M5

MÓDULO V

Chips de DNA

2

Chips de DNA: janelas para o genoma das células

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução

Em 1995, uma equipa

multidisciplinar da Universidade de

Stanford publicou um artigo que

descrevia uma nova tecnologia que

revolucionou a forma como os

cientistas abordam o estudo da

expressão e regulação génica. Essa

nova tecnologia baseia-se nos chips

de DNA e permite a monitorização

simultânea da expressão de centenas

ou milhares de genes em diferentes

tipos de células.

O impacto desta tecnologia na

investigação científica deve-se

principalmente ao facto dos chips de

DNA permitirem a análise da

expressão do genoma de uma célula

no seu todo.

Antes do desenvolvimento dos

chips de DNA, a investigação era feita

de tal modo que eram necessários

vários dias para analisar a expressão

de um único gene. Os chips de DNA

permitem, num único dia, a análise

simultânea de milhares de genes.

Segundo muitos investigadores,

esta tecnologia será a chave para o

entendimento do funcionamento e

interacção de todos os genes

presentes num organismo. As suas

aplicações são já numerosas, sendo

de esperar que cada vez mais

cientistas utilizem esta ferramenta

revolucionária nas suas investigações,

abordando de uma nova forma os

problemas da sua área científica.

O que são chips de DNA?

Os chips de DNA são ferramentas

modernas da Biotecnologia que

possibilitam a análise da expressão

génica de uma ou mais amostras.

Existem vários tipos de chips de

DNA (Fig.1). Alguns são “caseiros”, ou

seja, são feitos em laboratórios de

investigação para serem utilizados

nos vários grupos de investigação do

próprio laboratório, enquanto outros

são comercializados por empresas de

Biotecnologia que os produzem a um

ritmo intenso. No entanto, todos se

baseiam no mesmo princípio: uma

sequência de DNA ou RNA tem

tendência a procurar e a ligar-se à

sua sequência complementar,

fenómeno denominado hibridação.

Um chip de DNA é constituído por

uma placa de suporte (normalmente

uma lâmina de microscópio ou uma

membrana de silicone) onde são

colocados milhares de pontos

ordenados de tal modo que todos

estão à mesma distância dos seus

pontos vizinhos. Em cada um desses

pontos está adsorvida uma sequência

3

de DNA (denominada sonda) que

pode corresponder a um gene, ou a

parte da sua sequência.

Figura 1 – Chip de DNA produzido pela empresa

Affymetrix (A) e chip de DNA “caseiro” (B).

Para que possa expressar um

gene, uma célula tem que fazer a sua

transcrição (construindo uma “cópia”

da sequência de DNA do gene, ou

seja, construindo uma molécula de

mRNA) para depois poder recorrer aos

ribossomas, que farão a tradução do

mRNA numa proteína funcional. Esta

sucessão de acontecimentos

processa-se do seguinte modo:

DNA (gene) → mRNA → proteína

Assim, é possível concluir que

cada gene que esteja a ser expresso

num determinado momento vai ter o

seu mRNA correspondente presente

na célula. Extraindo esse mRNA e

colocando-o num chip de DNA que

contenha todos os genes dessa

mesma célula, poderemos esperar

que esse mRNA se ligue à sequência

de DNA complementar presente no

chip. Sabendo a que gene

corresponde aquele ponto poderemos

saber que ele está a ser expresso na

célula. Deve no entanto referir-se

que, numa experiência real, é

necessário um passo adicional para

que se possam observar e analisar os

resultados.

Normalmente, a utilização de

chips de DNA numa experiência

envolve as seguintes etapas:

Isolamento do mRNA – a primeira

etapa de uma experiência deste tipo

corresponde à selecção das células

que se pretendem estudar. Se, por

exemplo, se estiver a analisar a

expressão génica num tipo de cancro,

iremos extrair o mRNA de uma célula

cancerosa mas também de uma célula

normal para termos um controlo, um

termo de comparação. A extracção do

mRNA deve ser bem efectuada, ou

seja, a solução extraída não deve

conter proteínas ou DNA, pois estas

moléculas podem interferir nos

resultados finais.

Formação do cDNA – de modo a

prevenir que o mRNA se degrade, é

necessário produzir uma molécula

mais estável, denominada cDNA,

através do uso de uma enzima, a

transcriptase reversa. Os nucleótidos

que formam o cDNA são ligados a

uma molécula de corante fluorescente

e, assim, toda a molécula de cDNA

fica corada, o que permitirá a

posterior visualização. É necessário

que os cDNA’s das duas amostras

sejam corados com corantes de

diferente comprimento de onda.

Normalmente utiliza-se um corante

verde para a amostra de células

A B

4

normais (controlo) e um corante

vermelho para a amostra em estudo.

Isto permitirá a distinção entre os

resultados de ambas as amostras.

Hibridação no chip de DNA – após

terem sido corados, os cDNA’s de

ambas as amostras são misturados e

postos em contacto com o chip de

DNA. Nessa altura, o chip é posto a

incubar a uma temperatura de 42 ºC.

Cada cDNA que encontre a sua

sequência complementar vai hibridar.

Após 12 horas, o chip de DNA é

lavado para retirar os cDNA’s que não

hibridaram com a sua sequência

complementar.

Aquisição da imagem – para que se

possa saber que cDNA’s hibridaram e,

consequentemente, que genes estão a

ser expressos pelas células em

análise, temos que obter uma imagem

dos pontos do chip de DNA. Para isso

temos que recorrer a um scanner. O

scanner emite dois laser’s por toda a

área do chip de DNA. Cada laser

excita um dos dois corantes

fluorescentes que estão ligados aos

nucleótidos dos cDNA’s. Esses

corantes emitem então luminosidade

num comprimento de onda diferente:

um dos corantes emite na zona dos

verdes e o outro emite na zona dos

vermelhos. Ambas as imagens são

recolhidas e combinadas pelo

computador, obtendo-se uma imagem

final semelhante à que se apresenta

na figura 2:

Figura 2 – Parte da imagem final de um chip de

DNA.

Como se pode observar, existem

alguns pontos do chip de DNA que

surgem vermelhos (correspondem a

genes expressos exclusivamente nas

células cancerosas) e outros que

surgem verdes (correspondem a

genes expressos exclusivamente nas

células normais). No entanto,

observam-se pontos de cor amarela.

Estes pontos correspondem a genes

que são expressos de igual modo em

ambos os tipos de células. De notar

ainda que nem todos os pontos têm a

mesma intensidade: quanto mais

intensidade o ponto apresenta, mais

cDNA está presente nesse ponto e,

consequentemente, mais o gene

correspondente está a ser expresso

na célula. Os pontos que se mantêm

pretos representam genes que não

são expressos por nenhum dos tipos

de células, não havendo qualquer

cDNA que hibride com essas

sequências.

Análise dos resultados – após se ter

obtido a imagem do chip de DNA, é

necessário interpretar os resultados

5

obtidos. Como facilmente se imagina,

analisar os resultados de milhares de

genes um a um pode tornar-se uma

tarefa muito morosa. Deste modo, os

cientistas têm que recorrer a

programas informáticos desenvolvidos

para essa função e que processam

toda a informação contida num chip

de DNA principalmente através do

tratamento estatístico dos resultados.

Aplicações dos chips de DNA

As potenciais aplicações dos chips

de DNA são praticamente ilimitadas.

Uma das abordagens tornada

possível através do uso dos chips de

DNA é a possibilidade de poder “ver o

que acontece” numa célula após uma

perturbação específica ou,

simplesmente, poder comparar o que

acontece em diferentes tipos de

células. Os chips de DNA permitirão a

observação de fenómenos

anteriormente impossíveis de

observar, tal como ocorreu após a

invenção do telescópio e do

microscópio. Através dos chips de

DNA, os cientistas conseguem abrir

uma janela que permite observar

directamente o genoma das células e

o modo como este é utilizado por

estas em cada situação específica.

Os chips de DNA podem ainda ser

utilizados para descobrir novos genes.

Chips que incluam genes de função

actualmente desconhecida permitirão

descodificar essa função através da

variação das condições a que estão

sujeitas as células.

Outra abordagem possível é a

análise de padrões genéticos. Essa

análise é muito importante em várias

áreas de investigação tais como:

estudo da divisão celular e do

envelhecimento, estudo da progressão

de certas doenças, estudo dos efeitos

dos fármacos sobre as células-alvo

desse fármaco, identificação de

substâncias carcinogénicas, etc.

Além destas áreas, este tipo de

abordagem tem-se revelado muito útil

na comparação entre tecidos normais

e tecidos cancerosos, identificando

padrões genéticos indiciadores de

situações de cancro.

A utilização de chips de DNA no

diagnóstico e classificação de certas

doenças genéticas é considerada

como uma prioridade uma vez que os

chips têm muitas vantagens quando

comparados com os métodos de

diagnóstico tradicionais actualmente

utilizados.

O futuro dos chips de DNA

Se tivermos em conta o

desenvolvimento tecnológico dos

últimos cinco anos, podemos afirmar

com algum grau de confiança que

esta tecnologia estará cada vez mais

acessível e será cada vez mais

utilizada. Não é difícil prever que

dentro de pouco tempo os chips de

DNA estarão presentes em todos os

consultórios médicos e serão

6

utilizados para prever certas doenças

genéticas de manifestação tardia.

Além disso, o seu uso na

investigação irá muito provavelmente

revolucionar o nosso modo de pensar

sobre o processo de desenvolvimento

de doenças e sobre o próprio

diagnóstico molecular.

Questões de análise

No Laboratório Virtual de

Biotecnologia encontrará uma

animação que ilustra e explica como

funcionam os chips de DNA (canal 3

da LVBtv).

1 – Descreva as diferentes etapas de

uma experiência que envolva

utilização dos chips de DNA.

2 – Refira duas abordagens

investigativas tornadas possíveis

através do uso dos chips de DNA.

3 – Indique as principais áreas onde

se podem aplicar os chips de DNA.

4 – Foi realizada uma experiência

utilizando um chip de DNA para

analisar a expressão génica de dois

tipos de células diferentes: tipo A e

tipo B. A amostra obtida a partir das

células tipo A foi corada a verde e a

amostra obtida a partir das células

tipo B foi corada a vermelho.

Obtiveram-se os seguintes resultados:

4.1. Interprete os resultados obtidos,

identificando os genes mais expressos

nas células tipo A e tipo B e os genes

expressos em ambos os tipos.

7

Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

O resultado obtido para

uma amostra é

influencido pela análise

simultânea de outra

amostra?

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Material biológico Tubo

Fígado (verde) Epiderme (verde)

Fígado canceroso (verde) Epiderme cancerosa (verde)

Fígado (vermelho) Epiderme (vermelho)

Fígado canceroso (vermelho) Epiderme cancerosa (vermelho)

A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

8




Todas as células do

organismo expressam

os mesmos genes?

Princípios:

Conceitos:







A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

9




Uma célula normal e

uma célula cancerosa

expressam os mesmos

genes?

Princípios:

Conceitos:







A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

M5

Education

Transcript of M5