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MARIANA BARROS FRANCO DE ANDRADE VILÉLA

ESTRESSE OXIDATIVO EM Prochilodus lineatus EXPOSTOS AO CHUMBO

Londrina – Paraná

2007

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MARIANA BARROS FRANCO DE ANDRADE VILÉLA


Supervisor de Estágio: Cláudia Bueno dos Reis Martinez

Londrina – Paraná 2007

Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Estadual de Londrina como um dos requisitos à obtenção do

título de Bacharel em Ciências Biológicas.

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BANCA EXAMINADORA

Profª. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez

Universidade Estadual de Londrina

Profª Dra. Estefânia Gastaldello Moreira Universidade Estadual de Londrina

Ms. Lindalva Pereira Maduenho

Universidade Estadual de Londrina

Londrina, 07 de dezembro de 2007

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DEDICATÓRIA

A todos que durante este ano

me auxiliaram de alguma forma e

tornaram meus dias mais felizes...

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pela persistência, orientação e pelo grande aprendizado proporcionado por mais essa experiência. À minha orientadora, Profª. Dra. Cláudia Bueno dos Reis Martinez por sua dedicação, paciência, sensibilidade e apoio ao longo desta jornada. À Profa. Dra. Estefânia Gastaldello Moreira e a Mestre Lindalva Pereira Maduenho que fizeram parte da banca examinadora deste trabalho, pelas correções, críticas e sugestões. À Káthya, pelas explicações e companhia na hora dos ensaios e ainda nos passeios ao shopping. A todos que fazem parte do LEFA, que de alguma forma contribuíram para o meu crescimento e me deram apoio. A meus pais, que mesmo com todas as dificuldades não pouparam esforços para me educar e oferecer as condições necessárias para que eu estudasse, aos quais devo, em grande parte, o que hoje sou. À minha irmã Liliam, pela companhia nos momentos mais difíceis. Ao Gui, pelo seu jeitinho terno que me acalma. Ao Lucas, pela paciência, compreensão e principalmente pela companhia, te amo muito! À Cássia, Véssia e á Ericka, que juntas dividimos não só a nossa casa, mas as alegrias e tristezas. Ao tio Paulo, que mesmo distante também me auxiliou com valiosos conselhos e ainda me proporcionou o estudo de inglês que foi muito útil nesse trabalho. À Luciana Festti, minha grande amiga, que me confortou durante todo esse tempo via e-mails, e faz muita falta aqui do meu lado. Companheira de trabalhos, exames, risadas e muitas decisões acertadas, essencial durante toda a faculdade. A todos os meus amigos e familiares que acreditaram que eu era capaz. Aos funcionários da Estação de Piscicultura (EPUEL), pelo fornecimento dos peixes. E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para esta dissertação tornar-se realidade, MUITO OBRIGADA!

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“Hoje em dia, o ser humano apenas tem ante si três grandes problemas que foram ironicamente provocados por ele próprio:

a super povoação, o desaparecimento dos recursos naturais e a destruição do meio ambiente. Triunfar sobre estes problemas, visto sermos nós a sua causa, deveria ser a nossa mais profunda

motivação.” Jacques Yves Cousteau

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RESUMO

ESTRESSE OXIDATIVO NO PEIXE Prochilodus lineatus APÓS EXPOSIÇÃO AGUDA AO CHUMBO.

Mariana Barros Franco de Andrade Viléla

Devido às diversas ocorrências de contaminação de ambientes aquáticos com chumbo, este trabalho foi desenvolvido com Prochilodus lineatus, peixe de hábito alimentar detritívoro, que pode ser contaminado por metais que se acumulam no sedimento. Assim, foram feitos testes de toxicidade estáticos agudos para avaliar os possíveis efeitos do chumbo em parâmetros de estresse oxidativo da espécie de peixe neotropical P. lineatus. Peixes jovens foram expostos a 0,5 ppm de chumbo dissolvido (EXP) ou apenas à água (CTR) durante 6, 24 e 96h em aquários de vidro de 100L com uma média de sete peixes em cada. Os experimentos foram feitos com réplica. Após exposição os peixes foram anestesiados com benzocaína e mortos por secção medular para retirada do cérebro, músculo e fígado. Os órgãos foram congelados a –80º C para análises posteriores. Foram determinadas as atividades das enzimas acetilcolinesterase, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST), as concentrações de glutationa reduzida (GSH), metalotioneína e a lipoperoxidação (ensaio FOX). Após 6 horas de exposição ao Pb, a CAT, GSH e a MET aumentaram significativamente, enquanto a GPx, GST e FOX apresentaram tendência ao aumento. Em 24 h os peixes apresentaram decréscimo significativo na atividade da GST e tendência de redução da CAT e GSH, acompanhadas de aumento significativo da GPx e MET, e tendência da FOX. E no tempo de 96 horas, houve decréscimo significativo da GST, a GSH e a FOX apresentaram aumento significativo e a CAT, GPx e MET também tiveram uma tendência a aumentar. A acetilcolinesterase apresentou uma diminuição significativa em todos os tempos experimentais. Esses resultados indicam que o Pb na concentração testada agiu como anti-colinesterásico; promoveu a ativação das defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas; inibição da enzima de conjugação GST, provavelmente devido ao uso da GSH na associação com o Pb; aumentou a peroxidação lipídica, sugerindo que houve danos ao fígado do animal e as defesas antioxidantes não foram suficientes para evitar o estresse oxidativo. Palavras-chave: chumbo, estresse oxidativo, fígado, Prochilodus lineatus.

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SUMÁRIO

Pág.

1. INTRODUÇÃO

1.1 Contaminação ambiental 01

1.2 Toxicologia aquática 02

1.3 Exposição ao xenobiótico 03

1.4 Chumbo 07

1.5 Prochilodus lineatus 09

1.6 Biomarcadores 10

2. OBJETIVOS 17

3. ARTIGO: Estresse oxidativo em Prochilodus Lineatus expostos ao chumbo 18

Resumo 19

Introdução 20

Materiais e Métodos 22

Resultados 26

Discussão 32

Conclusão 37

Referências Bibliográficas 38

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS 43

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1. INTRODUÇÃO

1.1 Contaminação ambiental

Grande parte dos estudos do século XXI baseia-se principalmente na

problemática dos recursos hídricos em nível nacional e internacional. A água é

indispensável para a sustentação da vida e o que vem ocorrendo é a degradação da

sua qualidade, ressaltando a contaminação química pela agricultura e também por

indústrias. Segundo Heath (1995) a poluição aquática consiste na adição à água de

qualquer substância que altere sua composição química, temperatura ou

composição microbiológica.

Os efluentes gerados a partir de atividades industriais, muitas vezes contém

metais pesados que contaminam as águas. As principais fontes de contaminação

com metais derivam de diversas atividades humanas, tais como metalurgia,

mineração, fundição e galvanoplastia, indústrias de couro, gases liberados pela

queima de combustíveis fósseis como a gasolina e a fabricação e descarte de

baterias, entre outros (CHAOUI et al., 1997; JORDÃO et al., 1999; GIMENO-

GARCIA et al., 1996; SCHICKLER & CASPI, 1999). Nas últimas cinco décadas,

foram liberadas na biosfera 22.000 toneladas de cádmio, 939.000 t de cobre,

783.000 t de chumbo e 1.350.000 t de zinco, como produto da industrialização global

(SINGH et al., 2003). Estes contaminantes podem causar efeitos adversos aos

organismos. Além disso, causam prejuízos aos ecossistemas aquáticos, pois tendem

a se acumular na biota aquática.

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1.2 Toxicologia aquática

A avaliação dos efeitos de contaminantes nos ecossistemas aquáticos vem

sendo alvo de várias pesquisas na área da ecotoxicologia. Os peixes estão

representados por mais de 21.000 espécies entre as espécies de água doce e

marinha, e estão presentes em quase todos os ecossistemas aquáticos incluindo os

mais poluídos. Devido à sua capacidade de adaptação às variações ambientais, os

peixes são considerados modelos interessantes para estudos em ecotoxicologia. Em

áreas poluídas, os peixes encontram-se submetidos ao estresse químico que pode

ocasionar alterações em órgãos alvos afetando diferentes sistemas, dentre eles o

sistema imune (BETOULLE, 1998).

Os estudos em toxicologia aquática são qualitativos e quantitativos em

relação aos efeitos tóxicos sobre os organismos aquáticos. Os efeitos tóxicos podem

incluir tanto a letalidade (mortalidade) e efeitos subletais, como alterações no

crescimento, desenvolvimento, reprodução, respostas farmacocinéticas, patologia,

bioquímica, fisiologia e comportamento. Os efeitos podem ser expressos através de

critérios mensuráveis como o número de organismos mortos, alterações no tamanho

e peso, porcentagem de inibição de enzima, incidência de tumor, dentre outros. A

toxicologia aquática também está relacionada com as concentrações ou quantidades

dos agentes químicos que podem ocorrer no ambiente aquático (água, sedimento ou

alimento) (RAND & PETROCELLI, 1985). O efeito tóxico de um composto químico

depende da exposição, da suscetibilidade do organismo, das características

químicas do agente e de fatores ambientais.

A legislação brasileira determina que, quando apropriado, a qualidade dos

ambientes aquáticos pode ser avaliada por indicadores biológicos, utilizando-se

organismos e comunidades aquáticas (CONAMA 357, 2005).

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1.3 Exposição ao xenobiótico

A exposição é o contato entre o organismo e o composto químico, sendo que

os fatores mais importantes relacionados à exposição são: o tipo, duração,

freqüência da exposição e a concentração do agente químico. (RAND &

PETROCELLI, 1985).

Na exposição aguda, os organismos entram em contato com o composto

químico em um evento único ou em eventos múltiplos que ocorrem em pequenos

períodos de tempo, geralmente variando de horas a dias. Nas exposições agudas

onde o agente químico é rapidamente absorvido normalmente os efeitos são

imediatos, embora seja possível a produção de efeitos retardados similares àqueles

resultantes da exposição crônica. Na exposição crônica normalmente os organismos

são expostos a baixas concentrações do agente tóxico que é liberado continuamente

ou com alguma periodicidade em um longo período de tempo (semanas, meses ou

anos). Exposição crônica a compostos químicos pode também induzir a efeitos

rápidos e imediatos, como os efeitos agudos, em adição aos efeitos que se

desenvolvem lentamente (OLIVEIRA et al., 2002).

A freqüência da exposição também afeta o efeito tóxico dos compostos

químicos. Uma exposição aguda a uma única concentração pode resultar em efeito

adverso imediato no organismo, enquanto duas exposições sucessivas cumulativas

iguais à exposição aguda única podem ter efeito pequeno ou nenhum efeito, devido

ao metabolismo (detoxificação) do organismo entre as exposições ou à adaptação

do organismo ao composto (SPRAGUE, 1985).

O efeito tóxico também depende da suscetibilidade dos organismos ao

composto químico. Diferentes espécies possuem suscetibilidades diferentes de

acordo com seu aparato metabólico, de acordo com seus hábitos alimentares, seu

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comportamento, fase de desenvolvimento, dentre outros aspectos. Organismos

estressados em função de exposição prévia a outros tóxicos podem ser mais

suscetíveis aos compostos químicos, cenário comum na realidade dos

ecossistemas, pois normalmente há a presença simultânea de diferentes produtos

(RAND & PETROCELLI, 1985).

As características do composto químico também influenciam grandemente no

efeito tóxico como, por exemplo, sua composição, ou grau de pureza, pois as

impurezas ou contaminantes que são consideravelmente mais tóxicos do que o

agente propriamente dito, podem estar presentes. As propriedades físicas e

químicas como solubilidade, pressão de vapor e pH afetam a biodisponibilidade,

persistência, transformação, e o destino do agente químico no ambiente e também

são fatores importantes nos testes de toxicidade. Existem compostos químicos não

seletivos em seu modo de ação e que provocam efeitos indesejáveis em numerosas

células e tecidos dos organismos aquáticos. Em contraste, há os compostos com

modo de ação seletivo que afetam adversamente apenas um tipo de célula ou

tecido, sendo inofensivo para os demais com os quais esteve em contato direto,

assim, o modo de ação dos compostos químicos também afetam o efeito tóxico

(MALAVOLTA, 1994).

Os fatores ambientais definidos pelas características bióticas e abióticas

também podem alterar o efeito tóxico de compostos químicos no ambiente aquático.

Os fatores bióticos incluem o tipo de organismo (alga, inseto ou peixe), estágio de

desenvolvimento (larva, juvenil, adulto), tamanho, estado nutricional e de saúde,

alterações sazonais no estado fisiológico, sendo que estes fatores bióticos

influenciam a resposta ao poluente de diferentes maneiras. Os fatores abióticos que

podem atuar modificando o efeito tóxico incluem todas as características físicas e

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químicas da água que circunda o organismo vivo, como a temperatura, o pH, o teor

de oxigênio dissolvido na água, a salinidade e a dureza, conteúdo de matéria

orgânica e material particulado em suspensão, a velocidade do fluxo da água, dentre

outros (SPRAGUE, 1985).

Para assegurar sua sobrevivência, os organismos desenvolveram

mecanismos para a proteção de suas células na presença xenobióticos. Estes

envolvem: a absorção, a distribuição, a biotransformação e a excreção das

substâncias estranhas. A absorção em peixes ocorre por várias rotas, incluindo a

alimentação e o transporte direto através das membranas externas, sendo então

distribuídos para as diversas partes do corpo.

A biotransformação (metabolização) geralmente leva à formação de

compostos mais polares, portanto, mais hidrofílicos, conseqüentemente mais

facilmente excretados do que o composto original. O órgão mais comumente

envolvido neste processo é o fígado. O fígado atua na emulsão de gorduras através

da produção da bile, na metabolização de substâncias presentes na corrente

sanguínea e produção de vários compostos, como por exemplo, proteínas

(LIVINGSTONE, 1998; VAN DER OOST, 2003).

A biotransformação geralmente envolve dois estágios distintos, referidos

como reações da Fase I e da Fase II. Na Fase I, a biotransformação de xenobióticos

ocorre através de reações de redução, hidrólise e/ou oxidação, sendo responsáveis

por introduzir grupos funcionais no xenobiótico. A principal reação é a oxidação,

catalisada principalmente pelo citocromo P-450 monooxigenase, pelas monoamino

oxidases (MAO) e pelas flavinas monooxigenase (FMO) (LIVINGSTONE, 1998).

Além disso, em múltiplas reações metabólicas de transferência de elétrons em

células aeróbicas são formadas espécies reativas de oxigênio (ERO). Estas

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espécies reativas também podem resultar do metabolismo de certos xenobióticos e

causam peroxidação de lipídios, alterações em proteínas e em ácidos nucléicos,

produzindo danos às células. A proteção contra estas ERO é feita pelas enzimas,

catalase, GST, glutationa peroxidase e enzimas de reparo do DNA. Em geral, o

aumento da polaridade da molécula leva à perda do potencial tóxico do composto

sendo biotransformado, levando a desintoxicação. Porém, em alguns casos, pode

ocorrer a ativação metabólica da molécula e o xenobiótico pode ser convertido em

um produto com maior potencial tóxico (bioativação).

A longo prazo, de acordo com o agente estressor e tempo de exposição,

estas alterações podem gerar, por exemplo, redução na capacidade reprodutiva ou

tolerância aos fatores de estresse. A contaminação do animal ocorre através da

superfície respiratória branquial, responsável pela absorção direta de substâncias

presentes na água, ou através da ingestão de água e alimento contaminado,

podendo comprometer assim o funcionamento de brânquias, trato gastrointestinal,

fígado e rins. Em geral, os compostos tóxicos acabam gerando uma resposta

integrada, envolvendo diversos sistemas e a liberação de várias substâncias para

conter ou minimizar os efeitos tóxicos no metabolismo. Perturbações internas no

organismo dos peixes, como resultado de alterações do ambiente, geram respostas

compensatórias que, se não forem suficientes podem levar à morte do animal

(KENNEDY & FARRELL, 2005; MARTÍNEZ-ÁLVAREZ et al., 2002).

Adicionalmente, o metabolismo de compostos tóxicos freqüentemente resulta

na formação EROs e, quando a taxa de formação de ERO é excessiva, acaba

superando a capacidade fisiológica dos organismos de eliminá-las ou anulá-las,

criando a situação de estresse oxidativo. Esse processo pode também ser definido

como o reflexo do desequilíbrio existente entre a produção e a remoção destes

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produtos oxidantes. Quando os mecanismos de defesa do animal, responsáveis pela

remoção destes compostos são inadequados ou insuficientes, aumentam o nível de

estresse oxidativo de tecidos animais, com dano às suas macromoléculas, o que

pode até acarretar a morte (CAZENAVE et al., 2006; GUERREIRO et al., 2002;

HERMES-LIMA & ZENTENO-SAVÍN, 2002; MARTÍNEZ-ÁLVAREZ et al., 2002).

Para combater essas espécies reativas de oxigênio existe um sistema de

defesa antioxidante, que utiliza mecanismos enzimáticos e não-enzimáticos.

(STOREY, 1996; VAN DER OOST et al., 2003).

1.4 Chumbo

O chumbo é um metal cinza-azulado de peso atômico 207.19, ponto de fusão

327.502° C e ponto de ebulição 1740° C (IPCS, 1995).

Este metal era conhecido pelos antigos egípcios, que devido ao seu baixo

ponto de fusão, durabilidade e facilidade em formar ligas metálicas era utilizado na

fabricação de armas, adornos e utensílios. Os antigos romanos usavam o chumbo

para fabricar manilhas, e alguns compostos do metal já eram usados na fabricação

de cosméticos e de tintas (MELLOR, 1967).

O chumbo é considerado um contaminante ambiental e as concentrações no

meio ambiente cresceram de acordo com o aumento do seu uso industrial. Com o

advento da Revolução Industrial, as concentrações de chumbo no meio ambiente

elevaram-se de forma alarmante, principalmente devido à introdução de compostos

orgânicos de chumbo (chumbo tetraetila) como aditivo para gasolina, mas em alguns

países, incluindo o Brasil, o uso se tornou restrito (WHO, 1995).

E nos últimos anos a demanda de chumbo tem sofrido uma mudança quanto

ao tipo de utilização. Seu emprego em aditivos para gasolina e tintas tem diminuído

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bastante, porém existe um aumento significativo nos processos industriais. Usa-se o

chumbo na fabricação de canos, revestimentos, cabos elétricos, chapas para pias,

cisternas e telhados, na indústria de acumuladores, e outros.

O chumbo é tóxico para toda a biota aquática, e, embora não seja

considerado um dos metais de maior mobilidade no meio ambiente, ainda há

evidências consideráveis mostrando a biodisponibilidade de chumbo associado a

sedimentos para espécies que se alimentam de depósitos (BRYAN & LANGSTON,

1992).

Além disso, o chumbo pode ser acumulado diretamente de águas salgadas e

doces, especialmente em organismos filtradores que utilizam as brânquias como a

principal rota de ingestão de nutrientes. Estudos toxicológicos apontaram efeitos

subletais em peixes, incluindo mudanças na morfologia, no metabolismo e em

atividades enzimáticas. O comportamento de esquiva (comportamento através do

qual alguns animais aquáticos são capazes de evitar áreas com concentrações

anormais de substâncias nocivas) também foi observado em peixes adultos

expostos a níveis que variam de 10 a 100 mg.L-1 (SADIQ, 1992; WHO, 1989).

A legislação brasileira (CONAMA, 1989) admitia um valor máximo permitido

de 0,5 mg de chumbo total por litro de água. Após uma revisão, este valor foi

reduzido para 0,01 mg.L-1, com adequação ao valor proposto pela Organização

Mundial de Saúde (CONAMA 357, 2005).

Um estudo conduzido por Yabe & Oliveira (1998) aponta a presença de

metais em rios de Londrina-PR. No local mais crítico, onde eram descartados os

efluentes da fábrica de baterias, encontrou-se um valor máximo de 4,5 mg de

chumbo por litro de água.

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A exposição ao chumbo é perigosa uma vez que se trata de um poluente

acumulável, e, mesmo em concentrações relativamente baixas, o chumbo está

associado a alterações no desempenho das enzimas, transferência de energia e

outros processos bioquímicos (RAND et al., 1995).

A presença desse poluente no ambiente aquático pode causar letalidade em

massa nas populações aquáticas ou causar diversos efeitos em todos os níveis da

organização biológica, desde o subcelular e orgânico até níveis de comunidade e

ecossistema. Isso porque as concentrações subletais podem causar alterações no

organismo que comprometem a estrutura dos tecidos, o comportamento, o

crescimento, o desenvolvimento e a reprodução, e isso pode comprometer também

as comunidades e ecossistema aquático (JOBLING, 1995; RAND et al., 1995).

1.5 Prochilodus lineatus

O curimba (Prochilodus lineatus), um peixe de região neotropical, pertencente

à ordem Characiformes, família Prochilodontidae é considerado uma das espécies

mais abundantes e importantes da região Sul e Sudeste do Brasil, sendo bastante

utilizado na alimentação humana. São encontrados ainda na Bacia Amazônica,

Araguaia-Tocantins, Prata, São Francisco, açudes do Nordeste, onde foram

introduzidos.

São peixes de escamas, e a principal característica da família é a boca

protrátil em forma de ventosa, com lábios carnosos, sobre os quais estão

implantados numerosos dentes diminutos dispostos em fileiras. As escamas são

ásperas e a coloração é prateada. Pode alcançar de 30 a 80 cm de comprimento

total. Realizam longas migrações reprodutivas. São capturados em grandes

10

cardumes, sendo espécies importantes comercialmente, principalmente para as

populações de baixa renda.

Este peixe demonstra elevada tolerância a variações de temperatura e de pH,

apresentando um ótimo potencial para a piscicultura. Entretanto, devido ao hábito

alimentar detritívoro a chance de serem contaminados por metais que se acumulam

nos sedimentos é grande (BARRINUEVO e FERNANDES, 1995; MARTINEZ et al.,

2006; TAKASUSUKI et al., 2004).

Essa espécie é muito sensível, não sobrevive em locais poluídos e por isso

pode ser considerada como espécie bioindicadora da qualidade do ambiente.

Possui, ainda, uma biologia bastante conhecida, sendo utilizada em muitos trabalhos

da área.

Figura 1: Exemplar jovem de Prochilodus lineatus

1.6 Biomarcadores

A utilização de alguns parâmetros fisiológicos e morfológicos pode ser uma

ferramenta bastante útil para a avaliação dos efeitos da contaminação ambiental nas

populações de peixes. Vários são os parâmetros biológicos que podem ser alterados

como conseqüência da interação entre o agente químico e o organismo; entretanto,

a determinação quantitativa desses parâmetros pode ser usada como biomarcador

somente se existir uma correlação com a intensidade da exposição e/ou com o efeito

1 cm

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biológico da substância. Estes biomarcadores são excelentes ferramentas para

monitorar a saúde do ecossistema aquático e têm sido incluídos em vários

programas modernos de monitoramento ambiental de países desenvolvidos. O uso

de biomarcadores bioquímicos em programas de monitoramento oferece algumas

vantagens porque são normalmente os primeiros a serem detectados, são bastante

sensíveis à presença de determinados poluentes, apresentam alta especificidade,

possuem baixo custo de análise e fornecem informações a respeito do efeito

metabólico causado pelo xenobiótico (AMORIM, 2003; STEGEMAN et al., 1992;

WALKER et al., 1996).

Os aspectos comuns entre organismos diferentes se acentuam principalmente

ao nível molecular e, por isso, biomarcadores moleculares possuem a vantagem de

poderem ser aplicados a uma ampla variedade de organismos vivos. Estes tipos de

biomarcadores são de grande importância como sinalizadores iniciais da exposição

aos contaminantes e de seus efeitos, sobretudo antes que as populações e

comunidades, e até mesmo todo o ecossistema, sejam afetados ou encontrem-se

comprometidos (LAMA & GRAY, 2003).

Quando um xenobiótico entra no organismo, no caso dos peixes de água

doce, mais comumente pelas brânquias, este é transportado via sanguínea até os

órgãos, onde são armazenados ou metabolizados para sua eliminação. Como a

maioria dos xenobióticos tem propriedade lipofílica, possuem grande capacidade de

atravessar as membranas biológicas, podendo causar danos aos componentes

celulares. O organismo tem duas maneiras principais de eliminar um composto

xenobiótico, ou pode excretá-lo em sua forma original ou pode ocorrer a

biotransformação, que geralmente leva à formação de compostos mais hidrofílicos

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que são mais facilmente eliminados pelo organismo (JOBLING, 1995; MARTINEZ,

2006; VAN DER OOST et al., 2003).

O fígado é considerado um órgão-alvo e de grande importância para os

peixes, pois participa dos processos de biotransformação e eliminação de

xenobióticos e, por isso, pode ser utilizado em biomonitoramentos devido à sua alta

sensibilidade a poluentes (HINTON et al., 1992; MYERS et al., 1998; THOPHON et

al., 2003).

O processo de metabolização de xenobióticos é uma importante fonte de

espécies reativas de oxigênio, que correspondem aos produtos da redução do

oxigênio molecular, como o ânion radical superóxido (O2-●), o radical hidroxil (OH●) e

o peróxido de hidrogênio (H2O2). As espécies reativas de oxigênio passam a ter um

efeito prejudicial ao organismo quando ocorre um aumento excessivo na sua

produção ou diminuição de agentes antioxidantes. Em qualquer uma dessas

situações predomina EROS no organismo, o que é denominado estresse oxidativo.

Essa situação pode derivar tanto de fatores internos como de fatores externos

(STEGEMAN et al., 1992).

Para combater essas espécies reativas de oxigênio existe um sistema de

defesa antioxidante, composto por mecanismos enzimáticos e não-enzimáticos. As

principais enzimas antioxidantes são superóxido dismutase (SOD), a catalase e a

glutationa peroxidase (GPx), todas elas abundantes nos tecidos de peixes

(STOREY, 1996; VAN DER OOST et al., 2003).

A catalase descrita em 1901 por Loew (FRUGOLI et al., 1996), é uma enzima

tetramérica que contém grupos heme e é encontrada em todos os organismos vivos.

A CAT é a única entre as enzimas degradantes de H2O2 que não consome

equivalentes redutores celulares e possui um mecanismo muito eficiente para

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remover o H2O2 formado nas células sob condições de estresse (MALLICK &

MOHN, 2000). Ocorrem primariamente nos peroxissomos e a proliferação

peroxissômica é a principal causa para a elevação da atividade catalásica nos

tecidos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2005).

A glutationa peroxidase (GPx), é a principal peroxidase de peixes, uma

enzima citosólica tetramérica, dependente de selênio, que emprega a glutationa

reduzida (GSH) como co-fator. A GPx catalisa o metabolismo de um grande número

de hidroperóxidos orgânicos (ROOH) e do H202 para água, envolvendo a oxidação

concomitante da GSH para sua forma oxidada (GSSG). A GPx pode estar localizada

no citosol, bem como na matriz mitocondrial, e divide com a catalase a habilidade

para detoxificar o H2O2 (MARTINEZ, 2006).

A enzima glutationa-S-transferase (GST) desempenha um papel importante

na detoxificação e eliminação de compostos eletrofílicos, incluindo agroquímicos.

Sua estimulação envolve reações de conjugação na presença de glutationa. Assim,

animais aquáticos que habitam ambientes poluídos podem estar expostos a

xenobióticos os quais sofrem detoxificação mediada pela glutationa na sua forma

reduzida, catalisada pela enzima GST. Esta enzima de biotransformação tem sido

estudada em trabalhos de campo no monitoramento de poluentes de origem

industrial e agrícola (CHO et al., 1999; FENET et al., 1998; KANTONIEMI et al.,

1996).

A GSH está envolvida em várias funções fisiológicas: mantém os grupos SH

das proteínas no estado reduzido, participa no transporte de aminoácidos e

detoxificação de toxinas, atua enzimaticamente degradando peróxidos endógenos,

forma moléculas bioativas e atua como coenzima em várias reações enzimáticas

(STAMLER & SLIVKA, 1996). A GSH participa ainda na decomposição do H2O2,

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potencialmente tóxico, que é convertido em H2O em reação catalisada pela GPx, às

custas da glutationa reduzida; a glutationa oxidada resultante é reciclada à forma

reduzida pela glutationa redutase e NADPH (GUL et al., 2000). O NADPH é

regenerado pela via das pentoses fosfato, em reação catalisada pela glicose 6-

fosfato desidrogenase, a qual é particularmente importante nos eritrócitos. Dessa

forma, este processo de reciclagem e a manutenção de níveis adequados de GSH

podem prevenir o dano celular causado pelo estresse oxidativo (STAMLER &

SLIVKA, 1996).

Nos vertebrados é bastante conhecido o fato de que a exposição a metais

induz a síntese nos tecidos do animal, de um tipo particular de proteína, as

metalotioneínas (MTs). As MTs compreendem uma família de proteínas de baixo

peso molecular, ricas em cisteína que tem como propriedades fundamentais a

detoxificação de metais, proteção celular contra a citotoxidade da radiação ionizante

e captura de radicais livres. Estas proteínas possuem uma elevada afinidade por

íons metálicos dos grupos IB e IIB da tabela periódica, especialmente Zn e Cu. Sua

função principal está relacionada com a regulação das concentrações intracelulares

de metais-traço essenciais. Servem como reserva intracelular destes íons para o

metabolismo de ácidos nucléicos, síntese de proteínas e outros processos

metabólicos (CANLI et al., 1997).

A peroxidação lipídica é um processo fisiológico regular, pois possui um

importante papel na manutenção celular e mobilização de lipídeos (FEUSSNER et

al., 1995 e 2001; MATSUI et al., 1997; SCHEWE et al., 1986; VAN LEYEN et al.,

1998). Porém, determinadas classes de contaminantes podem conduzir a efeitos

deletérios que podem resultar no mau funcionamento celular, destruição da função

das membranas celulares e organelas essenciais tais como o processo de

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transporte, a manutenção de gradiente de metabólitos e íons e a transdução de

sinais mediada por receptores, com conseqüentes modificações estruturais dos

complexos lipoprotéicos das membranas celulares (BAKER & KRAMER, 1999;

BENZIE, 1996; GIROTTI, 1998; KOZAR et al., 1994; MASON et al., 1997;

MEAGHER & FITZGERALD, 2000; SEVANIAN & URSINI, 2000).

Durante a lipoperoxidação os grupos hidroperóxidos ligam-se aos sítios

hidrofóbicos dos ácidos graxos insaturados, tendo este processo uma dupla

conseqüência: perturbação nas interações lipídicas, que levam às alterações

estruturais das biomembranas e das lipoproteínas; e a formação de espécies

reativas de oxigênio, que podem induzir a modificação secundária de outros

constituintes da membrana (GIROTTI, 2002).

Estas espécies reativas de oxigênio, produzidas em sistemas biológicos, são

detoxificadas por mecanismos antioxidantes do organismo. Estes são encontrados

com freqüência em organismos aquáticos (LIVINGSTONE, 1991; LIVINGSTONE et

al., 1992; AVCI et al., 2005). A peroxidação lipídica apresenta expressivas respostas

frente a danos oxidativos, possuindo também estreita correlação com dados

genéticos.

A acetilcolinesterase (AChE) é um outro biomarcador que pode ser utilizado

para a avaliação da contaminação ambiental. Esta enzima catalisa a clivagem do

neurotransmissor acetilcolina nas sinapses colinérgicas bloqueando a propagação

contínua do impulso nervoso. Vários são os agentes anticolinesterásicos

conhecidos, mas sua inibição é diretamente ligada às ações tóxicas de

organofosforados e carbamatos, praguicidas largamente utilizados em atividades

agrícolas e campanhas de saúde pública. A ação tóxica de alguns compostos inibe a

atividade de acetilcolinesterase (HUGGETT et al., 1992).

16

Os parâmetros bioquímicos como as enzimas de biotransformação, os

antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos e os danos oxidativos podem ser

utilizados como biomarcadores em peixes, pois fornecem importantes informações a

respeito da capacidade de defesa destes organismos, bem como a capacidade de

metabolização de compostos tóxicos. Entretanto, é importante que seja feita uma

análise conjunta desses parâmetros para uma melhor interpretação dos resultados.

17

2. OBJETIVOS

● Analisar as possíveis alterações bioquímicas e fisiológicas em Prochilodus

lineatus submetidos a uma concentração subletal de chumbo em testes de

toxicidade aguda.

18

3. ARTIGO

ESTRESSE OXIDATIVO EM Prochilodus lineatus EXPOSTOS AO

CHUMBO

Viléla, M.B.F. de A; Ribeiro, A. M. e Martinez, C.B.R.

19


Viléla, M.B.F. de A; Ribeiro, A. M. e Martinez, C.B.R.

Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual de Londrina. Correspondência para: Mariana Barros F. de A. Viléla, Depto de Ciências Fisiológicas,

Universidade Estadual de Londrina, C.P. 6001, CEP 86051-990, Londrina, PR. e-mail: [email protected]

RESUMO

A exposição de peixes aos contaminantes em ecossistemas aquáticos pode aumentar a formação intracelular de espécies reativas ao oxigênio (EROs). Mas possuem um sistema de defesa antioxidante, responsável por combater essas EROs. As enzimas antioxidantes têm um papel crucial na manutenção da homeostase celular, e sua indução reflete uma resposta específica aos poluentes. O presente estudo investigou os efeitos do chumbo em Prochilodus lineatus. Os animais foram expostos a uma concentração subletal de 0,5 ppm de chumbo dissolvido, durante 6, 24 e 96 horas. Foram determinadas as atividades das enzimas acetilcolinesterase muscular e cerebral, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST) no fígado, as concentrações de glutationa reduzida (GSH), metalotioneína (MET) e a lipoperoxidação (ensaio FOX). Após 6 horas de exposição ao Pb, a CAT, GSH e a MET aumentaram significativamente, enquanto a GPx, GST e FOX apresentaram tendência ao aumento. Em 24 h os peixes apresentaram decréscimo significativo na atividade da GST e tendência de redução da CAT e GSH, acompanhadas de aumento significativo da GPx e MET, e tendência da FOX. E no tempo de 96 horas, houve decréscimo significativo da GST, a GSH e a FOX apresentaram aumento significativo e a CAT, GPx e MET também tiveram uma tendência a aumentar. A acetilcolinesterase apresentou uma diminuição significativa em todos os tempos experimentais. Esses resultados indicam que o Pb na concentração testada agiu como anti-colinesterásico; promoveu a ativação das defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas; inibição da enzima de conjugação GST, provavelmente devido ao uso da GSH na associação com o Pb; aumentou a peroxidação lipídica, sugerindo que houve danos ao fígado do animal e as defesas antioxidantes não foram suficientes para evitar o estresse oxidativo. Palavras-chave: chumbo, Prochilodus lineatus, estresse oxidativo, fígado.

20

INTRODUÇÃO

A água é indispensável para a sustentação da vida e o que vem ocorrendo é

a degradação da sua qualidade, ressaltando a contaminação química pela

agricultura e também por indústrias. Os efluentes gerados a partir de atividades

industriais, muitas vezes contêm metais pesados que contaminam o ambiente. Estes

contaminantes podem causar efeitos adversos aos organismos e, além disso,

causam prejuízos aos ecossistemas aquáticos, pois tendem a se acumular na biota

aquática (WHO, 1987).

A exposição ao chumbo é perigosa uma vez que se trata de um poluente

acumulável, e mesmo que em doses relativamente baixas, o chumbo está associado

a alterações na atividade das enzimas, transferência de energia e outros processos

bioquímicos (RAND et al., 1995).

Os biomarcadores nos níveis mais baixos da organização biológica, como os

bioquímicos, fisiológicos e histológicos, têm sido considerados como medidas viáveis

de alterações biológicas em virtude da presença de agentes estressores. Esses

biomarcadores podem permitir uma avaliação rápida do estado de saúde do

organismo (HUGGETT et al., 1992).

Nesse contexto, a toxicologia aquática, ciência que estuda os efeitos dos

compostos químicos produzidos pelo homem sobre os organismos aquáticos, pode

ser uma ferramenta bastante útil para avaliação de impactos de poluentes sobre a

biota aquática (LOMBARDI, 2004; RAND et al., 1995).

O curimba (Prochilodus lineatus), um peixe de região neotropical, é

considerado uma das espécies mais abundantes e importantes da região Sul e

Sudeste do Brasil, sendo bastante utilizado na alimentação humana. Este peixe

21

demonstra elevada tolerância a variações de temperatura e de pH, apresentando um

ótimo potencial para a piscicultura. Entretanto, devido ao hábito alimentar detritívoro

a chance de serem contaminados por metais que se acumulam nos sedimentos é

grande (BARRINUEVO & FERNANDES, 1995; MARTINEZ et al., 2006;

TAKASUSUKI et al., 2004).

Os efeitos dos contaminantes em peixes podem se manifestar em vários

níveis de organização biológica, incluindo disfunções fisiológicas, alterações

estruturais em órgãos e tecidos e modificações comportamentais que levam ao

prejuízo do crescimento e reprodução (ADAMS, 1990). Os aspectos comuns entre

organismos diferentes se acentuam principalmente ao nível molecular e, por isso,

biomarcadores moleculares possuem a vantagem de poderem ser aplicados a uma

ampla variedade de organismos vivos. Estes tipos de biomarcadores são de grande

importância como sinalizadores iniciais da exposição aos contaminantes e de seus

efeitos (LAMA & GRAY, 2003).

A absorção de metais, pose se dar diretamente através da água ou

indiretamente através da cadeia alimentar (BENTLEY, 1992; HAMILTON et al.,

1998). Nos peixes, as brânquias são alvos de metais, mas estes também podem ser

absorvidos pelo trato gastrointestinal e pele (WATANABE et al., 1997; SCHLENK &

BENSON, 2001).

O fígado é considerado um órgão-alvo e de grande importância para os

peixes, pois participa dos processos de biotransformação e excreção de

xenobióticos e por isso pode ser utilizado em biomonitoramentos devido a sua alta

sensibilidade a poluentes. Alterações em sua estrutura podem ser significativas na

avaliação da saúde de peixes e refletem os efeitos da exposição a uma variedade de

22

poluentes ambientais (HINTON et al., 1992; MYERS et al., 1998; THOPHON et al.,

2003).

Assim, considerando-se as ocorrências de contaminação aquática por

chumbo, como por exemplo, o estudo conduzido por Yabe & Oliveira (1998) em que

encontraram concentrações de até 4,5 mg.L-1 em Londrina-PR, onde eram

descartados os efluentes da fábrica de baterias, e por conseqüência a exposição

dos peixes ao xenobiótico, torna-se necessário a realização de testes de toxicidade

para avaliação do efeito toxicológico desse metal. Portanto, esse trabalho visou

avaliar as possíveis alterações bioquímicas e fisiológicas de Prochilodus lineatus,

após exposição aguda a concentração subletal de chumbo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Organismo-teste

Os experimentos foram realizados com exemplares jovens de Prochilodus

lineatus (VALENCIENNES, 1847), com massa corpórea de 9,26 ± 3,22 g e

comprimento total de 9,71 ± 1,10 cm (média ± DP), fornecidos pela Estação de

Piscicultura da Universidade Estadual de Londrina (EPUEL). No laboratório os

animais foram aclimatados em tanques de 300 litros durante uma semana, com água

desclorada e aeração constante, alimentados em intervalos de 48 horas com ração

comercial peletizada, sendo esta suspensa 24h antes do início da amostragem.

Parâmetros como temperatura, pH, condutividade, oxigênio e fotoperíodo de 12/12

claro/escuro foram observados durante todo o período de aclimatação e exposição.

23

Testes de toxicidade

Depois da aclimatação os peixes foram submetidos a testes de toxicidade

estáticos agudos de 6, 24 e 96h. Os animais foram transferidos para aquários de

100 litros e divididos em dois grupos, o controle, com água limpa, e o experimental,

que recebe uma concentração de 4 gramas de nitrato de chumbo, o que

corresponde a 0,5 mg.L-1 de chumbo dissolvido. Cada aquário apresentou uma

média de 7 animais, obedecendo a proporção de 1 grama de peixe por litro de água.

Após os experimentos amostras de água foram coletadas para a

quantificação da concentração de chumbo, por espectrofotometria de absorção

atômica. Amostras de água filtrada (filtro com poro de 45 µm) foram utilizadas para a

determinação da concentração de chumbo dissolvido, que corresponde à fração do

metal que está livre na água, disponível para o peixe. Amostras não filtradas foram

utilizadas para a análise da concentração de chumbo total, que corresponde à

concentração total do metal, incluindo o chumbo que está complexado com outros

compostos.

Amostragem

Após a retirada dos peixes dos aquários, foram anestesiados imediatamente

com benzocaína (0,1 g.L-1). Na amostragem os animais foram medidos

(comprimento total e padrão) e pesados, e então mortos por secção medular para

retirada do cérebro, músculo e fígado, e as amostras congeladas a - 80 C até o

momento do ensaio.

Análise de parâmetros de estresse oxidativo

24

As amostras de fígado congeladas a -80ºC foram utilizadas para

determinação das atividades das enzimas catalase (CAT), glutationa peroxidase

(GPx) e glutationa-S-transferase (GST), para a determinação das concentrações de

glutationa reduzida (GSH) e metalotioneína e para a quantificação da

lipoperoxidação (ensaio FOX). Os órgãos foram pesados e homogeneizados com

mini-homogeneizador TE-103 em 4000 rpm por cerca de 1 minuto, em tampão

fosfato 0,1 M e pH 7,0 (10 vezes o volume), e então centrifugados, durante 20

minutos a 4°C e 12.000 g. O sobrenadante foi separado para as análises

enzimáticas.

A atividade da catalase foi determinada de acordo com a técnica descrita por

Beutler (1975), seguindo-se a velocidade de decomposição do peróxido de

hidrogênio, sendo fornecido um tampão para catalase com pH 8,0 e o meio de

reação. A leitura da absorbância foi feita em 240 nm, e a atividade foi expressa em

µmol.min-1.mg de proteína hepática-1.

A atividade da glutationa-S-transferase (GST) foi determinada de acordo com

a metodologia descrita por Keen et al., (1976), seguindo-se a complexação da

glutationa reduzida (GSH) com o 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CNDB), em 340 nm e

expressa em nmol.min-1.mg de proteína hepática-1.

A GPx foi determinada de acordo com a técnica de Nakamura (1984), através

da oxidação do NADPH + H+ em presença de peróxido, em 340 nm. Ou seja, a GPx

dismuta o H2O2 do ensaio, gerando para isso uma ponte de dissulfeto entre duas

GSH (GS-GS), que por sua vez volta ao estado reduzido (2 GSH), pela ação da

glutationa redutase (GR). A GR age mediante a oxidação de NADPH. Assim, o

ensaio é uma medida que consiste em registrar a diminuição de NADPH. Expressa

em nmol.min-1.mg de proteína hepática-1.

25

A lipoperoxidação foi determinada utilizando-se o ensaio FOX (JIANG et al.,

1991), que corresponde à reação química de auto oxidação de lipídios (LH) que

conduz a lipoperoxidação (LOOH). O ensaio FOX está baseado na oxidação do Fe

(II) por LOOH em pH ácido na presença de um pigmento complexador de Fe (III), o

xilenol laranja. A formação deste complexo pode ser quantificada pelo aumento da

absorção em 560 nm e expressa em µM CHP (hidroperóxido de cumeno) por mg de

proteína hepática.

O princípio para medida da GSH corresponde à reação da glutationa com o

DNTB, formando um tiolato (TNB) de cor amarelada, quanto maior a presença de

GSH, mais acentuada a cor. Leitura em 412 nm e expressa em nmol.mg de proteína

hepática-1.

A concentração das metalotioneínas foi estimada através da concentração de

grupamentos sulfidrilas (VIARENGO et al., 1997). O fígado foi homogeneizado em

tampão TRIS-HCL 20 mM com pH 8,6, contendo sacarose 0,5M e ß-mercaptoetanol

0,01%, e centrifugado a 12000 g por 20 minutos a 4º C. A concentração de

metalotioneína foi quantificada espectrofotometricamente utilizando-se o reagente de

Ellman (NaCl 2M, DTNB 0,43M em tampão fosfato 0,2M e pH 8,0) em 412 nm e

expressa em µM GSH de proteína hepática-1.

A concentração de proteínas do sobrenadante foi determinada de acordo com

o método descrito por Lowry et al. (1951), para expressar a atividade das enzimas. A

leitura foi feita em 700 nm, utilizando-se como padrão protéico albumina sérica

bovina.

Análise da atividade de acetilcolinesterase muscular e cerebral

26

As amostras de músculo e cérebro foram homogeneizadas em tampão fosfato

com pH 7,5 e centrifugadas a 10.000 g a 4ºC, durante 20 minutos, para a

determinação da atividade da acetilcolinesterase e de proteína cerebral e muscular.

A atividade da acetilcolinesterase foi determinada de acordo com a técnica de Silva

de Assis (1998), modificada de Ellman et al., (1961), a partir da reação de iodeto de

acetilcolina com o reagente de cor ditionitrobenzoato (DTNB), em leitora de

microplacas a 415 nm, e expressa em nmol.min-1.mg de proteína-1. A concentração

da proteína foi determinada de acordo com Lowry et al. (1951).

Análises estatísticas

Os grupos experimentais foram comparados com seus respectivos controles

empregando-se testes estatísticos apropriados. Foram considerados significativos

valores de P ≤ 0,05.

RESULTADOS

Análise da água

Os parâmetros físico-químicos da água se mantiveram estáveis durante os

experimentos. Os valores médios (média ± DP) foram: Temperatura 23,02 ± 2,1 ºC;

pH 7,41 ± 0,22; OD 7,05 ± 0,61 mg O2.L-1; condutividade 63,55 ± 7,3 µS.cm-1. Nos

aquários experimentais, a concentração média de chumbo total foi de 2,25 mg.L-1, e

a de chumbo dissolvido, 0,5 mg.L-1. Enquanto que nos controles foi menor que 0,1

mg.L-1.

27

Parâmetros de estresse oxidativo

Os exemplares de Prochilodus lineatus expostos à concentração de 0,5 ppm

de chumbo dissolvido apresentaram aumento significativo na atividade hepática da

enzima catalase no tempo experimental de 6h, quando comparado com o grupo

controle (Fig.1). Já a glutationa-S-transferase (GST) apresentou uma diminuição

significativa nos tempos de 24 e 96h (Fig.2) enquanto a glutationa peroxidase (GPx)

aumentou significativamente em 24h (Fig.3). Dentre os antioxidantes não

enzimáticos, a concentração hepática de glutationa reduzida (GSH) aumentou

significativamente após 6 e 96h (Fig. 4) e a de metalotioneína hepática apresentou

um aumento significativo após 6 e 24h de exposição ao metal. (Fig.5).

CAT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.min

-1.m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 1: Atividade hepática da enzima catalase (CAT) de Prochilodus lineatus expostos a

concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP) ou apenas a água (CTL), por 6, 24 e 96 horas.

As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão (n=7). * indica diferença

significativa em relação ao grupo controle (P≤0,05).

*

28

Figura 2: Atividade hepática da enzima glutationa-S-transferase de Prochilodus lineatus

expostos a concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP) ou apenas a água (CTL), por 6, 24 e

96 horas. As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão (n=7). * indica

diferença significativa em relação ao grupo controle (P≤0,05).

GPx

0

20

40

60

80

100

120

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.min

-1.m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 3: Atividade hepática da enzima glutationa peroxidase (GPx) de Prochilodus lineatus

expostos a concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP) ou apenas a água (CTL), por 6, 24 e



GST

0

10

20

30

40

50

60

70

80

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.min

-1.m

g proteína-1

CTL EXP

*

*

*

29

GSH

0

5

10

15

20

25

30

35

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.mg proteína-1

CTL EXP

Figura 4: Concentração hepática de glutationa reduzida (GSH) de Prochilodus lineatus

expostos à concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP) ou apenas a água (CTL), por 6, 24 e



Metalotioneína

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

6h 24h 96h

TEMPO

uM GSH.m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 5: Concentração hepática de metalotioneína de Prochilodus lineatus expostos a




* *

*

*

30

Lipoperoxidação

A concentração de lipoperóxidos no fígado de P. lineatus expostos ao

chumbo, estimada pelo ensaio FOX e expressa pela concentração de hidroperóxido

de cumeno (CHP), apresentou aumento significativo após 96 h de exposição.

FOX

0

20

40

60

80

100

120

140

6h 24h 96h

TEMPO

uM CHP/m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 6: Concentração de lipoperóxidos no fígado de Prochilodus lineatus expostos à




Atividade da enzima acetilcolinesterase em músculo e cérebro

A atividade da acetilcolinesterase muscular foi significativamente menor nos

curimbas expostos ao chumbo, em todos os tempos experimentais (6, 24 e 96 h)

quando comparados aos seus respectivos grupos controles (Fig.7). Entretanto, para

atividade da acetilcolinesterase cerebral não foram detectadas diferenças entre os

animais do grupo controle e aqueles expostos ao chumbo (Fig.8).

*

31

Acetilcolinesterase

0

20

40

60

80

100

120

140

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.min

-1.m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 7: Valores médios da atividade da acetilcolinesterase em músculo de Prochilodus

lineatus expostos a concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP), ou apenas a água (CTL),

por 6, 24 e 96 horas. As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão

(n=7). * indica diferença significativa em relação ao grupo controle (P≤0,05).

.

Acetilcolinesterase

0

10

20

30

40

50

60

70

6h 24h 96h

TEMPO

nmol.min-1.m

g proteína-1

CTL EXP

Figura 8: Valores médios da atividade da acetilcolinesterase em cérebro de Prochilodus

lineatus expostos a concentração de 0,5 ppm de chumbo (EXP), ou apenas a água (CTL),

por 6, 24 e 96 horas. As barras representam as médias e as linhas verticais o erro padrão

(n=7). * indica diferença significativa em relação ao grupo controle (P≤0,05).

* * *

32

DISCUSSÃO

As avaliações bioquímicas são ferramentas utilizadas para se verificar o

estado geral de um organismo (MCGEER et al., 2000; ROMÉO et al., 2000). No

presente estudo os parâmetros avaliados foram as atividades das enzimas

acetilcolinesterase, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-

transferase (GST), as concentrações de glutationa reduzida (GSH), metalotioneína e

de lipoperóxidos (ensaio FOX). Os parâmetros analisados mostraram-se de uma

maneira geral bastante sensíveis a presença do chumbo na água.

A catalase é uma hemeproteína que fica nos peroxissomos e catalisa a

redução do H2O2 a H2O e O2. É encontrada no sangue, medula óssea, mucosas, rim

e fígado. A suplementação de catalase exógena previne a oxidação da GSH

mediada pelo H2O2, em eritrócitos humanos normais, e também inibe as lesões

oxidativas do DNA (MAYES, 1990; SCOTT et al., 1991). Nesse trabalho a catalase

apresentou um aumento significativo em 6 horas, o que supõe o esforço do animal

para combater o peróxido de hidrogênio produzido em função da presença do

chumbo.

O aumento da atividade específica da CAT tem sido relatado como indicador

de estresse oxidativo. O estresse oxidativo encontrado é resultado da tentativa da

célula em eliminar espécies reativas de oxigênio, formadas na metabolização de

diversos compostos químicos, através de enzimas específicas tais como a catalase

e enzimas desidrogenases como as glutationas. A indução da catalase sugere uma

defesa do organismo frente a agentes oxidantes, pois é uma enzima chave para

remover peróxido de hidrogênio e evitar a formação de radicais hidroxil que podem

33

causar danos celulares. (GIULIO et al., 1989; REGOLI et al., 2000; STURVE et al.,

2005, STURVE et al., 2006; VAN DER OOST et al., 2003).

Aumento na atividade da CAT também foi evidenciado no mexilhão de água

doce (Dreissena polymorpha) coletados no Rio Sena, e no mexilhão marinho

(Mytilus edulis) na Baía Sena, França, em locais contaminados por metais Pb, Cd,

Hg e Ni. Outros estudos também já demonstraram o aumento da atividade da CAT

decorrente da exposição à metais (GRAVATO et al., 2006; HANSEN et al., 2006; LIU

& KUEH, 2005; ROCHER et al., 2006).

Além da CAT, a GPx também catalisa a redução do peróxido de hidrogênio

(H2O2), como também de peróxidos orgânicos para seus correspondentes alcoóis às

custas da conversão da GSH a GSSG. A GPx tem ação fundamentalmente

citosólica. O aumento significativo dessa enzima no fígado dos peixes após 24 h de

exposição ao chumbo deve estar relacionado com o combate ao peróxido de

hidrogênio, já que a catalase neste tempo não esteve aumentada, e também a

possível metabolização de peróxidos orgânicos (HEBELL, 1986; SHAN et al., 1990).

A GSH está presente na maioria das células e é o tiol mais abundante no

meio intracelular. Sua capacidade redutora é determinada pelo grupamento -SH,

presente na cisteína. A GSH pode ser considerada um dos agentes mais

importantes do sistema de defesa antioxidante da célula, protegendo-a contra lesões

resultantes da exposição a agentes oxidantes como íons ferro, oxigênio hiperbárico,

radiação e luz ultravioleta. Além disto, participa da detoxificação de agentes

químicos e da eliminação de produtos da lipoperoxidação e é requerida para a

síntese de DNA, de proteínas e de algumas prostaglandinas. No presente trabalho, o

aumento significativo da GSH nos tempos experimentais de 6 e 96 horas indicam o

aumento da proteção do organismo contra o estresse oxidativo (DENEKE et al.,

34

1989; GALLEANO & PUNTARULO, 1994; MEISTER et al., 1983). Além disto, após a

entrada de metais nas células esses tendem a ser complexados com compostos de

baixo peso molecular, como o tripeptídeo glutationa (GSH), de modo a inibir ou

reduzir suas ações deletérias (GIULIO et al., 1989).

A GST é considerada uma importante enzima de desintoxicação, por

metabolizar grande variedade de compostos xenobióticos orgânicos, por meio da

conjugação destes com a glutationa reduzida (GSH), formando substâncias de baixa

toxicidade. No presente trabalho, o chumbo promoveu inibição da enzima desta

enzima de conjugação após 24 e 96 horas de exposição, provavelmente devido ao

uso da GSH na associação com o chumbo, quando o metal entra na célula do

animal.

A indução de metalotioneínas em organismos aquáticos após exposição a

metais pesados é um fato bem documentado (CANLI et al., 1997). E comprovado

com este trabalho, onde ocorreu um aumento significativo nos tempos de 6 e 24

horas. Após a entrada do chumbo na célula hepática o metal deve ter se

complexado com a metalotionéina existente, e ainda estimulado a transcrição de

genes específicos para a produção de mais metalotioneína.

A enzima acetilcolinesterase tem se mostrado sensível a alguns tipos de

contaminantes, como praguicidas, metais, produtos originados da combustão de

hidrocarbonetos e detergentes, que contem amônia terciária e quaternária, entre

outros. Neste trabalho verificou-se que curimbas expostos ao chumbo apresentaram

diminuição significativa na atividade muscular da acetilcolinesterase em todos os

tempos experimentais, indicando a ação inibitória da acetilcolinesterase pelo metal.

A inibição da AChE por poluentes tem sido amplamente estudada e já foi

considerada um biomarcador específico para carbamatos e organofosforados (OP),

35

porém outros estudos tem indicado que outras substâncias como metais pesados,

organoclorados e PAHs também podem vir a inibí-la, mas a concentração

necessária para promover este efeito é relativamente mais alta. Essa inibição

causada pelo anticolinesterásicos pode ser reversível ou irreversível. Compostos

organofosforados, por exemplo, formam um complexo inibidor enzimático muito

estável e que não sofre dissociação espontânea significativa, e desta forma, a

enzima fica permanentemente fosforilada e a recuperação de sua atividade depende

da síntese de nova enzima (AKAISHI et al., 2004; GOODMAN & GILMAN, 1996;

MARTINEZ-TABCHE et al., 1997; PAYNE et al., 1996; RANGE & DALE, 2000;

STURM et al., 1999).

A AChE é muito importante à manutenção e equilíbrio da transmissão de

estímulos nervosos, pois catalisa a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina, que é

transformado em colina e acetato que reage com uma molécula de água e produz

ácido acético, e por fim a enzima é reativada e a fração colina é prontamente

reabsorvida por um processo de transporte sódio-dependente. Quando a atividade

da AChE é inibida ocorre um bloqueio na transmissão dos impulsos nervosos, o que

pode paralisar algumas funções vitais do organismo (ADAMS, 1990; BEYERS &

SIKOSKI, 1994; HABIG & DI GIULIO, 1991; KLEMZ, 2002; STENESH, 1998).

Estudos indicam que a relação entre a inibição da acetilcolinesterase cerebral e

muscular é específica para cada espécie, podendo o animal apresentar igual, maior

ou menor sensibilidade entre estes tecidos (FULTON & KEY, 2001).

Além disto, a inibição da atividade da acetilcolinesterase no músculo pode

estar associada ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio no

organismo, em função de um aumento da demanda energética, e, portanto aumento

do metabolismo energético. Isto se justifica pelo fato de que, com a inibição da

36

acetilcolinesterase, o animal gasta mais energia devido a manifestações como

hiperestesia, espasmos intermitentes e tremores musculares e o aumento da

demanda de oxigênio, em função do gasto energético devido à ação colinérgica,

pode levar ao estresse oxidativo.

Considerando-se de forma conjunta todos os resultados obtidos neste

trabalho, pode-se propor um modelo ainda bastante preliminar para a ação do

chumbo em células hepáticas de Prochilodus lineatus (Fig.9): após entrar nas

células do organismo, o chumbo associou-se a moléculas de baixo peso molecular,

como as proteínas metalotioneínas, ou o tripeptídeo GSH, que tornam o metal

inativo. O Pb também deve ter induzido o aumento da produção da MET para

combater os efeitos desse metal. Porém, a quantidade do metal foi maior do que a

proteção dada pela MET e GSH, e o deve ter interferido na cadeia respiratória da

mitocôndria, levando ao aumento da produção do ânion superóxido (O2●), que é

muito tóxico para a célula e pode se transformar em radical hidroxil (HO●), que é

ainda mais nocivo. O peróxido de hidrogênio, resultante da ação da SOD, foi

quebrado em água e oxigênio através da ação das enzimas catalase e GPx, que

apresentaram aumento significativo no fígado dos peixes expostos ao chumbo. A

diminuição significativa da GST deve estar relacionada com a utilização da GSH

para a associação inicial com o metal. A inibição da acetilcolinesterase muscular

também deve ter contribuído para a geração de mais EROs. Entretanto, apesar da

ativação das defesas antioxidantes do animal, houve o aumento da lipoperoxidação

no fígado. Isto demonstra que nos animais expostos à concentração de chumbo

testada (0,5 mg de chumbo dissolvido por litro de água) as defesas antioxidantes

foram insuficientes para prevenir a ocorrência de lesões oxidativas, resultando no

estresse oxidativo.

37

Figura 9: Modelo explicativo sobre a ação do chumbo nas células hepáticas de Prochilodus

lineatus. Ver texto para explicações.

CONCLUSÕES

• O chumbo na concentração testada inibiu a acetilcolinesterase muscular o

que pode ter contribuído para o aumento da geração de EROs no organismo.

• Promoveu a ativação das defesas antioxidantes enzimáticas (CAT e GPx) e

não-enzimáticas (GSH e MT);

• Promoveu a inibição da enzima de conjugação GST, provavelmente

associada ao uso da GSH na associação com o Pb;

• Aumentou a peroxidação lipídica no fígado, indicando a ocorrência de danos

oxidativos provavelmente porque as defesas antioxidantes não foram

suficientes para evitar os efeitos das EROS.

Pb

MT +

O2- H2O2 +

SOD

H2O + O2

CAT

GPx

2GSH

GSSH

GST

AChE

+

HO•

-

-

PUFA

Peroxidação lipídica

Pb

38

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