UNICAMP

MANUAL DE BIOSSEGURANÇA E DE PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

LABORATÓRIO DE NEUROBIOLOGIA MOLECULAR DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E EVOLUÇÃO

INSTITUTO DE BIOLOGIA - UNICAMP

Prof. Dr. Fabio Papes set/2009

LABORATÓRIO DE NEUROBIOLOGIA MOLECULAR

MANUAL DE BIOSSEGURANÇA PARA TRABALHO COM MICRORGANISMOS GENETICAMENTE

MODIFICADOS DAS CLASSES DE RISCO 1 E 2 (NB-1 E NB-2) 1. INTRODUÇÃO

Profissionais da área de saúde e outros trabalhadores que exercem suas atividades em laboratórios estão sob risco de desenvolver doença profissional por exposição a agentes infecciosos, radiação, produtos químicos tóxicos e inflamáveis, entre outros.

Atualmente, com a sofisticação das novas técnicas de diagnóstico, observamos profissionais de outras áreas, tais como físicos, químicos, analistas de sistemas, etc, envolvidos em atividades com exposição a agentes infecciosos e por outro lado, microbiologistas manipulando substâncias químicas ou materiais radioativos.

Tornou-se imperativo conscientizar o profissional da importância da sua adesão às técnicas microbiológicas seguras e da incorporação das normas de biossegurança ao seu trabalho diário.

O objetivo principal da biossegurança é criar um ambiente de trabalho onde se promova a contenção do risco de exposição a agentes potencialmente nocivos ao trabalhador, pacientes e meio ambiente, de modo que este risco seja minimizado ou eliminado.

Os métodos utilizados para se obter esta contenção representam as bases da biossegurança e são ditos primários ou secundários.

A contenção primária, ou seja, a proteção do trabalhador e do ambiente de trabalho contra a exposição a agentes infecciosos, é obtida através das práticas microbiológicas seguras e pelo uso adequado dos equipamentos de segurança. O uso de vacinas, como a vacina contra a hepatite B, incrementa a segurança do trabalhador e faz parte das estratégias de contenção primária.

A contenção secundária compreende a proteção do ambiente externo contra a contaminação proveniente do laboratório e/ou setores que manipulam agentes nocivos. Esta forma de contenção é alcançada tanto pela adequada estrutura física do local como também pelas rotinas de trabalho, tais como descarte de resíduos sólidos, limpeza e desinfecção de artigos e áreas, etc.

CLASSIFICAÇÃO DOS LABORATÓRIOS DE ACORDO COM O NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA.

As características físicas estruturais e de contenção de um laboratório determinam o tipo de OGM que pode ser manipulado em suas dependências. Os OGMs são classificados por grupo de risco em:

Risco 1: OGM cuja manipulação acarreta risco de exposição profissional e de contaminação ambiental baixo ou nulo. Ex: microorganismos usados na produção de cerveja, vinho, pão e

queijo (S. cerevisiae, etc), cepas de E. coli normalmente utilizadas no laboratório de Biologia Molecular.

Risco 2: OGMs que podem causar doença humana ou animal, existindo medidas efetivas de tratamento e/ou de prevenção e sendo o risco de disseminação da infecção para a coletividade baixo. Exemplo: Vírus da hepatite B, Salmonella enteriditis e lentivírus.

Risco 3: OGMs que geralmente causam doença humana ou animal grave mas com baixo risco de transmissão. Existem medidas terapêuticas e preventivas conhecidas e disponíveis. Exemplos: HIV, HTLV, Mycobacterium tuberculosis, Brucella suis, Coxiella burnetti.

Risco 4: OGMs que geralmente causam doença humana ou animal grave, o risco de transmissão de uma pessoa a outra, direta ou indiretamente, é alto e medidas efetivas de tratamento ou prevenção não estão disponíveis. Exemplos: Vírus de febres hemorrágicas, Febre de Lassa, Machupo, Ébola, arenavírus e certos arbovírus.

Desta forma, de acordo com suas características e capacitação para manipular OGMs de risco 1, 2, 3 ou 4, os laboratórios são designados como nível 1 de biossegurança ou proteção básica (P1), nível 2 de biossegurança básica (P2), nível 3 de biossegurança de contenção (P3) e nível 4 de biossegurança de contenção máxima (P4), respectivamente. As pesquisas desenvolvidas no Laboratório de Neurobiologia Molecular do Prof. Dr. Fabio Papes entram dentro das classificações NB1 e NB2

2. OBJETIVOS

.

Estabelecer procedimentos para a condução de todas as tarefas, de tal maneira que se reduzam ao mínimo possível os riscos e, consequentemente, os acidentes de qualquer tipo ou contaminação biológica. Para atingir esse objetivo é necessário o apoio e cooperação de todos os colaboradores, sem distinção de nível hierárquico, na observância e cumprimento das Normas e Recomendações de Segurança, inclusive aquelas determinadas pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) em suas deliberações e Instruções Normativas.

3. CAMPO DE APLICAÇÃO Este documento é usado por todos os setores do Laboratório.

4. RESPONSABILIDADES

Prof. Dr. Fabio Papes – Chefe do Laboratório – Responsável Geral frente à CIBIO/IB/UNICAMP. Responsável geral das condições, melhorias do ambiente de trabalho e adequação da segurança às legislações locais. Responsável pela definição e promoção dos procedimentos, garantindo a segurança à saúde e bem-estar dos colaboradores.

Responsável pela sua segurança e de seu ambiente de trabalho, bem como pelo aviso ao membro da CIPA sobre condições e atos inseguros.

5. CONTENÇÃO PRIMÁRIA – TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS SEGURAS

Todos os colaboradores devem:

• efetuar o seu trabalho de maneira segura e cuidadosa para salvaguardar vidas, prevenindo acidentes;

• usar pepitadores, nunca pipetar com a boca e nunca passar etiqueta ou outros materiais na boca;

• manter o laboratório limpo, organizado e livre de materiais que não são usados durante o trabalho;

• nunca comer, beber, ou guardar alimentos nos refrigeradores da área técnica; não fumar na área técnica;

• usar luvas, aventais, óculos protetores, água, detergente e sacos especiais ou grânulos absorventes para desinfetar as superfícies quando ocorrer um derramamento de material potencialmente perigoso;

• lavar as mãos com água e sabão após cada manuseio de reagentes ou materiais que entrar em contato com o corpo, bem como ao saírem do laboratório;

• tirar as dúvidas antes da execução de suas tarefas; seguir os conselhos dos colaboradores mais experientes, prevenindo assim um acidente resultante da inexperiência; e ter a atenção voltada para a tarefa que está sendo executada; ainda que todas as regras e regulamentos sejam seguidos, a desatenção pode ser a causa de vários acidentes;

• discutir com o supervisor ou representante da CIPA ao julgar necessário efetuar qualquer modificação em seu setor, a fim de melhorar a segurança dos equipamentos ou do pessoal;

• usar óculos, protetores faciais, máscaras (produtos químicos voláteis) ou outra forma de proteção da face e olhos em trabalhos que apresentem perigo para rosto e olhos. Por exemplo, manuseio de vidros contendo produtos químicos.

• depositar o lixo e materiais usados nos recipientes existentes para esse fim;

• tomar conhecimento de: o nomes e telefones de emergência do quadro de avisos; o caixa de primeiros-socorros (ataduras, pomadas para queimaduras e compressas

oculares), colocando no local após o uso;

o locais dos lava-olhos e chuveiros de segurança; o local da água e soro fisiológico esterilizado; o incompatibilidades dos produtos químicos, nunca os misturando; por exemplo,

hipoclorito de sódio (4% em água), no frasco de dejeto, ao misturar com diluentes, reagem produzindo cloro (gás), que inativa o desinfetante, tornando-o inútil (ver Anexo I);

• abrir portas, utilizar bebedouros e atender ao telefone sem luvas; ao sair do local de trabalho, devem retirar as luvas e jaleco;

• substituir as vidrarias quando estiverem quebradas; manter materiais infectados fechados quando não estiverem em uso; desinfectar as bancadas (área técnica) e centrífugas com hipoclorito de sódio a 2% ao final da jornada de trabalho;

• evitar: produzir aerossol desnecessário por agitação violenta, destampar a centrífuga ainda em movimento, abrir vasilhames com pressão interna maior que a externa;

• cobrir cortes e abrasões de pele, principalmente das mãos, antes de manusear qualquer espécime do laboratório;

• nunca colocar objetos de qualquer espécime sobre os equipamentos, a fim de evitar danos;

• somente permitir a entrada, nas áreas de serviço do laboratório, a pessoas devidamente avisadas sobre os eventuais perigos e proibir crianças de terem acesso as áreas técnicas e ao laboratório;

• manter fechadas as portas do laboratório durante o trabalho;

Existem certos cuidados específicos no laboratório de modo a garantir a não contaminação pessoal bem como dos equipamentos.

5.1. LABORATÓRIO PRINCIPAL:

• Os géis, bem como qualquer material descartável, contendo brometo de etídio, devem ser descartados em um descarpack (embalagem de plástico resistente, dupla, armazenada em caixa de papelão que é recolhida para incineração).

• Existem vidrarias exclusivas para o preparo de géis contendo brometo de etídio, utiliza-las somente para este fim.

• Os materiais devem ser sempre lavados com o uso de luvas específicas de borracha que possuam uma superfície antiderrapante na região da palma da mão e dos dedos.

• O Brometo de Etideo deve ser sempre descartado no recipiente destinado a esse fim para que seja incinerado.

5.2. OS EQUIPAMENTOS:

O Laboratório de Neurobiologia Molecular conta com os seguintes equipamentos:

• Duas cabines de segurança biológica de Classe IIA

• Autoclave de 100L para esterilização de materiais

• Autoclave de 150L para descarte de material microbiológico contendo OGMs que exigem nível NB-1

• Autoclave de bancada de 10L para descarte de material microbiológico contendo OGMs que exigem nível NB-2

• Forno de esterilização

• Estufas

• Microcentrífugas

• Centrífugas de bancada

• Agitadores orbitais com temperatura controlada

• Cubas de eletroforese

• Fontes de eletroforese

• Sistema de transferência para Western blotting

• Sistema de água destilada

• Balanças de precisão

• Medidor de pH

• Forno microondas

• Jogos de micropipetas de volumes variáveis

• EPIs

• Microscópio invertido simples

• Micrótomo de lâmina vibratório

• Estereomicroscópio

• Agitadores de tubo

• Banho seco EPIs: Genericamente, podem ser considerados equipamentos de proteção individual (EPIs) todos os objetos cuja função é prevenir ou limitar o contato entre o operador e o material infectante. Desta forma, oferecem segurança ao funcionário desde objetos simples como as luvas descartáveis, até equipamentos mais elaborados como os fluxos laminares e cabines de segurança biológica. Porém, é fundamental que o funcionário tenha consciência de que os EPIs não substituem a prática das técnicas microbiológicas seguras. Entre elas, estão o conhecimento preciso do funcionamento e o uso correto e apropriado destes equipamentos de proteção. A maioria dos EPIs, se usados adequadamente, promovem também uma contenção da dispersão de agentes infecciosos no ambiente, facilitando a preservação da limpeza do laboratório. Por exemplo, não atender telefone de luvas; não abrir as centrífugas antes da parada completa da mesma, não abrir o visor frontal do fluxo durante procedimento, entre outros. O uso de determinados EPIs está condicionado a conscientização e à adesão do funcionário às normas de biossegurança, uma vez que o funcionário deve "vesti-los". São eles: luvas, máscaras, aventais, visores, óculos de proteção, protetores auriculares, etc.

• LUVAS. Devem ser usadas em procedimentos com exposição a amostras biológicas. Luvas apropriadas para manipulação de objetos em temperaturas altas ou baixas estão disponíveis nos locais onde tais procedimentos são realizados. Em casos de acidente, luvas grossas de borracha devem ser usadas nos procedimentos de limpeza e na retirada de fragmentos cortantes do chão ou de equipamentos, com auxílio de pá e escova.

• AVENTAIS. Seu uso é obrigatório apenas para procedimentos com exposição a amostras biológicas infectantes ou a produtos químicos perigosos, tais como fenol, brometo de etídio, SybrGreen, ácidos, peróxido de hidrogênio, etc. Os aventais de tecido devem ser SEMPRE de mangas compridas, comprimento pelo menos até a altura dos joelhos e devem ser usados abotoados. Quando retirado do laboratório para ser lavado, o avental deve ser acondicionado em saco plástico.

• VISORES OU ÓCULOS. Devem ser usados em procedimentos com risco de impacto ou de manipulação de produtos químicos perigosos.

• MÁSCARA DE PROTEÇÃO UV. Devem ser usadas na exposição ocular e facial à luz ultravioleta.

PIPETADORES MANUAIS: Os pipetadores existem para abolir a pipetagem com a boca. Grande parte dos

acidentes em laboratórios é decorrente da ingestão de material infectante ou de substâncias tóxicas pelo funcionário/aluno. Por outro lado, o uso incorreto dos pipetadores pode favorecer a formação de aerossóis, que, contaminando o ambiente de trabalho, expõe não só o funcionário que usa inadequadamente o equipamento, mas também todos os outros que trabalham ou circulam na área.

As seguintes regras devem ser obedecidas com relação às técnicas adequadas para uso das pipetas:

• O uso de pipetadores manuais ou automáticos é obrigatório. A pipetagem com a boca é terminantemente proibida em todos os laboratórios.

• Não soprar ar com o pipetador, dentro de líquido contendo material infectante.

• Não homogeneizar o material infectante aspirando e expulsando o mesmo das pipetas.

• Não expelir o conteúdo das pipetas com força.

• Preferir pipetas graduadas marca a marca para evitar a expulsão da última gota.

• O recipiente para descarte das pipetas deve ficar dentro do fluxo laminar durante o procedimento e não do lado de fora.

• Não usar seringas e agulhas para aspirar líquido de frascos.

• Não usar pipetas Pasteur de vidro.

OS FLUXOS LAMINARES e CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA:

Os fluxos laminares são os principais equipamentos na contenção física de agentes contaminantes. Há três tipos de fluxos designados como classe I, classe II e classe III.

As cabines de classe II, que são utilizadas em nosso laboratório, têm entrada de ar pelo lado de cima do equipamento, circulando depois por um sistema de filtros HEPA e dentro da área de trabalho, sendo então aspirado e passado por um outro filtro HEPA, protegendo o meio ambiente da contaminação com quaisquer microorganismos. O ar do meio em frente ao equipamento é aspirado e não entra em contato com o material sendo manipulado, oferecendo proteção completa tanto para o experimentador como para o ambiente.

As cabines devem ser limpas com álcool 70% (incluindo o visor de vidro) antes do início das atividades e ao final de cada dia de trabalho. Uma vez por dia, a cabine deverá ser esterilizada por tratamento com luz UV (já presente no equipamento) por 30 min. Evitar ligar e desligar o sistema; quanto mais tempo ligado maior a segurança oferecida e maior a durabilidade dos filtros. É recomendável que todos os frascos de soluções, reagentes e outros materiais que entrarão na cabine sejam previamente limpos com álcool 70%. Os coletores de pérfuro-cortantes e as cubas para descarte de pipetas devem ficar dentro do fluxo para evitar a entrada e retirada das mãos durante a operação. Entretanto, devem ser retirados ao final de cada procedimento, deixando novamente limpa a área de trabalho.

Uma das cabines de segurança biológica do tipo IIA do laboratório será acondicionada na sala de cultura de células, e será utilizada exclusivamente para trabalhos de cultura de células de mamíferos, incluindo procedimentos que envolvam OGMs, como linhagens celulares transformadas com vetores plasmidiais (OGMs do tipo I) ou infectadas com lentivírus (OGMs do tipo II).

Além do exposto, outras regras básicas devem ser respeitadas para o bom funcionamento e durabilidade do equipamento:

• Não usar antes de instalado pelos fornecedores e funcionando adequadamente.

• Descontaminar a cabine antes do uso por exposição a luz UV durante 30 minutos.

• Reduzir ao mínimo os materiais que ficarão dentro do fluxo durante o procedimento. Tais objetos devem ficar no fundo do fluxo sem obstruir as saídas de exaustão (grades na mesa).

• Trabalhar usando o meio e a parte de trás do fluxo, de modo visível através do visor frontal.

• O trânsito atrás do operador deve ser minimizado. O local onde o fluxo está instalado deve ser previsto antes que reformas sejam efetuadas.

• O operador não pode atrapalhar o fluxo de ar gerado com movimentos repetidos de retirada e introdução das mãos dentro do fluxo.

• Manter a cabine funcionando por pelo menos mais 15 minutos após o término do procedimento, antes de desligá-la.

• Cumprir os prazos estipulados pela assistência técnica para as visitas de revisão e de trocas de filtros.

AS CENTRÍFUGAS:

Os acidentes com centrífugas raramente causam infecções laboratoriais. Entretanto, um único acidente geralmente expõe um número grande de funcionários.

Todo procedimento de centrifugação gera aerossol e as centrífugas são equipamentos que impedem a dispersão destas partículas no ar. Para tal, é necessário que operem fechadas e cumprindo-se os prazos previstos para sua abertura após o procedimento de centrifugação.

Para garantir a segurança da centrifugação:

• As centrífugas devem estar calibradas, funcionando adequadamente e operando e acordo com as orientações do fabricante.

• Devem ser colocadas em locais que permitam que mesmo funcionários de baixa estatura, consigam inspecionar seu interior todos os dias e colocar as caçapas corretamente. A centrífuga que deixa resíduos no rotor e fica suja no final do dia não está funcionando mecanicamente de forma satisfatória. Nestes casos, rever os protocolos de uso e chamar a assistência técnica.

• As caçapas e rotores devem ser inspecionados diariamente também com relação a rachaduras e corrosão.

• Após o uso, ao final do trabalho, as caçapas deverão ser limpas e estocadas invertidas para escoar qualquer resíduo de seu interior.

• Os tubos devem ser colocados tampados no interior da centrífuga.

A AUTOCLAVE:

O uso de vapor úmido sob pressão é o método mais eficaz para esterilizar os materiais de laboratório.

A autoclave do tipo panela de pressão é aquecida por eletricidade. A carga é introduzida por cima. O vapor é produzido pelo aquecimento da água contida na base do vaso. O ar desloca-se para cima através de uma válvula de escape. Após a saída de todo o ar, fecha-se a válvula de segurança e diminui-se a temperatura. Controla-se a temperatura através da pressão pré-determinada.

Como carregar a autoclave

Coloque os materiais esterilizáveis, com folga, dentro da câmara para permitir a livre circulação de vapor e retirada fácil do ar. Abra os sacos plásticos para que os vapores penetrem no seu conteúdo.

Cuidados com a autoclave

• Chame um técnico especializado para inspecionar a câmara e as vedações da porta.

• Faça manutenção preventiva com registros e controles.

• Não sobrecarregue a autoclave, pois parte da carga deixará de ser esterilizada.

• Mantenha a válvula principal de vapor fechada e abra somente quando a temperatura estiver abaixo de 80ºC ou zero de pressão (kgf/cm2).

• Use sempre luvas e máscara com visor, ao abrir a autoclave.

• Treine as pessoas para manuseio da autoclave.

• Limpe o filtro de drenagem (fundo da câmara) diariamente.

• Verifique se a válvula de escape está desobstruída. Uso da autoclave de bancada na sala de contenção NB-2

Uma das salas do laboratório será utilizada para procedimentos de cultura de tecidos e células e todo material OGM que requeira nível de biossegurança NB-2 será manipulado exclusivamente neste ambiente de contenção. Neste local, haverá uma autoclave de bancada

de pequenas dimensões que será utilizada exclusivamente para a esterilização anterior ao descarte de todo material OGM desta natureza. Uso da autoclave de esterilização

Para os demais OGMs (do tipo I, com nível de segurança NB-1) e outros tipos de microorganismos não transgênicos, será utilizada uma autoclave específica para sua esterilização e descarte.

5.3. RISCOS QUÍMICOS

Usar EPIs apropriados para evitar acidentes com os seguintes produtos químicos. Um breve resumo dos riscos do manuseio de produtos químicos encontra-se no Anexo I. Em caso de contaminação, os procedimentos corretos para descontaminação estão descritos no ANEXO II.

SUBSTÂNCIAS CARCINOGÊNICAS

Ortotoluidina, benzina, benzeno, formaldeído (fixador e preservativo), ácido clorídrico ou formaldeído = éter, biclorometil, hipoclorito com formaldeído.

SUBSTÂNCIAS EXPLOSIVAS

Ácido perclórico, ácido pícrico, azida sódica.

SOLVENTES

Álcool, acetona, éter, xilol, toluol. Não descarte na rede de esgotos, sem tratamento prévio.

ÁCIDOS / CORROSIVOS

HCl (ácido clorídrico), HNO3 (ácido nítrico), H2SO4 (ácido sulfúrico), CH3COOH (ácido acético), tricloroacético, NaOH (hidróxido de sódio), KOH (hidróxido de potássio).

6. CONTENÇÃO SECUNDÁRIA

6.1. ÁREA FÍSICA DOS LABORATÓRIOS

Embora as exigências de cada setor sejam diversas, existem certos aspectos que em geral são válidos para todos os laboratórios e todos os itens foram aplicadas aos nossos, seguem abaixo as recomendações para o conhecimento de todos:

• O laboratório deve ser amplo para permitir o trabalho com segurança e facilitar a limpeza e manutenção.

• Paredes, tetos e chão devem ser fáceis de limpar, impermeáveis a líquidos e resistentes aos agentes químicos propostos para sua limpeza e desinfecção. O chão não pode ser escorregadio.

• Tubulação exposta deve estar afastada das paredes.

• Iluminação deve ser adequada para todas as atividades.

• As bancadas devem ser impermeáveis à água e resistentes aos desinfetantes, ácidos, solventes orgânicos e calor moderado.

• O mobiliário deve ser de fácil limpeza. O espaço entre os equipamentos deve permitir a limpeza de toda a área, com o mínimo de deslocamento de equipamentos de grande porte.

• Os materiais de uso diário podem ficar em estoque pequeno dentro do laboratório, porém nunca sobre as bancadas. O restante do material de consumo deve ser estocado em área própria, fora das dependências do laboratório.

• As portas devem ser mantidas fechadas.

• A Autoclave deve estar disponível no mesmo prédio dos laboratórios.

• A área destinada à guarda de objetos pessoais e ao armazenamento de alimentos para consumo diário, deve estar fora do laboratório.

• Em caso de falta de energia elétrica, setores que dispõem de freezer, câmaras frias e fluxos laminares que necessitam ficar continuamente ligados, devem ter geradores que se ligam automaticamente.

6.2. DESCARTE DOS RESIDUOS SÓLIDOS

De acordo com a NBR 12808 da ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas), os resíduos de serviço de saúde são classificados como resíduos infectantes classe A tipo A.1. - biológico; ou tipo A.2. - sangue e hemoderivados.

A recomendação para o manuseio deste tipo de resíduo é o tratamento pela esterilização na unidade geradora antes de serem descartados ou encaminhados para incineração (ABNT, NBR 12809). A resolução CONAMA no. 5 de 5/8/93 recomenda a autoclavagem OU a incineração para o tratamento este tipo de resíduo.

O resíduo perfurante ou cortante (lâminas, tubos, seringas, pipetas Pasteur de vidro, bisturis, etc) deve ser descartado em coletor rígido, disponível em todos os laboratórios. O coletor deve ser colocado próximo ao local onde o procedimento é realizado para evitar que o funcionário circule com os pérfuro-cortantes nas mãos ou em bandejas.

Os tubos, pipetas e outros materiais não descartáveis, devem ser desprezados em coletores plásticos que são recolhidos periodicamente das áreas, por funcionários do laboratório responsáveis pela limpeza e esterilização. Estes coletores têm tampa e devem permanecer tampados no setor.

O recolhimento deste material deve é realizado pelos funcionários da Limpeza e Esterilização da Unidade de Gerenciamento de Rejeitos Sólidos sa UNICAMP, em carrinhos fechados e laváveis, com freqüência de uma vez por semana, ou sempre que se fizer necessário. Todo material biológico é autoclavado.

6.3. OGMs

6.3.a PROCEDIMENTOS DE BIOSSEGURANÇA.

As salas para manuseio de OGMs devem ser de acesso restrito, sendo permitida a entrada somente de pessoas com prévia autorização dos Biólogos responsáveis pelo local. Todo o material que tiver contato com os OGMs deve ser autoclavado antes de ser descartado. Todos os procedimentos aqui descritos foram expressamente baseados nas leis e recomendações da CTNBio, de acordo com a LEI Nº 9.649, DE 27 DE MAIO DE 1998, e com as Instruções Normativas 1,7, 12 e 15 da CTNBio.

6.3.b. INATIVAÇÃO E DESCARTE DO MATERIAL GENETICAMENTE MODIFICADO

O material geneticamente modificado, antes de ser descartado, deve ser armazenado em recipientes de vidro tipo Pirex e autoclavado no próprio laboratório (sala de inativação) por 30 minutos à 121ºC. Após autoclavado o material deve ser armazenado em bombonas plásticos de 25 ou 50L contendo o símbolo de risco biológico e recolhido para incineração pela Unidade de Gerenciamento de Resíduos Biológicos da UNICAMP (http://www.cgu.unicamp.br/residuos/sobre/fluxobio.htm).

O mesmo procedimento será utilizado para o descarte de OGMs do tipo II que o laboratório venha a utilizar, incluindo principalmente lentivírus e células em cultura infectadas com estes vetores virais. Para isto, conforme explicitado em itens anteriores, haverá uma sala para manipulação deste tipo de OGM, contendo no seu interior uma autoclave de bancada para descarte dos materiais.

6.3.c. MEDIDAS PARA SE EVITAR O ESCAPE DOS OGMs Todo o material somente poderá ser manipulado dentro da área designada e credenciada para esse fim. O acesso a esses locais é restrito aos responsáveis pela área. Quando finalizados os trabalhos todo o material deverá ser descartado e incinerado.

Para os trabalhos com OGMs do tipo II (classe de risco 2, que requerem NB-2), principalmente cultura de células de mamíferos na presença de lentivírus, será utilizada uma cabine de segurança biológica Classe II, localizada em sala especial, sempre que: (a) sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criação de aerossóis, como centrifugação, trituração, homogeneização, agitação vigorosa, ruptura por sonicação, abertura de recipientes contendo material onde a pressão interna possa ser diferente da pressão ambiental, inoculação intranasal em animais e em cultura de tecidos infectados; (b) altas concentrações ou grandes volumes de organismos contendo DNA/RNA recombinante. Tais materiais só poderão ser centrifugados fora de cabines de segurança se forem utilizadas

centrífugas de segurança e frascos lacrados. Estes só deverão ser abertos no interior da cabine de segurança biológica. 6.3.d. PROCEDIMENTOS EMERGENCIAIS EM CASO DE ACIDENTES RESULTANDO EM ESCAPE

DOS OGMs.

Todas as atividades com os OGMs serão realizadas nas instalações do Laboratório de Neurobiologia Molecular, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, bloco H, andar superior no IB/UNICAMP e com o acesso sendo possível apenas por 1 porta (existindo uma saída de emergência nos fundos do andar); caso ocorra escape dos mesmos para outras áreas do laboratório, os técnicos responsáveis farão a descontaminação com solução de etanol 70% seguida de solução de hipoclorito de sódio a 2%. O cloro é um desinfetante universal e eficaz contra todos os microorganismos. É um oxidante poderoso, com ação corrosiva sobre os metais. As soluções de hipoclorito de sódio perdem seu efeito progressivamente, por isso é necessário fazer a diluição imediatamente antes do uso.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• CARNEIRO-LOPES A.R. Manual de Biossegurança. Secretaria da Saúde do Estado da Bahia. Superintendência de Vigilância e Proteção da Saúde. Diretoria de Vigilância e Controle Sanitário. BRASIL. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde, 2001

• PIKE R.M. Laboratory-associated infections. Summary and analysis of 3921 cases. Health Lab. Sci., 13: 105-114, 1976.

• SEWELL D.L. - Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Micribiol. Rev., 8: 389-405, 1995.

• GERSHON R.M. and Zirkin B.G. - Behavioral factors in safety training. In D.O. Fleming, J.H. Richardson, J.I. Tulis, and D. Vesley (ed.),Laboratory Safety: principles and practices, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 269-277p. 1995.

• FLEMING D.O. 1995. Laboratory biosafety practices, p.203-218. In D.O. Fleming, J.H. Richardson, J.I. Tulis, and D. Vesley (ed.),Laboratory Safety:principles and practices, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

• NBR 12808 - Resíduos de Serviço de Saúde. Classificação. ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas, Janeiro de 1993.

• NBR 12809 - Manuseio de Resíduos de Serviço de Saúde. ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas, Fevereiro de 1993.

• Ministério do Meio Ambiente - Conselho Nacional do Meio Ambiente - Resolução número 5, de 5/8/93. D.O.U. Executivo de 31/8/93.

• Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. 4th edition, 1999.

ANEXO I SEGURANÇA EM RELAÇÃO AOS COMPOSTOS QUÍMICOS

As pessoas que trabalham em laboratórios de Biologia Molecular estão expostas não

apenas aos microorganismos, mas também aos perigos de natureza química.

ARMAZENAMENTO DOS COMPOSTOS QUÍMICOS

Guardar no próprio laboratório para uso diário somente quantidades mínimas dos compostos químicos. Os estoques maiores precisam ser guardados em salas, com piso de concreto e soleiras junto às portas, para reter o líquido eventualmente derramado. As substâncias inflamáveis devem ser guardadas separadamente, em prédio distante dos demais. Para evitar a ignição de vapores inflamáveis ou explosíveis pelas faíscas dos contatos elétricos, recomenda-se que os interruptores de luz sejam colocados na parede externa do prédio e que as lâmpadas tenham protetores.

Os compostos químicos não devem ser guardados por ordem alfabética para evitar que produtos químicos incompatíveis se encontrem próximos um do outro e que os compostos perigosos sejam guardados nas prateleiras altas. Todos os frascos grandes, assim como aqueles que contêm ácidos ou bases, precisam ser armazenados ao nível do piso e dentro de bandejas para reter as gotas. É preciso ter à mão carrinhos para o transporte dos frascos e dispositivos em sifão para passar o conteúdo dos grandes recipientes para as garrafas. As escadas dobráveis são indispensáveis nos locais em que existem prateleiras altas.

COMPOSTOS QUÍMICOS INCOMPATÍVEIS

Numerosos compostos químicos de uso freqüente em laboratório reagem de maneira perigosa quando entram em contato uns com os outros.

REGRA GERAL

As substâncias constantes da lista abaixo devem ser guardadas e manuseadas de maneira a evitar o contato acidental com as substâncias que constam da lista à direita.

• Sódio, potássio, cálcio, césio, lítio • Dióxido de carbono, hidrocarbonetos clorados, água

• Halogênios • Amônia, acetileno, hidrocarbonetos

• Ácido acético, sulfeto de hidrogênio, anilina, hidrocarbonetos, ácido sulfúrico

• Substâncias oxidantes, p. ex., ácido crômico, ácido nítrico, peróxidos, permanganatos.

EFEITOS TÓXICOS DOS COMPOSTOS QUÍMICOS

Sabemos atualmente que certos compostos químicos exercem ação nociva sobre a saúde das pessoas que os manejam ou que inalam os seus vapores. Além dos venenos conhecidos, existem numerosos produtos químicos, com efeito, tóxico. O aparelho respiratório, o sangue, os pulmões, o fígado, os rins e o trato gastrointestinal, assim como

outros órgão e tecidos, podem ser prejudicados ou sofrer lesões graves. Alguns compostos químicos são sabidamente carcinogênicos ou teratogênicos.

Os vapores de alguns solventes são tóxicos quando inspirados. Além dos efeitos mais sérios que acabamos de descrever, a exposição pode comprometer o organismo sem que apareçam efeitos imediatos sobre a saúde, mas o indivíduo pode vir a apresentar distúrbios da coordenação, sonolência ou sintomas semelhantes que o tornam mais propenso aos acidentes.

A exposição prolongada ou repetida à fase líquida de muitos solventes orgânicos é capaz de provocar lesões cutâneas. Essas podem ser devido à ação desengordurante, mas podem também surgir manifestações de natureza alérgica ou corrosiva.

O ANEXO II traz uma lista dos efeitos nocivos sobre a saúde, atribuídos a alguns dos compostos químicos mais usados no laboratório.

COMPOSTOS QUÍMICOS EXPLOSIVOS

Os nitretos não devem entrar em contato com o cobre, por exemplo, no esgoto ou nos encanamentos. O nitreto de cobre explode violentamente ao menor impacto.

O ácido perclórico, quando deixado secar sobre madeira, alvenaria ou tecido, explode e se incendeia ao impacto.

O ácido pícrico e os picratos são detonados pelo calor e pelo impacto mecânico.

A azida de sódio pode reagir com chumbo e cobre formando compostos de azida metálica altamente explosivos. Descarte com bastante água.

DERRAMAMENTO DE COMPOSTOS QUÍMICOS

A maioria dos produtores de compostos químicos para uso laboratorial costuma distribuir quadros que descrevem a maneira de lidar com os respingos e derramamentos dos diversos produtos químicos. Os quadros devem ser afixados em local apropriado. Os seguintes equipamentos devem estar disponíveis:

• trajes de proteção, tais como luvas de borracha grossa, pró-pés ou botas de borracha;

• pás para recolhimento do lixo;

• panos de esfregão e papel-toalha para o chão;

• baldes;

• soda cáustica ou bicarbonato de sódio para neutralização dos ácidos;

• areia;

• um detergente não inflamável.

O líquido derramado é neutralizado da seguinte maneira:

• ácidos e compostos químicos corrosivos: com soda cáustica ou com bicarbonato de sódio (recomenda-se diluir previamente, despejando-se cuidadosamente água em abundância).

• álcalis: cobrindo-os com areia seca.

As seguintes medidas devem ser adotadas sempre que ocorrer derramamento de um composto químico perigoso:

• Informe a CIPA e retire todo o pessoal não indispensável do local.

• Atenda as pessoas que podem ter se contaminado.

• Tratando-se de derramamento de substância inflamável, extinga todas as chamas abertas, desligue o gás na sala e nos recintos adjacentes e o equipamento elétrico capaz de produzir faíscas.

• Evite respirar o vapor do produto derramado.

• Ligue o ventilador do exaustor, desde que não haja perigo em fazê-lo.

• Providencie o equipamento necessário para limpar os locais contaminados pelo produto.

• Em caso de derramamento maciço de algum produto químico, recomenda-se evacuar a sala e, se possível, abrir as janelas. Se a substância derramada for inflamável, extinga todas as chamas abertas na sala onde ocorreu o acidente; desligue o equipamento elétrico capaz de provocar faíscas.

ANEXO II

COMPOSTOS QUÍMICOS: EFEITOS SOBRE A SAÚDE E PRIMEIROS SOCORROS

TABELA IIA: EFEITOS SOBRE A SAÚDE

(Continua)

TABELA IIB: AÇÕES IMEDIATAS

(Continua)

(continua)

(Continua)

ANEXO III

PROCEDIMENTOS EM CASO DE INCÊNDIO NO LABORATÓRIO

É indispensável que haja estreita colaboração entre os profissionais de segurança do Laboratório e os funcionários do serviço local de bombeiros. Além dos perigos decorrentes da presença de compostos químicos, é preciso considerar também os efeitos do fogo na possível disseminação do material infeccioso. Essas considerações determinam a eventual atitude de “burn out”, isto é, determinam se é preferível extinguir o fogo ou apenas limitá-lo.

O treinamento da equipe nas medidas de prevenção do incêndio, nas primeiras medidas a serem adotadas em caso de fogo e no uso correto do equipamento para a sua extinção, é feito pelo Corpo de Bombeiros local.

Os alertas contra incêndio, as instruções pertinentes e os caminhos de saída precisam estar indicados em lugar visível em cada uma das salas, bem como nos corredores.

As causas mais frequentes dos incêndios que se observam no laboratório são as seguintes:

• sobrecarga da rede de eletricidade;

• falta de manutenção da rede elétrica;

• canos de gás e cabos de eletricidade demasiado compridos;

• equipamento que permanece ligado sem necessidade;

• chamas abertas;

• encanamento de gás defeituoso;

• uso indevido de fósforos;

• falta de cuidado ao lidar com substâncias inflamáveis;

• guarda de compostos químicos inflamáveis ou explosivos dentro do refrigerador comum.

O Departamento de Genética e Evolução consta com extintores de água e dióxido de

carbono localizados em 4 pontos distintos do corredor central.

A vida útil desses extintores está indicada nas etiquetas coladas nos mesmos, bem como a inspeção e manutenção dos mesmos. O seu uso consta no quadro a seguir.

Tabela A- Tipos de extintores de incêndio e seu uso

(a) Os extintores à base de água usam o CO2 como propulsor. É preciso ter cuidado com os extintores à base de CO2 em pó, visto que a força do seu jato é capaz de disseminar os materiais incendiados.

PERIGOS DA ELETRICIDADE

O choque elétrico coloca a vida em risco. Os defeitos da rede de eletricidade podem provocar incêndio. Portanto, é indispensável que todas as instalações elétricas e o equipamento elétrico sejam inspecionados e examinados a intervalos regulares (com inclusão da ligação térrea) e que essa manutenção fique a cargo de um eletricista qualificado. A equipe do laboratório não deve procurar consertar qualquer tipo de equipamento elétrico.

A voltagem da rede varia de um país para outro, mas, mesmo as voltagens mais baixas, podem acarretar perigo. É preciso ter sempre o cuidado de colocar os fusíveis certos entre o equipamento e a rede. O circuito elétrico do laboratório deve ter interruptores de circuito e interruptores para o caso de falhar a ligação térrea.

NOTA: Os interruptores de circuito não protegem as pessoas. Sua finalidade consiste em proteger os cabos de eletricidade contra o aquecimento excessivo e, portanto, em prevenir o incêndio. Os interruptores que desligam a corrente em caso de falha da ligação térrea têm a finalidade de proteger as pessoas contra o choque elétrico.

Todo equipamento elétrico do laboratório deve ter ligação térrea, de preferência mediante plugues de três pinos. A rede não ligada à terra pode transmitir a corrente elétrica em conseqüência de alguma falha despercebida.

Todo equipamento elétrico do laboratório deve ser de acordo com as normas nacionais de segurança para materiais elétricos e com aquelas da Comissão Internacional de Eletrotécnica.

A equipe do laboratório deve ter conhecimento dos seguintes perigos:

• superfícies úmidas ou molhadas perto do equipamento elétrico;

• cabos elétricos compridos e flexíveis;

• cabos com isolamento precário ou gasto;

• sobrecarga da rede, devido ao uso de adaptadores;

• equipamento capaz de produzir faíscas nas imediações de substâncias ou vapores inflamáveis;

• equipamento elétrico ligado sem ninguém para vigiá-lo;

• uso de extintor errado (água ou espuma em lugar de CO2) no combate ao fogo causado pela eletricidade.

ANEXO IV CONTATOS EM CASO DE EMERGÊNCIA

Contatos em caso de emergência

3521-6000

Segurança do Campus

193

Corpo de Bombeiros

190

Polícia Militar

Celular - (11) 8910-5436

Fabio Papes (chefe do lab.)

Casa – (11) 4816-6722

Celular - (19) 9223-4316

Gonçalo A. G. Pereira (chefe do depto)

Casa – (19) 3289-3336