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MARIA APARECIDA SOARES MURÇA

CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS RÁPIDO E TRADICIONAL DE DISCO-DIFUSÃO NA AVALIAÇÃO DE

SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS DE HEMOCULTURAS DA SANTA CASA DE SÃO PAULO

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde

São Paulo

2007

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

MARIA APARECIDA SOARES MURÇA

CORRELAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS RÁPIDO E

TRADICIONAL DE DISCO-DIFUSÃO NA AVALIAÇÃO DE SUSCEPTIBILIDADE DE ISOLADOS DE HEMOCULTURAS

DA SANTA CASA DE SÃO PAULO

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde

Orientadora:

Profa. Dra. Lycia Mara Jenné Mimica

Co-orientadora: Profa. Dra. Suely Mitoi Ykko Ueda

São Paulo

2007

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Murça, Maria Aparecida Soares Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemocultura do Hospital Central da Santa Casa de São Paulo./ Maria Aparecida Soares Murça. São Paulo, 2007.

Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de pós-graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Lycia Mara Jenne Mimica Co-Orientador: Suely Mitoi Ykko Ueda 1. Resistência bacteriana a drogas 2. Coleta de amostras

sangüíneas/normas 3. Técnicas bacteriológicas 4. Testes de sensibilidade microbiana 5. Sangue/microbiologia

BC-FCMSCSP/34-07

Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo

MURÇA MAS

DEDICATÓRIA

À minha mãe, Milda Soares Murça, por seu amor, compreensão e,

sobretudo pelo incentivo e apoio que me fortalecem e tornam tudo possível.

Ao meu pai, Geraldo Rocha Murça, in memoriam, pelo exemplo e

determinação.

Aos meus filhos: Carolina Murça e Gabriel Murça, companheiros fiéis e

inseparáveis, especialmente nos momentos de solidão.

A vocês, todo o meu amor e carinho!!!!

Aos meus irmãos, cunhados e sobrinhos por acreditarem em mim.

A Carlos Roberto Ribeiro, pelo amor, compreensão, paciência e incentivo a

cada dia.


MURÇA MAS

AGRADECIMENTOS

Á Deus, por sua inspiração.

À Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São

Paulo e Irmandade da Santa de Misericórdia de São Paulo, pelo auxílio na minha

formação.

À Profa. Dra. Lycia Mara Jenné Mimica, pela acolhida, dedicação, paciência

e oportunidades proporcionadas no decorrer deste trabalho.

À co-orientadora Profa. Dra. Suely Mitoi Ykko Ueda, pelo estímulo e auxílio

criterioso na execução de todas as etapas deste estudo.

Ao Prof. Dr. Igor Mimica Mimica, pelo apoio e conhecimento compartilhado

ao longo deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Waldemar Francisco, pelo carinho e apoio inestimável no

direcionamento e finalização deste estudo.

À Profª. Dra. Marinês Dalla Valle Martino, pelo convívio instrutivo,

cooperação e apoio em tantas situações.

Ao amigo Dr. Thiago Zinsly Sampaio Camargo pela colaboração e auxílio

imediato nos momentos de dificuldade.

Ao Mestre Dr. Bezerra de Menezes, pelo exemplo de dedicação, resignação

e perseverança.

À Profª. Dra. Rozane de Lima B. Carvalho, por sua amizade e presteza ao

longo desta jornada.

Ao Dr. Wilmar Silvino que, gentilmente, cedeu parte do seu tempo para que

este estudo pudesse ser realizado.


MURÇA MAS

Aos Prof. Drs. Carmem Lúcia Penteado Lancellotti e Flávio Alterthum,

da banca examinadora de qualificação, pela atenção e apoio.

À Cely Barreto da Silva, minha profunda gratidão pelo entusiasmo,

dedicação e disponibilidade. Sua valiosa colaboração foi imprescindível para a

realização deste estudo.

À Srta. Sadia Mustafá Hussein, pela atenção e auxílio na pesquisa

bibliográfica.

À Secretária Geral do Curso de Pós-Graduação: Rita de Cássia Santos Oliveira e Mirtes Dias Souza, Curso de Ciências da Saúde, e Celina Casagrande Federico, pela atenção e informações oferecidas.

Aos estagiários do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo e do Serviço de Controle de Infecção

Hospitalar da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo: Dálete Paulini Repker, Denise Yamamoto, Elaine Barros Ingrid Petschulat, Juliana Ferraz Rosa, Roberta Canuto do Rego Monteiro, Samira Geraldo, Vanessa da Silva, meus sinceros agradecimentos no apoio para realizar este estudo.

À equipe de enfermagem do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar

Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo: Adenilde Andrade, Hiroko Sato Pizzo, Maria Helena Nogueira, Mirian Varanda, Tereza Carboni, Valéria Cândido e Verônica O.S. Brito, pelo apoio com que sempre contei.

Aos queridos colegas do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de

Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e do Serviço de Controle de

Infecção Hospitalar da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo:

Alessandra Navarini, Carlos José dos Santos, Carlos Henrique Santana, Fátima Aparecida Silva Pinto, Maria Aparecida Silva Gennari, Maura Aparecida Lopes Miranda, Ronaldo de Souza Campos e Susethe Matiko Sassagawa, pela

inestimável contribuição na realização deste estudo, meu especial agradecimento.


MURÇA MAS

À Maria Aparecida Paschoallotti, pelo incentivo e apoio.

A Ting Hui Ching, pela orientação nos dados estatísticos.

À Probac do Brasil, pelo fornecimento de insumos utilizados neste estudo.


MURÇA MAS

LISTAS DE SÍMBOLOS % - porcentagem oC - graus Celsius β - Beta

LISTAS DE ABREVIAÇÕES ATCC – American Type Culture Collection BA - Bact/Alert

BaCl2 - Cloreto de Bário

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

CO2 - Dióxido de Carbono

H2SO4 - Ácido Sulfúrico

HT - Hemobac Trifásico

NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards

PCR - Reação de Polimerase em Cadeia

SCIH - Serviço de Controle de Infecção Hospitalar

SPS - Polianetol-sulfonato de Sódio

TBS - Tryptic soy Broth

UFC - Unidade Formadora de Colônias


MURÇA MAS

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 01

1.1. Revisão da literatura 04

1.1.1. Hemocultura 04

1.1.1.1. Indicação do exame 05

1.1.1.2. Incubação e avaliação das hemocultuas 06

1.1.1.3. Sistema Hemobac Trifásico 07

1.1.2. Teste de susceptibilidade 09

1.1.2.1.Técnica de difusão em meio sólido ou método de disco-difusão ou técnica de Kirby-Bauer

12

1.1.2.2. Resistência aos antibióticos 13

1.1.3. Teste de susceptibilidade rápido 14

2. OBJETIVOS 18

3. CASUÍSTICA E MÉTODO 20

3.1. Identificação da positividade das hemoculturas 21

3.2. Bacterioscopia a partir da coloração de Gram das colônias isoladas 21

3.3. Antibiograma 22

3.4. Análise Estatística 24

4. RESULTADOS 27

4.1. Staphylococcus spp 28

4.2. Enterococcus spp 29

4.3. Enterobactérias 29

4.4. Bacilos Gram Negativos não fermentadores de glicose 30

5. DISCUSSÃO 34

6. CONCLUSÃO 37

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39

RESUMO 44

ABSTRACT 46

APÊNDICE 48


Murça MAS.

1. INTRODUÇÃO


Murça MAS

2

Prioriza-se, cada vez mais, a relação eficácia/tempo, nos Laboratórios de

Microbiologia; isto é, durante a rotina laboratorial, todas as etapas do método são

analisadas, visando à resultados reportados. Portanto, é inevitável a busca por

métodos rápidos, que se mostrem eficazes no diagnóstico e na avaliação de

sensibilidade.

Cada método deve ser considerado de acordo com a condição do paciente e

dos agentes etiológicos potenciais. Dependendo do tipo de microrganismo

envolvido, a liberação de resultados em um tempo menor do que o habitual pode

determinar importante diferença na evolução do paciente, justamente pela indicação

terapêutica precoce.

Em virtude disto, são evidenciados vários métodos capazes de detectar uma

imensa variedade de microrganismos: há bases diagnósticas que possibilitam a

detecção dos mesmos a partir de antígenos tóxicos e não-tóxicos, enzimas,

produção de substratos coloridos e podemos optar pela biologia molecular, que

utiliza sondas genéticas na reação de polimerase em cadeia (PCR). Apesar dos

novos métodos, muitas vezes os procedimentos tradicionais ainda são utilizados, em

razão de seu custo menor.

Um importante processo de detecção de microrganismos muito utilizado, sem

dúvida nenhuma, é a microscopia direta a partir da amostra clínica. A bacterioscopia

pode proporcionar resultados preliminares satisfatórios em determinados casos,

como: Streptococcus pneumoniae ou Neisseria meningitidis, observados em

amostras de líquor, Neisseria gonorrhoeae em uma amostra de secreção uretral,

Clostridium sp em materiais sugestivos de infecção por anaeróbios. As bactérias de

exemplos como estes são facilmente detectadas pela morfologia e coloração

específicas, assim como a pesquisa por microscopia de outros microrganismos

fastidiosos: Mycobacterium tuberculosis e outras micobactérias, como

Mycobacterium leprae a partir da coloração de Ziehl-Neelsen (Isenberg, 1998).

Outro exemplo prático de utilização do método rápido é para o diagnóstico de

infecções urinárias, principalmente quando se refere ao principal agente causador, a

Escherichia coli (Johnson et al, 1995). Na utilização de alguns laminocultivos, foi


Murça MAS

3

observado que a leitura precoce, após 6-8 horas de incubação, tem relação de 100%

com a tradicional incubação de 24 horas ou overnight (Martino, 1998). O teste de

sensibilidade também pode ser realizado diretamente da amostra da urina, com boa

relação com o método padronizado, ou seja, realização do antibiograma antes

mesmo da verificação do crescimento das possíveis colônias e da preparação do

inóculo (Oakes et al, 1994).

Atualmente, dispõe-se de inúmeros métodos rápidos em bacteriologia, porém

há alguns mais dispendiosos, como a citometria de fluxo, que é uma técnica de

medição das propriedades óticas das células individuais, ou de partículas em geral,

em fluxo contínuo, uma de cada vez, seqüencialmente, em frente de um feixe de

laser com sensores para medir fluorescência e dispersão de luz (Sprules et al,

1992). Esta técnica não é somente utilizada para diagnósticos de infecções do trato

urinário, mas tem sido empregada também em testes de sensibilidade para alguns

antimicrobianos (Álvarez-Barrientos et al, 2000).

A presença de microrganismos no sangue de um paciente é um evento de

grande importância diagnóstica e prognóstica. Quando há isolamento de um agente

clinicamente importante nas hemoculturas, não é somente a causa infecciosa para a

doença do paciente que fica estabelecida, mas o agente torna-se disponível para o

teste de susceptibilidade ao antimicrobiano e otimização terapêutica. A necessidade

de identificação do agente etiológico de septicemia resulta em um direcionamento

adequado dos recursos aplicados na qualidade dos laboratórios (Baron, 2005).

Infecção de corrente sanguínea é causa importante de morbidade e

mortalidade; quando se tabulam hemoculturas positivas, sem distinção da síndrome

infecciosa em questão, ocorrem altas taxas de mortalidade, variando de 5% a 40%

(Koneman et al, 2001; Diekema et al, 2004).

A indicação de antibioticoterapia precoce tem demonstrado melhoria no

prognóstico desta infecção. A detecção imediata da infecção da corrente sanguínea,

com identificação microbiana e teste de susceptibilidade exato, assim como a

informação ágil e precisa dos resultados são importantes para a segurança do

paciente (Diekema et al, 2004).


Murça MAS

4

1.1. Revisão da Literatura

1.1.1. Hemocultura Hemocultura é a cultura realizada a partir da amostra proveniente da corrente

circulatória de um paciente, viabilizando o diagnóstico de bacteriemia (presença de

microrganismos na corrente circulatória) e septicemia (disseminação de

microrganismos pela corrente circulatória), com os objetivos de diagnosticar o

agente etiológico, minimizar a antibioticoterapia e detectar bactérias resistentes

(Fréjaville, Kamoun, 1989).

A entrada direta de bactérias e fungos na corrente sanguínea ocorre com

infecções intravasculares, como endocardite infecciosa, fístula arteriovenosa

infectada, aneurismas micóticos, tromboflebite supurativa e colonização de implantes

vasculares (cateter venoso central e periférico, linhas arteriais, ports subcutâneos e

enxertos vasculares, caracterizando bacteriemia e fungemia (Baron, 2005).

O padrão clínico da infecção de corrente sanguínea pode ser transitório,

intermitente ou contínuo. A bacteriemia transitória é a mais comum e ocorre após a

manipulação de tecidos infectados (por exemplo, abscesso, furúnculo e celulite),

instrumentação da superfície de mucosas contaminadas (procedimentos

odontológicos, manipulações urológicas como cistoscopia, dilatação uretral e

cateterização urinária; e procedimentos endoscópicos gastrintestinais superiores e

inferiores), cirurgia envolvendo áreas contaminadas (ressecção transuretral da

próstata, histerectomia vaginal e debridamento de queimaduras infectadas). A

intermitente é freqüentemente associada a abscessos não drenados intra-

abdominais, pélvicos, perianais, hepáticos, prostáticos, entre outros, observando que

os abscessos são causa comum da febre de origem desconhecida, enquanto a

bacteriemia contínua é um aspecto fundamental das infecções intravasculares,

notavelmente, endocardites infecciosas agudas e subagudas (Baron, 2005).

O sangue deve ser colhido antes da administração de terapia antimicrobiana

sistêmica em qualquer paciente que tenha febre (>38°C) ou hipotermia (<36ºC),

leucocitose (principalmente se houver desvio à esquerda), granulocitopenia absoluta


Murça MAS

5

ou uma das combinações acima (Fréjaville, Kamoun, 1989; Baron, 2005). A

positividade decai quando a coleta é realizada no pico febril e nunca deve ser

realizada após este pico, pois a probabilidade de isolamento do agente é quase

nula.

O volume colhido é critico e a mais importante variável individual na

recuperação dos microrganismos de pacientes com infecção da corrente sanguínea,

devendo ser obtido por meio de condições assépticas. A relação direta entre o

resultado diagnóstico da hemocultura e o volume de sangue foi demonstrada em

diversos estudos, comparando os métodos manuais e os semi-automatizados, pois

quando o volume aumentou de 10mL para 20mL, o resultado da cultura positiva

aumentou ao redor de 30%-50% (Baron, 2005). Baseados em dados avaliáveis, a

recomendação do volume de sangue para adulto, por cultura, é de 20 mL-30 mL;

para pacientes pediátricos, o sugerido é de 1mL-5 mL e, em recém-nascidos de

baixo peso e prematuros, o volume possível, pois pode ser impraticável obter o

volume recomendado. O número de frascos varia de 2-4 para uma ótima detecção

da bacteriemia e fungemia, salientando a eventual necessidade do aumento deste

número, quando o paciente recebe terapia antimicrobiana de amplo espectro.

Normalmente o intervalo recomendado entre as amostras é de 30-60 minutos,

exceto em pacientes criticamente sépticos, cujas amostras devem ser obtidas

rapidamente, antes do início da terapia antimicrobiana (Baron, 2005).

Seguindo as técnicas e métodos recomendados, pratica-se o “estado da arte”

para o processamento da hemocultura; entretanto, não há padrão-ouro para o

diagnóstico das infecções da corrente sanguínea (Baron, 2005).

1.1.1.1. Indicações do exame

É um procedimento diagnóstico recomendado em enfermidades febris agudas

graves, em que é indicada a antibioticoterapia empírica de início imediato, ou ainda

em pacientes com doenças infecciosas (osteomielite, artrite supurativa) que serão

submetidos a cirurgias de urgência, com febre de origem desconhecida e

endocardite infecciosa aguda e subaguda (Koneman et al, 2001).


Murça MAS

6

1.1.1.2. Incubação e avaliação das hemoculturas Existem vários sistemas utilizados para o processamento laboratorial

das hemoculturas: sistemas não automatizados ou manuais, semi-automatizados e

automatizados. Nos sistemas automatizados, a positividade das amostras pode ser

obtida por instrumentos que indicam multiplicação bacteriana no frasco onde a

amostra foi incluída (Munson et al, 2003; Paz Oplustil et al, 2004). Nos sistemas não

automatizados, são realizadas subculturas periódicas para a detecção de

microrganismos. As hemoculturas são avaliadas por um período que varia de 5 a

7dias, e liberadas como negativas logo após. Estudos recentes têm mostrado que a

liberação de resultados positivos de hemoculturas de forma precoce e por telefone

tem influenciado a terapêutica antimicrobiana e o resultado final do tratamento

(Munson et al, 2003).

1.1.1.3. Sistema Hemobac Trifásico®

O Hemobac Trifásico® (Probac do Brasil) (Fig. 1) é um sistema destinado à

realização de hemocultura. O sistema é composto por um laminocultivo com três

faces acoplado à parte superior de um recipiente plástico, contendo um caldo

suplementado com extrato de levedura e polianetol-sulfonato de sódio (SPS). As

faces do laminocultivo são: Agar Chocolate, Agar Sabouraud, Agar MacConkey e

Indicador de CO2, que detecta o crescimento de bactérias e fungos.

Figura 1: Hemobac Trifásico Pediátrico (Probac do Brasil, 2005a).


Murça MAS

7

O caldo suplementado (Fase 1) promove o crescimento de microrganismos,

devido à riqueza de nutrientes. O SPS (polianetol sulfonato de sódio) possui efeito

anticoagulante, favorece o cultivo à ação anticomplementar, antifagocitária e

inibitória da atividade antimicrobiana dos aminoglicosídeos e outras drogas que

podem estar presentes no sangue (Fig. 2 e Fig. 3).

Os meios de cultura sólidos (Agar Chocolate, Agar MacConkey e Agar

Sabouraud - Fase 2) permitem o crescimento das bactérias fastidiosas, isolamento

dos bacilos Gram-negativos e fungos, respectivamente, que são agentes produtores

de bacteriemia e fungemia (Fig. 2, Fig. 3). Indicador de CO2 (Fase 3), a viragem da

cor para rosa ocorre pela presença de CO2, produzido pelo microrganismo (Fig. 3).

Figura 2: Hemobac Trifásico Adulto: caldo e vista da lâmina dividida (Agar Sabouraud e Agar McConkey).

Figura 3: Hemobac Trifásico Adulto: caldo e vista da lâmina, face larga (Agar Chocolate e Indicador de CO2).


Murça MAS

8

Os frascos devem ser incubados por 5-7 dias a 35°C ± 2° C, observando

diariamente o aparecimento de colônias e/ou mudança do indicador. Quando

utilizada a estufa para Hemobac Trifásico® (Probac do Brasil, 2005a), que possui

agitação constante e inversão programada para semeadura no laminocultivo, o

procedimento é considerado automatizado e o resultado é analisado em até cinco

dias (Paz Oplustil et al, 2004).

As leituras são realizadas, no mínimo, duas vezes ao dia, e são interpretadas

conforme abaixo:

• Ausência de crescimento ou de alteração do indicador após o período

de incubação proposto: reportar como negativo após o período de leitura (período de

incubação mínimo: cinco dias).

• Presença de crescimento bacteriano nos meios sólidos: abrir o frasco

superior, desrosqueando a tampa com a lâmina, e proceder à identificação das

colônias presentes, trabalhando de forma a assegurar a assepsia do procedimento.

• Mudança da cor do indicador durante o período de incubação: a

presença da coloração rosa forte ou vermelho indica que há crescimento bacteriano

na amostra (alguns microrganismos pouco produtores de CO2 podem apresentar

crescimento no meio sólido, sem mudança no indicador). Se houver variação na cor

do indicador, sem a formação de colônias nos meios sólidos, fazer esfregaço a partir

do meio líquido. Algumas bactérias metabolicamente deficientes podem crescer em

meios líquidos e não nos meios sólidos. Neste caso pode ser observada a mudança

da cor do indicador, sem o aparecimento de colônias no meio sólido.

Trabalho comparativo entre o sistema Hemobac Trifásico (HT) (Probac do

Brasil, 2005a) e o BacT/Alert FAN (BA) (bioMérieux, França) mostrou positividade de

20,20%(n=39) nos frascos BA e 20,72%(n=40) nos frascos HT. As médias para

positividade do indicador de CO2 foram de 27,2h BA e 30,8h HT (p=0,8); para

disponibilidade de colônias viáveis foram de 40,26h BA e 31,78h HT (p<0,05) e o

tempo total decorrido até a liberação da identificação e do teste de susceptibilidade

foi de 56,51h BA e 48,60h HT. Foram isolados: S.aureus (n=20), E.cloacae (n=5),

K.pneumoniae (n=4), P.fluorecens (n=3), C.albicans (n=3), S.marcescens (n=2),

S.pneumoniae (n=1), E.coli (n=1) e K.oxytoca (n=1). Os autores concluíram que os


Murça MAS

9

sistemas analisados apresentam desempenhos semelhantes, em que o Hemobac

Trifásico demonstra disponibilizar precocemente colônias viáveis para a rotina

microbiológica e torna-se alternativa efetiva no diagnóstico microbiológico em

relação ao BacT/Alert, com a vantagem do custo e da produção nacional, além de

menor processamento laboratorial em relação aos métodos manuais, mantendo boa

correlação custo-efetividade para laboratórios que processam diferentes

quantidades de hemoculturas (Garcez Júnior, Martins, 2003).

Kusano et al, 2005, em outro trabalho comparativo entre o sistema Hemobac

Trifásico (Probac do Brasil, 2005a) e o BacT/Alert FAN (bioMérieux, França), com

amostras de hemoculturas provenientes de pacientes de terapia intensiva,

encontraram positividade de 16,3% (n=7), concordância de 100% entre os sistemas,

e concluíram que os sistemas analisados apresentam desempenhos semelhantes. O

BacT/Alert FAN mostra indicar positividade de CO2 precoce e automaticamente para

a posterior semeadura em meios sólidos, enquanto o Hemobac Trifásico mostra

disponibilizar precocemente colônias viáveis para a rotina microbiológica,

necessitando de leitura diária dos frascos em busca de positividade.

1.1.2. Teste de susceptibilidade

O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos ou antibiograma é

habitualmente realizado pela imensa maioria dos laboratórios a partir do método

qualitativo, descrito por Bauer et al, (1966): o método de disco-difusão, que consiste

em testar antimicrobianos impregnados em discos de papel filtro, numa

concentração determinada para cada droga (Fig. 4), é considerado prático, de fácil

execução e idealizado para bactérias de crescimento rápido (Jorgensen, 1997;

Jorgensen, Ferraro, 1998).

Usando o teste de susceptibilidade em disco, a resistência antimicrobiana é

detectada pelo crescimento bacteriano ao seu redor, na placa previamente semeada

com o inóculo do microrganismo em questão (Acar, Goldstein, 1996).


Murça MAS

10

Figura 4: Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de Kirby-Bauer

(Disco-difusão).

Estes discos, contendo uma concentração conhecida do agente

antimicrobiano, são colocados na superfície de uma placa de ágar Mueller-Hinton

recém inoculada com a bactéria a ser testada, onde o antimicrobiano começa

imediatamente a difundir-se e estabelecer um gradiente de concentração ao redor

do disco de papel filtro (Fig. 4). A maior concentração é obtida proximamente ao

disco. Após incubação, a bactéria cresce na superfície da placa, exceto onde o

gradiente de concentração atingido pelo antibiótico ao redor do disco foi suficiente

para inibir seu crescimento. Após incubação, o diâmetro da zona de inibição é

medida ao redor de cada disco, sendo este procedimento relatado em milímetros

(mm) (Acar, Goldstein, 1996).

Neste método, os reagentes são relativamente econômicos, não há

necessidade de equipamentos especiais, além de apresentar grande flexibilidade na

escolha do número e tipo de antimicrobianos a serem testados (Jorgensen, 1997;

Jorgensen, Ferraro, 1998).

No caso da metodologia de Kirby-Bauer, alguns laboratórios de microbiologia,

utilizando método de disco difusão, usam como rotina de 3 a 10 unidades

formadoras de colônias (UFC) suspendidas em 4 mL de meio de cultura líquido, que

é incubado por 2 a 5 horas, esperando o aumento bacteriano moderado, ou seja, o

inóculo pertinente a uma turbidez apropriada. Posteriormente, este é diluído em

água ou solução salina, observando uma densidade equivalente a 0,5 mL de BaCl2


Murça MAS

11

a 1%, adicionada a 99,5 mL de H2SO4 a 1% (Hong et al, 1996). A partir disto, em

uma placa de Petri de 15 cm, com meio Agar Mueller-Hinton de espessura de

aproximadamente 5 mm a 6 mm, com o auxílio de um swab, este inóculo será

semeado em três direções, onde devem ser imediatamente acomodados nove

discos contendo antimicrobianos, com distância de 3 cm, aproximadamente. Após

uma incubação de 24 horas, devem ser medidos os diâmetros dos halos de inibição

e interpretados de acordo com padrões estabelecidos para cada antimicrobiano

(Bauer et al, 1966).

Outros estudos descrevem uma variante do método de Kirby-Bauer, cujas

amostras são provenientes de hemoculturas positivas, com posterior inóculo de

acordo com a escala de 0,5 de McFarland, semeado em placas de Muller Hinton; o

período de incubação, em estufa a 35o C, consiste em 4, 6 e 24 horas. Os resultados

que apresentaram maiores discrepâncias foram, respectivamente, 3,5%, 0,6% e

0,7% em cepas de microrganismos Gram-negativos (Coyle et al, 1984).

A indicação de uma terapia antimicrobiana exige pesquisa de susceptibilidade

aos antibióticos pelas bactérias presumivelmente responsáveis pelas infecções.

Estas deverão ser previamente obtidas em cultura pura e identificadas. Para ganhar

tempo, é sempre recomendável iniciar o teste de sensibilidade assim que se esteja

orientado pela morfologia e afinidades tintoriais da cepa isolada (Fréjaville, Kamoun,

1989).

Para uma dada espécie bacteriana, é possível, em certa medida, prever que

um determinado número de agentes antimicrobianos atuará eficazmente. Todavia,

dentro da mesma espécie, diferentes cepas podem apresentar resistência a outros

agentes, resistência essa que não cessa de evoluir, tornando indispensável o estudo

da sensibilidade in vitro (Fréjaville, Kamoun, 1989).

Sendo conhecida a natureza do agente infeccioso, os clínicos dispõem de

uma gama de exames, muitos de execução trabalhosa, para prescrever o

antimicrobiano, levando em consideração a etiologia e a gravidade da infecção

(Fréjaville, Kamoun, 1989).


Murça MAS

12

1.1.2.1. Técnica de difusão em meio sólido ou método de disco-difusão ou técnica de Kirby-Bauer

Na prática, o antibiograma é realizado por técnica de difusão em meio com

ágar, a partir de uma fonte antibiótica: alguns discos de papel-filtro impregnados com

diferentes antibióticos são colocados sobre a superfície de uma placa de Petri com

Agar Mueller Hinton semeada com a bactéria em cultura pura. Quando o antibiótico

é inibidor, forma-se um halo sem crescimento bacteriano em torno do disco,

tornando-se zona de inibição, e cujo diâmetro é medido (Bauer, 1966). Essa técnica,

baseada na possibilidade de difusão do antibiótico em meio de ágar, é menos

utilizável para os antibióticos de difusão reduzida (Fréjaville, Kamoun, 1989).

Nem por meio dessa técnica, nem pelas que serão descritas a seguir, procura-

se reproduzir um meio biológico tal como pode existir no homem, mas trabalha-se

em condições artificiais e reprodutíveis que permitem, como demonstra a

experiência, uma extrapolação dos resultados in vitro e sua aplicação in vivo. Essas

condições foram codificadas por Ericsson, Sherris (1971) e devem ser respeitadas

por todos os laboratórios. Elas dizem respeito, principalmente: ao tempo de

observação do crescimento das bactérias (16 a 24 horas); à densidade do inóculo e

sua fase de crescimento; à composição do meio nutritivo: pH, sais, líquidos, glicídios,

proteínas, tendo como referência o Mueller-Hinton (Fréjaville, Kamoun, 1989).

O resultado final é dado sob a forma de uma planilha que comporta, para cada

antibiótico, uma interpretação qualitativa (a cepa pode ser: sensível (S),

intermediária (I) ou resistente (R) ao antibiótico) (Fréjaville, Kamoun, 1989).

A leitura do antibiograma efetuado pelo método de difusão permite observar a

bacteriostase e fornece informações de ordem qualitativa. Uma cepa resistente a um

antibiótico será indiferente à sua ação, para qualquer forma de tratamento; uma

cepa sensível deverá, em princípio, ter sua multiplicação contida por uma dose

conveniente administrada por via geral; é preciso que o antibiótico seja escolhido em

função do órgão infectado e possa atingir ali um nível eficaz. Se a resposta for

intermediária, o antibiótico pode ser usado com eficiência para tratar de infecções

em órgãos com elevada taxa de concentração do antibiótico sob forma ativa; o


Murça MAS

13

antibiótico também pode ser usado em doses superiores às habitualmente usadas,

porém, nesse caso, é preferível fazer uma medição da concentração inibidora

mínima (CIM em µg/ml) (Fréjaville, Kamoun, 1989).

1.1.2.2. Resistência aos antibióticos

Os diâmetros dos halos de inibição são relacionados com as concentrações

inibitórias mínimas (CIM), obtidas por diluição em caldo ou ágar e, por regressão

linear analítica, podemos relacionar o tamanho destas zonas com a CIM

propriamente dita, apesar de este não ser um recurso bastante aplicado, até

questionado por alguns microbiologistas. A determinação por métodos quantitativos

e não qualitativos constitui método padrão para real determinação da CIM dos

antimicrobianos (Acar, Goldstein, 1996; Brooks et al, 2000).

Em virtude disto as cepas a serem consideradas podem ser classificadas

como: resistentes, intermediárias ou sensíveis. Mesmo que este procedimento seja

questionado por alguns microbiologistas, ainda é aplicado nas rotinas laboratoriais,

determinando resultados satisfatórios. Em relação aos métodos qualitativos, no

caso, disco-difusão (Método de Kirby-Bauer), o fator determinante dos diâmetros dos

halos de inibição é conhecido como tempo crítico, que consiste no tempo que o

microrganismo necessita para obter sua massa celular ideal, ou seja, mesmo com a

difusão do antimicrobiano, a mesma continuará, proporcionando assim o

aparecimento do halo, determinando a eficácia do mesmo. Isso sugere que leituras

precoces podem corresponder àquelas obtidas após incubação prolongada, em que

leituras após 5-8 horas mostraram-se bastante confiáveis. (Doern et al, 1994; Acar,

Goldstein, 1996).

Mediante estas informações, um método rápido (5 horas), o que é uma

variante da metodologia de Kirby-Bauer, consiste em: pré-incubação das placas a

37o C, antes da inoculação; turbidez do inóculo ajustada para o padrão de 1,0 na

escala de McFarland, ao invés de 0,5, sem uma pré-incubação e leitura após 5 horas

de incubação. Com a utilização destas modificações, os resultados obtidos com

Enterobactérias, cocos Gram positivos e Pseudomonas spp em termos de

sensibilidade e resistência mostraram porcentagem de concordância entre estes


Murça MAS

14

resultados obtidos em relação ao método padrão de 98,9%, 98,7% e 97,9%,

respectivamente. Apesar de os diâmetros dos halos de inibição medidos até 5 horas

serem menores que aqueles conseguidos após incubação overnight, a classificação

final em termos de sensibilidade ou resistência não foi afetada. (Kluge, 1975; Hong

et al, 1996).

1.1.3. Teste de susceptibilidade rápido

Liberman, Robertson, em 1975, avaliaram a rápida determinação de

susceptibilidade pelo método de Kirby-Bauer, reduzindo o tempo de incubação de

16-20 horas para 7-8 horas: foram testados 100 casos isolados clínicos e não se

observaram mudanças em 558 de 664 testes (84% de concordância).

Johnson, Washington 2nd, em 1976, compararam os métodos diretos e padrão

para hemoculturas positivas. O teste direto foi feito ajustando a turbidez do caldo

removido do frasco positivo de hemocultura para a escala 1.0 de McFarland em 2mL

de caldo Mueller Hinton e incubando-se a mistura por 2-4 horas. O resultado das

discrepâncias foi classificado em muito importantes, maiores ou menores. As

principais discrepâncias foram notadas com S.epidermidis (4 erros muito

importantes, 5 maiores), Klebsiella spp (2 erros muito importantes, 4 maiores) e

Alcaligenes spp (5 erros maiores). Os antibióticos que mais freqüentemente

demonstraram discrepâncias foram penicilina, ampicilina e cefalotina. Os resultados,

segundo os autores, indicam que um teste de susceptibilidade direto e preliminar a

partir de frascos de hemocultura positiva é tanto possível como exato.

Wegner et al, em 1976, também estudaram um método direto para o teste de

susceptibilidade de microrganismos de crescimento rápido e patógenos de sangue,

das amostras suspeitas uma gota de cultura líquida (aproximadamente 0,01 mL) foi

inoculada em 2mL de caldo Columbia e este foi incubado por 4h-6h a 37ºC e o

inóculo ajustado com salina para a escala 0,5 de McFarland, para então ser

plaqueado em Agar Mueller Hinton. Após a incubação de 18h-24h as leituras foram

realizadas e os resultados mudaram somente 0,7%, o que os autores definem como

alternativa para situações clinicamente urgentes.


Murça MAS

15

Mirrett, Reller, em 1979, compararam o método padrão com o teste realizado

a partir do frasco de hemocultura (1mL do sobrenadante do frasco, diluído 1: 1 com

caldo TSB e incubado a 35ºC por uma hora e então a turbidez foi ajustada com

salina para a escala 0,5 McFarland). A concordância foi de 94,6% para 2.308

comparações. As maiores discrepâncias foram vistas com três cepas de

S.epidermidis e uma de S.aureus, E. coli e Enterobacter spp, portanto os autores

recomendam este procedimento para guiar precocemente a terapia antimicrobiana

em paciente com septicemia.

Fay, Oldfather, em 1979, padronizaram um método para o teste de

susceptibilidade direto de hemoculturas no qual encontraram que o plaqueamento

de 0,03 mL do caldo de hemocultura produzia halos muitos próximos dos obtidos no

método padrão, com 94,6% de concordância. Por outro lado, Doern et al, em 1981,

avaliaram o teste de susceptibilidade por disco-difusão a partir de amostras de

hemocultura positiva, o teste direto foi realizado com 1mL do líquido

homogeneizado, do qual seis gotas (aproximadamente 0,05mL) desta suspensão

foram plaqueadas em ágar Mueller Hinton e incubadas em ar ambiente a 35ºC por

16-18 horas. No total, 556 microrganismos e 4.234 comparações antibiótico-

microrganismos foram avaliados. O método direto demonstrou 69,8% de

concordância total com o método padronizado. Um total de 1,6% de erros menores,

1,5% de erros maiores e 0,1% de erros muito importantes foi observado.

Kiehn et al, 1982, compararam o teste susceptibilidade por microdiluição em

caldo padrão e direto de isolados de hemocultura; dos 271 microrganismos e 1.988

combinações microrganismos antibióticos testados, houve 13 discrepâncias em que

um microrganismo foi analisado como sensível por um método e resistente pelo

outro. Estas discrepâncias foram distribuídas entre diversas combinações

microrganismo-antibiótico, não mais que duas foram vistas para qualquer uma das

combinações. A alta acurácia deste resultado pode ser alcançada pela inoculação

direta de caldos de hemocultura.

De Cueto et al, 2004, inocularam diretamente o líquido do frasco do Bactec

9240 (Becton Dickinson Cockeysville , Md) da hemocultura positiva em cartão Vitek

2 System (bioMérieux, França). Para os bacilos Gram negativos, 31 de 50 (62%)


Murça MAS

16

mostraram concordância completa com o método padrão para identificação das

espécies, enquanto nenhum dos 50 cocos Gram positivos foi corretamente

identificado pelo método direto. Para os bacilos Gram negativos, eles foram 50%

concordantes entre os métodos direto e padrão para todas as drogas testadas. A

taxa de erro maior foi 2,4% e o de erro menor foi 0,6%. A taxa total de erros para os

Gram negativos foi 6,6%. Concordância completa na categoria clínica de todos os

agentes antimicrobianos avaliados foi obtida para 19 de 50 (38%) dos cocos Gram

positivos analisados, a taxa total de erro foi 8,4%, com 2,8% erros menores, 2,4%

erros maiores e 3,2% erros muito importantes; concluíram por estes dados que os

cartões de Vitek 2 inoculados diretamente com frascos positivos da Bactec 9240 não

oferecem identificação bacteriana ou de susceptibilidade aceitável em comparação

com os mesmos cartões testados pelo método padrão.

Segundo Diekema et al, 2004, o teste de susceptibilidade exato e o reporte

apropriado dos resultados para os patógenos isolados de hemoculturas são funções

críticas dos laboratórios de microbiologia. Eles estudaram o desempenho e reporte

de hemoculturas positivas (160 episódios de bacteriemia) em laboratórios de

microbiologia de hospitais de Iowa (14 hospitais). Foi detectado erro no teste de

susceptibilidade ou de identificação para 18 episódios (16%). Mais estudos são

necessários para determinar o impacto dos erros do teste e o reporte subótimo dos

resultados na condução das infecções de corrente sanguínea.

Doern et al, 1982, recomendam que os resultados de um teste rápido de

disco-difusão direto da hemocultura sejam usados para guiar a terapia , pois em seu

estudo o teste rápido indicou que 48 de 173 pacientes deveriam ter sua

antibioticoterapia mudada e, em 32 pacientes (66,6%), a indicação de mudança foi

aproximadamente 24 horas mais precoce que a convencional.

Barenfanger et al, em 1999, apontaram os benefícios clínicos e financeiros da

rápida identificação e do teste de susceptibilidade, demonstrando que a

permanência hospitalar diminuiu de 12,6 dias para 10,7 dias (p=0,006) no grupo em

que foram utilizados métodos mais rápidos e automatizados. A diferença de

liberação dos resultados foi de 39,2 horas contra 44,4 horas dos métodos de

processamento normal (p= 0,001). A mortalidade foi de 7,9% e 9,6% (p=0,45) em


Murça MAS

17

pacientes com os métodos rápido e normal, respectivamente, e os custos tiveram a

diferença de U$ 1,750 para menos (U$ 6,677 para U$ 4,927, p=0,001), nos

pacientes cujos exames foram realizados pelo método mais rápido.


Murça MAS

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2. OBJETIVOS


Murça MAS

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Verificar a correlação entre o método rápido de disco-difusão realizado

diretamente das cepas isoladas na hemocultura e o método de disco-difusão

tradicional na avaliação da susceptibilidade bacteriana.


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3. MATERIAL E MÉTODO


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21

Foram analisadas 130 amostras de hemoculturas positivas não seqüenciais,

obtidas pelo sistema Hemobac Trifásico, de diversas unidades, enviadas ao

laboratório de microbiologia do Serviço de Controle de Infecção Hospitalar da Santa

Casa de São Paulo, no período de 2003 a 2005.

3.1. Identificação da positividade das hemoculturas

As amostras positivas de hemocultivos (Sistema Hemobac Trifásico® - Probac

do Brasil, 2005a) do Laboratório de Microbiologia do Serviço de Controle de Infecção

Hospitalar e da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo foram

prospectivamente avaliadas da seguinte maneira:

1. Na presença de crescimento bacteriano nos meios sólidos (Fig 5), os frascos

foram abertos e fez-se a coloração de Gram, conforme item 3.2. e,

2. Na presença de viragem do indicador para rosa, sem crescimento bacteriano,

uma nova inversão foi realizada e a coloração de Gram, obtida do caldo com o

sangue.

Foram excluídos os hemocultivos sem crescimento, com crescimento de duas

ou mais espécies de bactérias e aquelas cujo crescimento no laminocultivo não foi

suficiente para a obtenção de um inóculo de 3x108 UFC/mL necessário para a

realização do antibiograma.

3.2. Bacterioscopia a partir da coloração de Gram das colônias isoladas

- A partir da amostra das hemoculturas positivas, foram feitos esfregaços em

lâminas, para a coloração de Gram (Carvalhal, Alterthum, 2005).

- A partir do crescimento bacteriano foi ajustada, visualmente, a suspensão

bacteriana com turvação correspondente a 1,0 da escala de McFarland, compatível

com 3,0x108 UFC/mL de bactérias em caldo de TSB (Tryptic Soy Broth) para o teste

rápido e, para o teste padrão, a escala utilizada foi a de 0,5 McFarland, que

corresponde a 1,5x108 UFC/mL. (Probac do Brasil, 2005b)


Murça MAS

22

Figura 5: Crescimento bacteriano em Agar Chocolate (Face larga da lâmina -

Hemobac Trifásico ®).

3.3. Antibiograma

A. O inóculo foi semeado em três direções em uma placa de Agar Mueller-

Hinton, previamente colocada por 30 minutos em estufa a 37o C.

B. Foram colocados os discos de antibióticos (de acordo com o CLSI (2005)

vigente), tal qual é feito no teste de sensibilidade realizado na rotina implementada

no laboratório, também de acordo com a bacterioscopia prévia e aspecto das

colônias utilizando os seguintes antimicrobianos:

• Staphylococcus spp: Penicilina, Oxacilina, Cefoxitina, Eritromicina,

Trimetoprim-Sulfametoxazol, Clindamicina, Vancomicina, Cloranfenicol,

Ciprofloxacina, Gentamicina, Tetraciclina, Levofloxacina, Teicoplanina, Cefepima,


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Meropenem e Linezolide;

• Enterococcus spp: Penicilina, Ampicilina, Vancomicina, Teicoplanina,

Gentamicina, Tetraciclina, Eritromicina, Cloranfenicol e Linezolide;

• Bacilos Gram negativos: Ampicilina, Cefazolina, Ticarcilina + Ácido

Clavulânico, Cefalotina, Gentamicina, Amicacina, Amoxacilina + Ácido Clavulânico,

Cefuroxima, Cefepima, Cefoxitima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Ciprofloxacina,

Levofloxacina, Imipenem, Meropenem, Trimetoprim-sulfametoxazol, Ceftazidima,

Aztreonam, Cloranfenicol, Tetraciclina e Tobramicina;

• Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose: Ceftazidima,

Gentamicina, Amicacina, Aztreonam, Cefepima, Ciprofloxacina, Levofloxacina,

Imipenem, Meropenem, Tobramicina, Cefotaxima, Ceftriaxona, Cloranfenicol e

Trimetoprim-Sulfametoxazol.

Quando a coloração de Gram indicou um bacilo Gram negativo, os discos

colocados foram para a família Enterobacteriaceae, na identificação deste bacilo

Gram negativo como não fermentador de glicose, foram considerados apenas os

antibióticos sugeridos para teste pelo CLSI.

Para os cocos Gram positivos, a prova da catalase foi realizada para

diferenciar os Staphylococcus spp dos Streptococcus ou Enterococcus spp, e

assumiram-se como enterococos as cepas que não apresentaram alfa hemólise no

agar chocolate, confirmando o diagnóstico na rotina padrão.

C. As placas foram incubadas em atmosfera ambiente, em estufa a 35oC -

37o C e, após cinco horas, houve a leitura do diâmetro dos halos e a interpretação

de acordo com os critérios adotados pelo CLSI – Clinical and Laboratory Standards

Institute, 2005 (antigo NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory

Standards) para halos obtidos na técnica de disco–difusão para antibiogramas, pela

metodologia padrão adotada pelos laboratórios.


Murça MAS

24

Paralelamente foi realizado o teste de susceptibilidade habitual, de acordo

com a padronização do CLSI, com leitura feita após 18-24 horas.

Como controle de qualidade laboratorial foram feitos os testes de

susceptibilidade com as cepas padrões (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923), padrão de

referência utilizado no laboratório e segue os critérios internacionais do CLSI (CLSI,

2005).

A leitura dos halos de inibição foi realizada após cinco horas de incubação,

por mensuração do halo na superfície do ágar com a placa aberta por

transiluminação devido à presença de halos mais claros.

3.4. Análise Estatística

Para avaliar a concordância entre o método padrão e rápido, utilizamos duas

formas de análise: índice Kappa (Tab. 1) e classificação de erro (Tab. 2) indicadas

pelo Serviço de Epidemiologia e Estatística da FCMSCSP.

O índice Kappa é obtido a partir da seguinte fórmula e classificado de acordo

com a tabela 1:

Kappa = Po – Pe

1 - Pe

Em que:

Po=proporção observada de cepas em concordância

Pe=proporção esperada de cepas em concordância


Murça MAS

25

Tabela 1: Classificação da concordância dos antimicrobianos a partir do índice Kappa.

KAPPA

Limite Inferior Limite Superior Classificação <0,00 Ruim

0 0,2 Fraca 0,21 0,4 Sofrível 0,41 0,6 Regular 0,61 0,8 Boa 0,81 0,99 Ótima

1 Perfeita Fonte: Adaptado do Landis J, Koch G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 1977; 33:159-74.

Tabela 2: Critérios de classificação de erros, comparando-se o teste rápido (TR)

com o teste padrão (TP). Teste Padrão Teste Rápido Erro

R Não houve erro

I EM Resistente

S EMI

R EM

I Não houve erro Intermediário S EM

R EI

I EM Sensível

S Não houve erro Fonte: Koneman E, Allen SD, Janda WM, Schereckenberger PC, Winn WC Jr. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5ª ed. São Paulo: MEDSI; 2001. onde: R = Resistente, I = Intermediário, S = Sensível, EM = Erro Menor, EMI = Erro Muito Importante e EI = Erro Importante .

Portanto, os critérios de classificação dos erros são obtidos quando há

discordância entre os resultados (Koneman et al, 2001), sendo:

- Erro muito importante (EMI): resultado no método padrão resistente (R)

e no método estudado sensível (S), R→S;


Murça MAS

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- Erro importante (EI): resultado no método padrão sensível e no método

estudado resistente, S→R e

- Erro menor (EM): resultado no método padrão resistente ou sensível e

no método estudado intermediário ou vice – versa, R↔I↔S.


Murça MAS

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4. RESULTADOS


Murça MAS

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Das 130 amostras de hemoculturas estudadas provenientes das diferentes

unidades de internação da Santa Casa de São Paulo, obtivemos os seguintes

resultados:

4.1. Staphylococcus spp

Das 50 cepas estudadas, 10 (20%) eram de Staphylococcus coagulase

negativo e 40 (80%) de Staphylococcus coagulase positiva; houve comparação entre

os resultados dos métodos padrão e rápido (Tab. 3).

Tabela 3: Classificação dos antimicrobianos testados para os Staphylococcus spp, segundo o índice Kappa que avalia a comparação entre os resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.

Antimicrobiano

Concordância

EMI

R→SEI

S→ REM

R↔I↔S Kappa

Classificação

Eritromicina 88 4 8 0 0,715 Boa Clindamicina 88 8 4 0 0,733 Boa Ciprofloxacina 90 6 4 0 0,798 Boa Gentamicina 88 4 8 0 0,757 Boa Tetraciclina 90 0 10 0 0,703 Boa Oxacilina 98 2 0 0 0,956 Ótima Sulfa-trimetoprim 98 2 0 0 0,960 Ótima Cloranfenicol 92 4 4 0 0,840 Ótima Levofloxacina 98 2 0 0 0,960 Ótima Cefepime 98 2 0 0 0,956 Ótima Meropenem 98 2 0 0 0,956 Ótima Penicilina 100 0 0 0 1 Perfeito Vancomicina 100 0 0 0 1 Perfeito Teicoplanina 100 0 0 0 1 Perfeito Linezolida 100 0 0 0 1 Perfeito

Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obteve-se R e EM: erro menor quando houve resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.

Das 50 cepas estudadas, houve concordância para os Staphylococcus

coagulase negativo de 60,0% e para os Staphylococcus coagulase positiva de

52,5%.


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4.2. Enterococcus spp

Foram isolados Enterococcus spp em culturas de 15 pacientes internados nas

várias enfermarias da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.

Todas as cepas de Enterococcus spp estudadas apresentaram 100% de

concordância em seus resultados, os quais foram avaliados de acordo com a

correlação entre os métodos padrão (TP) e rápido (TR).

4.3. Enterobactérias

Foram isoladas Enterobactérias em culturas de 32 pacientes. Das cepas

estudadas, 13 (40,6%) eram de Klebsiella pneumoniae; 9 (28,0%), de Enterobacter

spp; 5 (15,6%), de E.coli; 1 (3,1%), de Proteus mirabilis; 1 (3,1%), de Proteus

vulgaris; 2 (6,3%), de Klebsiella oxytoca e 1 (3,1%), de Morganella morganii. Para

comparar os métodos padrão (TP) e rápido (TR), construiu-se tabela, em que se

observou a concordância entre dois métodos por meio da análise de erros (Tab. 4).


Murça MAS

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Tabela 4: Classificação dos antimicrobianos testados para as Enterobactérias, segundo o índice Kappa que avalia a comparação dos resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.

Antimicrobiano

Concordância

EMI R→S

EI S→ R

EM R↔I↔S

Kappa

Classificação

Amicacina 84 3 3 9 0,585 Regular Ampicilina 97 0 0 3 0,788 Boa Ticarcilina+ácido clavulânico 88 3 0 9 0,708 Boa

Cefalotina 84 3 0 13 0,677 Boa Cefepime 84 9 0 6 0,707 Boa Cefoxitina 91 9 0 0 0,798 Boa Cefotaxima 88 9 0 3 0,750 Boa Aztreonam 88 3 0 9 0,761 Boa Tetraciclina 88 0 3 9 0,747 Boa Cefazolina 94 6 0 0 0,862 Ótima Gentamicina 94 3 0 3 0,870 Ótima Amoxacilina+ácido clavulânico 94 0 0 6 0,877 Ótima

Cefuroxima 97 0 0 3 0,931 Ótima Ceftriaxona 91 6 0 3 0,809 Ótima Sulfa-trimetoprim 97 3 0 0 0,920 Ótima Cloranfenicol 91 3 0 6 0,815 Ótima Tobramicina 94 0 0 6 0,882 Ótima Ciprofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Levofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Imipenem 100 0 0 0 1 Perfeito Meropenem 100 0 0 0 1 Perfeito Ceftazidima 100 0 0 0 1 Perfeito Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obteve-se R e EM: erro menor quando se obtiveram resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.

4.4. Bacilos Gram Negativos não fermentadores de glicose

Foram isolados BGN NF em culturas de 33 pacientes; das cepas estudadas,

21 (64%) eram de Acinetobacter baumannii; 7 (21%), de Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas spp 2 (6%), Stenotrophomonas maltophilia 2 (6%), Burkholderia

cepacia 1 (3%). Para comparar os métodos padrão (TP) e rápido (TR), construiu-se

tabela, observando a concordância entre dois métodos por análise de erros (Tab. 5).


Murça MAS

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Tabela 5: Classificação dos antimicrobianos testados para os Bacilos Gram negativos Não Fermentadores da Glicose, segundo o índice Kappa que avalia a comparação dos resultados obtidos pelo método padrão (TP) e o método rápido (TR), segundo a concordância e a ocorrência de erros detectados.

Antimicrobiano

Concordância

EMI

R→S EI

S→ R EM

R↔I↔S Kappa

Classificação

Gentamicina 76 3 18 3 0,553 Regular Amicacina 76 3 6 15 0,537 Regular Tobramicina 73 3 18 6 0,500 Regular Cefotaxima 76 9 3 12 0,561 Regular Cefepime 85 0 3 12 0,725 Boa Ceftriaxone 79 3 6 12 0,627 Boa Cloranfenicol 88 0 0 12 0,784 Boa Ceftazidima 94 0 3 3 0,893 Ótima Aztreonam 91 3 3 3 0,824 Ótima Imipenem 94 3 3 0 0,857 Ótima Meropenem 94 3 3 0 0,857 Ótima Sulfa-trimetoprim 94 3 3 0 0,878 Ótima Ciprofloxacina 100 0 0 0 1 Perfeito Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP. EMI: erro considerado muito importante quando no TP observou-se resistência (R) e, no TR, sensibilidade (S); EI: erro considerado importante quando no TP observou-se S e no TR obtivemos R EM: erro menor quando obtivemos resultados que variaram da resistência intermediária (I) para S e vice-versa e I para R e vice-versa.

De acordo com a metodologia proposta, a tabela a seguir demonstra o resumo

da relação de concordância entre o TP e o TR, segundo o número total de cepas

(Tab. 6).


Murça MAS

32

Tabela 6: Distribuição dos microrganismos isolados das hemoculturas e as concordâncias obtidas entre o teste padrão e o teste rápido, de acordo com os microrganismos isolados de hemoculturas.

Agente isolado Amostras Concordância Nº Nº %

Enterococcus spp 15 15 100 Cocos Gram (+) Staphylococcus aureus 40 20 50

Staphylococcus coagulase (-) 10 6 60 Total 65 41 63 Klebsiella pneumoniae 13 10 77 Escherichia coli 5 2 40 Enterobacter sp 9 0 0

Bacilo Gram (-) Morganella morganii 1 0 0 Klebsiella oxytoca 2 0 0 Proteus mirabilis 1 0 0 Proteus vulgaris 1 0 0 Total 32 12 38 Acinetobacter baumannii 21 10 48

Bacilo Gram (-) não Pseudomonas aeruginosa 7 3 43 fermentadores da Pseudomonas spp 2 1 50

Glicose Stenotrophomonas maltophilia 2 2 100 Burkholderia cepacia 1 0 0

Total 33 16 48 Total geral 130 69 53 Fonte: Laboratório de Microbiologia do SCIH e FCMSCSP.

Os resultados obtidos para as cepas controle Escherichia coli ATCC 25922,

Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

foram satisfatórios quando comparados com os intervalos preconizados para o teste

de controle de qualidade do método, segundo o CLSI vigente no período de estudo

2003-2005 (CLSI 2003-2005).


Murça MAS

33

5. DISCUSSÃO


Murça MAS

34

As infecções da corrente sanguínea são a décima causa de morte nos

Estados Unidos da América e também aumentam a morbidade, o tempo de

permanência e os custos hospitalares. O tempo para a notificação dos resultados

positivos é um dos fatores óbvios para diminuir o tempo de permanência da

hospitalização, portanto o laboratório de microbiologia deve focar a diminuição da

notificação priorizando a rotina das hemoculturas e a liberação dos resultados da

coloração de Gram, comunicando-os imediatamente aos responsáveis pelo paciente

(Beekmann et al, 2003).

Atualmente as culturas provenientes de pacientes internados levam ao redor

de 72 horas para liberação final dos resultados e, nestes casos, a terapêutica

definida será confirmada após a obtenção desses exames.

Escolhemos realizar um teste cuja determinação do perfil de sensibilidade

seria reduzida de 24 horas para 5 horas e, assim, teríamos uma confirmação de

eficácia terapêutica em um tempo menor. A gravidade das infecções também foi

considerada, escolhendo somente hemoculturas positivas em meio especial

Hemobac Trifásico (Probac do Brasil ®, 2005a), cuja característica é identificar os

agentes diretamente nos laminocultivos.

Associando as duas características, observamos que os resultados finais

poderiam ser obtidos em 30 horas, agilizando a indicação da terapêutica adotada

para os pacientes.

Os resultados alcançados nestes testes in vitro mostraram variação com

relação ao padrão-ouro já utilizado, e foi observada, para diferentes cepas

analisadas, uma concordância de 37,5% até 63%, com média de 53%, demonstrada

nos resultados (Tab.6). Nesta mesma tabela, podemos observar uma concordância

de 100% da metodologia rápida para os Enterococcus spp e 77% para Klebsiella

pneumoniae, determinando que, para esses agentes, tenhamos melhor expectativa

de realização do teste rápido. Para outras bactérias a discordância foi total (100%),

porém o número de cepas testado foi pequeno, portanto com necessidade de maior

quantidade de testes para confirmar estes resultados.


Murça MAS

35

Lembrando que as maiores divergências ocorreram nos antibióticos que

atuam na síntese protéica e na alteração do material genético bacteriano,enquanto

as maiores concordâncias foram para os que atuam na parede celular.

Nossos resultados são semelhantes aos obtidos por Kluge (1975), que utilizou

o inóculo de 0,5 de McFarland e realizou as leituras nos tempos de 4, 8 e 12 h,

demonstrando concordância de 100% para cloranfenicol e gentamicina nos

Staphylococcus spp. Para os Enterococcus spp, obteve em estreptomicina,

meticilina, kanamicina, trimetoprim-sulfametoxazol concordância de 100% e, para as

demais drogas, porcentagem acima de 90%.

Podemos observar, também, nos resultados, três tipos de discordâncias

principais: ERRO MUITO IMPORTANTE: um isolado determinado como resistente

pelo TP e sensível pelo TR; ERRO IMPORTANTE: um isolado determinado como

sensível pelo TP e resistente pelo TR; ERRO MENOR: um isolado determinado

como intermediário pelo TP e resistente ou sensível pelo TR (Koneman et al, 2001).

Analisando estes erros, os prováveis fatores que os explicam são: inóculo, tempo de

difusão do antimicrobiano, erros de leitura (variação de leitura pessoa-pessoa e

valores próximos aos intervalos estabelecidos).

Em trabalhos anteriores, os autores ignoravam a sensibilidade intermediária,

considerando-a como sensível, fazendo com que esses resultados aumentassem a

concordância para os testes (Doern et al, 1994; Acar, Goldstein, 1996).

Os resultados deste estudo foram comparados com alguns artigos analisados

(Tab. 7).


Murça MAS

36

Tabela 7: Comparação das concordâncias entre os testes.

Referência Método Microrganismo Antimicrobianos Resultado

Presente estudo DD

Enterococcus spp K.pneumoniae Staphylococcus spp Bacilo Gram (-) Bacilo Gram (-) NF

NCCLS, 2003-2004 CLSI, 2005

100% 77% 50% 35% 50%

Kluge, 1975 DD Enterococcus spp

streptomicina, meticilina, kanamicina, trimetoprim-sulfametoxazol Demais drogas

100%

90%

Liberman, Robertson,

1975 DD

A. calcoaceticus, A. lwoffii, E.coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Hafina sp, P. mirabilis, M. morganii, P.rettgeri, Pseudomonas spp

streptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina, ampicilina, cefalotina Polimixina B

84%

S.aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp

penicilina, meticilina, cefalotina, clindamicina, ampicilina, tetraciclina Mirret,

Reller, 1979 DD E.coli, K. pneumoniae, S. marcenscens, Salmonella spp, Enterobacter spp

ampicilina, cefalotina, gentamicina, kanamicina, cloranfenicol, tetraciclina

94,6%

DD = método de disco- difusão

Quando comparamos o fármaco e sua correlação entre os dois tipos de

testes, observamos que as drogas podem ser classificadas em categorias de acordo

com o índice Kappa (Tab. 1) e foram correlacionadas aos grupos de bactérias (Tab.

3, 4 e 5), cuja concordância para as diferentes drogas variou de 73 até 100.

Para o laboratório, a realização de métodos rápidos cria uma alternativa para

padronizar novos exames mais eficazes com redução de gastos.

Para a instituição, toda melhoria na qualidade do atendimento ao paciente

com implantação de exames alternativos eficazes implica satisfazer o cliente, reduzir

os custos hospitalares, a resistência bacteriana e diminuir o tempo de internação.

Para a sociedade, a alta precoce e o retorno às atividades normais desses cidadãos

reduzem os custos sociais.


Murça MAS

37

6. CONCLUSÃO


Murça MAS

38

O teste rápido teve correlação de 100% em Enterococcus spp, 40,6% em

Enterobactérias, 44% em Staphylococcus spp e 51,5% em bacilos Gram negativos

não fermentadores da glicose, para os antimicrobianos utilizados na rotina do

laboratório de microbiologia do SCIH da Santa Casa de São Paulo, quando

comparados com o método tradicional de disco-difusão.


Murça MAS

39

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Murça MAS

40

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Murça MAS

43

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Murça MAS

44

RESUMO


Murça MAS

45

Murça MAS. Correlação entre os métodos rápido e tradicional de disco-difusão na avaliação de susceptibilidade de isolados de hemoculturas da Santa Casa de São Paulo. Tese (Mestrado). 2007

Cada vez mais se busca nos Laboratórios de Microbiologia a relação

eficácia/tempo, visando a rapidez com que os resultados devem ser reportados. Este

estudo avalia um método rápido para o teste de susceptibilidade a antimicrobianos

(5 horas), uma variante do método de Kirby-Bauer, consistindo em: pré-incubação

das placas à 37o C, antes da inoculação; turbidez do inóculo ajustada para o padrão

de 1,0 na escala de McFarland, ao invés de 0,5, sem pré-incubação e leitura

realizada após 5 horas de incubação. O objetivo foi verificar a correlação existente

entre os dois métodos de determinação de susceptibilidade bacteriana (clássico e

rápido) a antimicrobianos, utilizando-se cepas isoladas de hemoculturas. A placa foi

incubada em atmosfera ambiente, em estufa a 35-37o C e após 5 horas foi realizada

a leitura do diâmetro dos halos; a interpretação dos resultados foi realizada de

acordo com os critérios adotados pelo CLSI - Comitte Laboratory Standards Institute,

(antigo NCCLS - National Comittee for Clinical Laboratory Standards). Os resultados

obtidos nestes testes “in vitro”, mostraram variação com relação ao padrão ouro já

utilizado: foi observada, para diferentes cepas analisadas, a concordância de 53%,

em média. O teste rápido realizado, com os discos de antimicrobianos utilizados na

rotina do Laboratório de Microbiologia do S.C.I.H. da Santa Casa de São Paulo, teve

correlação de 100% para Enterococcus spp. Para bacilos Gram negativos não

fermentadores da glicose, Staphylococcus spp e enterobactérias a correlação foi de

51,5%, 44%, e 40,6% respectivamente.


Murça MAS

46

ABSTRACT


Murça MAS

47

Murça MAS. Correlation between two methods of susceptibilit by testing tradiconal and rapid in blood cultures in Santa Casa of Sao Paulo. Thesis. 2007.

There has been a growing interest in the cost effectiveness of expediting test

results in Microbiology Laboratories. The current study evaluates a rapid (5-hour) test

of antimicrobial susceptibility. This test was modified from the Kirby-Bauer method,

consisting of a pre-incubation of the plates at 37oC before inoculation, turbidity of the

inoculate set at a standard of 1.0 on the McFarland scale (instead of 0.5), no pre-

incubation, and reading of the test results following 5 hours of incubation. The

objective was to compare both methods of establishing bacterial susceptibility to

antimicrobial drugs (classical vs rapid) using bacterial strains isolated from

hemocultures. The plate was incubated at room temperature and at 35-37o C for five

hours. The zone diameter of the halo was established at room temperature and after

incubation. Results were analyzed according to the Comitte Laboratory Standards

Institute Criteria (CLSI) , (former NCCLS - National Comittee for Clinical Laboratory

Standards). This “in vitro” test presented results that differred from those described

as “gold-standard”, with an average agreement of only 53%. The rapid test using

routine antimicrobial plates from the Microbiology Laboratory of Santa Casa of São

Paulo Hospital presented a 100% correlation with Enterococcus spp, and a 51.5%,

44%, and 40.6% correlation with non-glucose fermenting gram negative bacilli,

Staphylococcus spp, and enterobacteria, respectively.


Murça MAS

48

APÊNDICE


Murça MAS

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