malaria_diag_manual_final.pdf

Ministrio da Sade

BRASLIA / DF

Manual de Diagnstico Laboratorial da Malria

Ministrio da SadeSecretaria de Vigilncia em Sade

Departamento de Vigilncia Epidemiolgica e Diretoria Tcnica de Gesto


Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

Braslia / DF

2005. Ministrio da Sade

Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer m comercial.

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

1a edio 2005 tiragem: 3.000 exemplares

Elaborao, distribuio e informaes

MINISTRIO DA SADE

Secretaria de Vigilncia em Sade

Esplanada dos Ministrios, bloco G,

Edifcio Sede, 1 andar, sala 134

CEP: 70058-900, Braslia - DF

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Elaborao

Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

Diretoria Tcnica de Gesto

Produo Ncleo de Comunicao

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Ficha Catalogrca

Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade.

Manual de diagnstico laboratorial da malria / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia : Ministrio da Sade, 2005.

112 p. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos)

ISBN 85-334-0974-5

1. Malria. 2. Tcnicas e procedimentos de laboratrio. 3. Vigilncia epide-miolgica. I. Ttulo. II. Srie.

NLM WC 765

Catalogao na fonte Editora MS OS 2005/0626

Ttulos para indexao:

Em ingls: Manual of Malaria Laboratory Diagnosis

Em espanhol: Manual de Diagnstico Laboratorial de Malaria

Sumrio

APRESENTAO 5

CAPTULO 1 CONSIDERAES GERAIS SOBRE A MALRIA 7

1 Ciclo biolgico do parasito no homem 102 Ciclo biolgico do parasito no mosquito 11 3 Transmisso da malria 144 Epidemiologia 145 Manifestaes clnicas 16

CAPTULO 2 FUNDAMENTOS DO DIAGNSTICO LABORATORIAL DA MALRIA 17

1 A importncia do laboratrio no diagnstico da malria 19

2 Medidas de biossegurana 193 O exame microscpico 20

CAPTULO 3 A PESQUISA DE PLASMDIO PELA MICROSCOPIA 27

1 O preparo da gota espessa 292 O preparo do esfregao delgado 32

CAPTULO 4 COLORAO DAS LMINAS 37

1 Preparo de corantes e diluentes 392 Tcnica de colorao das lminas 403 Avaliao da qualidade de colorao da

gota espessa 424 Avaliao da qualidade de colorao do

esfregao 43

CAPTULO 5 CARACTERSTICAS DAS DIFERENTES ESPCIES DE PLASMDIOS ENCONTRADOS NO SANGUE PERIFRICO 45

1 Plasmodium falciparum 47 2 Plasmodium vivax 48 3 Plasmodium malariae 49 4 Plasmodium ovale 50

CAPTULO 6 COLORAO DAS GRANULAES DE SCHFFNER 51

CAPTULO 7 MTODOS DE QUANTIFICAO DA PARASITEMIA 57

1 Mtodo tradicional de avaliao semiquantitativa (em cruzes) 59

2 Mtodo de avaliao quantitativa pela contagem de 100 campos microscpicos 59

3 Estimativa da parasitemia a partir da avaliao semiquantitativa 60

4 Mtodo de avaliao relativa contagem de leuccitos por campo 60

5 Mtodo de avaliao pelo percentual de hemcias parasitadas (utilizado apenas para esfregao delgado) 61

CAPTULO 8 REGISTROS DE RESULTADOS DO EXAME MICROSCPICO 63

1 Resultados positivos 65 2 Resultados negativos 66

CAPTULO 9 TESTES RPIDOS PARA O DIAGNSTICO DE MALRIA 67

1 Testes exclusivos para o diagnstico de P. falciparum 69

2 Testes que discriminam o P. falciparum de outras espcies 70

3 Diagnstico pela deteco do DNA do parasito 70

CAPTULO 10 ELEMENTOS FIGURADOS NORMAIS DO SANGUE 71

1 Eritrcitos ou hemcias (glbulos vermelhos) 732 Leuccitos (glbulos brancos) 733 Plaquetas (trombcitos) 734 Importncia da avaliao dos elementos

normais do sangue 74

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 75

ANEXOS 79

1 Relao de material para laboratrio de malria 81

2 Imagens das diferentes espcies de plasmdios em esfregao e gota espessa 83

3 Doena de Chagas Aguda 1044 Normas de organizao e funcionamento

do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica Sislab 108

5 Relao dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen 110

EQUIPE DE ELABORAO 116

Apresentao

Em todo o mundo, a malria continua a ser um dos mais relevantes problemas de sade pblica e em nosso pas tambm persiste como uma das principais questes, em especial na regio Amaznica, que registra cerca de 90% dos casos e onde a transmisso da doena est diretamente relacionada s condies ambientais e socioculturais. Mas na regio extra-amaznica que a malria apresenta maior letalidade, seja devido ao diagnstico tardio, seja por manejo clnico inadequado dos casos espordicos importados de reas endmicas ou mesmo autctones em poucos estados.

A partir da descentralizao das aes de vigilncia epidemiolgica, preveno, diagnstico e controle da malria, o Ministrio da Sade vem for-talecendo o nvel local mediante o repasse de recursos nanceiros e humanos, aumentando a capacidade de os estados e municpios responderem de forma oportuna e eciente aos desaos enfrentados no controle da doena.

Como parte desse processo e objetivando contribuir na capaci-tao de novos prossionais para o diagnstico da malria, bem como atualizar os tcnicos de laboratrios da rede de sade j envolvidos com o seu diagnstico, a Secretaria de Vigilncia em Sade (SVS), do Ministrio da Sade, apresenta este Manual de diagnstico laboratorial da malria elabo-rado pela Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica (CGLAB), em conjunto com a Coordenao Geral do Programa Nacional de Controle da Malria (CGPNCM).

A divulgao desta publicao visa aumentar a efetividade da vigilncia epidemiolgica na regio Amaznica e prevenir a ocorrncia da doena nas reas no-endmicas ou de baixa endemicidade. Em sua leitura, os prossionais encontraro informaes tcnicas sobre a coleta e proces-samento das amostras para diagnstico, alm de um acervo de guras que facilitar a identicao do parasito.

Espera-se que sua utilizao, por meio da educao continuada dos prossionais da rede de sade pblica e privada do Pas, efetivamente contribua para a reduo da morbimortalidade da malria.

Jarbas Barbosa da Silva JniorSecretrio de Vigilncia em Sade

CONSIDERAES GERAIS SOBRE A MALRIA

Captulo

1


Secretaria de Vigilncia em Sade / MS | 9

A malria, mundialmente um dos mais srios problemas de sa-de pblica, uma doena infecciosa causada por protozorios do gnero Plasmodium e transmitida ao homem por fmeas de mosquitos do gnero Anopheles, produzindo febre, alm de outros sintomas. Quatro espcies de plasmdio podem causar a doena: P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (essa, de transmisso natural apenas na frica).

A malria, importante doena parasitria h sculos apesar das aes de controle implantadas h dcadas em muitas partes do mundo , tambm conhecida como impaludismo, febre palustre, maleita e sezo.

Dados da Organizao Mundial da Sade (OMS) mostram que seu impacto sobre as populaes humanas continua aumentando: ocorre em mais de 90 pases, pondo em risco cerca de 40% da populao mundial estima-se que ocorram de 300 a 500 milhes de novos casos, com mdia de um milho de mortes por ano. Representa, ainda, risco elevado para viajantes e migrantes, com casos importados em reas no-endmicas.

Por esses motivos, a OMS recomenda que seu diagnstico precoce e tratamento rpido devem ser os primeiros elementos bsicos estabelecidos em qualquer programa de controle.

No Brasil, o maior nmero de casos registrado na regio Amaz-nica, cujas condies ambientais e socioculturais favorecem a expanso de sua transmisso.

Em 2003, 407.691 casos da doena foram noticados na Amaz-nia Legal (diviso poltica do territrio nacional que engloba nove esta-dos: Amaznia, Acre, Amap, Maranho, Mato Grosso, Par, Rondnia, Roraima e Tocantins). Pela intensidade da transmisso destacaram-se os estados do Amazonas, Rondnia e Par, responsveis por 50% da totali-dade dos casos de malria no pas, com uma incidncia parasitria anual, respectivamente, de 46,3/1.000 habitantes, 64,4/1.000 habitantes e 17,6/1.000 habitantes. Em toda a Amaznia, as infeces causadas pelo P. vivax (79%) prevaleceram sobre as do P. falciparum (21%).

Desde 1993, por recomendao da Conferncia Ministerial de Amsterd (outubro, 1992), o Brasil utiliza a Estratgia Global de Controle Integrado da Malria uma ao conjunta e permanente do governo e da sociedade, dirigi-da para a eliminao ou reduo do risco de adoecer ou morrer de malria.

Essa estratgia objetiva diminuir a morbimortalidade e reduzir as per-das sociais e econmicas provocadas pela malria, mediante o fortalecimen-

Manual de Diagnstico Laboratorial da Malriaa

10 | Secretaria de Vigilncia em Sade / MS

to dos nveis regional e local de ateno sade. Esses objetivos devero ser alcanados pelo diagnstico precoce e preciso e tratamento imediato e ecaz dos casos. Para tanto, deve-se aproveitar o pessoal tcnico existente na rede de sade sucientemente treinado e as instalaes disponveis nos servios de sade locais (pblicos e privados), de modo que cada unidade seja um ponto de vigilncia e atendimento malria.

Tradicionalmente, o diagnstico da doena feito pela visualizao microscpica do plasmdio em exame da gota espessa de sangue, corada pela tcnica de Giemsa ou de Walker. Apesar de a microscopia ser consi-derada o padro-ouro para o diagnstico e monitoramento do tratamento da malria, essa tcnica exige pessoal treinado e experiente no exame de distenses sangneas.

Recentemente, novas tcnicas cientcas esto sendo empregadas para desenvolver diagnsticos simples, ecazes e passveis de realizao fora do laboratrio, destacando-se os testes imunocromatogrcos rpidos cuja indicao ainda limitada para reas de difcil acesso ou baixa prevalncia.

Sabendo-se que a chave para a reduo da taxa de mortalidade o diagnstico precoce e uma terapia ecaz, espera-se que a utilizao desses tes-tes possibilite diagnsticos rpidos nas comunidades locais, assegurando o tratamento imediato e adequado para prevenir a disseminao da doena.

1. Ciclo biolgico do parasito no homem

O ciclo assexuado do plasmdio, denominado esquizognico, inicia-se aps a picada do anofelino, com a inoculao de esporozotos infectantes no ho-mem. A seguir, os esporozotos circulam na corrente sangnea durante alguns minutos e rapidamente penetram nas clulas do fgado (hepatcitos), dando in-cio ao ciclo pr-eritroctico ou esquizogonia tecidual, que dura seis dias para a espcie P. falciparum, oito dias para a P. vivax e 12 a 15 dias para a P. malariae. Durante esta fase, o P. vivax e o P. ovale apresentam desenvolvimento lento de alguns dos seus esporozotos, formando os hipnozotos, formas latentes (dor-mentes) do parasito responsveis pelas recadas da doena meses ou anos aps.

Ao nal do ciclo tecidual, os esquizontes rompem o hepatcito, liberando milhares de elementos-lhos na corrente sangnea, chamados merozotos. Ressalte-se que cada hepatcito rompido libera cerca de 2.000 merozotos quando a infeco devida ao P. malariae;10.000, quando de-vida ao P. vivax e 40.000, quando devida ao P. falciparum. Os merozotos



iro invadir as hemcias, dando incio ao segundo ciclo de reproduo assexuada dos plasmdios: o ciclo sangneo ou eritroctico. O P. malariae s invade hemcias velhas (0,1% do total), o P. vivax invade preferencialmente as hemcias jovens e o P. falciparum, hemcias em qualquer fase evolutiva.

Durante um perodo que varia de 48 a 72 horas, o parasito se desen-volve no interior da hemcia at provocar a sua ruptura, liberando novos merozotos que iro invadir novas hemcias. A ruptura e conseqente libe-rao de parasitos na corrente sangnea traduz-se clinicamente pelo incio do paroxismo malrico, que se repetir com o trmino do novo ciclo (em dois dias, quando a infeco for devida ao P. falciparum ou P. vivax e em trs dias, quando devida ao P. malariae).

Inicialmente, no ciclo sangneo, o parasito sofre uma srie de trans-formaes morfolgicas sem diviso celular at chegar a fase de esqui-zonte, quando se divide e origina novos merozotos que sero lanados na corrente sangnea, aps a ruptura do eritrcito. Assim, no exame micros-cpico do sangue pode-se observar variada morfologia do parasito trofo-zotos jovens (anis), trofozotos maduros, formas irregulares, esquizontes jovens e esquizontes maduros (Figuras 1 e 2).

Aps um perodo de replicao assexuada, alguns merozotos se diferenciam em gametcitos machos e fmeas, que amadurecem sem divi-so celular e tornam-se infectantes aos mosquitos. A funo desses gamet-citos reprodutiva, isto , garantir a perpetuao da espcie. Eles podem ser de dois tipos, diferenciados microscopicamente nos esfregaos sangneos: os microgametcitos (masculinos) e os macrogametcitos (femininos).

2. Ciclo biolgico do parasito no mosquito

A reproduo sexuada (esporognica) do parasito da malria ocorre no estmago do mosquito, aps a diferenciao dos gametcitos em gametas e a sua fuso, com formao do ovo (zigoto). Este se transforma em uma forma mvel (oocineto) que migra at a parede do intestino mdio do inseto, formando o oocisto, no interior do qual se desenvolvero os esporozotos. O tempo reque-rido para que se complete o ciclo esporognico nos insetos varia com a espcie de Plasmodium e com a temperatura, situando-se geralmente em torno de 10 a 12 dias. Os esporozotos produzidos nos oocistos so liberados na hemolinfa do inseto e migram at as glndulas salivares, de onde so transferidos para o sangue do hospedeiro humano durante o repasto sangneo.



FIGURA 1 CICLO BIOLGICO DO PLASMODIUM VIVAX

ESPOROGONIA

OOCISTO

ESTMAGO

OOCINETO

ESPOROZOTO

GL

ND

ULA

SA

LIVA

R

MOSQUITO

ESPOROZOTO

TROFOZOTO

HIPNOZOTO

HOMEM

MACROGAMETCITO MICROGAMETCITOG

AM

ETO

GN

ESE

ESQUIZONTE

MEROZOTO

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MEROZOTOTROFOZOTO

ESQUIZONTE

FORMASEM

ANEL

TROFOZOTO

ESQUIZONTE

SEGMENTADO

ESQUIZOGONIAERITROCTICA

(SANGUE)

ESQUIZOGONIA

FONTE: DPDx:CDC s Web site for parasitology identification



FIGURA 2 O CICLO DE VIDA DO PLASMDIO

HOMEM COM GAMETCITOS

NO SANGUE

MACRO EMICROGAME-TCITOS SO INGERIDOS

PELO ANOFELINO

UM MICROGA-META

FECUNDA UM MACROGAMETA

MICROGAME-TCITOS NO

ESTMAGO DO MOSQUITO GERAM

VRIOS MICRO-GAMETAS POR

EXFLAGELAO

OVO MVEL OU OOCINETO

ENCISTAMENTO DO OVO QUE MI-

GRA AT A PAREDE DO INTESTINO

MDIO DO MOS-QUITO: OOCISTO

FORMAO DE ESPOROZOTOS

DENTRO DO OOCISTO

HEPATCITOS CRESCEM E FORMAM

MILHARES DE MEROZOTOS

ESPOROZOTOS ATINGEM

OS HEPATCITOS

ROMPIMENTO DO

OOCISTO QUE LIBERA

MILHARES DE ESPOROZOTOS

QUE SE DISSEMINAM POR TODO O MOSQUITO

CHEGANDO S GLNDULAS SALIVARES DO MESMO

ROMPIMENTO DO HEPATCITO COM LIBERAO DOS

MEROZOTOS

MEROZOTOS PENETRAM NAS

HEMCIAS FORMANDO TROFO-

ZOTOS JOVENS

TROFOZOTOAMEBIDE

FORMAO DE GAMETCITOS PARA INFECTAR

OUTRO MOSQUITO

ROSCEA

ESQUIZONTE

ANOFELINO FAZ NOVO REPASTO INOCULANDO

O ESPOROZOTO EM NOVO

HOSPEDEIRO

MACROGA-METCITOS

AMADURECEM NO ESTMAGO

DO MOSQUITO, GERANDO O

MACROGAMETA

FORMAO DO OVO OU ZIGOTO

ROMPIMENTO DA ROSCEA LIBERANDO

MEROZOTOS QUE IRO

INVADIR NOVAS HEMCIAS



3. Transmisso da malria

O perodo de transmissibilidade natural da malria est ligado existncia de portadores de gametcitos (reservatrios humanos) e de veto-res. Existem centenas de espcies de anofelinos com potencial de transmitir a malria. No Brasil, cerca de cinco espcies so importantes: Anopheles (N) darlingi, A. (N) aquasalis, A. (N) albitarsis, A. (K) cruzi e A. (K) bellator. Costumeiramente, esses insetos evoluem em guas limpas e sombreadas de remansos de rios, crregos, igaraps, lagoas, represas, audes, valetas de ir-rigao, alagados e pntanos. Por sua vez, a subespcie Kertesia desenvolve-se em guas acumuladas pelas bromeliceas, conhecidas no Sul pelo nome de gravats.

A malria pode ser transmitida acidentalmente por transfuso de sangue (sangue contaminado com plasmdio), pelo compartilhamento de seringas (em usurios de drogas ilcitas) ou por acidente com agulhas e/ou lancetas contaminadas. H, ainda, a possibilidade de transmisso neonatal.

4. Epidemiologia

A transmisso da malria est condicionada a determinados fato-res que permitem no s o surgimento de novas infeces como tambm a perpetuao do agente causal. Os primeiros so chamados fatores principais ou primrios, cuja presena essencial para a existncia da infeco, con-sistindo da interao dos trs seguintes fatores: o parasito, o hospedeiro hu-mano e o vetor. H tambm os fatores secundrios, que atuam favorecendo ou dicultando a transmisso.

No Brasil, a grande extenso geogrca da rea endmica e as con-dies climticas favorecem o desenvolvimento dos transmissores e agentes causais da malria pelas espcies de P. vivax, P. falciparum e P. malariae (este ltimo com menor freqncia). Especialmente na Amaznia Legal, a transmisso instvel e geralmente focal, alcanando picos principalmente aps o perodo chuvoso do ano.

A partir das informaes sobre a ocorrncia de malria em deter-minada rea e tempo, possvel, de acordo com o perl epidemiolgico de transmisso, classicar a regio em rea hiperendmica, mesoendmica ou hipoendmica. H ainda as reas holoendmicas, onde a transmisso pe-rene e o grau de imunidade da populao alto, permitindo a existncia de portadores assintomticos.



No Brasil, onde a transmisso da malria no completamente estvel, de acordo com a incidncia parasitria anual (IPA) costuma-se classicar as reas endmicas como de alto risco (IPA>50/1.000 hab.), mdio risco (IPA entre 10-49/1.000 hab.) e baixo risco (IPA 49,9 (ALTO RISCO - 76 MUNICPIOS)



5. Manifestaes clnicas

Os sintomas da malria envolvem a clssica trade febre, calafrio e dor de cabea. Sintomas gerais como mal-estar, dor muscular, sudorese, nusea e tontura podem preceder ou acompanhar a trade sintomtica. Contudo, esse quadro clssico pode ser alterado pelo uso de drogas pro-lticas ou aquisio de imunidade, e muitos desses sintomas podem ou no estar presentes e at mesmo todos podem estar ausentes. Nos casos compli-cados, podem ainda ocorrer dor abdominal forte, sonolncia e reduo da conscincia podendo levar ao coma nos casos de malria cerebral.

A ausncia de parmetros clnicos especcos que permitam conr-mar a infeco justica a necessidade de mtodos laboratoriais para o diag-nstico da malria. Alm disso, a presena da parasitemia no se relaciona com as manifestaes clnicas, isto , no h associao entre pico febril e positividade do exame microscpico.

Embora os ciclos evolutivos das espcies causadoras sejam similares, do ponto de vista patolgico a infeco malrica apresenta diferenciaes que podem determinar as variaes na evoluo clnica da doena. A in-feco de indivduos no imunes pelo P. falciparum pode resultar em forma grave e complicada, caracterizada pelo acometimento e disfuno de vrios rgos ou sistemas: sistema nervoso central, sistema hematopoitico, apare-lho respiratrio, fgado, sistema circulatrio, rins e coagulao sangnea. Assim, todo paciente portador dessa espcie de plasmdio deve merecer ateno especial, de modo a receber tratamento imediato, essencial para prevenir tais complicaes.

FUNDAMENTOS DO DIAGNSTICO LABORATORIAL DA MALRIA

Captulo

2



1. A importncia do laboratrio no diagnstico da malria

A associao de critrios clnicos e epidemiolgicos muito impor-tante para a suspeio da doena, isto , a presena de sintomatologia geral em paciente procedente de rea sabidamente malargena obrigatoriamente indica a solicitao do exame laboratorial conrmatrio da infeco.

Tradicionalmente, o diagnstico conrmatrio da malria feito pelo exame microscpico do sangue, necessitando de material e reagen-tes adequados, bem como de tcnicos bem treinados para sua realizao, objetivando a deteco e diferenciao das espcies de plasmdios.

O exame microscpico do sangue pode ser feito em esfregao delgado (distendido) ou espesso (gota espessa). A gota espessa corada pela tcnica de Walker (azul de metileno e Giemsa) e o esfregao delgado corado pelo Gie-msa, aps xao com lcool metlico. Alm do baixo custo, ambas permitem identicar, com facilidade e preciso, a espcie do plasmdio. Esses mtodos tambm possibilitam quanticar a intensidade do parasitismo, mediante a determinao da parasitemia por volume (l ou mm3) de sangue. Na prtica, o mtodo da gota espessa o mais utilizado, uma vez que a concentrao do sangue por campo microscpico favorece o encontro do parasito.

Nos ltimos anos, mtodos alternativos e/ou complementares ao exa-me da gota espessa tm sido disponibilizados. Com alto custo e ainda no completamente validados para uso em campo, so mtodos de diagnsticos sensveis e especcos e tm a vantagem de serem rpidos e de fcil execuo.

Entre as propostas hoje disponveis para o breve diagnstico da malria, destacam-se os testes imunocromatogrcos cujos principais produtos comerciais so posteriormente descritos.

2. Medidas de biossegurana

Por ser um procedimento que envolve sangue, o diagnstico labora-torial da malria requer muita ateno s regras de biossegurana. Assim, no ato da coleta de sangue, preparao/colorao das lminas e descarte de material contaminado deve-se observar atentamente todas as medidas de preveno de contaminao individual e coletiva, a saber:

a) Lavar as mos antes e aps o contato com o paciente;

b) Usar luvas de ltex descartveis;


c) Usar jaleco de mangas compridas, com punho elstico;d) Usar recipientes duros para descartveis perfurantes (lancetas e

agulhas usadas) e lminas desprezadas;e) Usar sacos apropriados para o lixo sanitrio.

3. O exame microscpico

Componentes pticos e mecnicos do microscpio

Existem diversos tipos de microscpios, dependendo da funo para a qual se destinam. Nos programas de controle de endemias o mais utilizado o tipo bacteriolgico, binocular, com sistema de iluminao incorporado e regulvel.

O microscpio tem uma parte mecnica com os seguintes compo-nentes: brao ou estativa, ao qual esto ligados o mecanismo coaxial e bila-teral de focalizao macro/micromtrica (parafuso de correo diptrica), o revlver ou porta-objetivas, o corpo binocular com ajuste interpupilar, o diafragma-ris, o parafuso do condensador, o parafuso de avano lateral-frontal do carro ou charriot, o porta-ltro, a presilha ou garra de lmina, a platina e a base ou p do equipamento (Figura 4). H uma parte situa-da acima da platina e que corresponde ao sistema para aumento e resolu-o, composta por prismas, lentes oculares e objetivas. Outra parte, abaixo da platina, serve para a iluminao, possuindo fonte de luz incorporada e regulvel ou sistema convencional com espelho.

Geralmente, o microscpio equipado com um ou dois pares de len-tes oculares para ampliao de 10 vezes (10x) e/ou 7x. O corpo binocular possui prismas que, aps realizado o ajuste da distncia interpupilar, levam a imagem ao observador.

As objetivas formam a imagem dos objetos aumentadas pelas lentes oculares, adaptadas numa pea circular chamada revlver. So em nme-ro de quatro e proporcionam aumentos de 4x, 10x, 40x e 100x (este ltimo necessita de imerso em leo adequado). A ampliao nal da imagem o resultado do produto das ampliaes produzidas pelas oculares e objetivas. Por exemplo, 7x (na ocular) multiplicado por 4x (na objetiva) gera uma am-pliao de 28 vezes.

O aumento total obtido com o microscpio binocular, quando do uso da objetiva de imerso de 100x, pode variar de 500x a 1.500x, dependendo das lentes oculares empregadas e do fator de aumento do corpo binocular.

Manual de Diagnstico Laboratorial de Malria - fundamentos do diagnstico laboratorial da malria



Existindo o fator de aumento do corpo binocular, multiplica-se o produto acima por esse nmero; no existindo, considera-se como sendo de 1x.

A experincia tem demonstrado que a clareza de detalhes ou nitidez da microscopia pode diminuir quando se ultrapassa o ponto timo de aumento com a ocular, razo pela qual os programas de diagnstico e controle da malria vm utilizando a lente ocular de 7x para a pesquisa do plasmdio.

O aumento obtido com oculares de 10x, objetiva de 100x e fator de 1x (resultando em ampliao de 1000x) o mais utilizado na rotina dos laboratrios das unidades de sade apesar de no ser o mais adequado para diagnosticar a malria.

A utilizao de objetiva de imerso de 60x recomendvel pois per-mite observar maior nmero de elementos normais do sangue e de parasitos por campo microscpico, sendo muito til para a reviso do diagnstico microscpico.

O processo de iluminao do microscpio

O grau de claridade e nitidez do campo microscpico recebe a denominao de resoluo microscpica. A pesquisa do plasmdio exige alto grau de claridade e nitidez para o reconhecimento dos pequenos parasitos da malria numa gota espessa desemoglobinizada. Em geral, pequenas estrutu-ras e outros microrganismos, aps corados, so facilmente identicveis num fundo de cor contrastante. Para o diagnstico da malria, entretanto, a ilumi-nao deve produzir um fundo de preparao to claro e limpo quanto poss-vel, para que contra o mesmo sejam realados os minsculos corpos de 0,5 a 2,0 micra de dimetro, corados de vermelho (ncleo) e azul (citoplasma).

Existem duas formas de iluminao do campo microscpico: a na-tural e a embutida. A iluminao natural, com luz do dia recurso til para locais que no dispem de iluminao eltrica , feita atravs de um espelho de dupla face (cncava e plana) situado na base do equipamento; a iluminao embutida feita por aparelho dotado de transformador de baixa voltagem e intensidade varivel (110/220V), cujas lmpadas devem ser halgenas (6V-20 W ou 12V-20W ou 6V- 30W).



O campo microscpico ou campo de imerso deve estar uniformemente iluminado com luz branca, ligeiramente azulada. O microscpio, a lmpada e os ltros devem ser dis-postos de modo a obter o mximo de luz possvel que pode ser diminuda vontade do microscopista, com o auxlio do reostato, diafragma-ris ou levantando-se ou abaixando-se o condensador.

FIGURA 4 MICROSCPIO BINOCULAR BACTERIOL-GICO

Correo diptrica e

ajuste da parfocalidade

Revlver ou porta- objetivas

Objetivas

Platina

Condensador ABBE

Diafragma de abertura

Porta-ltroAlavanca de pr-

focalizao automtica

Ajuste vertical do condensador

Lentes colimadoras

Lmpada de baixa voltagem

(halognio ou tungstnio)

Base

Interruptor principal

Oculares de campo amplo

Ajuste interpupilar

Cabeote binocular de observao

PrismasEstativa

Garra de lmina

Charriot

Controles coaxiais do Charriot

Anel de ajuste da tenso do movimento macrom-trico

Controle deslizante para variao da intensidade de luz

Boto macro-mtrico

Boto micromtrico

FONTE: FAC-SMILE DE CATLOGO DE EQUIPAMENTOS PTICOS



Para se obter o mximo de ecincia do condensador quando da utilizao de microscpio de iluminao com espelho, usar somente a face plana do mesmo.

As superfcies das lentes oculares expostas ao ar so revestidas por uma pelcula azulada anti-reexo, reduzindo ao mximo a disperso da luz, o que requer menos luz do que as lentes no tratadas. As superfcies assim revestidas, quando vistas com luz incidente, podem ser distinguidas pela cor azul-violeta.

Tcnica de utilizao do microscpio

Colocar a lmina entre as presilhas da platina mecnica, verican-do se cou rmemente presa barra mvel da mesma.

Ajustar a posio da lmina de modo que uma rea do material coincida com o orifcio de iluminao da platina.

Regular o sistema de iluminao do microscpio, fechando um pouco o diafragma-ris ou abaixando o condensador. Regular a intensidade da luz atravs do reostato ou do balo de vidro, se for o caso.

Colocar a objetiva de 10x na posio e fazer a focalizao com o boto macromtrico at que surjam os leuccitos. Ajustar o foco com o boto micromtrico.

Examinar com a objetiva at encontrar uma rea com maior nmero de leuccitos, bem corados.

Uma vez localizada a rea adequada, colocar uma gota de leo de imerso no centro da rea iluminada.

Girar o revlver, colocando a objetiva de imerso (100x) em posio. Levantar o condensador e abrir o diafragma-ris.

Inclinar a cabea para um lado, para melhor visualizao das obje-tivas, e usar o boto macromtrico para levantar a platina at que a objetiva toque de leve o leo de imerso.

Aproximar os olhos das lentes oculares e, com o auxlio do boto macromtrico, focalizar o material at o aparecimento dos leucci-tos, completando a focalizao com o boto micromtrico.

Examinar os campos microscpicos mais corados, movimentando os parafusos de avano frontal e lateral do carro (charriot) com a mo di-reita e o boto micromtrico com a esquerda (Obs: alguns microscpios so fabricados com esses dispositivos em posio invertida).

Rever os aspectos morfolgicos dos elementos gurados do sangue (leuccitos e plaquetas na gota espessa ou leuccitos, hemcias e pla-quetas no esfregao delgado), para avaliar a qualidade da colorao



(Anexo 2 Imagens das diferentes espcies de plasmdios em esfregao e gota espessa). Os espaos entre os leuccitos devem ser claros, com ligeiro tom azulado.

Proceder o exame microscpico do material para deteco dos pa-rasitos da malria.

Quando completar o exame, baixar a platina, retirar a lmina e registrar o resultado.

Colocar a lmina invertida sobre o papel absorvente, para posterior limpeza sem atrito do material. No usar xilol nem tolueno para a remoo do leo de imerso.

Aps a limpeza do leo de imerso, acondicionar as lminas em pa-pel adequado e arquiv-las em local prprio, para futuras revises.

Cuidados com o microscpio

Ao iniciar o trabalho, limpar as superfcies superiores das lentes oculares e inferiores das objetivas, condensador e espelho (caso exista) com papel macio e absorvente. O p depositado na parte interna dos tubos do corpo binocular pode ser removido com jatos de ar produzidos por uma pra de borracha.

No usar solventes como lcool, xilol ou tolueno para a limpeza dos componentes do equipamento. O leo mineral facilmente remo-vido por papel absorvente, passado sobre a lente de imerso.

A parte mecnica pode ser limpa com anela. A lubricao dos sistemas mecnicos (cremalheiras) feita com vaselina, no sendo recomendvel utilizar leo.

No desmontar as objetivas, oculares, corpo binocular e o sistema macro/micromtrico de focalizao, para no desregular o equipa-mento.

Manter o microscpio sempre limpo e, aps o uso, conserv-lo sob uma capa plstica e/ou na caixa original, sempre com um saco de slica-gel para proteo contra a umidade.

Em reas de elevada umidade, como a Amaznia, a utilizao de estufas de madeira, dotadas de uma lmpada de 25 watts constan-temente acesa (que garante uma temperatura entre 30C e 60C), mais eciente que o uso da slica e ideal para impedir o desenvolvi-mento de fungos no sistema tico do microscpio.



Transportar, sempre, o microscpio pela estativa (brao), com apoio da mo sob a base, e nunca pelos parafusos.

Limpeza e cuidado das lminas

Lminas novas

Retirar as lminas da caixa e coloc-las uma a uma num recipiente com lcool a 70%

Deixar em repouso por 24 horas Enxugar uma a uma, com toalha limpa Fazer pacotes com 10 unidades, identicar as lminas novas e

colocar a data

Obs: Nunca utilizar lmina que aps ter sido seca apresente vestgios de oxidao.

Lminas usadas

Preparar soluo contendo 4 colheres (de sopa) de gua sanitria comercial para cada litro de gua

Adicionar cerca de 50g (1 colher de sopa, cheia) de sabo em p a cada litro da soluo acima onde sero mergulhadas as lminas usadas

Deixar em repouso por 48 horas

Limpar uma a uma as lminas usadas, utilizando esponja, e coloc-las numa bacia com gua

Enxaguar bastante em gua corrente

Enxugar com toalha limpa

Fazer a seleo: desprezar as quebradas, arranhadas, oxidadas e as azuladas pelo uso continuado de corantes

Fazer pacotes de 10 unidades, identicar os pacotes como lminas recuperadas e colocar a data

A PESQUISA DE PLASMDIO PELA MICROSCOPIA

Captulo

3



A pesquisa de plasmdio pela microscopia pode ser feita tanto na gota espessa de sangue como em esfregao delgado. Dependendo do objeti-vo do trabalho, cada um desses recursos oferece vantagens e desvantagens (adiante descritas).

1. O preparo da gota espessa

A melhor preparao para o diagnstico de malria obtida com amostra de sangue colhida diretamente por puno digital ou venosa sem anticoagulante. Aps a coleta, a lmina deve ser mantida em temperatura ambiente para secagem da gota de sangue para tanto, pode-se tambm utilizar estufa de 37oC ou lmpada de 25-40 watts sob placa de vidro.

Na prtica, a secagem pode ser vericada pelo desaparecimento do brilho da amostra mida. O sangue colhido com anticoagulante no in-dicado para o preparo da gota espessa, por no apresentar boa xao na lmina, podendo desprender-se no ato da colorao ou durante a lavagem. Em caso de sangue com anticoagulante, a lmina deve ser submetida seca-gem durante um tempo maior, antes da colorao. O tempo decorrido entre a coleta do sangue e a colorao da amostra no deve ultrapassar trs dias, sob o risco de ter sua qualidade prejudicada, haja vista que aps esse perodo a desemoglobinizao dicultada.

Coleta de sangue e preparo de lminas para o exame da gota espessa

Separar duas lminas limpas, deixando-as em superfcie plana e horizontal.

Preencher os dados do paciente e do examinador, requeridos no formulrio.

Colocar uma das lminas sobre a superfcie plana e manuse-la pelas extremidades, evitando tocar as superfcies. De preferncia, a lmina deve estar com etiqueta auto-adesiva para o registro da identicao; a opo alternativa usar lmina com extremidade esmerilhada, onde a identicao feita com lpis.

Calar luvas de ltex descartveis.

Limpar vigorosamente a pele do local de puno (parte lateral do segundo ou terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou, em lactentes, o dedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou algodo embebido em lcool a 70%; posteriormente, enxugar com gaze ou algodo secos.



Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril, segu-rando-o rmemente.

Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o indicador da mo do operador e puncionar o local de maneira rme e leve (Foto 1, abaixo).

Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algo-do secos.

FIGURA 5 PUNO DIGITAL PARA COLETA DE SANGUE PARA PREPARO DE GOTA ESPESSA OU ESFREGAO

FONTE: RPUBLIQUE DMOCRATIQUE DU CONGO/MINISTRE DE LA SANT/PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LE PALUDISME



Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter outra gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar para no tocar o pon-to de sada do sangue.

Segurar a lmina rmemente pelas bordas da extremidade onde se encontra a etiqueta de identicao. Aproximar a lmina ao dedo do paciente (pela face onde consta a identicao) at tocar o alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele). Se a quantidade de sangue for insuciente, pode-se colocar outra gota ao lado da primeira.

Colocar a lmina, com a face para cima, na superfcie de traba-lho. Com o canto e os primeiros 5 mm da borda maior da segunda lmina, espalhar o sangue formando um retngulo de tamanho e espessura adequados: aproximadamente 1,2 cm2.

Limpar o local puncionado com gaze ou algodo embebido em lcool a 70% e, se necessrio, pression-lo.

Secar a lmina (em temperatura ambiente, ar morno, caixa com lmpada ou estufa), cuidando para que o sangue no se xe por calor excessivo.

Para iniciar a pr-colorao, esperar at que o sangue esteja total-mente seco. Caso contrrio, pode haver perda total de material.

Para a obteno de resultado satisfatrio na pesquisa de plasmdio pelo exame da gota espessa, alguns aspectos devem ser enfatizados quando da confeco da lmina:

IDEN

TIFICA

O



O sangue deve estar distribudo o mais homogeneamente possvel, para que os elementos sangneos e os parasitos se disponham de maneira uniforme em toda a amostra;

Uma gota espessa adequada deve ter de 1 cm2 a 1,5 cm2 de superf-cie, o que aproximadamente equivale a 500 a 800 campos micros-cpicos, quando se trabalha com aumento de 700 a 800 vezes. Nes-se caso, encontrada uma mdia de 10 a 20 leuccitos por campo.

Vantagens e desvantagens da gota espessa para a pesquisa de plasmdio

Vantagens:

Por concentrar maior quantidade de sangue desemoglobinizado numa rea relativamente pequena, a gota espessa aumenta a pro-babilidade de se encontrar parasitos, o que a torna o mtodo de eleio para o diagnstico de malria (e de outros hemoparasitos);

Por ser desemoglobinizada, o processo de colorao mais rpido, permitindo o processamento de grande nmero de amostras;

A distribuio dos parasitos e leuccitos se d ao acaso em toda a amostra. Portanto, pode-se avaliar a parasitemia contando-se o nmero de parasitos em relao a um determinado nmero de leu-ccitos.

Desvantagens:

Requer experincia para a identicao de espcies, uma vez que a morfologia do parasito altera-se durante o processo de desemoglo-binizao;

Requer processamento parcial ou total relativamente rpido depois de colhida a amostra, para evitar a xao de hemoglobina, a supercolorao e a descolorao.

2. O preparo do esfregao delgado

Coleta e preparo do esfregao delgado (distendido)

Trabalhar sobre superfcie plana e horizontal.

Usar duas lminas: uma, para receber a minscula gota de sangue (1l aproximadamente); outra, para espalhar o sangue (preferen-cialmente biselada).



Calar luvas de ltex descartveis.

Limpar vigorosamente a pele do local de puno (parte lateral do segundo ou terceiro dedo da mo, lbulo da orelha ou, em lac-tentes, o dedo grande do p ou calcanhar) com gaze ou algodo embebido em lcool a 70%. Posteriormente, enxugar com gaze ou algodo secos.

Retirar o estilete (lanceta) do envoltrio estril, segurando-o rmemente.

Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o indicador da mo esquerda do operador.

Puncionar o local de maneira rme e leve.

Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algodo secos.

Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter outra pequena gota de sangue esfrica sobre a pele seca. Cuidar para no tocar o ponto de sada do sangue.

Com a mo direita, segurar a lmina rmemente pelas bordas da extremidade onde se encontra a etiqueta de identicao. Aproximar a lmina ao dedo do paciente (pela face onde consta a identicao) at tocar o alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele).

Limpar o local puncionado com gaze ou algodo embebido em l-cool a 70% e, se necessrio, pressionar.

Com a borda estreita da lmina biselada em contato com a gota de sangue, formando um ngulo de 50, espalhar o sangue com um mo-vimento rpido para formar uma camada delgada (se possvel, uma nica camada de clulas), sem atingir a outra extremidade da lmina.

Deixar secar em temperatura ambiente, na posio horizontal.

Fixar com algumas gotas de lcool metlico, de modo a cobrir todo o esfregao, por 1 minuto.

O sangue tambm pode ser espalhado da seguinte forma:

Tocar a gota de sangue com a lmina distensora.

Colocar a extremidade da lmina que contm o sangue em contato com a extremidade da lmina que receber o esfregao delgado. Antes que o sangue, por capilaridade, atinja as bordas laterais da lmina distensora (biselada), faz-se o deslocamento rpido, em n-gulo de 50, para formar a camada na, sem atingir a extremidade da lmina.



Vantagens e desvantagens do esfregao delgadopara a pesquisa de plasmdio

Vantagens

Por xar as hemcias, permite melhor estudo da morfologia do parasi-to e das alteraes caractersticas do eritrcito parasitado, viabilizando conferir o diagnstico da gota espessa, em situaes de dvida.

Por ser xado e no submetido desemoglobinizao, a perda de parasitos bem menor que na gota espessa. Essas amostras resistem mais ao atrito quando da remoo do leo de imerso, so mais du-rveis e conservam por muito tempo a colorao original (enquanto que a gota espessa pode facilmente apresentar alterao tintorial).

Permite a determinao percentual da parasitemia, mediante a contagem de eritrcitos parasitados em 100 hemcias.

Desvantagens

Por ter menos quantidade de sangue, espalhada em uma nica camada, o esfregao delgado ocupa maior rea da lmina, di cul-tando o encontro das hemcias parasitadas. Assim, no indicado para diagnstico inicial, especialmente em pacientes com parasite-mias baixas.

A distribuio de leuccitos e parasitos no se d ao acaso (leuc-citos maiores e estgios mais avanados dos parasitos localizam-se nas bordas e nal de esfregao). Portanto, precisa-se examinar uma rea extensa para detectar todas as formas parasitrias, no esta-belecendo uma boa correlao entre o nmero de parasitos e o de leuccitos.



FOTO 1

GOTAS ESPES-SAS DE SANGUE EM LMINAS DE VIDRO, NO CORADAS

FOTO 2

ESFREGAOS DE SANGUE FIXADOS E CORADOS PELO MTODO DE GIEMSA

COLORAO DAS LMINAS

Captulo

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1. Preparo de corantes e diluentes

Preparo da mistura de azul de metileno fosfatado

Azul de metileno medicinal em p 1,0g

Fosfato de potssio monobsico 1,0g

Fosfato de sdio bibsico 3,0g

Misturar em gral seco. Preparo da soluo fosfatada de azul de metileno

Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250ml de gua destilada. Conservar a soluo em pissetas (frasco plstico de lavagem).

Preparo da mistura de sais fosfatados

Fosfato de potssio monobsico 4,0g

Fosfato de sdio bibsico 6,0g

Misturar em gral seco.

Preparo da gua tamponada a 6/4

Pesar 1,0g da mistura de sais fosfatados, acima descrita, e dissolver em 1.000ml de gua destilada. Conservar a soluo em pissetas.

Preparo da soluo alcolica de Giemsa

Giemsa em p 0,75gGlicerol PA 35mllcool metlico PA 65ml

Colocar a soluo num frasco com algumas prolas de vidro e agi-tar vrias vezes ao dia, at obter a homogeneizao. Esta soluo deve ser feita em maior volume e mantida em estoque. Para o uso dirio, a soluo alcolica deve ser colocada em pequeno frasco conta-gotas, evitando-se sua abertura por tempo prolongado.

Obs: Existem, no mercado, solues de Giemsa preparadas, carter PA.



Preparo do corante de Wrigth (para colorao dos esfregaos delgados)

Wrigth em p 0,10g

lcool metlico PA 100ml

Colocar o corante num frasco com algumas prolas de vidro e agitar vrias vezes ao dia, at obter a homogeneizao.

2. Tcnica de colorao das lminas

Mtodo de Walker para colorao da gota espessa

Material necessrio: placa de acrlico para colorao; pisseta com soluo fosfatada de azul de metileno; frasco conta-gotas com soluo alco-lica de Giemsa; pisseta com gua tamponada.

1 fase: Desemoglobinizao pela soluo hipotnica de azul de metileno

Aplicar a soluo de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue, por dois segundos.

Enxaguar a lmina com gua tamponada (sem jato forte).2 fase: Colorao pela soluo de Giemsa

Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie da placa de colorao.

Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota de corante para 1ml de gua tamponada. Homogeneizar.

Aplicar esta soluo na placa cncava de colorao, sob a lmina invertida.

Deixar corar por 10 minutos. Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte). Secar ao calor suave ou sob ventilao.

Neste mtodo no recomendvel imergir a lmina na soluo azul de metileno (pr-colorao) e na gua tamponada (lavagem) em copos, em virtu-de da contaminao destas solues repetidamente usadas por vrios dias, fa-vorecendo a proliferao de bactrias e fungos. Para evitar esta desvantagem, utilizar as solues contidas em pissetas para enxaguar as amostras de sangue. O aumento do consumo compensado com a boa qualidade das preparaes, livre de artefatos e contato com solues contaminadas por sangue.



Mtodo de Giemsa para colorao da gota espessa

Colocar a lmina com o lado da gota voltada para a superfcie da placa de colorao.

Preparar uma soluo de Giemsa na proporo de uma gota de corante para 1ml de gua tamponada. Homogeneizar.

Aplicar esta soluo na placa cncava de colorao, sob a lmina invertida.

Deixar corar por 20 a 30 minutos.

Enxaguar com gua tamponada (sem jato forte).

Secar ao calor suave ou sob ventilao.

Colorao do esfregao pelo mtodo de Giemsa

Fixar o esfregao com lcool metlico por um minuto.

Deixar secar.

Colocar a lmina invertida sobre a placa de colorao.

Despejar a diluio do corante de Giemsa na proporo de uma gota do corante para 1ml de gua tamponada.

Deixar corar por 20 a 30 minutos.

Enxaguar com jato forte de gua tamponada.

Secar ao calor suave ou sob ventilao.

Colorao do esfregao (distendido) pelo mtodo de Wrigth

Cobrir a lmina com soluo de Wrigth.

Deixar corar por 3 minutos.

Adicionar algumas gotas de gua destilada ou tamponada.

Misturar (borrifar ar com o auxlio de uma pisseta vazia ou pra de borracha).

Deixar corar por mais 7 minutos.

Enxaguar com jato forte de gua destilada ou tamponada.

Secar em temperatura ambiente.



3. Avaliao da qualidade de colorao da gota espessa

Desemoglobinizao

Quando a desemoglobinizao adequada, os elementos gurados do sangue e os parasitos, quando presentes, aparecem sobre fundo claro.

Espessura da gota

Cada campo microscpico (imerso em leo) deve apresentar de 10 a 20 leuccitos, em mdia.

Colorao propriamente dita

As cores dos elementos normais do sangue devem ser avaliadas de acordo com o seguinte roteiro:

Os restos das hemcias e reticulcitos devem estar corados em azul-claro

As plaquetas devem corar-se de rosa-vivo ao violeta

Os ncleos de leuccitos geralmente coram-se de azul-escuro ao violeta

Os grnulos nos dos neutrlos coram-se ora em rosa, ora em azul-violeta

Os grnulos grossos dos eosinlos coram-se em vermelho-cobre

O citoplasma dos linfcitos coram-se em azul-plido

Os moncitos apresentam-se com no estroma cinza-azulado

No exame da gota espessa, se o fundo estiver bem claro a cromati-na dos parasitos cora-se em vermelho e o citoplasma em azul. O pigmento malrico, que normalmente no se cora, tambm aparece com nitidez e sua cor varia do castanho ao negro, sendo mais visvel nas preparaes descora-das e no sangue examinado a fresco. Apresenta-se como massa na, difusa e castanha, ou na forma de pequena massa compacta, arredondada e escura.



4. Avaliao da qualidade de colorao do esfregao

O exame de esfregao deve ser feito, preferencialmente, na parte mais na (cauda) do esfregao, onde as hemcias esto dispostas numa s cama-da, com as bordas separadas ou apenas com leve contato e sem superposio, sendo facilmente observada a camada nica de clulas xadas formando franjas. A deteco de baixas parasitemias requer o exame de todo o es-fregao.

As seguintes caractersticas devem ser observadas para a avaliao da qualidade de colorao do esfregao:

A colorao do esfregao depende da espessura da camada de hemcias, bem como do mtodo de colorao.

O esfregao deve apresentar uma pelcula na e uniforme que no atinge as bordas, com diminuio progressiva da quantidade de sangue em direo ao nal da lmina, sem alcanar a extremidade da mesma mas formando franjas.

A cor do esfregao pode variar do cinza-claro ao rosa-plido.

Leuccitos: ncleo azul-escuro ou prpura e o citoplasma dos neu-trlos, granulaes nas azul e rosa; os eosinlos apresentam-se com granulaes grosseiras, podendo corar-se em tom rosa-aver-melhado.

Plaquetas: azul ou prpura.

Plasmdios: a cromatina nuclear cora-se em vermelho ou prpu-ra; o citoplasma, em azul-claro, com variaes que dependem da espcie e idade do parasito.

Granulaes de Schner: rosa ou vermelha. Sua presena, clara-mente denida nas hemcias parasitadas pelo P. vivax ou P. ovale, bom indicador de colorao satisfatria.

Obs: O aparecimento das granulaes de Schner, bem caracte-rsticas nas hemcias parasitadas pelo P. vivax ou P. ovale, depende do pH da gua tamponada e do tempo de colorao (pH 7,0 a 7,2 e tempo superior a 30 minutos). A visualizao das granulaes de Schner maior na periferia da gota espessa e camada delgada (esfregao), principalmente nas amostras de sangue com anticoagulante.

CARACTERSTICAS DAS DIFERENTES ESPCIES DE PLASMDIOS ENCONTRADOS NO SANGUE PERIFRICO

Captulo

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Individualmente, os parasitos do gnero Plasmodium variam em ta-manho, forma e aparncia, confundindo-se com elementos estranhos, con-taminantes das amostras de sangue, como fungos, bactrias, etc. (Anexo 1 Figura 1/1 Elementos que podem confundir o diagnstico de malria).

Em alguns casos, no exame da gota espessa as formas de determi-nada espcie se assemelham muito s de outras (anis, pr-esquizontes e gametcitos arredondados). A nica forma que se pode considerar como tpica nesse exame o gametcito de P. falciparum, que apresenta-se em for-ma de banana, crescente ou salsicha. Ainda assim torna-se freqente-mente arredondado (em vista da secagem do sangue ser demorada em clima quente e mido), com aparncia de formas de outras espcies (P. vivax e P. malariae).

A comparao entre o tamanho das formas evolutivas dos plasm-dios, de acordo com a variao de crescimento de cada espcie e o tama-nho do linfcito pequeno (microlinfcito), cujo dimetro se aproxima do dimetro do glbulo vermelho, pode auxiliar no diagnstico da espcie.

1. Plasmodium falciparum

Trofozoto jovem: em forma de pequeno anel ou s vezes aberto, formando vrgulas, regulares, ligadas a uma, duas e at trs pe-quenas massas de cromatina. Ausncia de pigmento malrico.

Trofozoto maduro (forma rara): compacto, com aspecto slido, sem vacolo ou com pequeno vacolo. Colorao mais escura que o mesmo estgio das outras espcies. Massa nica de pig-mento malrico, cuja cor varia do castanho ao negro.

Esquizonte: redondo e de tamanho variado. Apresenta duas ou mais massas de cromatina e massa nica de pigmento malrico. Comumente, no visto em amostra de sangue perifrico. Pode aparecer em infeces graves por esta espcie, assim como em pacientes esplenectomizados. Cada esquizonte pode apresentar de 8 a 40 merozotos (cromatinas), usualmente de 16 a 24, assi-metricamente arranjados.

As hemcias parasitadas podem apresentar-se com a superfcie irregular, sem granulaes de Schner nem aumento do dime-tro. Parasitemias mais altas so comuns nesta espcie. O parasi-tismo mltiplo da hemcia comum nas infeces graves.

Os parasitos invadem hemcias jovens, maduras e velhas.



O pigmento malrico pode ser encontrado nos leuccitos circu-lantes, sendo sinal de alerta para infeco grave.

O gametcito do P. falciparum, em forma de banana, cres-cente ou salsicha, considerado tpico dessa espcie. Entre-tanto, pode car arredondado quando a secagem da lmina for demorada por exemplo, nos locais de clima quente e mido , podendo confundir-se com formas de outras espcies. Os game-tcitos aparecem por volta da segunda semana da parasitemia assexuada e podem permanecer no sangue perifrico de 5 a 7 semanas.

Rotineiramente, as nicas formas parasitrias do P. falciparum en-contradas na leitura de uma lmina de gota espessa so anis (tro-fozotos jovens e maduros) e gametcitos (em forma de banana).

Nos casos de malria grave, podem ser encontradas todas as formas evolutivas descritas, acompanhadas de esquizontes, geralmente nos casos de elevada parasitemia devida doena por mais de uma semana.

O encontro de parasitos pequenos, mdios e grandes sinal de mais de uma gerao, sendo raras as parasitemias sincrnicas, isto , crescimento uniforme de uma nica camada. A coleta de sangue realizada em diferentes horrios pode acarretar resultados contra-ditrios, positivos ou negativos. Por isso, em alguns casos suspei-tos, recomenda-se a coleta das lminas em diferentes horrios.

2. Plasmodium vivax

Trofozoto jovem: em forma de anis pequenos, s vezes abertos, mostrando apenas uma massa de cromatina (raramente duas). Pode ser confundido com os trofozotos jovens do P. falciparum. Ausncia de pigmento malrico. Os anis podem ser maiores e, nesse caso, apresentam vacolo claramente denido.

Trofozoto maduro: grande, amebide e com vacolo presen-te. Grnulos nos de pigmento malrico escuro no citoplasma, geralmente identicados como formas irregulares.

Esquizonte: grande, redondo e com menos de 12 ncleos (cro-matinas) quando ainda jovem. Grnulos de pigmento no, escuro e difuso pelo citoplasma. Quando maduro, apresenta 12 a 24 merozotos (cromatinas maiores), irregularmente arranja-dos. Grnulos de pigmento malrico visualizado, s vezes, como pequena massa escura numa parte do citoplasma.



Gametcito: redondo ou oval, com nica massa de cromatina triangular ou redonda, tamanho varivel. Pigmento malrico no, difuso e escuro sobre o citoplasma. As formas mais evolu-das podem ser maiores que o microlinfcito.

As hemcias parasitadas geralmente so jovens (reticulcitos) e apresentam granulaes de Schner. Seu dimetro pode estar aumentado pelo tamanho do parasito.

No apresenta pigmento malrico fagocitado por leuccitos no sangue perifrico.

No exame da lmina de um paciente com malria causada por P. vivax so encontradas todas as formas evolutivas dessa espcie: anis (trofozotos jovens), formas irregulares (trofozotos madu-ros), esquizontes e gametcitos.

3. Plasmodium malariae

Trofozoto: pequeno, redondo e compacto. Anis de forma re-gular, com cromatina relativamente grande. Pigmento malrico mais evidente nas formas mais compactas. Pode ou no apre-sentar vacolo. Quando maduro, apresenta massa de cromatina maior e grnulos grossos e escuros de pigmento malrico.

Esquizonte: quando jovem, apresenta menos de 8 ncleos, sem citoplasma evidente. Grnulos de pigmento malrico grossos, sem formao de massa compacta. Quando maduro, tem de 8 a 12 merozotos (cromatinas), s vezes em torno de uma massa compacta e escura de pigmento malrico (forma de roscea). Os ncleos podem aparecer bem separados, sem citoplasma e espalhados de modo irregular.

Gametcito: semelhante ao trofozoto maduro. Massa grande de cromatina, forma compacta, regular e bastante pigmento malrico grosso e escuro.

Hemcia parasitada no aumentada e sem granulaes de Schner. Invade preferencialmente hemcias velhas.

No exame da lmina de um paciente com malria causada por P. malariae so encontradas todas as formas evolutivas dessa espcie: anis (trofozotos), esquizontes e gametcitos.

No esfregao delgado, o trofozoto maduro apresenta-se como banda ou faixa equatorial sobre a hemcia.



4. Plasmodium ovale

Trofozoto: quando jovem, pode parecer-se com o trofozoto do P. vivax ou do P. malariae. Possui anis com citoplasma com-pacto, podendo apresentar vacolo. Quando maduro, apresen-ta-se redondo, com massa de cromatina de tamanho varivel. Pigmento malrico escuro, porm mais claro que o de P. vivax e P. malariae.

Esquizonte: com aproximadamente 6 a 8 merozotos, distribu-dos irregularmente ou em torno de uma massa compacta e escu-ra de pigmento malrico, em aspecto de roscea, semelhante ao do P. malariae.

Gametcito: redondo ou oval, com nica massa grande de cromatina. Grnulos de pigmento escuro.

Hemcia parasitada pouco aumentada e com granulaes de Schner, sendo os grnulos mais espalhados. A presena de granulaes de Schner distingue esta espcie do P. malariae. A hemcia parasitada ovalada.

No exame da lmina de um paciente com malria causada por P. ovale so encontradas todas as formas evolutivas dessa espcie: anis (trofozotos), esquizontes e gametcitos.

COLORAO DAS GRANULAES DE SCHFFNER

Captulo

6



A natureza das granulaes de Schner ainda desconhecida. So grnulos de cor rsea surgidos nas hemcias parasitadas pelo P. vivax e P. ovale quando coradas pelos corantes de Romanowski, segundo os mtodos de Giemsa, Walker/Giemsa, Wright, Maygrunwald/Giemsa e Romanowski modicado.

Observou-se que essas granulaes assemelham-se s do citoplasma dos leuccitos polimorfonucleares (neutrlos). Seu aparecimento, forma, tamanho, quantidade e distribuio nas hemcias parasitadas varia com a qualidade da amostra de sangue, a espcie e o estgio do plasmdio, o pH do diluente, a qualidade do corante, o mtodo e o tempo de colorao.

O exame da gota espessa e/ou do esfregao revela as granulaes de Schner nas hemcias parasitadas vistas da periferia at a parte central, ou apenas nas camadas mais nas de hemcias, sendo mais coradas em meio alcalino (pH 7,2) e maior tempo de colorao.

Na maioria das preparaes da gota espessa, as granulaes de Schner no aparecem em virtude do pH cido do diluente e menor tempo de colora-o, sendo o P. vivax identicado pelas formas irregulares, pigmento ma-lrico e algumas formas maiores que o microlinfcito. Algumas hemcias parasitadas por trofozotos jovens podem no apresentar as granulaes de Schner, mas com P. ovale todas tm essas granulaes, mais grossas e em menor nmero quando comparadas s das hemcias dilatadas com P. vivax (que so nas). A identicao do P. ovale torna-se difcil sem a colorao das granulaes de Schner e a visualizao da hemcia parasitada em vir-tude da semelhana de formas evolutivas comparadas com as do P. malariae e algumas do P. vivax no irregulares.

A colorao das granulaes de Schner preservada por muitos anos, com ou sem montagem das preparaes com resinas sintticas. Re-centemente, na montagem dessas preparaes vem sendo experimentada a resina Superbonder e a substituio da lamnula de vidro por celofane.

Camadas

Nas infeces malricas, chamam-se camadas a presena assincrni-ca das populaes de parasitos encontrados no sangue perifrico.

Faz-se necessrio um perodo mnimo de tempo para que a esqui-zogonia se complete. No fgado, ela pode ser retardada por alguns dias; no sangue perifrico, retardada ou antecipada em algumas horas. Em conse-



qncia dessas variaes, geralmente se registra a presena de parasitos em diferentes estgios de desenvolvimento no sangue perifrico. Contudo, nem sempre possvel observar todas as diferentes fases quando do exame roti-neiro da gota espessa, haja vista que, em alguns casos, os parasitos so raros e essa variao no aparece nos campos microscpicos.

Sempre que um nmero suciente de parasitos completa sua esqui-zogonia ao mesmo tempo ou com diferena de algumas horas, produzem-se sintomas clnicos nos pacientes no-imunes ou semi-imunes. Conforme a gerao predominante, os sintomas se apresentam a cada 48 horas nas infec-es por P. falciparum, P. vivax e P. ovale; ou a cada 72 horas nas infeces pelo P. malariae.

A ocorrncia de sintomas de maior intensidade inicia-se com cala-frio, acompanhado de tremor generalizado. Esta fase, acompanhada de fe-bre, cefalia, nuseas e vmitos pelo menos uma vez por dia indica a presen-a de duas ou mais camadas. Por isso, no incio, possvel e no raro que o paciente tenha um acesso dos sintomas clnicos por dia, o que signica que o quadro clssico da infeco est descompassado, em vista da ocorrncia de pelo menos um quadro adicional. Entretanto, essa situao no costuma perdurar pois, uma vez estabelecida a gerao predominante, os parasitos da(s) outra(s) so suprimidos e, assim, no so sucientemente numerosos para causar sintomas.

O P. vivax jovem movimenta-se livremente em todo o interior da he-mcia, lanando pseudpodos citoplasmticos que atingem todas as partes da mesma. A cromatina aparece apenas em uma parte do citoplasma, talvez a maior. As demais partes podem ser desprezadas; os diminutos fragmentos de citoplasma ligados ao fragmento que contm a cromatina so demasiado delgados para ser vistos. A confuso freqentemente vericada na identi-cao do P. vivax e do P. malariae deve-se ao fato de que os fragmentos densos, que contm a cromatina, so tomados pelo parasito inteiro.

Para se vericar o que constitui o parasito inteiro numa gota espessa, faz-se muitas vezes necessrio considerar tudo quanto se encontre dentro de uma rea semelhante ao tamanho do maior leuccito polimorfonuclear observado em dado momento na mesma amostra de sangue.

A hemcia invadida pelo P. vivax, ao invs de adquirir viscosidade na membrana, apresenta uma srie de granulaes em todo o seu estroma denominadas granulaes de Schner, tm tamanho, forma e distribui-o regulares. A princpio pequenas, tornam-se maiores e mais evidentes



conforme o grau de exposio do sangue ao corante. Aps a colorao, as-sumem um tom avermelhado. Ressalte-se que essas granulaes s ocorrem nas hemcias parasitadas pelo P. vivax e P. ovale.

Gametcitos ou grandes mononucleados aparecem no sangue desde o incio da infeco, com variao apenas de tamanho.

A forma mais evoluda torna-se mais redonda e regular, sendo difcil identicar o gametcito adulto ou pr-esquizonte. Pode-se observar na gota espessa, medida em que o P. vivax amadurece, que a forma torna-se redon-da e regular, compacta e com bastante pigmento malrico, que s vezes se confunde com P. malariae.

As parasitemias baixas so mais raras do que nos casos por P. falci-parum, sendo mais fcil a deteco em amostras bem coradas pela presena das granulaes de Schner. As infeces mistas de P. vivax + P. falciparum so freqentes com gametcitos de P. falciparum (V + Fg), sendo raras com somente formas assexuadas de P. falciparum (F + V) e baixa parasitemia das duas espcies assexuadas associadas.

MTODOS DE QUANTIFICAO DA PARASITEMIA

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? ecretaria de Vigilncia em Sade / MS | 59


1. Mtodo tradicional de avaliao semiquantitativa (em cruzes)

Critrios

Nmero de campos a examinar: 100.

Nmero inferior a 40 parasitos nos 100 campos examinados: ano-tar o nmero encontrado. Por exemplo: 37 V.

Quando o nmero total de parasitos contados situar-se entre 40 e 60 parasitos por 100 campos, registrar: +/2 (meia cruz).

A partir de um parasito por campo, o resultado ser registrado como uma, duas, trs ou quatro cruzes, conforme o quadro a seguir:

Parasitos contados

Nmero de campos microscpicos Cruzes

40 a 60 100 +/21 1 +

2 20 1 ++21 200 1 ++++ 200 1 ++++

2. Mtodo de avaliao quantitativa pela contagem de 100 campos microscpicos

Critrios


Usar ocular de 7,5x ou 10x e 100x na objetiva do microscpio.

Assumir que nessas condies de leitura 100 campos microscpi-cos equivalem a 0,2 microlitros (l) de sangue.

Multiplicar por 5 o nmero de parasitos encontrados nos 100 campos examinados.

Registrar o nmero encontrado no clculo acima como a parasite-mia por l de sangue. Assim, o encontro de um nico parasito em 100 campos examinados signica 5 parasitos/l de sangue.



3. Estimativa da parasitemia a partir da avaliao semiquantitativa

Critrios


Classicar a parasitemia em cruzes, de acordo com o mtodo tradi-cional de avaliao semiquantitativa, anteriormente mencionado.

Registrar o intervalo de parasitemia por l, conforme o quadro a seguir, lembrando que 100 campos microscpicos equivalem a 0,2l de sangue:

Parasitos por campo Cruzes Parasitos p/ mm3

40 a 60/100 +/2 200 - 300

1 + 301 - 500

2 20 ++ 501 10.000

21 200 +++ 10.001 - 100.000

+ 200 ++++ 100.000 ou mais

4. Mtodo de avaliao relativa contagem de leuccitos por campo

Critrios

Nmero de campos a examinar: aqueles que levem ao alcance do nmero de leuccitos padronizado. Em geral, contam-se 200 leuc-citos.

Contar simultaneamente o nmero de parasitos assexuados, at al-canar 200 leuccitos.

Assumindo uma leucometria padro de 6.000 leuccitos/l de sangue para todo paciente com malria, realizar uma regra de trs para obter a parasitemia/l de sangue. Por exemplo:

Se encontrarmos 50 parasitos assexuados contra 200 leuccitos, tere-mos x parasitos para 6.000 leuccitos

50 200

X 6.000



Ento x = (50 x 6.000) 200 = 1.500 parasitos/l.

5. Mtodo de avaliao pelo percentual de hemcias parasitadas (utilizado apenas para esfregao delgado)

Critrios

Nmero de campos a examinar: aqueles que levem ao alcance do nmero de 500 hemcias (em geral, de 5 a 10 campos).

Contar simultaneamente o nmero de parasitos assexuados, at al-canar 500 hemcias.

Realizar uma regra de trs para obter a parasitemia percentual. Por exemplo:

Se encontrarmos 50 parasitos assexuados contra 500 hemcias tere-mos um percentual de 10% de hemcias parasitadas, ou seja,

50 500

(50 500) x 100 = 0,1 x 100 = 10%

Esse resultado equivale, em um indivduo com 5.000.000 de hem-cias por microlitro de sangue, a uma parasitemia de 500.000 parasitos/l de sangue.

REGISTROS DE RESULTADOS DO EXAME MICROSCPICO

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1. Resultados positivos

Os resultados do exame parasitolgico da gota espessa para as dife-rentes espcies de plasmdios so registrados nos formulrios do Sistema de Informao de Vigilncia Epidemiolgica Sivep/Malria, pelas respectivas iniciais, conforme o quadro a seguir:

Registro Descrio do resultado

V P. vivaxF P. falciparumM P. malariaeOv P. ovale

F + Fg Formas assexuadas + sexuadas (gametcitos) de P. falciparum

Fg Somente gametcitos

V+Fg Formas de P. vivax + gametcitos de P. falciparum

F+VF+MV+M

Para diferentes combinaes de infeces mistas

Obs: Em caso de infeco mista, registrar em primeiro lugar a inicial da espcie dominante. Exemplo:15.000F-3Fg-500V (+++F 3Fg +V);5.000V-60M (++V 60M)

Quando do encontro de esquizontes e formas assexuadas mais evo-ludas de P. falciparum, indicativas de malria grave, importante assinalar a sua presena, bem como o achado de pigmento malrico fagocitado por leuccitos.

Na rotina, uma infeco mista F+V aquela na qual encontramos a presena simultnea de anis (trofozotos jovens), formas irregulares (tro-fozotos maduros) de P. vivax e gametcitos (forma de banana) de P. falci-parum. Se o exame da lmina de gota espessa revelar grande quantidade de formas em anel (trofozotos jovens), associadas a formas irregulares (trofo-zotos maduros de P. vivax) em quantidade bem menor, por exemplo, 20.000 anis para 2.000 formas irregulares, mesmo na ausncia do gametcito em forma de banana (P. falciparum), deve-se suspeitar de uma infeco mista F+V e comunicar o fato ao terapeuta, utilizando o formulrio de resultados.



2. Resultados negativos

Como em qualquer exame microscpico, um resultado negativo deve ser emitido somente aps minucioso exame da lmina. No caso da gota espessa, para no deixar de detectar baixas parasitemias, bem como para garantir o diagnstico das infeces mistas, torna-se necessrio examinar mais de 100 campos microscpicos (500 campos seria o ideal), sobretudo se existir forte suspeita de malria (clnica e epidemiologia favorveis).

O exame de uma gota espessa padro durante 10 minutos suciente para se checar aproximadamente 500 campos, possibilitando o registro de um resultado negativo com maior segurana. A concluso diagnstica pelo encon-tro de um nico parasito na preparao deve ser feita com cautela. Recomenda-se concluir o diagnstico somente aps o encontro de dois ou trs parasitos, bem como repetir o exame em diferentes horrios, para aumentar sua sensibilidade.

TESTES RPIDOS PARA O DIAGNSTICO DE MALRIA

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Apesar do exame da gota espessa apresentar inquestionvel vanta-gem para o diagnstico, uma srie de fatores pode interferir nos resultados obtidos, entre eles: a habilidade tcnica no preparo da lmina, seu manuseio e colorao; qualidade tica e iluminao do microscpio; competncia e cuidado por parte do microscopista; grau de parasitemia.

Considerando-se esses fatores, realizar o diagnstico especco de malria torna-se difcil em muitos locais, seja pela precariedade dos servios de sade, seja pela diculdade de acesso da populao aos cen-tros de diagnstico. Por esta razo, nos ltimos 15 anos mtodos rpidos, prticos e sensveis vm sendo desenvolvidos.

Em 1986, uma protena rica em histidina, denominada Pf-HRP2, foi identicada no P. falciparum. Posteriormente, vericou-se sua presena no plasma de pacientes agudamente infectados com P. falciparum. A par-tir de 1993, houve grande desenvolvimento de testes imunocromatogr-cos baseados na captura qualitativa da Pf-HRP2. Sua desvantagem a per-manncia da protena circulante por tempo prolongado, dando resultado positivo em indivduos j tratados da doena.

Mais recentemente, mtodos de diagnstico rpido da malria foram desenvolvidos utilizando anticorpos monoclonais e policlonais dirigidos contra a protena Pf-HRP2 e contra a enzima desidrogenase lctica (pDHL) das quatro espcies de plasmdio. Estes testes tm a vantagem de diferenciar o P. falciparum das demais espcies, as quais so identicadas como no- P. falciparum.

A pDHL uma enzima intracelular produzida em abundncia pelos parasitos vivos, o que permite diferenciar a fase aguda e a convalescena da infeco. Possui alta sensibilidade e alta especicidade, sendo til para a triagem e, mesmo, conrmao diagnstica da malria, principalmen-te para turistas que visitam as reas endmicas. Como desvantagem no permite o diagnstico de uma infeco mista.

Alguns exemplos comerciais desses testes so descritos a seguir.

1. Testes exclusivos para o diagnstico de P. falciparum

ParaCheck-Pf e Malar-Check baseiam-se na deteco, no sangue do paciente, da protena Pf-HRP2, atravs de anticorpos monoclonais. A reao revelada macroscopicamente em ta de nitrocelulose, por reao enzimtica.



2. Testes que discriminam o P. falciparum de outras espcies

ICT-PfPv e OptiMal tambm realizados em ta de nitrocelulose, consistem na deteco, por imunocromatograa, de enzima desidrogenase lctica (pDHL) especca do gnero Plasmodium, e de outra especca do P. falciparum (Pf-DHL), presente no sangue total do paciente. Estes testes possibilitam diferenciar uma infeco causada pelo P. falciparum de outra causada por uma ou mais espcies no-P. falciparum entretanto no possi-bilitam identicar as espcies causadoras de malria mista.

3. Diagnstico pela deteco do DNA do parasito

Com o desenvolvimento da tecnologia de amplicao do DNA dos plasmdios usando a reao em cadeia da polimerase (PCR), o diagnstico da malria baseado na deteco de cido nuclico mostrou grande progresso em termos de eccia. Alm disso, com a extensa utilizao da PCR para o diagnstico de outras doenas, as tcnicas de extrao e puricao de DNA foram aprimoradas e simplicadas. O diagnstico de malria atravs da PCR ainda restrito aos grandes laboratrios, em virtude do custo eleva-do, reagentes necessrios e alta complexidade tcnica.

ELEMENTOS FIGURADOS NORMAIS DO SANGUE

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1. Eritrcitos ou hemcias (glbulos vermelhos)

Dentre os elementos que compem o sangue esto os eritrcitos ou hemcias, que so os glbulos vermelhos, clulas anucleadas que vivem, no mximo, 120 dias. Derivam da clula-tronco da medula ssea e, ao serem liberados no sangue perifrico, contm resqucios de ncleo, sendo chama-dos reticulcitos. Esses elementos possuem policromasia (basolia pontea-da) e desaparecem entre 1 e 3 dias aps a liberao pela medula.

Durante o procedimento de colorao da gota espessa de sangue para a pesquisa de plasmdio, os eritrcitos so lisados pela soluo fosfatada de azul de metileno. Desta forma, aparecem no campo microscpico como resduos de glbulos vermelhos ligeiramente azulados.

No caso dos reticulcitos, as clulas variam na aparncia, desde uma na camada at densos grnulos azuis de vrios tamanhos, correspondendo ao resqucio nuclear da clula.

Em pessoas normais so encontradas de uma a trs dessas formas, podendo apresentar-se em maior nmero em pacientes com reticulocitose provocada por maior resposta eritropoitica da medula ssea, tais como nos processos hemolticos (como na malria) e hiperesplenismo.

2. Leuccitos (glbulos brancos)

Os leuccitos ou glbulos brancos so transparentes e muito bri-lhantes, podendo apresentar movimento no seu citoplasma. Em geral, seus ncleos tm a tonalidade azul-violeta carregado. Variam de tamanho e forma e o citoplasma pode ser claro ou granuloso, de acordo com o tipo da clula. Sua vida curta (de 3 a 5 dias) e a aparncia de alguns tipos polimorfonucleares varia desde elementos compactos, perfeitamente deni-dos e bem corados, at grandes clulas, plidas, irregulares e, muitas vezes, deformadas.

3. Plaquetas (trombcitos)

As plaquetas sangneas no tm ncleo. So fragmentos do citoplas-ma de uma espcie de clula gigante da medula ssea, chamada megacaricito. Podem apresentar-se isoladas ou em grupos. So de diferentes densidades na mesma lmina, bem como de tamanho e forma, mas a cor varia do rosa



ao violeta (nunca azul) em amostras diferentes. Podem no ser identicadas em sangue secado lentamente ou desbrinado. Se as lminas forem cora-das aps decorrido muito tempo da coleta, as plaquetas podem adquirir colorao sucientemente forte para prejudicar a visualizao de pequenos parasitos.

4. Importncia da avaliao dos elementos normais do sangue

Somente quando os elementos normais do sangue surgem em suas cores prprias, pode-se esperar que qualquer parasito presente na lmina tenha tambm suas cores prprias. Assim, se os ncleos dos leuccitos forem muito vermelhos em certa rea da amostra, improvvel que se veja cor azul no citoplasma dos parasitos. Por outro lado, se os leuccitos forem muito azuis, no provvel que a cromatina do parasito apresente cor vermelha sucien-te. Contudo, no se deve deixar de considerar que, ocasionalmente, onde a colorao dos elementos celulares plida ou deciente, os parasitos podem continuar se destacando clara e distintamente por algum tempo.



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ANEXOS



Anexo 1 Relao de material para laboratrio de malria

Colheita de lminas

Lminas de vidro, caixa com 50 unidades

Microlancetas descartveis

Luvas de ltex descartveis

Algodo hidrlo, pacote com 500g

lcool

Caixa porta-lminas

Etiquetas auto-adesivas

Formulrios

Tubo para remessa de lminas

Leno de papel absorvente

Limpeza de lminas novas e usadas

malaria_diag_manual_final.pdf

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