citocinas Th1 e Th2 em pacientes com LES ..................................... 46
5.2.1 Dados demográficos ...................................................................................... 46
5.2.2. Manifestações clínicas, laboratoriais e de tratamento ................................ 46
5.2.3 Análise da progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso ....................... 47
6. Discussão .................................................................................................................... 50
6.1 Capítulo 1 Avaliação longitudinal das citocinas Th1 (TNF-α, INF-γ, IL-12) e Th2
(IL-4, IL-6, IL-10) em pacientes com LES: associações com manifestações clínicas e
laboratoriais ............................................................................................................... 50
6.2 Capítulo 2 Análise de progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso e
associação com citocinas Th1 e Th2 em pacientes com LES ..................................... 52
7. Conclusões .................................................................................................................. 55
8. Referências bibliográficas .......................................................................................... 56
9. Apêndices ................................................................................................................... 76
9.1 Termo de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Pacientes) .................. 76
9.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Controles sadios) ....................... 83
10. Anexos ...................................................................................................................... 90
10.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa-FCM ............................................ 90
15 1. Introdução e revisão da literatura
1.1 Definição
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune, multissistêmica,
caracterizada por períodos de remissão e exacerbação, com intensa participação do
sistema imunológico (1-5).
1.2 Epidemiologia
A taxa de incidência do LES é de 1 a 10 por 100.000 pessoas/ano e a taxa de
prevalência em geral, varia de 20 a 70 por 100.000 habitantes (6,7). Quanto às
diferentes raças, observa-se a frequência de 1 para cada 250 mulheres negras nos
Estados Unidos da América; 22,4 para cada 100.000 asiáticos e 10,3 para cada 100.000
caucasianos (5,7-11). Entretanto, apresenta-se como uma doença rara entre os negros
africanos (12,13). No Brasil, observa-se uma frequência maior entre caucasoides,
principalmente na região Sudeste do país (14). Um estudo de 2002 determinou uma
prevalência de 8,4 casos por 100.000 habitantes na região Nordeste (15).
Apesar de surgir geralmente na segunda e terceira décadas de vida, o LES pode
se manifestar em qualquer idade, predominantemente no sexo feminino (1,6,7).
Aproximadamente 15% a 20% dos diagnósticos são feitos na infância. Nas crianças, a
relação entre mulheres e homens é de 1,4 a 5,8:1; nos adultos varia de 8:1 a 13:1; nos
indivíduos de idade mais avançada, esta relação é de 2:1 (16-29).
1.3 Critérios classificatórios do LES
Não existem critérios definitivos para o diagnóstico do LES. Após cuidadosa
investigação e exclusão de doenças infecciosas e neoplásicas, entre outras, o Colégio
Americano de Reumatologia (ACR) estabeleceu critérios classificatórios para doença,
segundo os quais são necessários, no mínimo quatro critérios clínicos e/ou laboratoriais
entre onze para ter o diagnóstico definitivo de LES (30). Estes critérios foram revisados
em 1997, e o item “presença de células LE”, constante do critério “alterações
imunológicas”, foi excluído, e o teste falso positivo para sífilis foi substituído pela
presença de anticorpos antifosfolípides (31) (Tabela 1).
16
Tabela 1. Critérios revisados para a classificação de LES (31)
CRITÉRIO OBSERVAÇÕES
Eritema malar Eritema fixo sobre as eminências malares e/ou
pregas naso-labiais
Lesão discoide
Placas eritematosas, elevadas e circulares, com
escamação aderente, comprometimento dos pelos e
cicatrização com atrofia
Fotossensibilidade Rash cutâneo resultado da exposição à luz solar,
observadas por médico
Úlceras orais Ulceração oral e/ou em nasofaringe, geralmente
dolorosa, observadas por médico
Artrite Não erosiva de 2 ou mais articulações
Serosite Pleurite
Pericardite
Envolvimento renal
Proteinúria maior que 0,5 g/dia
Leucocitúria, na ausência de infecção
Hematúria dismórfica
Cilindros celulares
Envolvimento do sistema
nervoso central
Convulsão
Psicose
Alterações hematológicas
Anemia hemolítica (Bilirrubinemia indireta, LDH
elevada, Coombs direto positivo)
Leucopenia menor que 4.000/mm3
Linfopenia menor que 1.500/mm3
Plaquetopenia menor que 100.000/mm3
Alterações imunológicas
Anticorpos Anti-dsDNA
Anticorpos Anti-Sm
Anticorpos antifosfolípide [anticardiolipina (aCL)
IgG/IgM; anticoagulante lúpico (LA)]
Fator antinuclear (FAN)
Título ≥1/80 do FAN por imunofluorescência ou um
ensaio equivalente a qualquer ponto no tempo, na
ausência de drogas conhecidas por induzirem FAN
17 1.4 Apresentação clínica no LES
As apresentações clínicas do LES variam desde manifestações mucocutâneas a
manifestações do sistema nervoso central (SNC), como convulsões e psicose. Sintomas
constitucionais como fadiga, perda de peso e febre são frequentemente observados e
tem um impacto significativo na qualidade de vida dos pacientes (4,32).
O envolvimento cutâneo no LES é muito frequente, afetando até 90% dos
pacientes. Além do eritema malar e das lesões discoides, a fotossensibilidade é
frequentemente observada. Alopecia é frequentemente transitória associada à atividade
de doença, mas pode ocasionar cicatrizes quando associada a lesões discoides. Úlcera
oral recorrente, especialmente no palato mole é também uma característica de doença
ativa (4,33-35).
Artralgia e mialgia acometem a maioria dos pacientes. Artrite afeta, geralmente
as pequenas articulações da mão e não evoluindo para erosões. A clássica Artropatia de
Jaccoud resulta em deformidade e incapacidade funcional significativa, embora não
causada por artrite destrutiva (4, 33, 36).
As manifestações renais afetam cerca de 30% dos pacientes com LES (4,5). O
desenvolvimento da nefrite lúpica é mais comum nos primeiros anos da doença. A
nefrite lúpica é caracterizada por proteinúria (>0,5 g/24 horas), presença de sedimento
urinário (hemácias dismórficas, leucócitos) e ainda, achados histológicos. A revisão dos
critérios de classificação (37), desenvolvido pela Sociedade Internacional de Nefrologia
e da Sociedade de Patologia Renal foi atualizada. Na maioria das vezes, o envolvimento
renal é assintomático, o que torna imprescindível o exame de urina regular e
monitoramento da pressão arterial (5).
As alterações hematológicas incluem anemia, trombocitopenia e leucopenia.
Doença hematológica grave pode ocorrer, mas é relativamente rara (4,38). A anemia
geralmente é normocítica e normocrômica, e surge dependendo da gravidade e duração
da doença (38). Trombocitopenia, definida quando a contagem de plaquetas está inferior
a 100.000 células/mL, é um achado frequente no LES. O grau é variável. A
trombocitopenia transitória muitas vezes aparece durante uma fase de exacerbação da
doença sem causar tendência hemorrágica (4,38). Leucopenia é comum e pode resultar
de doença ativa ou devido à reação as medicações (4,38).
Pleurite, causando dor no peito, tosse e falta de ar é a manifestação pulmonar
mais comum no LES (39). Embora os sintomas possam estar relacionados diretamente à
atividade de doença, embolia pulmonar deve ser sempre considerada, principalmente
naqueles que têm anticorpos antifosfolípides positivos. As infecções são comuns, e
18 qualquer lesão parenquimatosa deve ser tratada como infecciosa até que se prove o
contrário (39,40).
As complicações cardíacas incluem pericardite, doenças valvares, endocardite de
Libman-Sacks, miocardite, cardiomiopatia, doenças da artéria coronária e distúrbios da
condução (41). Vinte e cinco porcento dos pacientes com LES apresentam
envolvimento cardiovascular em algum momento da doença. As complicações
cardiovasculares representam a terceira maior causa de morte nestes pacientes, embora
nem todas as doenças cardiovasculares sejam de natureza inflamatória de fato; uma
significativa porção é devido à aterosclerose (42).
As manifestações neuropsiquiátricas (NP) ocorrem em até 75% dos pacientes.
No entanto, a frequência dessas manifestações é muito variável, dependendo do tipo de
manifestação incluída e do método usado para avaliação (2,19,43-45). O lúpus
neuropsiquiátrico (LES NP) é, muitas vezes, de difícil diagnóstico. Em 1999, o ACR
elaborou um consenso para a terminologia e definição das síndromes NP que ocorrem
no LES (46), com a participação de reumatologistas, neurologistas, psiquiatras, entre
outros, e definiu 19 síndromes mais prevalentes (Tabela 2). Posteriormente, estes
critérios foram validados e apresentaram uma sensibilidade de 91% e uma
especificidade de 46% (47). A baixa especificidade se deu devido à presença de
ansiedade, cefaleia, depressão leve, distúrbio cognitivo leve e polineuropatia não
confirmada por eletroneuromiografia (47). Quando estas manifestações foram excluídas,
observou-se uma especificidade de 93% (47).
Sintomas de depressão e ansiedade são comumente relatados em pacientes com
LES e é, provavelmente, devido ao déficit físico e ao estresse de viver com uma doença
crônica (45,48). Pacientes com transtornos de depressão e ansiedade, muitas vezes
sentem vergonha de assumir publicamente os seus sintomas; alguns métodos de
avaliação, como questionários podem ser úteis na identificação desses sintomas nos
pacientes (49).
19 Tabela 2. Síndromes neuropsiquiátricas segundo o ACR (46)
SISTEMA NERVOSO
CENTRAL
SISTEMA NERVOSO
PERIFÉRICO
Meningite asséptica Síndrome de Guillain-Barré
Estado confusional agudo Disfunção autonômica
Ansiedade Neuropatia craniana
Doença cerebrovascular Mononeuropatia
Disfunção cognitiva Miastenia grave
Síndrome desmielinizante Plexopatia
Cefaleia Polineuropatia
Transtorno de movimento (Coreia)
Transtorno do humor
Mielopatia
Psicose
Convulsão
1.5 Patogênese
Duas características principais dos indivíduos que desenvolvem LES são a
produção de autoanticorpos e o clearance prejudicado de corpos apoptóticos. O LES é
uma doença multifatorial, incluindo fatores genéticos, ambientais e hormonais. Além
disso, alterações nas linhagens de células B e T também contribuem para o
desenvolvimento da doença (3-5). De maneira simplificada, os mecanismos envolvidos
na patogênese são: susceptibilidade genética, fatores ambientais, produção de
autoantígenos, sistema neuroendócrino, produção de autoanticorpos e hiperatividade de
células B e T. A seguir, cada item será detalhado.
1.5.1 Susceptibilidade genética
A probabilidade de desenvolvimento do LES em gêmeos monozigóticos é de 24-
57% e em gêmeos dizigóticos de 2-5%, indicando que a genética tem um papel
importante na patogênese do LES (50, 51). Genes do antígeno leucocitário humano
(HLA), particularmente HLA-DRB1e HLA-DQB1 têm sido associados à
susceptibilidade ao LES (52-59). O perfil HLA-DRB1*0301 tem sido associado à
susceptibilidade em indivíduos latino-americanos (60). Análises sorológicas específicas
20 mostram que tanto o HLA-DR3 como o HLA-DR2 também são fatores de risco. Já o
HLA-DR3-DQ2 é um haplótipo que tem forte associação no desenvolvimento do LES
em caucasianos (60).
Do ponto de vista genético, uma série de estudos sugere que polimorfismos dos
genes codificadores de citocinas estão associados à susceptibilidade ao LES.
Polimorfismos dos genes do TNF-α (61-69), INF-α (70-75), IL-6 (76-79), IL-10 (79-82)
tem sido descritos. Além da susceptibilidade à doença, alguns desses estudos
observaram uma associação entre determinado polimorfismo e manifestações clínicas
da doença (65,71,83).
Mais recentemente, têm sido estudados os sítios de microRNA (miRNA).
miRNAs são pequenas moléculas de RNA (não-codificantes), cuja principal função é
atuar como silenciadores pós-transcrição, pois pareiam-se com mRNAs específicos e
regulam sua estabilidade e tradução (84-87). Os pacientes com LES revelaram
“assinaturas” de miRNA únicas quando comparados à indivíduos saudáveis ou àqueles
com sem a doença. Estudos mostraram que a desregulação dos miRNAs também pode
estar associada à atividade de doença e também à um maior envolvimento orgânico
(88).
1.5.2 Fatores ambientais
Há evidências de que a exposição à radiação ultravioleta (UV) altera a química
do ácido desoxirribonucléico (DNA) e sua localização, bem como a disponibilidade dos
antígenos ribonucleiprotéicos (RNP) e Ro (89). Outro fator ambiental envolvido é a
exposição a determinados vírus como o Epstein-Bar (EBV) e citomegalovírus (CMV).
Após infecção, ocorre um mecanismo chamado de mimetismo molecular entre os
antígenos próprios e externos, seguido da ativação inespecífica de linfócitos T e B,
resultando na liberação de autoantígenos mais imunogênicos (90).
1.5.3 Produção de autoantígenos
O mecanismo de ativação induzida pela morte celular programada (apoptose) é
provavelmente uma das principais fontes de autoantígenos no LES (91-93). Uma célula
em apoptose desenvolve vesículas de superfície resultantes dos antígenos que se
deslocam do núcleo para a membrana celular. Perto da superfície das células, o antígeno
pode ativar a resposta imune. Células em apoptose são encontradas continuamente em
indivíduos sadios, mas em pacientes com LES este mecanismo se torna patogênico,
devido ao aumento na quantidade e duração de células apoptóticas em circulação
21 (94,95). Há evidências substanciais de que o clearance de células apoptóticas é
prejudicado em pacientes com LES (94).
1.5.4 Sistema neuroendócrino
Hormônios sexuais, especialmente a prolactina e o estrógeno desempenham um
papel importante na modulação da resposta imunológica (96). Anormalidades na função
do hipotálamo e/ou hipófise contribuem para a patogênese do LES. Foi observado que
alguns pacientes apresentam hiperprolactinemia e outros níveis inadequados do
hormônio antidiurético (97-99). A hiperprolactimenia estimula células B a produzirem
anticorpos, principalmente anti-dsDNA, aumentando a oferta de autoanticorpos na
circulação dos pacientes com LES. Além disso, prejudica a seleção negativa de células
B autorreativas (100-101).
O LES acomete predominantemente mulheres e em idade fértil. A alta
incidência da doença em mulheres férteis sugere o papel do estrógeno na predisposição
à doença (96). O estrógeno influencia na maturação dos linfócitos T e B. O estrógeno
ajuda a promover a hematopoese extra medular. Células B autorreativas que se
desenvolvem em meio extra medular podem escapar da seleção negativa. Notoriamente,
o estrógeno induz a ativação da citidina-desaminase, causando mutações no DNA, o que
leva a alteração das vias apoptóticas, permitindo a produção de autoanticorpos (96,102).
1.5.5 Produção de autoanticorpos
FAN é frequente em pacientes com LES, originalmente descritos em 1957
através de um ensaio de imunofluorescência com o tecido do fígado de roedores como
substrato (103,104). Mais de 90% dos pacientes com LES têm FAN positivo. Valores
de 1/80 ou maiores são aceitos como títulos significativos. Embora seja sensível, o FAN
não é específico para o LES (103).
Anti-dsDNA é um autoanticorpo altamente específico para o LES, presente em
até 70% dos pacientes, mas em menos de 0,5% dos indivíduos sadios ou pacientes com
outras doenças autoimunes (103,105). Entre os pacientes que têm títulos elevados de
anti-dsDNA e doença clinicamente quiescente, 80% têm a doença que se torna
clinicamente ativa dentro de 5 anos após a detecção de títulos elevados deste
autoanticorpo (106).
Aproximadamente 70% dos pacientes com lesões subagudas possuem anticorpo
anti-Ro (SSA), que pode estar associado a anticorpos anti-La (SSB) (107). O anti-Ro e
o anti-La são imunoglobulinas específicas contra as proteínas do RNA, sendo que o
22 anti-La normalmente coexiste com o anti-Ro, raramente sendo encontrado sozinho.
Além disso, a presença de anti-Ro e anti-La, ou ambos durante a gravidez confere um
risco de 1 a 2% maior de bloqueio cardíaco fetal (108).
Os anticorpos anti-receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), NR2a e NR2b têm
sido observados em pacientes com manifestações NP. Embora anticorpos anti-NR2
tenham sido estudados em pacientes com LES, apenas anticorpos anti-NR2 no líquido
cefalorraquidiano (LCR), e não no soro, estão associados a manifestações NP difusas no
LES (109-111). Os anticorpos contra receptores NMDA no LCR acometem o SNC
independente de eventos trombóticos ou vasculite (112). Estes anticorpos no LCR
foram associados com manifestações NP em geral e manifestações NP difusas
(109,110); já no soro, foram descritas associações com distúrbio cognitivo, depressão,
déficit de memória recente e de aprendizado (113).
A proteína P ribossomal é um pentâmero composto por 3 fosfoproteínas
diferentes, formando o monômero P0 e os dímeros P1 e P2. Está proteína desempenha
um papel importante em todas as etapas da síntese proteica. A presença de anticorpos
anti-P pode estar associada ao comprometimento do SNC (114-118), rins (119-121)
e/ou danos no fígado (122-124).
1.5.6 Hiperatividade de células B e T
Os mecanismos de hiperatividade de células B e T envolvem a produção de
autoantígenos, que está relacionada ao aumento da apoptose e ao clearance prejudicado
de corpos apoptóticos fornecidos continuamente pelo dano tecidual. Um único antígeno
inicia uma resposta, mas na ausência do mecanismo de tolerância imunológica, a
resposta imune torna-se ininterrupta, envolvendo mais células B e T com especificidade
relacionada ao antígeno inicial, até que ambas sejam ativadas por antígenos múltiplos,
muitos dos quais são antígenos próprios (125,126). Outro mecanismo importante sobre
hiperatividade é a expressão aumentada de moléculas de superfície que participam da
ativação de células como células B e T. Autoanticorpos podem ativar células T e ajudar
na sua diferenciação. O estímulo aumentado na diferenciação e maturação de células T
leva a uma produção anormal de citocinas em pacientes com LES (125,126).
As citocinas são proteínas de baixo peso molecular, produzidas por diferentes
células do sistema imunológico inato e adaptativo (Figura 1) (127). Elas mediam a
ativação e regulação funcional do sistema imunológico através da ligação aos receptores
de superfície celular, desempenhando um papel fundamental na diferenciação,
maturação e ativação de várias outras células (127,128).
23
Figura 1. Subpopulações de linfócitos T helper (Th) e as citocinas produzidas por cada subpopulação
O LES é uma doença heterogênea quanto à apresentação, gravidade da doença e
resposta ao tratamento. Perfis alterados de citocinas podem ser responsáveis por essas
variações observadas na prática clínica (127). Além disso, um dos maiores problemas
diagnósticos envolvidos no LES é a distinção entre as alterações causadas pela doença
com as anormalidades geradas por eventos secundários, como complicações da
hipertensão arterial sistêmica (HAS), distúrbios metabólicos, distúrbios de coagulação,
infecções severas, aterosclerose e decorrentes do tratamento (corticosteroides e outras
medicações), entre outros (129).
Por isto é crescente o interesse em identificar biomarcadores que se
correlacionem com a atividade sistêmica do LES e que possam predizer um
envolvimento orgânico futuro, além de ajudarem na investigação de novos alvos
terapêuticos (129). Há fortes evidências que suportam o papel das citocinas na
predisposição genética e na atividade do LES (130). As principais citocinas associadas à
imunidade celular (Th1) são interleucina (IL)12, interferon gama (INF-γ) e fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) enquanto que IL-4, IL-6 e IL-10 estão associadas à
produção de anticorpos e à indução de imunidade humoral (Th2) (131).
A IL-12 é uma citocina pró-inflamatória que induz a produção de INF-γ,
favorecendo a diferenciação de células Th1, e mantendo uma ligação entre a resposta
inata e a adaptativa (132,133). Células dendríticas e fagócitos ativados são produtores
de IL-12. Sua produção depende de diferentes mecanismos de regulação da expressão
24 de genes que codificam a IL-12, da expressão de receptores toll-like e ainda da reação
cruzada dos diferentes subtipos de células dendríticas, envolvendo citocinas, como IL-
10 e INF tipo I. Através da regulação negativa, a IL-12 é inibida pela IL-10. No LES,
estudos demonstraram que níveis aumentados de IL-12 estão associados à nefrite em
pacientes com LES (134) e ainda observou-se uma associação entre IL-12 e dano
cumulativo no LES (135). Um estudo mais recente demonstrou que pacientes com LES
com o anticorpo anti-P ribossomal positivo apresentavam níveis aumentados de IL-12,
sugerindo que os anticorpos promovem um aumento de reposta Th1 em pacientes com
LES (136).
O INF-γ é uma glicoproteína dimérica com subunidades de 146 aminoácidos. As
duas formas ativas da proteína são 20 e 25 kd, respectivamente (127). Esta citocina é
produzida, principalmente por células T, CD4+, assim como CD8+ e células natural
killer. Ela promove a ativação de macrófagos tanto na resposta inata quanto na
adquirida. Sua atividade é aumentada na presença de TNF-α e TNF-β. Na literatura,
estudos demonstraram níveis aumentados de INF-γ em pacientes com LES e ainda uma
correlação positiva entre níveis de INF-γ e IL-12 (137,138). Outro estudo demonstrou
uma tendência de diminuição dos níveis de INF-γ em pacientes com doença ativa (139).
Em relação a IL-10, constatou-se que o INF-γ suprime a expressão de moléculas dessa
citocina (137).
O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória e está diretamente envolvida no
processo de apoptose (140). Esta citocina é expressa como um trímero na superfície
celular e na forma solúvel após a ativação de macrófagos e células dendríticas (127).
Sabe-se que o TNF-α exerce um papel importante na organogênese do sistema linfóide,
agindo pró-apoptose e também anti-apoptose. Esta ação do TNF-α está vinculada ao
aparecimento de autoanticorpos. Além disso, o TNF-α é uma citocina secretada por
células Th1com um papel central na inflamação, induzindo a expressão de outras
moléculas pró-inflamatórias, citocinas quimiotáticas e fatores de adesão (140). Sua ação
na patogênese do LES ainda não é completamente esclarecida (141). Em contrapartida,
em alguns casos de LES, o tratamento com TNF auxiliou no controle do processo
inflamatório dos tecidos (142,143). Vários estudos demonstraram que os níveis séricos
de TNF-α são notoriamente mais elevados em pacientes com LES quando comparados a
indivíduos sadios (131,144-150). Estudos observaram uma associação TNF-α e
atividade de doença (144, 145,147), nefrite (150,151) e depressão em pacientes com
LES (150,152). No entanto, em um estudo prévio, os níveis de TNF-α foram maiores
em pacientes com doença inativa em comparação com pacientes com doença ativa e
25 controles, sugerindo que, TNF-α também poderia ser um fator protetor em pacientes
com LES (131).
A IL-4 é uma glicoproteína de 129 aminoácidos (20 kd), produzida por uma
subpopulação de linfócitos Th2. A IL-4 favorece a proliferação e a diferenciação de
células B e aumenta a expressão de moléculas de classe II do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC). Esta citocina inibe a ativação das células natural killer e
estimula a proliferação de timócitos (127). Em vivo, foram demonstrados níveis
aumentados de IL-4 em pacientes com LES e também uma correlação negativa com
níveis de IL-18 (153). No entanto, não há estudos na literatura que observaram qualquer
associação da IL-4 com manifestações clínicas ou laboratoriais em pacientes com LES.
A IL-6 é uma citocina secretada por Th2 (127,154). A IL-6 é produzida por
células apresentadoras de antígenos (APC), tais como macrófagos, células dendríticas e
células B, embora a sua secreção pode também ser por células T e linfócitos B (154).
Sua produção é desencadeada pela IL-1, IL-2 e TNF-α, mas atenuada pela IL-4, IL-10 e
IL-13. Um dos efeitos mais importantes da IL-6 é induzir a maturação de linfócitos B
em células plasmáticas e aumentar a secreção de imunoglobulinas (127). Estudos
observaram níveis séricos de IL-6 aumentados em pacientes com LES quando
comparados a controles sadios e ainda associações de IL-6 com atividade de doença e
hematúria (150,155).
A IL-10 é produzida, principalmente por macrófagos, monócitos e linfócitos. Ela
bloqueia a ativação das APCs, diminui a expressão de moléculas coestimulatórias e,
portanto, atenua a ativação das células T e a secreção de TNF-α (154). IL-10 estimula a
proliferação das células B e o switching de classe de imunoglobulina, resultando em
uma maior secreção de anticorpos, que por sua vez, têm a capacidade de penetrarem em
compartimentos extra-vasculares e promoverem inflamação nos pacientes com LES
(154). Níveis séricos aumentados de IL-10 foram observados em pacientes com LES
(150, 154, 156). Estudos demonstraram além da associação de IL-10 com atividade de
doença, a correlação positiva dessa citocina com escores de SLEDAI (154, 157, 158).
Um estudo também observou a associação de IL-10 com a presença de anticorpos anti-
dsDNA (150).
Dentre suas funções pleiotrópicas, as citocinas também são importantes
mediadores na sinalização bidirecional entre sistema imunológico e SNC, podendo
ajudar na determinação manifestações NP e atrofia cerebral. O comprometimento
cerebral exerce um importante impacto tanto na qualidade de vida quanto na
mortalidade dos pacientes com LES (44,159,160).
26 2. Justificativa
Os mecanismos intrínsecos envolvidos no LES tem sido um desafio para a
comunidade científica e corpo clínico. Atualmente, os esforços estão dirigidos no
sentido de explicar as possíveis causas envolvidas no aparecimento da doença e no
desenvolvimento de determinadas manifestações clínicas. O uso de biomarcadores pode
ser de grande valia na identificação de atividade de doença e na identificação de
subgrupos de pacientes com pior prognóstico.
3. Objetivos
3.1 Objetivo geral
- Avaliar, durante o período de 2 anos, os níveis séricos de citocinas Th1 (IL-12,
INF-γ e TNF-α) e Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10) em pacientes com LES e controles
sadios
3.2 Objetivos específicos
- Associar os níveis séricos de citocinas Th1 e Th2 com atividade de doença e as
diferentes manifestações clínicas e laboratoriais
- Identificar subgrupos de pacientes, em especial pacientes com atividade renal e
do sistema nervoso central
- Avaliar se há variação dos níveis séricos de citocinas Th1 e Th2 e se as mesmas
podem ser consideradas biomarcadores
- Determinar se as citocinas Th1 e Th2 podem estar associadas com a progressão
de atrofia cerebral
4. Pacientes e Métodos
4.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo observacional, longitudinal, aberto com grupo controle.
Foram realizadas 4 coletas de sangue (intervalo de 6 meses), durante 2 anos, de todos os
pacientes com LES e controles incluídos no estudo. Foram realizados dois exames de
ressonância magnética (RM) com intervalo de 1 ano.
27 4.2 Seleção dos pacientes
Foram selecionados pacientes consecutivos com LES, acompanhados no
ambulatório de Reumatologia do Hospital de Clínicas/UNICAMP cujas manifestações
clínicas e laboratoriais foram rotineiramente estudadas de acordo com protocolo já
estabelecido.
4.2.1 Critérios de inclusão - Foram incluídos pacientes com diagnóstico de LES segundo os critérios
estabelecidos pelo ACR (31) e acompanhados rotineiramente no Ambulatório de
Reumatologia do Hospital de Clínicas/UNICAMP
- Pacientes que tinham, no mínimo, 6 meses de acompanhamento no Ambulatório
de Reumatologia do Hospital de Clínicas/UNICAMP
4.2.2 Critérios de exclusão (Figura 2) - Pacientes que não concordaram em participar da pesquisa
- Pacientes com sobreposição de outras doenças autoimunes, como por exemplo,
artrite reumatoide e esclerose sistêmica
- Pacientes que apresentaram contraindicações para realização dos exames de RM
como presença de marca passo, clipes metálicos, aparelho ortodôntico,
claustrofobia
- Gravidez
4.3 Seleção dos indivíduos sadios não aparentados
O grupo controle foi constituído por indivíduos sadios com idade e distribuição
de gênero semelhante ao grupo de pacientes com LES, que não apresentaram infecções
nas datas de coleta de sangue e que concordaram em participar do projeto de pesquisa.
Esses indivíduos sadios pertenciam à mesma região geográfica (Campinas e
região), sendo estes amigos de paciente, pesquisadores e profissionais do hospital.
Foram excluídos indivíduos com doenças autoimunes e antecedentes familiares de
doença autoimune, indivíduos que apresentaram contraindicações para realização dos
exames de RM como presença de marca passo, clipes metálicos ou aparelho
ortodôntico, indivíduos com claustrofobia, com hipertensão arterial sistêmica (HAS),
diabetes mellitus, acidente vascular cerebral (AVC) prévio, gravidez (Figura 2).
28
Figura 2. Fluxograma de inclusão e exclusão de indivíduos nesse estudo
4.4 Termo de consentimento livre e esclarecido
Todos os pacientes e voluntários foram previamente informados e assinaram o
termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) - UNICAMP (nº1081/2011).
4.5 Análise clínica-laboratorial
Manifestações pregressas foram analisadas através da revisão do prontuário
médico. Foram analisadas as seguintes manifestações clínicas, laboratoriais e de
tratamento: presença de adinamia; emagrecimento (> 4 kg); febre (≥37,8° C); artrite
(não erosiva em duas ou mais articulações periféricas, vista pelo médico); necrose
asséptica (documentada em pacientes sintomáticos por radiografia simples, cintilografia
ou ressonância magnética); deformidades articulares (geralmente redutíveis vistas pelo
médico); eritema malar (eritema fixo sobre as eminências malares e/ou pregas naso-
labiais); lesões discoides (placas eritematosas, elevadas e circulares, com a presença de
escamas queratóides aderidas); alopecia; úlcera oral e/ou nasal (ulceração oral e/ou em
nasofaringe, geralmente dolorosa, observadas por médico); fotossensibilidade (rash
29 cutâneo resultado da exposição à luz solar, relatado na história clínica ou observada por
médico); nefrite (definida pela presença de proteinúria maior que 0,5 g/l em 24 horas,
aumento progressivo de creatinina sérica ou ainda alterações histopatológicas quando
compatíveis com nefrite lúpica, segundo critérios da Organização Mundial de Saúde);
hipertensão arterial (níveis pressóricos maiores que recomendados para a idade);
síndrome nefrótica (proteinúria maior que 3 g/l em 24 horas); serosite (presença de
pleurite, pericardite ou ambas documentada no exame clínico e por imagem); outras
manifestações pulmonares como hipertensão pulmonar, pneumonite e hemorragia
pulmonar; outras manifestações cardíacas como miocardite, endocardite própria do LES
e infarto do miocárdio; miopatia (revelada por fraqueza muscular, alterações
enzimáticas, alterações da biópsia muscular e /ou da eletromiografia).
Outros fatores avaliados foram: envolvimento intestinal, hepático, e do sistema
retículo-endotelial, presença de tromboembolismo pulmonar e alterações oculares e a
presença do fenômeno de Raynaud.
Os seguintes exames, solicitados rotineiramente no diagnóstico e monitoramento
do LES foram realizados de acordo com as técnicas utilizadas no Laboratório de
Patologia Clinica e no Laboratório de Investigação em Alergia e
Imunologia/UNICAMP. Foram considerados: leucopenia (<4000 células/mm3);
linfopenia (<1500 células/mm3); anemia hemolítica (Bilirrubinemia indireta, LDH
elevada, Coombs direto positivo); trombocitopenia (<100000 células/mm3); FAN (por
imunofluorescência indireta, positivo em títulos maiores que 1/80); anticorpo anti-
dsDNA (por imunofluorescência indireta com Crithidia luciliae como substrato)
(Harris, 1987); anticorpo aCL (por método imunoenzimático); anticorpo LA (por TTPA
e Russel) (Brandt, 1995). Anticorpos contra antígenos extraídos do núcleo (ENA),
incluindo Ro (SSA), La (SSB) e Sm foram detectados por um método padronizado de
ELISA (ORG 506 ENAscreen- ORGENTEC Diagnostika GmbH). Toda investigação
clínica foi realizada por um reumatologista capacitado.
4.6 Análise de atividade de doença e dano
A atividade de doença foi avaliada pelo Systemic Lupus Erythematosus Disease
Activity Index (SLEDAI) e doença foi considerada ativa quando a somatória de pontos
do SLEDAI foi igual e/ou superior a três pontos (161,162). O dano cumulativo foi
avaliado através de um questionário especificamente desenvolvido para este fim, o
Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC)/American College of
Rheumatology Damage Index (ACR-DI) (SDI) (163). O SDI consiste em 38 itens e a
30 pontuação pode variar de 0 a 47 pontos. Foi considerada a presença de dano se a
pontuação foi igual e/ou superior a 1.
4.7 Avaliação neurológica
As manifestações NP foram determinadas através da revisão de prontuários
médicos, seguindo os critérios para manifestações NP estabelecidos pelo ACR, em 1999
(46).
4.7.1 Avaliação dos transtornos de humor e ansiedade
Todos os indivíduos completaram os Inventários de Depressão de Beck (BDI)
(164,165) e Ansiedade (BAI) (166,167). Essas escalas consistem em 21 itens, cada um
descrevendo um sintoma comum a ansiedade/ depressão. O entrevistado foi convidado a
avaliar o quanto ele ou ela foi incomodado por cada sintoma durante o mês passado em
uma escala de 4 pontos variando de 0 a 3. Os itens são somados para obter uma
pontuação total que pode variar de 0 a 63. Os valores de corte utilizados para o BDI são:
0-13: sem/mínimo de sintomas de depressão; 14-19: sintomas leves de depressão; 20-
28: sintomas moderados de depressão e 29-63: sintomas severos de depressão e para o
BAI: 0-7: sem/mínimo de sintomas de ansiedade; 15/08: sintomas leves de ansiedade;
16-25: sintomas moderados de; 26-63: sintomas severos de ansiedade.
4.8 Tratamento
Foram consideradas as medicações prescritas nas datas das coletas das amostras
de sangue dos pacientes. As medicações consideradas foram prednisona,
cloroquina/hirdroxicloroquina/difosfato de cloroquina e outras drogas
imunossupressoras (azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato e
micofenolato mofetil).
4.9 Investigação com Ressonância Magnética
Os pacientes e controles foram submetidos a dois exames de RM, com intervalo
de 1 ano. As imagens de RM foram obtidas utilizando-se um aparelho de 3 Tesla
(Philips®), com aquisições em plano coronal, sagital e axial, além de aquisições em 3D
(volumétricas), que permitiu a reconstrução das imagens em qualquer plano ou
inclinação. Os parâmetros de imagens para as diferentes aquisições foram:
31 1. Imagens sagitais T1 ponderadas spin echo (espessura de 6 mm, ângulo de excitação –
tip angle –de 180º ; TR=430, TE=12, matriz de 200x350, FOV=25x25cm). Estas
imagens foram utilizadas para orientar o plano de aquisição das demais imagens.
2. Imagens no plano coronal (T2 ponderadas, FLAIR); T2 ponderadas (espessura de 6
mm, ângulo de excitação de 180º, TR=1800, TE=90, matriz de 165x256,
FOV=20x24cm) ou fast spin echo T2 ponderadas (espessura de 4mm, ângulo de 50
excitação de 120º , TR6800, TE=129, matriz de 252x328, FOV=21x23cm); FLAIR
(TR= 8500 e 2000 ou 100 e 2200, TE=72 ou 90, matriz= 256 X 296 ou 250 X 256,
FOV= 200 X 220 ou 220 x 220 mm).
3. Imagens no plano axial: duplo spin echo (T2 ponderadas e densidade de prótons);
T2 ponderadas (espessura de 6 mm, ângulo de excitação de 180º , TR=1800, TE=90,
matriz de 165x256, FOV=20x24cm) ou fast spin echo T2 ponderadas (espessura de
4mm, ângulo de excitação de 120º , TR6800, TE=129, matriz de 252x328,
FOV=21x23cm.
4. Aquisições em 3D obtidas no plano sagital gradient echo T1 ponderadas com
espessura de 1mm, ângulo de excitação de 35º TR=22, TE=9, matriz de 256x220,
FOV=230x250 cm, pixel 1x1.
4.9.1Análise das Imagens: Para o estudo volumétrico, as segmentações foram realizadas em um software
semiautomático (Neuroline®), desenvolvido no Laboratório de Neuroimagem do
Departamento de Neurologia da FCM- UNICAMP. O volume das estruturas foi obtido
pela somatória das áreas, multiplicada pela espessura do corte da imagem.
Os resultados da análise dos pacientes com RM foram comparados ao grupo
controle; o padrão de normalidade foi obtido a partir da análise das estruturas de
interesse dos voluntários sadios.
O volume do corpo caloso foi corrigido pelo volume cerebral. A atrofia do corpo
caloso e cerebral foi determinada quando o Z-escore médio foi menor ou igual a -2 DP e
foi determinado aumento de ventrículo quando o Z-escore médio foi maior ou igual a 2
DP.
A progressão de atrofia foi determinada pela fórmula: (volume da estrutura na
RM 2 – volume da estrutura na RM1) / volume da estrutura na RM1. A progressão foi
expressa em porcentagem.
32 4.10 Determinação dos níveis séricos das citocinas
Foi coletado um total de 32 mL (8mL por coleta) de sangue venoso de cada
paciente, no centro de coleta, em conjunto com os exames de rotina solicitados
regularmente para avaliação de atividade de doença. A coleta de sangue dos controles
foi realizada em no mesmo dia da coleta do paciente. Foram realizadas 4 coletas de
sangue (Tempo I, II, III e IV).
As amostras de sangue, após coagulação em temperatura ambiente de 30
minutos, foram centrifugadas, aliquotadas e conservadas a –80°C, para posterior análise
no Laboratório de Reumatologia FCM/UNICAMP. As amostras de soro foram obtidas
de janeiro/2010 a dezembro/2012.
Os níveis séricos de IL-12, INF-γ, TNF-α, IL-4, IL-6 e IL-10 foram dosados
pelo método de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) [Kits da R&D Systems
(London, UK)] conforme previamente apresentado na literatura e descrito a seguir.
Todos os testes foram feitos pelo mesmo indivíduo.
4.10.1 Técnica de ELISA A amostra utilizada foi soro, a partir de sangue total, colhido em tudo seco com
gel. Esperamos a amostra de sangue total coagular, a temperatura ambiente por 30
minutos. O tubo com a amostra de sangue foi centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos.
PREPARO DE REAGENTES:
1. Solução de lavagem: 100 mL do concentrado foram diluídos em água destilada
e/ou deionizada para obtenção de um volume final de 1000 mL.
2. Substrato: O substrato liofilizado foi reconstituído com 6,0 mL de diluente de
substrato, 10 minutos antes do uso.
3. O amplificador liofilizado foi reconstituído com de 6,0 mL de diluente do
amplificador, 10 minutos antes do uso.
4. Padrão: A solução padrão foi reconstituída com o diluente Calibrador, segundo
as especificações impressas no rótulo do frasco do padrão para produzir uma
solução estoque.
a. Tubos de polipropileno foram utilizados para montagem da curva de
calibração. 500 µL de Calibrador Diluente foram pipetados em cada tubo. A
solução estoque foi utilizada para produzir uma série de diluição. Cada tubo
foi homogeneizado cuidadosamente antes da próxima transferência. O
padrão diluído serviu de padrão elevado. O Calibrador Diluente serviu como
padrão zero (0 pg/mL).
33 PROCEDIMENTO:
1. Todos os reagentes, amostras e padrões de trabalho foram preparados
previamente, conforme indicado nas seções anteriores.
2. 50 µL de Diluente de amostra foram adicionados em todos os poços.
3. 200 µL de solução padrão, amostra ou controle foram adicionados em seus
respectivos poços. A microplaca foi coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A
microplaca foi incubada por 3 horas à temperatura ambiente.
4. Lavagem
a. O líquido dos poços foi removido por aspiração ou por inversão da
microplaca, descartando o conteúdo.
b. O excesso de líquido foi retirado, segurando firmemente a microplaca,
pressionando-a em toalha de papel limpa, por 5 vezes.
c. Foram colocados 400 µL de tampão de lavagem em cada poço da
microplaca, utilizando uma pipeta multicanal automática.
d. O líquido dos poços foi removido por aspiração ou por inversão da
microplaca, descartando o conteúdo.
e. Os passos b, c, d foram repetidos por 5X para um total de seis lavagens.
5. Foram adicionados 200 µL de Conjugado em cada poço. A microplaca foi
coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 2 horas
à temperatura ambiente.
6. A lavagem (passo 5) foi realizada novamente.
7. Foram adicionados 50 µL de Substrato em cada poço. A microplaca foi coberta
com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 1 hora à
temperatura ambiente. Após incubação a placa não foi lavada.
8. Foram adicionados 50 µL de Amplificador em cada poço. A microplaca foi
coberta com a fita adesiva fornecida pelo kit. A microplaca foi incubada por 30
minutos à temperatura ambiente. A adição do Amplificador iniciou o
desenvolvimento da cor da solução. Após incubação a placa não foi lavada.
9. Foram adicionados 50 µL de solução de parada em cada poço. A adição da
solução de parada não afetou a cor dos poços.
10. A densidade óptica de cada poço foi determinada por uma leitora de microplacas
ajustada para 490 nm (variação do filtro de acordo com instruções de cada
fornecedor) no prazo de 30 minutos depois de colocada solução de parada.
34
4.10.2 Obtenção de resultados
Após obtenção da média das duplicatas (absorbância), foi subtraída a média do
padrão zero. A curva padrão foi desenhada a partir da densidade óptica (absorbância) e
as concentrações dos padrões já conhecidos. Os dados puderam ser linearizados por
log/log.
Para determinar a concentração de cada citocina de cada amostra, primeiro,
encontrou-se o valor da absorbância no eixo-y e estendeu-se uma linha horizontal para a
curva padrão. No ponto de intersecção, estendeu-se uma linha vertical para o eixo-x e
leu-se a concentração correspondente a citocina.
4.11 Análise estatística
Para a determinação dos resultados foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk. Os níveis séricos das citocinas não apresentaram distribuição normal; foi
necessário usar a Transformação de Blom para ajustá-los a distribuição normal. A
seguir, foi empregado o teste t de Student para comparação dos grupos independentes.
A análise de variância para dados pareados (One Way Repeated Measures Anova) foi
utilizada para comparar as médias da citocinas nos quatro tempos (TI, TII, TIII e TIV).
Para análise de progressão de atrofia das estruturas cerebrais, empregou-se o teste T
pareado.
Mantivemos as variáveis não normalizadas para comparação das distribuições
nos quatro tempos (quatro tempos pareados). Utilizou-se o teste de Friedman. Nas
situações em que o teste de Friedman apresentou significância estatística realizamos as
comparações múltiplas não paramétricas. Para a análise dos dados pareados, foi feita a
divisão em dois grupos: grupo I, formado pelos pacientes com LES que apresentaram
atividade de doença, alguma manifestação clínica e/ou laboratorial, e estavam em uso de
medicação em pelo menos um dos tempos de avaliação; e o grupo II, formado pelos
pacientes com LES que não apresentaram atividade de doença, qualquer manifestação
clínica e/ou laboratorial, e que, não estavam em uso de medicação em todos os tempos
de avaliação. A correlação de Spearman foi utilizada para correlacionar as variáveis
contínuas.
Para avaliar a associação entre Dano Cumulativo e as citocinas Th1 e Th2
determinou-se o Odds Ratio não ajustado por Regressão logística univariada. Para o
modelo logístico multivariado foram selecionadas as variáveis que apresentaram p-valor
menor ou igual a 0,20. Empregou-se o método forward stepwise com probabilidade de
35 inclusão de 0,05 e de exclusão de 0,20. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado
estatisticamente significativo. A análise estatística foi realizada no programa SPSS®
16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
5. Resultados
5.1 Capítulo 1 Avaliação longitudinal das citocinas Th1 (TNF-α, INF-γ, IL-12) e Th2
(IL-4, IL-6, IL-10) em pacientes com LES: associações com manifestações clínicas e
laboratoriais
5.1.1 Dados demográficos
Foram incluídos 218 (210 mulheres) pacientes com LES, com média de idade de
42,62 anos [desvio padrão (DP)± 11,98 anos; intervalo 20-76]. A média do tempo de
doença foi de 13,09 anos (DP±7,31; intervalo 2-44 anos). O grupo controle, com
distribuições de idade e sexo similares ao grupo de pacientes, foi constituído por 46 (40
mulheres) voluntários sadios com média de idade de 40,04±13,54 anos (intervalo 22-
73).
5.1.2 Características clínicas, laboratoriais e tratamento
Em relação à atividade de doença, 102 (46,8%) estavam em atividade no tempo
I, 86 (39,4%) pacientes no tempo II, 75 (34,4%) no tempo III e 78 (35,8%) pacientes
estavam em atividade de doença no tempo IV. Observou-se uma mudança da atividade
de doença ao longo do acompanhamento dos pacientes (Tabela 3). Através do teste de
Friedman (distribuição não-normal) observou-se uma diminuição significativa no
escore de SLEDAI (p<0,005) dos pacientes ao longo do tempo.
36
Tabela 3. Score do SLEDAI dos pacientes nos 4 tempos de avaliação
TEMPO DA
AVALIAÇÃO
PACIENTES EM
ATIVIDADE
ESCORE TOTAL
SLEDAI
I N=102 (46,8%) 3,46±3,85
(0-16)
II N=86 (39,4%) 2,98±3,69
(0-15)
III N=75 (34,4%) 2,77±3,84
(0-18)
IV N=78 (35,8%) 2,67±3,80
(0-22) Dados expressos em média±DP (Mínimo-Máximo)
As manifestações mais frequentemente observadas nos quatro tempos de
avaliação foram: sintomas de ansiedade, nefrite, sintomas de depressão, eritema malar,
cefaleia, alopecia e, por fim, artrite. A frequência dessas manifestações em cada tempo
de avaliação está descritas na Tabela 4.
37
Tabela 4. Frequência das manifestações clínicas nos quatro tempos de avaliação
MANIFESTAÇÕES
CLÍNICAS
TEMPO I
N (%)
TEMPO II
N (%)
TEMPO III
N (%)
TEMPO IV
N (%)
Sintomas de
ansiedade 110 (50,4) 96 (44) 80 (36,6) 66 (30,3)
Nefrite 66 (30,3) 55 (25,2) 50 (22,9) 56 (25,7)
Sintomas de
depressão 64 (29,4) 62 (28,4) 46 (21,1) 45 (20,6)
Eritema malar 21 (9,6) 12 (5,5) 14 (6,4) 22 (10,1)
Cefaleia 15 (6,9) 16 (7,3) 10 (4,6) 10 (4,6)
Alopecia 13 (6) 9 (4,1) 14 (6,4) 11 (5)
Artrite 10 (4,6) 7 (3,2) 7 (3,2) 11 (5)
As manifestações laboratoriais em cada tempo de análise estão descritas na
Tabela 5:
38
Tabela 5. Frequência das manifestações laboratoriais nos quatro tempos de avaliação
MANIFESTAÇÕES
LABORATORIAIS
TEMPO I
N (%)
TEMPO II
N (%)
TEMPO III
N (%)
TEMPO IV
N (%)
Hipocomplementemia 48 (22) 49 (22,5) 37 (16,9) 36 (16,5)
Plaquetopenia 6 (2,8) 3 (1,4) 5 (2,3) 3 (1,4)
Leucopenia 11 (5) 11 (5) 10 (4,6) 10 (4,6)
Em relação ao tratamento, foram consideradas as seguintes medicações para
este estudo: corticosteroides (prednisona), anti-maláricos (cloroquina, hidroxicloroquina
e difosfato de cloroquina) e imunossupressores (Azatioprina, Metotrexato, Micofenolato
Mofetil, Ciclosporina e Ciclofosfamida). A frequência dos de pacientes com LES que
estavam em uso dessas medicações está descrita na Tabela 6:
39
Tabela 6. Medicações em uso pelos pacientes com LES nos quatro tempos de avaliação
PARÂMETRO TEMPO I
N (%)
TEMPO II
N (%)
TEMPO III
N (%)
TEMPO IV
N (%)
Pacientes com medicação
em uso 208 (95,4) 208 (95,4) 204 (93,6) 200 (92,2)
Pacientes em uso de
corticosteroides 189 (86,7) 189 (86,7) 181 (83) 175 (80,3)
Pacientes em uso de
cloroquina/
Hidroxicloroquina/
Difosfato de cloroquina
115 (52,8) 119 (54,6) 119 (54,6) 119 (54,6)
Pacientes em uso de
imunossupressores
Azatioprina
Metrotexato
Micofenolato Mofetil
Ciclosporina
Ciclofosfamida
84 (38,5)
62 (28,4)
20 (9,2)
7 (3,2)
0 (0)
2 (0,9)
87 (40)
65 (29,8)
16 (7,3)
8 (3,7)
0 (0)
0 (0)
88 (40,4)
68 (31,2)
19 (8,7)
5 (2,3)
0 (0)
1 (0,4)
90 (41,3)
69 (31,6)
16 (7,3)
3 (1,4)
0 (0)
0 (0)
5.1.3 Dosagem dos níveis séricos das citocinas Th1 e Th2
Observou-se que, apenas a IL-6 permanece significativamente aumentada em
pacientes com LES quando comparada a controles sadios, nos quatro tempos de
avalição. A mediana (mínimo-máximo) dos níveis séricos das citocinas Th1 (IL-12,
INF-γ, TNF-α) e as Th2 (IL-4, IL-6 e IL-10), em cada tempo de análise está
demonstrada nas figuras abaixo (Figura 3).
40
Figura 3A, 3B, 3C. Níveis séricos de citocinas Th1 em pacientes com LES e controles sadios
O grupo 1 é representado pelos pacientes com LES e o grupo 2 pelos controles sadios. O nível das
citocinas Th1 está expresso em pg/mL. As barras horizontais são as medianas. Resultados do teste de
Mann-Whitney usado para comparar os níveis das citocinas Th1 entre os grupos. *p<0,05.
3A
3B
3C
41
Figura 3D, 3E, 3F. Níveis séricos de citocinas Th2 em pacientes com LES e controles sadios
O grupo 1 é representado pelos pacientes com LES e o grupo 2 pelos controles sadios. O nível das
citocinas Th2 está expresso em pg/mL. As barras horizontais são as medianas. Resultados do teste de
Mann-Whitney usado para comparar os níveis das citocinas Th2 entre os grupos. *p<0,05.
3D
3E
3F
42 Observou-se uma associação entre os níveis séricos de IL-10 e nefrite nos quatro
tempos de análise; tempo I (p=0,008), tempo II (p=0,036), tempo III (p=0,024) e tempo
IV (p=0,005).
5.1. 4 Avaliação dos dados pareados
Na avaliação dos dados pareados, não se observou flutuação significativa nos
níveis de TNF-α (p=0,304) e IL-6 (p=0,241) ao longo do tempo estudado. A flutuação
dos níveis séricos das citocinas Th1 (IL-12, INF-γ, TNF-α) e das Th2 (IL-4, IL-6 e IL-
10) nos pacientes com LES, de acordo com os tempos de análise está demonstrada na
tabela abaixo (Tabela 7). No grupo dos controles sadios, não foi observada flutuação
das citocinas Th1 e Th2 (p>0,05) (Tabela 8).
43
Tabela 7. Flutuação dos níveis séricos das citocinas Th1 e Th2 nos pacientes com LES, de acordo com os tempos de análise
PA
CIE
NT
ES
LE
S
CITOCINAS Th1
TNF-α INF-γ IL-12
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor P
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor p
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor p
Med 2,84 2,67 2,83 2,71 0,304 25,7 31,22 35,99 26,26 0,026* 1,86 0,94 1,09 1,34 <0,001* Min 0,37 0,31 0,27 0,48 3,07 0,07 0,29 0,93 0,22 0,16 0,21 0,29 Max 19,77 30,89 16,58 23,55 75,35 96,06 95,59 83,65 15,58 5,39 7,88 18,36
CITOCINAS Th2
IL-4 IL-6 IL-10 Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
P Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
p Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
p
Med 0,41 0,34 0,34 0,5 0,001* 2,13 1,96 2,5 2,37 0,241 0,98 0,94 1,09 1,34 <0,001* Min 0,01 0,03 0,05 0,04 0,03 0,02 0,1 0,05 0,31 0,16 0,21 0,29 Max 2,02 1,08 6,62 2,64 19,77 16,93 30,14 25,2 15,1 5,39 7,88 18,36
Med- mediana Min- mínimo
Max - máximo *p<0,05
44
Tabela 8. Flutuação dos níveis séricos das citocinas Th 1 e Th2 nos controles sadios, de acordo com os tempos de análise
C
ON
TRO
LE
S
CITOCINAS Th1
TNF-α INF-γ IL-12
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor P
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor p
Tempo I
Tempo II
Tempo III
Tempo IV
Valor p
Med 1,7 2,07 2,53 2,21 0,114 25,38 37,27 41,18 42,77 0,266 1,55 1,55 1,44 1,25 0,314 Min 0,48 0,43 0,53 0,84 0,49 10,5 24,57 29,73 0,14 0,14 0,03 0,82 Max 8,97 27,16 6,23 17,28 51,29 108,55 77,71 79,13 8,09 8,09 3,9 2,98
CITOCINAS Th2
IL-4 IL-6 IL-10 Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
P Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
p Tempo
I Tempo
II Tempo
III Tempo
IV Valor
p
Med 0,1 0,34 0,48 0,43 0,064 0,91 0,91 0,93 1,3 0,242 0,8 0,8 0,87 1,27 0,801 Min 0,01 0,02 0,07 0,17 0,4 0,4 0,36 0,61 0,18 0,18 0,56 0,21 Max 1,2 2,83 3,92 1,83 8,83 8,83 6,3 12,93 9,54 9,54 2,89 2,37
Med- mediana Min- mínimo
Max - máximo *p<0,05
45
Em relação ao INF-γ, observou-se uma associação entre a flutuação dos níveis
de INF-γ e o uso de medicação (p=0,029). Além disso, uma associação entre a flutuação
dos níveis de INF-γ e o uso de corticosteroide (p=0,04) e também com o uso de
cloroquina (p=0,012) foi observada. Observou-se uma associação entre a flutuação dos
níveis de INF-γ e manifestação NP (p=0,039). Quando as manifestações NP foram
avaliadas individualmente, não se observou essa associação.
Ao analisar a IL-12, observou-se uma associação entre a flutuação dos níveis de
IL-12 e o uso de medicação (p<0,001). Quando cada grupo de medicação foi avaliado
individualmente, essa associação não foi observada. Não se observaram associações
entre a flutuação dos níveis de IL-12 e manifestações clínicas e/ou laboratoriais.
Ao analisar a IL-4, uma associação entre a flutuação dos níveis IL-4 e o uso de
medicação (p<0,001) foi observada. Além disso, uma associação foi observada entre
flutuação dos níveis IL-4 e o uso de cloroquina (p<0,001). Em relação às manifestações
clínicas e laboratoriais, observou-se uma associação entre a flutuação dos níveis de IL-4
e pacientes com sintomas de ansiedade (BAI) (p=0,004) e pacientes com sintomas de
depressão (BDI) (p=0,005).
Em relação a IL-10, não foi observada associação entre a flutuação dessa
citocina e o uso de medicações. Uma associação entre a flutuação dos níveis de IL-10 e
atividade de doença (p<0,001) foi observada. Para suportar este dado, foi feita uma
análise em cada tempo entre níveis séricos de IL-10 e atividade de doença. Observou-se
que em todos os tempos, os níveis séricos de IL-10 estavam associados e
correlacionados com a atividade de doença (vide Tabela 9):
Tabela 9. Resultados dos testes de Mann-Whitney e das correlações de Spearman entre os níveis séricos
de IL-10 e atividade de doença em cada tempo de análise
TEMPO TESTE MANN-WHITNEY CORRELAÇÃO SPEARMAN
I p<0,001* rs= 0,28 p<0,001*
II p=0,004* rs= 0,23 p=0,001*
III p=0,007* rs= 0,19 p=0,007*
IV p=0,039* rs= 0,14 p=0,049*
rs= Coeficiente de correlação de Spearman *p<0,05
46
Em relação às manifestações clínicas e laboratoriais, observou-se uma
associação entre a flutuação dos níveis de IL-10 e manifestação NP (p<0,001). Houve
uma associação entre a flutuação dos níveis de IL-10 e pacientes com sintomas de
ansiedade (BAI) (p<0,001).
5.1.5 Análise de preditores de dano cumulativo
Para determinar se as citocinas Th1 e Th2 seriam preditoras de dano cumulativo
no LES, aplicou-se a regressão logística. De acordo com os resultados da regressão
logística univariada, observou-se uma possível associação entre dano cumulativo e
TNF-α (OR=0,39; 95%IC 0,16 - 0,96; p=0,041), IL-6 (OR=0,32; 95%IC 0,12 - 0,88;
p=0,027) e IL-10 (OR=0,44; 95%IC 0,20 - 0,97; p=0,044).
Após o ajuste por regressão logística multivariada não foi observada associação
entre dano cumulativo e TNF-α (OR ajustado=0,52; 95%IC 0,21-1,33; p=0,274), IL-6
(OR ajustado=0,40; 95%IC 0,14-1,11; p=0,079) e IL-10 (OR ajustado=0,47; 95%IC
0,20-1,08; p=0,074).
5.2 Capítulo 2 Análise de progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso e
associação com citocinas Th1 e Th2 em pacientes com LES
5.2.1 Dados demográficos
Foram incluídos 85 (81 mulheres) pacientes com LES com média de idade de
41,14 anos (DP±11,08 anos; intervalo 24-73). O tempo médio de doença foi de 13,48
(DP±7,83 anos; intervalo 3-44). O grupo controle foi constituído por 59 (52 mulheres)
com média de idade 40,14 anos (DP±13,42; intervalo 22-71). O grupo controle foi
pareado por idade (p=0,35) e sexo (p=0,11).
5.2.2. Manifestações clínicas, laboratoriais e de tratamento
Em relação à atividade de doença, na data da primeira RM, 38 pacientes
apresentavam doença ativa com SLEDAI médio de 3,71 (DP± 4,24 pontos; intervalo 0-
16). Na data da segunda RM, 34 apresentavam doença ativa com SLEDAI médio de
2,83 (DP± 3,52 pontos; intervalo 0-12). As manifestações neuropsiquiátricas mais
frequentemente observadas foram: cefaleia, convulsão, transtorno do humor, ansiedade
e polineuropatia (Tabela 10).
47
Tabela 10. Manifestações NP observadas nos pacientes com LES até a data do primeiro exame de RM e
depois até o segundo exame de RM
Manifestação NP
Até a data da
1ª RM
N (%)
Entre a data da 1ª RM
e da 2ª RM
N (%)
Ansiedade 46 (54,1) 31 (36,5)
Transtorno do humor 30 (35,3) 23 (27)
Convulsão 10 (11,8) 6 (7)
Cefaleia 9 (10,6) 5 (5,9)
Polineuropatia 5 (5,9) 2 (2,4)
Transtorno de movimento (Coreia) 1 (1,2) 1 (1,2)
Mielite transversa 1 (1,2) 0
O anticorpo aCL estava positivo em 30 (35,3%) pacientes com LES e o
anticorpo LA em 25 (29,4%) dos pacientes com LES. Na primeira RM, 5 (5,8%)
pacientes com LES estavam sem medicação. Sessenta e seis (77,6%) pacientes estavam
em uso de corticosteroides, com dose média de 13,79mg (DP±13,49). Quarenta e nove
(57,6%) pacientes estavam em uso de cloroquina/hidroxicloroquina/difosfato de
cloroquina e 39 (45,8%) estavam em uso de alguma droga imunossupressora. Na
segunda RM, 8 (9,4%) pacientes com LES estavam sem medicação. Sessenta e cinco
(76,5%) pacientes estavam em uso de corticosteroides, com dose média de 11,36mg
(DP±12,37). Quarenta e seis (54,1%) pacientes estavam em uso de cloroquina/
hidroxicloroquina/ difosfato de cloroquina e 34 (40%) estavam em uso de alguma droga
imunossupressora. A média de corticosteroide total (g) dos pacientes com LES foi
41,95± 34,09.
5.2.3 Análise da progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso
Houve uma diferença significativa no volume cerebral e de corpo caloso dos
pacientes com LES quando comparado aos controles sadios (Tabela 11).
48
Tabela 11. Volume cerebral, do corpo caloso e do ventrículo de pacientes com LES e controles sadios, na 1ª RM e
na 2ª RM (após 1 ano)
1ªRM 2ªRM
Cerebral
Corpo
caloso Ventrículo Cerebral
Corpo
caloso Ventrículo
Pacientes
com LES
1056,45±
86,75
11,57±
2,10
17,92±
9,14
1040,13±
133,31
13,20±
13,57
18,99±
14
Controles 1086,37±
165,77
14,67±
14,33
16,32±
16,95
1103,82±
87,68
12,37±
1,77
21,10±
23,13
Valor p 0,01* <0,001* 0,06 0,007* 0,001* 0,73
Dados expressos em média±DP (cm3) *p<0,05
Em relação à atrofia cerebral, na 1ª RM nenhum paciente apresentava atrofia e
na 2ª RM, 6 (7%) pacientes apresentaram atrofia cerebral (p=0,013). Quanto à atrofia de
corpo caloso, na 1ª RM nenhum paciente apresentava atrofia, na 2ª RM, 5 (5,8%)
pacientes apresentaram atrofia de corpo caloso (p=0,024). Não houve diferença no
aumento de ventrículo (p=0,313). Após aplicação do teste T pareado, não foi observada
diferença significativa no volume cerebral (p=0,167), no volume de corpo caloso
(p=0,274) e no volume do ventrículo (p=0,412) entre a 1ª e a 2ª RM.
A média de progressão de perda de volume cerebral nos pacientes com LES foi
de 2,3% (DP±10,08), e de volume de corpo caloso foi de 5,83% (DP±4,97). A média de
progressão de aumento de ventrículo foi de 5,31% (DP±4,74). A média de progressão
de perda de volume cerebral nos controles sadios foi de 0,32% (DP±1,73), e de volume
de corpo caloso foi de 0,03% (DP±0,19). A média de progressão de aumento de
ventrículo nos controles foi de 0,91% (DP±2,69). Observou uma diferença significativa
na progressão de perda de volume cerebral (p=0,028) e de perda de volume de corpo
(p<0,001) entre pacientes com LES e controles sadios. Não foi observada diferença
significativa na progressão de aumento de ventrículo entre pacientes e controles
(p=0,27).
Observou-se uma associação entre IL-12 e progressão de atrofia cerebral
(p=0,008). E ainda, uma correlação direta entre os níveis séricos de IL-12 e
porcentagem de perda de volume cerebral (rs=0,3; p=0,015). Não foram observadas
49
associações entre progressão de atrofia (cerebral e de corpo caloso) e as outras citocinas
estudadas ou manifestações clínicas e laboratoriais.
Tabela 12. Associações entre progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso com citocinas,
manifestações clínicas, laboratoriais e de tratamento
Parâmetro
Atrofia
Cerebral
(Valor p)
Atrofia
Corpo Caloso
(Valor p)
Citocinas
IL-4 0,294 0,830
IL-6 0,669 0,470
IL-10 0,107 0,680
IL-12 0,008* 0,652
TNF-α 0,847 0,352
INF-γ 0,352 0,091
Manifestações Clínicas
SLEDAI 0,156 0,978
SDI 0,216 0,354
Manifestações NP 0,547 0,951
Manifestações laboratoriais
aCL 0,688 0,094
LA 0,718 0,824
Tratamento
Corticosteroides 0,354 0,963
Cloroquina/Hidroxicloroquina/
Disfosfato de cloroquina 0,483 0,426
Imunossupressores 0,527 0,188
Corticosteroide total 0,479 0,647 *p<0,05
50
6. Discussão
6.1 Capítulo 1 Avaliação longitudinal das citocinas Th1 (TNF-α, INF-γ, IL-12) e Th2
(IL-4, IL-6, IL-10) em pacientes com LES: associações com manifestações clínicas e
laboratoriais
Este é o primeiro estudo de avaliação longitudinal do perfil de citocinas Th1 e
Th2 em pacientes com LES. O LES é caracterizado pela perda global da tolerância
imunológica com ativação de células B e T autorreativas, levando a um aumento na
produção de autoanticorpos e de citocinas, causando importantes lesões teciduais (168).
As citocinas são proteínas de baixo peso que desempenham um papel fundamental no
equilíbrio imunológico. O desequilíbrio nos níveis séricos de citocinas pró e anti-
inflamatórias influencia na patogênese do LES (127). Níveis aumentados de citocinas
em pacientes com LES promovem exacerbação da resposta inflamatória, aumento da
apoptose e da produção de autoanticorpos, que além de iniciarem podem também
manter a atividade de doença ao longo do tempo (127).
Identificar biomarcadores que se correlacionem com a atividade sistêmica do
LES e que possam predizer um envolvimento orgânico futuro, além de ajudarem na
investigação de novos alvos terapêuticos é de suma importância (169). Embora vários
grupos de pesquisa estudem a patogênese da doença, poucos biomarcadores têm sido
validados até o presente momento. A ausência de biomarcadores dificulta não somente a
avaliação precisa de atividade de doença, mas também dificulta a identificação de
pacientes com riscos de agudização e da ocorrência de lesão cumulativa em órgãos
alvos (129).
Em nosso estudo, observamos uma associação de INF-γ com o uso de
medicação. Níveis séricos mais baixos de INF-γ foram observados em pacientes em uso
de corticosteroides, ao longo do tempo estudado. Estudos demonstraram que os
corticosteroides bloqueiam a resposta proliferativa de linfócitos T ativados, diminuindo
assim, a produção de citocinas (170,171). Além disso, os corticosteroides modificam a
função das células Natural Killer (NK) (produtoras de INF-γ) (172). Epigeneticamente,
através dos mecanismos de acetilação e de metilação, os corticosteroides diminuem a
atividade das células NK, consequentemente diminuindo a produção de INF-γ (172).
Nossos dados também demonstraram níveis séricos mais baixos de INF-γ e de
IL-4 em pacientes em uso de cloroquina/hidroxicloroquina/difosfato de cloroquina, ao
longo do tempo estudado. Os anti-maláricos (cloroquina/hidroxicloroquina/difosfato de
51
cloroquina), são capazes de alterarem a apresentação de antígenos próprios, por meio
do aumento do pH de compartimentos intracelulares, levando a uma disfunção da
fagocitose (173,174). Os anti-maláricos também podem bloquear a resposta
proliferativa de células T ativadas, levando a uma diminuição na produção de citocinas,
como por exemplo, de INF-γ (175). Estudos anteriores demonstraram que os anti-
maláricos também podem inibir os toll-like receptor (TLR) (176). Os TLR são
responsáveis, dentre outras células, pela produção de citocinas pró-inflamatórias,
incluindo o INF-γ e IL-4. A inibição dos TLR acarreta numa menor produção dessa
citocina (149).
Nossos dados mostraram uma associação da IL-10 com atividade de doença.
Níveis séricos de IL-10 são de 3 a 12 vezes mais elevados em pacientes com LES
quando comparado a indivíduos saudáveis (157,177-180). Nossos dados corroboram
com estudos anteriores, demonstrando a correlação direta dos níveis de IL-10 com a
atividade de doença (154,156,169,177,180,181). Um estudo avaliou os níveis de IL-10
em um grupo de pacientes com LES com doença ativa e quatro semanas após o início
do tratamento (156). No primeiro momento, os níveis séricos de IL-10 estavam até nove
vezes mais elevados quando comparados a controles sadios. Além disso, houve uma
correlação direta com o escore de SLEDAI. Depois do tratamento, novas dosagens
foram feitas, e observada novamente uma correlação com o escore de SLEDAI; desta
vez, mais baixos (156).
Apesar de seu papel anti-inflamatório, quando superexpressada, que é o caso dos
pacientes com LES, a IL-10 passa a apresentar um papel patogênico (158). Esse
aumento pode ser atribuído às células B e aos monócitos. Uma vez aumentada, pode
desregular a função de células B e de células T, promovendo um desvio na resposta
imunológica (158). O aumento na secreção desta citocina pode ainda, resultar do
aumento de células B prematuras circulantes (182). Contudo, contribuindo para um
aumento na produção de autoanticorpos e de outras citocinas, como por exemplo, TNF-
α.
Observamos uma associação dos níveis séricos de INF-γ e IL-10 com
manifestações neuropsiquiátricas em pacientes com LES. Na literatura, estudos
mostraram níveis aumentados de INF-γ em pacientes com LES e manifestações SNC
(183). Essa relação entre citocinas e neuroinflamação pode ser explicada pelo fato de
que citocinas, como a IL-10 podem ser produzidas por células neuronais e da microglia,
52
provavelmente em resposta a autoanticorpos do espaço intratecal (184), levando a uma
neuroinflamação.
Especificamente em relação ao INF-γ, essa citocina só é encontrada no SNC
caso haja a quebra da barreira hematoencefálica (BHE) e consequentemente a
infiltração de células T ativadas (185). O INF-γ é um potente modulador de expressão
do antígeno de MHC em certos tipos de células, incluindo os astrócitos, os
oligodendrócitos e células da microglia (186,187). Células cerebrais expressam baixos
níveis de antígenos de MHC de classe I, que exercem um papel crítico na regulação da
resposta imunológica. Uma vez aumentado o INF-γ no espaço intratecal, pode haver
uma maior expressão de MHC de classe I, levando as células cerebrais a se romperem
(188).
Moléculas de MHC classe II têm um papel chave na regulação da resposta
imunológica, por apresentarem antígenos a células T auxiliares, ativando-as. Os
astrócitos e as células da microglia não expressam constitutivamente antígenos de MHC
de classe II, no entanto, o INF-γ pode induzir a expressão desses antígenos nessas
células, causando uma ativação inespecífica de células T auxiliares (189-191).
Observamos uma associação entre IL-4 e IL-10 e sintomas de ansiedade e de
depressão. Uma associação de IL-10 e sintomas de ansiedade também foi observada nos
pacientes com LES. Não há estudos anteriores na literatura que relatem associações
entre IL-4 e/ou IL-10 e transtornos de humor e ansiedade em pacientes com LES. Uma
possível explicação para a associação de citocinas com transtornos do humor e
ansiedade é que estímulos neuroinflamatórios induzem processos que estimulam a
liberação de mediadores (citocinas) que influenciam no comportamento e no humor
(192,193).
6.2 Capítulo 2 Análise de progressão de atrofia cerebral e de corpo caloso e
associação com citocinas Th1 e Th2 em pacientes com LES
A frequência de atrofia cerebral em pacientes com LES é variável (194-206). A
fisiopatologia consistente no envolvimento do SNC no LES permanece não esclarecida.
Alguns mecanismos têm sido propostos, como por exemplo, imunocomplexos e
autoanticorpos circulantes, utilização de corticosteroides e liberação de citocinas
(207,208).
53
São poucos os estudos publicados sobre progressão de atrofia cerebral no LES
(205). Observamos em nosso estudo uma redução do volume cerebral dos pacientes
com LES quando comparados a controles sadios. Estudos já publicados também relatam
essa perda (194-206). Em nossas análises das imagens de RM, observamos atrofia
cerebral em 7% dos pacientes e em 5,8% dos pacientes com LES, observamos atrofia de
corpo caloso. Estas frequências são menores do que as relatadas na literatura (194-206),
mas podem ser atribuídas ao método utilizado em nosso estudo. Ao realizarmos a
segmentação por um método semiautomático e ao usarmos a definição de atrofia
quando o Z-escore médio fosse menor ou igual a -2 DP, apenas atrofia mais
pronunciada foi considerada.
Observamos uma associação de IL-12 com a progressão de atrofia cerebral nos
pacientes com LES. Observamos ainda, uma correlação direta dos níveis séricos de IL-
12 com a porcentagem de perda do volume cerebral nos pacientes. Além do tempo de
doença, dose cumulativa de corticosteroide, presença de anticorpos antifosfolípides,
entre outros, e envolvimento do SNC, as citocinas também contribuem para o dano
cerebral (202,207-210). Citocinas periféricas produzidas durante a resposta inflamatória
podem ser importantes biomarcadores na investigação da relação entre a inflamação e
SNC (211,212). Inflamação periférica pode contribuir para a progressão de atrofia
cerebral por ativarem uma resposta inflamatória no espaço intratecal.
A interação entre o SNC e o sistema imunológico se baseia na expressão de
diversas citocinas e seus receptores em diferentes tipos de células (213). Os dois
principais tipos de células gliais reativas que desempenham papéis importantes durante
a lesão cerebral são microglia e astrócitos (212,214). Estas células estão envolvidas na
resposta imune intratecal onde atuam, em parte, através da secreção de citocinas, de
quimiocinas e de fatores neurotóxicos (212,214).
Outra possível explicação para a neuroinflamação seria a quebra da BHE,
fazendo com que moléculas da circulação periférica, como por exemplo, as citocinas
periféricas passem para o espaço intratecal, levando a uma inflamação no SNC (215). A
BHE atua como um condutor regulatório entre o SNC e a circulação periférica,
estabelecendo e mantendo a homeostase do SNC, ajudando a controlar o fluxo de
moléculas sinalizadoras (212,215). As citocinas podem ainda levar a uma alteração na
permeabilidade da BHE, e também a uma alteração do transporte saturado de
neuropeptídios, sem alterar a integridade da BHE. A própria BHE pode secretar
citocinas que podem participar ativamente das reações inflamatórias do SNC (216-218).
54
Estudos relatam a associação de anticorpos antifosfolípides e dano cerebral
(209,210,219,220). Os anticorpos antifosfolípides estão associados a AVCs secundários
a microembolia, podendo agravar a atrofia cerebral (209,210,219,220). Em nosso
estudo, não observamos associação entre a atrofia e a presença dos anticorpos
antifosfolípides (aCL e LA). Não observamos associação entre atrofia cerebral e outras
citocinas estudadas.
Em nosso estudo, não observamos associação entre a atrofia cerebral e
corticosteroide total. Na literatura, essa associação ainda é controversa. Alguns estudos
demonstraram que a atrofia cerebral é decorrente do uso prolongado de corticosteroide,
enquanto que, outros estudos afirmam ser devido à atividade de doença (202,204,221-
223). Essa discrepância é decorrente de fatores como: dose de manutenção e/ou
cumulativa de corticosteroide e gravidade dos pacientes incluídos no estudo.
55
7. Conclusões
1. Há a presença de uma flutuação significativa nos níveis séricos de INF-γ, IL-12,
IL-4 e IL-10 em pacientes com LES
2. IL-10 pode ser considerada biomarcador para atividade de doença e nefrite no
LES
3. INF-γ, IL-4 e IL-10 podem identificar subgrupos de pacientes com LES e
envolvimento de SNC
4. IL-12 pode ser considerada um biomarcador para dano cerebral no LES
56
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Doornbos J, et al. The effect of corticosteroid medication on quantitative MR
parameters of the brain. AJNR Am J Neuroradiol. 2005;26:2475-80
76
9. Apêndices
9.1 Termo de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (pacientes)
OBJETIVO DA PESQUISA:
Eu __________________________________________________ entendo que fui
convidado (a) a participar em um projeto de pesquisa envolvendo pacientes com lúpus
eritematoso sistêmico. O objetivo geral do estudo é o de determinar a utilidade de
exames específicos de sangue e de líquor e da Imagem por Ressonância Magnética no
Lúpus Eritematoso Sistêmico e correlacionar as alterações encontradas `a atividade da
doença, a manifestações clínicas diversas como dor de cabeça e problemas de memória.
A identificação e quantificação dessas anormalidades no cérebro, pode eventualmente
melhorar o diagnóstico e levar a um melhor tratamento desta doença. As informações
médicas a meu respeito que forem obtidas para esse estudo, poderão ser compartilhadas
com outros pesquisadores que trabalham com diversos tipos de doenças reumatológicas,
podendo assim, ser utilizadas, eventualmente, para outros fins de pesquisa sobre Lúpus
Eritematoso Sistêmico. O sigilo será mantido em todos os estudos colaborativos através
da utilização de um número de código para a identificação dos indivíduos participantes.
A coleta de sangue será realizada em um dos braços no dia da sua coleta de sangue no
centro de coleta. É importante ter várias amostras ao longo de sua doença para comparar
a atividade do lúpus. O líquor será obtido quando o médico que avaliar você achar
necessário obter para afastar outras doenças como meningite. Vamos pedir a ele colher
20 gotas a mais do que o usado para afastar infecção e esta quantidade será usada para a
pesquisa. A ressonância magnética é uma técnica capaz de produzir imagens de alta
qualidade e resolução (nitidez) anatômica, assim como informações sobre a bioquímica
dos tecidos. A ressonância magnética produz imagens em cortes que são parecidos com
as imagens produzidas pela tomografia computadorizada, porém com maior resolução
(nitidez) e sem a exposição aos raios X. Essas imagens também irão produzir
77
informações bioquímicas que serão úteis para melhor definição do diagnóstico e
tratamento. O objetivo principal desse estudo é determinar a importância dessas
informações bioquímicas e estruturais no diagnóstico e seguimento de pacientes com
lúpus.
PROCEDIMENTO:
Eu entendo que se concordar em participar desse estudo, os pesquisadores participantes
farão perguntas a respeito dos meus antecedentes médicos e de minha família.
Responderei a um questionário para avaliar a presença de depressão, ansiedade e
qualidade de vida. Eu serei submetido a um exame físico, neurológico e um teste para
diagnóstico de distúrbios cognitivos para estabelecer meu estado clínico e cognitivo.
Hospitalização não será necessária.
Uma amostra de sangue venoso será colhida (30 ml, o equivalente a três colheres de
sopa) a cada visita ao ambulatório e na ocasião da sua coleta de sangue de rotina que
são pedidos para cada visita no ambulatório de reumatologia. O sangue será identificado
por um número e será congelado. Os exames poderão ser feitos durante um período
máximo de 30 anos após a coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu
sangue serão preservadas para utilização durante todo o estudo e depois que ele se
completar serão destruídas.
O procedimento de ressonância magnética é semelhante a uma tomografia. Eu fui
informado que eu serei colocado em uma maca e serei movido lentamente para dentro
do aparelho de ressonância magnética. Um alto falante dentro do campo magnético
possibilita a minha constante comunicação com as pessoas responsáveis pelo exame.
Durante todo o tempo o pessoal médico e paramédico pode me ver e ouvir, e eu posso
ser removido(a) se for preciso; por exemplo, se durante o exame eu me sentir mal ou
com claustrofobia. O procedimento pode durar entre 45 a 90 minutos. Durante a
78
primeira parte do exame eu irei ouvir ruídos, tipo marteladas, por alguns minutos
enquanto o aparelho faz as imagens do meu cérebro. O restante do exame será
relativamente silencioso. O exame de RM será repetido uma vez por ano para
comparação ou mais frequentemente se eu apresentar sintomas dos quais os médicos
queiram repetir a ressonância. Não vai haver nenhuma forma de reembolso de dinheiro,
já que com a participação na pesquisa você não vai ter nenhum gasto.
VANTAGENS:
Eu entendo que não obterei nenhuma vantagem direta com a minha participação nesse
estudo e que o meu diagnóstico e o meu tratamento provavelmente não serão
modificados. Contudo, os resultados desse estudo podem, em longo prazo, oferecer
vantagens para os indivíduos com Lúpus Eritematoso Sistêmico, possibilitando um
melhor diagnóstico e um tratamento mais adequado. Os resultados do meu exame de
ressonância magnética, do exame de sangue e de líquor ficarão a disposição dos
médicos responsáveis pelo meu tratamento, e poderão ser úteis no futuro.
RISCO E DESCONFORTO:
Os riscos associados à coleta de sangue são mínimos, podendo ocorrer dor e manchas
roxas (equimoses) no local da coleta do sangue. O desconforto será mínimo pois se trata
de uma coleta de sangue geralmente da veia do braço que será realizada por profissional
treinado e devidamente habilitado para realizar esse procedimento. Os riscos associados
com a coleta de líquor são principalmente dor de cabeça. O único desconforto
relacionado ao exame de ressonância é o ruído intermitente durante os primeiros 15
minutos. Depois disso o ruído será muito menor. O pessoal técnico providenciará tapas-
ouvido para me deixar mais confortável.
Uma das principais vantagens da ressonância magnética e que esta não utiliza raios X
ou outro tipo de radiação ionizante, ao contrário de outros tipos de exame radiológicos.
79
As imagens são obtidas graças a um campo magnético (imã), um transmissor e receptor
de ondas de rádio e um computador que é utilizado para obter as informações
bioquímicas e imagens da anatomia interna. Não existem efeitos nocivos associados
com a ressonância magnética dentro das condições utilizadas atualmente.
REQUERIMENTOS:
É muito importante informar aos médicos(as) e técnicos(as) caso eu tenha um marca-
passo cardíaco, um clipe de cirurgia para aneurisma cerebral ou qualquer outro objeto
metálico em meu corpo, que tenha sido implantado durante uma cirurgia ou alojado em
meu corpo durante um acidente, pois estes podem parar de funcionar ou causar
acidentes devido ao forte campo magnético que funciona como um imã muito forte. Eu
também devo remover todos os objetos metálicos que estiverem comigo (relógio,
canetas, brincos, colares, anéis, etc), pois estes também podem movimentar ou aquecer
dentro do campo magnético.
SIGILO:
Eu entendo que todas as informações médicas decorrentes desse projeto de pesquisa
farão parte do meu prontuário médico e serão submetidos aos regulamentos do HC-
UNICAMP referentes ao sigilo da informação médica. Se os resultados ou informações
fornecidas forem utilizados para fins de publicação científica, nenhum nome será
utilizado.
FORNECIMENTO DE INFORMAÇÃO ADICIONAL:
Eu entendo que posso requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer
momento. A Dra Simone Appenzeller, tel: (019) 3521-7372 estará disponível para
responder minhas questões e preocupações. Em caso de recurso, dúvidas ou
reclamações contactar a secretaria da Comissão de Ética da Faculdade de Ciências
Médicas-UNICAMP, tel. (019) 3521-8942.
80
RECUSA OU DESCONTINUAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO:
Eu entendo que a minha participação é voluntária e que eu posso me recusar a participar
ou retirar meu consentimento e interromper a minha participação no estudo a qualquer
momento sem comprometer os cuidados médicos que recebo atualmente ou receberei no
futuro no HC- UNICAMP.
Eu confirmo que o(a) Dr(a)._______________________________________________
me explicou o objetivo do estudo, os procedimentos aos quais serei submetido e os
riscos, desconforto e possíveis vantagens advindas desse projeto de pesquisa. Eu li e
compreendi esse formulário de consentimento e estou de pleno acordo em participar
desse estudo.
_____________________________________________________HC:___________
Idade:_____
Nome do participante e responsável (se necessário)
_____________________________________________ _______________
Assinatura do participante ou responsável data
____________________________________________________________________
Nome da testemunha
_____________________________________________ _______________
Assinatura da testemunha data
Telefone de contato:__________________
Endereço:_____________________________________________________________
RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR:
Eu expliquei a _____________________________________________________ o
objetivo do estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos e vantagens que
81
poderão advir do estudo, usando o melhor do meu conhecimento. Eu me comprometo a
fornecer uma cópia desse formulário de consentimento ao participante ou responsável.
_____________________________________________________________________
Nome do pesquisador ou associado
__________________________________________ ______________
Assinatura do pesquisador ou associado data
ARMAZENAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO:
Eu confirmo que o(a) Dr(a). _____________________________________me explicou
o objetivo do estudo e concordo com o armazenamento de sangue e líquor para análises
futuras. Os exames poderão ser feitos durante um período máximo de 30 anos após a
coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu sangue serão preservadas para
utilização durante todo o estudo e depois que ele se completar serão destruídas.
_____________________________________________________________________
Nome do participante ou responsável
_________________________________________________ _______________
Assinatura do participante ou responsável data
_____________________________________________________________________
Nome da testemunha
____________________________________________________ ______________
Assinatura da testemunha data
Eu confirmo que o(a) Dr(a)._______________________________________________
me explicou o objetivo do estudo e não concordo com o armazenamento de sangue e
líquor para análises futuras. Os exames poderão ser feitos durante um período máximo
de 30 anos após a coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu sangue
82
serão preservadas para utilização durante todo o estudo e depois que ele se completar
serão destruídas.
_____________________________________________________________________
Nome do participante ou responsável
_________________________________________________ ______________
Assinatura do participante ou responsável data
_____________________________________________________________________
Nome da testemunha
____________________________________________________ _______________
Assinatura da testemunha data
83
9.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Controles sadios)
OBJETIVO DA PESQUISA:
Eu __________________________________________________ entendo que fui
convidado (a) a participar em um projeto de pesquisa para ajudar pacientes com lúpus
eritematoso sistêmico. O objetivo geral do estudo é o de determinar a utilidade de
exames específicos de sangue e de líquor e da Imagem por Ressonância Magnética no
Lupus Eritematoso Sistêmico e correlacionar às alterações encontradas à atividade da
doença, a manifestações clínicas diversas como dor de cabeça e problemas de memória.
A identificação e quantificação dessas anormalidades no cérebro, pode eventualmente
melhorar o diagnóstico e levar a um melhor tratamento desta doença. As informações
médicas a meu respeito que forem obtidas para esse estudo, poderão ser compartilhadas
com outros pesquisadores que trabalham com diversos tipos de doenças reumatológicas,
podendo, assim, ser utilizadas, eventualmente, para outros fins de pesquisa sobre Lúpus
Eritematoso Sistêmico. O sigilo será mantido em todos os estudos colaborativos através
da utilização de um número de código para a identificação dos indivíduos participantes.
A coleta de sangue será realizada em um dos braços no centro de coleta do Hospital das
Clínicas por um profissional treinado para este fim. O líquor será obtido quando o
médico que avaliar você achar necessário obter para afastar outras doenças como
meningite, ou quando realizarei exames como mielograma. Vamos pedir a ele colher 20
gotas a mais do que o usado para afastar infecção e esta quantidade será usada para a
pesquisa. A ressonância magnética é uma técnica capaz de produzir imagens de alta
qualidade e resolução (nitidez) anatômica, assim como informações sobre a bioquímica
dos tecidos. A ressonância magnética produz imagens em cortes que são parecidos com
as imagens produzidas pela tomografia computadorizada, porém com maior resolução
(nitidez) e sem a exposição aos raios X. Essas imagens também irão produzir
informações bioquímicas que serão úteis para melhor definição do diagnóstico e
84
tratamento. O objetivo principal desse estudo é determinar a importância dessas
informações bioquímicas e estruturais no diagnóstico e seguimento de pacientes com
lúpus.
PROCEDIMENTO:
Eu entendo que se concordar em participar desse estudo, os pesquisadores participantes
farão perguntas a respeito dos meus antecedentes médicos e de minha família.
Responderei a um questionário para avaliar a presença de stress, imagem corporal,
distúrbios do sono, sexualidade, fadiga, aderência, depressão, ansiedade e qualidade de
vida e nível socioeconômico. Eu serei submetido a um exame físico, neurológico e um
teste para diagnostico de distúrbios cognitivos para estabelecer meu estado clínico e
cognitivo. Hospitalização não será necessária.
Uma amostra de sangue venoso será colhida (30 ml, o equivalente a três colheres de
sopa) a cada visita ao ambulatório e na ocasião da sua coleta de sangue de rotina que
são pedidos para cada visita no ambulatório de reumatologia. O sangue será identificado
por um número e será congelado. Os exames poderão ser feitos durante um período
máximo de 4 anos após a coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu
sangue serão preservadas para utilização durante todo o estudo e depois que ele se
completar, serão destruídas. O procedimento de ressonância magnética é semelhante a
uma tomografia. Eu fui informado que eu serei colocado em uma maca e serei movido
lentamente para dentro do aparelho de ressonância magnética. Um alto falante dentro do
campo magnético possibilita a minha constante comunicação com as pessoas
responsáveis pelo exame. Durante todo o tempo o pessoal médico e paramédico pode
me ver e ouvir, e eu posso ser removido(a) se for preciso; por exemplo, se durante o
exame eu me sentir mal ou com claustrofobia. O procedimento pode durar entre 45 a 90
minutos. Durante a primeira parte do exame eu irei ouvir ruídos, tipo marteladas por
85
alguns minutos enquanto o aparelho faz as imagens do meu cérebro. O restante do
exame será relativamente silencioso. O exame de RM será repetido uma vez por ano
para comparação ou mais frequentemente se eu apresentar sintomas dos quais os
médicos queiram repetir a ressonância. Não vai haver nenhuma forma de reembolso de
dinheiro, já que com a participação na pesquisa você não vai ter nenhum gasto.
VANTAGENS:
Eu entendo que não obterei nenhuma vantagem direta com a minha participação nesse
estudo. Contudo, os resultados desse estudo podem, a longo prazo, oferecer vantagens
para os indivíduos com Lúpus Eritematoso Sistêmico, possibilitando um melhor
diagnóstico e um tratamento mais adequado. Os resultados do meu exame de
ressonância magnética, do exame de sangue e de líquor ficarão a disposição dos
médicos responsáveis pelo meu tratamento, e poderão ser úteis no futuro.
RISCO E DESCONFORTO:
Os riscos associados à coleta de sangue são mínimos, podendo ocorrer dor e manchas
roxas (equimoses) no local da coleta do sangue. O desconforto será mínimo, pois se
trata de uma coleta de sangue geralmente da veia do braço que será realizada por
profissional treinado e devidamente habilitado para realizar esse procedimento. Os
riscos associados com a coleta de líquor são principalmente dor de cabeça. O único
desconforto relacionado ao exame de ressonância é o ruído intermitente durante os
primeiros 15 minutos. Depois disso o ruído será muito menor. O pessoal técnico
providenciará tapa-ouvidos para me deixar mais confortável. Uma das principais
vantagens da ressonância magnética e que esta não utiliza raios X ou outro tipo de
radiação ionizante, ao contrário de outros tipos de exame radiológicos. As imagens são
obtidas graças a um campo magnético (imã), um transmissor e receptor de ondas de
rádio e um computador que é utilizado para obter as informações bioquímicas e imagens
86
da anatomia interna. Não existem efeitos nocivos associados com a ressonância
magnética dentro das condições utilizadas atualmente.
REQUERIMENTOS
É muito importante informar aos médicos(as) e técnicos(as) caso eu tenha um marca-
passo cardíaco, um clipe de cirurgia para aneurisma cerebral ou qualquer outro objeto
metálico em meu corpo, que tenha sido implantado durante uma cirurgia ou alojado em
meu corpo durante um acidente, pois estes podem parar de funcionar ou causar
acidentes devido ao forte campo magnético que funciona como um imã muito forte. Eu
também devo remover todos os objetos metálicos que estiverem comigo (relógio,
canetas, brincos, colares, anéis, etc), pois estes também podem movimentar ou aquecer
dentro do campo magnético.
SIGILO:
Eu entendo que todas as informações médicas decorrentes desse projeto de pesquisa
farão parte do meu prontuário médico e serão submetidos aos regulamentos do HC-
UNICAMP referentes ao sigilo da informação médica. Se os resultados ou informações
fornecidas forem utilizados para fins de publicação científica, nenhum nome será
utilizado.
FORNECIMENTO DE INFORMAÇÃO ADICIONAL:
Eu entendo que posso requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer
momento. A Dra Simone Appenzeller, tel (019) 3521-7372 estará disponível para
responder minhas questões e preocupações. Em caso de recurso, dúvidas ou
reclamações contatar a secretaria da Comissão de Ética da Faculdade de Ciências
Médicas-UNICAMP, tel. (019) 3521-8942
RECUSA OU DESCONTINUAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO:
87
Eu entendo que a minha participação é voluntária e que eu posso me recusar a participar
ou retirar meu consentimento e interromper a minha participação no estudo a qualquer
momento sem comprometer os cuidados médicos que recebo atualmente ou receberei no
futuro no HC- UNICAMP.
Eu confirmo que o(a) Dr(a)._____________________________________me explicou o
objetivo do estudo, os procedimentos aos quais serei submetido e os riscos, desconforto
e possíveis vantagens advindas desse projeto de pesquisa. Eu li e compreendi esse
formulário de consentimento e estou de pleno acordo em participar desse estudo.
____________________________________HC:___________ Idade:_____
Nome do participante e responsável (se necessário)
_________________________________________________ __________________
Assinatura do participante ou responsável data
____________________________________________________________________
Nome da testemunha
____________________________________________________________________
Assinatura da testemunha data
Telefone de contato:__________________
Endereço:______________________________________________________________
RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR:
Eu expliquei a _______________________________________________ o objetivo do
estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos e vantagens que poderão advir
do estudo, usando o melhor do meu conhecimento. Eu me comprometo a fornecer uma
cópia desse formulário de consentimento ao participante ou responsável.
______________________________________________________________________
Nome do pesquisador ou associado
88
___________________________________________________ _______________
Assinatura do pesquisador ou associado data
ARMAZENAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Eu confirmo que o(a) Dr(a).____________________________________ me explicou o
objetivo do estudo e concordo com o armazenamento de sangue e líquor para análises
futuras. Os exames poderão ser feitos durante um período máximo de 30 anos após a
coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu sangue serão preservadas para
utilização durante todo o estudo e depois que ele se completar serão destruídas.
______________________________________________________________________
Nome do participante ou responsável
_________________________________________________ ____________________
Assinatura do participante ou responsável data
______________________________________________________________________
Nome da testemunha
______________________________________________________________________
Assinatura da testemunha data
Eu confirmo que o(a) Dr(a).______________________________________ me explicou
o objetivo do estudo e não concordo com o armazenamento de sangue e líquor para
análises futuras. Os exames poderão ser feitos durante um período máximo de 30 anos
após a coleta. As células que por ventura forem isoladas do meu sangue serão
preservadas para utilização durante todo o estudo e depois que ele se completar serão
destruídas.
______________________________________________________________________
Nome do participante ou responsável
_________________________________________________ __________________
89
Assinatura do participante ou responsável data
____________________________________________________________________
Nome da testemunha
_____________________________________________________________________
Assinatura da testemunha data
90
10. Anexos
10.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa-FCM
91
