i

UFAL

Universidade Federal de Alagoas

Instituto de Química e Biotecnologia

Programa de Pós-Graduação em Química e

Biotecnologia

IQB

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES MOLUSCICIDA E LARVICIDA DE Tocoyena selloana K. Schum.

(RUBIACEAE)

Marcos Oliveira Rocha

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Química.

Orientadora: Profa. Dra. Margarida Maria dos Santos Humberto

Maceió - Alagoas Dezembro de 2009

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

ii

Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas

Biblioteca Central Divisão de Tratamento Técnico

Bibliotecária Responsável: Helena Cristina Pimentel do Vale R672e Rocha, Marcos Oliveira. Estudo fitoquímico e avaliação das atividades moluscicida e larvicida de Tocoyena selloana K. Schum. (Rubiaceae) / Marcos Oliveira Rocha, 2009. xii, 82 f. : il. grafs. e tabs. Orientador: Geraldo Majela Gaudêncio Faria. Dissertação (mestrado em Química e Biotecnologia) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de Química e Biotecnologia, 2009. Bibliografia: f. 77-82.

1. Fitoquímica. 2. Tocoyena selloana. 3. Rubiaceae. 4. D-Mantol. I. Título. CDU: 547.9

iii

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Margarida Maria dos Santos Humberto, pelos ensinamentos, paciência,

estímulo e orientação;

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, em

especial: Lúcia Maria Conserva, Marília Oliveira Fonseca Goulart, Antônio Euzébio

Goulart Sant’Ana, Margarida Maria dos Santos Humberto e Marcia Pletsch, pelos

ensinamentos a mim repassados;

Ao Prof. Dr. Edson de Souza Bento pela obtenção dos espectros de Ressonância

Magnética Nuclear;

À botânica Rosário de Fátima de Almeida Rocha pela identificação do material vegetal;

Aos técnicos Aldy dos Santos e D. Margarida Tenório pelo apoio e por tantas ajudas;

Ao Prof. Dr. Dennis de Oliveira Imbroisi, por ter cedido o aparelho para determinação

de ponto de fusão e a balança analítica;

À Profa. Dra. Simone Margaretti Plentz Meneguetti pela obtenção dos espectros no

Infravermelho;

Ao Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Sant’Ana, pelo fornecimento dos solventes

deuterados para a obtenção dos espectros de RMN;

Ao Prof. Dr. João Xavier de Araújo Júnior e a Profa. Dra. Lucia Maria Conserva, pela

colaboração no Exame de Qualificação;

Aos doutorandos Cenira Monteiro e Karlos Lisboa pela realização dos testes biológicos;

Aos funcionários do Instituto de Química e Biotecnologia, em especial Rejane

Montenegro por tantas ajudas;

À Danielle de Lima do Laboratório de Pesquisa em Química dos Produtos Naturais

pela amizade e inúmeros favores;

Aos colegas e amigos do Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, em

especial ao Jataí Sobreira e ao Sivaldo Paulino pelo apoio e amizade;

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) pelo apoio

financeiro concedido através de bolsa de mestrado;

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

iv

Dedico este trabalho a Deus que está comigo em

todos os momentos.

Aos meus pais Claudio e Mônica pelo apoio

incondicional em todos os momentos da minha vida, pela

educação e bom exemplo que sempre me deram.

À minha amada esposa Magna pelo carinho,

companheirismo e paciência.

v

“A grandeza não consiste em receber grandes honras, mas sim em merecê-las”

Aristóteles

vi

SUMÁRIO

Lista de Figuras viii

Lista de Tabelas viii

Lista de Esquemas ix

Lista de Quadros ix

Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos x

Resumo xi

Abstract xii

1. Introdução 1

1.1 Aspectos gerais dos produtos naturais 2

1.2 Considerações sobre a Família Rubiaceae 3

1.2.2 Estudos químicos sobre a família Rubiaceae 6

1.3 Considerações sobre o Gênero Tocoyena 11

1.4 Considerações sobre a Esquistossomose 14

1.5 Considerações sobre a Dengue 17

1.6 Caracterização do espécime 19

2. Objetivos 20

2.1. Objetivo Geral 21

2.2. Objetivos Específicos 21

3. Parte Experimental 23

3.1. Solventes, Reagentes e Equipamentos 23

3.2. Coleta e Identificação do Material Vegetal 24

3.3. Preparação dos Extratos das Folhas e do Caule 24

3.3.1. Preparação dos Extratos e Frações das Folhas 24

3.3.2. Preparação dos Extratos e Frações do Caule 25

3.4. Isolamento e Purificação das Substâncias 25

3.4.1. Fração em Hexano das Folhas de Tocoyena selloana 25

3.4.2. Fração em Clorofórmio das Folhas de Tocoyena selloana 27

3.4.3. Fração em Acetato de Etila das Folhas de Tocoyena selloana 29

3.4.4. Fração Aquosa Proveniente das Folhas de Tocoyena selloana 29

3.4.5. Fração em Acetato de Etila do Caule de Tocoyena selloana 29

3.4.6. Fração Aquosa do Caule de Tocoyena selloana 30

3.5. Ensaios Biológicos 33

3.5.1. Atividade Larvicida Frente às Larvas do Mosquito Aedes Aegypti 33

3.5.2. Atividade Moluscicida 34

3.6 Dados físicos e espectroscópicos das substâncias isoladas 35

3.6.1 Substância TsFA-1 35

3.6.2 Substância TsFH-1 35

3.6.3 Substância TsFC-2 35

3.6.4 Substância TsFC-1 36

4. Resultados e Discussões 37

4.1. Identificação Estrutural das Substâncias Isoladas 38

4.1.1 Identificação Estrutural da Substância TsFA-1 38

4.1.2 Identificação Estrutural da Substância TsFH-1 40

4.1.3 Identificação Estrutural da Substância TsFC-2 43

4.1.4 Identificação Estrutural da Substância TsFC-1 46

4.2. Resultados dos Testes de Atividade Biológica 49

vii

4.2.1. Atividade Larvicida 49

4.2.2. Atividade Moluscicida 50

5. Considerações Finais 51

6. Espectros das Substâncias Isoladas 53

7. Referências Bibliográficas 77

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Plantas ornamentais da família Rubiaceae 5

Figura 2. Ciclo de vida do schistosoma 16

Figura 3. Mosquito Aedes aegypti 18

Figura 4. Fotos de Tocoyena selloana K. Schum. 19

Figura 5. Espectro de IV da substância codificada de TsFA-1 54

Figura 6. Espectro de RMN 1

H da substância codificada de TsFA-1 55

Figura 7. Espectro de RMN 13

C da substância codificada de TsFA-1 56

Figura 8. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFA-1 56

Figura 9. Espectro de RMN 1

H da substância codificada de TsFH-1 57

Figura 10. Espectro de RMN 1

H de TsFH-1 (Ampliado) 58

Figura 11. Espectro de RMN 13

C da substância codificada de TsFH-1 59

Figura 12. Espectro de RMN 13

C de TsFH-1 (Ampliado) 60

Figura 13. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFH-1 61

Figura 14. Espectro de RMN DEPT de TsFH-1 (Ampliado) 62

Figura 15. Espectro de IV da substância codificada de TsFC-2 63

Figura 16. Espectro de RMN 1

H da substância codificada de TsFC-2 64

Figura 17. Espectro de RMN 1

H de TsFC-2 (Ampliado) 65

Figura 18. Espectro de RMN 1

H de TsFC-2 (Ampliado) 66

Figura 19. Espectro de RMN 13

C da substância codificada de TsFC-2 67

Figura 20. Espectro de RMN 13

C de TsFC-2 (Ampliado) 68

Figura 21. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFC-2 69

Figura 22. Espectro de RMN DEPT de TsFC-2 (Ampliado) 70

Figura 23. Espectro de IV da substância codificada de TsFC-1 71

Figura 24. Espectro de RMN 1

H da substância codificada de TsFC-1 72

Figura 25. Espectro de RMN 13

C da substância codificada de TsFC-1 73

Figura 26. Espectro de RMN 13

C de TsFC-1 (Ampliado) 74

Figura 29. Espectro de RMN DEPT da substância codificada de TsFC-1 75

Figura 30. Espectro de RMN DEPT de TsFC-1 (Ampliado) 76

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Dados de RMN 1

H de TsFA-1 e do D-Manitol 39

Tabela 2. Dados de RMN 13

C de TsFA-1, do D-Manitol, do L-Initol e do D-

Sorbitol

40

Tabela 3. Dados de RMN 13

C de TsFH-1, dos ácidos ursólico e oleanólico 42

Tabela 4. Dados de RMN 13

C de TsFC-2, dos ácidos quinóvico, 3-O-β-D-

glicopiranosilquinóvico e 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico

45

Tabela 5. Dados de RMN 13

C de TsFC-1 47

Tabela 6. Dados de RMN 13

C de TsFC-1M e do ácido ursólico 48

Tabela 7. Resultado dos bioensaios preliminares de atividade larvicida 49

ix

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Procedimento Realizado com a Fração Clorofórmica das Folhas

de Tocoyena selloana K. Schum.

28

Esquema 2. Procedimento efetuado com as folhas da espécie de Tocoyena selloana K.Schum.

31

Esquema 3. Procedimento Realizado com o caule da espécie Tocoyena selloana K. Schum.

32

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Cromatografia da fração hexânica resultante do extrato etanólico

das folhas de Tocoyena selloana K.Schum.

26

Quadro 2. Fracionamento cromatográfico da subfração 17-27 do extrato

hexânico das folhas de Tocoyena selloana K.Schum

26

Quadro 3. Extratos e Frações Submetidas a Ensaios Larvicida 33

Quadro 4. Valores de Ponto de Fusão de TsFA-1, do D-Manitol, do L-

Iditol e do D-Sorbitol

40

x

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

AcOEt Acetato de Etila

ATR Attenuated total reflectance

BuOH Butanol

ºC Grau Ceusius

CHCl3 Clorofórmio

CDCl3 Clorofórmio deuterado

C5D5N Piridina deuterada

CL Concentração letal

cm Centímetro

d Dupleto

dd Duplo dupleto

ddd Duplo duplo dupleto

DEPT Distortioless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO-d6 Dimetil sulfóxido deuterado

EtOH Etanol

g Grama

Hz Hertz

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento em Hertz

MeOH Metanol

CD3OD Metanol deuterado

mg Miligrama

MHz Megahertz

mL Mililitros

OMS Organização mundial de Saúde

p. Página

p.f. Ponto de fusão

ppm Partes por milhão

RMN 1

H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN 13

C Ressonância magnética nuclear de carbono

xi

RESUMO

O presente trabalho descreve o isolamento de alguns constituintes químicos,

bem como a avaliação das atividades moluscicida e larvicida de extratos e frações

das folhas e do caule da espécie Tocoyena selloana K. Schum. (Rubiaceae),

conhecida como genipapo-bravo e coletada em Barra de São Miguel / Alagoas. O

estudo fitoquímico conduziu ao isolamento de dois triterpenóides, o ácido 3β-hidróxi-

urs-12-en-28-óico (ácido ursólico), o qual está sendo descrito pela primeira vez no

gênero Tocoyena e o ácido 3-O-β-D-glicopiranosílquinóvico; o carboidrato (2R, 3R,

4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-hexano (D-Manitol), também descrito pela primeira vez

no gênero e uma quarta substância, possivelmente um triterpeno que não teve ainda

sua estrutura caracterizada. Todas as substâncias isoladas tiveram suas estruturas

identificadas com base na análise dos dados espectrais (IV, RMN 1H, 13C e DEPT) e

comparação com dados descritos na literatura. Os extratos em etanol das folhas e

do caule, bem como as frações em hexano, clorofórmio, acetato de etila, butanol e

água foram considerados inativos frente ao caramujo Biomphalaria glabrata e às

larvas do mosquito Aedes aegypti na concentração de 500 ppm.

Palavras chave: Tocoyena selloana, Rubiaceae, D-manitol.

xii

ABSTRACT

This work describes the isolation and elucidation of some chemical

constituents, as well as evaluation of the molluscicidal and larvicidal activities of the

extracts and fractions from the leaves and stem of Tocoyena selloana K. Schum.

(Rubiaceae), known popularly as genipapo-bravo, colleted in Barra de São Miguel /

Alagoas. From the phytochemical investigation, were isolated of the two

triterpenoids, the 3-O-β-D-glucopiranosil quinovic acid and the ursolic acid, the last

one, is being described for the first time in the genus Tocoyena. The carbohydrate D-

Mannitol, was also isolated it is described for the first time in the genus too, a fourth

substance, possible triterpen, is not fully characterized yet. All isolated substances

were elucidated on the basis of their spectral data (IR, NMR 1H, 13C and DEPT) and

compared with data described in the literature. The ethanol extracts and fractions

from the leaves and stem of T. selloana did not show activity against the

Biomphalaria glabrata and Aedes aegypti in concentration of 500 ppm.

Key words: Tocoyena selloana, Rubiaceae, D-mannitol.

1

1. INTRODUÇÃO

2

1.1. Aspectos Gerais dos Produtos Naturais

A utilização de plantas com fins medicinais, para tratamento, cura e

prevenção de doenças, é uma das mais antigas formas de prática medicinal da

humanidade (Veiga Júnior et al, 2005). Na história do desenvolvimento das

civilizações Oriental e Ocidental encontram-se muitos exemplos da utilização de

recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa.

A medicina tradicional chinesa, por exemplo, desenvolveu-se com tal eficiência que

até hoje muitas espécies e preparados vegetais medicinais são estudados na busca

pelo entendimento de seu mecanismo de ação e o isolamento dos princípios ativos

(Viegas Júnior et al, 2006).

Acredita-se que cerca de 80% da população mundial usem as plantas como

primeiro recurso terapêutico (Silva & Filho, 2002) e a tendência desde a metade do

século XIX, tem sido a utilização de substâncias isoladas em substituição aos

extratos vegetais que apresentam alguma propriedade terapêutica comprovada e

tenham seus constituintes ativos identificados (Schenkel et al, 2007).

As plantas, além de seu uso na medicina popular, têm contribuído, ao longo

dos anos para a obtenção de vários fármacos, até hoje amplamente utilizados.

Como exemplo, podemos citar a colchicina (1), encontrada na espécie Colchicum

autumnale e utilizada como anti-inflamatório e a morfina (2), princípio ativo do ópio,

preparado de Papaver somniferum, que é conhecida desde a época dos Sumérios

(4000 a.C.) devido às suas propriedades soporíferas e analgésicas, havendo relatos

na mitologia grega atribuindo à papoula do ópio o simbolismo de Morfeu, o deus do

sono (Filho & Yunes, 1998; Viegas Júnior et al, 2006).

O

NH

H

H3CO

H3CO

OCH3

O

OCH3

NCH3

H

HO

O

HO

H

(1) Colchicina (2) Morfina

3

Von Martius, botânico alemão criador da obra Flora Brasiliensis, definiu o poder

das ervas brasileiras como: "As plantas medicinais brasileiras não apenas curam,

fazem milagres", de fato, das 200.000 espécies vegetais que possam existir no

Brasil, pelo menos a metade pode ter alguma propriedade terapêutica útil à

população, mas nem 1% dessas espécies foram cientificamente estudadas (Barraca,

1999; Chiquieri et al, 2004).

As plantas medicinais da flora nativa são consumidas com poucas ou nenhuma

comprovação de suas propriedades farmacológicas. Comparadas com a de

medicamentos usados nos tratamentos convencionais, a toxicidade de plantas

medicinais e fitoterápicos pode parecer trivial. Isto, entretanto, não é verdade. A

toxicidade de plantas é um problema sério de saúde pública. Os efeitos adversos

dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a ação sinérgica

ocorrem comumente (Veiga Júnior et al, 2005). Com isso, é fundamental a

realização de pesquisas para investigação dos constituintes químicos das plantas,

visando à possibilidade de aplicação no tratamento das mais diversas patologias.

Serão abordados alguns aspectos relacionados à família Rubiaceae e ao gênero

Tocoyena, assim como a esquistossomose e a dengue.

1.2 Considerações Sobre a Família Rubiaceae

A família Rubiaceae Juss., descrita pela primeira vez por Antoine Laurent de

Jussieu, em 1789, tem seu nome derivado do gênero Rubia L., do latim rubium,

relativo à tinta vermelha produzida pelas raízes de plantas deste gênero, utilizadas

para tingir tecidos (Pereira, 2007). Ela representa a quarta maior família do grupo

das Angiospermae, com cerca de 650 gêneros e mais de 13.000 espécies,

distribuídas principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo, com

poucos representantes nas áreas temperadas e frias. No Brasil, estão descritos

próximo de 130 gêneros e 1500 espécies (Hottz et al, 2007).

A maioria das espécies de Rubiaceae são árvores de pequeno porte ou

arbustos muito freqüentes em bosques e subosque. A família pode ser facilmente

reconhecida pelas folhas geralmente opostas e pela presença de estípulas

interpeciolares. A grande variação nas formas, tamanhos e cores das flores atrai um

grande número de polinizadores para a família. Os frutos carnosos também variam

4

nas cores e tamanhos, sendo dispersos por pássaros, morcegos ou ainda por

pequenos mamíferos (Taylor et al, 2007).

A família Rubiaceae tem sido dividida em quatro subfamílias: Ixoroideae,

Cinchonoideae, Antirheoideae e Rubioideae. A avaliação de dados químicos revela

que na subfamília Ixoroideae, os iridóides são considerados marcadores

quimiotaxonômicos exclusivos, enquanto em Cinchonoideae os alcalóides indólicos

predominam e, em Rubioideae, as antraquinonas estão presentes como a principal

classe de metabólitos secundários. Já na subfamília Antirheoideae não há

ocorrência de nenhum destes marcadores químicos (Gazda, 2004).

A família Rubiaceae possui espécies de grande importância econômica, que

são exploradas das seguintes formas:

Como alimentícias, tem-se como exemplo o café que é uma das bebidas mais

consumidas no mundo e provém de uma árvore do gênero Coffea que dentre as

várias espécies conhecidas se destaca a espécie Coffea arabica L. O componente

mais conhecido obtido do café é a cafeína (3), devido às suas propriedades

fisiológicas e farmacológicas. A cafeína é um alcalóide, pertencente ao grupo das

xantinas, é uma substância inodora e possui sabor amargo bastante característico

(Monteiro e Trugo, 2005).

N

NN

N

CH3

H3C

CH3O

O

(3) cafeína

Ornamentais, como a Ixora coccínea Linn., conhecida como Ixora (Figura 1)

(Dias-Arieira et al, 2007), e a Galianthe brasiliensis conhecida pelo nome de poaia-

do-campo (Figura 1), que é utilizada inclusive na medicina popular por suas

propriedades eméticas (Moura et al, 2006).

5

Ixora

http://www.florabeiradamata.com.br , acessado em agosto de 2009.

poaia-do-campo http://exactas-unam.dyndns.org, acessado em agosto de 2009.

Figura 1. Plantas ornamentais da família Rubiaceae.

Na indústria farmacêutica, a Cinchona pubescens Vahl, uma das espécies

produtoras da quinina (4), que é empregada no tratamento da malária (Coelho et al,

2006); a Cephaelis ipecacuanha (Brot.) A. Richard, planta que produz os alcalóides

isoquinolínicos emetina (5) e cefalina (6) que possuem propriedades amebicidas,

expectorantes, diaforéticas e eméticas. Além disso, várias espécies são referidas

popularmente como medicinais, dentre as quais destacam-se: Coutarea hexandra

(Jacq.) K. Schum., diversas espécies dos gêneros Borreria, Cinchona e Richardia

(Fabri, 2008; França, 2007) e plantas do gênero Diodia que são usadas como

agentes anti-reuméticos, antidiarréicos, laxativos, eméticos e no tratamento de

úlceras gástricas, urticárias e gastrites (Moura et al, 2006).

N

H3CO

HO

H

N

H

H

N

OCH3

OCH3

H

H

NH

H

H3CO

H3CO

H3C

(4) quinina

(5) emetina

6

N

OCH3

OCH3

H

H

NH

H

HO

H3CO

H3C

(6) cefalina

1.2.2 Estudos Químicos Sobre a Família Rubiaceae

Estudos químicos realizados com espécies da família Rubiaceae, indicam

uma grande diversidade de metabólitos secundários como iridóides, alcalóides

indólicos, antraquinonas, flavonóides e outros derivados fenólicos e terpenóides

(triterpenos, diterpenos). Destes, iridóides, antraquinonas e alcalóides indólicos são

considerados marcadores quimiotaxonômicos da família (Gazda, 2004). Dentre os

diversos relatos na literatura de metabólitos secundários isolados de Rubiáceas,

podemos mencionar:

Richardia grandiflora – Conhecida popularmente como ervanço, é utilizada

na medicina popular como vermífugo. Estudos fitoquímicos conduziram ao

isolamento de β-sitosterol (7), ácido salicílico (8), estigmasterol (9) e ácido-m-metoxi-

p-hidroxibenzóico (10) (Tomaz et al, 2008).

HO

H

H

COOH

OH

(7) β-sitosterol (8) ácido salicílico

7

HO

H

H

(9) estigmasterol

COOH

OH

OCH3

(10) ácido-m-metoxi-p-hidroxibenzóico

Galianthe brasiliensis - É uma planta ornamental usada como emético na

medicina popular. Desta planta foram isolados os iridóides glicosilados

asperulosídeo (11) e desacetilasperulosídeo (12) e o β-sitosterol (7) (Moura et al,

2006).

O

O

O

H

H

H3COC OO OH

OHHO

HO

O

O

O

H

H

HO OO OH

OHHO

HO

asperulosídeo (11)

desacetilasperulosídeo (12)

Guettarda pohliana – Conhecida popularmente como angélica-do-mato, é

utilizada no tratamento de ferimentos e inflamações. Estudo químico realizado com

esta espécie conduziu ao isolamento do ácido quinóvico (13), das saponinas

triterpênicas: os ácidos 28-O-β-glicopiranosilquinóvico (14), 3-O-β-D-glicopiranosil-

28-O-β-glicopiranosilquinóvico (15), 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-glicopiranosil-

quinóvico (16) e 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosilcinchólico (17) e ainda

o ácido 4,5-O-dicafeoilquínico (18) (Oliveira et al, 2008).

8

HO

COOH

COOHH

H

H

(13) ácido quinóvico

HO

COOH

COO O

HO

OHOH

HOH

H

H

(14) ácido 28-O-β-glicopiranosilquinóvico

COOH

COO O

HO

OHOH

HO

O

OH

HO

HOO

HO

H

H

H

(15) ácido 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-glicopiranosilquinóvico

9

COOH

COO O

HO

OHOH

HO

O

OH

HO

HOO

H

H

H

(16) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-glicopiranosilquinóvico

O

COOH

COO O

HO

OHOH

HOO

OH

HOHO

HO

H

H

H

(17) ácido 3-O-β-D-glicopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosilcinchólico

COOHHO

O

OHO

O

HO

HOO

HO OH

(18) ácido 4,5-O-dicafeoilquínico

Chomelia obtusa – Esta espécie é um arbusto típico do Cerrado, conhecida

popularmente como viuvinha. Em análise fitoquímica realizada, foram isoladas as

10

substâncias: ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosil quinóvico (16)

ácido ursólico (19), ácido oleanólico (20), ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-

glicopiranosil cinchólico (21), e o flavonóide 3-O-β-D-glicopiranosil quercetina (22)

(Barros et al, 2008).

HO

COOHH

H

H

HO

COOH

H

H

H

(19) ácido ursólico (20) ácido oleanólico

O

C

O

OH

HO

HO

O

HO

OHOH

HOH

H

H

O

O

(21) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosil-28-O-β-D-glicopiranosil cinchólico

OHO

OH O

O

OH

OH

O

OHOH

HO

OH

(22) 3-O-β-D-glicopiranosil quercetina

11

1.3 Considerações Sobre o Gênero Tocoyena

O gênero Tocoyena, para o qual são descritas cerca de 30 espécies com

distribuição neotropical, ocorrendo na América Central e América do Sul, até o sul do

Brasil. São espécies típicas do Cerrado, sendo encontradas preferencialmente no

Cerrado stricto senso, mas também ocorrem em florestas com clima quente e úmido,

como a Floresta Amazônica. Todos os representantes do gênero são árvores de

pequeno porte ou arbustos (Coelho et al, 2006).

O gênero Tocoyena pertence à subfamília Ixoroideae, sendo os iridóides

considerados seus principais marcadores quimiotaxonômicos. Além de iridóides, a

subfamília é conhecida por metabolizar flavonóides, triterpenos, derivados fenólicos

e alcalóides do tipo emetínicos, quinolínicos e poliindolenínicos (Hamerski et al,

2005).

Foram encontrados na literatura apenas quatro relatos sobre avaliações

fitoquímicas de quatro espécies no gênero Tocoyena, mencionadas a seguir:

Tocoyena formosa K. Schum. é uma espécie lenhosa de porte arbustivo-

arbóreo, de ampla distribuição geográfica no bioma Cerrado e conhecida

popularmente como olho-de-boi (Carvalho et al, 2007). É uma espécie da América

do Sul, encontrada no Paraguai, Bolívia e Brasil (Coelho et al, 2006). Essa planta é

muito usada, pela população em geral, no tratamento de inflamações ósseas

e musculares, entorses e inchações, e também como calmante cardíaco. Da casca

do caule é preparado um cataplasma, que é aplicado diretamente sobre a área

lesionada, deixando o local enegrecido e acelerando o processo de reparo (Azevedo

et al, 2006).

Estudos fitoquímicos realizados com T. formosa revelaram a presença de

iridóides, entre eles o α-gardiol (23) e β-gardiol (24), os quais apresentaram

atividade antifúngica (Bolzani et al, 1997). Foram também isolados os iridóides

galiosídeo (25) e o apodantosídeo (26) (Bolzani et al, 1996) .

12

O

OH

HH3CO2C

H

O

HO

O

OH

CO2CH3H

H

OHO

(23) α-gardiol (24) β-gardiol

O

CO2CH3

H

OH

HO

H

HO

O

CO2CH3

H

O

H

HO2CO

OH

OH

HO

HO

(25) Galiosídeo (26) apodantosídeo

Tocoyena bullata Schum. é uma árvore pequena encontrada principalmente na

Zona Litorânea e na Restinga. É uma espécie atraente pela coloração de suas

folhas verde-brilhantes e pela disposição congesta das mesmas, associadas às

flores brancas, que a tornam possuidora de grande potencial ornamental. A

avaliação fitoquímica conduziu ao isolamento do iridóide gardenosídeo (27) (Poser,

1998).

O

OO

H3C

OH

H

H

OHO

O

H

OH

HO

HO

HO

(27) gardenosídeo

13

Tocoyena brasiliensis Mart., conhecida popularmente como genipapinho, é

facilmente encontrada no Brasil, exceto na região sul (Delprete, 2008). No trabalho

desenvolvido por Hamerski e colaboradores (2005), foram isolados um flavonóide

glicosilado, identificado como sendo o ramanzina-3-O-rutinosídeo (28) e duas

misturas binárias de saponinas triterpênicas, a primeira contendo o ácido 3-O-β-D-

quinovopiranosíl quinóvico (29) e o ácido 3-O-β-D-quinovopiranosíl cinchólico (30) e

a segunda, o ácido 3-O-β-D-glicopiranosíl quinóvico (31) e o ácido 28-O-β-D-

glicopiranosílquinóvico (14).

OHO

OH O

O

OH

OCH3

O

O

HOHO

OH O

OH

HO

OH

(28) ramanzina-3-O-rutinosídeo

O

COOH

COOH

O

OH

HO

HO

H

H

H

(29) ácido 3-O-β-D-quinovopiranosíl quinóvico

O

COOH

COOH

O

OH

HO

HO

H

H

H

(30) ácido-3-O-β-D-quinovopiranosíl cinchólico

14

O

COOH

COOH

O

OH

HO

HO

HO

H

H

H

(31) ácido 3-O-β-D-glicopiranosíl quinóvico

Tocoyena selloana K. Schum., conhecida como genipapo bravo, é uma

árvore pequena. A casca do caule é utilizada na medicina popular como

antiinflamatório sob forma de compressas em áreas afetadas por contusões. De um

espécime desta planta, foram isolados uma cumarina, a escopoletina (32), e uma

saponina triterpênica, o ácido 3-β-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31), além de dois

iridóides, o β-gardiol (24) e seu epímero (33) (Jane et al, 1997).

O

MeO

HO O

O

OH

CO2MeH

H

OHO

(32) escopoletina (33) epímero do β-gardiol

1.4 Considerações Sobre a Esquistossomose

As esquistossomoses são doenças transmitidas por trematódeos do gênero

Schistosoma que, para o homem, têm como principais agentes etiológicos as

espécies S. mansoni, S. heamatobium e S. japonicum (Pordeus et al, 2008).

O controle da esquistossomose é uma das tarefas mais difíceis dos serviços

de Saúde Pública. A importância da doença não se restringe à persistência da

prevalência e larga distribuição geográfica no mundo. Ela diz respeito, também, ao

mecanismo de escape do molusco frente ao moluscicida, precárias condições de

moradia e saneamento básico, atividades econômicas ligadas ao uso da água –

15

principalmente em zonas rurais –, longo tempo para educação sanitária e adesão

aos programas de controle. Além disso, há de se considerar a inexistência de

mecanismos naturais de defesa imunológica, bem como de uma vacina efetiva

(Pordeus et al, 2008).

A esquistossomose mansônica é uma endemia mundial, ocorrendo em 52

países e territórios, principalmente na América do Sul, Caribe, África e Leste do

Mediterrâneo, onde atinge as regiões do Delta do Nilo, além de países como Egito e

Sudão. No Brasil, a transmissão ocorre em 19 estados, numa faixa contínua ao

longo do litoral, desde o Rio Grande do Norte até o interior do Espírito Santo e Minas

Gerais. Atualmente, as prevalências mais elevadas são encontradas nos estados de

Alagoas, Pernambuco, Sergipe, Minas Gerais, Bahia, Paraíba e Espírito Santo

(Ministério da Saúde, 2005). Em Alagoas, 60% do território é área endêmica e mais

de dois milhões de indivíduos estariam expostos à infecção (Couto, 2005).

O ciclo biológico de transmissão da esquistossomose é descrito da seguinte

forma. Os ovos do S. mansoni são eliminados pelas fezes do hospedeiro humano

infectado e, se as fezes são lançadas nas coleções de água doce, eles eclodem

liberando uma larva ciliada, denominada miracídio, responsável por infectar o

hospedeiro intermediário. Após quatro a seis semanas, as larvas abandonam o

caramujo e ficam livres na água, na forma de cercária. Se o homem tiver contato

com águas infectadas pelas cercárias, estas penetram ativamente, pela pele e

mucosa, fazendo com que o indivíduo adquira a infecção. O verme se desenvolve no

organismo humano durante duas a seis semanas após a penetração das cercarias

(Figura 2, p. 16). Passado esse período, o homem infectado pode transmitir a

doença eliminando ovos de S. mansoni nas fezes, por muitos anos. O verme, por si

só, não é capaz de induzir uma significante patologia no homem. A deposição de

ovos no fígado e outros órgãos, entretanto, é o responsável pela vigorosa resposta

inflamatória. Assim, no combate a esquistossomose há dois caminhos a seguir: o

tratamento de indivíduos infectados e a profilaxia mediante a destruição dos

caramujos que são hospedeiros intermediários, com o uso de substâncias

moluscicidas (Pordeus et al, 2008; Ministério da Saúde, 2005).

As substâncias moluscicidas são um fator crucial para o controle da

esquistossomose. Apenas uma substância sintética, a niclosamida (34), é

recomendada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como moluscicida. Em

16

países do Terceiro Mundo o uso de moluscicidas sintéticos tem causado problemas

de toxidade, contaminação do meio ambiente e a resistência dos caramujos

(Biomphalaria glabrata) transmissores da esquistossomose. Em contraste, o uso de

plantas com atividade moluscicida pode representar uma alternativa barata, além de

não poluir o meio ambiente (Pinheiro et al, 2003).

N

Cl

Cl

NO2

OH

O

H

(34) niclosamida

(http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/IFN_Esquisto.htm acessado em abril de 2008).

Figura 2. Ciclo de vida do Schistosoma.

17

1.5 Considerações Sobre a Dengue

A dengue tem se destacado entre as enfermidades reemergentes e é

considerada a mais importante das doenças virais transmitidas por artrópodos. A

incidência de dengue tem aumentado nas últimas décadas. A doença ocorre em

mais de 100 países e expõe mais de 2,5 bilhões de pessoas ao risco de contraí-la

nas áreas urbanas, periurbanas e rurais dos trópicos e subtrópicos. A dengue é

endêmica na África, nas Américas, no Leste do Mediterrâneo, no Sudeste Asiático e

no Oeste do Pacífico (Braga & Valle, 2007).

A dengue ocorre e dissemina-se especialmente nos países tropicais, onde as

condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do

Aedes aegypti, principal mosquito vetor. O A. aegypti, encontrou no mundo moderno

condições muito favoráveis para uma rápida expansão, pela urbanização acelerada

que criou cidades com deficiências de abastecimento de água e de limpeza urbana;

pela intensa utilização de materiais não-biodegradáveis, como recipientes

descartáveis de plástico e vidro; e pelas mudanças climáticas (FUNASA, 2002;

Ministério da Saúde, 2005).

O combate ao mosquito A. aegypti (Figura 3, p. 18) deve ser feito de duas

maneiras: eliminando os mosquitos adultos e, principalmente, acabando com os

criadouros de larvas. O inseticida aplicado em regiões epidêmicas, elimina apenas a

forma adulta do mosquito, mas não tem nenhuma eficácia para acabar com as

larvas desse inseto. Para controlar os criadouros, foram utilizadas alternativas tais

como: controle biológico através de peixes, moluscos, bactérias etc; uso de

larvicidas químicos, como o temefós e o metoprene (Cavalcanti et al, 2004).

http://www.rc.unesp.br/ib/zoologia/%20.htm, acessado em setembro de 2009.

Figura 3. Mosquito Aedes aegypti

18

Com o surgimento de formas resistentes do mosquito aos inseticidas

convencionais utilizados, tem crescido a procura por extratos vegetais e substâncias

naturais que sejam efetivas no combate ao mosquito adulto e/ou à larva de A.

aegypti e que sejam isentas de toxidade para o meio ambiente. Plantas, como

organismos que co-evoluem com insetos e outros microorganismos, são fontes

naturais de substâncias inseticidas e antimicrobianas (Simas et al, 2004).

Dentre as substâncias extraídas de plantas com propriedades larvicidas

cientificamente comprovadas, destacam-se o ácido anacárdico (35), e os

sesquiterpenos: E-nerolidol (36) e E, E-farnesol (37) (Cavalcanti et al, 2004).

OH

COOH

(35) Ácido anacárdico

HO

OH

(36) E-nerolidol (37) E, E-farnesol

1.6 Caracterização da Espécie

A espécie Tocoyena selloana (Cham. & Schltdl.) K. Schum. (Figura 4),

pertencente à família Rubiaceae, com distribuição neotropical, tem como sinônimos:

Gardenia sellowiana Cham. & Schltdl., T. sellowiana, T. brasiliensis e T.

lichmophora. No Brasil, ocorre nos Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Minas Gerais,

Pará, Paraná, Paraíba, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte e Santa

Catarina. É geralmente encontrada na mata úmida e em outros ambientes

litorâneos.

19

São plantas lenhosas com altura variando de 2 - 4m de altura, caule glabro e

entrenós 0,7- 4,2 cm de comprimento. Estípulas 0,5-0,9 x 0,4-0,5 cm, inteiras,

triangulares e glabras. Folhas obovada a lanceoladas, limbo com 8,3-16,5 x 5,2-

10,5 cm, pecíolo 0,9-1,6 cm, opostas, membranáceas a cartáceas, glabras em

ambas as faces, cor castanha quando seca, margem inteira, ápice obtuso a agudo,

base atenuada a aguda, nervura peninérvea, 7-10 pares de nervuras. Inflorescência

em dicásio compostos terminais, flores diclamídeas, andrógenas. Cálice

campanulado esverdeado, persistente, 1,1-1,5cm de comprimento. Corola amarela,

pentâmera, tubo 11,1-13,2 de comprimento. Ovário bilocular, pluriovular. Estilete

terminal, bífido, 10,6 – 10,9cm de comprimento. Estames 5 livres, sésseis; anteras

0,8-1,0cm de comprimento, dorsifixas, amarelas. Frutos carnosos tipo baga,

subglobosa, glabra. Sementes lisas (Rocha, 2007).

Figura 4. Fotos de Tocoyena selloana (Rocha, 2007)

20

2. OBJETIVOS

21

2.1 Objetivo Geral

Realizar análise fitoquímica dos extratos das folhas e do caule da espécie

Tocoyena selloana (genipapo bravo) e avaliar as atividades moluscicida e larvicida.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a atividade moluscicida e larvicida dos extratos etanólicos e frações,

provenientes dos extratos etanólicos das folhas e caule de um espécime de

Tocoyena selloana (genipapo bravo) coletada em Barra de São Miguel/Alagoas.

Conhecer a composição química das folhas e caule de Tocoyena selloana

(genipapo bravo).

Contribuir para o conhecimento de alguns constituintes químicos e atividade

biológica das plantas do estado de Alagoas.

22

3. PARTE EXPERIMENTAL

23

3.1 Solventes, Reagentes e Equipamentos

Na preparação dos extratos utilizou-se percolador de aço inoxidável;

Nas separações cromatográficas utilizou-se gel de sílica 60 (70-230 e 230-

400 mesh da Merck) e Sephadex LH-20, bem como solventes (hexano,

clorofórmio, acetato de etila, e metanol) pró-análise (P.A.)(Dinâmica);

A concentração das soluções com grande volume foi efetuada em evaporador

rotatório (Büchi, modelo RE-111), e as com volume pequeno a temperatura

ambiente e em capela de exaustão (Permution);

Nas separações cromatográficas em coluna, utilizou-se como adsorvente

sílica (70-230 mesh). O tamanho e o diâmetro da coluna variaram de acordo

com a quantidade da amostra e da sílica a serem empregadas;

Nas permeações em gel foi utilizada Sephadex LH-20 (Pharmacia);

Nas cromatografias em camada delgada foram utilizadas cromatoplacas pré-

fabricadas (Merck), bem como confeccionadas no próprio laboratório (0,75

mm de espessura) utilizando-se sílica gel 60 da Merck. Sendo estas

preparadas utilizando-se suspensão de sílica gel em água destilada,

espalhada sobre placas de vidro através de um espalhador mecânico e

ativadas em estufa (Biopar) a 100ºC;

Os cromatogramas foram revelados através de irradiação com luz

ultravioleta em comprimento de onda 245 e 365 nm, imersão em cubas

contendo vapores de iodo, borrifação com reagente de Lieberman-Burchard e

borrifação com solução ácida de sulfato cérico;

Os pontos de fusão foram determinados usando um aparelho da Macro

Química, modelo MQAPF-302;

Na secagem da vidraria utilizou-se estufa de esterilização universal Biopar,

modelo S225T;

As pesagens dos extratos e frações foram efetuados em balança eletrônica

analítica (Shimadzu, modelo AX200) ou semi analítica (OHAUS);

Nas dissoluções dos extratos utilizou-se ultra-som Branson (mod. 1210);

Os espectros de RMN (1H: 400 MHz; 13C: 100 MHz) foram registrados em

espectrômetro da Brüker Avance 400 do Instituto de Química e Biotecnologia

24

da Universidade Federal de Alagoas e as amostras foram dissolvidas em

solventes deuterados (metanol, clorofórmio, piridina e água);

Os espectros no Infravermelho foram obtidos em equipamento Varian 660-IR,

utilizando acessório ATR;

A solução ácida de sulfato cérico utilizada como revelador foi preparada com

0,30g de sulfato cérico e 7 mL de ácido sulfúrico 100 mL de solução aquosa

(Matos, 1997).

O reagente de Liebermann-Burchard foi preparado com 50 mL de anidrido

acético e 1mL de ácido sulfúrico concentrado. Este reagente é utilizado para

diferenciar triterpenóides de esteróides, através da mundança de coloração.

Para triterpenóides a coloração varia de rósea a vermelho, já para esteróides

apresenta coloração azul esverdeado (Matos, 1997).

Os solventes utilizados (Hexano, clorofórmio, acetato de etila, butanol,

metanol e etanol) foram P. A. da marca Dinâmica Química.

3.2 Coleta e identificação do Material Vegetal

O caule e as folhas da espécie vegetal Tocoyena selloana foram coletados

em março de 2007, no município de Barra de São Miguel – Alagoas. A identificação

botânica foi realizada pela botânica Ms. Rosário de Fátima de Almeida Rocha do

Instituto de Desenvolvimento Científico e Tecnológico de Xingó (Instituto Xingó),

onde exsicata da planta foi catalogada no Herbário Xingó - HXG, da Unidade de

Projetos Biodiversidade da Caatinga do referido instituto, sob o número HXG nº

05217.

3.3 Preparação dos Extratos das Folhas e do Caule

3.3.1 Preparação dos Extratos e Frações das folhas de T. selloana

As folhas, após secagem à temperatura ambiente e trituração por

turbopercolação, foram extraídas através de maceração com etanol. Após

concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, o extrato

25

bruto resultante (222,0 g) foi suspenso em uma solução de metanol e água (4:1) e

extraído exaustivamente e sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila

e n-butanol. Após concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador

rotativo, foram obtidas as frações em hexano (19,9 g), clorofórmio (68,6 g), acetato

de etila (27,7 g), n-butanol (26,7 g) e em água (43,0 g) (Esquema 2, p. 31).

3.3.2 Preparação dos Extratos e Frações do caule de T. selloana

O caule, após secagem à temperatura ambiente e trituração, foi extraído

através de maceração com etanol. Após concentração das soluções, sob pressão

reduzida em evaporador rotativo, resultaram 155,5 g de extrato. O extrato bruto foi

suspenso em uma solução de metanol e água (3:2) e extraído exaustivamente e

sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila e n-butanol. Após

concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, foram

obtidas as frações em hexano (26,0 g), clorofórmio (25,3 g), acetato de etila (12,3 g),

n-butanol (16,8 g) e em água (25,1 g) (Esquema 3, p. 32).

3.4 Isolamento e Purificação das Substâncias

3.4.1 Fração em Hexano das folhas de T. selloana

A fração em hexano (17,5g), proveniente da partição do extrato etanólico das

folhas, foi submetida à fracionamento cromatográfico, utilizando-se gel de sílica

(230-400 mesh) como fase estacionária e como eluentes: hexano, n-hexano/CHCl3

33%, n-hexano/CHCl3 50%, CHCl3, AcOEt, AcOEt/MeOH 2%, AcOEt/MeOH 5% e

MeOH (Quadro 1). Este procedimento forneceu 56 subfrações de 125mL, as quais

foram reunidas em cinco grupos (1-13, 14-16, 17-26, 27-38 e 39-56), após

eliminação dos solventes sob pressão reduzida e análise comparativa por

cromatografia em camada delgada (CCD).

26

Quadro 1. Cromatografia da fração hexânica resultante do

extrato etanólico das folhas de T. selloana

Eluentes Subfrações (125mL)

n-hexano 1-10

n-hexano / CHCl3 33% 11-26

n-hexano / CHCl3 50% 27-34

CHCl3 35-40

AcOEt 41-44

AcOEt / MeOH 2% 45-46

AcOEt / MeOH 5% 47-48

MeOH 49-56

O grupo de subfrações 17-26 (1,0 g), eluídas em n-hexano/CHCl3 33%, foi

submetido à cromatografia utilizando coluna de sílica. Este procedimento forneceu

220 frações com volume médio de 5 mL cada, as quais, após análise comparativa

através de cromatografia em camada delgada de sílica, foram reunidas em 7 grupos

(Quadro 2).

Quadro 2. Fracionamento cromatografico da subfração 17-26 da fração hexânica

das folhas de T. selloana

Grupos Frações reunidas Massa (mg) Substância

isolada

I 1-26 40

II 27-52 60

III 53-76 90

IV 77-91 200 TsFH-1

V 92-125 410 TsFH-1

VI 126-164 130

VII 165-220 60

O grupo IV (frações 77-91), após ser submetido a novo procedimento

cromatográfico utilizando coluna de sílica forneceu um sólido branco cristalino, de

ponto de fusão 232-234ºC, codificado de TsFH-1 (13 mg).

27

O grupo V (frações 92-125) foi submetido a novo procedimento

cromatográfico, utilizando coluna de sílica, obtendo-se 24 mg de um sólido branco

cristalino, de ponto de fusão 232-234 ºC, o qual após análise, observou-se que

também se tratava da substância codificada de TsFH-1.

Os demais grupos de frações não conduziram ao isolamento de substâncias.

3.4.2 Fração em Clorofórmio das folhas de T. selloana

Parte da fração clorofórmica das folhas (36,0 g) foi submetida à filtração em

sílica. Desta filtração resultaram as subfrações em n-hexano (0,1 g), n-hexano/CHCl3

50% (1,9 g), CHCl3 (5,6 g), AcOEt (13,3 g) e MeOH (13,2 g) (Esquema 1, p. 28).

A subfração em clorofórmio (5,6 g) foi submetida à fracionamento

cromatográfico utilizando coluna de sílica. Esta forneceu 365 frações, que após

análise comparativa através de cromatografia em camada delgada de sílica, foram

reunidas em 5 grupos. O grupo de frações 42-102, eluído em hexano/acetato de etila

50%, após sucessivos procedimentos cromatográficos utilizando coluna de sílica

forneceu um sólido branco cristalino, de ponto de fusão 218-221ºC, codificado de

TsFC-1 (25 mg).

A subfração em metanol (13,2 g) oriunda da fração clorofórmica das folhas foi

realizado procedimento cromatográfico utilizando coluna de sílica. A fração 24,

eluída em acetato de etila/metanol 5%, após concentração do solvente em capela de

exaustão, mostrou-se como um sólido amorfo de coloração amarela, esta fração foi

então submetida à permeação em Sephadex, a qual originou 14 frações que foram

reunidas através de análise comparativa por CCD. As frações reunidas 6-13 foram

recromatografadas utilizando coluna de sílica, este procedimento forneceu um sólido

branco cristalino, de ponto de fusão 245-248 ºC, codificado de TsFC-2 (16 mg).

28

ESQUEMA 1: Procedimento realizado com a fração clorofórmica das folhas.

Partição

Fração em

C6H14/CHCl3

50%

(1,9 g)

Fração em

C6H14

(0,1 g)

Fração em

CHCl3

(5,6 g)

Fração em

AcOEt

(13,3 g)

Fração em

MeOH

(13,2 g)

Coluna de sílica

TsFC-1

(25 mg)

Fração em CHCl3

(Folhas)

(36,0 g)

Frações 27-41

(170 mg)

Frações 1-26

(110 mg)

Frações

103-138

(1,3 g)

Frações

42-102

(1,5 g)

Frações

139-365

(1,0 g)

Colunas de sílica

Coluna de sílica

Frações 14

(30 mg) Frações 6-13

(110 mg) Frações 1-5

(80 mg)

TsFC-2

(16 mg)

Coluna de sílica

Sephadex

Frações 1-11

(600 mg)

Fração 24

(250 mg)

Frações 12-23

(2,0 g)

Frações 25-29

(190 mg)

29

3.4.3 Fração em acetato de etila das folhas de T. selloana

A fração em acetato de etila (27,7g), apesar das tentativas de purificação

utilizando coluna cromatográfica de sílica, permeação em Sephadex e lavagens com

diversos solventes, não conduziu ao isolamento de substância com grau de pureza

apropriado para determinação estrutural.

3.4.4 Fração aquosa das folhas de T. selloana

A fração aquosa (43,0 g), oriunda do extrato etanólico das folhas, foi

submetida à lavagem com metanol à temperatura ambiente, seguida de filtração,

resultando cristais de coloração verde-claro (230 mg). A água-mãe resultante da

filtração, foi submetida à permeação em Sephadex, utilizando metanol/água 30%

(frações 1 e 2 com 125 mL cada) e metanol (frações 3 e 4 com 125 mL cada). A

fração 1, foi tratada com etanol dando origem a um material branco amorfo.

Utilizando-se metanol/água 10%, o material branco amorfo foi submetido à

cristalização. Observou-se a formação de cristais finos, de ponto de fusão 163-

165ºC, que foram codificados de TsFA-1 (530 mg). O mesmo procedimento foi

adotado para a fração 2, fornecendo cristais finos, de ponto de fusão 164-167ºC, o

qual observou-se também se tratar da substância codificada de TsFA-1 (95 mg).

O material cristalino de coloração verde-claro, oriundo da fração aquosa das

folhas (Esquema 2, p. 32), foi dissolvido em metanol/água 30% e submetido à

permeação em Sephadex, originando 8 frações. As frações 2-6 foram reunidas e

após tratamento com etanol formou-se um material branco. Utilizando-se

metanol/água 10%, o material foi submetido a recristalização a qual deu origem a

uma solução contendo cristais finos em forma de agulhas, de ponto de fusão 162-

165ºC, que foi submetida a filtração a vácuo e posteriormente com os dados de

RMN verificou-se que também era a substância codificada de TsFA-1 (50 mg).

3.4.5 Fração em Acetato de Etila do Caule de Tocoyena selloana

A fração em acetato de etila (12,3 g), proveniente da partição do extrato

etanólico do caule (Esquema 3, p. 32), foi submetida à cromatografia em coluna de

30

sílica, obtendo-se 10 frações com volume médio de 125 mL cada, após

concentração das soluções em evaporador rotativo, foi observado que a fração 9,

eluída em acetato de etila/metanol 50%, apresentava sólido de coloração escura.

Esta fração foi submetida à recristalização usando metanol/água 10%,

originando cristais finos, de ponto de fusão 154-156 ºC, que apesar da diferença de

pontos de fusão também se tratava de TsFA-1 (114 mg).

3.4.6 Fração Aquosa do Caule de Tocoyena selloana

A fração aquosa do caule (25,1 g) foi submetida à filtração em sílica gel,

utilizando funil de separação sob vácuo. Foram obtidas as frações em hexano (0,4g),

clorofórmio (2,2g), acetato de etila (3,8g), metanol (1,7g) e aquosa (4,7g) (Esquema

3, p. 32).

A fração metanólica (1,7 g) proveniente da filtração em sílica da fração

aquosa do caule (Esquema 3, pág. 32), apresentou material branco com aspecto de

farinha. Este foi suspenso em uma solução de metanol e água (4:1), e extraído

sucessivamente com hexano, clorofórmio, acetato de etila e n-butanol. Após

concentração das soluções, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, foram

obtidas as subfrações em hexano (30 mg), clorofórmio (40 mg), acetato de etila (290

mg), butanol (410 mg) e metanol (270 mg).

A subfração em acetato de etila, após eliminação do solvente apresentou

material cristalino de coloração amarronzada. Depois de ser solubilizado em

metanol/água 30% foi filtrado a vácuo, obtendo-se o material cristalino ainda com

uma coloração marrom. Este foi submetido à recristalização usando metanol/água

10% e forneceu cristais finos, de ponto de fusão 164-166 ºC, que também foi

confirmado como TsFA-1 (88 mg).

A subfração butanólica foi submetida à permeação em Sephadex, fornecendo

um material branco que foi cristalizado, levando a quantidade adicional de TsFA-1

(27 mg).

31

ção

ESQUEMA 2: Procedimento efetuado com as Folhas de T. selloana

1. Maceração com etanol

2. Concentração

Partição

Extrato EtOH

(222,0 g)

Fração em CHCl3

(68,6 g)

Fração em C6H14

(19,9 g)

Fração em AcOEt

(27,7 g) Fração em BuOH

(26,7 g) Fração aquosa

(43,0 g) Filtração

Fração em MeOH

(16,6 g) Fração em CHCl3

(5,6 g) Material cristalino

(230 mg)

TsFC-2

(16 mg) TsFC-1

(25 mg)

TsFH-1

(13 mg)

Coluna de sílica

Colunas de sílica Colunas de sílica

Tratamento com MeOH

Filtração a vácuo

Água-mãe

TsFA-1

(50 mg)

TsFA-1 (530 mg)

Sephadex/

Cristalização

Sephadex/

Cristalização

TsFA-1 (95 mg)

Folhas (Trituradas)

(892,0 g)

Frações 14-16

(600 mg) Frações 17-27

(1,0 g)

Frações 77-91

(180 mg) Frações 92-105

(300 mg)

TsFH-1

(24 mg)

32

ESQUEMA 3: Procedimento realizado com o Caule de T. selloana

Maceração com etanol / Concentração

Partição

Fração em CHCl3

(25,3 g) Fração em C6H14

(26,0 g) Fração em AcOEt

(12,3 g) Fração em BuOH

(16,8 g) Fração aquosa

(25,1 g)

Fração 9

(1,2 g)

TsFA-1

(25 mg)

Colunas de sílica

Recristalização

Caule (Triturado)

(4492,6 g)

Extrato EtOH

(155,5 g)

Fração em CHCl3

(2,2 g) Fração em C6H14

(0,4 g) Fração em AcOEt

(3,8 g) Fração em MeOH

(1,7 g) Fração aquosa

(4,7 g)

Partição

Filtração

em sílica Fração 10

(1,9 g)

Frações 4-8

(5,8 g)

Frações 1-5

(2,6 g)

Subfração em

CHCl3 (40 mg)

Subfração em

C6H14 (30 mg)

(10 mg)

Subfração em

AcOEt (290 mg) Subfração em

BuOH (410 mg) Subfração em

MeOH (270 mg)

Filtração a vácuo

Material solúvel

Material cristalino

(210 mg)

TsFA-1 ( 88mg)

Recristalização Recristalização

Sephadex

Frações 1-6

(220 mg)

Fração 7

(110 mg) Frações 8-11

(70 mg)

TsFA-1 ( 27 mg)

33

3.5 Ensaios Biológicos

3.5.1 Atividade Larvicida Frente às Larvas do Mosquito Aedes aegypti

Os ensaios biológicos com as larvas de A. aegypti foram realizados no

laboratório de bioensaios do Instituto de Química e Biotecnologia da Universidade

Federal de Alagoas (IQB / UFAL), sob a orientação do Professor Antônio Euzébio

Goulart Sant’Ana e supervisão do doutorando Karlos Lisboa, utilizando-se de larvas

no quarto estágio, segundo metodologia preconizada pela Organização Mundial de

Saúde (OMS 1970). O quadro 3 relaciona os extratos que foram avaliados.

Quadro 3. Extratos e Frações submetidos aos ensaios larvicida

Partes da Planta Extratos

Folhas Extrato bruto e frações em C6H14, CHCl3, AcOEt,

BuOH e aquosa

Caule Extrato bruto e frações em C6H14, CHCl3, AcOEt,

BuOH e aquosa

Após a pesagem dos extratos, estes foram dissolvidos em solução aquosa de

dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% até a concentração de 500 ppm. Quando foi

considerado promissor (causou mortalidade superior a 75%), foi analisado em

menores concentrações visando à obtenção das concentrações letais (CL50).

Os testes preliminares foram feitos em duplicatas com 10 larvas em copos

descartáveis de 200 mL contendo 25 mL de solução. As larvas foram consideradas

mortas quando não conseguiam atingir a superfície da solução quando o recipiente

era agitado. A contagem das larvas foi realizada a hora 0 (início do experimento),

24h e 48h, como controle negativo foi utilizada uma solução a 1% de DMSO e como

controle positivo foi usada a rotenona (38) que é o larvicida sintético comercialmente

disponível.

34

O

OO

H

H

H

OCH3

H3CO

O

(38) rotenona

Dos extratos testados, foram considerados promissores e submetidos a testes

quantitativos, aqueles que obtiveram percentual de mortalidade larval superior a

75%. Os dados concentração x mortalidade dos ensaios apurados foram submetidos

a tratamento estatístico utilizando o programa Probity, para a determinação dos

valores de concentração letal (CL50).

3.5.2 Atividade Moluscicida

Nos ensaios biológicos de atividade moluscicida, foram utilizados caramujos

da espécie Biomphalaria glabrata Say criados em laboratório e descendentes de

exemplares, não infectados por trematódeos, originários da região do Barreiro de

Cima, zona periférica de Belo Horizonte, Minas Gerais. Essa população caracteriza-

se por possuir 5% de exemplares albinos (Santos, 2005). Os testes com os extratos

foram realizados no laboratório de bioensaios do Instituto de Química e

Biotecnologia da UFAL, sob orientação do Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart

Sant’Ana e supervisão da doutoranda Cenira Monteiro. Utilizando-se do caramujo B.

glabrata na fase adulta, de acordo com o protocolo da Organização Mundial de

Saúde (OMS, 1994).

Os ensaios biológicos consistiram na imersão dos caramujos em uma solução

aquosa a 100 ppm (100 g mL-1) dos extratos etanólicos brutos e também das

frações oriundas da partição. Foram utilizados 5 caramujos por concentração e os

testes realizados em duplicata. Dois conjuntos de controle foram usados visando

verificar a suscetibilidade dos caramujos, um positivo com niclosamida (34) a 3 ppm

e um negativo - somente com água desclorada.

35

O tempo de exposição destes organismos foi de 24 horas e o de observação

72 horas, com leitura e troca de água a cada 24 horas, além da remoção dos

exemplares mortos. Durante o período de observação foram alimentados com

alface.

A morte dos caramujos foi indicada pela descoloração, ausência de

contrações musculares, hemorragia e deterioração dos tecidos do corpo.

3.6 Dados Físicos e Espectroscópicos das Substâncias Isoladas

3.6.1 Substância TsFA-1

Sólido branco cristalino, isolado da fração aquosa das folhas e das frações

metanólica e em acetato de etila do caule.

P.f. = 164-166 ºC; p.f. 165-168 ºC (Oliveira et al, 2009).

IV (cm-1) (ATR) 3400, 3300, 2900, 1100, 1050 (Figura 5, p. 54)

RMN 1H (400 MHz, D2O ,δ) (Figura 6, p. 55)

RMN 13C (100 MHz, D2O ,δ) (Figura 7, p. 56)

RMN DEPT 135º (100 MHz, D2O ,δ) (Figura 8, p. 56)

3.6.2 Substância TsFH-1

Sólido branco cristalino, isolado da fração hexânica das folhas.

P.f. = 232-234 ºC; p.f. 232-235 ºC (Costa et al, 2008).

RMN 1H (400 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 9 e 10, p. 57 e 58)

RMN 13C (100 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 11 e 12, p. 59 e 60)

RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3/DMSO-d6 ,δ) (Figuras 13 e 14, p. 61 e 62)

3.6.3 Substância TsFC-2

Sólido branco cristalino, isolado da fração clorofórmica das folhas.

P.f. = 246-248 ºC; p.f. 252-254 ºC (Jane et al, 1997)

IV (cm-1) (ATR) 3600-3200, 3000-2500, 1650, 1000 (Figura 15, p. 63)

RMN 1H (400 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 16-18, p. 64-66)

36

RMN 13C (100 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 19 e 20, p. 67 e 68)

RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3/CD3OD ,δ) (Figuras 21 e 22, p. 69 e 70)

3.6.4 Substância TsFC-1

Sólido branco cristalino, isolado da fração clorofórmica das folhas.

P.f. = 218-221 ºC

IV (cm-1) (ATR) 2900, 2850, 1700 (Figura 23, p. 71)

RMN 1H (400 MHz, C5D5N ,δ) (Figura 24, p. 72)

RMN 13C (100 MHz, C5D5N, δ) (Figuras 25 e 26, p. 73 e 74)

RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N, δ) (Figuras 27 e 28, p. 75 e 76)

37

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

38

4.1 Identificação Estrutural das Substâncias Isoladas

4.1.1 Identificação Estrutural da Substância TsFA-1

A substância codificada de TsFA-1, de ponto de fusão 164-166ºC, isolada

como um sólido branco cristalino, foi obtida a partir da fração aquosa das folhas e

das frações em acetato de etila e aquosa do caule.

A cromatografia em camada delgada do constituinte TsFA-1 não apresentou

fluorescência quando irradiada com ultravioleta, também não apresentou revelação

utilizando o reagente de Liebermann-Burchard e solução ácida de sulfato cérico.

O espectro no infravermelho (IV) (Figura 5, p. 54) de TsFA-1 apresentou

bandas de absorção intensas em 3400 e 3300 cm-1, em 2900 cm-1 e 1100 e 1050

cm-1, sugestivas de um composto alifático poliidroxilado (Barbosa, 2007).

O espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H)

(Figura 6, p. 55; Tabela 1, p. 39) apresentou quatro sinais referentes a 8 hidrogênios

carbinólicos, sendo dois duplo dupletos em δ 3,54 (J=11,0 e 5,8Hz) e 3,74 (J=11,0 e

2,5Hz), um duplo duplo dupleto em δ 3,62 (J=8,6, 5,8 e 2,5Hz) e um dupleto em δ

3,67. Esses dados aliados as informações obtidas no espectro de infravermelho

sugeriram que TsFA-1 se tratava de um poliálcool (Paula et al, 1998).

A análise do espectro de Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN

13C) (Figura 7, p. 56; Tabela 2, p. 40) revelou a presença de apenas três sinais (δ

63,1, 69,1, 70,7) e o experimento DEPT permitiu atribuir o sinal de carbono em δ

63,1 a um CH2 e os sinais em δ 69,1 e δ 70,7 a dois CH, o que levou a propor que a

substância em questão se tratava de um alditol com seis átomos de carbono e

simétrica, descartando assim a estrutura do D-Sorbitol (39), o qual é assimétrico, e

sugerindo um poliálcool simétrico, como o D-Manitol (40) ou o L-iditol (41).

A análise em conjunto dos dados dos espectros de infravermelho, RMN 1H,

RMN 13C e DEPT, em adição ao ponto de fusão (Quadro 4, p. 40), e comparação

com dados descritos na literatura para polióis, permitiram sugerir para a substância

TsFA-1, a estrutura do carboidrato (2R, 3R, 4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-

hexano, conhecido como D-manitol, o qual apresenta um eixo de simetria C2 e

quatro centros estereogênicos (Oliveira et al, 2009; Ferreira et al, 2009).

39

HO

OH

OHOH

OH

OH

HO

OH

OHOH

OH

OH

HO

OH

OHOH

OH

OH

(39) D-Sorbitol (40) D-Manitol (41) L-Iditol

O D-Manitol é um carboidrato natural encontrado em diversos vegetais como

beterraba, cebola, figo e azeitonas e também está presente em alguns exsudados

de árvores e algas marinhas (Ferreira et al, 2009). É um poliálcool muito utilizado

para os mais variados fins, como na indústria farmacêutica onde é usado como

excipiente do tipo diluente, em comprimidos que devem dissolver na boca, devido à

agradável sensação de doçura e frescor. Por não ser higroscópico é usado também

como estabilizante em comprimidos que contenham compostos sensíveis a

umidade, como a vitamina C e o ácido acetilsalicílico (Oliveira et al, 2008). É também

utilizado como diurético osmótico para neuroanestesia e neurorremediação devido

não ser absorvido no trato gastrointestinal (Oliveira et al, 2009).

Há alguns relatos na literatura de isolamento do D-Manitol na família

Rubiaceae (Silva et al, 2007; Lapikanon et al, 1983; Luciano et al, 2004). Já no

gênero Tocoyena não foi encontrado registro de isolamento, sendo portando,

descrito pela primeira vez neste gênero.

Tabela 1. Dados de RMN 1H (400 MHz, D2O) de TsFA-1 e do D-manitol (400

MHz, D2O) (Guimarães, 2006).

H TsFA-1 D-Manitol

1a 3,54 dd (J = 11,0 e 5,8Hz) 3,58 dd (J = 11,6 e 5,8Hz)

1b 3,74 dd (J = 11,0 e 2,5Hz) 3,78 dd (J = 11,6 e 2,5Hz)

2 3,62 ddd (J = 8,6, 5,8 e 2,5Hz) 3,68 ddd (J = 8,5, 5,8 e 2,5Hz)

3 3,67 d 3,71 d

40

Tabela 2. Dados de RMN 13C (100 MHz, D2O) de TsFA-1, do D-manitol (100

MHz, D2O) (Paula et al, 1998), do L-Iditol (100 MHz, D2O) (Liu & Liu,

2008) e do D-Sorbitol (100 MHz, DMSO-d6) (Margulies et al, 2000).

C TsFA-1 D-Manitol L-Iditol D-Sorbitol

1 63,1 63,7 66,0 63,7

2 69,1 69,6 73,5 73,4

3 70,7 71,2 72,0 70,7

4 70,7 71,2 72,0 72,6

5 69,1 69,6 73,5 72,5

6 63,1 63,7 66,0 63,8

Quadro 4. Valores de pontos de fusão de TsFA-1, do D-manitol (Oliveira et al,

2009), do D-Sorbitol (Willians et al, 2006) e do L-Iditol (Liu & Liu,

2008).

Substância Ponto de fusão (ºC)

TsFA-1 164-166

D-manitol 165-168

D-Sorbitol 95-99

L-Iditol 73-75

4.1.2 Identificação Estrutural da Substância TsFH-1

A substância codificada de TsFH-1, isolada como um sólido branco cristalino,

de ponto de fusão 232-234ºC, teve sua natureza triterpenoídica sugerida por

apresentar coloração rosa com o reagente de Liebermann-Burchard (Jain & Yadaya,

1994).

A análise dos dados do espectro de RMN 1H de TsFH-1 (400 MHz, CDCl3-

DMSO-d6) (Figuras 9 e 10, p. 57 e 58) permitiu identificar um sinal de hidrogênio

olefínico [δ 5,03 (sl)], sugerindo a presença de hidrogênio H-12 de triterpeno

pentacíclico com esqueleto ursano ou oleanano, tais como a α-amirina (42) e β-

amirina (43), respectivamente (Mahato & Kandu, 1994). Apresentou também sinal de

hidrogênio de carbono carbinólico [δ 3,44 (d, J = 7 Hz)] e vários sinais compatíveis

41

com deslocamentos químicos de hidrogênios metílicos (δ 0,48-1,23) e metilênicos (δ

1,34-2,89).

HO

H

H

H

HO

H

H

H

(42) α-amirina (43) β-amirina

Os dados obtidos dos espectros de RMN 13C e DEPT (100 MHz, CDCl3-

DMSO-d6) (Figuras 11 e 12, p. 59 e 60; Tabela 3, p. 41) permitiram reconhecer a

presença de 30 sinais de átomos de carbono, sendo sete carbonos não

hidrogenados, sete monoidrogenados, nove diidrogenados e sete triidrogenados.

Dentre esses, foram observados sinais com deslocamentos químicos compatíveis

com carbonos olefínicos [δ 137,8 (C, C-13) e δ 124,7 (CH, C-12)], característicos de

triterpenos com esqueleto urs-12-eno (Mahato & Kandu, 1994). Observaram-se

ainda, sinais para carbono carbonílico [δ 179,5] de ácido carboxílico e para carbono

carbinólico [δ 77,9]. A análise comparativa destas informações com os dados obtidos

na literatura (Junges et al, 2000) permitiram sugerir que TsFH-1 se tratava do ácido

3β-hidróxi-urs-12-en-28-óico, conhecido como ácido ursólico (19). A tabela 3 mostra

os dados de RMN 13C de TsFH-1, do ácido ursólico e da substância com esqueleto

oleanano, o ácido oleanólico (20).

Na família Rubiaceae existem vários relatos na literatura de isolamento do

ácido ursólico (Barros et al, 2008; Lima et al, 2009; Moura et al, 2006). Entretanto,

no gênero Tocoyena não foi encontrado registro de isolamento, sendo portando

descrito pela primeira vez neste gênero.

Várias atividades biológicas têm sido atribuídas ao ácido ursólico, tais como:

antiinflamatória, hepatoprotetora, antitumoral e antimicrobiana (Leite et al, 2001).

42

Tabela 3. Dados de RMN 13C de TsFH-1 (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6), dos ácidos

ursólico (50 MHz, CDCl3) (Junges et al, 2000) e oleanólico (CDCl3)

(Mahato & Kandu, 1994).

Posição TsFH-1 Ácido ursólico Ácido oleanólico

1 38,2 38,9 38,5 2 23,0 23,5 27,4 3 77,9 78,3 78,7 4 38,3 37,3 38,7 5 54,7 55,7 55,2 6 17,8 18,7 18,3 7 32,5 33,3 32,6 8 38,5 39,3 39,3 9 47,0 46,7 47,6

10 36,3 37,2 37,0 11 23,7 23,8 23,1 12 124,7 125,5 122,1 13 137,8 139,2 143,4 14 41,5 42,0 41,6 15 28,8 28,4 27,7 16 22,1 22,7 23,4 17 47,0 47,9 46,6 18 52,2 53,4 41,3 19 39,1 39,3 45,8 20 38,1 39,8 30,6 21 30,9 30,9 33,8 22 36,4 37,3 32,3 23 27,7 28,6 28,1 24 15,0 16,5 15,6 25 15,3 15,6 15,3 26 17,8 16,5 16,8 27 22,7 23,5 26,0 28 179,5 179,8 181,0 29 16,6 17,3 33,1 30 20,8 21,3 23,6

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

H

H

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29 30

H

H

H

(19) ácido ursólico (20) ácido oleanólico

43

4.1.3 Identificação Estrutural da Substância TsFC-2

A substância codificada de TsFC-2, isolada como um sólido branco cristalino,

de ponto de fusão 245-248ºC, teve sua natureza triterpenoídica sugerida por

apresentar coloração rosa com o reagente de Liebermann-Burchard e coloração

violeta com solução ácida de sulfato cérico (Jain & Yadaya, 1994).

O espectro na região do infravermelho, obtido com a utilização de acessório

ATR, no qual a amostra é colocada diretamente no equipamento (Figura 15, p. 63),

apresentou bandas intensas na região de 3600 a 3200 cm-1 e em 1000 cm-1,

sugestivas de estiramentos de grupos hidroxila e C-O de álcool, respectivamente

(Barbosa, 2007). Apresentou também bandas na região de 3000-2500 cm-1 e em

1650 cm-1, que sugerem a presença de grupo carboxila (Barbosa, 2007).

A análise do espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) (Figuras 16-18,

p. 64-66) mostrou, a presença de um sinal em δ 5,30, compatível com o

deslocamento químico de hidrogênio olefínico, um sinal para hidrogênio carbinólico

(δ 3,16) e sinais para hidrogênios de seis grupos metila em (δ 0,69; δ 0,63; δ 0,58; δ

0,56; δ 0,50; δ 0,42). Observaram-se também sinais sugestivos da presença de uma

unidade β-D-glicopiranosídica: δ 4,01 [(d); J = 7,7, H-1’ carbono anomérico], em δ

3,75-3,91 (m; H-3’, H-4’ e H-5’) 3,52 (dd; J = 2,7 e 11,8, H-6’a), e δ 3,41 (dd; J = 4,8

e 11,8, H-6’b). Adicionalmente foi observado um dupleto em δ 1,95, compatível com

deslocamento químico de hidrogênio em C-18 de um triterpeno pentacíclico

(Hameski et al, 2005).

Os dados fornecidos pela análise dos espectros de RMN 13C e DEPT 135

(Figuras 19-22, p. 67-70; tabela 4, p. 45), permitiram reconhecer a presença de um

total de 36 átomos de carbono (oito não hidrogenados, doze monoidrogenados, dez

diidrogenados e seis triidrogenados). Dentre esses átomos de carbonos, seis

apresentam deslocamentos químicos compatíveis com a presença de uma unidade

β-D-glicopiranosila [δ 104,5 (CH, C-1’), δ 75,1 (CH, C-2’), δ 77,3 (CH, C-3’), δ 69,4

(CH, C-4’), δ 75,9 (CH, C-5’) e δ 60,9 (CH2, C-6’)] (Hameski et al, 2005), confirmado,

portanto, as evidências fornecidas pelo espectro de RMN 1H . Os Trinta átomos de

carbono restantes correspondem à uma unidade aglicônica triterpenoídica. Assim, a

região de absorção de carbonos olefínicos revelou dois sinais com deslocamentos

químicos condizentes com a presença de uma ligação dupla trissubstituida [δ 131,6

44

(C, C-13) e δ 128,4 (CH, C-12)] que são característicos de triterpenos da série

ursano (Mahato & Kandu, 1994). Estão presentes, também, dois sinais em δ 179,9 e

δ 177,2, compatíveis com carbonilas de grupo carboxílico. A análise comparativa

destas informações com os dados obtidos da literatura permitiram sugerir que TsFC-

2 se tratava do ácido quinóvico (13) glicosilado. Quanto à posição da unidade de

açúcar, a presença de um sinal com deslocamento químico em δ 89,9 permitiu a sua

localização na posição C-3, descartando, assim, a possibilidade de tratar-se do

ácido 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (14), cuja unidade de açúcar localiza-se no

carbono C-28 (Mahato & Kandu, 1994; Oliveira et al, 2008).

A análise conjunta dos dados espectroscópicos discutidos e comparação com

dados da literatura permitiram sugerir para a substância TsFC-2, a estrutura da

saponina triterpênica conhecida como ácido 3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31)

(Hamerski et al, 2005).

O ácido 3-β-O-D-glicopiranosilquinóvico já havia sido isolado anteriormente de

espécies do gênero Tocoyena, bem como de um espécime de T. selloana estudado

por um grupo da Universidade Federal do Ceará (Jane et al, 1997).

HO

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

24 23

27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26 H

H

H

HO

COOH

C

O

O

O

HO

OH

OH

HO

H

H

H

(13) ácido quinóvico (14) ácido 28-O-β-D-glicopiranosilquinóvico

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

24 23

27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26

OO

OH

HO

HO

HO

1'

2'3'4'

5'6'

H

H

H

(31) ácido 3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico

45

Tabela 4. Dados de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2, dos ácidos

3-O-β-D-glicopiranosilquinóvico (31) (100 MHz, CD3OD) (Hamerski

et al, 2005), quinóvico (13) (75 MHz, C5D5N ) (Oliveira et al, 2008) e

28-O-β-D-glicopiranosil quinóvico (33) (125 MHz, DMSO-d6)

(Hameski et al, 2005).

Carbonos TsFC-2 (31) (13) (33)

1 37,8 38,6 39,5 39,0 2 23,8 24,1 26,7 24,4 3 89,0 88,0 78,3 77,6 4 38,1 39,0 39,6 38,7 5 54,7 55,3 56,1 54,8 6 17,3 17,8 19,2 17,1 7 35,9 36,3 37,9 36,1 8 38,0 38,9 40,4 38,9 9 45,9 46,2 47,6 46,8

10 35,8 38,7 37,7 38,7 11 21,8 22,4 23,7 23,5 12 128,4 128,0 129,3 128,0 13 131,6 132,5 134,5 132,6 14 55,2 55,3 57,1 56,2 15 29,2 29,8 28,5 29,1 16 24,4 25,0 25,9 25,7 17 47,9 47,3 49,1 47,8 18 53,2 53,7 55,3 53,8 19 38,2 38,5 39,7 38,6 20 36,2 36,6 38,0 36,4 21 25,1 25,6 30,9 30,2 22 35,9 35,9 37,4 37,0 23 26,8 27,8 19,3 28,2 24 16,4 16,5 28,9 16,5 25 15,3 16,1 17,0 16,1 26 18,0 18,2 17,0 17,9 27 177,2 176,3 178,4 175,3 28 179,9 178,6 180,5 176,9 29 15,4 17,5 18,5 18,6 30 20,0 21,1 21,7 21,2 1’ 104,5 105,6 - 94,0 2’ 75,1 74,0 - 72,4 3’ 77,3 76,9 - 76,6 4’ 69,4 70,3 - 69,6 5’ 75,9 76,6 - 76,6 6’ 60,9 61,3 - 60,8

46

4.1.4 Identificação Estrutural de TsFC-1

A substância codificada de TsFC-1, obtida em mistura a partir da fração

clorofórmica das folhas, foi isolada como um sólido branco cristalino, de ponto de

fusão 218-221ºC. A análise da mistura por cromatografia em camada delgada de

sílica, utilizando-se vários eluentes e, como reveladores, o reagente de Liebermamn-

Burchard e solução ácida de sulfato cérico, mostrou uma única mancha de coloração

rosa e violeta, respectivamente, sugestiva de substâncias de natureza triterpênica

(Jain & Yadaya, 1994).

O espectro na região do infravermelho da mistura (Figura 23, p. 71), obtido

utilizando acessório ATR, revelou a natureza alifática dos constituintes e, dentre

outras bandas, a presença de duas bandas de absorção de grupos carbonila, uma

de baixa intensidade em 1715 cm-1 e a outra mais intensa em 1700 cm-1.

O espectro de RMN 1H (Figura 24, p. 72) da mistura foi pouco informativo

devido à baixa resolução do mesmo. No entanto, revelou na região de absorção de

hidrogênios olefínicos, um sinal com deslocamento químico em δ 5,03, sugestivo de

hidrogênio em C-12 de triterpeno pentaciclico com esqueleto urs-12-eno e/ou olean-

12-eno (Connolly & Hill, 1991). Mostrou também vários sinais na região de absorção

de grupos metila (δ 0,60-1,26).

A análise conjunta dos dados obtidos dos espectros de RMN 13C (Figuras 25

e 26, p. 73 e 74; Tabela 6, p. 48;) e DEPT 135º (Figuras 27 e 28, p. 75 e 76), apesar

do grande número de sinais presentes, permitiu reconhecer na região de absorção

de átomos de carbono olefínicos, dois carbonos cujos valores de deslocamentos

químicos [ δ 139,1 (C, C-13) e δ 125,5 (CH, C-12)], estão condizentes com a

presença de triterpeno de esqueleto urs-12-eno (Mahato & Kandu, 1994)

A análise comparativa das informações fornecidas pelos espectros da mistura

com os dados obtidos da literatura permitiu sugerir a presença de ácido ursólico

(TsFC-1M) (19), como um dos constituintes da mistura, já isolado da fração hexânica

das folhas (p. 41) (Junges et al, 2000).

Retornando ao espectro de RMN 13C da mistura, foi possível ainda

reconhecer sinais de alta intensidade (δ 30,6, 31,2, 30,4, 30,0 e 14,4) sugestivos da

presença de hidrocarboneto saturado de cadeia longa.

47

Quanto à substância TsFC-1, exceto os sinais atribuídos aos átomos de

carbono do ácido ursólico (TsFC-1M; Tabela 6) e aos da graxa, observam-se, no

espectro de RMN 13C, um sinal com deslocamento químico em δ 206,1, indicativo de

grupo carbonila de cetona, vários sinais na região de ligação dupla (δ 139,6-114,7),

além de outros sinais compatíveis com carbono saturado, conforme mostrado na

tabela 5 (p. 47). Apesar das tentativas, com os dados fornecidos, não foi possível

propor estrutura para o componente da mistura TsFC-1.

Tabela 5. Dados de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.

Sinal Carbono

206,1 C 139,6 CH 139,4 CH 125,2 CH 124,8 CH 119,8 CH 114,7 C 34,2 C 33,7 C 30,1 CH3 29,7 CH2 29,5 CH3 29,3 C 28,8 C 25,0 C

48

Tabela 6. Dados de RMN 13C de TsFC-1M (100 MHz, C5D5N), e do ácido

ursólico (50 MHz, CDCl3) (Junges et al, 2000)

Posição TsFC-1M Ácido ursólico

1 37,6 38,9 2 23,7 23,5 3 78,2 78,3 4 37,4 37,3 5 55,9 55,7 6 18,9 18,7 7 32,2 33,3 8 40,0 39,3 9 48,2 46,7

10 35,3 37,2 11 25,0 23,8 12 125,8 125,5 13 139,1 139,2 14 42,6 42,0 15 28,2 28,4 16 23,0 22,7 17 48,1 47,9 18 53,6 53,4 19 39,6 39,3 20 39,5 39,8 21 31,5 30,9 22 39,5 37,3 23 28,9 28,6 24 16,7 16,5 25 15,8 15,6 26 17,6 16,5 27 24,0 23,5 28 180,1 179,8 29 17,7 17,3 30 21,5 21,3

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

H

H

(19) ácido ursólico

49

4.2 Resultados dos Testes de Atividade Biológica

4.2.1 Atividade Larvicida

Dentre os extratos das folhas e do caule que foram submetidos aos ensaios

preliminares, na concentração de 500 ppm, foram considerados promissores

somente o extrato bruto do caule (90% de letalidade) e a fração clorofórmica do

caule (80% de letalidade) (Tabela 7).

Para a fração em CHCl3 do caule, a concentração que causa 50% da

mortalidade da população de larvas (CL50) foi determinada em CL50 260,755 ppm,

com intervalo de confiança entre 213,374 a 319,310. Para o extrato bruto do caule, a

concentração letal foi determinada em CL50 298,808 ppm com intervalo de confiança

entre 252,672 a 355,508. De acordo com dados da literatura (Cheng et al, 2003) é

considerado um bom agente larvicida substâncias com valores de CL50 menores que

100 ppm, portanto, na concentração testada a espécie foi considerada inativa.

Tabela 7: Resultado dos bioensaios preliminares de atividade larvicida,

realizados na concentração de 500 ppm.

Fração % de Letalidade CL50

Hexânica (Folhas) 0

Clorofórmica (Folhas) 0

Acetato (Folhas) 20

Butanólica (Folhas) 0

Aquosa (Folhas) 0

Extrato bruto (Folhas) 20

Hexânica (Caule) 0

Clorofórmica (Caule) 90 260,755

Acetato (Caule) 0

Butanólica (Caule) 0

Aquosa (Caule) 20

Extrato bruto (Caule) 80 298,808

50

4.2.2 Atividade Moluscicida

Na avaliação da atividade moluscicida, os extratos brutos e as frações das

folhas e do caule de T. selloana, na concentração de 100 ppm, não causaram a

mortalidade dos caramujos, sendo portanto, considerados inativos frente ao

caramujo Biomphalaria glabrata.

51

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

52

O estudo fitoquímico dos extratos etanólicos do caule e das folhas de

Tocoyena selloana (Rubiaceae) conduziu ao isolamento de quatro substâncias, das

quais três tiveram suas estruturas identificadas.

A substância TSFA-1, isolada da fração aquosa das folhas e também das

frações em acetato de etila e aquosa do caule foi identificada como sendo o

carboidrato (2R, 3R, 4R, 5R)-1,2,3,4,5,6-hexa-hidroxi-hexano (D-Manitol), isolado

pela primeira vez no gênero Tocoyena.

A substância codificada como TsFH-1 isolada da fração hexânica das folhas

foi identificada como o triterpeno da série ursano, conhecido como ácido ursólico,

para o qual não foi encontrado registro na literatura em espécies do gênero

Tocoyena.

A substância TsFC-2, isolada da fração clorofórmica das folhas foi identificada

como sendo uma saponina triterpênica derivada do ácido quinóvico, conhecida como

ácido 3-O-β-D-glicopiranosílquinóvico, previamente isolado de um espécime de T.

selloana estudado na Universidade Federal do Ceará.

Os extratos e frações obtidos de Tocoyena selloana apresentaram fraca

atividade larvicida frente às larvas do mosquito Aedes aegypti.

Os testes biológicos realizados com os extratos e frações obtidos de

Tocoyena selloana, foram biologicamente inativos frente ao caramujo Biomphalaria

glabrata, na concentração de 100 ppm.

53

6. ESPECTROS DAS SUBSTÂNCIAS

ISOLADAS

54

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

60

70

80

90

100

Tra

nsm

itânc

ia%

C m-1

B

Figura 5. Espectro de IV (ATR) de TsFA-1.

HO

OH

OHOH

OH

OH

D-Manitol

55

Figura 6. Espectro de RMN 1H (400 MHz, D2O) da substância codificada de TsFA-1.

SpinWorks 2.2: MMSH - M5

PPM 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4

4

.70

00

3

.75

82

3

.75

19

3

.72

89

3

.72

29

3

.68

19

3

.66

03

3

.64

71

3

.64

09

3

.63

23

3

.62

58

3

.61

05

3

.60

46

3

.56

62

3

.55

13

3

.53

70

3

.52

23

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\1\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.201459 MHz

time domain size: 65536 points

width: 3238.34 Hz = 8.091780 ppm = 0.049413 Hz/pt

number of scans: 16

freq. of 0 ppm: 400.199995 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

SpinWorks 2.2: MMSH - M5

PPM 3.84 3.82 3.80 3.78 3.76 3.74 3.72 3.70 3.68 3.66 3.64 3.62 3.60 3.58 3.56 3.54 3.52 3.50 3.48 3.46 3.44

0

.99

9

0

.98

4

1

.07

6

0

.98

3

3

.75

82

3

.75

19

3

.72

89

3

.72

29

3

.68

19

3

.66

03

3

.64

71

3

.64

09

3

.63

23

3

.62

58

3

.61

05

3

.60

46

3

.56

62

3

.55

13

3

.53

70

3

.52

23

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\1\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.201459 MHz

time domain size: 65536 points

width: 3238.34 Hz = 8.091780 ppm = 0.049413 Hz/pt

number of scans: 16

freq. of 0 ppm: 400.199995 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

HO

OH

OHOH

OH

OH

56

Figura 7. Espectro de RMN 13C (100 MHz, D2O) da substância TsFA-1.

Figura 8. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, D2O) de TsFA-1.

SpinWorks 2.2: MMSH - M5

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

7

0.7

32

4

6

9.1

65

2

6

3.1

52

6

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\2\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 2748

freq. of 0 ppm: 100.630369 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 1.000 GB: 0.0000

SpinWorks 2.2: MMSH - M5

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

7

0.7

32

4

6

9.1

65

2

6

3.1

52

6

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M5 e 1 e 2\mmsh_26.06.09\2\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 2748

freq. of 0 ppm: 100.630369 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 1.000 GB: 0.0000

HO

OH

OHOH

OH

OH

57

Figura 9. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0

7

.27

00

5

.03

85

2

.98

09

2

.96

16

2

.74

60

2

.74

33

2

.74

09

2

.73

90

2

.40

72

2

.40

33

2

.01

12

1

.98

42

1

.72

22

1

.71

46

1

.69

22

1

.49

74

1

.48

32

1

.47

22

1

.44

83

1

.43

93

1

.41

41

1

.39

70

1

.37

41

1

.36

22

1

.35

41

1

.33

07

1

.31

00

1

.28

82

1

.26

96

1

.16

01

1

.14

21

1

.09

77

1

.06

05

1

.01

06

0

.99

30

0

.96

49

0

.88

69

0

.86

82

0

.86

13

0

.83

67

0

.80

79

0

.78

80

0

.75

30

0

.73

82

0

.72

26

0

.70

28

0

.68

62

0

.66

66

0

.65

05

0

.62

81

0

.57

82

0

.55

26

0

.53

77

0

.50

94

0

.48

60

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6\mmsh_02.10.09\1\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.201701 MHz

time domain size: 65536 points

width: 4432.62 Hz = 11.075975 ppm = 0.067636 Hz/pt

number of scans: 16

freq. of 0 ppm: 400.200003 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

58

Figura 10. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 0,0 – 2,6).

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4

2

.40

72

2

.01

12

1

.98

42

1

.72

22

1

.71

46

1

.69

22

1

.49

74

1

.44

83

1

.43

93

1

.41

41

1

.39

70

1

.31

00

1

.14

21

1

.09

77

1

.06

05

0

.88

69

0

.78

80

0

.75

30

0

.73

82

0

.72

26

0

.70

28

0

.68

62

0

.66

66

0

.65

05

0

.62

81

0

.57

82

0

.53

77

0

.50

94

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\1\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.201701 MHz

time domain size: 65536 points

width: 4432.62 Hz = 11.075975 ppm = 0.067636 Hz/pt

number of scans: 16

freq. of 0 ppm: 400.200003 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

59

Figura 11. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

17

9.4

76

9

13

7.7

91

9

12

4.7

50

3

7

7.8

92

3

77

.32

14

7

7.2

00

4

77

.00

10

7

6.6

80

6

5

4.6

86

0

5

2.1

82

8

4

7.0

19

0

4

6.9

72

1

41

.50

72

4

0.1

12

3

39

.90

41

3

9.6

94

7

39

.48

56

3

9.2

76

6

39

.06

72

3

8.9

97

8

38

.85

86

3

8.5

48

3

38

.33

92

3

8.2

33

3

38

.12

06

3

6.4

08

4

36

.25

75

3

2.4

82

2

31

.35

41

3

0.9

18

6

30

.19

69

2

9.6

32

7

29

.11

92

2

9.0

93

5

28

.79

22

2

7.7

30

0

27

.49

20

2

6.6

65

4

23

.69

47

2

3.0

30

3

2

2.7

15

7

2

2.1

32

3

20

.76

81

1

7.8

04

3

1

6.6

23

1

16

.57

60

1

5.3

35

6

14

.96

66

1

3.6

50

8

file: C:\mmsh_02.10.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 28672

freq. of 0 ppm: 100.630407 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 1.000 GB: 0.0000

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

60

Figura 12. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 60,0).

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 55.0 53.0 51.0 49.0 47.0 45.0 43.0 41.0 39.0 37.0 35.0 33.0 31.0 29.0 27.0 25.0 23.0 21.0 19.0 17.0 15.0 13.0 11.0

5

4.6

85

9

5

2.1

82

8

4

7.0

19

0

46

.97

21

4

1.5

07

2

3

9.9

04

0

3

9.6

94

7

3

9.4

85

5

3

9.2

76

6

3

9.0

67

2

38

.99

77

3

8.8

58

6

38

.54

83

3

8.3

39

2

3

8.2

33

3

38

.12

05

3

6.4

08

4

3

6.2

57

5

3

2.4

82

2

3

1.3

54

1

3

0.9

18

6

3

0.1

96

9

2

9.6

32

6

2

9.1

19

2

29

.09

34

2

8.7

92

2

27

.72

99

2

7.4

91

9

2

6.6

65

3

2

3.6

94

6

2

3.0

30

2

2

2.7

15

6

22

.13

23

2

0.7

68

1

1

7.8

04

3

1

6.6

23

1

1

6.5

75

9

1

5.3

35

6

14

.96

66

1

3.6

50

8

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 28672

freq. of 0 ppm: 100.630407 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

61

Figura 13. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

12

4.7

61

5

7

7.8

81

7

5

4.6

87

8

52

.18

03

4

6.9

69

6

38

.55

06

3

8.3

41

3

38

.12

09

3

6.2

94

8

36

.26

22

3

2.4

81

8

30

.92

80

3

0.2

28

5

30

.19

63

2

9.6

33

0

2

9.1

62

9

29

.13

12

2

9.1

04

3

28

.80

56

2

7.7

64

3

27

.73

61

2

7.5

20

7

27

.48

83

2

6.6

65

9

2

3.6

95

8

23

.06

23

2

3.0

37

2

2

2.7

42

7

2

2.7

12

5

2

0.8

07

1

2

0.7

81

2

1

7.8

05

8

16

.64

78

1

6.5

88

2

15

.38

02

1

5.3

54

7

14

.99

74

1

4.9

73

4

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\3\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 24576

freq. of 0 ppm: 100.630405 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 1.000 GB: 0.0000

HO

COOH

12

34

56

7

89

10

1112

13

1415

16

17

18

1920

21

22

2324

2526

27

28

29

30

H

62

Figura 14. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-DMSO-d6) de TsFH-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 60,0).

SpinWorks 2.2: MMSH-M4

PPM 57.0 55.0 53.0 51.0 49.0 47.0 45.0 43.0 41.0 39.0 37.0 35.0 33.0 31.0 29.0 27.0 25.0 23.0 21.0 19.0 17.0 15.0 13.0

5

4.6

90

2

5

2.1

83

6

4

6.9

71

3

3

8.5

53

8

3

8.3

44

3

3

8.1

24

3

3

6.2

65

1

3

0.2

00

3

2

9.1

34

8

2

7.7

39

8

2

7.4

92

3

2

6.6

69

7

2

3.6

99

1

2

3.0

39

9

2

2.7

17

0

2

0.7

85

2

1

7.8

10

0

1

6.6

27

0

1

6.5

91

0

1

5.3

55

8

14

.97

63

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M4 e 6 TsFH-1 ursólico\mmsh_02.10.09\3\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 24576

freq. of 0 ppm: 100.630405 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

63

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

75

80

85

90

95

100

105

Tra

nsm

itânc

ia%

C m-1

B

Figura 15. Espectro de IV (ATR) de TsFC-2.

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

24 23

27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26

OO

OH

HO

HO

HO

1'

2'3'4'

5'6'

64

Figura 16. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

7

.32

04

7

.27

20

5

.31

63

4

.42

43

4

.01

98

4

.00

04

3

.91

85

3

.90

88

3

.90

47

3

.89

43

3

.81

25

3

.79

46

3

.77

65

3

.75

98

3

.54

34

3

.53

66

3

.51

34

3

.50

70

3

.43

57

3

.42

36

3

.40

58

3

.39

38

3

.16

20

3

.06

25

1

.95

11

1

.92

87

1

.88

03

1

.73

41

1

.72

50

1

.38

16

1

.37

44

1

.34

87

1

.34

24

0

.94

85

0

.69

36

0

.63

73

0

.58

41

0

.56

36

0

.50

90

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.202471 MHz

time domain size: 65536 points

width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt

number of scans: 64

freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

24 23

27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26

OO

OH

HO

HO

HO

1'

2'3'4'

5'6'

65

Figura 17. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 3,36 - 4,16).

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 4.16 4.12 4.08 4.04 4.00 3.96 3.92 3.88 3.84 3.80 3.76 3.72 3.68 3.64 3.60 3.56 3.52 3.48 3.44 3.40 3.36

4

.01

98

4

.00

04

3

.91

85

3

.90

88

3

.90

47

3

.89

43

3

.81

25

3

.79

46

3

.77

65

3

.75

98

3

.54

34

3

.53

66

3

.51

34

3

.50

70

3

.43

57

3

.42

36

3

.40

58

3

.39

38

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.202471 MHz

time domain size: 65536 points

width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt

number of scans: 64

freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

66

Figura 18. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 0,30 – 1,00).

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 0.96 0.92 0.88 0.84 0.80 0.76 0.72 0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36

0

.94

85

0

.69

36

0

.63

73

0

.58

41

0

.56

36

0

.50

90

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\3\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.202471 MHz

time domain size: 65536 points

width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt

number of scans: 64

freq. of 0 ppm: 400.201696 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

67

Figura 19. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

17

9.8

93

2

17

7.2

91

3

13

1.6

14

8

12

8.4

71

6

10

4.5

37

2

8

9.0

75

2

78

.01

34

7

7.9

78

7

7

7.3

84

0

7

7.3

06

5

7

7.2

69

2

7

7.1

15

8

76

.98

76

7

6.7

95

5

76

.47

33

7

5.9

16

8

75

.13

98

7

3.4

06

2

7

1.2

07

1

69

.43

98

6

0.9

31

8

5

5.2

00

5

54

.70

30

5

3.2

92

9

4

8.5

46

7

48

.33

21

4

8.2

23

2

48

.11

82

4

7.9

04

9

47

.69

19

4

7.5

25

7

47

.47

80

4

7.2

64

8

47

.05

18

4

5.9

62

1

3

8.6

60

6

38

.22

18

3

8.1

59

9

3

7.8

91

8

36

.28

29

3

5.9

63

6

3

5.8

67

4

3

5.6

27

4

2

8.8

34

4

2

6.8

05

0

25

.15

47

2

1.9

57

4

20

.01

39

1

8.0

57

4

17

.37

23

1

6.4

51

7

1

5.4

75

3

1

5.4

02

6

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 25388

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processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

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27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26

OO

OH

HO

HO

HO

1'

2'3'4'

5'6'

68

Figura 20. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0

7

8.0

13

4

77

.97

87

7

7.3

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0

77

.30

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7

7.2

69

2

7

7.1

15

8

7

6.9

87

6

76

.79

55

7

6.4

73

3

7

5.9

16

8

7

5.1

39

8

7

3.4

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2

7

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1

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39

8

6

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8

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5.2

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5

5

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0

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9

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0

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47

.05

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3

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8.2

21

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3

8.1

59

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3

7.8

91

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3

6.2

82

9

3

5.9

63

6

3

5.8

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4

3

5.6

27

4

2

8.8

34

4

2

6.8

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0

2

5.1

54

7

2

1.9

57

4

2

0.0

13

9

1

8.0

57

4

1

7.3

72

3

1

6.4

51

7

1

5.4

75

3

1

5.4

02

6

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 25388

freq. of 0 ppm: 100.630833 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

69

Figura 21. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2.

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 -20.0

13

0.4

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.49

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.05

22

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20

4

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.39

89

7

7.0

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76

.37

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7

5.9

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4

75

.91

71

7

5.5

42

3

75

.15

26

7

4.9

53

8

74

.54

50

7

3.4

71

7

73

.39

71

7

2.8

52

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71

.19

77

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.14

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67

.14

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97

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4.7

29

2

54

.69

59

5

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4

51

.60

57

4

8.9

10

2

48

.51

70

4

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0

47

.73

42

4

7.5

22

8

45

.94

92

4

5.4

06

1

4

2.3

01

8

3

8.2

17

1

37

.99

39

3

7.8

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1

36

.27

23

3

5.9

57

5

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.61

68

3

1.1

19

8

29

.63

68

2

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85

9

29

.25

20

2

8.8

28

8

28

.78

80

2

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74

1

28

.54

34

2

8.1

46

8

26

.92

71

2

6.7

81

3

25

.14

39

2

4.4

66

3

23

.84

35

2

3.6

75

5

22

.93

94

2

2.1

46

0

21

.94

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2

1.8

47

1

20

.00

12

1

8.0

37

1

1

7.3

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3

17

.34

35

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39

2

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5.4

56

3

15

.39

06

1

5.3

17

7

1

3.0

05

3

9

.92

26

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros18.09.09\M10\mmsh_14.08.09\4\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 22278

freq. of 0 ppm: 100.630835 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

COOH

COOH

1

2

34

56

7

89

10

1112

13

24 23

27

28

29

30

18

1920

21

1415

16

17

22

25 26

OO

OH

HO

HO

HO

1'

2'3'4'

5'6'

70

Figura 22. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, CDCl3-CD3OD) de TsFC-2 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).

SpinWorks 2.2: MMSH M10

PPM 74.0 70.0 66.0 62.0 58.0 54.0 50.0 46.0 42.0 38.0 34.0 30.0 26.0 22.0 18.0 14.0 10.0

7

7.0

04

3

7

5.9

17

1

7

5.1

52

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7

3.3

97

1

6

9.4

16

2

6

0.8

97

8

5

4.6

95

9

5

3.2

85

4

4

8.5

17

0

4

5.9

49

2

3

8.2

17

1

37

.88

21

3

6.2

72

3

35

.95

75

3

5.6

16

8

2

9.2

52

0

2

8.8

28

8

28

.78

80

2

6.7

81

3

2

5.1

43

9

24

.46

63

2

3.8

43

5

2

1.9

44

8

21

.84

71

2

0.0

01

2

1

8.0

37

1

17

.36

33

1

6.4

39

2

1

5.4

56

3

15

.39

06

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M10 TsFC-2 quinovico glico\mmsh_14.08.09\4\fid expt: <dept135>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 22278

freq. of 0 ppm: 100.630835 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

71

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65

70

75

80

85

90

95

100

105

Tra

nsm

itânc

ia %

cm-1

B

Figura 23. Espectro de IV (ATR) de TsFC-1.

72

Figura 24. Espectro de RMN 1H (400 MHz, C5D5N) de TsFC-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M9

PPM 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

8

.69

85

7

.99

77

7

.56

42

7

.24

55

7

.23

01

7

.22

38

7

.19

47

3

.58

17

2

.03

79

2

.03

38

1

.98

72

1

.98

31

1

.47

36

1

.32

01

1

.27

16

1

.23

31

1

.21

03

1

.03

24

1

.00

77

0

.94

21

0

.86

47

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\mmsh_22.10.09\1\fid expt: <zg30>

transmitter freq.: 400.202471 MHz

time domain size: 65536 points

width: 8278.15 Hz = 20.684894 ppm = 0.126314 Hz/pt

number of scans: 64

freq. of 0 ppm: 400.200597 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 1.000 GB: 0.0000

73

Figura 25. Espectro de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M9

PPM 200.0 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0

20

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7

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0.5

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5

15

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.99

46

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9.7

25

0

13

6.0

09

7

13

5.9

14

1

13

5.7

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6

13

5.6

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3 1

35

.51

60

12

5.8

02

9 1

24

.88

89

12

3.9

59

5 1

23

.71

11

12

3.4

63

1 1

23

.28

27

12

3.2

59

6 1

23

.23

04

12

3.2

04

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23

.17

24

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0

7

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84

4

5

5.9

61

1

4

8.1

99

5

48

.18

37

4

2.6

39

4

4

0.1

00

6

39

.63

40

3

9.5

46

8

39

.52

81

3

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15

0

37

.59

85

3

7.4

16

1

35

.33

71

3

4.7

93

8

3

2.2

75

4

31

.53

40

3

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69

3

30

.61

83

3

0.6

02

9

30

.48

65

3

0.1

43

5

30

.07

53

3

0.0

02

9

29

.99

42

2

9.9

51

6

29

.92

13

2

9.7

68

6

2

8.9

60

1

2

8.8

21

5

28

.23

52

2

5.0

49

5

24

.05

85

2

3.7

70

1

2

3.0

96

9

2

1.5

73

2

1

7.6

78

4

1

7.6

05

3

1

6.7

42

1

15

.82

42

1

4.4

44

1

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M9\Piridina\mmsh_22.10.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 6144

freq. of 0 ppm: 100.630481 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

74

Figura 26. Espectro de RMN 13C (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).

SpinWorks 2.2: MMSH-M9

PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0 8.0

7

8.2

84

4

5

5.9

61

1

4

8.1

99

5

48

.18

37

4

2.6

39

4

4

0.1

00

6

39

.63

40

3

9.5

46

8

39

.52

81

3

9.2

15

0

3

7.5

98

5

37

.41

61

3

5.3

37

1

34

.79

38

3

2.2

75

4

31

.53

40

3

0.6

69

3

30

.61

83

3

0.6

02

9

30

.48

65

3

0.1

43

5

30

.07

53

3

0.0

02

9

29

.99

42

2

9.9

51

6

2

9.9

21

3

2

9.7

68

6

2

8.9

60

1

28

.82

15

2

8.2

35

2

25

.04

95

2

4.0

58

5

23

.77

01

2

3.0

96

9

21

.57

32

1

7.6

78

4

17

.60

53

1

6.7

42

1

15

.82

42

1

4.4

44

1

file: E:\Documents and Settings\Marcos\Desktop\DISSERTAÇÃO\espectros\M9\Piridina\mmsh_22.10.09\2\fid expt: <zgpg30>

transmitter freq.: 100.640433 MHz

time domain size: 65536 points

width: 23980.82 Hz = 238.282116 ppm = 0.365918 Hz/pt

number of scans: 6144

freq. of 0 ppm: 100.630481 MHz

processed size: 32768 complex points

LB: 0.000 GB: 0.0000

75

Figura 27. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1.

SpinWorks 2.2: MMSH-M9

PPM 180.0 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0

15

0.3

93

8

13

6.1

15

9

12

5.8

48

6

12

5.2

80

7 1

24

.94

44

12

4.0

59

8

11

9.8

72

4

7

8.3

26

8

5

5.9

97

2

53

.72

68

4

8.2

22

1

3

9.6

70

6

3

9.5

91

7

32

.32

22

3

1.6

04

1

31

.57

47

3

1.5

33

6

3

0.7

65

6

3

0.7

47

7

30

.71

90

3

0.5

26

1

3

0.4

73

1

30

.43

94

3

0.3

65

7

30

.33

99

3

0.2

98

4

30

.27

34

3

0.2

53

0

30

.23

96

3

0.1

83

7

30

.12

34

3

0.0

56

2

2

9.8

18

6

2

8.2

73

5

23

.14

37

1

7.6

47

4

15

.86

55

1

4.4

91

6

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76

Figura 28. Espectro de RMN DEPT 135º (100 MHz, C5D5N) de TsFC-1 (Ampliado na região δ 10,0 – 80,0).

SpinWorks 2.2: MMSH-M9

PPM 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0 36.0 32.0 28.0 24.0 20.0 16.0 12.0

7

8.3

26

8

5

5.9

97

2

5

3.7

26

8

4

8.2

22

1

3

9.6

70

6

3

9.5

91

7

3

2.3

22

2

3

1.6

04

1

3

1.5

74

7

31

.53

36

3

0.7

65

6

30

.74

77

3

0.7

19

0

3

0.5

26

1

30

.47

31

3

0.4

39

4

3

0.3

65

7

30

.33

99

3

0.2

98

4

3

0.2

73

4

30

.25

30

3

0.2

39

6

30

.18

37

3

0.1

23

4

30

.05

62

2

9.8

18

6

2

8.2

73

5

2

3.1

43

7

1

7.6

47

4

1

5.8

65

5

1

4.4

91

6

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77

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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