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MANUEL PEDRO MALEIA PRODUTIVIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA DE CULTIVARES COMERCIAIS DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum L. raça latifolium H.) EM MOÇAMBIQUE MARINGÁ PARANÁ - BRASIL JANEIRO - 2010
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MANUEL PEDRO MALEIA
PRODUTIVIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA DE CULTIVARES COMERCIAIS DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum L. raça latifolium H.) EM
MOÇAMBIQUE
MARINGÁ
PARANÁ - BRASIL JANEIRO - 2010
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MANUEL PEDRO MALEIA
PRODUTIVIDADE E DIVERGÊNCIA GENÉTICA DE CULTIVARES
COMERCIAIS DE ALGODÃO (Gossypium hirsutum L. raça latifolium H.) EM MOÇAMBIQUE
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de Mestre.
MARINGÁ PARANÁ - BRASIL JANEIRO - 2010
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Maleia, Manuel Pedro
M245p Produtividade e divergência genética de cultivares
comerciais de algodão (Gossypium hirsutum L. raça
latifolium H.) em Moçambique / Manuel Pedro Maleia. --
Maringá, 2010.
75 f. : il. color.
Orientador : Prof. Dr. Pedro Soares Vidigal Filho.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento, 2010.
1. Algodoeiro - Avaliação. 2. Algodão - Produtividade -
Diversidade genética. 3. Algodoeiro Adaptabilidade. 4.
Algodoeiro - Similaridade genética. 5. Algodoeiro -
Dissimilaridade genética. 6. Algodoeiro - Marcadores
moleculares RAPD. 7. Algodão - Moçambique. I. Universidade
Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Genética
e Melhoramento. II. Título.
CDD 21.ed.633.51
Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte.
(O autor)
iii
Aos meus pais, Pedro Manuel Maleia e Muachema Muhamade Maleia.
À minha esposa, Teresa José Maleia.
Aos meus irmãos, Fátima, Josefina, Pedro Jr., Aida, Momade e Irene.
Aos meus sobrinhos, Susana, Benito, Assanito e Mamu.
A toda família Maleia.
DEDICO.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois sem Ele nada seria possível.
À Universidade Estadual de Maringá, em especial ao Programa de Pós-
graduação em Genética e Melhoramento (PGM), pela oportunidade de realizar este
curso.
Ao Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT) - Moçambique e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – Brasil, pelo
intercâmbio para formação em cursos de pós-graduação, e pela concessão de bolsa
de estudos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela disponibilização de recursos financeiros necessários à aquisição de materiais
para a pesquisa.
Ao Centro de Investigação e Multiplicação de Sementes de Algodão de
Namialo (CIMSAN), à DUNNAVANT – Morrumbala, à PLEXUS – Montepuez e a
todos os funcionários que tornaram possível a realização da parte deste trabalho
desenvolvida em Moçambique.
Ao Instituto de Investigação Agrária de Moçambique (IIAM), em especial ao
doutor Calisto Bias, pela disponibilidade e auxílio na recomendação da candidatura à
bolsa de estudos.
Ao professor doutor Pedro Soares Vidigal Filho, pela orientação, incentivo e
apoio científico que prestou incansavelmente, com muita paciência, sabedoria e,
sobretudo, pelos conhecimentos transmitidos. A ele, meu grande reconhecimento e
especial agradecimento.
Às professoras doutora Maria Celeste Gonçalves Vidigal e doutora Adriana
Gonela, pela co-orientação, pelas experiências e conhecimentos transmitidos e
pelas sugestões que foram essenciais à realização deste trabalho.
À doutora Giselly Figueiredo Lacanallo, pela ajuda durante os trabalhos
laboratoriais.
Ao Núcleo de Pesquisa Aplicada à Agricultura (NUPAGRI), pelas condições
técnicas e materiais disponibilizados.
Ao doutor Marcus Vinícius Kvitschal, da Empresa de Pesquisa Agropecuária
e Extensão Rural de Santa Catarina (EPAGRI), pela ajuda prestada nas análises
estatísticas.
v
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento (PGM), especialmente aos professores doutor Carlos Alberto Scapim,
doutor Alberto José Prioli, doutor Ronald José Barth Pinto, doutor Erasmo Renesto e
doutora Maria de Fátima Pires da Silva Machado, pelos importantes conhecimentos
transmitidos. Ao Secretário do PGM, Francisco José da Cruz, e à Maria Valquíria Magro,
pelo encorajamento e pelos serviços prestados.
Aos amigos e grandes companheiros de curso do PGM, pela ajuda,
amizade, companheirismo e convivência, tornando minha permanência no Brasil
uma valiosa experiência profissional e pessoal.
A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para o sucesso do
presente trabalho.
vi
BIOGRAFIA
MANUEL PEDRO MALEIA, filho de Pedro Manuel Maleia e de Muachema
Muhamade, nasceu em 2 de agosto de 1976, na cidade de Angoche, província de
Nampula, Moçambique.
Em dezembro de 1993, concluiu o Ensino Básico na Escola Secundária de
Angoche, Nampula, Moçambique.
Concluiu o Ensino Médio, em dezembro de 1996, na Escola Pré-Universitária
1º de Maio, Nampula, Moçambique.
Ingressou no Curso de Licenciatura em Engenharia Agronômica, em agosto
de 1997, na Universidade Eduardo Mondlane (UEM), Maputo, Moçambique, obtendo
o título de Engenheiro Agrônomo em 2003.
Em junho de 2003, ingressou no Instituto de Investigação Agrária de
Moçambique (IIAM), exercendo funções no Centro de Investigação e Multiplicação
de Sementes de Algodão de Namialo (CIMSAN), nas áreas de Melhoramento de
Plantas, Proteção Vegetal e Fitotecnia.
Em março de 2008, ingressou no curso de Mestrado do Programa de Pós-
Graduação em Genética e Melhoramento (PGM), da Universidade Estadual de
Maringá – UEM, em Maringá – PR, Brasil.
vii
ÍNDICE
LISTA DE QUADROS ........................................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. xi LISTA DE QUADRO E FIGURA DO APÊNDICE ................................................. xii RESUMO ............................................................................................................. xiii ABSTRACT .......................................................................................................... xv
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 4
2.1. Origem, distribuição geográfica e difusão do algodão ............................. 4
2.2. Evolução e genética ................................................................................ 4
2.3. Cultura de algodão (Gossypium hirsutum L.) .......................................... 6
2.3.1. Importância sócio-econômica ............................................................... 6
2.3.2. História e problemas da cultura do algodoeiro em Moçambique .......... 7
2.4. Interação genótipo x ambiente ................................................................. 8
2.5. Estabilidade e adaptabilidade fenotípicas .............................................. 11
2.5.1. Metodologia proposta por Annicchiarico (1992) .................................. 14
2.5.2. Metodologia proposta por Toler e Burrows (1998) .............................. 14
2.6. Diversidade genética ............................................................................. 17
2.7. Marcadores moleculares ....................................................................... 18
2.7.1. Marcadores moleculares do tipo RAPD .............................................. 20
2.7.2. Análise estatística dos dados de marcadores RAPD .......................... 21
2.7.2.1. Medidas de similaridade ..................................................................... 21
2.7.2.2. Coeficiente de similaridade de Jaccard .............................................. 22
2.7.2.3. Análise de agrupamento ..................................................................... 22
2.7.2.3.1. Método hierárquico UPGMA (Ligação média entre grupo) ........... 23
2.7.2.3.1.1. Definição do número de grupos ......................................................... 24
2.7.2.4. Análise de variância molecular (AMOVA) ........................................... 25
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 26
3.1. Análise de adaptabilidade e de estabilidade produtivas ........................ 26
3.1.1. Localização dos experimentos ............................................................ 26
3.1.2. Clima e solo ........................................................................................ 28
3.1.3. Características das regiões agro-ecológicas ...................................... 28
viii
3.1.4. Tratamentos ........................................................................................ 29
3.1.5. Delineamento experimental ................................................................ 30
3.1.6. Unidades experimentais ..................................................................... 30
3.1.7. Instalação e condução dos experimentos ........................................... 30
3.1.8. Características avaliadas .................................................................... 31
3.1.9. Análises estatísticas ........................................................................... 31
3.1.9.1. Análise de variância individual ............................................................ 32
3.1.9.2. Análise de variância conjunta ............................................................. 33
3.2. Análise da divergência genética molecular ............................................ 34
3.2.1. Cultivares e linhagens analisadas ...................................................... 34
3.2.2. Extração e quantificação do DNA genômico....................................... 35
3.2.3. Iniciadores (primers) RAPD utilizados ................................................ 36
3.2.4. Amplificação do DNA e Análises do DNA genômico .......................... 37
3.2.5. Análises estatísticas dos dados moleculares ...................................... 38
3.2.5.1. Análise de agrupamento e quantificação da variabilidade
genética entre e dentro dos grupos geográficos ........................................... 38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 39
4.1. Análise de variância individual ............................................................... 39
4.2. Análise de variância conjunta ................................................................ 40
4.3. Adaptabilidade e estabilidade de produtividade de algodão em caroço 42
4.4. Rendimento de fibra das cultivares analisadas ...................................... 45
4.5. Divergência genética molecular entre cultivares e linhagens ................ 46
4.5.1. Análise de variância molecular (AMOVA) ........................................... 51
4.5.2. Análise de agrupamento ..................................................................... 51
4.6. Considerações finais ............................................................................. 54
5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 57
APÊNDICE ............................................................................................................ 73
ix
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Critério de classificação dos grupos de cultivares pelo padrão de
resposta fenotípica, conforme classificação de Toler e Burrows (1998)
......................................................................................................... 16
Quadro 2 - Comparação dos tipos de marcadores moleculares mais utilizados em
estudos genéticos e programas de melhoramento .......................... 19
Quadro 3 - Anos e locais de avaliação de produtividade de cultivares de algodão em
diferentes Regiões Agroecológicas de maior concentração de produção
de algodão em Moçambique ............................................................ 27
Quadro 4 - Lista de cultivares avaliadas, origem, ano da introdução, características
de tolerância à cigarrinha (Empoasca fascialis) e o percentual da área
cultivada em Moçambique ............................................................... 30
Quadro 5 - Análise de variância individual, com as respectivas esperanças de
quadrados médios ........................................................................... 32
Quadro 6 - Análise de variância conjunta, com as respectivas esperanças de
quadrados médios ........................................................................... 33
Quadro 7 - Lista das cultivares e linhagens usadas para análise da divergência
genética ........................................................................................... 34
Quadro 8 - Primers decâmeros utilizados nas reações de amplificação de
fragmentos de DNA usados como marcadores RAPD ..................... 37
Quadro 9 - Resumo da análise de variância individual da produtividade de algodão
em caroço (kg ha-1) de nove cultivares avaliadas em três regiões de
Moçambique, durante os anos agrícolas de 2003/04, 2004/05 e
2005/06 ............................................................................................ 39
Quadro 10 - Resumo da análise de variância conjunta da produtividade de algodão
em caroço (kg ha-1) de nove cultivares avaliadas em três regiões de
Moçambique, durante os anos agrícolas de 2003/04, 2004/05 e
2005/06 ............................................................................................ 40
Quadro 11 - Desdobramento do efeito de cultivares na produtividade de algodão em
caroço de nove cultivares de algodão avaliadas em três Regiões Agro-
ecológicas de Moçambique durante os anos agrícolas 2003/04,
2004/05 e 2005/06 ........................................................................... 41
x
Quadro 12 - Estimativa dos parâmetros de estabilidade e adaptabilidade para
produtividade de algodão em caroço de nove cultivares comerciais de
algodão mediante as metodologias propostas por Annicchiarico (1992)
e por Toler e Burrows ( 1998) .......................................................... 45
Quadro 13 - Relação dos primers decâmeros utilizados, número de bandas obtidas
de RAPD amplificados de 21 cultivares e linhagens de algodão ..... 46
Quadro 14 - Resumo da matriz de coeficientes de similaridade de Jaccard (sii’) e de
seus complementos (dii’), obtidos com 151 marcadores de DNA
mediante o método de RAPD entre 21 cultivares e linhagens de
algodão ............................................................................................ 49
Quadro 15 - Medidas de dissimilaridade obtidas a partir de Complemento Aritmético
do Índice de Jaccard entre as 13 cultivares e oito linhagens de algodão
(G. hirsutum) .................................................................................... 50
Quadro 16 - Análise de variância molecular de dois grupos geográficos de cultivares
e linhagens de algodão (G. hirsutum), obtida por marcadores
moleculares RAPD (151 bandas) ..................................................... 51
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Padrões de resposta fenotípica bi-segmentada convexo e côncavo (A e E)
e uni-segmentada (B, C e D) das cultivares em função da variação na
qualidade ambiental (µ). ........................................................................... 17
Figura 2 - Locais onde foram realizados os experimentos de avaliação das nove
cultivares comerciais de algodão. ............................................................ 26
Figura 3 - Padrão de resposta das cultivares de algodão enquadradas nos grupos
uni-segmentados (B, C e D). .................................................................... 44
Figura 4 - Perfil eletroforético dos produtos de amplificação do DNA genômico de 13
cultivares e oito linhagens de algodão (G. hirsutum) com os primers OPA-
13 (A), OPB-07 (B) e OPA-11 (C). ........................................................... 48
Figura 5 - Dendrograma baseado na matriz de dissimilaridade correspondente ao
Complemento Aritmético do Índice de Jaccard entre 21 cultivares e
linhagens de algodão (G. hirsutum) definido pelo critério de agrupamento
UPGMA, utilizando 151 marcadores RAPD. ............................................ 52
Figura 6 - Projeção gráfica das distâncias genéticas das 13 cultivares e oito
linhagens de algodão (G. hirsutum) em espaço bidimensional, com base no
Complemento Aritmético do Índice de Jaccard. ....................................... 54
xii
LISTA DE QUADRO E FIGURA DO APÊNDICE
Quadro 1A - Desdobramento do efeito de cultivares no rendimento de fibra de nove
cultivares de algodão avaliadas em três Regiões Agro-ecológicas de
Moçambique, no ano
2005/06.............................................................74
Figura 1B - Mapa de Regiões Agro-ecológicas de Moçambique (INIA, 2000)........75
xiii
RESUMO
MALEIA, Manuel Pedro, M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, janeiro de 2010. Produtividade e divergência genética de cultivares comerciais de algodão (Gossypium hirsutum L. raça latifolium H.) em Moçambique. Professor Orientador: Pedro Soares Vidigal Filho. Professores Conselheiros: Maria Celeste Gonçalves-Vidigal e Adriana Gonela.
O algodoeiro produz a mais importante fibra têxtil e a maioria das cultivares
comerciais plantadas no mundo pertencem à espécie G. hirsutum raça latifolium. O
presente estudo teve como objetivos avaliar o comportamento fenotípico de nove
cultivares comerciais de algodão (G.hirsutum L. raça latifolium) e estimar a
divergência genética entre cultivares e linhagens de algodão de origem africana e
americana introduzidas em Moçambique. Os experimentos de avaliação de
produtividade foram constituídos das cultivares africanas REMU 40, ALBAR SZ9314,
ALBAR FQ902, ALBAR BC853, STAM 42, CA 222, CA 324, IRMA 12-43 e ISA 205,
utilizando-se do delineamento em blocos completos casualizados, com quatro
repetições. A estabilidade e a adaptabilidade de produção foram efetuadas mediante
o emprego das metodologias de Annicchiarico (1992) e de Toler e Burrows (1998).
Na análise da divergência genética das cultivares africanas e das cultivares e
linhagens americanas TAMCOT 22, TAM 96WD-69s, TAMCOT Pyramid, TAM 98D-
102, TAM 96WD-18, TAM 94J-3, TAM 88G-104, TAMCOT Sphinx, TAM 98D-99ne,
TAM 94WE-37s, TAM 94L-25 e TAMCOT Luxor, utilizou-se de marcadores
moleculares RAPD. A análise de adaptabilidade pela metodologia de Toler e
Burrows (1998) indicou que as cultivares CA 324 e STAM 42 apresentaram
adaptabilidade específica a ambientes de alta e de baixa qualidade,
respectivamente, enquanto as demais cultivares avaliadas apresentaram
adaptabilidade ampla. No que se refere à metodologia de Annicchiarico (1992),
verificou-se que as cultivares ISA 205, STAM 42 e IRMA 12-43 apresentaram maior
estabilidade fenotípica. Os 24 primers RAPD utilizados amplificaram um total de 166
bandas, identificando 90,96% de polimorfismo. A quantificação da variabilidade
genética intra e intergrupos geográficos evidenciou uma variabilidade significativa de
16,30% entre os grupos geográficos africano e americano. O estudo revelou maior
similaridade genética entre as cultivares comerciais de algodão africanas, enquanto
as cultivares e linhagens americanas foram as mais dissimilares. O complemento
xiv
aritmético de Jaccard, obtido com os 151 marcadores moleculares RAPD, mostrou
que as cultivares africanas ALBAR BC853 e STAM 42 foram as mais similares,
enquanto as combinações mais dissimilares foram entre a cultivar TAMCOT Sphinix
com ISA 205, ALBAR BC853 e REMU 40. Em Programas de Melhoramento do
Algodoeiro, visando ao incremento de produtividade, recomendam-se as
combinações ISA 205 x TAMCOT Sphinix, ALBAR BC853 x TAMCOT Sphinix e
REMU 40 x TAMCOT Sphinix de forma a se obter segregantes transgressivos
superiores.
Palavras-chave: Adaptabilidade, dissimilaridade genética, interação G x A,
marcadores moleculares RAPD.
xv
ABSTRACT
MALEIA, Manuel Pedro, M.Sc. Universidade Estadual de Maringá, January, 2010. Productivity and genetic divergence of commercial cotton cultivars (Gossypium hirsutum L. race latifolium H.) in Mozambique. Adviser: Pedro Soares Vidigal Filho. Committee members: Maria Celeste Gonçalves-Vidigal and Adriana Gonela.
Cotton is the main textile fiber and most of the commercial cotton cultivars grown in
the world belong to G. hirsutum race latifolium. The objectives of the present study
were to evaluate phenotypic behavior of nine commercial cotton cultivars (G.
hirsutum L. race latifolium), and also to estimate genetic divergence among cotton
cultivars and lineages of African and American origins introduced in Mozambique.
The experiments of cotton productivity were carried out with African cultivars Remu
40, ALBAR SZ9314, ALBAR FQ902, ALBAR BC853, STAM 42, CA 222, CA 324,
IRMA12-43 and ISA 205, in a randomized complete block design with four
replications. The stability and adaptability of cottonseed productivity were assessed
using methodologies proposed by Annicchiarico (1992) and Toler and Burrows
(1998). The adaptability analysis of Toler and Burrows (1998) indicated that the
cultivars CA 324 and STAM 42 presented specific adaptability to high and low quality
environments, respectively, whereas the remaining evaluated cultivars showed
general adaptability. Regarding the Annicchiarico’s methodology (1992), it was
verified that the cultivars ISA 205, STAM 42 and IRMA 12-43, showed higher
phenotypic stability. The genetic divergence among the African cultivars and
American cultivars and lineages TAMCOT 22, TAM 96WD-69s, TAMCOT Pyramid,
TAM 98D-102, TAM 96WD-18, TAM 94J-3, TAM 88G-104, TAMCOT Sphinx, TAM
98D-99ne, TAM 94WE-37s, TAM 94L-25 e TAMCOT Luxor was performed using
RAPD molecular markers. The 24 RAPD primers used had amplified a total of 166
bands showing 90.96% of polymorphism. The quantification of genetic diversity of
intra and inter geographic groups pointed out a significant variability of 16.30%
between African and American geographic groups. The study revealed higher
similarity among African commercial cotton cultivars, while American cultivars and
lineages were the most dissimilar. The Arithmetic Complement of Jaccard’s Index,
obtained with the 151 RAPD molecular markers, showed that the African cultivars
xvi
ALBAR BC853 and STAM 42 were the most similar, whereas the combinations
between cultivar TAMCOT Sphinix with ISA 205, ALBAR BC853 and REMU 40 were
the most dissimilar. In order to increase the cotton productivity the following
combinations ISA 205 x TAMCOT Sphinix, ALBAR BC853 x TAMCOT Sphinix e
REMU 40 x TAMCOT Sphinix should be recommended for the Mozambique Cotton
Breeding Program to obtain superior transgressive segregants.
Key words: Adaptability, genetic dissimilarity, G x E interaction, RAPD molecular
markers.
1
1. INTRODUÇÃO
O algodoeiro (Gossypium spp.) pertence à família Malvaceae, gênero
Gossypium, que inclui 45 espécies diplóides (2n=2x=26) e seis alotetraplóides
(2n=4x=52) entre selvagens e cultivadas (Brubaker et al., 1999). As espécies
cultivadas do gênero Gossypium são quatro: duas delas diplóides (Gossypium
herbaceum e Gossypium arboreum), originárias do Velho Mundo, e duas
alotetraplóides (Gossypium hirsutum e Gossypium barbadense), originária do
Novo Mundo. As espécies diplóides envolvem os genomas A, B, C, D, E, F, G e
K, enquanto as alotetraplóides correspondem a dois grupos sub-genômicos, com
similaridades aos genomas A e D (Endrizzi et al., 1985; Stewart, 1995).
A produção mundial do algodão é inteiramente proveniente das espécies
G. hirsutum e G. barbadense. A espécie G. hirsutum destaca-se como a mais
importante, contribuindo com 90 a 95% da produção mundial (Iqbal et al., 2001;
Altaf-Khan et al., 2002; Penna, 2005). São descritas para esta espécie sete raças
geográficas (latifolium, marie-galante, morrilli, palmeri, punctatum, richmondi e
yucatanense), de acordo com as variações ocorridas devido à difusão da cultura
(Neves, 1965). A raça latifolium, originária do México e da Guatemala, deu origem
às cultivares comerciais “upland”, amplamente semeadas no mundo.
O algodoeiro (Gossypium hirsutum L. raça latifolium H.) é cultivado em
regiões tropicais e subtropicais em diferentes tipos de solos como cultura anual,
embora seja basicamente uma cultura perene tropical (Prentice, 1972; Fryxell,
1984). A cultura representa cerca de 40% de todas as fibras produzidas no mundo
(Ozyigit, 2009). Mais de dois terços da sua produção mundial é proveniente de
regiões de Latitudes superiores a 30ºN, onde se localizam os dois principais
produtores: os Estados Unidos e a China (FAO, 2009). Em Moçambique, o
algodão é cultivado principalmente por produtores familiares, em áreas de cultivo
inferiores a 1 ha, contribuindo com cerca de 90% da produção total Moçambicana
de algodão (Mahalambe, 2003). Entretanto, as lavouras apresentam uma
produtividade média de 541 kg ha-1, muito inferior à produtividade média mundial
que é da ordem de 1.251 kg ha-1 de algodão em caroço (FAO, 2009).
A pesquisa agrária no período colonial em Moçambique, que data dos
anos anteriores a 1974, foi marcada pela negligência do setor familiar (Bias e
2
Donovan, 2003). Desde a independência até a assinatura dos Acordos Gerais da
Paz, celebrados em 1992, a eficácia da pesquisa agrária foi minada pela
instabilidade política e pela guerra civil. Neste período, as cultivares
predominantemente usadas foram Remu 40 e A 637-24, caracterizadas pelo
baixo rendimento de fibra (34 a 35%). Como forma de melhorar a produtividade e
a rentabilidade da cultura, houve uma crescente demanda de variedades
melhoradas, mais produtivas e com melhores indicadores tecnológicos de fibra
(Walker et al., 2006).
A introdução de cultivares comerciais de algodão oriundas de outros
países africanos, com destaque àquelas com elevada porcentagem de fibra e
potencialidade produtiva nas condições em que foram desenvolvidas, foi a prática
mais adotada (Walker et al., 2006). Uma parte desse germoplasma está sendo
cultivado pelos agricultores. De acordo com a IAM (2007), as cultivares
amplamente utilizadas em Moçambique são a CA 324 e a Remu 40, que juntas
representam cerca de 80% do total de área de cultivo de algodão
Apesar de algumas destas cultivares introduzidas já estarem sendo
utilizadas pelos produtores, em decorrência do estímulo das empresas
fomentadoras, as mesmas ainda não tinham sido avaliadas quanto à estabilidade
e adaptabilidade de produção nas condições Moçambicanas.
Segundo Suinaga et al. (2006), a interação genótipos por ambientes é um
dos principais desafios no melhoramento de plantas, tanto no processo de
seleção ou recomendação de cultivares, principalmente quando o ranqueamento
de desempenho dos genótipos aos ambientes não é constante. A identificação de
cultivares com alta adaptabilidade e desempenho previsível no âmbito específico
ou geral das condições ambientais é uma opção para lidar com este fato (Cruz e
Carneiro, 2006). Como a produção de algodão em Moçambique é ainda
caracterizada por baixos níveis de produtividade mesmo ao nível da África (FAO,
2009), supôs-se que as cultivares introduzidas apresentam um padrão
diferenciado de adaptabilidade e algumas delas não são bem adaptadas às
condições do ambiente de Moçambique, assim como são nas condições em que
foram desenvolvidas e recomendadas.
Desse modo, foi necessário um estudo para avaliar o potencial produtivo e
a adaptabilidade dessas cultivares, para oferecer maior suporte ao sistema de
produção de algodão em Moçambique, conferindo a sua adequação às condições
3
ambientais do país. Além do mais, a variabilidade encontrada nas cultivares
comerciais de algodão é considerada baixa pelo uso das mesmas cultivares
comerciais ou germoplasma elite aparentado nos programas de melhoramento
(Van-Esbroeck et al., 1998). Com a finalidade de ampliar o banco de
germoplasma e utilizar a sua fonte nos programas de melhoramento, foram
introduzidas, em 2006, mais quatro cultivares e oito linhagens de algodão da
espécie G. hirsutum dos Estados Unidos da América (EUA). Entretanto, a
diversidade genética deste germoplasma ainda não tinha sido avaliada, sendo
este procedimento importante para que os recursos genéticos possam ser
utilizados de forma adequada, auxiliando o melhorista na identificação e seleção
dos genitores para os programas de melhoramento (Falconer, 1989).
Na avaliação da diversidade genética, os marcadores moleculares
destacam-se como uma das principais ferramentas por possibilitar a obtenção de
informações mais precisas no que se refere ao polimorfismo, a independência dos
efeitos ambientais e do estádio fisiológico da planta (Agarwal, 2008).
Dentre os marcadores moleculares disponíveis atualmente, o RAPD
(Random Amplified Polimorfism DNA) tem sido utilizado para identificar
divergência genética disponível em bancos de germoplasma, pela sua
simplicidade, necessidade de pouca quantidade de DNA e habilidade em gerar
polimorfismo (Williams et al.,1990; Ferreira e Grattapaglia,1998). Gottardi et al.
(2002) salientam que o uso de marcadores RAPD permite a identificação do
parentesco entre cultivares e inferências sobre a diversidade existente entre e
dentro de cultivares. No algodoeiro, vários trabalhos demonstraram que a técnica
RAPD foi eficiente na identificação da divergência genética (Zuo et al., 2000; Lu e
Myers, 2002; Linus et al., 2002; Mehetre et al., 2004; Vafaie-Tabar et al., 2004;
Rana e Bhat, 2005; Sheidai et al., 2007; Patil et al., 2007; Esmail et al., 2008;
Mohmood et al., 2009).
O presente trabalho teve como objetivos avaliar o comportamento
fenotípico de nove cultivares comerciais de algodão (Gossypium hirsutum L. raça
latifolium) visando à recomendação de cultivares estáveis e adaptáveis às
condições das regiões algodoeiras de Moçambique; e estimar a divergência
genética entre as nove cultivares comerciais de algodão (G. hirsutum) africanas e
quatro cultivares e oito linhagens de algodão (G. hirsutum) americanas, por meio
de marcadores moleculares RAPD.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Origem, distribuição geográfica e difusão do algodão
As espécies cultivadas do gênero Gossypium são quatro, sendo duas
delas, a G. herbaceum e a G. arboreum, originárias do Velho Mundo, enquanto as
duas outras, G. hirsutum e G. barbadense, do Novo Mundo (Neves, 1965).
Assume-se que a G. hirsutum foi primeiramente domesticada por povos pré-
Colombianos da península de Yucatan. A raça selvagem de G. hirsutum é
“yucatanense”, da qual surgiu a raça “punctatum”. Estas foram domesticadas e
dispersaram para o resto da Mesoamérica, América do Sul e do Norte. Evidências
etno-botânicas sugerem que a raça “latifolium” surgiu deste germoplasma
(Brubaker et al., 1994). Os Centros Primários da diversidade do gênero
Gossypium são Centro Ocidental e Sul do México (18 espécies), Arábico e Norte
de África (14 espécies) e Austrália (17 espécies) (Brubaker et al., 1999). De
acordo com Brown et al. (1999), as espécies G. hirsutum e G. barbadense são
nativas do México onde foram originalmente domesticadas.
A distribuição dos componentes da tribo Gossypiae é mundial, estando os
gêneros e as espécies presentes nas regiões tropicais e subtropicais com um
padrão de distribuição geral que pode ser, em alguns casos, relacionado à
dispersão marítima (Penna, 2005). Neves (1965) reporta que a produção desta
fibra distribui-se desde o paralelo 47°N até o paralelo 30°S, limites muito mais
amplos do que os originais da cultura. O algodoeiro também é encontrado nas
regiões áridas e semi-áridas, nas quais a cultura é praticada em sistemas de
irrigação (Penna, 2005).
2.2. Evolução e genética
O algodoeiro é uma dicotiledônea com sistema reprodutivo intermediário
(preferencialmente autógama com freqüente alogamia), com as taxas de
polinização cruzada variando entre 5 a 35%, dependendo do local, e das
atividades de insetos polinizadores (Allard, 1960; Poehlman, 1987; Fuzatto,1999;
Abdalla et al., 2001). Esta cultura pertence à ordem Malvales, família Malvaceae e
gênero Gossypium. Este gênero inclui 45 espécies diplóides (2n=2x=26) e seis
alotetraplóides (2n=4x=52), entre selvagens e cultivadas (Brubaker et al., 1999).
5
Fryxell (1992) descreve na sua revisão um total de 50 espécies do gênero
Gossypium, das quais cinco são alotetraplóides, em função da sua proposta de
incorporação de G. lanceolatum à espécie G. Hirsutum. Contudo, não há pleno
acordo entre os especialistas quanto à classificação de espécies apresentada por
Fryxell devido, principalmente, à complexidade de sua variabilidade
(Fuzatto,1999).
Os algodoeiros em cultivo no mundo pertencem a quatro espécies
distintas deste gênero, duas espécies diplóides do Velho Mundo (G. arboreum L.
e G. herbaceum L.) ambas com genoma A (2n=2x=26), nativas da África e
Sudeste da Ásia e duas alotetraplóides do Novo Mundo (G. barbadense L. e G.
hirsutum L.) com genoma AD (2n=4x=52) das Américas (Endrizzi et al., 1985;
Pillay e Myers, 1999; Iqbal et al., 2001). As espécies diplóides envolvem os
genomas A, B, C, D, E, F, G e K e as alotetraplóides correspondem a dois grupos
sub-genômicos, com similaridades aos genomas A e D (Endrizzi et al., 1985;
Stewart, 1995).
Nas espécies alotetraplóides, o genoma D tem 13 cromossomos
pequenos e o genoma A tem 13 cromossomos moderadamente grandes no
complemento haplóide de 26. Os genomas A e D diferem na quantidade de
seqüências repetitivas de DNA (Geever et al.,1989). Estas diferenças permitem a
especificidade do genoma durante o processo meiótico de emparelhamento de
cromossomos (Mursal e Endrizzi, 1976).
Durante o processo evolutivo, as espécies diplóides com pequenos
cromossomos hibridizaram com uma segunda espécie diplóide com cromossomos
grandes. A duplicação espontânea criou espécies tetraplóides com 52
cromossomos (2n=4x=52) com dois grupos de genomas A e D (AD) (Simmonds,
1984; Munro, 1987).
A produção mundial do algodão é inteiramente proveniente de G.
barbadense e G. hirsutum. Esta última é a de maior importância, sendo
responsável por 90 a 95% da produção mundial. A espécie G. barbadense tem
importância na produção de fibras especiais de alta qualidade, destacando-se as
cultivares conhecidas como ”Pimas” no Hemisfério Norte e pouco mais de 5% da
produção mundial é devida a esta espécie (Iqbal et al., 2001; Altaf-Khan et al.,
2002; Penna, 2005). As plantas da espécie Gossypium hirsutum, conhecida no
Brasil como algodoeiro “herbáceo” ou “anual” e no Hemisfério Norte, como
6
algodoeiro “upland”, apresentam porte sub-arbustivo e não são verdadeiras
anuais, pois, havendo condições favoráveis após o período de produção,
continuam vegetando, podendo permanecer por dois ou três anos (Penna, 2005).
2.3. Cultura de algodão (Gossypium hirsutum L.)
2.3.1. Importância sócio-econômica
A planta do algodão (G. hirsutum) produz a mais importante fibra têxtil do
mundo, sendo que 47% dos têxteis do mundo contêm algodão. Ela representa
cerca de 40% de todas as fibras produzidas no mundo (Instituto de Economia
Agrícola, 2009; Ozyigit, 2009). O algodão é, também, uma cultura de
aproveitamento mais completo e que oferece os mais variados produtos de
utilidade. Além da fibra, seu principal produto, o algodoeiro produz diversos
subprodutos, que apresentam também grande importância econômica,
destacando-se o línter (6%), o óleo bruto (15%), o bagaço, que é quase a metade
da semente (26%) do total do peso bruto (Embrapa, 2008). Quanto ao comércio,
os Estados Unidos da América são os líderes fornecedores no mercado mundial,
respondendo por 24% das exportações mundiais. Destacam-se, também,
Uzbequistão, Austrália e países africanos (ex-colônias francesas), responsáveis
por 40% do total exportado (Instituto de Economia Agrícola, 2009).
Apesar de ser o maior produtor, a China não participa das exportações,
uma vez que quase toda a sua produção é consumida internamente. Os outros
países maiores produtores de algodão são Índia, Estados Unidos da América,
Paquistão, Brasil, Uzbequistão e Turquia (Instituto de Economia Agrícola, 2009;
Ozyigit e Gozukirmizi, 2009).
Em Moçambique, o algodoeiro é uma cultura de grande importância
econômica e social sendo a principal cultura de rendimento depois do tabaco,
representando 27% de exportações de produtos agrícolas nos últimos dez anos
(Instituto Nacional de Estatística, 2009). Como cultura industrial, o algodoeiro tem
na sua cadeia produtiva diversos setores que empregam e/ou fornecem ocupação
desde o campo até a indústria de descaroçamento.
7
2.3.2. História e problemas da cultura do algodoeiro em Moçambique
A cultura de algodoeiro foi introduzida em Moçambique no século XVI,
sem grande crescimento pela carência de investimentos. Em resposta à crise
econômica vivida no início da década de 30, do século XX, a sua produção
industrializou-se com início de investimentos do Governo Colonial, subseqüente à
publicação do Diploma de Trabalho Forçado para o Algodão. Tal publicação, que
durou três décadas, dizia que cada família rural tinha por obrigação fazer pelo
menos meio hectare desta cultura (Mahalambe, 2003).
O interesse manifestado em Moçambique pelas cultivares exógenas de
algodão, espécie Gossypium hirsutum, tipo herbáceo ou “upland”, vem de longa
data. Segundo Melo e Carvalho (1969), as primeiras importações de cultivares
melhoradas de algodão foram feitas pelo Centro de Investigação Cientifica
Algodoeira (CICA) em 1946, com a introdução de cultivares de origem americana.
As atividades de melhoramento genético do algodoeiro (Gossypium
hirsutum L.), do tipo “upland”, africano, realizadas em Moçambique de 1966 a
1975, objetivavam recuperar as cultivares em exploração que se encontravam
degeneradas, procurando-se beneficiar vários caracteres agronômicos,
especialmente a resistência à cigarrinha (Empoasca facialis) e à bacteriose,
causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, e melhorar várias
características tecnológicas da fibra (Carvalho, 1989).
Como resultado deste trabalho, foram selecionadas três cultivares (A 637-
24, A 637-33 e REMU 40) as quais foram lançadas para o cultivo em 1974, sendo
a primeira recomendada para a agricultura familiar e as outras para a agricultura
mais evoluída (Carvalho, 1989).
Desde a independência até a assinatura dos Acordos Gerais da Paz
(1975 a 1992), período em que a eficácia da pesquisa agrária declinou pela
instabilidade política e pela guerra civil, as cultivares predominantemente usadas
eram Remu 40 e A 637-24. Em 1994, foi criado o Centro de Investigação e
Multiplicação de Sementes de Algodão de Namialo (CIMSAN), com a finalidade
de reativar os trabalhos de pesquisa realizadas pelo então Centro de Investigação
Científica de Algodão (CICA), coordenando toda a pesquisa científica da cultura,
que consiste em: melhoramento, fitotecnia e proteção de plantas, com todos estes
setores trabalhando em conjunto. No melhoramento e na produção do algodão, a
8
avaliação da produtividade é efetuada a partir de dois caracteres: produtividade
de algodão em caroço e de pluma (Kg há-1) e rendimento da fibra (%). Em
Moçambique, a produção de algodão caroço é mais importante, uma vez que o
produtor efetua a comercialização geralmente em caroço.
A produção de algodão em Moçambique encontra-se mais concentrada
nas regiões agroecológicas 6, 7 e 8, com quase cerca de metade da produção na
Região 7. Segundo Rohrbach et al. (2001), tais regiões, em sua maior parte,
representam a Região Norte do país.
As empresas algodoeiras fomentadoras é que têm a responsabilidade de
fornecer as sementes dentro das suas concessões. Eles adquirem sementes
básicas (local ou importada), multiplicam e distribuem gratuitamente aos seus
produtores de algodão. Contudo, maior parte da semente utilizada é proveniente
da lavoura anterior. A cultura é majoritariamente praticada em sequeiro e
inteiramente dependente das chuvas. A comercialização pelo setor familiar,
responsável pela maior parte da produção total, acontece geralmente em caroço e
a fibra é normalmente comercializada pelas empresas algodoeiras fomentadoras
para exportação.
Em Moçambique são apontados como principais fatores limitantes da
produção: o manejo da cultura, condições edafo-climáticas desfavoráveis (baixa
fertilidade dos solos e irregularidade da distribuição das chuvas), incidência de
pragas (cigarrinha “Empoasca fascialis”, pulgões “Aphis gossypii” e lagarta
americana ”Helicoverpa armigera”), uso de cultivares não adaptadas às condições
do ambiente, cultivos sucessivos com o algodoeiro sem uso de fertilizantes, e a
existência de solos com elevados índices de acidez (Rohrbach et al., 2001; UEM,
2007).
Isaacman (1996) salienta que os solos ferralíticos encontrados ao Norte
de Moçambique são duros, pesados e propensos ao alagamento, em função do
seu elevado conteúdo de argila que, aliado aos sucessivos ciclos de cultivo do
algodoeiro ao longo de muitos anos, constituem-se em ambientes desfavoráveis
ao desenvolvimento das plantas do algodoeiro.
2.4. Interação genótipo x ambiente
Genótipo refere-se ao conjunto de alelos que um indivíduo possui, os
quais são importantes para determinar a expressão dos caracteres pesquisados.
9
O termo ambiente tem um significado amplo, abrangendo condições em
que as plantas se desenvolvem, incluindo local, anos, incidência de pragas,
práticas de manejo, ou uma combinação desses fatores. Isto é, representa todos
os fatores não genéticos que influenciam o crescimento e desenvolvimento de um
indivíduo. A combinação entre locais e anos forma os ambientes e, na realidade,
sintetizam um conjunto enorme de variáveis, que interagem mutuamente influindo
no desempenho dos genótipos, cujos fenótipos tornam-se indicadores da
qualidade em cada ambiente (Lukonge, 2005).
As culturas são normalmente implantadas em uma grande faixa
ambiental. Todavia, pode ocorrer que diferentes populações de uma mesma
espécie venham a ter diferentes médias fenotípicas. Para saber se essas
diferenças se devem a fatores genéticos, ambientais, ou a uma combinação de
ambas, as populações devem ser cultivadas primeiramente em um mesmo
ambiente. Se as diferenças permanecerem no mesmo ambiente, conclui-se que
as populações são geneticamente diferentes e se as diferenças fenotípicas
desaparecerem em um ambiente comum comprova-se que houve influência do
meio ambiente. Também, pode acontecer que um genótipo comporte-se bem em
um ambiente e mal em outro, indicando a presença de interações específicas que
ocorrem entre genótipos e ambientes (Montalván e Montaño-Velasco, 1999).
Como as condições de ambiente no campo são bastante flutuantes, deve-
se ter muita cautela no momento da indicação de cultivares, quer seja para um
espectro amplo ou restrito de ambientes, sempre devendo ser estimada a
significância, a natureza e a magnitude da interação genótipo por ambiente
(Borém, 1997).
De acordo com Montalván e Montaño-Velasco (1999), a interação
genótipo x ambiente refere-se ao comportamento diferenciado de genótipos
quando cultivados em vários ambientes. Isto é, as respostas dos genótipos são
diferentes às alterações que ocorrem nos ambientes. Esta interação não só
interfere na recomendação de cultivares, que fica restrita a um ambiente
específico, como também dificulta o trabalho dos melhoristas, exigindo que o
melhoramento seja conduzido nas condições em que o genótipo será utilizado.
Allard e Bradshaw (1964) definiram a resposta relativa dos genótipos em
relação à variação dos ambientes em previsível e imprevisível. A previsível inclui
todos os fatores permanentes do ambiente, tais como as características gerais do
10
clima e do tipo do solo, as características do ambiente que variam de uma forma
sistemática, como o fotoperíodo, e os aspectos do ambiente que estão sob
controle do homem, como a época e a densidade de semeadura e outras práticas
culturais. A imprevisível inclui as flutuações aleatórias do ambiente que não estão
sob controle humano, ou seja, aquelas que variam, como precipitação pluvial,
temperatura, umidade relativa do ar, incidência de pragas e doenças e outros.
Um dos objetivos da maioria dos programas de melhoramento genético é
estimar quanto da variação fenotípica se deve à interação genótipo por ambiente.
Por meio desta estimativa, podem-se direcionar trabalhos visando a atenuar os
efeitos da interação ou até mesmo utilizá-la na obtenção de cultivares para
condições específicas (Ramalho et al., 2004). Vencovsky e Barriga (1992)
salientam que não basta apenas detectar a presença ou a ausência da interação
genótipo x ambiente, mas deve-se também considerar a sua natureza.
Existem dois tipos de interação genótipos x ambientes: uma denominada
simples ou quantitativa, que ocorre quando o comportamento das cultivares nos
ambientes não for semelhante e outra chamada complexa ou qualitativa, quando
a ordem de mérito das cultivares não é a mesma nos ambientes. Quando a
interação é de natureza simples, um genótipo mantém sua posição relativa apesar
da presença da interação. Entretanto, no caso da interação ser
predominantemente complexa, tal relação deixa de se verificar, observando-se
uma inversão de comportamento de um ambiente para outro, de modo que estes
apresentam diferentes respostas a variações ambientais, causando alteração na
sua classificação, considerando os diversos ambientes (Robertson, 1959;
Montalván e Montaño-Velasco, 1999). A interação de natureza complexa é a que
complica o trabalho do melhorista, impedindo que a recomendação de cultivares
possa ser feita de maneira generalizada.
Na análise da interação genótipos x ambientes, diferentes genótipos
devem ser avaliados em dois ou mais ambientes contrastantes, procurando,
também, definir se os seus respectivos efeitos são fixos ou aleatórios,
dependendo da abrangência das futuras conclusões sobre os resultados. O efeito
é considerado fixo quando ele não pode ser generalizado, gerando informações
válidas somente para os materiais envolvidos no estudo. O efeito é aleatório toda
vez que os tratamentos representarem uma amostra de uma população em que a
informação obtida pode ser estendida para toda essa população (Ramalho et al.,
11
1993). Assim, se os genótipos forem escolhidos e o pesquisador se interessar
apenas por estes determinados genótipos o seu efeito será tratado como fixo e se
os ambientes se constituírem amostras de diferentes regiões de um local de
estudo com a finalidade de generalizar as conclusões para todo local, então os
ambientes serão considerados de efeitos aleatórios.
Antes de se estudar a interação genótipos x ambientes, é fundamental
que se faça a análise de variância em cada ambiente, para que se possa avaliar a
existência de variabilidade genética entre as cultivares estudadas, a precisão
relativa de cada experimento e a homogeneidade das variâncias residuais (Cruz e
Regazzi, 2001) e fazer a análise conjunta apenas dos ambientes cujas variâncias
residuais sejam homogêneas (Cruz et al., 2004).
2.5. Estabilidade e adaptabilidade fenotípicas
Estimada a interação genótipo x ambiente (G x A), que constitui um dos
maiores problemas dos programas de melhoramento de qualquer espécie, seja na
fase de seleção ou na recomendação das cultivares, é possível adotar medidas
para atenuar o seu efeito (Ramalho et al., 2004; Cruz e Carneiro, 2006).
Vencovsky (1978) e Ramalho et al. (1993) recomendam como meios para
atenuar o efeito da interação G x A: a identificação de cultivares específicas para
cada ambiente, o zoneamento ecológico e a identificação de cultivares com maior
estabilidade fenotípica. A primeira é uma solução considerada altamente
dispendiosa e praticamente inexecutável. Neste caso, as cultivares/linhagens são
avaliadas em vários ambientes e, por meio da análise dos dados, são
identificadas as cultivares para cada ambiente específico. O ambiente pode ser
muito restrito a quaisquer variações imprevistas nessas condições, fazendo com
que as cultivares não mais se mostrem adaptadas.
A segunda alternativa, que consiste em agrupar ambientes
ecologicamente semelhantes, os quais são agrupados em sub-regiões dentro das
quais a interação não seja significativa, só é possível com base em diferenças
macroambientais, tornando o zoneamento vulnerável às variações imprevisíveis
que possam ocorrer no ambiente.
A identificação de cultivares com maior estabilidade fenotípica, ou
segundo Cruz e Carneiro (2006), o emprego de cultivares com ampla
12
adaptabilidade e boa estabilidade, é a alternativa que tem sido recomendada,
uma vez que pode ser aplicada nas mais variadas situações. Esta requer estudos
sobre a “performance” genotípica com base nos parâmetros de adaptabilidade e
estabilidade, pelos quais se tornam possíveis a identificação de cultivares de
comportamento previsível e que sejam responsivas às variações ambientais, em
condições específicas ou amplas. Estudos de adaptabilidade e de estabilidade
fornecem informações pormenorizadas sobre o comportamento de cada genótipo
frente às variações ambientais, o que não é possível obter a partir de interação
genótipos por ambiente, apesar de este ser importante para direcionar o
melhorista (Cruz e Regazzi, 1994).
Problemas na conceituação dos termos ‘adaptabilidade e estabilidade’
têm sido freqüentes, em função das variadas definições por autores diferentes
(Mariotti et al.,1976). No entanto, estes sugerem que a adaptabilidade seria a
capacidade de os genótipos responderem vantajosamente à melhoria do
ambiente, enquanto a estabilidade refere-se à capacidade de os genótipos
apresentarem comportamento altamente previsível em função das variações
ambientais. Segundo Verma et al. (1978), a adaptabilidade é a capacidade de os
genótipos apresentarem produtividades elevadas constantes em ambientes
desfavoráveis, mas com habilidade de responder a melhoria das condições
ambientais. De acordo com Cruz e Carneiro (2006), alguns autores consideram
esta definição a mais apropriada e para caracteres como produtividade estes
conceitos são os mais atuais.
Segundo Montalván e Montaño-Velasco (1999), existem três conceitos
básicos de estabilidade, quais sejam: a estabilidade estática, a estabilidade
agronômica e a estabilidade ligada à previsibilidade. O primeiro conceito refere-se
a uma constância de desempenho dos genótipos nos ambientes. Desse modo, o
genótipo mais estável do ponto de vista estático é aquele que tem menor variação
média em todos os ambientes considerados. Isso é avaliado pelo cálculo da
variância de desempenho de cada um dos genótipos nos ambientes testados. A
cultivar ideal será aquela com variância zero. Este tipo de estabilidade, na prática,
não é de interesse porque, quando existe, geralmente está relacionada a
genótipos de pobre desempenho que não reagem na presença de melhores
ambientes. Entretanto, a estabilidade estática tem importância quando ligada a
caracteres de resistência a doenças e pragas.
13
O segundo conceito refere-se à capacidade de resposta ao potencial
produtivo dos ambientes. Um genótipo com estabilidade agronômica mostra
interação mínima com o ambiente e acompanha o desempenho médio de todos
os genótipos em cada um dos ambientes. A identificação de cultivares com este
tipo de estabilidade permite selecionar genótipos com potencial para manter-se
entre as melhores em qualquer um dos ambientes estudados (Cruz e Carneiro,
2006).
A estabilidade ligada à previsibilidade leva em conta também o potencial
responsivo de genótipos à melhoria de ambientes com o adicional de considerar a
confiabilidade dessa resposta. Assim, o genótipo que possua resposta positiva
perfeitamente linear, sem nenhum desvio da reta de regressão e média de
produtividade vantajosa, é considerado ideal (Cruz e Carneiro, 2006).
De acordo com Cruz e Carneiro (2006), recomenda-se ainda utilizar o
termo geral “performance” genotípica para designar o desempenho, o
comportamento e as flutuações de um genótipo quando desenvolvido em vários
ambientes. Utiliza-se o termo “desempenho” quando relacionado a caracteres
como produtividades de grão e “comportamento” quando se refere a caracteres
relativos à resistência a doenças.
Diversos tipos de análises estatísticas são atualmente utilizados para
estimar a adaptabilidade e a estabilidade de diferentes genótipos, dentre elas
estão disponíveis diversas metodologias, conforme aos princípios estatísticos
envolvidos: metodologias baseadas na análise de variância, tais como a
Tradicional e as propostas por Plaisted e Peterson (1959), Wricke (1965) e
Annicchiarico (1992); baseadas em regressão linear, como as de Finlay e
Wilkinson (1963), Eberhart e Russel (1966) e Tai (1971); baseadas em regressão
linear bissegmentada, como a de Verma et al. (1978), Cruz et al. (1989) e Toler e
Burrows (1998); e as metodologias baseadas em análise não paramétrica,
proposta por Lin e Binns (1988), Huehn (1990). Algumas metodologias
proporcionam informações complementares, permitindo melhor conhecimento,
tanto das cultivares avaliadas quanto dos ambientes estudados. Enquanto
algumas análises são relativamente simples outras são mais sofisticadas e
complexas, mas todas fundamentadas na existência de interações. Dentre os
vários métodos de análise de estabilidade, aqueles que fazem o uso da
regressão, são os mais aceitáveis. Contudo, o método adotado pelo melhorista
14
deve ser simples e fornecer resultados de fácil interpretação, dependendo dos
dados experimentais, principalmente os relacionados com o número de ambientes
disponíveis, da precisão requerida e do tipo de informação desejado (Borém e
Miranda, 2007).
2.5.1. Metodologia proposta por Annicchiarico (1992)
A metodologia proposta por Annicchiarico (1992) vem sendo muito
utilizada pelos melhoristas de plantas na análise da estabilidade fenotípica, pois a
mesma apresenta uma relativa facilidade de aplicação e de interpretação dos
resultados gerados. Esta metodologia é baseada em análise de variância e
considera a estimação de um índice de confiança (Wi) que representa a chance
de uma cultivar i apresentar performance fenotípica superior à média geral do
conjunto genotípico que está sendo avaliado (Nunes et al., 1999). Este índice de
confiança pode ser estimado pela seguinte expressão:
( ) iii SZYW α−−= 1.
Em que:
iW : índice de confiança da cultivar i (%);
iY : média geral da cultivar i;
( )α−1Z : percentil (1-α) da função de distribuição normal acumulada;
iS : desvio-padrão dos valores percentuais;
α: nível de significância prefixado (para este estudo foi considerado α
igual a 0,25).
Conforme Annicchiarico (1992), quanto maior a estimativa de Wi, mais
estável é considerada a respectiva cultivar, sendo preferidas as cultivares que
apresentem estimativa superior a 100%. Dessa forma, pela proposta de
Annicchiarico (1992), as cultivares que apresentarem valor de Wi superior a 100%
não deverão apresentar médias fenotípicas inferiores à média geral.
2.5.2. Metodologia proposta por Toler e Burrows (1998)
A metodologia proposta por Toler e Burrows (1998) considera o uso de
regressão não-linear na estimação do índice ambiental e foi desenvolvida a partir
15
de uma união de conceitos relacionados aos modelos propostos por Digby (1979)
e por Cruz et al. (1989). O modelo de Digby é um modelo uni-segmentado que
considera a análise de regressão não linear, mas é incapaz de avaliar o padrão
de resposta dos genótipos em ambientes favoráveis e desfavoráveis,
simultaneamente. Por outro lado, a metodologia de Cruz et al. (1989) permite esta
avaliação de duplo padrão de resposta dos genótipos por se tratar de uma
metodologia de regressão linear bi-segmentada. Entretanto, também existe a
dependência entre o índice ambiental e as médias do conjunto genotípico, tal
como na análise de regressão linear simples (Eberhart e Russel, 1966). Na
metodologia de Toler e Burrows (1998), a estimação dos parâmetros é feita por
um processo interativo de quadrados mínimos (não-linear) de acordo com o
método de Gauss-Newton modificado (Gallant, 1987). Dessa forma, esta
metodologia prevê que os parâmetros que refletem a qualidade ambiental não
apresentam relação de dependência com as médias fenotípicas do conjunto
genotípico, tal como é verificado nas metodologias baseadas em regressão linear.
Além disso, esta metodologia permite a escolha do modelo que melhor
explique a “performance” fenotípica das cultivares, o qual pode ser uni ou bi-
segmentado. A rejeição da hipótese H( i1β = i2β ) implica na escolha do modelo bi-
segmentado, enquanto que o aceite desta hipótese implica na escolha do modelo
uni-segmentado.
O modelo uni-segmentado é expresso por:
ijijjiiijY εδµβα +++=
Em que:
ijY : “performance” média da i-ésima cultivar no j-ésimo ambiente; sendo i
= 1,2,...,I e j = 1,2,...,J;
iα : “performance” média da cultivar i;
iβ : coeficiente de sensibilidade da resposta fenotípica da cultivar i ao
ambiente;
iµ : efeito ambiental do j-ésimo ambiente;
ijδ : desvio de regressão para a i-ésima cultivar no j-ésimo ambiente;
ijε : erro experimental médio (resíduo) da observação Yij;
16
Por sua vez, o modelo bi-segmentado é expresso por:
ijijjijijiij ZZY εδµββα ++−++= ])1([ 21
Em que:
ijY : “performance” média da cultivar i no ambiente j;
iα : parâmetro que reflete a “performance” da cultivar i no intercepto com
jµ = 0;
i1β e i2β : parâmetros que refletem a sensibilidade da resposta fenotípica
da cultivar i nos ambientes desfavoráveis e favoráveis, respectivamente;
jµ : parâmetro que reflete a qualidade do ambiente j;
ijδ : desvio de regressão para a i-ésima cultivar no j-ésimo ambiente;
ijε : erro experimental médio (resíduo);
Zj : variável binária que assume valor 0 quando jµ > 0 e 1 quando jµ ≤ 0.
As estimativas de i1β , i2β e jµ com g genótipos e a ambientes estão
sujeitas às restrições:
gg
ii
g
ii ==∑∑
=
∧
=
∧
12
11 ββ e 0
1=∑
=
∧a
jjµ
Toler e Burrows (1998) também propuseram a classificação das cultivares
em cinco diferentes grupos, de acordo com o seu padrão de resposta (Quadro 1).
Quadro 1 - Critério de classificação dos grupos de cultivares pelo padrão de resposta fenotípica, conforme classificação de Toler e Burrows (1998) Grupo Critério Significado prático
A Rejeita-se H( i1β = i2β ), com i1β < 1 < i2β
Resposta convexa (bi-segmentada) e duplamente desejável
B Aceita-se H( i1β = i2β ), aceita-se H( iβ > 1)
Resposta linear simples e adaptabilidade somente em ambientes de alta qualidade
C Aceita-se H( i1β = i2β = iβ = 1)
Resposta linear simples não desviando da resposta média; adaptabilidade ampla
D Aceita-se H( i1β = i2β ), aceita-se H( iβ < 1)
Resposta linear simples e adaptabilidade somente em ambientes de baixa qualidade
E Rejeita-se H( i1β = i2β ), com i1β > 1 > i2β
Resposta côncava (bi-segmentada) e duplamente indesejável
17
Um padrão de resposta convexa ou duplamente desejável caracteriza-se
quando o genótipo apresenta desempenho consistente nos ambientes
desfavoráveis (µ < 0) e é responsiva em condições favoráveis (µ > 0). Por outro
lado, uma resposta côncava ou duplamente indesejável caracteriza-se quando o
genótipo apresenta sensibilidade aos ambientes abaixo da média (desfavoráveis)
e é pouco responsiva às condições favoráveis (Figura 1).
Figura 1 - Padrões de resposta fenotípica bi-segmentada convexo e côncavo (A e E) e uni-segmentada (B, C e D) das cultivares em função da variação na qualidade ambiental (µ).
2.6. Diversidade genética
A avaliação da diversidade genética e do grau da associação entre ou
dentro das cultivares é o primeiro passo para o desenvolvimento de cultivares.
Nesta avaliação, a aplicação de tecnologias baseadas em DNA melhora a
precisão e eficiência na seleção de parentais nos programas de melhoramento
(Falconer e Mackay, 1996).
Segundo Neves (1965), a variabilidade encontrada no gênero Gossypium
é considerada enorme, principalmente devido ao grande número de espécies
existentes. Outra fonte de variação disponível aos melhoristas da cultura é a
diversidade intra-específica. Na espécie G. hirsutum, existem sete raças
geográficas: punctatum, marie-galante, palmeri, richmond, morrili, yucatanense e
latifolium. Esta última compreende as cultivares modernas do algodoeiro anual de
fibra média (Penna, 2005).
Apesar da variabilidade encontrada no gênero Gossypium ser
considerada enorme, vários estudos revelam que as cultivares comerciais do
algodoeiro herbáceo (Gossypium hirsutum L.) têm baixo nível de diversidade
genética, avaliada com base em izoenzimas (Wendel et al., 1992), RAPDs
(Tatineni et al., 1996; Lu e Myers, 2002), AFLPs (Pilley e Myers, 1999; Abdalla et
18
al., 2001; Iqbal et al., 2001) e marcadores microssatélites (Gutierrez et al., 2002;
Rungis, 2005).
Uma das razões deste declínio de diversidade é o uso freqüente de
poucos parentais, associado à reseleção dentro das cultivares e do germoplasma
elite no desenvolvimento de novas cultivares comerciais (Van-Esbroeck et al.,
1998). A outra hipótese da falta de diversidade é relacionada ao efeito
“bottleneck” (gargalo de garrafa) que ocorre quando se dá uma diminuição
drástica do tamanho de população, resultando em perda de arsenal genético o
que causa mudanças nas taxas de variabilidade (Tajima, 1989))..
Iqbal et al. (2001) confirmam a hipótese do efeito “bottleneck” que ocorreu
durante a importação de pequenas quantidades de semente do México para
Estados Unidos da América no século XIX. Este efeito foi agravado durante os
estágios de desenvolvimento de G. hirsutum L. raça latifolium por meio de
seleções para maturação precoce o que levou a uma limitada diversidade no
algodoeiro cultivado (Lewis, 1962).
2.7. Marcadores moleculares
Diversas técnicas de biologia molecular estão hoje disponíveis para
detecção de variabilidade genética de DNA. Estas técnicas permitem a obtenção
de um número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares, cobrindo todo o
genoma do organismo. Tais marcadores podem ser utilizados para as mais
diversas aplicações, tanto no estudo de genética como na prática de
melhoramentos de plantas.
A avaliação da divergência genética e do grau da associação entre ou
dentro das cultivares é muito importante num programa de melhoramento. As
tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar
pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente denominados marcadores
moleculares, que são sequências de DNA que diferenciam dois ou mais
indivíduos e são herdadas geneticamente.
Por meio do uso de marcadores moleculares, técnicas avançadas têm
sido empregadas, permitindo que os pesquisadores alcancem maior eficiência em
estudos de diversidade genética ao analisar a variação diretamente no genoma
(DNA), uma vez que estes não sofrem influências do ambiente e nem dependem
19
do desenvolvimento da planta, como é o caso de marcadores morfológicos
(Borém e Miranda, 2007).
Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados
em dois grupos, conforme a metodologia utilizada para identificá-los: hibridização
ou amplificação de DNA. Entre os identificados por hibridização estão os
marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e minissatélites
ou locos VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Já aqueles revelados por
amplificação incluem os marcadores do tipo: RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) ou ASA
(Amplified Specific Amplicon); microssatélite (ou SSR - Simple Sequence
Repeats”; AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism); SNPs (Single
nucleotide polymorphism); CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences);
SRAP (Sequence-related amplified polymorphism); RAMP (Randomly amplified
microsatellite polymorphism); TRAP (Target region amplification polymorphism).
Atributos como consistência e tempo para obtenção de resultados, nível de
polimorfismo obtido, custo e facilidade de uso são importantes para a
implementação de marcadores moleculares na rotina de um programa de
melhoramento. Para essas e outras características, o Quadro 2 ilustra a
comparação dos tipos de marcadores moleculares mais utilizados em estudos
genéticos e programas de melhoramento (Agarwal et al., 2008).
Quadro 2 - Comparação dos tipos de marcadores moleculares mais utilizados em estudos genéticos e programas de melhoramento
Tipos de marcadores moleculares
Tributos RFLP SCAR AFLP RAPD Microssatélites
Consistência Alta Média a Alta Média Baixa Baixa a Média
Abundância Alta Baixa Alta Alta Média
Custo ($) Alto Médio a Alto Médio Baixo Baixo a Médio
Facilidade de Implementação Difícil Média Média Fácil Média
Polimorfismo Médio Médio Médio Médio Médio Reproducibilidade Alta Alta Alta Baixa Média
Fonte: Agarwal et al, (2008).
20
O algodoeiro (G. hirsutum L.), uma das principais culturas produtora de
fibras do mundo, vem sendo bastante estudado com relação ao DNA, utilizando
marcadores moleculares, ferramenta muito valiosa nos programas de
melhoramento genético. Anteriormente os marcadores moleculares não eram
largamente usados no algodão devido a vários desafios e dificuldades
encontradas pelos cientistas na sua aplicação para o genoma do algodoeiro. O
primeiro problema enfrentado pelos pesquisadores foi o desenvolvimento de um
protocolo padrão de extração para a produção de alta qualidade de DNA
apropriada para análises moleculares. Uma vez que o tecido do algodoeiro tem
altos teores de polissacarídeos e compostos fenólicos que interagem com
proteínas e ácidos nucléicos, isso gera um problema na extração de DNA com
alta qualidade. O segundo desafio é o baixo nível de polimorfismo encontrado
dentro das cultivares do tipo “upland”. Contudo, todos estes desafios têm sido
ultrapassados e, assim, a pesquisa genômica do algodoeiro tem alcançado uma
notável dimensão (Preetha e Raveendren, 2008).
Métodos apropriados de extração de DNA de algodão foram propostos
por Paterson et al. (1993), Vroh et al. (1996), Saha et al. (1997) e Permingeat et
al. (1998). De acordo com Vidal et al. (2003), vários são os métodos de extração
utilizados na obtenção de DNA de algodão de alta qualidade e, entre aqueles que
melhores resultados geram na eficiência para a extração de DNA de algodão,
destacam-se os protocolos de Ferreira e Grattapaglia (1998) e Zhang e Stewart
(2000).
2.7.1. Marcadores moleculares do tipo RAPD
O uso de pequenos iniciadores, primers oligonucleotídicos, de dez bases,
na reação em cadeia de DNA polimerase (PCR) como um método de geração de
marcadores moleculares polimórficos foram propostos, independentemente, por
Williams et al.,(1990) e Welsh e McClelland (1990).
Esta técnica, conhecida por RAPD (Random Amplified Polymorphic DN),
envolve a amplificação simultânea de vários loci anônimos no genoma utilizando
vários princípios de seqüência arbitrária. O polimorfismo de DNA amplificado ao
acaso (RAPD) ou AP-PCR (Arbitrarily Primed – PCR) surgiu com a idéia de se
utilizarem iniciadores mais curtos e de seqüência arbitrária para dirigir a reação de
21
amplificação, eliminando, assim, a necessidade de conhecimento prévio da
seqüência, no caso, do PCR. Na técnica de RAPD utiliza-se de um
oligonucleotídeo sintético como iniciador (primer), que produz um polimorfismo
detectado na presença ou ausência de bandas discretas de DNA, sendo,
portanto, de expressão dominante, não permitido a discriminação de indivíduos
heterozigóticos. Porém, esta técnica é bem simples e rápida, não requer grande
quantidade de DNA, não envolve o uso de sondas radioativas e demanda menos
mão-de-obra (Borém e Miranda, 2007). Além disso, constitui-se em uma das
poucas ferramentas disponíveis que efetivamente permite a análise genética
detalhada para um grande número de marcadores, sem a necessidade do
conhecimento prévio da seqüência a ser estudada (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Contudo, os marcadores RAPD são criticados por terem baixa reproducibilidade
(Jones et al., 1997). Muitos fatores podem influenciar o padrão de
reproducibilidade dentro ou entre laboratórios, incluindo a concentração de DNA,
padrão de reproducibilidade do termociclador usado, qualidade e concentração
dos iniciadores primers, a escolha do DNA polimerase e a precisão ao pipetar os
diversos componentes da PCR (Rafalski, 1997). Porém, o uso de marcadores
RAPD permite a identificação do parentesco entre cultivares e as inferências da
diversidade existente entre e dentro de cultivares (Gottardi et al., 2002).
2.7.2. Análise estatística dos dados de marcadores RAPD
2.7.2.1. Medidas de similaridade
As medidas de similaridade ou os coeficientes de similaridade são
utilizados em análises por meio de marcadores de DNA, como o RAPD ou AFLP,
que geram variáveis binárias, do tipo ausência (0) e presença (1). São utilizadas,
também, as medidas de dissimilaridade, que são obtidas pelo complemento
aritmético das medidas ou coeficientes de similaridade (Moreira et al., 1994). De
acordo com Cruz e Carneiro (2006), nessa situação, os coeficientes de
similaridade entre pares de genótipos podem ser obtidos levando-se em conta os
valores:
a: valor que quantifica o número de coincidência do tipo 1-1 para cada par
de genótipo.
22
b: valor que quantifica o número de discordância do tipo 1-0 para cada par
de genótipo.
c: valor que quantifica o número de discordância do tipo 0-1 para cada par
de genótipo.
d: valor que quantifica o número de coincidência do tipo 0-0 para cada par
de genótipo.
Com base nesses valores, podem ser obtidas as medidas de similaridade,
como:
• índice de similaridade de Jaccard, dado por: SJ = a/(a+b+c);
• coeficiente de coincidência simples, dado por: SSM = (a+d)/(a+b+c+d);
• entre outros.
Como se trata de medidas de similaridade, Cruz e Carneiro (2006)
recomendam, na análise de agrupamento, o uso de medidas de dissimilaridade.
Em função de haver vários coeficientes de similaridade propostos, a
escolha vai depender dos objetivos da pesquisa, do tipo de unidade amostral em
estudo e das propriedades inerentes de cada coeficiente. Na prática, tem sido o
mais rotineiro o de Jaccard (Jaccard, 1908), sendo indicado para comparar
populações dentro de uma espécie (Cattaneo, 2001; Cruz e Carneiro 2006).
2.7.2.2. Coeficiente de similaridade de Jaccard
O coeficiente de similaridade de Jaccard (Jaccard, 1908) caracteriza-se
por excluir a coincidência do tipo 0-0, ou seja, não admite a ausência, bem como
similaridade, pois necessariamente as concordâncias 0-0 não indicam
similaridade. As alterações no genoma, que condicionam a ausência de banda em
um genótipo, podem não ser as mesmas que ocasionam a ausência de banda em
outro (Amaral-Júnior e Thiebaut, 1999).
2.7.2.3. Análise de agrupamento
A análise de agrupamento consiste no uso de técnicas que permitam
reunir, por algum critério de classificação, unidades amostrais em grupos, de
maneira que as unidades sejam similares dentro do grupo e com heterogeneidade
entre os grupos. Por outro lado, as estimativas de similaridade quantificam e
23
informam sobre o grau de semelhança ou de diferença apresentado entre dois
quaisquer genótipos. No entanto, o número de estimativas obtidas é relativamente
grande (igual a n(n-1)/2, em que n é o número de acessos considerados no
estudo), o que torna impraticável o reconhecimento de grupos homogêneos pelo
simples exame visual daquelas estimativas. Assim, para realizar esta tarefa faz-se
uso de métodos de agrupamento ou de projeções de distâncias em gráficos
bidimensionais, em que cada coordenada é obtida a partir da medida de
dissimilaridade (Cruz e Carneiro, 2006).
Há diversos métodos de agrupamento, que se distinguem pelo tipo do
resultado a ser fornecido e pelas diferentes formas de definir a proximidade entre
um indivíduo em um grupo já formado ou entre dois grupos quaisquer. Em todos
os casos, não se conhece, a priori, o número de grupos a serem estabelecidos e
diferentes métodos proporcionam diferentes resultados. Dos métodos de
agrupamento, os mais utilizados são os hierárquicos ou de otimização. Nos
métodos hierárquicos, obtém-se um dendrograma que expressa graficamente a
relação entre as observações, enquanto nos métodos de otimização, como o de
Tocher, os grupos formados são mutuamente exclusivos, não permitindo a
visualização das relações entre grupos (Amaral-Júnior, 1994).
2.7.2.3.1. Método hierárquico UPGMA (Ligação média entre grupo)
Entre os métodos de agrupamento hierárquicos, o UPGMA (Unweighted
Pair Grouping Method with Aritimetical Means – média das distâncias) (Sneath e
Sokal, 1973) apresenta o melhor ajuste para as distâncias originais e estimadas.
É o mais adequado por apresentar dendrogramas com coeficiente de correlação
cofenético máximo, que é uma medida de concordância entre os valores originais
de dissimilaridade e aqueles apresentados no dendrograma (Arriel et al., 2006).
No melhoramento genético e em estudos biológicos, o método UPGMA é um dos
mais utilizados. Este método é indicado quando os possíveis grupos naturais são
de diferentes dimensões e é recomendado quando nos genótipos a serem
agrupados, há expectativa de formação de grupos próximos daqueles
considerados naturais. O método UPGMA proporciona um agrupamento dos
genótipos com muitas propriedades desejáveis, como a alta estabilidade
(Cattaneo, 2001).
24
Este método agrupa indivíduos de acordo com a similaridade, utilizando
médias aritméticas das medidas de dissimilaridade, que evita caracterizar a
dissimilaridade por valores extremos (máximo ou mínimo) entre os genótipos
considerados. Neste método, os indivíduos mais similares são agrupados
inicialmente e assim, sucessivamente, até os indivíduos ou grupos mais distantes
(Cruz e Carneiro, 2006).
Neste método, o dendrograma é estabelecido pelos genótipos com maior
similaridade e a distância entre um indivíduo k e um grupo formado pelos
indivíduos i e j é dada por:
d(ij)k = média{dik ; djk} = (dik + djk) / 2
Ou seja, d(ij)k é dada pela média do conjunto das distâncias dos pares dos
indivíduos (i e k) e (j e k).
A distância entre dois grupos é fornecida por:
d(ij)(kl) = média {dik ; dil ; djk ; djl} = (dik + dil + djk + djl) / 4
A distância entre dois grupos formados, respectivamente, pelos indivíduos
(i e j) e (k e l) é dada pela média do conjunto, cujos elementos são as distâncias
entre os pares de indivíduos (i e k), (i e l), (j e k) e (j e l).
Segundo Cruz e Carneiro (2006), a utilização conjunta de métodos de
agrupamento e de dispersão gráfica tem sido a alternativa mais ideal, sobretudo
quando se pretende visualizar as distâncias entre os indivíduos dentro e entre os
grupos formados.
2.7.2.3.1.1. Definição do número de grupos
A determinação do número de grupos para uma base de dados é uma
das tarefas mais difíceis no processamento de agrupamento. Não existe um
critério objetivo para determinar um ponto de corte no dendrograma, ou seja, para
determinar quantos grupos devem ser formados (Albuquerque et al., 2006). De
acordo com Barroso e Artes (2003), o número de grupos pode ser definido, a
priori, por algum conhecimento que se tenha sobre os dados, pela conveniência
do pesquisador, por simplicidade, ou ainda pode ser definido a posteriori com
base nos resultados da análise.
25
2.7.2.4. Análise de variância molecular (AMOVA)
Inferências seguras sobre a estruturação genética podem ser obtidas por
meio de marcadores moleculares, mas tal procedimento envolve diferentes
metodologias, dependendo do tipo de marcador, se dominante (Zucchi et al.,
2003) ou co-dominante (Zucchi et al., 2005). No caso de marcadores dominantes,
a quantificação da variabilidade só foi possível a partir da introdução da estatística
FST, sendo facilmente aplicável em diferentes situações por constituir uma
estrutura coerente e flexível para a análise de dados moleculares (Oliveira e Silva,
2008). Pela estatística FST, estimam-se os componentes de variâncias (entre e
dentro das populações) análogos às estatísticas F de Wright, por meio da análise
de variância molecular (AMOVA). De acordo com Oliveira e Silva (2008), a
variância genética total ( 2Tσ ) corresponde ao somatório da variância entre
procedências ( 2pσ ) e a variância entre acessos dentro de procedências ( 2
aσ ), com
os componentes de variância sendo testados a partir do coeficiente ØST (Excoffier
et al., 1992).
ØST = FST = 22
2
ap
p
σσ
σ
+
Em que:
ØST: valor da variabilidade genética entre as procedências; 2pσ : componente de variância devido às diferenças entre procedências;
2aσ : componente de variância devido às diferenças entre acessos dentro
de procedências.
A AMOVA pode ser empregada em qualquer grupo de indivíduos e classe
de marcadores (Mohammadi e Prasanna, 2003).
De acordo com Wright (1978), valores de variabilidade genética entre as
populações ou procedências de 0 a 0,05; 0,05 a 0,15; 0,15 a 0,25 e acima de
0,25 indicam divergências genéticas baixa, moderada, alta e muito alta,
respectivamente.
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Análise de adaptabilidade e de estabilidade produtivas
3.1.1. Localização dos experimentos
Os experimentos foram instalados no Município de Montepuez e na Vila
de Namialo, situados na Região Norte de Moçambique, nos anos agrícolas
2003/04, 2004/05 e 2005/06. Enquanto na Vila de Morrumbala, que se situa na
Região Central do país, os experiemento foi instalado no ano agrícola 2005/06
(Figura 2).
Figura 2 - Locais onde foram realizados os experimentos de avaliação das nove cultivares comerciais de algodão. Fonte: Adaptado da Architect Africa Network, 2008.
27
Todos os locais onde os estudos foram desenvolvidos estão situados
entre as Regiões Agroecológicas 6, 7 e 8. Na Região Agroecológica R7 (média
altitude), situa-se o município de Montepuez, a 555 m de altitude, 38º59’ de
Longitude Leste e 13º07’ de Latitude Sul, no distrito de Montepuez, Região Sul da
Província de Cabo Delgado. Namialo localiza-se entre as Regiões Agroecológicas
R7 (média altitude) e R8 (litoral costeira), a 157 m de altitude, 39º59’ de Longitude
Leste e 14º55’ de Latitude Sul, no distrito de Meconta, Centro Leste da Província
de Nampula. A Vila de Morrumbala, por sua vez, está localizada entre as Regiões
Agroecológicas R6 (semi-árida do Vale do Zambeze) e R7 (média altitude), a 392
m de altitude, 35º35’ de Longitude Leste e 17º19’ de Latitude Sul, no distrito de
Morrumbala, na Região do Baixo Zambeze, Província de Zambézia.
Os anos agrícolas (2003/04, 2004/05 e 2005/06) e os locais
representativos da produção de algodão de Moçambique (Namialo, Montepuez e
Morrumbala) foram combinados, totalizando sete ambientes distintos de avaliação
(Quadro 3).
Quadro 3 - Anos e locais de avaliação de produtividade de cultivares de algodão em diferentes Regiões Agroecológicas de maior concentração de produção de algodão em Moçambique
Ambiente Ano Local Regiões
Agroecológicas Província Região
I 2003/04 Montepuez R7 Cabo Delgado Norte
II 2003/04 Namialo R7 e R8 Nampula Norte
III 2004/05 Montepuez R7 Cabo Delgado Norte
IV 2004/05 Namialo R7 e R8 Nampula Norte
V 2005/06 Montepuez R7 Cabo Delgado Norte
VI 2005/06 Morrumbala R6 e R7 Zambézia Centro
VII 2005/06 Namialo R7 e R8 Nampula Norte
Fonte: Adaptado do INIA (2000).
28
3.1.2. Clima e solo
A Região de Namialo caracteriza-se por apresentar um clima do tipo Aw,
segundo a classificação de Koppen, sub-úmido seco. A precipitação pluvial média
anual oscila entre 800 a 1.000 mm e a temperatura média anual é de 26°C. A
classificação dos solos varia de arenosos (ferralic arenosols e haplic arenosols de
textura arenosa) a franco argilosos e gleyic arenosols, que ocorrem
alternadamente com solos arenosos hidromórficos (MAE, 2005a).
A Região de Montepuez é típica por apresentar clima do tipo Aw,
conforme classificação de Koppen, semi-árido e sub-úmido seco. A precipitação
média anual variando entre 800 e 1.200 mm, enquanto a temperatura média anual
varia entre 20 a 25°C. Nesta Região, predominam os solos hidromórficos, cuja
textura varia entre arenosos, arenosos sobre argila e solos argilosos
estratificados, de cor escura do tipo mollic, gleic e dystric gleysols, e haplic e luvic
phaeozems (MAE, 2005b).
Por sua vez, a Região de Morrumbala apresenta clima do tipo Aw,
conforme classificação de Koppen, tropical chuvoso de savana, com temperatura
e precipitação média anual de 23ºC e 1.000 mm, respectivamente. Predominam
os solos vermelhos, variando de franco arenosos a argilosos, bem como de
ferralíticos a litossolos de fundo (MAE, 2005c).
3.1.3. Características das regiões agro-ecológicas
Os elementos de dinâmica que devem ser considerados na análise do
sector agrário em Moçambique incluem a dispersão geográfica das zonas de
produção de acordo com as regiões agro-ecológicas definidas, o que constitui um
fator importante na definição de estratégias diferenciadas (Sitóe, 2005). Conforme
a classificação do INIA (2000), do ponto de vista do potencial agro-ecológico para
agricultura, Moçambique possui um total de dez (10) Regiões Agro-ecológicas
com diferentes aptidões, as quais, em geral, são definidas principalmente pela
precipitação e tipo de solos. As distintas zonas agro-ecológicas podem ser
agrupadas em três macro-zonas: Norte, Centro e Sul. Este agrupamento não
corresponde literalmente à divisão tradicional entre províncias do Norte, Centro e
Sul de Moçambique (Sitóe, 2005). Os experimentos foram instalados
29
considerando as Regiões Agro-ecológicas 6, 7 e 8, onde o algodão é
majoritariamente produzido:
Região agro-ecológica 6 (R6): representa a região semi-árida do Vale do
Zambeze e Sul de Tete. Esta região consiste duma vasta área seca desde o
distrito de Mopeia até a fronteira com a Zâmbia. A maior parte da região não
excede a 200 m de altitude e a precipitação média anual varia entre 500 e 800
mm, concentrada entre os meses de Novembro e Março. A zona mais baixa desta
região possui duas sub-zonas: uma com evapotranspiração entre 1.200 -1.400mm
e outra com um grande déficit de água durante a maior parte do ano e um alto
risco de perda de culturas. Dessa forma, o algodão é produzido na média do
Zambeze. Região agro-ecológica 7 (R7): região de média altitude das províncias da
Zambézia, Nampula, Tete, Niassa e Cabo Delgado. Esta é uma vasta zona,
incluindo terras com altitude entre 200 e 1.000 m no interior da Zambézia,
Nampula, Sul de Cabo Delgado e Niassa. A precipitação média anual e
evapotranspiração potencial variam entre 100 e 1.400 mm, sendo que algumas
zonas desta região possuem temperaturas mais altas (acima de 25ºC) e outras
moderadamente quentes (entre 20 e 25 ºC). A textura dos solos é variável. Em
quase toda a região, há um grande potencial para produção de algodão, a qual
tem sido praticada desde várias décadas. Região agro-ecológica 8 (R8): região litoral das províncias de Zambézia,
Nampula e Cabo Delgado. É uma região que consiste de uma faixa costeira de
largura variável desde Pebane na Zambézia até Quionga em Cabo Delgado. A
precipitação média anual varia entre 800 e 1200 mm e a evapotranspiração varia
entre 1.400 mm e 1.600 mm. Os solos em geral são arenosos, sendo pesados
nas zonas mais baixas e caracterizam-se por apresentar fertilidade muito baixa.
3.1.4. Tratamentos
Os tratamentos foram constituídos de nove cultivares comercias de
algodão africanas, sendo uma delas de origem local (Remu 40); três (ALBAR
SZ9314, ALBAR FQ902, ALBAR BC853), introduzidas do Zimbabwe; e cinco
(STAM 42, CA 222, CA 324, IRMA12-43, ISA 205), introduzidas de Camarões,
Costa do Marfim e Senegal (Quadro 4).
30
Quadro 4 - Lista de cultivares avaliadas, origem, ano da introdução, características de tolerância à cigarrinha (Empoasca fascialis) e o percentual da área cultivada em Moçambique
Cultivares
Origem Ano de
introdução
Tolerância à cigarrinha (Empoasca
fascialis)
Área cultivada (%)a
ALBAR SZ9314
Zimbabwe 1999 Alta 4
ALBAR FQ902 Zimbabwe 1999 Alta 0
ALBAR BC853 Zimbabwe 1999 Alta 0
STAM 42 Senegal 1999 Baixa 7
CA 222 Costa do Marfim 1994 Média 0
CA 324 Costa do Marfim 1994 Média 47
IRMA 12-43 Camarões 1994 Alta 0
ISA 205 Costa do Marfim 1994 Alta 4
REMU 40 Moçambique 1980 Alta 34 aÁrea cultivada no ano agrícola 2005/06. Fonte: Instituto de Algodão de Moçambique (2007).
3.1.5. Delineamento experimental
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos completos
casualizados, com quatro repetições, perfazendo um total de 36 parcelas
experimentais em cada experimento.
3.1.6. Unidades experimentais
Em todos os experimentos, cada unidade experimental foi constituída de
5 fileiras de plantas com 5,0 m de comprimento, espaçadas a 1,0 m entre fileiras e
0,20 m entre plantas na fileira, totalizando 25 plantas por fileira, correspondente a
uma densidade populacional de 50.000 plantas ha-1. A área útil da parcela
constituiu-se em três fileiras centrais, perfazendo uma área útil de 15 m²,
enquanto as duas fileiras laterais foram consideradas como bordaduras.
3.1.7. Instalação e condução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos em regime hídrico de sequeiro. A
semeadura foi efetuada durante o período de início das chuvas, geralmente na
31
primeira quinzena de dezembro, em covas, de forma manual (com auxílio de
enxada) em linhas, depositando-se 4 a 10 sementes por cova, a
aproximadamente 4 cm de profundidade. Aos 15 dias após a emergência das
plântulas foi feito o primeiro desbaste, deixando-se duas plantas por cova,
posteriormente, aos 21 dias após a emergência, foi realizado um segundo
desbaste deixando-se apenas uma planta por cova.
O controle de plantas invasoras foi mediante cinco a seis capinas
manuais, com auxílio de enxada, de forma a impedir que as plantas daninhas
exercessem concorrência com a cultura. Não foi feita nenhuma adubação de
base ou de cobertura, de forma a permitir que os experimentos simulassem as
condições similares àquelas predominantes nos campos dos produtores rurais
daquelas regiões.
No controle de pragas foram feitas duas pulverizações de inseticida
EndosSulfan (475 g L-1), seguida de 3 aplicações de Lambda-cihalothrin (50 g L-1),
com intervalo de duas semanas a partir da sexta semana após a emergência, nas
doses de 800 e 400 mL ha-1, respectivamente (INIA, 2003). A aplicação do
inseticida foi realizada com micro ulva do tipo ULV (Ultra Low Volume).
3.1.8. Características avaliadas
Na análise de produtividade, foram avaliadas as seguintes características:
a) Produtividade de algodão em caroço: valor médio, expresso em kg
ha-1, da massa total do algodão em caroço colhido de todas as plantas existentes
na área útil de cada parcela experimental.
b) Rendimento de fibra: valor médio referente à porcentagem (%) de
fibra extraída de algodão em caroço colhido em cada parcela. O descaroçamento
foi realizado com auxílio de máquina de serra de escova (Continental C21-10).
Esta característica foi avaliada apenas para o ano agrícola de 2005/06 em todos
locais (Namialo, Montepuez e Morrumbala).
3.1.9. Análises estatísticas
Antes da análise da variância (ANOVA), os erros experimentais foram
submetidos aos testes de normalidade e de homogeneidade de variâncias que
32
foram feitas no software SAS (2008), aplicando-se os testes de Shapiro-Wilk
(Shapiro e Wilk, 1965) e de Bartlett (Bartlett, 1937), respectivamente, a 5% de
probabilidade, para verificar se os mesmos obedeciam às pressuposições básicas
de normalidade e homogeneidade de variâncias (Pimentel Gomes, 1987;
Banzatto e Kronka, 2006). Após a satisfação das pressuposições, procedeu-se a
aplicação da ANOVA individual.
3.1.9.1. Análise de variância individual
Em cada combinação de local e ano (ambiente), foi feita a ANOVA
(Quadro 5), na qual se considerou efeitos fixo para cultivares e aleatório para os
blocos, utilizando o seguinte modelo estatístico (Cruz et al., 2004):
ijjiij BGY εµ +++=
Em que:
=ijY valor observado, relativo à i-ésima cultivar no j-ésimo bloco;
=µ média geral;
=iG efeito fixo da i-ésima cultivar (i = 1, 2,..., g);
=jB efeito aleatório do j-esimo bloco ( j = 1,2,...,b);
=ijε erro experimental.
Quadro 5 - Análise de variância individual, com as respectivas esperanças de quadrados médios
FV GL QM E (QM) F Blocos r – 1 QMB 22
Bgσσ +
Cultivares
g – 1
QMG )1/(1
22 −+ ∑=
gGri
iσ
QMG/ QMR
Resíduo (r – 1) (g – 1) QMR 2σ
Total rg – 1
Antes de se proceder a ANOVA conjunta, efetuou-se a avaliação da
homogeneidade das variâncias residuais dos ambientes, pelo teste de Fmáximo
de Hartley (Hartley, 1950), a 5% de probabilidade, a fim de garantir a viabilidade
da aplicação da análise de variância conjunta.
33
3.1.9.2. Análise de variância conjunta
Na ANOVA conjunta (Quadro 6), foi adotado o efeito de cultivares como
fixo e os efeitos ambientes e blocos como aleatórios, com base no seguinte
modelo estatístico (Cruz et al., 2004):
ijkjkijjiijk ABGAAGY εµ +++++= /
Em que:
=ijkY valor observado, relativo ao i-ésima cultivar no k-ésimo bloco dentro
do j-ésimo ambiente;
=µ média geral;
=iG efeito fixo da i-ésima cultivar (i = 1, 2,..., g);
=jA efeito aleatório do j-ésimo ambiente (j = 1, 2,..., a);
=ijGA efeito da interação da i-ésima cultivar com o j-ésimo ambiente;
=jkAB / efeito aleatório do k-ésimo bloco dentro do j-ésimo ambiente (k =
1, 2,..., r);
=ijkε erro experimental.
Quadro 6 - Análise de variância conjunta, com as respectivas esperanças de quadrados médios FV GL QM E (QM) F
Blocos/ambientes a (r – 1) QMB 22bgσσ +
Ambientes (A) a – 1 QMA 222ab grg σσσ ++ QMA/QMB
Cultivares (G) g – 1 QMG garr ga φσσ ++ 22 l QMG/QMGA
G x A (a – 1) (g – 1) QMGA 22gar σσ l+ QMGA/QMR
Resíduo a (r – 1) (g – 1) QMR 2σ
Total agr – 1
Após a constatação da significância para a interação genótipos/cultivares x
ambientes, foi feita análise de estabilidade e de adaptabilidade fenotípicas
mediante o emprego das metodologias propostas por Annicchiarico (1992) e por
Toler e Burrows (1998), considerando a produtividade de algodão em caroço, de
34
todos os ambientes. A comparação entre as médias foi realizada pelo teste de
Tukey (Tukey, 1971). As análises de variância e da estabilidade proposta por
Annicchiarico (1992) foram realizadas com auxílio do programa computacional
Genes (Cruz, 2006a; Cruz, 2006b), enquanto a aplicação da metodologia
proposta por Toler e Burrows (1998) foram realizadas mediante o uso do
Programa Estabilidade (Ferreira e Zambalde, 1997).
3.2. Análise da divergência genética molecular
3.2.1. Cultivares e linhagens analisadas
O estudo foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular, do Núcleo de
Pesquisa Aplicada à Agricultura (Nupagri), da Universidade Estadual de Maringá.
No total, foram analisadas 13 cultivares (nove africanas e quatro americanas) e
oito linhagens americanas de algodão (G. hirsutum L.), provenientes de
Moçambique. As cultivares e linhagens americanas foram recentemente
introduzidas no país pelo Centro de Investigação e Multiplicação de Sementes de
Algodão de Namialo (Quadro 7).
Quadro 7 - Lista das cultivares e linhagens usadas para análise da divergência genética Número de
ordem
Cultivar/linhagem
Grupo geográfico
Origem
1 ALBAR SZ9314 Africano Zimbabwe
2 ALBAR FQ902 Africano Zimbabwe
3 ALBAR BC853 Africano Zimbabwe
4 STAM 42 Africano Senegal
5 CA 222 Africano Costa do Marfim
6 CA 324 Africano Costa do Marfim
7 IRMA 12-43 Africano Camarões
8 ISA 205 Africano Costa do Marfim
9 REMU 40 Africano Moçambique
10 TAMCOT 22 Americano EUA
11 TAM 96WD-69s (L) Americano EUA
35
Quadro 7, Cont.
12 TAMCOT Pyramid Americano EUA
13 TAM 98D -102 (L) Americano EUA
14 TAM 96WD-18 (L) Americano EUA
15 TAM 94J-3 (L) Americano EUA
16 TAM 88G-104 (L) Americano EUA
17 TAMCOT Sphinx Americano EUA
18 TAM 98D-99ne (L) Americano EUA
19 TAM 94WE-37s (L) Americano EUA
20 TAM 94L-25 (L) Americano EUA
21 TAMCOT Luxor Americano EUA
EUA: Estados Unidos da América. (L) Linhagem. Números de ordem 10 a 21 são as quatro cultivares e oito linhagens introduzidas dos Estados Unidos da América no ano de 2006.
3.2.2. Extração e quantificação do DNA genômico
O processo de extração de DNA do algodão foi realizado segundo o
protocolo descrito por Zhang e Stewart (2000). Para tanto, as sementes de cada
cultivar e linhagem foram semeadas em bandejas, contendo areia lavada e
mantidas em casa de vegetação até o momento da coleta das folhas jovens. No
total, foram obtidas quatro plantas de cada cultivar e linhagem.
Cerca de 20 dias após a emergência, foi realizada a coleta do material
vegetal. Igual quantidade de tecidos foliares, jovens e frescos, de quatro plantas
de cada cultivar foi coletada e agrupada de forma a compor uma amostra de 300
mg. Após a coleta o tecido vegetal de cada amostra, o material foi imediatamente
colocado em tubos plásticos do tipo eppendorf com capacidade de 1,5 mL,
fechados e acondicionados em caixa de isopor, contendo nitrogênio líquido, e
imediatamente levados para o laboratório.
Em seguida, o material foi triturado, adicionando ao mesmo 600 µL de
tampão de extração pré-aquecido a 65°C [CTAB 2% (w/v); NaCl 1M; EDTA 0,02
M; Tris-HCl 0,1 M pH 8,0; PVP-40 2% (w/v); β-mercaptoetanol 10%].
Os tubos foram agitados em vórtex por 30 segundos e incubados a 65ºC
em banho-maria por 30 minutos, sendo homogeneizados a cada 5 minutos. Após
os 30 minutos, os tubos foram retirados e deixados esfriar em temperatura
36
ambiente, sendo a eles adicionados 600 µL da mistura de clorofórmio:álcool
isoamílico (24:1) e homogeneizados gentilmente por 5 minutos.
As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm em temperatura ambiente,
por 5 minutos, sendo o sobrenadante (fase aquosa) transferido para um novo
tubo. Depois foram adicionados em cada tubo 600 µL de isopropanol gelado
(-5ºC) e misturado lentamente por inversão dos tubos.
A seguir, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm à temperatura
ambiente por 15 minutos e, depois, descartado o sobrenadante, sendo no DNA
precipitado adicionados 300 µL de etanol 70% e as amostras centrifugadas a
12.000 rpm, em temperatura ambiente, por 15 minutos, descartando o
sobrenadante. Foram adicionados novamente 300 µL de etanol 95% gelado e as
amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm, em temperatura ambiente por 5
minutos, sendo o sobrenadante descartado.
O precipitado foi posto para secar por aproximadamente 1 hora em
temperatura ambiente e, depois, ressuspendido em 100 µL de H2O Milli-Q.
Após a extração, foi efetuada a quantificação do DNA em
espectrofotômetro Femto 700S, seguindo o seguinte procedimento: 20 µL de cada
amostra de DNA foi diluída em 1.980 µL de água Milli-Q estéril em cuvette de
quartzo de 2.000 µL e submetida à leitura da densidade óptica a 260 nm (DO260),
para avaliar a quantidade de DNA, e a 280 nm (DO280), para avaliar a
contaminação com proteínas ou fenóis. A concentração da amostra de DNA foi
estimada de acordo com a equação [DNA] (ng/µL) = DO260 x 5.000. O quociente
DO260 e DO280 das amostras de DNA pura foi aproximadamente igual 1,8. Um
valor inferior a 1,8 indica contaminação com proteína; valor superior a 2,0 indica
contaminação com fenol (Romano, 1998). Finalmente, as amostras de DNA foram
diluídas em água Milli-Q estéril de modo que as amostras de trabalho estivessem
a uma concentração padrão de 10 ng de DNA µl-1. As amostras foram então
armazenadas em freezer a -20oC até que se procedesse as reações de
amplificação de DNA.
3.2.3. Iniciadores (primers) RAPD utilizados
No estudo da divergência genética foram testados 46 primers decâmeros
arbitrários adquiridos da Operon Technologies, dos quais foram selecionados 24
37
por serem considerados os mais polimórficos e aqueles que apresentaram
bandas mais definidas (Quadro 8).
Quadro 8 - Primers decâmeros utilizados nas reações de amplificação de fragmentos de DNA usados como marcadores RAPD
Iniciador Sequência
de nucleotídeos Iniciador Sequência
de nucleotídeos Primer (5’ – 3’) Primer (5’ – 3’) OPA-11 CAA TCG CCG T OPF-16 GGA GTA CTG G OPA-13 CAGCACCCAC OPG-14 GGA TGA GAC C OPA-18 AGG TGA CCG T OPG-19 GTC AGG GCA A OPB-04 GGA CTG GAG T OPH-14 ACC AGG TTG G OPB-07 GGT GAC GCA G OPI-03 CAG AAG CCC A OPB-12 CCT TGA CGC A OPJ-04 CCG AAC ACG G
OPC-06
GAA CGG ACT C OPK-08 GAA CAC TGG G OPC-20 ACT TCG CCA C OPK-09 CCC TAC CGA C OPE-04 GTG ACA TGC C OPK-20 GTG TCG CGA G OPF-05 CCG AAT TCC C OPO-19 GGT GCA CGT T OPF-06 GGG AAT TCG G OPW-07 CTG GAC GTC A OPF-07 CCG ATA TCC C OPY-20 AGC CGT GGA A
3.2.4. Amplificação do DNA e Análises do DNA genômico
As reações de amplificação com os 24 primers RAPD foram preparadas
em um volume total de 25 µL por reação, as quais continham: 0,2 mM de cada
dNTP, 5 mM de MgCl2; 0,2 mM de primer, 20 mM de Tris-HCl pH 8,4; 50 mM de
KCl, uma unidade de taq DNA polimerase, 50 ng de DNA genômico e água ultra-
pura para completar o volume de 25 µL.
Os ciclos de amplificação foram constituídos por uma etapa inicial de
desnaturação a 94ºC por 5 minutos, seguidos de 45 ciclos de amplificação
composto por três etapas. Uma etapa de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, uma
etapa de ligação do primer ao DNA a 35ºC por 1 minuto e, por último, a terceira
etapa para a amplificação e incorporação dos nucleotídeos a 72ºC por 2 minutos.
Ao final, foi dado um período adicional de 5 minutos a 72°C para que as
extensões se completassem.
Concluída a amplificação, os fragmentos de DNA foram fracionados em
gel de agarose 1,2%, contendo brometo de etídio (0,02 µL mL-1) em tampão TAE
38
1X (TAE 50X: Tris base - 242 g; ácido acético glacial – 57,1 mL; EDTA 0,5 M pH
8,0 - 100 mL), sendo o mesmo utilizado como tampão de corrida.
Os fragmentos amplificados foram visualizados sob luz ultravioleta
utilizando, para tanto, o Fotossistema Spectroline, com as imagens sendo
capturadas em câmera digital Canon Power Shot A620.
Utilizou-se como padrão de tamanho de bandas o DNA ladder de 100pb
(Invitrogen), sendo a altura da banda encontrada determinada pelo programa
computacional GeneLine, versão 2.0. Somente as bandas nítidas foram
selecionadas para serem utilizadas nas análises estatísticas.
3.2.5. Análises estatísticas dos dados moleculares
3.2.5.1. Análise de agrupamento e quantificação da variabilidade genética entre e dentro dos grupos geográficos
Os fragmentos de DNA amplificados foram computados com a presença (1)
ou ausência de bandas (0). A análise foi realizada somente para as bandas
polimórficas. O agrupamento das cultivares e linhagens de algodão foi realizado
por meio do método hierárquico UPGMA (Unweighted Pair Grouping Method with
Aritimetical Means) (Sneath e Sokal, 1973), utilizando a matriz de dissimilaridade
correspondente ao complemento do coeficiente de Jaccard (Jaccard,1908).
A quantificação da variabilidade genética entre e dentro dos grupos
geográficos (nove cultivares comerciais africanas e doze cultivares e linhagens
americanas), verificada pela análise de variância molecular (AMOVA), foi
realizada pelo método de Excoffier et al. (1992), com base em 151 bandas
polimórficas. Considerou-se uma estrutura hierárquica desbalanceada, uma vez
que o número de acessos por grupo geográfico foi variável e cada grupo
geográfico (africano ou americano) considerado uma população (Oliveira e Silva,
2008).
A significância estatística das variâncias foi testada utilizando-se 1.000
permutações aleatórias. Para avaliar a diversidade dentro de cada grupo
geográfico foi feita a análise de projeção gráfica, utilizando espaço bidimensional,
obtida pela matriz de dissimilaridade de Jaccard. As análises estatísticas
aplicadas no presente estudo foram realizadas mediante o uso do programa
computacional GENES (Cruz, 2008).
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análise de variância individual
Uma vez satisfeitas às pressuposições básicas de normalidade e de
homogeneidade de variâncias dos erros (p > 0,05) pelos testes de Shapiro-Wilk
(Shapiro e Wilk, 1965) e de Bartlett (Bartlett, 1937), respectivamente, foi feita a
análise de variância (ANOVA) em cada ambiente. A ANOVA individual evidenciou
a presença de diferenças significativas (p < 0,05), na produtividade de algodão em
caroço, entre as cultivares avaliadas, em quase todos os ambientes, à exceção
dos ambientes correspondentes a Namialo, no ano agrícola de 2003/04, e
Montepuez, no ano agrícola de 2004/05 (Quadro 9).
Quadro 9 - Resumo da análise de variância individual da produtividade de algodão em caroço (kg ha-1) de nove cultivares avaliadas em três regiões de Moçambique, durante os anos agrícolas de 2003/04, 2004/05 e 2005/06
Ambientes QM
F(QMG/QMR) CV (%) Cultivares (G) Resíduo (R)
Montepuez (2003/04) 154.618,29 * 54.620,91 2,83 7,05 Namialo (2003/04) 46.374,19 50.028,77 0,93 26,37 Montepuez (2004/05) 57.097,67 93.822,50 0,61 19,97 Namialo (2004/05) 343.549,38 ** 88.611,11 3,88 22,26 Montepuez (2005/06) 393.550,86 ** 84.738,67 4,64 21,25 Morrumbala (2005/06) 443.745,80 * 145.201,11 3,06 25,07 Namialo (2005/06) 175.416,67 * 66.435,19 2,64 24,29
G.L. 8 24
Fmáx = 2,90 *Significativo a 5% pelo teste F. **Significativo a 1% pelo teste F.
Na avaliação da homogeneidade das variâncias residuais (Quadro 9),
entre os ambientes, pelo teste de Fmáximo de Hartley (Hartley,1950), constatou-
se que foi razoável supor que as variâncias residuais foram homogêneas (p >
0,05), garantindo a viabilidade da aplicação da análise de variância conjunta.
40
Uma boa precisão experimental foi também verificada (Quadro 9), visto os
coeficientes de variação para a produtividade de algodão em caroço se
apresentarem dentro dos limites toleráveis para a variável em análise (Santos et
al., 1998).
4.2. Análise de variância conjunta
A análise de variância conjunta permitiu verificar um efeito significativo da
interação cultivares x ambientes (G x A) na produtividade de algodão em caroço,
em nível de 1% de probabilidade (Quadro 10).
Quadro 10 - Resumo da análise de variância conjunta da produtividade de algodão em caroço (kg ha-1) de nove cultivares avaliadas em três regiões de Moçambique, durante os anos agrícolas de 2003/04, 2004/05 e 2005/06
FV GL QM F Blocos/Ambiente 21 414.554,74 Ambientes (A) 6 23.579.295,31 56,88**
Cultivares (G) 8 328.238,43 1,53 G x A 48 214.352,41 2,57**
Resíduo 168 83.351,18 Total 251 Média geral 1.569,63 CV (%) 18,39
4.067,36
29.111,38
7,16
** Significativo a 1% de probabilidade.
Os resultados mostram que o efeito da interação G x A foi de elevada
magnitude, o que propiciou uma alteração do padrão de resposta fenotípica das
cultivares frente à variação na qualidade ambiental (Quadros 10 e 11),
justificando, portanto, o estudo da estabilidade e da adaptabilidade (Cruz e
Carneiro, 2006).
Pode-se observar, também, que houve variação na qualidade ambiental
conforme apresentado no Quadro 11. Ramalho et al. (1993) enfatizam a
importância do uso de dois ou mais ambientes contrastantes em estudos dessa
natureza.
41
Quadro 11 - Desdobramento do efeito de cultivares na produtividade de algodão em caroço de nove cultivares de algodão avaliadas em três Regiões Agro-ecológicas de Moçambique durante os anos agrícolas 2003/04, 2004/05 e 2005/06
Produtividade (kg ha-1)
Ambientes
Cultivares A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Média
ALBAR SZ9314 3.270,00 a 820,17 a 1.524,44 a 1.333,33 ab 1.185,66 bc 1.675,00 abc 725,00 b 1.504,71 ab
ALBAR FQ902 3.519,17 a 837,83 a 1.582,22 a 1.583,33 a 918,17 c 1.308,33 bc 1.183,33 ab 1.561,57 ab
ALBAR BC853 3.053,33 ab 800,00 a 1.446,67 a 716,67 b 1.334,17 b 1.247,23 c 875,00 ab 1.353,29 b
STAM 42 3.048,83 ab 872,17 a 1.672,22 a 1.600,00 a 1.593,67 ab 1.716,67 abc 1.183,33 ab 1.669,57 a
CA 222 3.517,00 a 647,17 a 1.372,22 a 1.116,67 ab 1.542,17 ab 1.900,00 ab 1.100,00 ab 1.599,29 ab
CA 324 3.547,83 a 822,50 a 1.723,33 a 1.183,33 ab 1.074,83 bc 1.400,00 bc 941,67 ab 1.527,71 ab
IRMA 12-43 3.247,50 a 883,50 a 1.460,00 a 1.383,33 a 1.980,17 a 1.165,00 c 1.450,00 a 1.652,86 a
ISA 205 3.209,67 a 1.059,67 a 1.603,33 a 1.566,67 a 1.413,83 ab 2.077,78 a 1.100,00 ab 1.718,86 a
REMU 40 3.439,83 a 892,00 a 1.421,11 a 1.550,00 a 1.288,33 bc 1.188,89 c 991,67ab 1.538,86 a
Média 3.317,02 848,33 1.533,95 1.337,04 1.370,11 1.519,88 1.061,11 1.569,63
CV (%) 7,05 26,37 19,97 22,26 21,25 25,07 24,29 18,39
A1 = Montepuez (2003/004), A2 = Namialo (2003/004), A3 = Montepuez (2004/05), A4 = Namialo (2004/05), A5 = Montepuez (2005/06), A6 = Morrumbala (2005/06), A7 = Namialo (2005/06). Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
42
Ainda no Quadro 11, observa-se que cultivares melhores num ambiente
são piores noutros. Por exemploa cultivar ALBAR FQ902, que foi uma das
melhores no ambiente de Namialo, no período de 2004/05, foi a pior em
Montepuez, no ano agricola 2005/06. Enquanto a cultivar Remu 40, uma das
melhores em Namialo (2004/05), foi uma das piores em Morrumbala (2005/06).
Resultados semelhantes foram encontrados por Killi e Harem (2006), Mustafa e
Babiker (2007), Hoogerheide et al. (2007), ao estudarem o comportamento
produtivo de algumas cultivares de algodão na Turquia, Sudão e Brasil,
respectivamente.
4.3. Adaptabilidade e estabilidade de produtividade de algodão em caroço
Na análise da adaptabilidade mediante a proposta de Toler e Burrows
(1998), observa-se que todas as cultivares apresentaram comportamento uni-
segmentado, visto a hipótese de nulidade entre as estimativas de β1i e β2i (Ho: β1i
= β2i ou β1i - β2i = 0 ) ser aceita para todas elas. Dessa forma, detectou-se não
haver evidências estatísticas, em nível de 5% de probabilidade para afirmar que
as estimativas β1i e β2i foram diferentes (Quadros 1 e 12).
A cultivar CA 324, classificada no grupo B e que representa quase a
metade (47%) da produção nacional de algodão (Instituto de algodão de
Moçambique, 2007) caracterizou-se por ser mais responsiva em ambientes de
alta qualidade (estimativa de βi > 1,0), mostrando, portanto, adaptabilidade
específica (Quadro 12). Assim, a indicação da cultivar CA 324 deve se restringir
aos ambientes mais favoráveis, tais como aqueles constituídos por áreas de
maior fertilidade do solo, neutralidade de pH, com regime de chuvas que supra as
necessidades hídricas do algodoeiro e onde os produtores sejam detentores de
melhores condições tecnológicas. Caso contrario, a mesma poderá apresentar
médias de produtividade significativamente reduzidas, pois um genótipo que é
superior em ambientes muito específicos pode apresentar comportamento
medíocre em outros, caso as condições ambientais requeridas por ele não forem
prevalecentes. Cultivar que responde melhor à melhoria da qualidade ambiental
pode desapontar em ambientes desfavoráveis (Vencovsky e Barriga, 1992;
Caierão et al., 2006). As regiões algodoeiras de Moçambique são caracterizadas
pela baixa fertilidade e pelos elevados níveis de acidez dos solos (Universidade
43
Eduardo Mondlane, 2007). A falta de adubação, a elevada acidez, associado ao
problema de não se fazer rotações de culturas, tem levado a uma acentuada
degradação de solos em várias regiões, caracterizadas pela perda de fertilidade e
vulnerabilidade à erosão. Além disso, esse problema se agrava pela prática de
queima da soqueira como medida de controlo de pragas e doenças, o que leva a
fertilidade dos solos a um rápido esgotamento. Conforme Isaacman (1995), os
solos ferralíticos encontrados ao Norte de Moçambique são duros, pesados e
propensos ao alagamento, em função do seu elevado conteúdo de argila que,
aliado aos vários ciclos sucessivos de cultivo do algodoeiro, constituem-se em
ambientes desfavoráveis ao desenvolvimento das plantas do algodoeiro, limitando
significativamente a produtividade. Assim sendo, a cultivar CA 324 é pouco
promissora no país. Esta cultivar representa cerca de 50% do total de área de
cultivo de algodão no país (IAM, 2007). Assim, os baixos níveis de produtividade
de algodão em Moçambique podem ser resultantes da ampla utilização de CA
324 por pequenos agricultores de baixa renda, sem a aplicação de altas
tecnologias. O Relatório do Instituto de Algodão de Moçambique (2009) mostra
que os agricultores autônomos, aqueles que normalmente utilizam boas
tecnologias, conseguem obter uma produtividade de algodão em caroço, na
cultivar CA 324, duas a três vezes mais que a produtividade média nacional da
cultura. Enquanto isso, a produtividade obtida pelos pequenos produtores com
baixas tecnologias de produção encontra-se abaixo da média nacional e cerca de
quatro vezes menos que os produtores que utilizam tecnologias mais avançadas.
A cultivar STAM 42 apresentou adaptabilidade específica a ambientes de
baixa qualidade (Grupo D), visto ser a estimativa de βi inferior a 1 (Quadro 12),
não sendo muito exigente a melhoria da qualidade ambiental e tendo maior
potencial de resposta fenotípica em ambientes de baixa qualidade que as demais
cultivares avaliadas. Pelas características dos solos da maioria das regiões
algodoeiras de Moçambique, esta cultivar seria promissora. As demais cultivares
avaliadas enquadraram-se no grupo C (Quadro 12), fato indicativo de que estas
cultivares apresentaram resposta fenotípica satisfatória para maior parte de
ambientes, ou seja, mostraram adaptabilidade ampla (estimativa de βi = 1).
A Figura 3 mostra o padrão de resposta fenotípica de três cultivares de
algodão, representando os distintos grupos (B, C e D). Observa-se que a cultivar
CA324 (grupo B) respondeu melhor à melhoria da qualidade ambiental (µi > 0) e
44
sob condições adversas (µi < 0) mostrou baixa produtividade. Assim, para os
agricultores sem recursos tecnológicos, e/ou em regiões com problemas
edafoclimáticos esta cultivar não seria a mais adequada.
A Cultivar ISA 205, do grupo C, acompanhou a resposta média dos
ambientes, mostrando adaptabilidade geral. A cultivar STAM 42, enquadrada no
grupo D, partiu de uma produtividade razoável em ambientes de baixa qualidade
e foi pouco responsiva à melhoria da qualidade ambiental. Portanto, ela seria a
mais indicada para as regiões de baixa tecnologia, não respondendo
satisfatoriamente nas condições de alta tecnologia.
Figura 3 - Padrão de resposta das cultivares de algodão enquadradas nos grupos uni-segmentados (B, C e D).
No que se refere à metodologia de Annicchiaricco (1992), as cultivares ISA
205, STAM 42 e IRMA 12-43 apresentaram estimativas do índice de confiança Wi
superiores a 100%, evidenciando maior estabilidade fenotípica para produtividade
de algodão em caroço (Quadro 12). Ou seja, estas cultivares apresentaram-se
45
com 75% (Wi (75)) de probabilidade de, na pior das hipóteses, terem 8,49; 6,63 e
1,81% de produtividade, respectivamente, acima da média dos ambientes, sendo,
portanto, as mais previsíveis.
Quadro 12 - Estimativa dos parâmetros de estabilidade e adaptabilidade para produtividade de algodão em caroço de nove cultivares comerciais de algodão, mediante metodologias propostas por Annicchiarico (1992) e por Toler e Burrows ( 1998)
Cultivares Toler e Burrows Annicchiarico
iα̂ i2β̂ - i1β̂ i1β̂ i2β̂ iβ̂ Grupo R2 Wi (75) (%)a
ISA 205 1.718,86 a - 0,48 1,27 0,79 0,89 C 94,6 108,49 (1)
STAM 42 1.669,57 a - 0,50 1,22 0,72 0,83* D 96,7 106,63 (2)
IRMA 12-43 1.652,86 a 0,48 0,50 0,98 0,88 C 82,6 101,81 (3)
CA 222 1.599,29 ab - 0,36 1,41 1,05 1,12 C 95,5 94,80 (4)
Albar FQ902 1.561,57 ab 0,44 0,74 1,18 1,09 C 92,8 94,00 (6)
REMU 40 1.538,86 ab 0,49 0,67 1,16 1,05 C 95,3 94,32 (5)
CA 324 1.527,71 ab 0,12 1,05 1,17 1,15* B 97,4 91,69 (7)
Albar SZ9314 1.504,71 ab - 0,37 1,33 0,96 1,04 C 97,4 90,56 (8)
Albar BC853 1.353,29 b 0,18 0,82 1,00 0,96 C 93,6 81,02 (9)
* Significativo a 5% de probabilidade. Os valores dentro dos parênteses indicam o ranking de estabilidade em ordem decrescente. Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Segundo o Instituto de Algodão de Moçambique (2007), as cultivares ISA
205 e STAM 42 representam 4 e 7% de produção nacional de algodão,
respectivamente, não sendo a cultivar IRMA 12-43 praticamente mais cultivada.
4.4. Rendimento de fibra das cultivares analisadas
Levando-se em consideração a média por cultivar, para a característica
rendimento da fibra, observou-se que ela variou aproximadamente de 35 a 40%.
No geral, as cultivares apresentaram elevado rendimento de fibra (>37%) sem
diferenças estatisticamente significativas (p > 0.05). A exceção ocorreu com a
cultivar Remu 40, que apresentou um rendimento de fibra baixo e estatisticamente
diferente de todas as cultivares, em nível de 5% de probabilidade.
46
4.5. Divergência genética molecular entre cultivares e linhagens
A utilização de 24 primers RAPD propiciou a amplificação de um total de
166 bandas, com uma média de 6,92 e amplitude de 2 a 10 bandas por primer.
Do total de bandas produzidas, 151 foram polimórficas (90,96 % de polimorfismo),
o que corresponde a 6,29 bandas polimórficas por primer (Quadro 13).
Quadro 13 - Relação dos primers decâmeros utilizados, número de bandas obtidas de RAPD amplificados de 21 cultivares e linhagens de algodão
Primers Total de bandas
Bandas polimórficas
Bandas monomórficas Polimorfismo (%)
OPA-11 8 7 1 87,50 OPA-13 4 4 0 100,00 OPA-18 2 2 0 100,00 OPB-04 10 10 0 100,00 OPB-07 4 2 2 50,00 OPB-12 8 8 0 100,00 OPC-06 6 6 0 100,00 OPC-20 4 4 0 100,00 OPE-18 9 8 1 88,89 OPF-05 7 7 0 100,00 OPF-06 8 8 0 100,00 OPF-07 5 4 1 80,00 OPF-16 8 7 1 87,50 OPG-14 5 3 2 60,00 OPG-19 7 7 0 100,00 OPH-14 10 10 0 100,00 OPI-03 7 7 0 100,00 OPJ-04 9 8 1 88,89 OPK-08 8 8 0 100,00 OPK-09 8 6 2 75,00 OPK-20 9 8 1 88,89 OPO-19 7 6 1 85,71 OPW-07 8 6 2 75,00 OPY-20 5 5 0 100,00 Total 166 151 15 90,96 Média 6,92 6,29 0,63 -
Esmail et al. (2008), estudando a divergência genética entre linhagens
elites de germoplasma de algodão nos Estados Unidos da América e utilizando 23
47
primers RAPD, encontraram 113 bandas, dos quais 96 bandas (84,96%) foram
polimórficas. Por sua vez, Menezes et al. (2008), estimando a divergência
genética entre linhagens avançadas de germoplasma de algodão e utilizando 28
iniciadores RAPD, obtiveram um total de 280 fragmentos de DNA, dos quais
apenas 70 fragmentos (25%) foram polimórficos. No presente trabalho, observou-
se um polimorfismo diferenciado e relativamente superior ao dos trabalhos acima
mencionados. De acordo com Colombo et al. (2000), a obtenção de 50 a 100
bandas polimórficas são suficientes para estimar relações genéticas entre e
dentro de espécies vegetais.
Ainda no Quando 13, pode-se observar que os primers OPB-04 e OPH-14
propiciaram maior número de bandas (10), enquanto o primer OPA-18 propiciou o
menor número de bandas (2). A porcentagem mais elevada de polimorfismo foi
observada com os primers OPA-13, OPA-18, OPB-04, OPB-12, OPC-06, OPC-20,
OPF-05, OPF-06, OPG-19, OPH-14, OPI-03, OPK-08 e OPY-20, com 100% de
polimorfismo cada, enquanto o nível de polimorfismo mais baixo foi obtido com o
primer OPB-07 (50%).
A análise de padrões de bandas de DNA (Figura 4), correspondente a
amplificação obtida com os primers OPA-11, OPA-13 e OPB-07, mostra o nível de
polimorfismo encontrado entre as cultivares e linhagens. Observa-se que 100%
de polimorfismo foi obtido com o primer OPA-13, que amplificou dois marcadores
moleculares, com pesos de 500 pb e 700 pb específicos para a cultivar TAMCOT
Luxor. O primer, por sua vez, OPA-11 amplificou um marcador de 550 pb
específico para a cultivar TAM 94L-25.
A estimativa da divergência genética entre os pares de 13 cultivares e oito
linhagens de algodão (G. hirsutum), determinada a partir de 151 bandas
polimórficas, por meio do Complemento Aritmético de Jaccard (Quadros 14 e 15),
evidenciou que a dissimilaridade entre as cultivares e linhagens variou de 0,08 a
0,66, com uma média de 0,29. Os pares de cultivares ou linhagens de algodão
mais divergentes foram ISA 205 e TAMCOT Sphinx, seguido por ALBAR BC853 e
TAMCOT Sphinx. A cultivar americana TAMCOT Sphinx formou pares mais
divergentes com a maior parte das cultivares comerciais africanas (dii' > 0,50).
A menor divergência genética foi encontrada entre as cultivares ALBAR
BC853 e STAM 42, com dissimilaridade menor que dii’ = 0,1. Ainda no Quadro 14.
48
Observa-se que, na maioria dos casos, a maior similaridade encontrada foi entre
as cultivares comerciais de algodão de origem africana (sii' > 0,80).
Figura 4 - Perfil eletroforético dos produtos de amplificação do DNA genômico de 13 cultivares e oito linhagens de algodão (G. hirsutum) com os primers OPA-13 (A), OPB-07 (B) e OPA-11 (C). M, DNA ladder de 100 pb; 1, ALBAR SZ9314; 2, ALBAR FQ902; 3, ALBAR BC853; 4, STAM 42; 5, CA 222; 6, CA 324; 7, IRMA 12-43; 8, ISA 205; 9, REMU 40; 10, TAMCOT 22; 11, TAM 96WD-69s; 12, TAMCOT PYRAMID; 13, TAM 98D-102; 14, TAM 96WD-18; 15, TAM 94J-3; 16, TAM 88G-104; 17, TAMCOT Sphinx; 18, TAM 98D-99ne; 19, TAM 94WE-37s; 20, TAM 94L-25; 21, TAMCOT Luxor.
Na análise da diversidade genética dentro e entre os grupos geográficos
(americano e africano), verificou-se que a dissimilaridade dentro do grupo africano
foi menor, pois variou de 0,08 a 0,31, com uma média de 0,19 muito abaixo da
média geral (0,29).
49
Quadro 14 - Resumo da matriz de coeficientes de similaridade de Jaccard (sii’) e de seus complementos (dii’), obtidos com 151 marcadores de DNA, mediante o método de RAPD entre 21 cultivares e linhagens de algodão
Combinações entre cultivares ou linhagens mais divergentes sii' dii'
Combinações entre cultivares ou linhagens mais similares sii' dii'
ISA 205 TAMCOT Sphinx 0,34 0,66 ALBAR BC853 STAM 42 0,92 0,08ALBAR BC853 TAMCOT Sphinx 0,35 0,65 REMU 40 STAM 42 0,90 0,10REMU 40 TAMCOT Sphinx 0,37 0,63 IRMA 12-43 STAM 42 0,89 0,11TAM 98D-102 TAMCOT Sphinx 0,38 0,62 IRMA 12-43 REMU 40 0,89 0,11TAM 94J-3 TAMCOT Sphinx 0,38 0,62 ALBAR BC853 CA 324 0,88 0,12STAM 42 TAMCOT Sphinx 0,38 0,62 IRMA 12-43 ALBAR FQ902 0,87 0,13TAM 98D-99ne TAMCOT Sphinx 0,39 0,61 ALBAR BC853 ALBAR FQ902 0,87 0,13CA 222 TAMCOT Sphinx 0,39 0,61 ALBAR BC853 IRMA 12-43 0,86 0,14ALBAR SZ9314 TAMCOT Sphinx 0,39 0,61 REMU 40 TAM 98D-99ne 0,86 0,14TAMCOT 22 TAMCOT Sphinx 0,39 0,61 CA 324 STAM 42 0,86 0,14
Resultados similares, de baixa divergência, foram obtidos também por
Multani et al. (1995), ao estimarem a divergência genética entre nove cultivares
de algodão australianas, e por Iqbal et al. (1997), entre 17 cultivares de algodão
da espécie G. hirsutum, por meio de marcadores RAPD. Estes autores
observaram uma dissimilaridade que variou, respectivamente, de 0,01 a 0,08 e
0,07 a 0,18. Em outro estudo, Lukonge (2005) relatou também altos valores de
similaridade na avaliação de 26 cultivares comerciais de algodão na Tanzânia,
cuja amplitude de valores variaram de 0,89 a 0,98. Porém, a diversidade dentro
do grupo americano, o qual é constituído principalmente por linhagens (Quadro 7),
apresentou-se relativamente maior, variando de 0,16 a 0,62, com uma média de
0,32 acima da média geral (Quadro 15).
A baixa divergência verificada entre as cultivares comerciais africanas
sugere que estas possuem uma base genética estreita. Tal fato indica a utilização
de poucos genótipos parentais com menor divergência entre si nos programas de
melhoramento das mesmas (Van-Esbroeck et al., 1998; Iqbal et al., 2001).
Situação idêntica foi reportada por Lu e Myers (2002), ao encontrarem alta
similaridade (92.7% a 97.7%), na avaliação da divergência genética entre as 10
variedades de algodão herbáceo (G. hirsutum L.), que tiveram a maior
contribuição genética para as cultivares comercias de algodão nos Estados
Unidos da América.
50
Quadro 15 - Medidas de dissimilaridade obtidas a partir de Complemento Aritmético do Índice de Jaccard entre as 13 cultivares e oito linhagens de algodão (G. hirsutum)
Cultivares/
Linhagens
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
1 0,00 0,27 0,26 0,24 0,31 0,25 0,26 0,27 0,27 0,29 0,29 0,31 0,32 0,26 0,32 0,30 0,61 0,29 0,39 0,33 0,37
2 - 0,00 0,13 0,15 0,22 0,15 0,13 0,22 0,19 0,32 0,27 0,25 0,22 0,24 0,25 0,24 0,61 0,22 0,38 0,25 0,28
3 - - 0,00 0,08 0,19 0,12 0,14 0,26 0,16 0,28 0,23 0,21 0,22 0,22 0,28 0,26 0,65 0,21 0,40 0,24 0,30
4 - - - 0,00 0,15 0,14 0,11 0,23 0,10 0,27 0,22 0,22 0,24 0,23 0,25 0,26 0,62 0,16 0,38 0,26 0,28
5 - - - - 0,00 0,17 0,18 0,26 0,20 0,31 0,26 0,28 0,28 0,27 0,29 0,28 0,61 0,24 0,44 0,30 0,31
6 - - - - - 0,00 0,15 0,24 0,16 0,25 0,23 0,22 0,18 0,16 0,25 0,19 0,61 0,19 0,37 0,24 0,16
7 - - - - - - 0,00 0,16 0,11 0,28 0,21 0,22 0,24 0,23 0,26 0,22 0,59 0,15 0,36 0,25 0,28
8 - - - - - - - 0,00 0,21 0,38 0,28 0,33 0,30 0,32 0,30 0,26 0,66 0,26 0,44 0,38 0,39
9 - - - - - - - - 0,00 0,27 0,23 0,25 0,23 0,25 0,23 0,25 0,63 0,14 0,38 0,25 0,29
10 - - - - - - - - - 0,00 0,17 0,26 0,20 0,23 0,28 0,28 0,61 0,30 0,40 0,33 0,33
11 - - - - - - - - - - 0,00 0,19 0,21 0,23 0,26 0,27 0,60 0,24 0,38 0,28 0,28
12 - - - - - - - - - - - 0,00 0,19 0,18 0,30 0,26 0,60 0,23 0,36 0,24 0,29
13 - - - - - - - - - - - - 0,00 0,16 0,23 0,22 0,62 0,25 0,42 0,26 0,27
14 - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,20 0,18 0,58 0,20 0,32 0,21 0,23
15 - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,19 0,62 0,25 0,37 0,29 0,27
16 - - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,56 0,25 0,38 0,28 0,29
17 - - - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,61 0,54 0,57 0,60
18 - - - - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,37 0,24 0,25
19 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,44 0,39
20 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0,00 0,23
21 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0,00
Coeficiente de dissimilaridade media = 0,29; Amplitude de coeficiente de dissimilaridade (0,08 – 0,66). 1= ALBAR SZ9324; 2= ALBAR FQ902; 3= ALBAR BC853, 4= STAM 42; 5= CA 222; 6= CA 324; 7= IRMA 12-43; 8= ISA 205; 9= REMU 40; 10= TAMCOT 22; 11= TAM 96WD-69s; 12= TAMCOT PYRAMID; 13= TAM 98D-102; 14= TAM 96WD-18; 15= TAM 94J-3; 16= TAM 88G-104; 17= TAMCOT Sphinx; 18= TAM 98D-99ne; 19= TAM 94WE-37s; 20= TAM 94L-25; 21= TAMCOT Luxor.
51
4.5.1. Análise de variância molecular (AMOVA)
A quantificação da variabilidade entre e dentro dos grupos geográficos,
verificada pela AMOVA, foi estimada em 16,30% e 83,70%, respectivamente
(Quadro 16). Segundo Wright (1978), o valor de FST é alto e significativo (p <
0,01), evidenciando uma considerável divergência genética entre os grupos
geográficos (Quadro 16). Ainda no Quadro 16, pode-se observar que não existem
evidências estatísticas, em nível de 5% de probabilidade, que suportam a
existência de variabilidade entre as cultivares ou linhagens dentro de todos os
grupos geográficos. Porém, a maior variância observada dentro dos grupos
geográficos é evidenciada em virtude da divergência entre cultivares ou linhagens
dentro do grupo geográfico americano, uma vez que se verificou maior
similaridade entre as cultivares comercias dentro do grupo africano (Quadros 14 e
15). Estes resultados indicam que os dois grupos geográficos estudados podem
ser considerados populações geneticamente distintas (Oliveira e Silva, 2008) e
que o grupo americano é o mais divergente.
Quadro 16 - Análise de variância molecular de dois grupos geográficos de cultivares e linhagens de algodão (G. hirsutum), obtida por marcadores moleculares RAPD (151 bandas)
FV
GL SQ Componentede variância
Porcentagem de variação
FST
Entre os grupos geográficos
1 51,37 3,33 16,30** 0,163**
Dentro dos grupos geográficos
19 325,06 17,11 83,70
Total 20 376,43 20,44 100,00 ** significativo a 1% de probabilidade.
4.5.2. Análise de agrupamento
Com base na matriz de dissimilaridade correspondente ao Complemento
do Coeficiente Aritmético de Jaccard, tornou-se possível a obtenção do
dendrograma obtido pelo Método Hierárquico UPGMA (ligação média entre
grupo).
52
Efetuar um corte vertical a uma distância de 41,30% no dendrograma
possibilitou identificar seis grupos (Figura 5). O primeiro grupo foi constituído por
cerca de 90% de cultivares comerciais, de origem africana, com a cultivar ALBAR
SZ9314 formando um grupo isolado (IV). As cultivares e linhagens americanas
foram agrupadas nos restantes quatro grupos (II, III, V e VI), com exceção da
linhagem americana TAM 98D-99ne, que, apesar de pertencer ao grupo
geográfico americano, foi alocada no grupo africano. Esta linhagem não possui
nectários nas folhas e nas brácteas, comparando com as demais linhagens e
cultivares americanas (Thaxton et al., 2005). No caso do grupo II, foi possível
observar dois subgrupos: o subgrupo 1 com similaridade de 59,02 % em relação
ao subgrupo 2. O grupo III foi formado pela linhagem TAMCOT 94L-25 e cultivar
TAMCOT Luxor com 61,04 % de similaridade entre si.
Figura 5 - Dendrograma baseado na matriz de dissimilaridade correspondente ao Complemento Aritmético do Índice de Jaccard entre 21 cultivares e linhagens de algodão (G. hirsutum), definido pelo critério de agrupamento UPGMA, utilizando 151 marcadores RAPD.
Os grupos IV, V e VI foram constituídos por apenas uma cultivar ou
linhagem: cultivar africana ALBAR SZ9314, linhagem americana TAMCOT 94WE-
53
37s, e a cultivar americana TAMCOT Sphinx, respectivamente. As cultivares e as
linhagem mencionadas, que formaram grupos singulares e isolados dos outros,
possuem características que lhes são peculiares em relação a outras. A cultivar
ALBAR SZ9314 tem muita das suas características agronômicas e de qualidade
de fibra melhoradas pelo Instituto de Investigação do Algodão no Zimbabwe. A
linhagem TAMCOT 94WE-37s, por sua vez, é caracterizada pela ausência de
tricomas no caule e nas folhas (Smith, 2003). Enquanto a cultivar TAMCOT
Sphinx destaca-se pelo elevado nível de resistência a nematóides (Rotylenchus
reniformis) (El-Zik e Thaxton, 1996).
A projeção gráfica das cultivares e linhagens no espaço bidimensional,
obtida pela matriz de dissimilaridade de Jaccard, mostra de maneira generalizada
as distâncias genéticas entre e dentro de grupos geográficos (Figura 6).
Esses resultados confirmam o grau de variabilidade genética existente
entre e dentro dos dois grupos geográficos (africano e americano) usados neste
estudo. O grupo africano engloba cultivares comerciais mais similares e, por sua
vez, o grupo geográfico americano é constituído por cultivares e linhagens mais
divergentes.
54
Figura 6 - Projeção gráfica das distâncias genéticas das 13 cultivares e oito linhagens de algodão (G. hirsutum) em espaço bidimensional, com base no Complemento Aritmético do Índice de Jaccard. A identificação das cultivares e linhagens encontra-se apresentada no Quadro 7. 4.6. Considerações finais
Tendo em vista o conhecimento obtido a respeito do potencial produtivo,
da adaptabilidade e da estabilidade de produção das cultivares comerciais, é de
se esperar que isso venha contribuir para maior sustentabilidade ao sistema
produtivo de algodão em Moçambique. Assim sendo, para melhorar as baixas
produtividades verificadas até o presente momento em Moçambique, as cultivares
ISA 205, STAM 42 e IRMA 12-43 poderiam ser as mais indicadas para o cultivo,
por mostraram-se mais estáveis, com menor risco de baixa produtividade de
algodão em caroço e com padrão de resposta fenotípica favorável.
A diversidade genética observada nas cultivares comerciais de algodão
em Moçambique foi baixa. A recente introdução de cultivares e de linhagens
americanas permitiu ampliar essa baixa variabilidade genética encontrada entre
as cultivares comerciais.
Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo poderão auxiliar
no incremento da eficiência nas pesquisas, dando uma direção consistente ao
Programa de Melhoramento do Algodão em Moçambique. Visando ao alcance na
elevação da produtividade de algodão em Moçambique e utilizando do
germoplasma disponível, são recomendados os seguintes pares de combinações
híbridas: ISA 205 x TAMCOT Sphinix, ALBAR BC853 x TAMCOT Sphinix e REMU
40 x TAMCOT Sphinix. Porém, cruzamentos entre parentais com bom
desempenho e ao mesmo tempo divergentes entre si aumentam a possibilidade
de obtenção de segregantes superiores e, consequentemente, aumentam as
chances de êxito dos programas de melhoramentom visando ao aumento da
produtividade da cultura. Sendo assim, a hibridação entre ISA 205 e TAMCOT
Sphinx seria a mais indicada por serem estas as mais divergentes e pela boa
adaptabilidade e estabilidade encontrada na cultivar ISA 205. Pode, ainda, ser
complementada com a alta resistência a pragas e a doenças encontradas na
cultivar TAMCOT Sphinix.
55
5. CONCLUSÕES
a) As cultivares ISA 205, STAM 42 e IRMA 12-43 foram as que apresentaram
maior produtividade de algodão em caroço, enquanto a menos produtiva foi a
cultivar ALBAR BC853.
b) No geral, as nove cultivares comerciais africanas apresentaram alto rendimento
de fibra com exceção da cultivar Remu 40 ;
c) A metodologia proposta por Annicchiarico (1992) indicou que as cultivares ISA
205, STAM 42 e IRMA 12-43 apresentam maior estabilidade fenotípica para
produtividade de algodão em caroço. Essas cultivares apresentaram-se com 75%
de probabilidade de, na pior das hipóteses, terem 8,49; 6,63 e 1,81% de
produtividade, respectivamente, acima da média dos ambientes, sendo, portanto,
as mais previsíveis.
d) A metodologia proposta por Toler e Burrows (1998) mostrou que todas as
cultivares foram representadas pelo modelo uni-segmentado. A cultivar STAM 42
apresentou adaptação específica a ambientes de baixa qualidade, enquanto a
cultivar CA 324 apresentou adaptação específica a ambientes de alta qualidade.
As demais cultivares apresentaram adaptabilidade geral.
e) As cultivares de algodão ISA 205, STAM 42 e IRMA 12-43, por terem
apresentando maior estabilidade, com menor risco de baixa produtividade de
algodão em caroço e padrão de resposta fenotípica favorável, mostraram-se mais
promissoras para serem recomendadas para cultivo nas condições de
Moçambique.
f) O uso de marcadores moleculares RAPD foi eficiente no estudo de divergência
genética das cultivares e linhagens de algodão, identificando um polimorfismo de
90,96 %.
g) O gráfico de projeção das cultivares e linhagens no espaço bidimensional,
obtido pelo complemento do Coeficiente Aritmético de Jaccard, evidenciou
menores distâncias dentro das cultivares comerciais africanas. As cultivares e
linhagens americanas, por sua vez, foram mais divergentes entre si.
h) O Complemento Aritmético de Jaccard, obtido com os 151 marcadores
moleculares RAPD, indicou que as cultivares mais divergentes foram ISA 205 e
TAMCOT Sphinx, enquanto as mais similares foram ALBAR BC853 e STAM 42.
56
i) As combinações híbridas recomendadas, utilizando-se o germoplasma
estudado em Programas de Melhoramento do Algodoeiro, visando ao incremento
de produtividade, são as seguintes: ISA 205 x TAMCOT Sphinix, ALBAR BC853 x
TAMCOT Sphinix e REMU 40 x TAMCOT Sphinix.
57
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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73
APÊNDICE
74
Quadro 1A - Desdobramento do efeito de cultivares no rendimento de fibra de nove cultivares de algodão avaliadas em três Regiões Agro-ecológicas de Moçambique, no ano 2005/06
Rendimento de fibra (%)
Ambientes Média
Cultivares Montepuez
(2005/06)
Morrumbala
(2005/06)
Namialo
(2005/06)
ALBAR SZ9314 41,53 a 38,21 ab 37,48 bcd 39,07 a
ALBAR FQ902 35,77 b 42,41 a 36,50 cd 38,23 a
ALBAR BC853 34,6 b 39,40 a 42,90 ab 38,99 a
STAM 42 36,58 ab 39,41 a 43,94 a 39,98 a
CA 222 36,64 ab 36,30 ab 44,81 a 39,25 a
CA 324 35,7 b 39,11 ab 40,35 abc 38,40 a
IRMA 12-43 35, b 38,70 ab 41,30 abc 38,57 a
ISA 205 33,54 b 39,93 a 43,28 a 38,92 a
REMU 40 36,86 ab 33,90 b 34,52 d 35,09 b
Média 36,34 38,60 40,56 38,50
CV (%) 8,35 6,21 4,14 6,32
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
75
Figura 1B - Mapa de Regiões Agro-ecológicas de Moçambique (INIA, 2000).
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