MARIANA MUNARI MAGNUS -...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

MARIANA MUNARI MAGNUS

PERFIL DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E MICROQUIMERISMO EM

RECEPTORES DE TRANSFUSÃO SANGUÍNEA SUBMETIDOS À CIRURGIA

ORTOPÉDICA

CAMPINAS

2016


PERFIL DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E MICROQUIMERISMO EM

RECEPTORES DE TRANSFUSÃO SANGUÍNEA SUBMETIDOS À CIRURGIA

ORTOPÉDICA

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.

ORIENTADOR: PROF(A) DR(A) SARA TERESINHA OLALLA SAAD

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA

ALUNA MARIANA MUNARI MAGNUS, E ORIENTADO PELA

PROF(A). DR(A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD.

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO


ORIENTADOR: PROF (A). DR (A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD

MEMBROS:

1. PROF(A). DR (A). SARA TERESINHA OLALLA SAAD

2. PROF. DR. MARCELO ADDAS CARVALHO

3. PROF. DR. ANTONIO FABRON JUNIOR

Programa de Pós-Graduação em [PROGRAMA] da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 20 de Dezembro de 2016

AGRADECIMENTOS:

Ao meu marido, Thiago, pelo constante apoio e compreensão durante os

momentos difíceis. E aos meus filhos, Miguel e Clara, pelo tempo que não pude

estar com eles.

Aos meus pais por me ensinarem a enfrentar obstáculos e a continuar

caminhando.

À Profa Dra Simone Gilli por ter me incentivado a pesquisar e a estudar o

que me despertava verdadeiro interesse.

À minha orientadora, Profa Dra. Sara Teresinha Olalla Saad, pelo

constante apoio e pela ajuda. Agradeço pelas discussões e por me mostrar um

caminho quando não pude enxergar. Pessoa admirável, de grande conhecimento e

enorme experiência.

À Profa Dra. Patrícia Favaro pelas ideias e sugestões.

Ao departamento de ortopedia da Unicamp, à equipe do centro cirúrgico e

aos funcionários do serviço de transfusão do Hospital das Clínicas por me ajudarem

a coletar as amostras.

Ao João Agostinho, à Maria Helena Medola e à Fernanda Niemann por

me auxiliarem na parte técnica.

Ao meu amigo Fernando por me escutar e me ajudar a ilustrar meus

resultados.

À Tereza pelo suporte com o material e reagentes.

Ao Michel pela ajuda com os gráficos e as figuras.

Ao Roberto Zulli pelo auxílio com as análises estatísticas.

E por fim aos pacientes que aceitaram participar e que tornaram este

trabalho possível.

RESUMO:

A transfusão sanguínea alogênica tem sido associada com

complicações em pacientes cirúrgicos e no trauma. Os leucócitos e plaquetas

presentes nos hemocomponentes parecem ser uma das principais causas do efeito

conhecido como imunomodulação associada à transfusão. Apesar das evidências

clínicas dos efeitos deletérios da transfusão sanguínea, o real mecanismo envolvido

não é conhecido. Realizamos um estudo observacional prospectivo para avaliar a

presença de microquimerismo associado à transfusão e a resposta imune em 28

pacientes submetidos à cirurgia ortopédica eletiva comparando os pacientes

transfundidos no intra-operatório com os não transfundidos. Os hemocomponentes

utilizados foram concentrado de hemácias (CH) não leucodepletados. Os

marcadores inflamatórios IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, IL-21, IL-22,

IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), CD40 ligante solúvel (sCD40L) e fator

de necrose tumoral (TNFα) foram quantificados no sangue periférico dos pacientes

em três tempos: pré-operatório, final da cirurgia e 6 horas de pós-operatório. Além

disso, avaliamos a presença de microquimerismo nos pacientes transfundidos

durante a internação utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo

real com um painel contendo iniciadores específicos para 12 alelos HLA DR. Como

resultados, encontramos maiores concentrações de IL-6 (p = 0,023) e uma redução

significativa de sCD40L (p = 0,016) ao final da cirurgia, assim como maiores níveis

de IL-10 (p = 0,022) com 6 horas de pós-operatório nos pacientes transfundidos

quando comparados aos não transfundidos. A presença de microquimerismo foi

documentada em 13 dos 15 pacientes avaliados, com uma mediana de seguimento

de 14 dias após a última transfusão (variando de 5 a 30 dias). Comparando os

pacientes com e sem microquimerismo, não houve diferença nas características

sexo, idade, número de unidades transfundidas ou na dosagem dos marcadores

inflamatórios após a transfusão. Concluímos que a transfusão de CH não

leucodepletados, neste contexto onde já existe um estresse inflamatório secundário

ao trauma cirúrgico, leva a uma maior resposta inflamatória imediata, com aumento

de IL-6 e diminuição do sCD40L e posterior estímulo imunossupressor evidenciado

pelo maior aumento de IL-10; a redução da concentração de sCD40L no sangue

periférico pode prever este efeito anti-inflamatório. Palavras–chave: transfusão de

sangue, efeito imunomodulatório, citocinas, microquimerismo, leucócitos.

ABSTRACT

Transfusion of red blood cells (RBCs) has been associated with

complications in trauma and surgical patients. Leukocytes present in blood

components seems to be one of the main causes of the effect know as transfusion-

related immunomodulation. Despite evidence of deleterious clinical effects of

allogeneic blood transfusion, the real mechanism involved is unclear. A prospective

observational study was conducted to evaluate transfusion-associated

microchimerism and immune responses in 28 patients undergoing elective

orthopedic surgery divided into leukocyte-containing RBCs transfused and non-

transfused groups. Inflammatory markers IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-

17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand

(sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα) were measured in both groups at three time

points: preoperative, end of surgery and 6 hours of postoperative. The presence of

microchimerism was performed by polymerase chain reaction (PCR) analysis using

quantitative allele-specific HLA DR assays to detect non-recipient alleles in

transfused patients. Higher levels of IL-6 (p = 0.023) and significant reduction of

sCD40L (p = 0.016) at the end of surgery, as well as higher levels of IL-10 (p =0.022)

after 6 hours of postoperative were demonstrated in transfused patients compared to

non-transfused. Microchimerism was documented in 13 of 15 patients after

leukocyte-containing RBC transfusion and the median time of evaluation was 14

days after transfusion (range 5-30 days). Comparing patients with and without

microchimerism, there was no difference in sex, age, number of units transfused or in

inflammatory markers after transfusion. We concluded that leukocyte-containg RBC

transfusion is associated with an early inflammatory response followed by an anti-

inflammatory response in trauma surgery patients and the reduction in sCD40L level,

after transfusion, may predict an anti-inflammatory effect.

Key words: blood transfusion; transfusion-related immunomodulation; cytokines;

microchimerism; leukocytes.

Sumário:

1. Introdução.......................................................................................

1.1 A Resposta Imune.........................................................................

1.2 Possíveis efeitos clínicos associados à TRIM...............................

1.3 Fisiopatologia da TRIM.................................................................

1.4 Microquimerismo associado à transfusão.....................................

1.5 Características dos hemocomponentes e TRIM...........................

9

9

10

11

14

17

2. Objetivos......................................................................................... 19

3. Material e métodos.......................................................................... 20

3.1 Pacientes e protocolo transfusional.............................................. 20

3.2 Coleta das amostras..................................................................... 20

3.3 Análise dos marcadores inflamatórios.......................................... 21

3.4 Pesquisa de microquimerismo...................................................... 22

3.4.1Extração do DNA genômico .......................................................

3.4.2 Amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase

(PCR) em tempo real..........................................................................

22

22

3.4.3 Eletroforese em gel de agarose a 4%........................................

3.5 Pesquisa de anticorpo contra antígeno eritrocitário.....................

23

23

3.6 Análise estatística......................................................................... 23

4. Resultados...................................................................................... 25

4.1 Análise dos marcadores inflamatórios.......................................... 25

4.1.1 Características dos pacientes.................................................... 25

4.1.2 Dosagem dos marcadores inflamatórios por multiplex..............

4.2 Correlações entre as citocinas .....................................................

25

34

4.3 Resultados microquimerismo........................................................ 36

4.3.1 Características dos pacientes.................................................... 36

4.3.2 Análise dos marcadores inflamatórios....................................... 42

4.3.3 Confirmação pela tipagem HLA-DR dos doadores.................... 42

4.4 Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários.................

5. Discussão........................................................................................

43

44

6. Conclusão....................................................................................... 48

7. Referências.....................................................................................

8. Apêndices........................................................................................

49

55

9. Anexos............................................................................................ 58

9

1. INTRODUÇÃO:

Os efeitos imunomodulatórios relacionados à transfusão sanguínea

alogênica são conhecidos há décadas. Foram primeiramente descritos em 1973 por

Opelz e colaboradores, ao observar que a transfusão sanguínea precedendo o

transplante renal poderia melhorar a sobrevida do rim transplantado, demonstrando

seu efeito imunossupressor[1]. Posteriormente, Gantt demonstrou em 1981 a

associação entre a transfusão sanguínea e o maior risco de recorrência tumoral, o

que reforçou a hipótese de um efeito imunomodulador relacionado à transfusão [2].

Desde então muito avanços ocorreram para melhorar a segurança

transfusional, diminuindo os riscos de transmissão de doenças e de aloimunização

conforme o desenvolvimento de novos testes para agentes infecciosos e com a

maior compreensão dos antígenos presentes nas hemácias, leucócitos e plaquetas.

Por outro lado, a existência de um efeito imunológico e possivelmente deletério

associado à transfusão sanguínea, síndrome conhecida como Imunomodulação

relacionada à transfusão (TRIM-Transfusion-related Imunomodulation) vem sendo

amplamente discutido na literatura.

1.1. A Resposta Imune:

O sistema imunológico é constituído pela resposta imune inata e

adaptativa. A resposta inata é a primeira defesa do organismo frente a uma

agressão, não dependendo de estímulo prévio. A resposta adaptativa é mediada

pelos linfócitos T e B, sendo uma resposta específica contra patógenos

reconhecidos como antígenos. Os principais subtipos de linfócitos T efetores são os

Linfócitos T CD4+ auxiliares e os linfócitos T CD8+ citotóxicos. Dentre os linfócitos T

CD4+, são bem caracterizadas 4 subpopulações: Th1, Th2, T reguladores e Th17.

As células Th1 produzem IFN-, principal citocina que leva a ativação de

macrófagos. As células Th2 secretam IL-4 e IL-5, estando associadas a doenças

alérgicas e a infecções por helmintos. Os linfócitos T reguladores atuam impedindo

respostas imunes exacerbadas e secretam citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e

TGF-. Por último, os linfócitos T CD4+ de padrão Th17 secretam principalmente IL-

17, cujo papel é recrutar neutrófilos, além de IL-21, que leva a diferenciação de

linfócitos B, e IL-23 que tem sido associada à ocorrência de doenças autoimunes [3].

10

Figure 1. Representação esquemáticas das 4 vias da resposta imune derivadas de linfócitos

T CD4+: Th1, Th2, Th17 e Treg.

1.2. Possíveis efeitos clínicos associados à TRIM:

Diversos estudos observacionais associaram a transfusão sanguínea

alogênica com maior risco de recorrência tumoral, maior ocorrência de infecção no

pós-operatório e maior mortalidade [4-6]. Porém como viés de confusão comum

nestes estudos, temos que frequentemente os pacientes transfundidos representam

aqueles com piores condições clínicas e maior gravidade, o que torna questionável

esta associação.

Já os estudos randomizados controlados apresentam resultados

heterogêneos e de difícil comparação por utilizarem diferentes estratégias

transfusionais, como transfusão restritiva contra transfusão liberal, transfusão

autóloga contra transfusão alogênica ou ainda comparando pacientes recebendo

hemocomponentes contendo diferentes graus de contaminação por leucócitos.

Tendo em vista que a presença do leucócito do doador é um dos

mecanismos centrais na fisiopatologia da TRIM, grandes estudos randomizados

foram feitos analisando diferentes desfechos clínicos em pacientes transfundidos

com concentrados de hemácias leucodepletados (contendo < 5x106 leucócitos por

unidade) comparados a pacientes transfundidos com concentrado de hemácias

buffy-coat depletados (contendo <1,2x109 leucócitos por unidade) ou ainda com

11

concentrado de hemácias com maior contaminação leucocitária (109 a 1010

leucócitos por unidade).

Neste contexto, os estudos randomizados que analisaram a taxa de

recorrência tumoral em pacientes transfundidos com hemácias leucodepletadas

comparados a pacientes que receberam hemácias buffy-coat depletadas no

perioperatório de cirurgias oncológicas não evidenciaram diferença entre os grupos

em até 5 anos de seguimento. [7-9]

Da mesma forma, diversos estudos randomizados analisaram o risco de

infecção no pós-operatório, de falência de múltiplos órgãos e de mortalidade em

pacientes transfundidos em diferentes contextos cirúrgicos [8, 10-13]. Novamente os

resultados são heterogêneos e de difícil comparação. Duas meta-análises realizadas

para avaliar estes estudos chegaram a conclusões discordantes sobre o benefício

da leucodepleção para diminuição do risco de infecção no pós-operatório [14, 15].

Os resultados mais concordantes estão nos estudos que avaliaram a

transfusão em cirurgia cardíaca, evidenciando menor risco de infecção no pós–

operatório, menor ocorrência de disfunção de múltiplos órgãos e menor mortalidade

por causas não cardíacas nos pacientes que receberam transfusões de concentrado

de hemácias leucodepletadas quando comparados aos transfundidos com

concentrados de hemácias com maior contaminação por leucócitos [16-20]. Porém

neste cenário é importante ressaltar que o volume transfundido é maior e que os

pacientes são submetidos a um grande trauma cirúrgico, envolvendo a circulação

extracorpórea e a lesão de isquemia e reperfusão secundária a hipotermia, o que

poderia exacerbar os efeitos da imunomodulação relacionada à transfusão. Além

disso, alguns trabalhos conseguiram demonstrar este efeito dose dependente, onde

o benefício da leucodepleção é evidenciado apenas em pacientes que receberam

acima de 3 unidades de concentrados de hemácias [17, 19, 20].

1.3. Fisiopatologia da TRIM:

Inúmeros mecanismos foram propostos na tentativa de explicar essa

síndrome, incluindo a presença de leucócitos alogênicos nos hemocomponentes

transfundidos, a liberação de citocinas e mediadores inflamatórios durante o

armazenamento e a presença de proteínas solúveis no plasma dos

hemocomponentes, porém sua real fisiopatologia continua incerta [5].

12

Os primeiros estudos in vivo e em modelo animal que avaliaram o perfil

de citocinas inflamatórias após uma transfusão sanguínea demostraram aumento da

liberação de interleucinas IL-4 e IL-10. Assim, o efeito imunológico da transfusão foi

inicialmente descrito como um desbalanço na resposta imune do receptor, com

exacerbação da resposta Th2 e supressão da resposta Th1, o que explicaria o seu

efeito imunossupressor [21, 22]. Posteriormente, a transfusão sanguínea foi também

relacionada a um efeito pró-inflamatório, com a evidência de maior liberação de

Interleucina 6 no pós-operatório de cirurgia cardíaca em pacientes transfundidos

comparados aos não transfundidos ou com a utilização de concentrados de

hemácias não leucodepletados quando comparados aos leucodepletados [5, 20, 23].

Clinicamente este efeito pró-inflamatório poderia ser traduzido pelo

maior risco de disfunção de múltiplos órgãos levando a maior mortalidade, enquanto

o efeito imunossupressor seria traduzido pelo maior risco de recorrência tumoral e

de infecção no pós-operatório, como já discutido anteriormente. Dessa forma, tendo

em vista a dualidade destes achados, com aumento de citocinas tanto pró como

anti-inflamatórias após a transfusão, o termo imunomodulação passou a ser mais

utilizado para descrever esta síndrome [5].

Um dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da TRIM é a

presença de mediadores inflamatórios no plasma dos hemocomponentes, como

citocinas IL-1β, IL-6, IL-8, TNF α, além de CD40 ligante solúvel (sCD40L), moléculas

HLA e Fas-ligante [24, 25]. Sabidamente, leucócitos e plaquetas liberam essas

proteínas durante o armazenamento e assim sua concentração é influenciada pelo

tempo de estocagem e pela presença dos leucócitos e plaquetas no concentrado de

hemácias [26-28]. Além disso, após a transfusão, todo este material contido no

hemocomponente leva a ativação dos linfócitos do receptor com novo estímulo ao

sistema imune [29]. É interessante perceber que os estudos que avaliaram pacientes

transfundidos em contexto clínico, na ausência de trauma cirúrgico ou de lesão

tecidual, falharam em demonstrar o benefício da leucodepleção e os possíveis

efeitos clínicos da imunomodulação, sustentando a hipótese de um modelo baseado

no “duplo insulto” [6, 29-31]. Dessa forma, a TRIM funcionaria como um segundo

estímulo em um ambiente onde já existe ativação imunológica, tornando mais

evidente uma resposta pró-inflamatória ou imunossupressora.

Um segundo mecanismo, talvez o de maior destaque na literatura, é a

presença do leucócito do doador nos hemocomponentes. Ele seria responsável não

13

apenas por contribuir com a chamada lesão de armazenamento, mas também por

interagir com o sistema imune do receptor após a transfusão, levando a um efeito

com fisiopatologia semelhante à doença do enxerto contra o hospedeiro. Acredita-se

que a compatibilidade HLA parcial entre doador e receptor facilitaria a persistência

dessas células alogênicas no paciente transfundido por um processo de anergia e

imunotolerância [5, 32]. Estudos in vitro e em modelo animal demonstram que as

células apresentadoras de antígenos alteram sua expressão de sinal coestimulatório

durante o armazenamento e sua capacidade de estimular a proliferação de linfócitos

T [33, 34]. Possivelmente, a interação dos leucócitos do doador com os linfócitos T

do receptor levaria a proliferação de células T supressoras, prolongando a sobrevida

das células alogênicas e ocasionando o microquimerismo associado à transfusão.

Fortalecendo esta hipótese, estudos in vitro demonstraram que a transfusão

alogênica induz à proliferação de linfócitos T regulatórios (Treg), uma população de

linfócitos com imunofenótipo CD4+CD25+ amplamente envolvida no controle da

resposta imune, responsável pela imunotolerância e prevenção de autoimunidade.

Os linfócitos Treg inibem a resposta imune celular suprimindo tanto a atividade dos

linfócitos T CD4+ e CD8+ como a função das principais células apresentadoras de

antígeno, as células dendríticas [35, 36]. Além disso, estas células já foram

relacionadas à fisiopatologia da sepse e do trauma, onde pacientes com lesão

tecidual apresentam supressão da imunidade celular por exacerbação dos linfócitos

T regulatórios [35, 37, 38].

Sustentando a hipótese de que a fisiopatologia da TRIM está centrada na

presença do leucócito do doador, temos como evidência os estudos clínicos que

demonstram o benefício da leucodepleção principalmente em pacientes submetidos

a cirurgias cardíacas [17, 19]. Além disso, estudos realizados em modelo animal

também demonstraram que o efeito da transfusão sanguínea na promoção do

crescimento de lesões tumorais está centralizado na presença dos leucócitos

alogênicos [39].

Por último, proteínas derivadas de moléculas HLA existentes no plasma

poderiam contribuir para este efeito imunológico. Estudos em modelo animal e in

vitro demonstraram que peptídeos não polimórficos derivados de moléculas HLA

classe I suprimem a resposta imune celular enquanto peptídeos polimórficos

induzem a anergia [5, 40]. Porém, estudos clínicos que avaliaram o efeito da

14

transfusão de concentrado de hemácias plasma reduzidos não conseguiram

demonstraram benefícios em cirurgia cardíaca [16].

1.4. Microquimerismo associado à transfusão (TA-MC):

O termo quimerismo significa a presença de linhagens genéticas distintas

em um organismo, enquanto microquimerismo refere-se à presença de uma

população alogênica correspondente a menos de 5% das células totais. Este

fenômeno pode ocorrer na gestação (entre a mãe e o feto), entre gêmeos, em

transplante de órgãos sólidos ou de medula óssea e associado à transfusão

sanguínea alogênica (transfusion-associated microchimerism-TA-MC) [41].

O TA-MC foi inicialmente observado na década de 70, a partir da análise

de cariótipo evidenciando a persistência de células femininas em neonatos

masculinos após realização de transfusão fetal de sangue materno [42, 43].

Historicamente era possível identificar os leucócitos do doador a partir da presença

do cromossomo Y em pacientes femininas que receberam transfusões de doadores

masculinos.

Um dos grandes obstáculos para o estudo do microquimerismo associado

à transfusão foi o desenvolvimento de uma metodologia capaz de identificar

quantidades mínimas de células do doador entre grandes quantidades de células do

receptor, além da necessidade de selecionar um marcador genético sensível o

suficiente para diferenciar estas duas populações.

Com o surgimento da técnica de amplificação gênica alelo-específica foi

possível desenvolver uma metodologia mais sensível para estudar o

microquimerismo, mas ainda baseada na pesquisa de genes do cromossomo Y em

receptoras femininas ou utilizando alelos HLA classe II em receptores com tipagem

HLA conhecida e ausência destes marcadores. Isto tornava a avaliação do

microquimerismo restrita a algumas populações de pacientes e/ou doadores. Além

disso, a pequena concentração do DNA do doador em um ambiente com grande

concentração de um DNA muito similar, correspondente às células do receptor,

tornava possível a falha na identificação do material genético em menor quantidade

por exaustão dos iniciadores durante o processo de amplificação [44, 45].

Mais recentemente, a partir da utilização do PCR (polymerase chain

reaction) em tempo real, Lee et al desenvolveu uma metodologia para identificar

células do doador em mínimas concentrações no sangue periférico do receptor.

15

Essa técnica é baseada em um painel contendo iniciadores específicos para 12

alelos HLA-DR, o que torna possível diferenciar a existência de duas populações

distintas geneticamente conforme a concentração do DNA. Assim, temos a presença

de um DNA em maior quantidade que amplificaria com uma menor quantidade de

ciclos, correspondente às células do receptor, e um DNA em menor concentração

que amplificaria com maior quantidade de ciclos, correspondendo às células do

doador. Conforme demonstrado pelos autores, a partir da diluição de amostras de

DNA onde era esperada a existência de uma única cópia para cada alelo HLA-DR foi

observado amplificação em 96,7% das amostras, conferindo uma alta sensibilidade.

Além disso, nas 564 amostras utilizadas como controle, ou seja, sem a presença do

marcador HLA específico, não houve amplificação, demonstrando alta especificidade

e ausência de falsos positivos [46].

Apesar dessas dificuldades, o TA-MC já foi estudado em diversos

contextos clínicos, não sendo evidenciada a persistência de leucócitos do doador

por mais de 4 semanas em pacientes transfundidos na ausência de trauma como em

portadores de HIV e de Talassemia [44, 45].

Para melhor entender como ocorreria a persistência dessas células

alogênicas no receptor, um estudo comparou 8 mulheres transfundidas em cirurgia

eletiva com 10 mulheres transfundidas em politrauma, encontrando grandes

diferenças. Houve clareamento dessas células com até 14 dias após a transfusão

em todas as pacientes submetidas à cirurgia eletiva, enquanto foi encontrada a

persistência do microquimerismo por até 1,5 anos nas pacientes traumatizadas [47].

A partir de então foi definida a existência de um microquimerismo a curto prazo, com

eliminação dos leucócitos do doador em dias ou semanas após a transfusão, e um

microquimerismo a longo prazo, com persistência dessas células por mais de 6

meses ou anos, fenômeno que foi descrito apenas em pacientes transfundidos em

grandes traumas.

Um trabalho marcante conseguiu demonstrar a presença de leucócitos do

doador com até 58 anos após a transfusão em soldados que combateram nas

guerras do Vietnam, Coreia ou II Guerra Mundial [48].

É interessante perceber que estas células teriam a capacidade não só de

permanecer no receptor, mas também de proliferar como um verdadeiro enxerto,

porém ainda existem muitas dúvidas sobre como aconteceria esta interação entre o

leucócito do doador e o sistema imune do receptor. Em pacientes transfundidos em

16

cirurgia ortopédica já foi demonstrado que ocorre clareamento de 99% das células

do doador com 24 horas após a transfusão e posteriormente, após 3 a 5 dias, estes

leucócitos proliferam e observamos aumento da sua concentração. Em

contrapartida, em pacientes traumatizados, a concentração dos leucócitos

alogênicos parece ser maior nos primeiros dias após a transfusão, porém não é

possível predizer em quais pacientes estes leucócitos persistirão a longo prazo [47,

49, 50]. Acredita-se que o grau de compatibilidade HLA entre doador e receptor

possa interferir na eliminação ou persistência das células alogênicas ou ainda que

ocorram respostas diferentes a partir da interação dos linfócitos de um paciente com

doadores distintos [51]. Inicialmente acreditava-se que maiores volumes

transfundidos e que a maior contaminação de leucócitos nos hemocomponentes

facilitaria a presença do microquimerismo associado à transfusão, porém foi

observada ausência de correlação com o número de unidades transfundidas e que a

leucodepleção não previne o TA-MC [41, 46, 52, 53]. Além disso, é curioso notar que

nos pacientes transfundidos em trauma, que receberam transfusão de múltiplos

doadores, os leucócitos alogênicos identificados como quimera correspondem na

maioria das vezes a tipagem HLA de 1 ou 2 doadores, o que reforça a teoria de que

a ocorrência do TA-MC não depende da quantidade de leucócitos recebida e do

volume transfusional, mas sim de características intrínsecas da interação entre o

doador e o receptor. Sustentando esta hipótese, um desses estudos demonstrou,

através da cultura mista de linfócitos, hiporreatividade bidirecional entre os

leucócitos do receptor e os leucócitos do doador cujas células foram identificadas

como microquimerismo [41, 46, 47]. Por outro lado, é provável que o trauma por

apresentar grande lesão tecidual e ativação inflamatória leve a alterações no

sistema imune que possam facilitar a proliferação e persistência dessas células, o

que explicaria a diferença na cinética dos leucócitos do doador nestes pacientes e o

microquimerismo a longo prazo. Sabemos que após grandes traumas ocorre

diminuição da resposta de linfócitos e imunossupressão, sendo esta diminuição

ainda mais acentuada naqueles pacientes traumatizados que apresentaram TA-MC

[54].

Por último, os trabalhos que tentaram identificar características dos

pacientes que facilitariam a ocorrência do TA-MC não encontraram diferenças entre

os grupos com e sem microquimerismo em relação à idade, ao sexo, ao tipo de

trauma, a gravidade do trauma, a ocorrência de hipotensão, a presença de

17

comorbidades, ao intervalo de tempo entre o trauma e a transfusão e ao volume

transfundido. Porém houve associação com o tempo de armazenamento dos

hemocomponentes, sendo que os pacientes com microquimerismo receberam

bolsas com menor tempo de estocagem quando comparados aos pacientes sem

microquimerismo [52]. Possivelmente, o leucócito armazenado a menos tempo

apresente maior viabilidade favorecendo a sua proliferação no receptor após a

transfusão e sua persistência.

Apesar da ampla discussão na literatura, não sabemos ao certo qual o

significado clínico da persistência dessas células no receptor. Trabalhos que

analisaram a ocorrência de complicações e a taxa de mortalidade nesses pacientes

não encontraram associação entre o TA-MC e pior desfecho clínico. Discute-se

ainda se a ocorrência do microquimerismo a longo prazo poderia ocasionar o

desenvolvimento de autoimunidade, câncer ou outras complicações, porém também

não foi encontrada maior ocorrência dessas patologias nos pacientes avaliados [48,

52].

1.5. Características dos hemocomponentes e TRIM:

Algumas características dos hemocomponentes transfundidos parecem

influenciar diretamente o efeito da TRIM. Como já amplamente discutido, a principal

delas é a quantidade de leucócitos do doador presente nos hemocomponentes.

Diversos estudos avaliaram o benefício da leucodepleção para diminuir a

imunomodulação associada à transfusão. Além disso, o volume transfusional

também parece ter grande importância sobre este efeito no sistema imune, uma vez

que os trabalhos em cirurgia cardíaca encontraram seus principais resultados em

pacientes que receberam acima de 3 unidades de concentrado de hemácias [17, 19,

20]. Enquanto o número de bolsas transfundidas parece influenciar a liberação de

citocinas inflamatórias após a transfusão, com maior aumento de IL-6 em pacientes

com maior número de transfusões, não observamos correlação com a ocorrência do

microquimerismo. Como última característica, discute-se o quanto o tempo de

armazenamento poderia influenciar a imunomodulação. A lesão de armazenamento

do concentrado de hemácias vem sendo amplamente estudada na literatura, com a

constante discussão se haveria prejuízo em utilizarmos sangue mais “velho” quando

comparado ao mais recente, porém sem evidência clínica suficiente [55-57]. Alguns

estudos retrospectivos demonstraram que a transfusão de concentrados de

18

hemácias com maior armazenamento foi fator de risco independente para pior

desfecho clínico com maior número de complicações e maior mortalidade em alguns

grupos de pacientes, principalmente em cirurgia cardíaca e em trauma [58-61].

Porém parece haver influência do volume total transfundido sobre esses resultados

e outros estudos não comprovaram esse prejuízo, o que torna o efeito clínico do

tempo de armazenamento controverso [27, 29, 56].

Por fim, a avaliação da resposta imune em pacientes transfundidos em

cirurgia abdominal revelou forte correlação entre a concentração sérica de

interleucina 10 no pós-operatório e o tempo médio de armazenamento dos

hemocomponentes, sendo que os pacientes que receberam concentrados de

hemácias mais antigos apresentaram maior pico de IL-10 no pós-operatório, porém

não houve diferenças significativas no número de complicações infecciosas e na

evolução destes pacientes [62].

19

2. OBJETIVOS:

Em vista do exposto, foram objetivos deste estudo:

- Avaliar as dosagens séricas dos mediadores inflamatórios em pacientes

submetidos à cirurgia ortopédica eletiva;

- Comparar as dosagens séricas dos mediadores inflamatórios entre os grupos de

pacientes com e sem transfusão no intra-operatório, a partir da utilização de

concentrados de hemácias com grande contaminação por leucócitos e plaquetas;

- Avaliar a presença de microquimerismo associado à transfusão nos pacientes

transfundidos.

20

3. MATERIAL E MÉTODOS:

3.1. Pacientes e protocolo transfusional:

Foram avaliados 28 pacientes submetidos à cirurgia ortopédica eletiva de

artroplastia total de quadril ou de fratura de fêmur proximal no Hospital das Clínicas

da Unicamp, com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa e após consentimento

informado. Os pacientes foram entrevistados previamente à cirurgia para responder

a um questionário com informações sobre dados para contato, diagnóstico, cirurgia a

ser realizada, histórico gestacional, uso de medicações atuais, comorbidades e

ocorrências de transfusões anteriores. Foram excluídos pacientes com diagnóstico

de neoplasia em quimio ou radioterapia, com tratamento imunossupressor, em uso

de corticoide sistêmico nos últimos 30 dias ou de anti-inflamatório nas últimas 48

horas, ou com antecedente de infecção ou uso de antibiótico nos 15 dias anteriores

à cirurgia.

Todos os pacientes foram operados pela mesma equipe cirúrgica e a

necessidade de transfusão foi avaliada pela equipe anestésica no decorrer da

cirurgia, conforme parâmetros hemodinâmicos, volume de sangramento e dosagem

de hemoglobina. Os hemocomponentes transfundidos foram concentrados de

hemácias não-leucodepletados, fracionados a partir do sangue total pela separação

do plasma rico em plaquetas e armazenados em CPDA-1.

3.2. Coleta das amostras:

Foram coletadas amostras de 8 ml de sangue periférico em três tempos:

no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório. Após

centrifugação, o soro foi aliquotado e armazenado a -80°C.

Dos 28 pacientes, foi coletada uma amostra de 8 ml de sangue periférico

em EDTA antes da cirurgia, da qual foi armazenado DNA de leucócitos extraído pelo

método fenol-clorofórmio.

Os pacientes transfundidos durante a internação foram submetidos a uma

nova coleta após a alta, no primeiro retorno ambulatorial. Nesta ocasião foi coletado

8 ml de sangue periférico em EDTA para extração do DNA juntamente com 8 ml de

sangue periférico em tubo seco para realização da pesquisa de anticorpos

irregulares e verificação de aloimunização eritrocitária após a transfusão.

21

3.3. Análise de marcadores inflamatórios:

Foram dosados IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL12p70, IL-17, IL-21, IL-22,

IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), CD40 ligante solúvel (sCD40L) e Fator

de necrose tumoral (TNF) pela metodologia multiplex no soro das amostras

coletadas no pré-operatório, final da cirurgia e com 6 horas de pós operatório.

A metodologia multiplex é baseada em um teste de imunoensaio em

formato “sanduíche” que utiliza a citometria de fluxo. Anticorpos de captura

específicos para cada analito estão ligados a microesferas que são codificadas por

cores. Além disso, existe um anticorpo de detecção que emite fluorescência após se

ligar ao analito permitindo a sua quantificação. No presente estudo, foram utilizados

dois kits de multiplex: Bio-Plex Pro Human Th17 Cytokine Painel, BioRad

Laboratories Inc. USA e ProcartaPlex Multiplex Immunoassay, eBioscience,

conforme instruções do fabricante. A sensibilidade informada pelo kit para cada um

dos marcadores inflamatórios avaliados encontra-se na tabela 1.

Tabela 1. Limite inferior de detecção dos marcadores inflamatórios

pg/ml

IL-1B 0,26

IL-2 0,37

IL-4 1,73

IL-6 0,83

IL-10 0,18

IL-12p70 0,76

IL-17A 1,73

IL-17F 1,51

IL-21 14,93

IL-22 4,13

IL-23 9,81

IL-25 0,93

IL-31 3,14

IL-33 5,63

IFN-γ 0,80

sCD40L 1,51

TNF-α 1,35

22

3.4. Pesquisa de microquimerismo:

3.4.1. Extração do DNA genômico:

O DNA foi isolado de células nucleadas a partir de 8 ml de sangue

periférico coletado em EDTA. O sangue foi centrifugado a 2.000 rpm por 10 minutos.

O plasma foi desprezado. Para lise de hemácias foi adicionado solução de cloreto de

amônio (NH4Cl 0,144) na proporção de 5 vezes o volume de células e solução de

bicarbonato de amônio (NH4HCO3 0,01M) na proporção de 0,5 vezes o volume de

células. Após 15 minutos a 4ºC, a solução foi centrifugada a 2.200 rpm por 20

minutos. Esta etapa foi repetida até a obtenção de um precipitado de leucócitos livre

de hemácias.

Os leucócitos foram dissolvidos em 5ml de tampão contendo Tris/HCl pH

7,5 10mM, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 20mM e 30µl de Triton X-100 com

incubação a temperatura ambiente por 15 minutos e centrifugação a 2.200 rpm por

15 minutos. Foi novamente adicionado 800µl de tampão contendo NaCl 0,4M,

Tris/HCl pH 7,5 10mM, KCl 10mM, MgCl2 10mM, EDTA 20mM e dodecil sulfato de

sódio 10% (SDS) com nova incubação a 55ºC por 30 minutos e centrifugação a

12.000 rpm por 5 minutos. Foi realizada a extração com igual volume de mistura

contendo fenol, clorofórmio e álcool isoamílico na proporção 25:24:1 com

centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos. Após, nova extração foi realizada apenas

com clorofórmio e álcool na proporção 24:1. A precipitação do DNA foi feita com

acetato de sódio 3M pH 5,3 (10% do volume total) e 1000µl de etanol absoluto

gelado. O DNA precipitado foi lavado com etanol a 70% para eliminar resíduos de

fenol e posteriormente diluído em água estéril ou em TE (TRIS pH 8,0 10mM e

EDTA 1mM). A concentração do DNA foi determinada por espectrofotometria pela

leitura das densidades ópticas nos comprimentos de onda de 260 e 280 nM em luz

ultravioleta.

3.4.2. Amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em

tempo real:

Foi realizado PCR em tempo real com a utilização de um painel contendo

12 alelos HLA-DR (DR1, DR3, DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13,

DR15 e DR16) utilizando sequências de iniciadores específicas (Integrated DNA

Technologies), conforme metodologia descrita por Lee et al em 2005 [46]. A

amplificação foi realizada no equipamento ABI 7500 Sequence detector System (Life

23

Technologies) utilizando Maxima Sybr Green PCR máster mix (MBI Fermentas).

Setenta e cinco ng de cada amostra de DNA foram utilizados na reação com os

iniciadores para os genes alvos. Um controle negativo, sem adição de DNA, foi

utilizado para cada par de iniciadores. Foi avaliada a temperatura de dissociação

para cada amplificação para garantir a especificidade do material amplificado (tabela

1). Após a reação, foi verificada a presença de DNAs em concentrações diferentes

conforme o número de ciclos necessários para amplificação. O DNA amplificado com

menor número de ciclos (cycle thresold, Ct), ou seja, em maior concentração,

corresponde ao material genômico do receptor e havendo amplificação de um

segundo alelo com maior número de ciclos, ou seja, em menor concentração, é

verificada a presença de material genômico do doador.

3.4.3. Eletroforese em gel de agarose a 4%:

Os produtos da reação de amplificação do PCR foram visualizados em gel

de agarose a 4% corado com brometo de etídio. Foi realizada eletroforese com

corrida a 80V por uma hora e visualização em equipamento LPIX. Com a utilização

de marcador de DNA de 100 pb, foi verificado o tamanho dos fragmentos de DNA

amplificados para cada alelo HLA-DR (tabela 2).

3.5. Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários:

Para os pacientes transfundidos, foi realizada a pesquisa de anticorpos

irregulares (PAI) no soro pela técnica em gel em meio de baixa força iônica (solução

LISS) e em meio enzimático (papaína) na amostra coletada no primeiro retorno

ambulatorial.

3.6. Análise Estatística:

As análises estatísticas foram realizadas utilizando R version 3.1.3 (2015)

(R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Para as comparações,

foram utilizados o teste exato de Fisher para as variáveis categóricas com dois

níveis e o teste não paramétrico de Mann-Whitney para os fatores mensuráveis.

Para os testes de correlação foi utilizada a análise de correlação de Spearman.

24

Tabela 2. Sequência dos iniciadores, concentração, temperatura de dissociação e tamanho do fragmento de DNA.

Alelo HLA-DR Concentração Sequência iniciador Temperatura dissociação (°C) Tamanho

DR1 300 nM DR1A (CTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATG) 82 91bp

DR1C (GGACTCCTCTTGGTTATAGATGCA)

DR3 300 nM DR3A (TACTTCCATAACCAGGAGGAGA) 90.9 153bp

DR3C (TGCAGTAGTTGTCCACCCG)

DR4 300 nM DR4A (GTTTCTGGAGCAGGTTAAAC) 91.4 250bp

DRBB (CCGCTGCACTGTGAAGCTCT)

DR7 300 nM DR7A (CCTGTGGCAGGGTAAGTATA) 91.4 232bp

DR7C (CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC)

DR8 300 nM DR8A (AGTACTCTACGGGTGAGTGTT) 90.7 215bp

DR8C (CTGCAGTAGGTGTCCACCAG)

DR9 300 nM DR9A (GTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTT) 91.8 236bp

DR7C (CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC)

DR10 300 nM DR10A (CGGTTGCTGGAAAGACGCG) 91.8 204bp

DR10C (CTGCACTGTGAAGCTCTCAC)

DR11 300 nM DR11A (GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC) 89 214bp

DR11C (CTGGCTGTTCCAGTACTCCT)

DR12 300 nM DR8A (AGTACTCTACGGGTGAGTGTT) 89.7 260bp

DR12C (CACTGTGAAGCTCTCTCCACAG)

DR13 300 nM DR3A (TACTTCCATAACCAGGAGGAGA) 89.7 130bp

DR13C (CCCGCTCGTCTTCCAGGAT)

DR15 300 nM DR2A (CTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGT) 90.7 195bp

DR15C (CCGCGCCTGCTCCAGGAT)

DR16 300 nM DR2A (CTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGT) 91.2 241bp

DR16C (AGGTGTCCACCGCGGCG)

25

4. RESULTADOS:

4.1. Análise dos marcadores inflamatórios:

4.1.1. Características dos pacientes

Foram avaliados 15 pacientes que receberam transfusão no intra-

operatório e 13 pacientes não transfundidos durante a cirurgia. Não houve

diferenças nas características de sexo, idade, peso, altura, tipo de cirurgia realizada,

tempo cirúrgico e dosagem de hemoglobina no pré-operatório nos dois grupos.

(tabela 3).

O grupo com transfusão recebeu de 1 a 2 unidades de CH não

leucodepletados e não irradiados durante a cirurgia. A mediana de armazenamento

dos hemocomponentes foi de 11 dias, variando de 6 a 28 dias.

Como referência da concentração média de leucócitos e plaquetas nestes

hemocomponentes, temos os resultados da análise realizada pelo controle de

qualidade do Hemocentro de Campinas onde foram coletadas amostras no primeiro

dia de armazenamento dos concentrados de hemácias standard produzidos de 12

de fevereiro a 30 de março de 2015 e de 08 de abril a 27 de julho de 2016, com

amostragem de 31 e 40 unidades respectivamente, selecionadas semanalmente e

de forma aleatória. Foram encontradas as concentrações médias de 3,0 x 109

leucócitos por unidade, com desvio padrão de 0,5 e de 1,8 x 1010 plaquetas por

unidade, com desvio padrão de 0,9.

4.1.2. Dosagem dos marcadores inflamatórios por multiplex:

As dosagens dos marcadores inflamatórios IL-1B, IL-2, IL-4, IL12p70, IL-

17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-33 e TNFα foram próximas ao limite de detecção do

kit em todos os pacientes e nos três tempos avaliados, não sendo possível a análise

estatística.

Os resultados das dosagens de IL-6, IL-10, sCD40L, IL-31 e IFN-γ nos 3

tempos analisados estão descritos na tabela 4.

A interleucina 6 (IL-6) comportou-se de forma semelhante nos dois

grupos, apresentando aumento da sua concentração sérica, quando comparada ao

valor inicial (pré-operatório), ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório.

Porém, houve maior aumento de IL-6 no grupo com transfusão quando comparado

ao grupo sem transfusão ao final da cirurgia (p=0,023) (Figura 1).

26

O CD40 ligante solúvel (sCD40L) apresentou valores com grande

variação nas dosagens pré-operatórias em ambos os grupos. No grupo com

transfusão, ao final da cirurgia houve redução da sua concentração sérica em

relação ao valor inicial, sendo esta diminuição mantida na amostra coletada após 6

horas. Já no grupo não transfundido os resultados mantiveram maior variação entre

os pacientes nas dosagens realizadas ao final da cirurgia e após 6 horas. Houve

diferença significativa entre os dois grupos na amostra coletada ao final da cirurgia,

com menor concentração de sCD40L no grupo transfundido (p=0,016) (figura 2).

A interleucina 10 (IL-10) apresentou aumento da concentração sérica nas

amostras coletadas ao final da cirurgia e após 6 horas nos dois grupos. Houve

diferença significativa entre os grupos com 6 horas de pós operatório, sendo maior a

dosagem de IL-10 no grupo com transfusão quando comparado ao grupo não

transfundido (p=0,022) (Figura 3).

Tabela 3. Características dos pacientes com e sem transfusão no intra-operatório.

Característica Grupo com transfusão (n=15)

Grupo sem transfusão (n=13)

Valor p

Idade (anos) 70 (40-93) 69 (47-89) 0,58a

Sexo

Masculino (%) 8 (53) 7 (54) 1b

Feminino (%) 7 (47) 6 (46)

Peso (Kg) 69 (50-98) 70 (50-101) 0,91a

Altura (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,60 (1,49-1,80) 0,39a

Cirurgia ortopédica

Artroplastia total de quadril (%) 9 (60) 7 (54) 1b

Fratura proximal de fêmur (%) 6 (40) 6 (46)

Duração da cirurgia (horas) 4 (2-6,5) 3,5 (2,3-5,16) 0,38b

Hb pré-operatório (g/dl) 11,8 (8,2-14,9) 12,7 (11-15,6) 0,069b

Volume transfundido (unidades) 1 (1-2) 0 0a

Os valores estão demonstrados como mediana com valores mínimos e máximos ou

como valor absoluto com a porcentagem relativa.

(a) teste de Mann-Whitney (b) teste exato de Fisher

27

A interleucina 31 (IL-31) apresentou valores heterogêneos no pré-

operatório em ambos os grupos. No grupo com transfusão, observamos uma

diminuição da sua concentração ao final da cirurgia e com 6 horas de pós operatório,

em relação ao valor inicial. Além disso, observamos resultados mais homogêneos

entre os pacientes deste grupo. Já no grupo sem transfusão, os resultados são mais

heterogêneos e com menor variação entre os tempos. Porém não houve diferença

significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados. (Figura 4).

O interferon gama (IFN-γ) apresentou menor variação nos 3 tempos

avaliados na maioria dos pacientes. O grupo com transfusão apresentou valores

mais elevados ao final da cirurgia quando comparado ao grupo sem transfusão,

porém não houve diferenças significativas entre os grupos em nenhum dos tempos

avaliados (Figura 5).

28

Tabela 4. Dosagens dos marcadores inflamatórios nos grupos com e sem

transfusão no intra-operatório.

Marcadores inflamatórios

Grupo com transfusão (n=15)

Grupo sem transfusão (n=13)

Valor p

IL-6 Pre-op 5,35 (0,83-46,21) 3,05 (0,83-22,81) 0,38

Final da cirurgia 79,36 (5,76-498,9) 7,8 (0,41-92,45) 0,023*

6hs pos-op 145,03 (12,31-577,44) 75,01 (3,53-599,70) 0,4

sCD40L

Pre-op 34,98 (0,75-209,09) 47,86 (3,31-369,76) 0,7

Final da cirurgia 11,06 (0,75-53,59) 36,06 (8,65-318,68) 0,016*

6hs pos-op 22,66 (0,75-527,33) 24,03 (5,57-287,43) 0,61

IL10

Pre-op 0,52 (0,18-2,49) 0,46 (0,18-1,55) 0,56

Final da cirurgia 1,31 (0,79-29,53) 1,42 (0,18-18,76) 0,89

6hs pos-op 5,90 (1,72-101,39) 2,31 (0,89-13,98) 0,022*

L31

Pre-op 10,47 (1,57-39,91) 12,23 (1,57-64,17) 0,73


6hs pos-op 7,19 (1,57-62,47) 8,34 (1,57-61,79) 0,93

IFN-Ƴ

Pre-op 2,13 (0,40-24,11) 1,25 (0,40-6,08) 0,17


6hs pos-op 3,09 (0,40-11,39) 1,84 (0,40-11,63) 0,36

Os valores estão em pg/ml e são demonstrados como medianas, com valores

mínimo e máximo. Foi utilizado o teste de Mann-Whitney para análise estatísitca.

* p < 0,05

29

Figura 2. Resultados da dosagem de IL-6 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e sem

transfusão (B) no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório. (C)

Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras vermelhas) e sem

transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-Whitney.

(*)p= 0,023

30

Figura 3. Resultados da dosagem de sCD40L em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e

sem transfusão (B) no pré-operatório, ao final da cirurgia e com 6 horas de pós-operatório.

(C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras vermelhas) e sem

transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-Whitney.

(*)p= 0,016

31

Figura 4. Resultados da dosagem de IL-10 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e

sem transfusão (B) no pré-operatório (1), ao final da cirurgia (2) e com 6 horas de pós-

operatório (3). (C) Comparação estatística entre os grupos com transfusão (barras

vermelhas) e sem transfusão (barras verdes) nos 3 tempos utilizando o teste de Mann-

Whitney. (*)p= 0,022

32

Figura 5. Resultados da dosagem de IL-31 em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e




Whitney. Não houve diferença significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados.

33

Figura 6. Resultados da dosagem de IFN-γ em pg/ml nos pacientes com transfusão (A) e




Whitney. Não houve diferença significativa entre os grupos nos 3 tempos avaliados.

34

4.2. Correlações entre citocinas:

Foram feitas as correlações entre as concentrações das citocinas IL-6, IL-

10 e sCD40L dosadas nos 3 tempos (pré-epratório, final da cirurgia e 6 horas de

pós-operatório) nos dois grupos de pacientes (tabela 5). No pré-operatório, a

concentração do sCD40L apresentou correlação negativa com a concentração de IL-

6 e correlação positiva com a concentração de IL-10, demonstrando que antes da

cirurgia e da transfusão, quando a concentração de IL-6 aumenta, as concentrações

de IL-10 e sCD40L diminuem. Já com 6 horas de pós-operatório observamos uma

correlação positiva entre as concentrações de IL-6 e IL-10 nos dois grupos,

evidenciando que após o trauma cirurgico temos o aumento da concentração de IL-

6 juntamente com o aumento da concentração de IL-10.

35

Tabela 5. Correlação entre as citocinas nos 3 tempos avaliados

Grupo com transfusão (n=15) IL-10 pre-op. IL-10 fim cir. IL-10 pos-op. sCD40L pre-op. sCD40L fim cir. sCD40L pos-op.

IL-6 pre-op. r = -0,098 r = -0,200

IL-6 fim cir. r = 0,350 r = 0,434

IL-6 pos-op. r = 0,609* r = -0,231

IL-10 pre-op. r = 0,536*

IL-10 fim crir. r = 0,469

IL-10 pos-op. r = -0,512

Grupo sem transfusão (n=13) IL-10 pre-op. IL-10 fim cir. IL-10 pos-op. sCD40L pre-op. sCD40L fim cir. sCD40L pos-op.

IL-6 pre-op. r = 0,251 r = -0,664*

IL-6 fim cir. r = 0,255 r = -0,291

IL-6 pos-op. r = 0,636* r = -0,264

IL-10 pre-op. r = 0,228

IL-10 fim crir. r = 0,136

IL-10 pos-op. r = -0,264

Análise de correlação de Spermann. * p< 0,05

Abreviações : pre-op., pré-operatório ; fim cir, final da cirurgia ; pos-op, 6 horas de pós-operatório.

36

4.3. Resultados microquimerismo:

4.3.1. Características dos pacientes:

A pesquisa de microquimerismo associados à transfusão foi realizada em

15 pacientes transfundidos no intra-operatório e/ou no pós operatório imediato. Dos

15 pacientes transfundidos durante a cirurgia foi possível avaliar 12 pacientes,

porque os outros não retornaram após a alta para coleta de nova amostra. Além

disso, foram avaliados 3 pacientes que não receberam transfusão no intra-operatório

mas que foram transfundidos no primeiro dia de pós operatório. Para análise do

volume trasnfusndido para cada paciente foram incluídas todas as transfusões

recebidas durante a internação, não apenas no intra-operatório mas tambem no pós

operatório. Foi observada a presença de microquimerismo associado à transfusão

em 13 dos 15 pacientes analisados.

Para descartar outras causas de microquimerismo, como gestação ou

transfusão anterior, foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) também

na amostra coletada no pré-operatório, não sendo considerado microquimerismo

associado à transfusão caso o alelo HLA-DR, visualizado na amostra coletada após

a alta, já estivesse presente no pré-operatório (Figuras 4 e 5).

Os alelos HLA-DR correspondentes ao material genômico do doador

apresentaram amplificação com Ct próximo de 20 ciclos. Já os alelos considerados

como microquimerismo apresentaram amplificação com Ct acima de 30 ciclos.

Dos 13 receptores com microquimerismo, em 10 pacientes foi observada

a presença de um único alelo HLA-DR correpondente aos leucócitos do doador

(microquimerismo) e em 3 pacientes foi observada a existência de 2 alelos.

Não houve diferenças entre os grupos com e sem microquimerismo nas

características sexo, idade, peso, altura, tipo de cirurgia realizada, duração da

cirurgia e dosagem de hemoglobina no pré-operatório. Além disso, não houve

diferença quanto ao volume total transfundido para cada paciente, considerando

todas as transfusões de concentrados de hemácias recebidas durante a internação.

Também não houve diferença entre os grupos no intervalo entre a última

transfusão e a coleta da amostra para avaliação do microquimerismo e no tempo de

armazenamento dos hemocomponentes. Nos pacientes com microquimerismo, a

mediana de seguimento foi de 14 dias, variando de 5 a 30 dias. Quanto ao tempo de

armazenamento dos hemocomponentes, a mediana foi de 17 dias, variando de 6 a

22 dias (tabela 6).

37

Tabela 6 . Características dos grupos com e sem microquimerismo associado à

transfusão.

Características Microquimerismo (n=13)

Sem microquimerismo

(n=2)

Valor p

Idade (anos) 77 (40-89) 72,5 (70-75) 0,80a

Sexo masculino (%) 8 (61) 1 (50) 1b

Peso (Kg) 69 (50-98) 69,5 (65-74) 1a

Altura (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,57 (1,49-1,65) 0,27a

Cirurgia ortopédica

Artroplastia total de quadril (%) 9 (69) 0 0,14b

Fratura de fêmur proximal (%) 4 (31) 2 (100)

Duração da cirurgia (horas) 4,16 (2-6,5) 3,38 (3,25-3,5) 0,20a

Hb preoperatório (g/dl) 12,3 (8,2-14,9) 11,4 (11-11,8) 0,57a

Transfusão no intra-operatório

Sim (%) 11 (85) 1 (50) 0,37b

Não (%) 2 (15) 1 (50)

Unidades de CH transfundidas

na internação

3 (1-8) 3 (2-4) 0,86a

Tempo entre a última transfusão

e a coleta da amostra (dias)

14 (5-30) 13 (12-14) 0,80a

Tempo armazenamento

hemocomponentes (dias)

17 (6-22) 8,5 (5,5-11,5) 0,17a

Os valores estão demonstrados como mediana com valores mínimos e máximos ou

como valor absoluto com a porcentagem relativa.

(a) teste de Mann-Whitney (b) teste exato de Fisher

38

Figura 7. Resultado de paciente com microquimerismo associado à transfusão.

(A) Amostra pré-operatória com presença de alelos HLA-DR 4 e 15, ambos com Ct próximo

de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. (B) Amostra coletada após a alta

hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 13 com Ct acima de 30, correspondendo aos

leucócitos do doador (microquimerismo). (C) eletroforese em gel de agarose a 4% dos

produtos de amplificação da amostra (B) com visualização dos 3 fragmentos.

39

Figura 8. Resultado de paciente com microquimerismo associados à transfusão.


de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. (B) Amostra coletada após a alta

hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 1 com Ct acima de 30, correspondendo aos

leucócitos do doador (microquimerismo). (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos


40

Figura 9. Resultado de paciente com microquimerismo associado à transfusão.


de 20, correspondendo aos leucócitos do receptor. Presença de alelo HLA-DR 8 com Ct

acima de 30. Paciente com antecedente de múltiplas gestações. (B) Amostra coletada após

a alta hospitalar com aparecimento do alelo HLA-DR 9 com Ct acima de 30, correspondendo

aos leucócitos do doador (microquimerismo). (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos


41

Figura 10. Resultado de paciente sem microquimerismo associado à transfusão.

(A) amostra pré-operatória e (B) amostra coletada após a alta hospitalar, ambas com

presença de alelos HLA-DR 4 e 11 com Ct proximo de 20, correspondente aos leucócitos do

doador. Ausência de microquimerismo. (C) Eletroforese em gel de agarose a 4% dos


42

4.3.2. Análise dos marcadores inflamatórios:

Não houve diferença nas dosagens de IL-6, sCD40L, IL-10, IL-31 e IFN-

nos 3 tempos avaliados (pré-peratório, final da cirurgia e 6hs de pós operatório)

entre os grupos com e e sem microquimerismo associado à transfusão (tabela 7).

Porém o grupo sem microquimerismo contém apenas 2 pacientes, o que prejudicou

a análise estatística.

Tabela 7. Dosagem dos marcadores inflamatórios nos grupos com e sem

microquimerismo.

Marcadores inflamatórios

Microquimerismo (n=13)

Sem microquimerismo (n=2)

Valor p

IL-6

Pre-op 5,35 (0,83-21,53) 11,39 (7,94-14,85) 0,57


6hs pos-op 135,61 (12,31-577,44) 290,91 (161,80-420,02) 0,57

sCD40L

Pre-op 57,25 (1,57-209,09) 25,72 (3,58-47,86) 0,3


6hs pos-op 25,39 (1,57-527,33) 39,56 (22,54-56,58) 0,69

IL10

Pre-op 0,56 (0,18-2,49) 0,56 (0,46-0,65) 0,67


6hs pos-op 3,24 (1,72-101,1) 4,78 (2,21-7,35) 0,93

IL-31

Pre-op 9,05 (1,57-39,91) 7,95 (1,57-14,33) 0,61


6hs pos-op 6,92 (1,57-62,47) 11,33 (7,28-15,38) 0,35

IFN- γ

Pre-op 1,55 (0,40-24,11) 0,82 (0,40-1,25) 0,23

Final da cirurgia 1,84 (0,40-17,77) 1,54 (1,25-1,84) 1

6hs pos-op 2,96 (0,40-11,39) 4,03 (3,5-4,55) 0,49

Os valores estão em pg/ml e são demonstrados como medianas com valores mínimo e

máximo. Foi utilizado o teste de Mann-Whitney para análise estatísitca.

4.3.3. Confirmação pela tipagem HLA-DR dos doadores:

O total de doadores envolvidos nas transfusões dos 13 pacientes com

presença de microquimerismo associado à transfusão foi de 47 indivíduos. Desses,

apenas 11 compareceram para a coleta de amostra para tipagem HLA-DR. Em 5

dos 13 pacientes foi possível confirmar a tipagem HLA-DR visualizada como

microquimerismo com a tipagem HLA-DR de um dos doadores transfundidos. Em

43

outros 5 casos não foi possível realizar esta confirmação porém não compareceram

todos os doadores transfundidos. Em 3 casos nenhum dos doadores envolvidos

compareceu não sendo feita esta análise.

4.4. Pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários:

Nenhum dos 15 pacientes que foram avaliados após a alta hospitalar

apresentou evidência de aloimunização eritrocitária. Quatorze pacientes

apresentaram PAI negativo. Um paciente apresentou PAI positivo com a presença

de anti-E, porém este paciente já apresentava este anticorpo na avaliação realizada

antes da cirurgia. O paciente em questão tinha antecedente de transfusão

sanguínea em uma cirurgia anterior.

44

5. DISCUSSÃO:

Sabemos que o trauma cirúrgico leva a uma reação pró-inflamatória,

conhecida como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS - systemic

inflammatory response syndrome) que é contrabalanceada por um efeito anti-

inflamatório compensatório (CARS - compensatory anti-inflammatory response

syndrome). Assim, já foi demonstrado que após uma lesão tecidual extensa ocorre

uma tempestade de citocinas, com ativação do sistema imune e liberação de IL-6,

IL-8, IL-10 e TNF α entre outros [6, 63-65]. Acredita-se que neste contexto a

transfusão sanguínea alogênica possa exacerbar esta resposta inflamatória,

funcionando como um segundo insulto ao sistema imune [6, 66]. Para melhor

demonstrar este efeito imunomodulatório da transfusão alogênica, escolhemos um

grupo de pacientes que recebeu concentrados de hemácias standard, ou seja, com

maior contaminação por leucócitos e plaquetas, já que a maioria dos estudos da

literatura são realizados com hemocomponentes com menor contaminação. Os

resultados encontrados com relação ao aumento da IL-6 e da IL-10 no pós-

operatório de ambos os grupos eram assim esperados e estão condizentes com a

literatura, reforçando a ideia do trauma por si gerar uma resposta inflamatória

sistêmica. Além disso, o maior aumento de IL-6 ao final da cirurgia e o maior

aumento de IL-10 com 6 horas de pós-operatório nos pacientes transfundidos,

quando comparados aos não transfundidos, fortalece a teoria de que a transfusão

sanguínea age como um segundo estímulo, exacerbando a resposta imune.

Resultados semelhantes já tinham sido descritos para estas

interleucinas com relação à transfusão. Estudos anteriores demonstraram aumento

de IL-6 em pacientes transfundidos em cirurgia cardíaca, como já discutimos [20,

23]. Da mesma forma, um estudo mais recente avaliou pacientes transfundidos em

cirurgia abdominal divididos em um grupo com estratégia transfusional liberal

comparado a um grupo com estratégia restritiva e também evidenciou maior

dosagem de IL-10 no pós-operatório no primeiro grupo, correlacionando o aumento

desta interleucina com a transfusão [62].

Por outro lado, esperávamos encontrar resultados mais exuberantes

com relação às dosagens de citocinas inflamatórias, por utilizarmos concentrados de

hemácias com alta contaminação por leucócitos e plaquetas. Não foram observadas

diferenças significativas entre os grupos nas outras citocinas avaliadas. Porém, é

45

possível que o baixo volume transfusional e o curto período de armazenamento dos

hemocomponentes tenham minimizado possíveis diferenças conforme resultados já

descritos. De fato, o estudo que avaliou 346 pacientes transfundidos em cirurgia

cardíaca evidenciou maior aumento de IL-6 nos pacientes que receberam 4 ou mais

unidades de concentrados de hemácias buffy-coat depletadas quando comparados

aos pacientes que receberam concentrado de hemácias leucodepletadas [20]. Da

mesma forma, van de Watering et al também evidenciou efeito dose dependente ao

avaliar 866 pacientes, encontrando maior mortalidade no grupo que recebeu 4 ou

mais unidades de concentrados de hemácias não leucodepletadas [17].

Além disso, é importante ressaltar que, por comparamos pacientes

transfundidos com pacientes não transfundidos, é possível que as características

intrínsecas de cada grupo interfiram nos resultados encontrados. Observamos que,

apesar das características dos pacientes não apresentarem diferenças significativas

entre os grupos, os pacientes que tiveram necessidade transfusional no intra-

operatório foram aqueles com menor dosagem de hemoglobina sérica no pré-

operatório, com nível de hemoglobina variando de 8,2 g/dl a 14,9 g/dl no grupo com

transfusão contra 11,0 a 15,6 g/dl no grupo sem transfusão, o que pode refletir uma

pior condição clínica; e com maior tempo cirúrgico, variando de 2,00 a 6,50 horas de

cirurgia no grupo com transfusão contra 2,30 a 5,16 horas no grupo sem transfusão,

o que possivelmente levou a maior lesão tecidual com maior volume de

sangramento (tabela 3).

Como resultado ainda não descrito, encontramos diminuição

significativa da concentração de sCD40L ao final da cirurgia nos pacientes

transfundidos em relação aos não transfundidos. O receptor de membrana CD40, da

família do TNF, é encontrado em células apresentadoras de antígenos, nos linfócitos

B e nas células endoteliais, sendo o seu ligante (CD40L ou CD154) expresso

principalmente nos linfócitos T e nas plaquetas. Através da ligação CD40-CD40L

ocorre, por exemplo, a interação das células apresentadoras de antígenos com os

linfócitos T assim como das plaquetas com as células endoteliais. Inicialmente

acreditava-se que a parte solúvel do CD40 ligante (sCD40L) era produzida apenas

por linfócitos T, a partir da clivagem proteica da região externa do receptor CD40L.

Atualmente sabemos que as plaquetas são a principal fonte do sCD40L encontrado

no plasma. Esta descoberta tem ganhado destaque na literatura por evidenciar o

papel pró-inflamatório e pró-trombótico das plaquetas após uma lesão tecidual.

46

Dessa forma, o sCD40L está sendo estudado em diversos cenários, sendo

relacionado à inflamação vascular, à ativação de células endoteliais e a risco

trombótico [67-71].

Além disso, foi demonstrado que ocorre a liberação dessa molécula

coestimulatória no plasma dos hemocomponentes durante o armazenamento, sendo

a maior quantidade encontrada nos concentrados de plaquetas. Em relação aos

concentrados de hemácias, observamos que a leucodepleção reduz

significativamente a liberação do sCD40L, sendo que nos hemocomponentes não

leucodepletados esta concentração aumenta durante o armazenamento. Existem

estudos que demonstram o envolvimento do sCD40L na fisiopatologia da lesão

pulmonar aguda associada à transfusão (TRALI – transfusion-related agude lung

injury), provavelmente por levar à ativação de neutrófilos e de células endoteliais

[72].

No presente estudo, apesar dos pacientes transfundidos receberem

concentrados de hemácias com maior contaminação por leucócitos e plaquetas, ou

seja, com maiores quantidades de sCD40L, houve redução significativa deste

marcador no grupo transfundido, diferentemente do que aconteceu no outro grupo.

Isto demonstra o seu acentuado consumo após a transfusão. Acreditamos que o

sCD40L tenha se ligado aos seus receptores presentes, por exemplo, em linfócitos e

em células endoteliais, o que levou `a sua redução no sangue periférico. Já foi

demonstrado in vitro que o sCD40L tem a capacidade de estimular a proliferação de

linfócitos T regulatórios e de induzir a liberação de IL-10 [71]. Sendo assim, é

possível explicar o maior aumento de IL-10 com 6 horas de pós-operatório neste

grupo de pacientes, quando comparado ao grupo não transfundido.

Avaliamos também a presença de microquimerismo associado à

transfusão encontrando positividade em 13 dos 15 pacientes. A mediana de

seguimento foi de 14 dias, sendo que foi evidenciado microquimerismo por até 30

dias após a transfusão em um dos pacientes. É uma alta taxa de positividade, porém

realizamos apenas uma avaliação a curto prazo, não sendo possível dizer se

ocorreu persistência dessas células no receptor. Apesar de Lee et al ter

demonstrado em 1999 a eliminação dos leucócitos do doador com até 14 dias após

a transfusão em cirurgia eletiva, existem outros trabalhos que demonstraram a

persistência desses leucócitos por mais tempo, sendo que um estudo demonstrou

microquimerismo por até 24 semanas após a transfusão em um dos pacientes

47

avaliados [47, 73]. Porém, só foi visto microquimerismo a longo prazo em pacientes

transfundidos em grandes traumas como foi observado em soldados feridos em

guerra [46-48]. Além disso, por utilizarmos PCR em tempo real a sensibilidade da

nossa metodologia é maior do que a utilizada por Lee et al em 1999.

Existem ainda outros mecanismos possivelmente envolvidos na

imunomodulação associada à transfusão, como a presença de microvesículas e

exossomas nos concentrados de hemácias. Essas vesículas são derivadas

principalmente de hemácias e plaquetas e são acumuladas nos hemocomponentes

durante o armazenamento. Estudos in vitro demonstraram que a interação dos

exossomas com as células apresentadoras de antígenos induz a proliferação de

linfócitos T, sendo este efeito neutralizado com o bloqueio dos receptores CD40-

CD40L [74]. Dessa forma, estudos futuros devem avaliar a importância deste

mecanismo na liberação de citocinas e na resposta imune após uma transfusão.

Por fim, os resultados obtidos com relação ao perfil de citocinas no pós-

operatório destes pacientes sugere que a transfusão de até 2 unidades de

concentrados de hemácias contaminados com leucócitos e plaquetas pode causar

menor imunomodulação do que o esperado e corroborar a hipótese de que esse

efeito seria mais exuberante apenas em transfusões acima de 4 unidades. Este é

um resultado importante para centros em países em desenvolvimento onde a prática

de leucorredução é menos utilizada.

48

6. CONCLUSÃO:

Concluímos que a transfusão de concentrado de hemácias não

leucodepletados no contexto cirúrgico induz um insulto adicional em um ambiente

onde já existe a ativação do sistema imune pelo trauma. Este duplo estímulo leva a

maior liberação de IL-6 e IL-10 no pós-operatório, com consumo de sCD40L. Além

disso, a sobrevida transitória do leucócito alogênico parece contribuir com este efeito

imunomodulatório. Porém, é dífícil definir o quanto estas alterações se traduzem em

um efeito clínico no receptor.

49

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54

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55

8. Apêndices:

56

Tabela 8. Resultados dos marcadores inflamatórios em pg/ml por paciente avaliado.

sem transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op

1 3.05 38.82 567.89 0.18 0.18 2,31 93.14 34.72 30.03

2 21.53 74.38 90.44 1.41 1.27 4,93 4.74 23.35 24.03

3 0.83 2.44 13.03 0.32 6.65 0,92 87.69 36.06 5.57

4 * * * 0.73 5.94 5,6 * * *

5 * * * 0.20 0.18 1,01 * * *

6 7.94 92.45 161.80 0.65 2.63 2,21 47.86 73.32 56.58

7 2.68 4.86 58.43 1.55 1.42 0,89 369.76 184.26 259.72

8 15.74 46.17 599.70 0.26 9.22 13,98 3.31 10.39 10.68

9 4.79 1.98 12.92 0.46 0.24 1 18.44 55.52 19.66

10 1.42 7.8 56.01 0.34 18.76 2,34 114.55 318.68 287.43

11 0.90 4.48 181.26 0.18 0.38 2,35 10.80 8.65 7.44

12 22.81 37.64 75.01 0.78 6.17 4,43 10.68 13.87 13.63

13 0.86 0.41 3.53 1.19 1.24 2,08 235.18 187.58 137.36

mediana 3.05 (0.83-22.81) 7.80 (0.41-92.45) 75.01 (3.53-599.70) 0.48 (0.18-1.55) 1.42 (0.18-18.76) 2.31 (0.89-13.98) 47.86 (3.31-369-76) 36.06 (8.65-318.68) 24.03 (5.57-287.43)

com transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op

1 9.93 * 154.45 1.04 * 5.15 57.25 * 145.07

2 2.81 5.76 14.31 0.27 1.37 6.65 3.53 4.96 22.79

3 3.15 97.89 368.16 0.56 2.62 101.10 61.47 28.33 14.58

4 12.81 80.59 28.90 0.18 1.33 2.47 7.04 0.90 25.39

5 4.66 20.71 37.05 0.47 11.22 1.72 147.15 22.73 26.76

6 46.21 * 209.41 1.13 * 101.39 25.33 * 1.00

7 2.71 267.61 577.44 1.16 29.53 7.70 161.94 51.94 51.54

8 14.85 91.05 420.02 0.46 1.08 7.35 3.58 10.74 22.54

9 17.25 250.86 99.17 0.50 0.79 2.17 10.68 6.14 2.40

10 8.22 18.10 423.59 0.49 0.92 10.13 1,57 1,57 1,57

11 5.35 498.90 421.04 0.61 7.98 3.24 12.27 53.59 27.33

12 1.94 78.12 * 0.18 1.30 * 34.98 8.24 *

13 16.62 11.01 120.12 0.52 0.89 2.42 209.09 30.28 19.60

14 0.83 * 12.31 2.49 * 1.88 54.86 * 527.33

15 4.72 9.50 135.61 2.32 0.99 14.85 162.63 11.38 16.56

mediana 5.35 (0.83-46.21) 79.36 (5.76-498.90) 145.03 (12.31-577.44) 0.52 (0.18-2.49) 1.31(0.79-29.53) 5.90 (1.72-101.39) 34.98 (1,57-209.09) 11.06 (1,57-53.59) 22.66 (1,57-527.33)

IL-6 IL-10 sCD40L

Abreviações: sem transf, sem transfusão; com transf, com transfusão; pre-op, pré-operatório; pos-op, pós-operatório.

*Não avaliado

57

Tabela 9. Resultados dos marcadores inflamatórios em pg/ml por paciente avaliado.

sem transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op

1 6,56 1,57 1,57 0,40 0,40 3,50

2 1,57 5,85 5,13 1,55 0,40 0,40

3 26,15 11,52 4,05 3,50 0,40 0,40

4 * * * * * *

5 * * * * * *

6 14,33 14,68 15,38 1,25 1,25 3,50

7 64,17 42,99 61,79 1,25 5,07 7,32

8 3,69 6,92 14,68 6,08 3,50 11,63

9 12,23 25,11 8,34 1,25 1,25 1,25

10 13,63 22,69 25,97 0,40 1,55 1,84

11 1,57 1,57 4,23 0,40 0,40 0,40

12 1,57 1,57 3,32 0,40 0,40 4,03

13 45,22 40,42 25,11 0,40 0,40 0,40

mediana 12,23 (1,57-64,17) 11,52 (1,57-42,99) 8,34 (1,57-61,79) 1,25 (0,40-6,08) 0,40 (0,40-5,07) 1,84 (0,40-11,63)

com transf pre-op final cirurgia 6hs pos-op pre-op final cirurgia 6hs pos-op

1 13,98 * 41,11 1,25 * 6,58

2 4,05 4,77 12,05 4,03 5,58 4,55

3 9,05 8,70 6,21 24,11 17,77 9,98

4 4,77 4,41 8,34 2,41 3,50 11,39

5 39,91 9,05 9,58 3,23 0,40 2,41

6 21,3 * 3,32 2,96 * 2,41

7 28,04 9,76 8,17 1,25 1,84 2,96

8 1,57 4,41 7,28 0,40 1,84 4,55

9 3,32 1,57 1,57 2,41 2,96 1,25

10 7,99 5,49 5,31 9,50 6,08 6,58

11 4,41 11,70 6,92 1,25 3,50 3,23

12 15,03 3,69 * 0,4 0,40 *

13 26,32 5,85 5,13 2,13 0,40 0,40

14 10,47 * 62,47 0,40 * 0,40

15 24,76 5,49 7,10 0,95 0,95 1,84

mediana 10,47 (1,57-39,91 5,49 (1,57-11,70) 7,19 (1,57-62,47) 2,13 (0,40-24,11) 2,14 (0,40-17,77) 3,09 (0,40-11,39)

IL-31 IFN-Ƴ

Abreviações: sem transf, sem transfusão; com transf, com transfusão; pre-op, pré-operatório; pos-op, pós-operatório.

*Não avaliado

58

9. Anexos:

Anexo I

Reduction in sCD40L levels may predict an anti-inflammatory effect after leukocyte-

containing allogeneic blood transfusion in surgical patients

Running head: anti-inflammatory effect of transfusion

Mariana Magnus1, Fernanda Niemann1, William Belangero2, Simone Gilli1, Sara T Olalla Saad1.

1 Department of Hematology and Transfusion Medicine Center, 2 Department of Orthopedics,

University of Campinas, Campinas, SP, Brazil

Corresponding author: Mariana Magnus, Hematology and Transfusion Medicine Center, University

of Campinas.

Rua Carlos Chagas, 480. Campinas, SP, Brazil. 13083-878

Phone: +55 19 3521 8603

Email: [email protected]

The Authors have no conflicts of Interest to declare.

Financial support: This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq/MCT), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP) # 2011/51959-0

mailto:[email protected]

59

Abstract

Background: Red blood cell (RBCs) transfusion has been associated with complications in

trauma and surgical patients. Leukocytes and platelets, present in blood components, seem to be

a main cause of transfusion-related immunomodulation. Despite evidence of deleterious clinical

effects of allogeneic blood transfusion, the actual mechanism involved is unclear.

Study Design and Methods: A prospective observational study was conducted to evaluate

transfusion-associated microchimerism and immune responses of 28 patients undergoing elective

orthopedic surgery divided into a leukocyte-containing RBCs transfused and a non-transfused

group. Inflammatory markers IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-

25, IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand (sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα)

were measured in both groups at three time points: preoperative period, end of surgery and 6hs

hours after the postoperative period; microchimerism presence was detected by polymerase chain

reaction (PCR) analysis using quantitative allele-specific HLA DR assays to reveal non-recipient

alleles in transfused patients.

Results: Higher IL-6 levels (p = 0.023) and significant sCD40L reduction (p = 0.016) when surgery

ended, and higher IL-10 levels (p =0.022) after 6hs hours of postoperative period were

demonstrated in transfused compared to non-transfused patients. Microchimerism was

documented in 13 out of 15 patients after leukocyte-containing RBC transfusion and median

evaluation time was 14 days after transfusion (range 5-30 days). Comparing patients with and

without microchimerism, there was no difference in gender, age, number of units transfused or

inflammatory markers after transfusion.

Conclusion: Leukocyte-containing RBC transfusion is associated with early inflammatory

response followed by anti-inflammatory response in trauma surgery patients and reduction in

sCD40L levels after transfusion may predict an anti-inflammatory effect.

Key words: blood transfusion; transfusion-related immunomodulation; microchimerism;

leukocytes.

60

Introduction

The administration of blood products is associated with well described adverse effects, for

example, the risk of viral infection transmission, transfusion-related acute lung injury (TRALI) and

febrile nonhemolytic transfusion reactions.

Recently more restrictive transfusion polices have been used in critical care units and surgery

settings. Over the last 30 years, a variety of deleterious effects potentially attributable to blood

transfusion have been described andallogeneic blood transfusion (ABT) in particular, is believed to

be associated with increased risk of cancer recurrence[1-3], postoperative infection[4-6] and short-

term mortality. [7-10] To explain all these clinical findings, there has been increasing interest in the

idea that ABTs cause an effect on the recipient’s immune system known as transfusion-related

immunomodulation (TRIM). Despite TRIM being a real biologic phenomenon, the mechanism and

clinical significance of this syndrome remains controversial.

One possible mechanism of TRIM lies in the donor and recipient HLA partial compatibility,

potentially leading to the persistence of a small number of donor leucocytes in the recipient

circulation after blood transfusion. This transfusion-associated microchimerism (TA-MC) can lead

to the release of cytokines and can also promote the downregulation of the immune response of

the recipient. TA-MC has been described in trauma patients after 2 years of transfusion and in

elective surgery patients during short-term periods.[11-13]

In addition, leukocyte-containing blood products accumulate cytokines released during storage

and after transfusion the interaction between donor and recipient leukocytes results in the

production of many cytokines that induce an immunomodulatory effect in the recipient. [7, 8]

Previous studies have shown increased level of inflammatory mediators such as IL-6 and IL-10 in

the plasma of surgery patients after blood transfusion and the impairment in balance between

proinflamatory and antiinflamatory cytokines could possibly explain the worse outcome in these

patients. [14-16]

In the present study, we investigated whether intraoperative blood transfusion affects the release

of inflammatory mediators in patients undergoing elective orthopedic surgery and the association

of these cytokines with the presence of transfusion related microchimerism.

Materials and Methods

This is a prospective observational study at The University of Campinas Hospital. Patients

scheduled for elective orthopedic surgery (hip arthroplasty or proximal femoral fracture) were

61

enrolled in the study after providing written informed consent. Exclusion criteria included

individuals under the age of 18, preexisting infectious or autoimmune disease, corticosteroids or

imunossupressive drug use during the previous 30 days and cancer diagnosis in radio or

chemotherapy treatment.

All patients were operated by the same surgery team and used the same anesthetic protocol.

Intraoperative transfusions were supervised by the anesthesiologist according to the hospital

transfusion protocol that includes evaluation of bleeding amount, change in heart rate, blood

pressure and hemoglobin levels during surgery.

All transfusions were non-leukodepleted packed red cells stored in citrate-phosphate dextrose

adenine-1 (CPDA-1).

Inflammatory Markers. Peripheral blood samples were collected at the following time points:

preoperatively, at the end of surgery and 6 hours postoperatively. Blood samples were

immediately centrifuged and aliquoted; the serum sample was stored at -80°C. The

concentrations of cytokines were measured using two multiplex immunoassay: Bio-Plex Pro

Human Th17 Cytokine Painel, BioRad Laboratories Inc. USA and ProcartaPlex Multiplex

Immunoassay from eBioscience, according to the recommendations of the manufacturer. The

evaluated cytokines were: IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL12p70, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25,

IL-31, IL-33, interferon-γ (IFN-γ), soluble CD40 ligand (sCD40L), Tumor necrosis factor (TNFα).

Microchimerism. Samples were collected from patients who had received blood transfusion during

surgery or in the early postoperative days. DNA samples were obtained from peripheral blood

samples using phenol-chlorophorm protocol extraction. Identification of transfusion related

microchimerism was performed using quantitative real-time PCR in a ABI 7500 Sequence

Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) with SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems). DNA lysates were amplified for the HLA-DR panel consisting of DR1, DR3,

DR4, DR7, DR8, DR9, DR10, DR11, DR12, DR13, DR15 and DR16 using sequence-specific

primers. [11, 17]. After that, the amplification product was visualized on 4% agarose gel.

Microchimerism was identified in two different populations according to Ct value: a major HLA-DR

type with a relatively low Ct (patient’s cells) and a minor population with a higher Ct (microchimeric

cells). The post transfusion sample was compared with the pre transfusion sample for each patient

to exclude any other cause of microchimerism such as pregnancy or transplantation. Additionally,

HLA-DR types of donors were performed to confirm the survival of donor leukocyte subpopulations

in transfused patients.

62

Statistics

Patient characteristics and cytokine values were compared in the transfused and non-transfused

groups using the Wilcoxon signed-rank test for quantitative variables and Fisher’s exact test for

qualitative variables. Correlations were described as Sperman’s rank correlation coefficient (r). In

all analysis p < 0.05 was considered as statistically significant.

Results

Patient Characteristics. 15 patients were transfused during surgery and 13 were not. Comparison

of both groups showed no significant difference in age, gender, weight, height, type of orthopedic

surgery, surgery duration and in preoperative hemoglobin levels. Furthemore, median hemoglobin

levels before surgery were 11.8g/dl (range 8.2-14.9g/dl) in the transfused group versus 12.7g/dl

(range 11-15.6g/dl) in the non-transfused group and median surgery time was 4 hours (range 2-

6.5 hours) in the transfused group versus 3.5 hours (range 2.3-5.16 hours) in the non-transfused

group(Table 2). Transfused patients received 1 to 2 units of nonleukodepleted packed red cells

during surgery. The storage length of transfused units varied from 6 to 21 days, mean of 11 days.

Inflammatory Markers.IL1β, IL2, IL4, IL12, IL17, IL21, IL22, IL23, IL25, IL31, IL33, IFN-γ, TNFα

levels were low in both groups at all time points analyzed (data not shown), with no statistical

differences. However, significant differences were obtained for IL-6, IL-10 and soluble CD40 ligand

(sCD40L) levels. Detection sensitivity for each cytokine is listed in Table 1. The serial changes in

the circulating levels of IL-6, IL-10 and sCD40L in the two patient subgroups are summarized in

Table 3. IL-6 exhibited a postoperative increase in the two groups and at the end of surgery IL-6

levels were higher in the transfused group than in the non-transfused patients (P=0.023). IL-10

also increased progressively after surgery in both groups and a higher level was observed in the

transfused compared to the non-transfused group after 6hs of postoperative period (P=0.022).

sCD40L was higher from baseline at all three time points in the two groups and decreased after

surgery, with lower levels in the transfused group compared to the non-transfused group at the

end of surgery (P=0.016). (Figure 1). Correlation analysis using Spearman test showed that in the

pre-operative period, sCD40L correlated positively with IL10 (r=0,536, p<0,05) and correlated

negatively with IL6 ( r=-0,664 p<0,05) , confirming the anti-inflammatory effect (Table 5).

Microchimerism. Blood samples were collected after transfusion to investigate the evidence of

microchimerism in 15 patients. Twelve patients were transfused during surgery (transfused group)

and 3 patients were transfused after surgery, in the first or second postoperative day. In a total of

15 patients, 13 demonstrated evidence of transfusion related microchimerism (Figure 2). The

63

median time of blood sampling was 14 days after transfusion (range 5-30 days), calculated from

the time the last unit have been transfused. Comparing patients that did and did not demonstrate

evidences of microchimerism, there was no difference in gender, age, type of orthopedic surgery,

number of units transfused or time of sample collection (days after transfusion) (Table 4).

Furthermore, there was no significant difference in IL-6, IL-10 and sCD40L levels at all time points

in both subgroups.

We requested the blood donors involved in the transfusions of these 13 patients to collect samples

for HLA typing. In a total of 42 blood donors, 11 attended the service. It was possible to confirm

the survival of donor leukocyte subpopulations in 5 patients.

Discussion

The mechanisms involved in transfusion related immunomodulation (TRIM) are still uncertain. In

this study we demonstrated that allogeneic blood transfusion during orthopedic surgery is

associated with increased inflammatory markers, corroborating data reported in patients

undergoing cardiac and abdominal surgery. [14, 16], Those studies compared different transfusion

strategies as, for example, liberal versus restrictive transfusion protocol or buffy-coat depleted

versus leukocyte-depleted red blood cells. To our knowledge, this is the first study to evaluate

early inflammatory profiles and microchimerism in patients submitted to transfusion with RBC

highly contaminated with leukocytes and platelet, during surgery procedure. The non-

leukodepleted RBCs contained 3 X 109 leukocytes/unit and were not irradiated.

Interesting, the cytokine profile levels of our results compared to the literature reporting data

obtained from patients transfused with buffy-coat or leuko-depleted RBCs were similar. Thus, our

findings confirmed, in transfused patients, higher concentrations of pro and anti-inflammatory

cytokines as interleukin-6 and interleukin-10, consistent with the literature. We believe that

transfusion of low number of non-leukodepleted RBCs, with a low storage length may reduce the

impact of granulocytes and platelets contamination. In fact, Bilgin et al [14] conducted an elegant

study in a large group of patients and showed that significant abnormalities in cytokine levels were

detected only in patients who had received at least 4 buffy-coat depleted RBC units. Moreover,

another study [16] showed a strong positive correlation between peak pos-operative Il10 values

and mean of storage length of transfused RBC. However, we cannot rule out the intrinsic

characteristics of our transfused group, who showed lower levels of pre-operative hemoglobin and

a slightly longer surgery time, which could lead to higher tissue lesion.

64

There is evidence that blood transfusion might be associated with higher risk of postoperative

infection [4-6, 9], cancer recurrence [1-3] and multiple-organ failure [10, 18] however, there is no

consensus whether leukocyte-containing transfusion induces a proinflammatory effect or

immunossuppression[7, 8]. Allogeneic blood transfusion might initially work as a proinflammatory

sign that induces an anti-inflammatory response as consequence, explaining our findings of higher

levels of IL-6 at the end of surgery and of IL-10 after 6 hours of postoperative period in transfused

group compared with non-transfused. It is interesting to point out that, despite transfused

patientshaving received RBC containing platelets, which release sCD40L during storage[19, 20], a

lower concentration of sCD40L at the end of surgery was detected in these group, compared to

the non-transfused group.

sCD40L is the extracellular domain of CD40 ligand (CD40L or CD154) that is generated via

proteolytic cleavage from the surface of CD40-expressing cells. CD40 is the receptor for CD40L

and is a membrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor (TNF) superfamily which is

expressed on the surface of immune cells including monocytes, B cells, dendritic cells and

activated T cells as on the surface of non-immune cells such as endothelial cells. [21, 22]CD40L

(or CD154) is mostly expressed by antigen-presenting cells as activated T cells and activated

dendritic cells (DC) or by activated platelets. CD40/CD154 interaction plays a role in the

regulation of humoral and cellular immune response, resulting in the enormous production of

cytokines, however, the crucial mechanism triggering the sCD40L production and its role in the

immune response remains unclear. sCD40L seems to maintain the ability to bind to CD40,

inhibiting the CD40/CD 154 interaction and working as a natural CD40 antagonist[22-24]. Taking

these findings together with our results, we may speculate that at the end of surgery, transfused

patients had a higher inflammatory response due to the interaction between donor antigen-

presenting cells and recipient T cells by CD40/CD154 costimulatory pathway, resulting in higher

consumption of sCD40L and in higher IL-6 release. Conversely, the partial HLA compatibility of

donor and recipient may lead to allograft tolerance, here demonstrated by the presence of short-

term transfusion associated microchimerism, triggering an anti-inflammatory stimulus with higher

IL-10 production and immunossuppression.

In summary, this study shows a higher reduction in sCD40L at the end of surgery of patients

transfused with non-leukodepleted RBCs compared with non-transfused ones. Since platelets

secrete sCD40L during storage [25, 26]), this is an unexpected and interesting result and may

indicate that non-leukodepleted RBC transfusion causes a higher consumption of this soluble

ligant. Moreover, leukocyte-containing RBC transfusion is associated with an early inflammatory

65

response followed by an anti-inflammatory response in trauma surgery patients and the reduction

in sCD40L level, after transfusion, may predict an anti-inflammatory effect.

Acknowledgments; We would like to thank Mrs Tereza Sueko Salles, Mrs Maria Helena Medola

and Dr. João Agostinho Machado-Neto for their important technical teachings. We would also like

to thank Dr Patricia Favaro for her valuable comments and Mrs Raquel Foglio for English review.

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68

Figure and legends:

Figure 1. : The cytokine interleukin (IL)-6, (IL)-10 and soluble (s)CD40L concentrations (pg/ml) in

patients measured preoperatively (pre op), at the end of surgery and after 6 hours. The

comparisons are made between patients who received blood transfusion and patients who did not

receive blood transfusion during surgery. Results are presented as median and 95% confidence

interval.

0 2 6

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T im e p o in ts

IL6

(p

g/m

L)

N o n -tra n s fu s e d g ro u p

T ra n s fu s e d g ro u p

*

0 2 6

0

5 0

1 0 0

1 5 0

3 0 0

T im e p o in ts

sC

D4

0L

(p

g/m

L)


T ra n s fu s e d g ro u p

*

0 2 6

0

5

1 0

5 0

1 0 0

1 5 0

T im e p o in ts

IL1

0 (

pg

/mL

)


T ra n s fu s e d g ro u p*

69

Figure 2. Evidence of transfusion related microchimerism. (A): Amplification plot for sample

collected before transfusion. (B): Amplification plot for sample collected 31 days after transfusion.

The major alleles are DR8 and DR15 (patient’s cells) and the minor allele is DR11 (donor’s cells).

(C): The amplification product of (B) visualized on 4% agarose gel.

A

C

B

70

Table 1

Table 1. Evaluated cytokines

pg/ml

IL-1B 0.26

IL-2 0.37

IL-4 1.73

IL-6 1.61

IL-10 0.19

IL-12p70 0.76

IL-17A 1.73

IL-17F 1.51

IL-21 14.93

IL-22 4.13

IL-23 9.81

IL-25 0.93

IL-31 3.14

IL-33 5.63

IFN-γ 0.79

sCD40L 1.51

TNF-α 1.35

LLOQ = low limit of quantitation

Table 2.

Table 2. Patient characteristcs.

characteristics transfused group (n=15) non-transfused group (n=13) p- Value

age (years) 70 (40-93) 69 (47-89) 0.58a

gender

male 8 (53) 7 (54) 1b

female 7 (47) 6 (46)

weight (Kg) 69 (50-98) 70 (50-101) 0.91a

height (m) 1.67 (1.52-1.80) 1.60 (1.49-1.80) 0.39a

orthopedic surgery

hip arthroplasty 9 (60) 7 (54) 1b

proximal femur fracture 6 (40) 6 (46)

duration of surgery (hours) 4 (2-6,5) 3.5(2.3-5.16) 0.38b

Hb preop (g/dl) 11.8 (8.2-14.9) 12.7 (11-15.6) 0.069b

Data are reported as number (%) or median (range). a Wilcoxon rank sun test b Fisher’s exact test

71

Table 3. Inflammatory Markers measured at three time points: preoperatively (preop), end of surgery and 6 hours postoperatively (6hs).

Non- transf preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs

1 3.05 38.82 567.89 0.18 0.18 2,31 93.14 34.72 30.03

2 21.53 74.38 90.44 1.41 1.27 4,93 4.74 23.35 24.03

3 0.83 2.44 13.03 0.32 6.65 0,92 87.69 36.06 5.57

4 * * * 0.73 5.94 5,6 * * *

5 * * * 0.20 0.18 1,01 * * *

6 7.94 92.45 161.80 0.65 2.63 2,21 47.86 73.32 56.58

7 2.68 4.86 58.43 1.55 1.42 0,89 369.76 184.26 259.72

8 15.74 46.17 599.70 0.26 9.22 13,98 3.31 10.39 10.68

9 4.79 1.98 12.92 0.46 0.24 1 18.44 55.52 19.66

10 1.42 7.8 56.01 0.34 18.76 2,34 114.55 318.68 287.43

11 0.90 4.48 181.26 0.18 0.38 2,35 10.80 8.65 7.44

12 22.81 37.64 75.01 0.78 6.17 4,43 10.68 13.87 13.63

13 0.86 0.33 3.53 1.19 1.24 2,08 235.18 187.58 137.36

median 3.05 (0.83-22.81) 7.80 (0.33-92.45) 75.01 (3.53-599.70) 0.48 (0.18-1.55) 1.42 (0.18-18.76) 2.31 (0.89-13.98) 47.86 (3.31-369-76) 36.06 (8.65-318.68) 24.03 (5.57-287.43)

Transf preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs preop end of surgery 6hs

1 9.93 * 154.45 1.04 * 5.15 57.25 * 145.07

2 2.81 5.76 14.31 0.27 1.37 6.65 3.53 4.96 22.79

3 3.15 97.89 368.16 0.56 2.62 101.10 61.47 28.33 14.58

4 12.81 80.59 28.90 0.18 1.33 2.47 7.04 0.90 25.39

5 4.66 20.71 37.05 0.47 11.22 1.72 147.15 22.73 26.76

6 46.21 * 209.41 1.13 * 101.39 25.33 * 1.00

7 2.71 267.61 577.44 1.16 29.53 7.70 161.94 51.94 51.54

8 14.85 91.05 420.02 0.46 1.08 7.35 3.58 10.74 22.54

9 17.25 250.86 99.17 0.50 0.79 2.17 10.68 6.14 2.40

10 8.22 18.10 423.59 0.49 0.92 10.13 0 0 0

11 5.35 498.90 421.04 0.61 7.98 3.24 12.27 53.59 27.33

12 1.94 78.12 * 0.18 1.30 * 34.98 8.24 *

13 16.62 11.01 120.12 0.52 0.89 2.42 209.09 30.28 19.60

14 0.80 * 12.31 2.49 * 1.88 54.86 * 527.33

15 4.72 9.50 135.61 2.32 0.99 14.85 162.63 11.38 16.56

median 5.35 (0.80-46.21) 79.36 (5.76-498.90) 145.03 (12.31-577.44) 0.52 (0.18-2.49) 1.31(0.79-29.53) 5.90 (1.72-101.39) 34.98 (0-209.09) 11.06 (0-53.59) 22.66 (0-527.33)

IL-6 IL-10 sCD40L

* = not measured, non-transf = non-transfused group, Transf = transfused group

72

Table 4

Table 4. Characteristics of patient with and without evidence of transfusion related

microchimerism.

characteristics Microchimerism (n=13) No microchimerism (n=2) p- Value

Age (years) 77 (40-89) 72,5 (70-75) 0,80a

male patients 8 (61) 1 (50) 1b

weight (Kg) 69 (50-98) 69,5 (65-74) 1a

height (m) 1,67 (1,52-1,80) 1,57 (1,49-1,65) 0,27a

orthopedic surgery

hip arthroplasty 9 (69) 0 0,14b

proximal femur fracture 4 (31) 2 (100)

duration of surgery (hours) 4.16 (2-6.5) 3.38 (3.25-3.5) 0.20a

Hb preop (g/dl) 12.3 (8.2-14.9) 11.4 (11-11.8) 0.57a

intraoperative transfusion

yes 11 (85) 1 (50) 0.37b

no 2 (15) 1 (50)

Units of PRBCs transfused 3 (1-8) 3 (2-4) 0.86a

time from last transfusion to blood sampling (days) 14 (5-30) 13 (12-14) 0.80a

Data are reported as number (%) or median (range). PRBCs, packed red blood cells. a Wilcoxon rank sun test. b Fisher’s exact test

Table 5

Table 5. Significative correlations between biomarkers of patients with and without transfusion.

Transfused group (n=15) IL-10 preop IL-10 end surg IL-10 posop sCD40L preop sCD40L end surg sCD40L posop

IL-6 preop r = -0.098 r = -0.200

IL-6 end of sutgery r = 0.350 r = 0.434

IL-6 6hs posop r = 0.609* r = -0.231

IL-10 preop r = 0.536*

IL-10 end surg r = 0.469

IL-10 posop r = -0.512

non-transfused group (n=13) IL-10 preop IL-10 end surg IL-10 posop sCD40L preop sCD40L end surg sCD40L posop

IL-6 preop r = 0.251 r = -0.664*

IL-6 end of sutgery r = 0.255 r = -0.291

IL-6 6hs posop r = 0.636* r = -0.264

IL-10 preop r = 0.228

IL-10 end surg r = 0.136

IL-10 posop r = -0.264

Preop = preoperative, end surg = end of surgery, posop = 6 hs of postoperative.

r = Spearman’s rank correlation coefficient . * p< 0,05

73

Anexo II

MARIANA MUNARI MAGNUS -...

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