MARCADORES MOLECULARES

1Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

2 Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica de Plantas

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Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuriaCentro Nacional de Pesquisa de Algodo

Documentos 147

Marcadores Moleculares como Ferramentas para

Estudos de Gentica de Plantas

Lcia Vieira HoffmannPaulo Augusto Vianna Barroso

Campina Grande, PB.2006

ISSN 0103-0205

Agosto, 2006


Exemplares desta publicao podem ser solicitados :

Embrapa AlgodoRua Osvaldo Cruz, 1143 CentenrioCaixa Postal 174CEP 58107-720 - Campina Grande, PBTelefone: (83) 3315-4300Fax: (83) [email protected]://www.cnpa.embrapa.br

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Supervisor Editorial: Nvia Marta Soares GomesReviso de Texto: Lcia Vieira HoffmannTratamento das Ilustraes: Geraldo Fernandes de Sousa FilhoCapa: Flvio Trres de Moura/Maurcio Jos Rivero WanderleyEditorao Eletrnica: Geraldo Fernandes de Sousa Filho

1 Edio1 impresso (2006) 1.000 exemplares

Todos os direitos reservadosA reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constituiviolao dos direitos autorais (Lei n 9.610)

EMBRAPA ALGODO (Campina Grande, PB)

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de Gentica dePlantas, por Lcia Vieira Hoffmann e Paulo Augusto Vianna Barroso. CampinaGrande, 2006

35p. (Embrapa Algodo. Documentos, 147)

1.Plantas-Estudos-Gentica. 2. Marcadores Moleculares. I. Hoffmann, L.V.

II. Barroso , P.A.V. III. Ttulo. IV. Srie.

CDD575.1

Embrapa 2006


Autores

Lcia Vieira HoffmannD.Sc., Eng Agrn., da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, 58107-720,Campina Grande, PB, CEP 58107-720. e-mail: [email protected],

Paulo Augusto Vianna BarrosoD.Sc., Eng Agrn., da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, 58107-720,Campina Grande, PB, CEP 58107-720. e-mail: [email protected]


Apresentao

Marcadores moleculares so uma importante ferramenta de biotecnologia

com ampla aplicao na agricultura. So grandes parceiros da gentica

clssica, pois se o desenvolvimento de conhecimento e suas aplicaes na

agricultura antes eram dificultados por um nmero relativamenete pequeno

de marcas genticas que podiam ser utilizadas, com os marcadores

moleculares um nmero tremendamente maior de caractersticas genticas

pode ser utilizado; entretanto, seu potencial s pode ser entendido como

ferramenta da gentica clssica, uma cincia que, mesmo que analisada

somente por suas aplicaes agrculas mais importantes, no de fcil

entendimento, pela quantidade de conceitos que envolve. Este documento

visa introduzir estudantes aos pincpios bsicos da biologia molecular mais

utilizados para obteno de marcadores moleculares, bem como ilustrar

algumas implicaes genticas de seu uso.


Sumrio

Marcadores Moleculares como Ferramentas para Estudos de

Gentica de Plantas .......................................................................11

1. Introduo .................................................................................11

2. Enzimas diferem quanto mobilidade eletrofortica .....................12

3. Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso .................................14

4. Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas .........................17

5. Marcadores diferem quanto habilidade de detectar polimorfismo.19

6. Dominncia e codominncia ........................................................20

7. Associando uma caracterstica de interesse a um marcador .........22

8. Mapas genticos : um exemplo utilizando marcadores RAPD.........24

9. Identificao de Gentipos (fingerprinting) e Estimativa da

Diversidade Gentica Utilizando Marcadores Moleculares .............27

10. Algumas populaes segregantes facilitam o mapeamento de

genes ......................................................................................29

11. Como otimizar a informao fornecida por marcadores

dominantes ..............................................................................30

Referncias Bibliogrficas ...............................................................33


Marcadores Moleculares

como Ferramentas para

Estudos de Gentica de

Plantas

Lcia Vieira HoffmannPaulo Augusto Vianna Barroso

1. Introduo

Em 1866, Mendel publicou trabalho cientfico onde postulou a taxa de

segregao de 3:1 de fentipos dominantes e recessivos (Primeira Lei de

Mendel) e de herana independente de diferentes caracteres (Segunda Lei

de Mendel). Estas inferncias foram feitas a partir da observao de dados

fenotpicos, entre eles cor do cotildone e textura da semente de ervilha

(WEIR, 1996).

A identificao do DNA como material gentico ocorreu na primeira

metade do sculo XX. Nos anos 70 desenvolveram-se algumas tcnicas,

uma delas a duplicao do DNA, in vitro, realizada pela DNA polimerase

extrada da bactria Thermus aquaticus que, por viver em fontes trmicas,

possui enzima que polimeriza a uma temperatura alta (72C) e mantm

atividade mesmo que submetida a 95C. Isto importante para a

automao do processo in vitro, onde a alta temperatura utilizada como

estratgia para separar as fitas de DNA, necessria para o processo de

duplicao. A duplicao do DNA in vitro conhecida por PCR, do ingls,

Polymerase Chain Reaction. Muitos procedimentos em biologia molecular

baseiam-se em PCR (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).

Esta e outras tcnicas transformaram o DNA, antes uma molcula de difcil


acesso, em uma molcula de fcil manipulao. Marcadores moleculares

surgiram a partir destas tcnicas. Eles consistem em fragmentos discretos

de DNA obtidos por ferramentas da biotecnologia moderna que,

visualizadas em gis de eletroforese, servem como ferramenta para uma

srie de estudos genticos em plantas.

O DNA de organismos eucariotos possui tanto seqncias transcritas,

regulatrias e ainda outras sem funo conhecida. Em qualquer dos casos,

sua segregao tambm obedece as Leis de Mendel.

As diversas aplicaes de marcadores moleculares residem em prover

instrumentos para os mais diversos estudos j realizados pela gentica

clssica. A principal aplicao de estudos de gentica de plantas o

melhoramento gentico, isto , a seleo artificial de plantas na busca do

aprimoramento de suas caractersticas agronmicas ou de qualidade do

produto agrcola. Os trabalhos de melhoramento gentico vm

acrescentando grandes ganhos no rendimento agrcola. Por proverem um

nmero quase que ilimitado de possveis alelos, marcadores moleculares

ampliam em muito a possibilidade de investigao genmica nas diversas

espcies.

As tecnologias para obteno de marcadores moleculares sero abordadas

brevemente, tendo sido j descritas em maior detalhe em uma diversidade

de publicaes (NBREGA et al., 1999; FERREIRA e GRATTAPAGLIA,

1998; SOUZA, 2001). Aqui sero enfatizados aspectos genticos dos

marcadores mais utilizados em gentica de plantas.Os procedimentos

bsicos para obteno de marcadores sero abordados apenas para alguns

marcadores largamente utilizados em gentica de plantas, por serem

suficientes para discutir os tpicos aqui abordados quanto a caractersticas

de interesse agronmico como nmero de alelos por loco, dominncia ou

codominncia e polimorfismo.

2. Enzimas diferem quanto mobilidade eletrofortica

Entre os marcadores moleculares podem estar as isoenzimas, que no so


DNA, mas sim protenas visualizadas em gel. Por isso alguns autores as

chamam de marcadores bioqumicos.

As enzimas so sintetizadas, como todas as protenas, a partir de um RNAmensageiro, por sua vez transcrito a partir de uma seqncia de DNA, um

gene. Estes genes podem ter diferenas entre si, codificando enzimas que,

embora tenham as mesmas funes metablicas, diferem entre si em

algumas propriedades. Estas diferentes formas de uma enzima sochamadas isoenzimas. Alm de, em um nico loco, poderem existir

diferentes alelos de um mesmo gene, codificando diferentes isoformas de

uma enzima, freqentemente em nico organismo existem vrios genes, em

vrios locos, que codificam a mesma enzima.

Enzimas, como outras protenas, tm carga eltrica. Quando em soluo,

podem ligar-se a ons e nions livres, modificando sua carga, por isso so

chamadas de substncias anfteras. Ento, se colocadas em um campo

eltrico, migram conforme seu peso molecular e sua carga eltrica lquida.Como isoenzimas podem diferir quanto a estas caractersticas, a

eletroforese vem sendo a maneira usual de identificar suas diferentes

isoformas. Assim, protenas totais de um organismo so colocadas em um

gel com porosidade suficiente para que se movimentem e, ento, sosubmetidas a um campo eltrico.

Ento, para verificar a presena de isoformas de uma enzima especfica,

aps o perodo de algumas horas de migrao no gel, utilizam-se substratos

especficos para a enzima, que forneam produtos coloridos. A presena de

cor utilizada como indicadora da presena da enzima.

Quando as isoformas observadas so produzidas a partir de genes de um

mesmo loco podem ser chamadas aloenzimas. Pode-se deduzir se duas ou

mais bandas so produzidas a partir de um ou mais locos a partir da

observao de gis de uma populao segregante. Se a segregao ocorrede maneira independente, como postulado na Segunda Lei de Mendel,

infere-se serem produtos de genes de diferentes locos, no ligados. Haver

maior certeza do nmero de locos se esta populao for obtida a partir do

cruzamento de pais contrastantes, se o perfil eletrofortico dos pais for

tambm observado.


Uma complicao na anlise de isoenzimas a possibilidade serem

compostas por duas ou mais subunidades, sendo estas codificadas por

alelos de um mesmo loco ou por genes de locos distintos. As enzimasformadas por duas, trs ou quatro subunidades so chamadas,respectivamente, dimricas, trimricas e tetramricas, e no so incomuns.

A maneira de proceder as anlises, nestes casos, foi descrita por Nbregaet al. (1999), Alfenas et al. (1991) e Alfenas (1998).

3. Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso

O polimorfismo de DNA amplificado ao acaso conhecido principalmenteatravs da sigla de seu nome em ingls, Random Amplified Polymorphic

DNA, RAPD. Esta tcnica baseia-se na duplicao do DNA, in vitro,utilizando PCR.

Na reao de PCR para obteno de marcadores RAPD so necessrios,como em qualquer PCR, uma pequena seqncia do DNA complementar aoDNA que se deseja estudar, conhecida como iniciador ou primer (ver Figura

1). O primer colocado em um pequeno tubo junto com o DNA em estudo(molde para a duplicao de DNA), a enzima DNA polimerase termoestvel,nucleotdeos, uma soluo tampo e magnsio. Esta mistura, ou mix,

submetida a 20 a 30 ciclos de temperatura de 95C, para denaturao doDNA, uma temperatura mais baixa para anelamento dos primers, e 72Cpara atividade da DNA polimerase e extenso das fitas.

Como em qualquer PCR, para que a amplificao ocorra exponencialmentee o fragmento amplificado seja de tamanho constante, so necessrios doisstios de anelamento dos primers, que devem anelar em locais que tm

entre si uma distncia amplificvel e cujas extremidades 3 (a direo deduplicao do DNA sempre 5 em direo a 3) posicionem-seinternamente ao fragmento a ser amplificado (ver Figura 1). necessrio

que o primer no possua seqncia palindrmica1, ou a amplificao dar-se-ia, indiferenciadamente, para a regio entre os primers e externamente a

ela.

1Seqncia palindrmica de DNA aquela que fornece a mesma leitura quando lida no sentido da posio3 para a posio 5 ou vice-versa.


O que diferencia a reao de PCR para obteno de marcadores RAPD de

outras reaes PCR o tamanho do primer. No RAPD o primer de 10

bases, tamanho suficientemente pequeno para que uma seqncia aleatria

encontre, em qualquer genoma, duas seqncias complementares na

posio necessria e haja duplicao do DNA (ver Quadro 1). Isto ocorre

normalmente de duas a dez vezes por genoma, resultando em uma a dez

bandas no gel. Devido ao menor tamanho do primer, menos pontes de

hidrognio sero formadas entre primer e DNA molde. A temperatura de

anelamento deve ser menor (cerca de 35C) que em PCR utilizando primers

especficos (quando seria de 40C a 60C).

Procedimentos semelhantes, com primers inespecficos, foram

desenvolvidos simultnea e independentemente por Willians et al. (1990) e

Welsh e McClelland (1990), sendo a denominao RAPD sugerida pelo

primeiro grupo.

Tambm preciso que primers com 10 bases contenham, pelo menos,

50% de guanina e citosina. Isto se justifica pelo maior nmero de pontes

de hidrognio responsveis pela ligao G-C (3 pontes) do que pela ligao

A-T (2). Assim, um hbrido primer-DNA com menos de 50% de GC,

provavelmente, no permanece anelado com a temperatura de

polimerizao (72oC), havendo separao antes da DNA polimerase

termoestvel iniciar a polimerizao.

Os segmentos de DNA amplificados atravs da tcnica RAPD so

separados em eletroforese de acordo com seu peso molecular, que reflete o

nmero de pares de base (pb), e visualizados sob luz ultravioleta aps

colorao com brometo de etdio. Cada produto de amplificao dever ser

visualizado como uma banda, portanto, espera-se encontrar normalmente

Fig. 1. Os primers RAPD anelam-se nas duas fitas de maneiras opostas, ou seja,com as posies 3 posicionando-se internamente regio a ser amplificada


Quadro 1: O tamanho do primer em RAPD e o nmero de fragmentosesperados

O tamanho do primer RAPD, 10 pb, pequeno, fazendo com que achance de anelamento seja relativamente alta. No caso de um primermaior, como os usados para amplificao de uma seqncia conhecida,de 18pb a 24 pb, a chance de encontrar uma seqncia complementar bem menor. Por isso o primer RAPD inespecfico, e um mesmo primerpode ser utilizado para amplificao de seqncias nos mais diferentesgenomas. Enquanto que o primer de 18 pb especfico e amplifica suma seqncia, geralmente, o primer RAPD amplifica 2 a 10 bandas.A probabilidade de uma seqncia ser complementar a uma seqnciaaleatria de 10 pb de 1 / 410, pois, como so 4 as bases quecompem o DNA (A, T, C e G), a probabilidade de a primeira ser, porexemplo, A, e de . A probabilidade de a primeira ser A e a segunda G de (1/4) x (1/4), e a probabilidade de se encontrar 10 determinadasbases em seqncia de 1 / 410.Porm, para que a amplificao de marcadores RAPD ocorra de maneiraexponencial e simultaneamente, o fragmento amplificado seja detamanho constante, so necessrios dois stios de anelamento dosprimers, distando entre si uma distncia amplificvel, ou seja, entre 500e 2500 pb. Ou seja, cerca de 2000 posies de distanciamento entre osprimers so aceitveis. Ento, a probabilidade de que isto ocorra

p = 2000 x 1 / 420 = 1,819 . 10-9

No genoma da principal espcie cultivada de algodo, Gossypiumhirsutum, de tamanho estimado em 2,38 x 109pb, o nmero n esperadode fragmentos RAPD, com base na probabilidade p calculada, seria

n = 2,38 x 109 p = 1,3

No entanto, verifica-se um nmero maior de bandas. Iqbal et al. (1997)encontraram cerca de 7 bandas por primer. Isto provavelmente ocorradevido a amplificaes a partir de seqncias no totalmentecomplementares, ou seja, a complementariedade entre nove ou oito paresde bases seja suficiente para que ocorra anelamento e duplicao deDNA. O nmero de bandas maior do que o esperado verdadeiro para amaioria das espcies estudadas. O pareamento de primers no totalmentecomplementares deve ser maior quanto menor o tamanho do genoma,pois nas mais diversas estudadas, mesmo o tamanho dos genomassendo muito varivel, o nmero de bandas permanece praticamenteconstante (Ferreira e Gattapaglia, 1998).


de 2 a 10 bandas. O polimorfismo entre dois indivduos verificado pela

comparao do perfil eletrofortico dos produtos de amplificao obtidos

pela utilizao dos mesmos primers e condies de reao.

Como na maioria dos marcadores moleculares, as informaes fornecidas

por um nico marcador RAPD so baixas, sendo necessrio analisar

diversos primers para que se obtenha resultados teis. Os dados obtidos a

partir de um conjunto de primers podem ser ampliados com a utilizao dos

primers isoladamente e em pares. Quando usados em pares, o padro de

amplificao apresenta novos produtos, enquanto alguns formados pela

utilizao isolada dos primers no so detectados (WILLIANS et al., 1993).

Os marcadores RAPD apresentam algumas vantagens em relao a outros

marcadores: um mesmo conjunto de primers pode ser usado em qualquer

espcie; permite analisar um maior nmero de amostras por unidade de

tempo; o investimento na instalao do laboratrio e o custo por amostra

so menores; os procedimentos so simples e no incluem radioistopos;

permite a automao do processo. A principal limitao do uso de RAPDs

sua dominncia, que ficar melhor compreendida aps a leitura do item 6.

4. Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas

Microssatlites ou Seqncias Simples Repetidas (SSR, do ingls, Simple

Sequence Repeats) ou so partes constituintes de DNAs de eucariotos

formado de seqncias de um a cinco nucleotdeos que se repetem. Essas

seqncias repetitivas so flanqueadas por seqncias nicas. Para que os

microsatlites sejam utilizados em biotecnologia como marcadores

moleculares, primers complementares s seqncias nicas que flanqueiam

os microsatlites so utilizados em PCRs Neste caso, os primers

constituem-se de 18 a 24 nucleotdeos, em nmero suficientemente grande

para que este primer no encontre outra seqncia complementar que no

a do microsatlite.

A maior dificuldade de se utilizar SSR justamente de se obter as


seqncias a serem utilizadas como primers. Para obt-las, necessrio

fazer bibliotecas genmicas e selecionar clones, utilizando-se como sondas

seqncias repetitivas. Uma vez selecionados estes clones so

seqenciados. Nem todos os microssatlites localizados podero ser

utilizados para rotina como marcadores moleculares. Deseja-se que o

produto de amplificao no seja maior que 200pb para que os alelos sejam

efetivamente separados, no deve haver no primer seqncias repetitivas

para evitar anelamento inespecfico e deve haver um contedo mnimo de

40% C+G (REDDY et al., 2001). Deve-se ainda observar entre os

possveis primers, utilizando-se programas computacionais, os seguintes

itens: i) presena de grampos (anelamento do primer com ele mesmo,

quando dobrado) e dmeros (anelamento de dois primer). Estas estruturas

devem estar ausentes ou, se presentes, ter baixa estabilidade. ii)

temperatura de anelamento: ser tanto maior quanto menor a

porcentagem de A+T em relao a T+G. Um destes programas pode ser

encontrado em www.generunner.com .

Em mamferos, incluindo o genoma humano, os marcadores microssatlites

so os mais utilizados, porm em plantas parecem ser menos abundantes,

pois so encontrados a cada 29 ou 80 kb, enquanto que no genoma

humano existe em mdia uma seqncia SSR a cada 6 kb. Alm disso,

enquanto que em mamferos sabe-se que as seqncias mais freqentes

so dinucleotdeos CA e TG, facilitando sua localizao, em plantas h uma

variabilidade de tipos de deteces. Assim, h menor quantidade de

primers de SSR em plantas, dificultando seu uso (CARDLE et al., 2000).

Os segmentos de DNA amplificados so separados em eletroforese em gis

de acrilamida ou agarose de alta resoluo, que fornecem melhor distino

entre fragmentos que diferem pouco entre si quanto ao peso molecular.

Quando em gis de acrilamida, a colorao do DNA para visualizao de

bandas feita com prata.

As vantagens da utilizao de microssatlites em relao a outros

marcadores moleculares so a fcil exeqibilidade, uma vez disponveis

primers para a espcie em estudo, o alto polimorfismo e a boa distribuio

no genoma.


5. Marcadores diferem quanto habilidade de detectar

polimorfismo

Se existe diversidade gentica em uma populao, ela deve ser detectada

pelo marcador molecular. Porem, esta habilidade pode ser maior ou

menor, dependendo das bases genticas deste marcador. Existe a

tendncia de que genes sejam mais conservados do que as regies de DNA

sem funo, como seqncias repetitivas, j que dependendo da alterao

no DNA do gene, a protena ou no seria codificada ou no teria funo,

tendendo a no serem selecionadas. Com efeito, verifica-se que

marcadores microssatlites, que detectam regies no codificadoras, so

muito mais polimrficos que isoenzimas. O RAPD, que amplifica igualmente

locos de regies repetitivas como genes, tem polimorfismo estimado maior

do que o marcador baseado no Polimorfismo no Fragmento de Fragmentos

de Restrio, mais conhecido como RFLP, do ingls, Restriction Fragment

Length Polimorphism (GARCIA et al., 1995), e especialmente adequado

na anlise de indivduos com baixa divergncia gentica (WILLIANS et al.,

1993).

O contedo de informao de polimorfismo, conhecido pela sigla PIC , de se

nome em ingls, Polymorphism Information Content, pode ser estimado por

onde fi a freqncia do isimo alelo. Calculado assim, o valor de PIC

reflete tanto o nmero de alelos como a freqncia de cada alelo, e ser

maior quanto maior for o nmero de alelos e quanto mais equivalentes as

freqncias allicas. Assim, com dois alelos, o valor de PIC ser mximo

quando a freqncia de cada um deles for 0,5. Com este clculo, PIC

torna-se sinnimo de heterozigosidade (ROBINSON, 1998) e diversidade

gentica (SENIOR et al., 1998).


Tanto na seleo assistida como no mapeamento gentico (ver adiante) a

investigao feita com base na segregao de marcadores. S se

observa segregao se houver polimorfismo. Logo, o fato de um marcador

ser altamente polimrfico considerado vantajoso.

6. Dominncia e codominncia

Por terem diferentes bases genticas os marcadores moleculares diferem

quanto ao tipo de segregao esperada em F2. Se imaginarmos uma

enzima codificada em um nico loco com dois alelos, sabemos que os

homozigotos para cada loco, como codificam uma s isoforma,

apresentaro uma s banda, enquanto que os heterozigotos apresentaro

duas bandas (contanto, claro, que as isoformas possam ser distintas

entre si na eletroforese). Portanto, marcadores isoenzimticos so

considerados codominantes. O cruzamento de dois homozigotos

contrastantes entre si, resultaria em F2 numa segregao do tipo 1:2:1,

como o esperado no caso de codominncia gnica. Isto pode ser testado

atravs de um teste qui-quadrado.

No caso de marcadores RAPD, como comentado no tem 3, uma banda

reflete a amplificao de um segmento entre dois stios de anelamento do

primer. Algumas diferenas genticas entre indivduos sero detectadas

por marcadores RAPD. Para explicar quais so elas, vamos imaginar que

temos um gentipo, chamado selvagem, que produz uma banda, e um

gentipo alterado em relao a este, chamado mutante. O gentipo

mutante poder ser diferenciado do selvagem pelo RAPD quando

contiver:

(a) Substituio de uma ou mais bases no stio de anelamento.

(b) Deleo de um fragmento contendo 1 ou 2 stios de anelamento do

primer

(c) Insero de um segmento grande de DNA entre os 2 stios de

anelamento, conduzindo a um fragmento muito grande para ser

amplificado;


(d) Insero ou deleo de um pequeno segmento de DNA entre os stios de

anelamento do primer.

Nos casos (a), (b) e (c), existe presena de banda no gentipo selvagem,

seja ele homozigoto ou heterozigoto para a presena dos dois stios de

anelamento. Indivduos homozigotos para o alelo mutante apresentaro

ausncia de banda. Nestas situaes, em F2, ocorrer segregao do tipo

3:1 para presena/ausncia de bandas e o marcador RAPD ser dominante.

No caso (d) o gentipo mutante tambm apresentar uma banda,

resultado da amplificao de um segmento, de maior ou menor mobilidade

eletrofortica do que banda do fentipo selvagem, decorrentes,

respectivamente, da deleo e da inserso de um fragmento. Indivduos

heterozigotos apresentaro duas bandas. Nesta situao apenas, o

marcador RAPD considerado codominante.

Quase na totalidade dos casos, os marcadores RAPD so dominantes,

impossibilitando a deteco de indivduos heterozigticos. A dominncia

pode restringir a possibilidade de sua utilizao em anlises genticas onde

seja importante diferenciar homozigotos de heterozigotos. Isto ser

particularmente importante em populaes de plantas algamas, onde a

porcentagem de locos em heterozigose alta. Nos casos onde os indivduos

avaliados so todos homozigotos, a segregao dominante dos RAPD no

representa limitao, como em selees dentro de variedades compostas

por uma mistura de linhas puras ou populaes locais onde os indivduos

embora heterogneos entre si, so homozigotos. Em estudos envolvendo

diversidade ou distncia gentica em plantas autgamas, como as plantas a

serem analisadas para a identificao e determinao da diversidade so

homozigotas, a segregao dominante dos marcadores RAPD no produz

menos informaes do que os marcadores codominantes. Assim, as

caractersticas de menor custo, maior rapidez e melhor explorao da

variabilidade molecular existente, fazem a tcnica RAPD ser especialmente

recomendada.

possvel ampliar a oportunidade de marcadores RAPD comportarem-se


como dominantes pela associao com metodologias que permitam a

identificao de pequenas variaes na seqncia de bases de duas bandas

aparentemente iguais, como o tratamento com enzimas de restrio e a

utilizao de gis com gradiente de condies desnaturantes (WEISING et

al., 1995).

Microssatlites tambm so considerados codominantes, uma vez que

alelos diferentes podem ser observados como bandas distintas e,

consequentemente, a segregao observada do tipo 1:2:1. Os

marcadores microssatlites podem eventualmente comportar-se como

dominantes, no caso de a diferena entre os gentipos que segregam

residir, no no nmero de seqncias repetitivas, mas no stio de

anelamento dos primers.

7. Associando uma caracterstica de interesse a um

marcador

Uma das dificuldades encontradas no melhoramento gentico o fato do

ambiente interferir na expresso genotpica. Um exemplo onde o ambiente

interfere drasticamente o caso de resistncia a doenas. A doena pode

no ocorrer por inexistncia de inculo ou condies climticas favorveis

para seu desenvolvimento, de forma que no existe incidncia ou

severidade da doena o suficiente para que se diferenciem plantas

suscetveis de plantas resistentes. Assim, seria altamente desejvel que a

seleo pudesse ser feita para a presena do gene em si, ao invs de se

fazer seleo para o fentipo, e isto seria facilmente executvel no caso de

se ter certeza do efeito de determinado gene num fentipo buscado pelo

melhoramento. No entanto, atualmente o conhecimento genmico da

grande maioria das espcies de plantas tal que raras so as

caractersticas de interesse agronmico para as quais a seqncia gnica

conhecida. Ento, existe a alternativa de identificar marcas gnicas ligadas

ao gene de interesse, que co-segreguem com ele.

Para encontrar marcadores para uma caracterstica, necessrio observar


uma populao segregante, tanto para a caracterstica de interesse como

para o marcador. Normalmente, essa populao obtida a partir do

cruzamento de dois gentipos contrastantes para a caracterstica. Na

populao segregante observa-se cada indivduo tanto para a caracterstica

de interesse (por exemplo, resistncia ou suscetibilidade a uma doena)

como para uma srie de marcadores moleculares. A seguir, faz-se um teste

para verificar ligao de cada marcador com o gene de interesse (Figura 2).

Fig. 2. A) A identificao de um marcador ligado a uma caracterstica agronmicade interesse, por exemplo resistncia de plantas a doenas, feita em umapopulao que segregue tanto para a caracterstica de interesse como para omarcador. Normalmente, a populao segregante uma populao F2 obtidapelo cruzamento de pais contrastantes (P1 x P2). Neste exemplo, a resistncia doena dominante sobre suscetibilidade, pois plantas F1 so resistentes epredominam em F2. Observando cada indivduo F2 simultaneamente para umacaracterstica de interesse e uma srie de marcadores, espera-se encontrar pelomenos um marcador ligado. B) Marcador dominante ligado in cis ao gene deinteresse, pois quase sempre est presente quando a caracterstica agronmica deinteresse est presente. Um marcador dominante ligado in trans estaria quasesempre ausente quando a caracterstica de interesse estivesse presente. C)Marcador codominante ligado caracterstica de interesse: plantas resistentes doena contm o marcador ligado in cis resistncia (no exemplo, a banda demenor mobilidade eletrofortica, pois ela est presente no parental resistente) emhomozigose ou em heterozigose.


Como necessrio encontrar um marcador ligado caracterstica de

interesse, desejvel que os marcadores tenham boa distribuio no

genoma. RAPD e microssatlites tm melhor distribuio no genoma que

isoenzimas, mas quaisquer destes so muito mais freqentes e dispersos do

que os marcadores morfolgicos.

Marcadores ligados ao gene de interesse podem servir para seleo indireta

de indivduos no melhoramento de plantas. Este processo chama-se seleo

assistida por marcadores.

A seleo assistida particularmente importante quando realizada para

caracteres que se expressam em estgios de desenvolvimento avanado,

como caractersticas de frutos e sementes, quando o padro de herana

recessivo ou quando h necessidade e operaes especiais para que o gene

se expresse, como para resistncia pragas e doenas. Em doenas, a

seleo assistida evita erros devido a mtodos de inoculao inadequados

ou ineficientes e possibilita selecionar plantas resistentes a patgenos no

existentes na regio onde se realiza o programa de melhoramento, ou onde

a inoculao artificial represente riscos s lavouras comerciais.

8. Mapas genticos : um exemplo utilizando

marcadores RAPD

Construir um mapa gentico envolve: i) encontrar grupos de genes e

marcadores ligados, constituindo grupos de ligao ii) medir a distncia

gentica entre estes genes e marcadores, dada pela porcentagem de

gametas recombinantes.

Um mapa gentico pode auxiliar na localizao de genes ainda nomapeados, j que fornece a distribuio genmica dos marcadores. Isto importante particularmente quando se deseja mapear caractersticascontroladas por vrios genes, tambm chamadas caractersticas

quantitativas. Os locos mapeados recebem o nome de locos de

caractersticas quantitativas, mais conhecidos pela sigla do nome em ingls,

QTL (Quantitative Trait Loci).


Quando a espcie j possui um mapa gentico molecular, procura-se

determinar a posio do marcador associado ao gene de interesse, atravs

da associao a marcadores j presentes no mapa.

Um trabalho preliminar produo do mapa a escolha dos progenitores a

serem utilizados. Os progenitores devem ser o mais divergentes possvel

para possibilitar a anlise de um grande nmero de marcadores segregantes

na populao. Em muitos casos, para explorar ao mximo a divergncia, o

mapa obtido a partir de um cruzamento entre uma espcie cultivada e

uma espcie selvagem, sendo, portanto, um mapa interespecfico.

A dominncia de um marcador, impossibilitando a deteco de indivduos

heterozigticos, no uma limitao para a construo de mapas em

populaes recombinantes homozigticos, como linhagens endogmicas

recombinantes ou de duplos haplides. Tampouco limita para populaes de

retrocruzamento.

Na construo de mapas moleculares para populaes F2 ou F

3,

considerando dois marcadores (locos A e B) a dominncia dos marcadores

RAPD permite a deteco de apenas 4 classes fenotpicas havendo 10

gentipos possveis (Tabela 1)

Contudo, a estimativa da distncia entre marcadores pode ser realizada

sem a necessidade de teste de prognie, caso se considere que todos os

Tabela 1. Gentipos existentes dentro das classes fenotpicas detectadas emuma populao F2, considerando 2 genes (A e B) ligados e supondo a existnciade equilbrio entre os alelos.

Notas: * indivduos formados por apenas 1 gameta recombinante;** indivduos formados por 2 gametas recombinantes.


gametas so igualmente viveis dentro da populao. Se uma combinao

gnica resultar em viabilidade diferencial dos gametas, os resultados

obtidos podem conter erros grosseiros.

Um exemplo hipottico de construo de mapas a partir de F2 dado a

seguir. Considere que a populao foi obtida do cruzamento AB/AB X ab/

ab, e que a anlise por RAPD forneceu os resultados apresentados na

Figura 3:

Verifica-se na Figura 3 a existncia de ligao entre os marcadores A e B,

evidenciada pela segregao em F2. Supondo igual viabilidade gamtica, os

gentipos que compem cada classe fenotpica so os apresentados na

Tabela 1. Pode-se observar que, com exceo da IV, as classes so

compostas por mais de um gentipo, sendo as II e III compostas

unicamente por recombinantes e a I por recombinantes e no

recombinantes.

Fig. 3. Anlise do cruzamento entre AB/AB e ab/ab, sendo A e B produtos deamplificao RAPD, e a proporo de cada fentipo RAPD verificado em F

2.Os

gentipos que compem as classes fenotpicas I, II, III e IV podem serobservados no quadro 4.

Caso se considere x a freqncia de cada gameta recombinante e (0,5-x)

a freqncia de cada gameta parental, a proporo de cada gentipo

dada na Tabela 2.

Observa-se que o gentipo ab/ab tem proporo esperada (x2-x+0,25).

Como a classe IV composta exclusivamente por indivduos ab/ab,

possvel estimar a freqncia de cada gameta recombinante (x):

16%


x2-x+0,25=0,16

x2-x+0,09=0

x=0,10

A distancia gentica entre os locos dada em unidades de recombinao e

igual, em nmero, porcentagem de gametas recombinantes formados

em F1. Conforme ilustrado na Tabela 2, em F

1 so formados dois tipos de

gametas recombinantes, em iguais propores, x Ab e x aB. Portanto, a

porcentagem de gametas recombinantes ser 2x, que igual 20%. Como,

a rigor, a correspondncia entre porcentagem de recombinantes e distncia

de recombinao no exata, pode-se utilizar ferramentas, como a curva

de Haldane (STAUB et al., 1996). Tem-se que a distncia entre os 2

marcadores de 20 unidades de recombinao.

9. Identificao de Gentipos (fingerprinting) e Estimativa

da Diversidade Gentica Utilizando Marcadores

Moleculares

As caractersticas genticas de populaes ou cultivares podem ser

mensuradas por caracteres morfolgicos. Porm, marcadores moleculares

podem ampliar em muito o poder de deteco de diferenas entre e dentro

de populaes, particularmente se forem altamente polimrficos.

Tabela 2. Propores esperadas de cada gentipo em uma populao F2, obtida

do cruzamento entre AB/AB e ab/ab, considerando que os genes A e B estoligados e que se recombinam a uma freqncia igual a 2x.


Os marcadores moleculares permitem obter um padro de polimorfismo

nico na comparao de diferentes gentipos. Atravs da identificao

molecular de gentipos possvel realizar trabalhos de caracterizao de

variedades e cultivares, realizar controle de pureza de sementes, verificar a

taxa de fecundao cruzada existente, detectar variao somaclonal em

cultura de tecidos, constatar a obteno de hbridos somticos e reduzir o

nmero de geraes de retrocruzamento necessrias para a recuperao

do progenitor recorrente.

Uma vez estabelecida a identificao molecular de um conjunto de

gentipos, possvel avaliar a diversidade gentica entre eles. Caso os

gentipos avaliados sejam escolhidos por uma razo qualquer, a diversidade

verificada representa, unicamente, a existente entre estes materiais. A

diversidade estimada pode representar a existente dentro e entre

populaes diferentes, se cada populao estiver representada por uma

amostra de indivduos.

Em programas de melhoramento pode-se querer maximizar a divergncia

gentica em uma populao. A escolha de pais divergentes muito

importante quando se deseja iniciar um programa por hibridao, pois

permite a ocorrncia de um maior nmero de recombinaes nas

populaes segregantes. Ento, marcadores moleculares so usados para

medir a distncia gentica entre os pais, optando-se pelos cruzamentos

onde os pais so mais distantes entre si. Em contrapartida, progenitores

menos divergentes podem facilitar a recuperao do progenitor recorrente

em programas de retrocruzamento (ABDELNOOR, 1994).

Estimativas da diversidade podem ser obtidas por mtodos que verifiquem a

similaridade ou a distncia existente. Diversos coeficientes podem ser

empregados, entre os quais se destacam: Jaccard, Coincidncia Simples

(simple matching), cuja metodologia de clculo foi bem descrita por Fungaro

& Vieira (1998) e a distncia mdia euclidiana e a distncia generalizada

Mahalanobis (CRUZ e REGAZZI, 1997). Os resultados so agrupados em

uma matriz, utilizada na construo de dendogramas atravs de tcnicas de

agrupamento (CRUZ e REGAZZI, 1997), como o mtodo das mdias das


distncias ou UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical

Averages) (FUNGARO e VIEIRA,1998). Os resultados obtidos pelos

diferentes coeficientes podem diferir entre si.

10. Algumas populaes segregantes facilitam o

mapeamento de genes

Para a obteno de marcadores associados a genes necessrio analisar

gentipos contrastantes. As populaes segregantes mais freqentemente

utilizadas so as linhagens quase isognicas, em ingls Near isogenic lines

(NIL), e plantas F2 em um procedimento conhecido como Bulked Segregant

Analysis (BSA).

As linhagens quase isognicas so linhagens que apresentam a mesma

constituio gentica, diferindo apenas em um carter. Elas so obtidas

atravs da hibridao entre duas linhagens contrastantes, seguida de

diversos ciclos de retrocruzamento, fazendo-se seleo para o carter que

se deseja estudar.

Um procedimento alternativo para a obteno de NILs foi desenvolvido por

Haley et al. (1994b), que ao invs de retrocruzamentos, utiliza um processo

que vincula o desenvolvimento de NILs aos mtodos convencionais de

desenvolvimento de cultivares e linhagens em plantas autgamas. Neste

procedimento, os processos de melhoramento so conduzidos normalmente

atravs de pedigree, pedigree modificado, bulk ou combinaes destes

mtodos. Atravs de NILs obtidas por este procedimento, os autores

encontraram um marcador RAPD intimamente ligado (2,23 1,33cM) ao

gene Ur-3, um gene maior que confere resistncia a algumas raas de

Uromyces appendiculatus, agente causal da ferrugem do feijoeiro.

BSA foi desenvolvido por Michelmore et al. (1991). Consiste em dividir uma

populao F2 em duas subpopulaes de acordo com a expresso da

caracterstica de interesse. De cada subpopulao retirada uma amostra

de 10 a 15 indivduos homozigotos, determinados atravs do teste de

prognie. Para cada amostra, o DNA das plantas extrado e misturado,


formando um pool. Os dois pools obtidos, um de cada amostra, so

submetidos amplificao. Como as regies do genoma no associadas

caracterstica devem estar igualmente representadas nos pools, espera-se

que o polimorfismo observado entre os pools esteja ligado caracterstica

em estudo.

Uma variao do BSA foi desenvolvida por Choi e Skorupska (1995) que,

ao invs de utilizar uma populao F2 para formar pools contrastantes,

utiliza uma mistura de diferentes cultivares com resposta comum a

determinado carter para compor cada pool. Empregando esta estratgia

eles conseguiram observar polimorfismo RAPD entre pools de soja

contrastantes para resistncia ao nematide do cisto. Porm, os autores

no verificaram se os produtos de amplificao polimrficos estavam

ligados resistncia.

A escolha do tipo de material vegetal a ser empregado nos estudos, se

NILs derivados de retrocruzamento, NILs derivadas de um processo de

seleo, BSA ou combinaes destes processos, depende das condies e

facilidades locais.

11. Como otimizar a informao fornecida por marcadores

dominantes

A dominncia dos marcadores RAPD pode ser contornada pela utilizao

de dois marcadores em fases de ligao diferente, um in cis, isto ,

localizado no mesmo cromossomo que contem o gene de interesse, e outro

in trans, isto , localizado no cromossomo homlogo, que no contem o

gene de interesse (WILLIANS et al., 1990, (Figura 4). Os homozigotos para

o gene de interesse possuem apenas a banda do marcador in cis, e os

indivduos heterozigotos possuem as 2 bandas, uma correspondente ao

marcador in cis e uma correspondente ao marcador in trans. A eficcia

com que heterozigotos podem ser identificados depende da distncia entre

o par de marcadores, sendo tanto maior quanto menor for a distncia.

Para realizar seleo assistida em populaes de retrocruzamento, que so


sempre heterozigotas para os genes de interesse, marcadores ligados in cis

podem servir para selecionar os gentipos heterozigticos, que so aqueles

que contm o gene de interesse. Marcadores dominantes in trans no tm

o poder de identificar gentipos que contm o gene de interesse em

populaes de retrocruzamento, pois amplificariam bandas tanto nos

heterozigotos como nos homozigotos (Tabela 3).

Em populaes F2, marcadores in trans so os mais informativos. Como

pode ser observado na Tabela 4, os marcadores ligados a genes dominantes

Fig. 4. Identificao de heterozigotos utilizando dois marcadores RAPD, um incis outro in trans.

Tabela 3. Em populaes de retrocruzamento marcadores ligados in cisselecionam os gentipos heterozigticos. Os marcadores in trans no podem serutilizados em seleo assistida, pois o produto de amplificao estaria presentenos dois gentipos formados.

+ plantas selecionadas - plantas descartadas


Tabela 4. Discriminao entre gentipos de uma populao F2 atravs de seleo

assistida por marcadores RAPD ligados a um gene de resistncia doena,segundo a forma de ligao. No caso de o gene de interesse ser dominante, osmarcadores in trans selecionam apenas indivduos homozigotos para acaracterstica, enquanto a seleo atravs de marcadores in cis resulta na seleode indivduos homo e heterozigotos.

+ plantas selecionadas - plantas descartadas

Fig. 5. Composio terica da porcentagem de indivduos de uma populao F2selecionados atravs de um marcador RAPD. A marcadores in trans localizados a20cM do gene permite mais de 50% dos indivduos selecionados sejamhomozigticos para a caracterstica de interesse. J marcadores associados in ciscom ligao absoluta selecionam apenas 33% de homozigticos (Haley et al.,1994a).

in trans selecionam apenas indivduos homozigotos para a caracterstica,

enquanto a seleo atravs de marcadores in cis resulta na seleo de

indivduos homo e heterozigotos, sendo portanto menos eficiente. Como se

pode observar na Figura 5, marcadores in trans localizados a 20cM do

gene permite mais de 50% dos indivduos selecionados sejam

homozigticos para a caracterstica de interesse. J marcadores


associados in cis com ligao absoluta selecionam apenas 33% de

homozigticos (HALEY et al., 1994a).

Conclui-se que a informao obtida de marcadores dominantes depende da

forma de ligao do marcador caracterstica e do tipo de populao a ser

averiguada.

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