MÓDULO III

PCR

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Reacção em Cadeia da Polimerase: fotocopiadora molecular

Laboratório Virtual de Biotecnologia

Introdução

O desenvolvimento da Reacção em

Cadeia da Polimerase (Polymerase

Chain Reaction – PCR), em meados

dos anos oitenta, pode considerar-se

como uma revolução dentro de outra.

Esta técnica veio possibilitar novas

estratégias de análise de genes no

âmbito da tecnologia de DNA

recombinante, iniciada nos anos

setenta. Esta técnica permite a

análise de quantidades ínfimas de

material genético o que possibilita um

melhoramento das técnicas utilizadas

no diagnóstico genético, investigação

forense, sistemática, etc.

De acordo com Mark Hughes,

Director do National Center for Human

Genome Research at the National

Institutes of Health, a técnica de PCR

“é a tecnologia mais importante dos

últimos anos”. A revista Science

refere ainda que, por ser muito mais

simples e menos dispendiosa que

todas as técnicas anteriormente

utilizadas na duplicação de DNA, esta

técnica democratizou a investigação

genética, colocando-a ao alcance de

todos os biólogos.

O que é a técnica de PCR?

A PCR explora de uma forma

espantosa a função natural de um

grupo de enzimas denominadas

polimerases. Estas enzimas

encontram-se presentes em todos os

seres vivos e têm como função copiar

o material genético (além de

corrigirem os erros que podem

ocorrer durante o processo de cópia).

Uma reacção de PCR necessita

essencialmente da presença da

sequência de DNA que se pretende

amplificar, de um par de sequências

nucleotídicas iniciadoras (que

normalmente são denominadas

primers), de nucleótidos (A, T, G e C)

e de uma polimerase. Os primers são

pequenas sequências de DNA de

cadeia simples, desenhadas em

laboratório (ou encomendadas a

empresas de Biotecnologia

especializadas), que são

complementares às extremidades 3’

do segmento de DNA relevante.

Assim, durante a reacção de PCR, os

primers irão flanquear a sequência

que queremos amplificar. Deste

modo, é necessário obter alguma

informação sobre a sequência de

DNA, ou sobre as sequências

flanqueantes, para levar a cabo uma

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reacção de PCR. Os primers são

misturados em excesso com a

amostra de DNA e a enzima

polimerase. Adiciona-se ainda

magnésio (cofactor da polimerase) e

os nucleótidos.

A reacção de PCR consiste numa série

de ciclos, cada um dos quais

envolvendo três passos efectuados a

diferentes temperaturas:

A desnaturação (Passo 1) consiste na

incubação do DNA a uma temperatura

de 95 ºC para separar as cadeias

simples. Segue-se o emparelhamento

dos primers (Passo 2) que flanqueiam

o DNA, diminuindo gradualmente a

temperatura para cerca de 55 ºC.

Esta temperatura varia dependendo

da composição do primer e da sua

complementaridade com o DNA alvo.

Durante este passo, as duas cadeias

complementares do DNA alvo

permanecem desnaturadas porque

estão em concentração baixa e não se

encontram para emparelhar. Como

estão presentes em concentração

muito alta, os primers emparelham

com as regiões flanqueantes do DNA

alvo. Finalmente, para completar o

ciclo, é feita a síntese de DNA pela

DNA polimerase a uma temperatura

de 72 ºC (Passo 3). Esta enzima faz a

extensão dos primers, utilizando como

molde a cadeia a que cada primer

está emparelhado.

O ciclo de desnaturação (95 ºC),

emparelhamento (55 ºC) e síntese

(72 ºC) é repetido várias vezes. Cada

ciclo demora apenas alguns minutos

e, por isso, todo o processo é muito

rápido (Fig.1).

Figura 1 – Um ciclo de PCR.

O resultado final é a amplificação

das sequências de DNA delimitadas

pelos dois primers utilizados na

reacção. Na prática obtém-se uma

quantidade enorme de um DNA alvo

partindo de uma mistura complexa

em que esta molécula pode estar

presente como cópia única. Esta

quantidade é suficiente para que o

DNA possa ser directamente

visualizado num gel de agarose.

As temperaturas elevadas que se

utilizam durante cada ciclo de PCR

requeriam o uso de uma polimerase

estável, ou seja, de uma enzima que

não desnaturasse cada vez que fosse

exposta a temperaturas altas. No final

da década de 80 foi isolada a primeira

enzima termoestável a partir da

bactéria Thermus aquaticus. Esta

bactéria vive junto a fontes

hidrotermais (cuja temperatura ronda

Emparelhamento dos primers (55 ºC, 30 s)

Síntese de DNA (72 ºC, 2 min.)

Desnaturação (95 ºC, 30 s)

Desnaturação da amostra para separar as cadeias de

DNA (95 ºC, 5 min.)

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os 80 ºC) e a sua polimerase,

designada Taq DNA polimerase,

mantém-se activa, mesmo quando

exposta repetidamente a

temperaturas de 95 ºC, fazendo com

que seja ideal para ser utilizada na

PCR.

Quando esta técnica começou a

ser utilizada, os ciclos de temperatura

eram obtidos através da transferência

manual dos tubos da reacção entre

diferentes recipientes postos em

banhos-maria a temperaturas

específicas. Esta actividade era

entediante para os cientistas e podia

provocar o aparecimento de erros,

uma vez que era difícil manter os

banhos à temperatura ideal e

controlar bem os tempos de cada

banho. Este problema foi ultrapassado

quando se inventaram os

termocicladores automatizados.

Nestes, os tempos e as temperaturas

de cada fase do ciclo são introduzidos

no computador e são executadas

precisamente sem ser necessário

transferir os tubos da reacção de

recipiente em recipiente (Fig.2).

Figura 2 – Termociclador automatizado.

O aparecimento da Taq DNA

polimerase e dos termocicladores

permitiu a proliferação desta técnica

de tal modo que, actualmente, está

ao alcance de virtualmente todos os

cientistas e estudantes.

Aplicações da técnica de PCR

A PCR tem tido uma diversidade

de aplicações crescente. É utilizada

actualmente para amplificar DNA:

para ser directamente sequenciado ou

clonado; para mapeamento de genes;

para diagnóstico de doenças

hereditárias e doenças infecciosas;

para estudos forenses; e, entre

outros, para estudos moleculares de

evolução. Uma das capacidades mais

surpreendentes desta técnica é a

capacidade de amplificar DNA de

organismo extintos, alguns há vários

milhões de anos.

PCR: a fotocopiadora molecular

A técnica de PCR está a fazer com

o material genético o que a invenção

da prensa fez com o material escrito:

está a tornar acessíveis inúmeras

cópias de material genético de um

modo rápido e barato. Em princípio

esta técnica pode reproduzir o

material genético de qualquer

organismo em quantidades ilimitadas.

Deste modo, podemos analisar de um

modo simples o material genético de

qualquer organismo, incluindo o

Homem. Facilmente vemos as

inúmeras vantagens que esta técnica

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trouxe à Biotecnologia, tendo quase

imediatamente ocupado um lugar de

destaque em inúmeras áreas da

investigação.

Questões de análise

No Laboratório Virtual de

Biotecnologia encontrará uma

animação que ilustra e explica cada

etapa da técnica de PCR (canal 1 da

LVBtv).

1 – Descreva o que ocorre durante

um ciclo da técnica de PCR.

2 – Enumere as principais vantagens

desta técnica relativamente a outras

utilizadas anteriormente para

amplificar moléculas de DNA.

3 – Faça uma lista do material

necessário para realizar uma

experiência utilizando esta técnica.

4 – Indique as principais áreas onde

se pode aplicar esta técnica.

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Todos os pares de primers

amplificam do mesmo modo a

mesma molécula de DNA?

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Material biológico Pista

1 Pista

2

DNA alfa-C5 DNA beta-A7

Par de primers 1 Par de primers 2

Pista 1 Pista 2

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Material biológico Pista

1 Pista

2

DNA alfa-C5 DNA beta-A7

Par de primers 1 Par de primers 2

Pista 1 Pista 2

Um par de primers

apresenta sempre o mesmo

resultado,

independentemente da

molécula de DNA a

amplificar?

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Desenho experimental:

Registos/Observações:

ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA

Princípios:

Conceitos:

Teoria: Conclusões:

Material biológico Pista

1 Pista

2

DNA alfa-C5 DNA beta-A7

Par de primers 1 Par de primers 2

Pista 1 Pista 2

A quantidade de DNA

amplificado está

dependente do número

de ciclos de temperatura

que se efectua?