LUCIELLEN EICH

VALIDAÇÃO DO DOSEAMENTO DO EXTRATO SECO DE PASSIFLORA INCARNATA 3,5% CALCULADO COMO

FLAVONÓIDES TOTAIS EXPRESSO EM VITEXINA POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO UV-VISÍVEL

CANOAS, 2011

LUCIELLEN EICH

VALIDAÇÃO DO DOSEAMENTO DO EXTRATO SECO DE PASSIFLORA INCARNATA 3,5% CALCULADO COMO

FLAVONÓIDES TOTAIS EXPRESSO EM VITEXINA POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO UV-VISÍVEL

Trabalho de conclusão apresentado ao curso de Química, do Centro Universitário La Salle - UNILASALLE, como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Química.

Orientação: Profª. Me. Adriana Lopes Barros

CANOAS, 2011

LUCIELLEN EICH

VALIDAÇÃO DO DOSEAMENTO DO EXTRATO SECO DE PASSIFLORA INCARNATA 3,5% CALCULADO COMO

FLAVONÓIDES TOTAIS EXPRESSO EM VITEXINA POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO UV-VISÍVEL

Trabalho de conclusão de curso aprovado como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário La Salle - Unilasalle.

Aprovado pelo avaliador em 11 de julho 2011.

Profª. Me. Adriana Lopes Barros

Unilasalle

Dedico este trabalho ao meu marido Anderson pela dedicação, amor e paciência e ao meu filho Nicolas pela compreensão da ausência. Amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me concedido o dom da vida.

Aos meus pais, José Mauro e Neli, pelo amor incondicional e por acreditarem

na minha escolha.

Ao meu marido Anderson, pelo apoio, paciência, carinho, amor e incentivo.

Ao meu filho Nicolas, por compreender as minhas ausências.

Aos amigos, por estarem sempre ao meu lado.

A empresa, que permitiu este estudo.

A professora Beth Horn pelas leituras de meu trabalho.

A professora Adriana Barros pela dedicação e orientação para que eu

pudesse concluir esta monografia.

Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste sonho.

Muito obrigada!

RESUMO

O Extrato Seco de Passiflora Incarnata tem como seu principio ativo a vitexina, uma

substância do grupo dos flavonóides heterosídeos. Essa substância é extraida das

folhas da planta trepadeira do maracujá, possuindo propriedades farmacêuticas

sedativas, conhecidas popularmente há muitos anos.

O trabalho realizado consiste na validação da metodologia analítica para a matéria-

prima utilizada em um determinado medicamento fitoterápico, onde foram realizadas

análises de especificidade/seletividade, linearidade, exatidão, precisão e robustez,

cada uma com sua determinada especificação conforme a Resolução (RE) 899 de

2003, utilizando padrão de referência com o extrato da planta.

Palavras chaves: passiflora incarnata, vitexina, validação, metodologia analítica.

ABSTRACT

The Passion Flower Dry Extract has as its active ingredient vitexin, a substance from

the group of flavonoids heterosides. This substance is extracted from the leaves of

passion fruit vine, having sedative drug properties, popularly known for many years.

The work is the validation of analytical methodology for the raw material used in a

particular herbal medicine, which was analyzed for specificity/selectivity, linearity,

accuracy, precision and robustness, each with its particular specification in

accordance with Resolution (RE) 899 2003, using a benchmark with the plant extract.

Keywords: Passion Flower, vitexin, validation, analytical methodology.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 9

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 11

2.1 Validação ....................................................................................................... 11

2.2 Flavonóides .................................................................................................. 13

2.2.1 Vitexina ........................................................................................................ 15

2.2.2 Maracujá ...................................................................................................... 16

2.2.3 Extrato Seco de Passiflora Incarnata .......................................................... 17

3 METODOLOGIA ............................................................................................... 18

3.1 Métodos normalizados ................................................................................. 18

3.2 Métodos não normalizados ......................................................................... 18

3.3 Parâmetros de validação ............................................................................. 19

3.3.1 Especificidade/Seletividade ......................................................................... 20

3.3.2 Linearidade e Intervalo ................................................................................ 20

3.3.3 Exatidão ...................................................................................................... 21

3.3.4 Precisão ...................................................................................................... 22

3.3.4.1 Repetibilidade ........................................................................................... 22

3.3.4.2 Precisão Intermediária (Intercorridas) ...................................................... 23

3.3.5 Robustez ..................................................................................................... 23

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 24

4.1 Reagentes e equipamentos utilizados ........................................................ 24

4.2 Preparo da amostra ...................................................................................... 25

5 RESULTADOS .................................................................................................. 27

5.1 Discussão dos resultados da validação do método analítico .................. 29

5.1.1 Especificidade/Seletividade ......................................................................... 29

5.1.2 Linearidade e Intervalo ................................................................................ 31

5.1.3 Exatidão ...................................................................................................... 33

5.1.4 Precisão ...................................................................................................... 34

5.1.4.1 Repetibilidade ........................................................................................... 34

5.1.4.2 Precisão Intermediária (Intercorridas) ...................................................... 35

5.1.5 Robustez ..................................................................................................... 36

6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 38

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 40

9

1 INTRODUÇÃO

O Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5% é uma matéria-prima, composta

pela passiflora incarnata L. e determinados excipientes, adquirida por empresas

farmacêuticas para a fabricação de medicamentos fitoterápicos. A metodologia

farmacopéica existente para a realização do doseamento do principio ativo, é

adequada apenas para o extrato vegetal (planta) e não para extratos secos. Devido

a não existir metodologia para a quantificação da matéria-prima em questão, houve

a necessidade de uma validação de metodologia.

Validação de uma metodologia analítica é a atividade de identificar se um

método é adequado ao uso pretendido. O objetivo deste trabalho é reproduzir os

conceitos mínimos necessários para validar a metodologia do Extrato Seco de

Passiflora Incarnata 3,5%, apresentando a sistemática de validação de método

analítico não normalizado segundo a Resolução (RE) 899 de 2003.

De acordo com a RE 899 de 2003, o procedimento de validação para

métodos analíticos e bioanalíticos por espectrofotometria por absorção no

ultravioleta e visível deve apresentar os seguintes parâmetros:

especificidade/seletividade, linearidade, exatidão, precisão (repetibilidade e precisão

intermediária) e robustez.

As atividades realizadas contemplaram desde o desenvolvimento teórico,

envolvendo a revisão bibliográfica e planejamento de experimentos, até a execução

dos testes em laboratório.

Segundo Santos (2007), medição em análises químicas quer sejam para o

controle da qualidade de processos e produtos, quer sejam destinadas ao

acompanhamento de trabalhos de pesquisa e desenvolvimento, quando

consideradas "erradas" ou não suficientemente confiáveis, podem representar

grande desperdício de tempo e dinheiro.

Conforme Barros (2002), validação de métodos analíticos não normalizados

deve ser efetuada após seleção, desenvolvimento e otimização dos métodos. Leite

(2002) define que validar é estar com o objetivo voltado para a confiabilidade

analítica do laboratório e do método desenvolvido para se obter o resultado

desejado. É importante lembrar que não existe modelo pronto para sistemas de

10

validação, portanto devem-se fazer adaptações, adequando as recomendações às

suas necessidades (SANTOS, 2007).

11

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Neste segmento serão abordados temas referentes à validação e sua

importância de aplicabilidade, os flavonóides, a vitexina, o grupo flavônico e a planta

da qual essa substância é extraída.

2.1 Validação

Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis e

interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominado

validação. A validação de um método é um processo contínuo que começa no

planejamento da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu

desenvolvimento e transferência (RIBANI, 2004).

Validar em análise química é estar com o objetivo voltado para a

confiabilidade do laboratório e do método escolhido ou desenvolvido para obter o

resultado. Antes da validação deve-se aprimorar o método, diminuindo o tempo de

análise e consumo de reagentes, ou seja, obter um menor esforço e uma maior

satisfação (LEITE, 2002).

É fundamental que os laboratórios disponham de meios e critérios objetivos

para demonstrar, através da validação, que os métodos de ensaio que executam

conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida. Se um

método existente for modificado para atender aos requisitos específicos, ou um

método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve se assegurar de que as

características de desempenho do método atendem aos requisitos das operações

analíticas pretendidas (DOQ-CGCRE-008, 2003).

Validar significa ser uma equipe honesta com vontade de aprender, o

profissional deverá ter formação para cumprir com as Boas Práticas de Laboratório

(BPL), deverá ter conhecimentos sobre a análise em questão, para que possa

reduzir o custo analítico, reduzir limites de sensibilidade, discutir e justificar os

resultados obtidos com bases químicas, físicas e estatísticas (LEITE, 2002).

12

Validar é a comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva, de

que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram

atendidos (ANVISA, 2005; BERNARDES, 2011; FREITAS, 2006; REBLAS, 2002).

Validação de metodologia analítica é o processo pelo qual se estabelece,

através de estudos laboratoriais, que as características de desempenho do método,

também denominadas parâmetros de validação, apresentam os requisitos para a

aplicação analítica pretendida (USP 33).

Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o

método sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a

aplicação requer (RIBANI, 2004).

O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a

finalidade, ou seja, a determinação qualitativa, semiquantitava e/ou quantitativa de

fármacos e outras substâncias (RE 899, 2003).

A determinação das características de desempenho do método é somente

uma parte do processo e os critérios de aceitação são baseados no uso intencional

do método (BARROS, 2002).

Para se ter certeza que um método é confiável do ponto de vista analítico,

deve-se observar alguns critérios mínimos, tais como:

a) Conhecer a substância a ser analisada;

b) Conhecer a amostra que contém a substância a ser analisada;

c) Conhecer o melhor sinal analítico da substância a ser analisada;

d) Definir amostragem e preservação;

e) Definir as condições analíticas;

f) Seletividade ou especificidade da substância a ser analisada na amostra

em questão;

g) Coeficiente de recuperação;

h) Linearidade;

i) Precisão e exatidão;

j) Limites;

k) Cálculos e expressões de resultados;

l) Robustez.

13

2.2 Flavonóides

Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e

diversificados dentre os produtos de origem natural. Essa classe de compostos é

amplamente distribuída no reino vegetal (SIMÕES, 2004).

Podem-se encontrar flavonóides em diversas formas estruturais. Entretanto, a

maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em seu

núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três

carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleos

A, B e C e os átomos de carbono recebem numeração com números ordinários para

os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma linha (‘) para o núcleo B

(SIMÕES, 2004).

Figura 1 - Núcleo fundamental dos flavonóides e sua numeração Fonte: SIMÕES, 2004, p. 580.

Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Dentre elas

podem-se citar:

a) Proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível,

além de proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias;

b) Atração de animais com finalidade de polinização;

c) Antioxidantes;

d) Controle da ação de hormônios vegetais;

e) Agentes alelopáticos;

14

f) Inibidores de enzimas.

A grande abundância e diversidade dos flavonóides sugerem que eles sejam

importantes para as plantas, contudo não está claro que também o sejam para o

homem. De fato, pode-se inferir que os seres humanos ingerem diariamente muitas

gramas de flavonóides, encontrados nas frutas e em muitas outras espécies

vegetais, no vinho, em cereais e ocasionalmente em corantes alimentares.

Entretanto, não há comprovação evidente de que esses metabólitos sejam

imprescindíveis à alimentação humana (SIMÕES, 2004).

O emprego terapêutico de plantas contendo flavonóides é vasto e, em muitos

casos, ainda empírico. Embora alguns resultados tenham mostrado que os

flavonóides possam apresentar efeito mutagênico, em geral, são considerados como

benéficos. Alguns medicamentos, em particular para o tratamento de doenças

circulatórias, hipertensão e agindo como cofator da vitamina C, são elaborados a

partir de flavonóides. Outras pesquisas sugerem que alguns flavonóides são

responsáveis por ação antitumoral considerável, podendo ainda agir como antivirais,

anti-hemorrágicos, hormonais, anti-inflamatórios, antimicrobianos e antioxidantes

(SIMÕES, 2004).

Os flavonóides, normalmente, não são considerados substâncias tóxicas e

várias especialidades farmacêuticas os descrevem como isentos de toxidade

(SIMÕES, 2004).

Os flavonóides podem ser divididos nas seguintes classes, como mostra a

Tabela 1.

15

Tabela 1 - Classes de flavonóides e algumas características conhecidas

Classes Número aproximado

de estruturas conhecidas

Características

Flavonas, flavonóis e seus O-

heterosídeos 1660

co-pigmentação em flores, protetores contra raios UV nas

folhas C-heterosídeos 303

Antocianos 256 pigmentação do vermelho até o

azul Chalconas 197 pigmentação amarela Auronas 29 pigmentação amarela

Di-hidro-flavonóis 110 estão presentes

frequentemente em tecidos de madeira

Flavanonas 319 podem apresentar sabor amargo

Di-hidro-chalconas 71 podem apresentar sabor amargo

Flavanas, leucoantocianidinas e proantocianidinas

309 substâncias adstringentes com

propriedades tanantes

Isoflavonóides 630 propriedades estrôgenicas e/ou antifúgicas

Neoflavonóides 70 Biflavonóides 134 propriedades antifúgicas

Outras estruturas 100 Fonte: SIMÕES, 2004, p. 580

2.2.1 Vitexina

A vitexina pode ser classificada como um flavonóide C-heterosídeo, sendo

que a principal característica química desse grupo é a resistência à hidrólise ácida. É

geralmente solúvel em água e em alcoóis diluídos, mas insolúvel nos solventes

orgânicos habituais (SIMÕES, 2004).

A vitexina atua no sistema nervoso central, possuindo propriedades sedativas.

A molécula da vitexina está expressa na Figura 2.

16

Figura 2 - Molécula de Vitexina Fonte: Certificado de padrão primário USP, 2009.

A vitexina é extraída das folhas do maracujá, e para sua extração utilizam-se

geralmente solventes com polaridade crescente. A primeira extração, com solvente

apolar, retira óleos, gorduras, esteróis e pigmentos, facilita a extração posterior dos

flavonóides. O uso da água quente visa a extrair os heterosídeos mais polares

(SIMÕES, 2004).

2.2.2 Maracujá

O maracujá tem a seguinte caracterização botânica:

a) Nome cientifico: Passiflora alata Curtis e Passiflora edulis Sims

b) Família botânica: Passifloraceae

As partes utilizadas do maracujá são as folhas, as folhas secas são

empregadas como sedativo, embora as substâncias químicas responsáveis por essa

atividade não sejam conhecidos com clareza. Dessa forma, emprega-se o total dos

constituintes das folhas do vegetal. Diversas espécies são conhecidas em todo o

Brasil, sendo Passiflora edulis sims e Passiflora alata curtis as mais cultivadas. Nas

farmacopeias da Europa encontra-se a nomenclatura de Passiflora Incarnata, já que

não existem monografias desse extrato na farmacopéia Brasileira (SIMÕES, 2004).

17

2.2.3 Extrato Seco de Passiflora Incarnata

A passiflora (Passiflora Incarnata) é uma planta cultivada em regiões tropicais

e subtropicais. Usa-se a parte aérea seca ou fresca (RIBEIRO, 2000).

. Nomenclatura botânica Passiflora incarnata L. Nome popular Maracujá, Passiflora Parte usada Partes aéreas Padronização/Marcador Flavonóides totais expressos em vitexina Derivado de droga vegetal Extratos/tintura Indicações/Ações terapêuticas Ansiolítico leve

Dose Diária 20 a 64 mg de flavonóides totais expressos em vitexina

Via de Administração Oral Restrição de uso Venda sem prescrição médica

Quadro 1- Classificação do Extrato Seco de Passiflora Incarnata Fonte: ANVISA, 2008, L. 22

18

3 METODOLOGIA

Neste segmento serão abordados os temas referentes aos métodos

normalizados e não normalizados, quando deve ocorrer uma validação de

metodologia analítica e quais os principais parâmetros realizados na validação de

fitoterápicos conforme a RE 899 de 2003.

3.1 Métodos normalizados

São aqueles desenvolvidos por um organismo de normalização ou outras

organizações, aceitos pelo setor técnico em questão (DOQ-CGCRE-008, 2003).

3.2 Métodos não normalizados

São aqueles desenvolvidos pelo próprio laboratório ou outras partes, ou

adaptados a partir de métodos normalizados e validados (DOQ-CGCRE-008, 2003).

O processo de validação de um método não normalizado deve estar descrito

em um procedimento, e os estudos para determinar os parâmetros de desempenho

devem ser realizados com equipamentos e instrumentos dentro das especificações,

funcionando corretamente, adequadamente calibrados e validados. Da mesma

forma, o operador que realiza os estudos deve ser competente na área de estudo e

precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho e ser capaz de tomar as

decisões apropriadas durante a realização do estudo (DOQ-CGCRE-008, 2003).

O Laboratório deve validar os métodos não normalizados, métodos

desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados usados fora dos

escopos para os quais foram concebidos, ampliações e modificações de métodos

normalizados, com o objetivo de confirmar que eles são apropriados para o uso

pretendido. O laboratório deve registrar os resultados obtidos em um procedimento

utilizado para a validação (REBLAS, 2002).

19

A validação deve ser considerada quando se desenvolvem ou efetuam

adaptações em metodologias já validadas, inclusão de novas técnicas ou uso de

diferentes equipamentos (BRITO, 2003).

Toda metodologia analítica não descrita em farmacopeias ou formulários

oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, deverá ser validada.

3.3 Parâmetros de validação

Os parâmetros que devem ser avaliados durante a validação de metodologia

analítica para testes quantitativos do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou

matérias-primas são (RE 899, 2003):

a) especificidade/seletividade;

b) linearidade e intervalo;

c) exatidão;

d) precisão (repetibilidade e precisão intermediária);

e) robustez.

Para a garantia da qualidade analítica dos resultados, todos os equipamentos

utilizados na validação, assim como as vidrarias, deverão estar devidamente

calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados (RDC

17, 2010).

A calibração e verificação de equipamentos, instrumentos e outros aparelhos

utilizados devem ser realizados em intervalos regulares, sendo etiquetados,

codificados ou de alguma forma identificados para indicar o status de calibração e a

data da próxima recalibração (RDC 17, 2010).

A validação e a qualificação são essencialmente componentes do mesmo

conceito. O termo qualificação é normalmente utilizado para equipamentos,

utilidades e sistemas, enquanto validação é aplicada a processos. A qualificação

constitui-se uma parte do processo (RDC 17, 2010).

20

3.3.1 Especificidade/Seletividade

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em

presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e

componentes da matriz (BRITO, 2003; RE 899, 2003; BARROS, 2002).

A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do

composto de interesse. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a

exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas (RIBANI, 2004).

A especificidade/seletividade é avaliada a partir da análise do branco e do teor

total encontrado no extrato, totalizando 100% do ativo. O branco preparado deve ser

comparado ao padrão de referência utilizado e não deve apresentar nenhuma

absorvância no comprimento de onda do ativo em estudo (RE 899, 2003).

Segundo “Orientações sobre Controle de qualidade de extratos vegetais e

fototerápicos”, como a metodologia empregada consiste em espectrofotometria para

quantificação de flavonóides totais expressos em vitexina, um extrato devidamente

qualificado deverá ser utilizado como padrão de referência e, este extrato, deverá

ser padronizado por uma farmacopeia oficialmente reconhecida.

Padrão primário ou padrão de referência é a substância analítica conhecida e

confiável, proveniente de uma síntese ou de purificação de compostos técnicos. Seu

grau de pureza, sua estabilidade e sua procedência são conhecidos resultando num

certificado de qualidade (LEITE, 2002).

3.3.2 Linearidade e Intervalo

Linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os

resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito da

amostra, dentro de um intervalo especificado (BORGES, 2006; BRITO, 2003;

FREITAS, 2006; NUNES, 2005; RE 899, 2003).

Linearidade é a habilidade do método analítico de produzir resultados que são

diretamente, ou por uma transformação matemática bem definida, proporcionais à

21

concentração do analito, dentro de uma determinada faixa de aplicação (BARROS,

2002; RIBANI, 2004).

Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo

cinco concentrações diferentes, conforme aplicação desejada. De acordo com as

“Orientações sobre Controle de Qualidade de Extratos Vegetais Fitoterápicos”

dispostas no site da ANVISA, os resultados da validação da metodologia analítica

para fitoterápicos podem seguir os níveis de aceitação estipulados pela RE 899 de

2003, para métodos bioanalíticos. Sendo assim, se aceita um coeficiente de

correlação linear (r) superior a 0,98.

O coeficiente de correlação (R) reflete a dispersão média dos valores

individuais do sinal analítico das amostras de calibração em torno da curva de

calibração e em torno da curva de regressão teórica (Orientações sobre Controle de

Qualidade de Extratos Vegetais Fitoterápicos).

3.3.3 Exatidão

Exatidão é o parâmetro analítico que avalia a proximidade dos resultados

obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro, através da análise

de uma amostra na qual se tem uma quantidade conhecida do ativo (NUNES, 2005;

RE 899, 2003).

Representa o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como

verdadeiro (FREITAS, 2006; RIBANI, 2004).

A exatidão do método deverá ser determinada após o estabelecimento da

linearidade, do intervalo linear e da seletividade/especificidade do mesmo, sendo

verificada a partir de, no mínimo, nove determinações contemplando o intervalo

linear do procedimento, em triplicata (RE 899, 2003).

A exatidão deverá ser expressa através da relação entre a concentração

média determinada experimentalmente e a concentração teórica da amostra, como

mostra a equação (1):

22

Exatidão = Concentração média experimental x 100 (1)

Concentração teórica

Os resultados de recuperação deverão estar dentro de um intervalo de 90% a

110% e o desvio padrão relativo entre as amostras deverá ser menor que 5%. (RE

899, 2003)

3.3.4 Precisão

É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de

medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Pode ser

considerada por: repetibilidade (intracorrida) e precisão intermediária (intercorridas)

(NUNES, 2005; RE 899, 2003).

A precisão é expressa como desvio padrão relativo ou coeficiente de variação.

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia

empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do

método, não se admitindo valores superiores a 5% (RE 899, 2003).

3.3.4.1 Repetibilidade

A repetibilidade é a concordância entre os resultados obtidos dentro de um

curto período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação (BRITO,

2003; NUNES, 2005; RIBANI, 2004; RE 899, 2003).

Este parâmetro será verificado por, no mínimo, nove determinações,

contemplando o intervalo linear do método, ou seja, três concentrações (baixa,

média e alta), com três réplicas cada, ou um mínimo de seis determinações a 100%

da concentração alvo.

23

3.3.4.2 Precisão Intermediária (intercorridas)

A precisão intermediária é a concordância entre os resultados do mesmo

laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou

equipamentos diferentes (BRITO, 2003; NUNES, 2005; RIBANI, 2004; RE 899,

2003).

A precisão intermediária é reconhecida como a mais representativa da

variabilidade dos resultados em um único laboratório e, como tal, mais aconselhável

a ser adotada. O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que no

mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados (RIBANI, 2004).

Para isto, a amostra deverá ser analisada, no mínimo, em dois dias diferentes

com analistas diferentes.

3.3.5 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir

a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica confiança

durante o uso normal. Constatando-se a susceptibilidade do método a variações nas

condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser

incluídas no procedimento (BORGES, 2006; RE 899, 2003; LASMAR, 2007;

NUNES, 2005).

Os testes de robustez, em geral, servem para indicar os fatores que podem

influenciar, significantemente, a resposta do método estudado. Tal fato fornece a

dimensão do problema que ocorre quando o método é repetido em diferentes

condições ou é transferido, por exemplo, para outro laboratório (BRITO, 2003).

Para a avaliação da robustez, deverão ser estudadas as variações dos

parâmetros analíticos críticos para a técnica de análise na rotina do Controle de

Qualidade, considerando-se como aceitável a manutenção dos valores de

recuperação na faixa de 90 a 110% com Desvio Padrão Relativo (DPR) entre as

triplicatas abaixo de 5% (RE 899, 2003).

24

4 MATERIAIS E MÉTODOS

Neste segmento serão citados os reagentes e os equipamentos utilizados na

validação, assim como a metodologia analítica empregada na determinação do teor

do Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%.

4.1 Reagentes e equipamentos utilizados

a) Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%

b) Padrão de referência USP de vitexina Lote LOT G01046

c) Ácido Oxálico P.A. Nuclear

d) Ácido Bórico P.A. Dinâmica

e) Ácido Fórmico 98-100% P.A. Merck

f) Álcool Metílico P.A. Nuclear

g) Ácido Acético Glacial P.A. Nuclear

h) Álcool Etílico Absoluto P.A. Merck

i) Balança analítica Shimadzu modelo AY220

j) Agitador magnético Quimis modelo Q-261-22

k) Banho termostático modelo 550

l) Rota à vapor Fisaton modelo 802

m) Bomba à vácuo Tecnal modelo TE-058

n) Espectrofotômetro Ultra violeta e Visível Shimadzu modelo UV-1700

o) Ultrassom Unique modelo USC-2800 A

p) Purificador de água Milli-QPlus

q) Reagente de cor: para o reagente de cor foi preparada uma solução

contendo 25 g de Ácido Bórico (H3BO3) e 20 g de Ácido Oxálico

dihidratado (C2H2O4.2H2O) em 1 L de Ácido Fórmico (CH2O2).

r) Solução de Ácido Acético (C2H4O2) em Metanol (CH3OH) 100:10

s) Solução de Etanol 60% (C2H5OH).

25

4.2 Preparo da amostra

Para o preparo da amostra foram pesados 100 mg do extrato seco de

Passiflora Incarnata 3,5% em um erlenmeyer de 250 mL esmirilhado, adicionando 16

mL de água purificada para solubilização da amostra e 24 mL de álcool etílico. Após,

o erlenmeyer contendo a amostra foi colocado em banho de ultrassom por 5

minutos. Em seguida o erlenmeyer foi acoplado em condensador de refluxo e

aquecido a 60°C com agitação magnética por 30 minut os. Depois de transcorrido o

tempo, a amostra foi filtrada por algodão para balão volumétrico calibrado de 100

mL, apertando-se o algodão com bastão de vidro contra o funil para retirar todo o

líquido. O algodão da filtragem foi colocado no erlenmeyer da primeira extração, e

foram adicionados 40 mL de solução de etanol 60%, acoplado novamente ao

condensador de refluxo com aquecimento de 60°C e ag itação magnética por 10

minutos. Transcorrido o tempo, filtrou-se por filtro quantitativo para o mesmo balão

volumétrico calibrado, retirando-se o algodão do erlenmeyer e apertando-se com

bastão de vidro contra o funil para retirar o liquido. O erlenmeyer foi lavado com

solução de etanol 60%, o líquido foi transferido para o funil, filtrando a solução para

o balão volumétrico calibrado e completado o volume a 100 mL com a solução de

álcool etílico 60%, a solução resultando foi denominada de solução mãe.

Com o auxilio de uma pipeta volumétrica calibrada, foi transferida uma

alíquota de 5 mL da solução mãe para um balão de fundo redondo de 250 mL

esmirilhado e a amostra evaporada em rota à vapor em uma temperatura de 60°C. O

resíduo foi ressuspendido, utilizando pipetas volumétricas calibradas, com 10 mL de

solução de ácido acético em metanol, 10 mL de ácido fórmico e 5 mL de ácido

acético glacial, transferidos para balão volumétrico calibrado de 25 mL. O volume foi

completado com ácido acético glacial, a solução resultante foi chamada de solução

de compensação ou branco.

Com o auxilio de uma pipeta volumétrica calibrada, foi transferida uma

alíquota de 5 mL da solução mãe para um balão de fundo redondo de 250 mL

esmirilhado e a amostra evaporada em rota à vapor em uma temperatura de 60°C. O

resíduo foi ressuspendido, utilizando pipetas volumétricas calibradas, com 10 mL de

solução de ácido acético em metanol com a solução sendo transferida para balão

volumétrico calibrado de 25 mL. O balão de fundo redondo foi lavado com 5 mL de

26

ácido acético glacial e o líquido transferido para o mesmo balão volumétrico

calibrado. Após, foram adicionados 10 mL do reagente de cor no balão volumétrico

de 25 mL. O volume foi completado com ácido acético glacial, obtendo-se assim a

solução teste ou solução amostra.

Após 30 minutos as amostras foram lidas em espectrofotômetro em uma

absorvância de 401 nm, utilizando a solução de compensação como branco.

Ambas as soluções, amostra e branco, foram preparadas com o máximo

cuidado, devido ao branco interferir no espectro obtido com a solução amostra.

27

5 RESULTADOS

A comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva, de que os

requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram atendidos é

uma forma de demonstrar que o método é adequado ao uso (NBR ISO 9000). Leite

(2002) afirma que comparar resultados faz parte do dia-a-dia do químico analítico,

garantir que resultados diferentes são comparáveis e que a precisão de ambos é

coerente é sempre uma decisão a ser tomada pelo grupo da confiabilidade.

Geralmente o objetivo final de cada pesquisa ou a análise científica é

identificar relações entre variáveis. Assim, o avanço da ciência deve sempre

empenhar-se encontrar relações consistente entre técnicas disponíveis para facilitar

as atividades diárias. Alguns testes são considerados adequados no apoio a esta

tomada de decisão e utilizam-se da análise de variância para isso. De forma geral, a

finalidade da análise de variância é testar diferenças significativas entre os métodos

comparados, cujo objetivo principal é testar e analisar as variações entre esses

(SANTOS, 2007).

Para os cálculos dos resultados, apresentados nas Tabelas 02 a 07, para o

Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%, foi utilizado o raciocínio exposto abaixo:

a) Como a amostra foi diluída para 100 mL com solvente e 5 mL dessa

diluição foram utilizados na reação com o reagente de cor em um balão

volumétrico de 25 mL, o resultado final expresso em mg de flavonóides

totais calculados como vitexina por 100 mg de extrato seco (% p/p), é

exposto na equação (2):

Absorvância específica do padrão (628) → 0,01 g.mL-1 (Concentração do Padrão)

Absorvância da amostra → X (g.mL-1) = 628

01,0)( xamAbs (2)

A absorvância específica de vitexina na concentração de 0,01 g.mL-1 é de 628

(Farmacopéia Européia).

b) Como a amostra foi diluída para 100 mL de solvente, temos a equação (3):

28

1 mL → 628

01,0)( xamAbs

100 mL → 628

10001,0)( xxamAbs

(3)

c) Como foram utilizados 5 mL da amostra na reação com o reagente de cor,

equação (4):

1 mL (tomada de amostra) → Concentração da amostra 628

10001,0)( xxamAbs

5 mL (tomada de amostra) → Y (g na T.A.) = 5628

10001,0)(

x

xxamAbs (4)

d) Diluindo para balão volumétrico de 25 mL, tem-se a equação (5):

1 mL (tomada de amostra) → Concentração da amostra 5628

10001,0)(

x

xxamAbs

25 mL de solução de leitura → Y (g na T.A.) = 5628

2510001,0)(

x

xxxamAbs (5)

e) Considerando a tomada de amostra inicial temos a equação (6):

Massa da amostra (g).......................... 5628

2510001,0)(

x

xxxamAbs

100 g .................................................. Z (g/100g) = 5628

1002510001,0)(

x

xxxxamAbs (6)

f) Sendo assim, a equação final (7) será:

29

% de flavonóides totais calculados como vitexina = )(628

500)(

gxm

xamAbs (7)

Onde:

Abs(am) = absorvância da amostra

500 = resultado das diluições do processo

628 = absorvância específica de vitexina em 401 nm a 0,01 g.mL-1

m = massa da amostra (g)

No doseamento do lote utilizado no processo de validação, o teor de vitexina

encontrado foi de 3,81%. A faixa de doseamento especifica para este extrato é de

3,5 a 3,9%.

5.1 Discussão dos resultados da validação do método analítico

5.1.1 Seletividade/Especificidade

Para avaliar a seletividade/especificidade, foi realizada análise espectral do

extrato seco e do padrão de referência de vitexina, o que contribui para assegurar

que os compostos presentes na amostra apresentam perfil espectral semelhante ao

padrão, ou seja, são da mesma classe química do padrão. Os perfis espectrais

foram obtidos a partir do padrão e de uma amostra preparada a 100%, conforme

mostra a Figura 3.

30

PADRÃO AMOSTRA

Figura 3 - Perfil espectral do Padrão de Vitexina x Amostra Fonte: Relatório de absorção do equipamento de espectrofotometria de UV-Vís, 2010.

Os espectros de absorção apresentados na Figura 3 confrontam o perfil de

absorção da amostra e do padrão USP de vitexina. Pode-se notar que o composto

de interesse está presente na amostra, e que o perfil espectral da amostra

corresponde com o perfil espectral do padrão USP de vitexina, ambos absorvendo

em 401 nm, apontando a seletividade do método em quantificar, de fato, a

substância de interesse.

31

BRANCO PADRÃO

Figura 4 - Perfil espectral do Branco x Padrão de Vitexina Fonte: Relatório de absorção do equipamento de espectrofotometria de UV-Vís, 2010.

Observou-se comparando os espectros do branco e do Padrão de vitexina,

conforme Figura 4, que o branco preparado não apresentou absorvância no

comprimento de onda de 401 nm.

5.1.2 Linearidade e Intervalo

A linearidade foi avaliada com cinco níveis de concentração, 50%, 75%,

100%, 125% e 150% da concentração alvo de vitexina. As soluções dos padrões

foram avaliadas em triplicata, sendo que todos os dados gerados foram utilizados

para a construção do gráfico da Figura 5 que registra a concentração real calculada

versus a resposta obtida do método.

Na Tabela 2 estão descritos os valores encontrados nas análises realizadas

de linearidade, com o padrão USP de vitexina.

32

Tabela 2 - Valores da linearidade do padrão USP de vitexina

Concentração

(%)

Concentração

(µg.mL -1) Absorvância

50 0,00352 0,213

75 0,00528 0,336

100 0,00720 0,426

125 0,00880 0,530

150 0,01040 0,588

% DPR 3,50%

Fonte: Autoria própria, 2010. Onde: %DPR – Desvio Padrão Relativo.

A Figura 5 apresenta a curva de linearidade do padr ão USP de vitexina.

Figura 5 - Gráfico curva de linearidade dos padrões de Vitexina Fonte: Autoria própria, 2010.

33

Como visualizado, a correlação dos dados gerou um coeficiente de correlação

superior a 0,98 (0,9913). Dessa forma, a linearidade apresentada pelo método em

questão está dentro do intervalo de 50 a 150%.

5.1.3 Exatidão

A avaliação do parâmetro exatidão foi realizada com três concentrações:

baixa, média e alta, correspondentes às concentrações teóricas de 50%, 100% e

150% de extrato, preparadas em triplicatas, totalizando nove determinações.

O resultado desse teste é apresentado em porcentagem de recuperação de

cada concentração analisada, calculado com base na equação (8):

Recuperação (%) = Concentração média experimental x 100

Concentração teórica (8)

Na Tabela 3 estão descritos os valores encontrados nas análises realizadas

de exatidão, com o Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%.

Tabela 3 - Exatidão do Extrato Seco Passiflora Incarnata 3,5%

Concentração

Concentração

teórica

(mg.mL -1)

Absorvância Vitexina

(%)

Concentração

experimental

(mg.mL -1)

Recuperação

(%)

150% 0,011460 0,677 3,60 0,010832 94,52

100% 0,007658 0,483 3,84 0,007728 100,91

50% 0,003825 0,234 3,73 0,003744 97,88

FONTE: AUTORIA PRÓPRIA, 2010.

A média das recuperações da exatidão está dentro do intervalo de 90% a 110%, estando de acordo com a RE 899 de 2003.

Média de Recuperação (%) 97,83

DPR% 2,82

34

5.1.4 Precisão

Precisão é o grau de concordância mútua entre os dados que foram obtidos

do mesmo modo (SKOOG, 2002). Portanto quanto mais próximos entre si estiverem

os valores experimentais (menor amplitude), mais preciso será o método. Esta

medida reflete a tendência de maior ou menor afastamento (erro) entre os resultados

dos ensaios.

5.1.4.1 Repetibilidade

Para o teste de repetibilidade, foram preparadas seis amostras a 100% do

Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5% como mostra a Tabela 4.

Tabela 4 - Resultados obtidos no Parâmetro de repetibilidade para o Extrato Seco de

Passiflora Incarnata 3,5%

Amostra Massa (g) Absorvância Vitexina (%)

A 0,1002 0,461 3,68

B 0,1000 0,470 3,76

C 0,1010 0,463 3,67

D 0,1000 0,466 3,73

E 0,1038 0,472 3,64

F 0,1002 0,475 3,79

FONTE: AUTORIA PRÓPRIA, 2010.

O desvio padrão relativo (DPR%) encontrado no teste de repetibilidade, foi

menor que 5%, estando de acordo com a RE 899 de 2003.

Média 3,72

DPR% 1,68

35

5.1.4.2 Precisão Intermediária ou Precisão Intercorridas

Para o teste de precisão intermediária, foram preparadas seis amostras a

100% do extrato em dois dias diferentes e por analistas diferentes. Para o Dia Um,

utilizaram-se os resultados do teste de repetibilidade.

Os resultados encontrados para a precisão intermediária do método em

validação estão apresentados na Tabela 5, estando de acordo com o critério de

aceitação.

Tabela 5: Resultado do teste de Precisão intermediária do Extrato Seco de

Passiflora Incarnata 3,5%

Fonte: Autoria própria, 2010.

O desvio padrão relativo (DPR%) encontrado no teste de precisão

intermediária, foi menor que 5%, estando de acordo com a RE 899 de 2003.

Analista Amostra Massa

(g) Absorvância

Vitexina

(%) DPR%

Dia

1 A

A 0,1002 0,461 3,68

1,59

B 0,1000 0,470 3,76

C 0,1010 0,463 3,67

D 0,1000 0,466 3,73

E 0,1038 0,472 3,64

F 0,1002 0,475 3,79

Dia

2 B

A 0,1010 0,490 3,88

0,93

B 0,1005 0,485 3,86

C 0,1012 0,487 3,85

D 0,1018 0,488 3,83

E 0,1000 0,472 3,78

F 0,1005 0,483 3,84

Média entre os dia 3,78

DPR% entre os dias 1,26

36

5.1.5 Robustez

A robustez foi avaliada em quatro variáveis. Escolheu-se variar analista, data

do preparo do reativo de cor, comprimento de onda da leitura e tempo para a leitura

da amostra, conforme pode ser observado na Tabela 6.

Tabela 6 - Tabela de Robustez

Teste Parâmetro Condição

Normal

Alteração

Realizada

A Preparo da Amostra Analista A Analista B

B Preparo do Reativo de

Cor

No dia da

análise

3 dias antes do

uso

C Comprimento de Onda

de Leitura 401 nm 406 nm

D Tempo de Leitura da

Amostra

Após 30

minutos 1h após preparo

Fonte: RE 899/2003.

Para realização do teste, foram preparadas quatro amostras, procurando obter

a concentração de 3,5% a 3,9% de vitexina e um controle.

O resultado médio das réplicas foi comparado à média do controle (análise

realizada na condição normal, apresentando os resultados finais (%), mostrado na

equação (9)):

Teor do controle .................... 100%

Resultado da amostra ............. X (9)

Os resultados obtidos no teste de robustez estão descritos na Tabela 7.

37

Tabela 7 - Resultados de Robustez do Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%

Amostra Absorvância

(401 nm)

Média das

Absorvâncias

% de

Vitexina

Resultados

finais (%)

DPR da

triplicata

(%)

Controle

0,466

0,466 3,73 - 0,12 0,467

0,466

A

0,483

0,483 3,86 103,64 0,12 0,484

0,483

B

0,497

0,497 3,89 106,65 0,12 0,498

0,497

C

0,471

0,472 3,77 101,14 0,24 0,473

0,471

D

0,492

0,492 3,94 105,50 0 0,492

0,492

Fonte: Autoria própria, 2010.

A partir dos resultados obtidos, observou-se que as variações de resultados

obtidos com as variáveis da análise não causaram interferência significativa nos

resultados, representando, assim, a robustez do método. No entanto, mesmo

obtendo valores aceitáveis para os resultados finais das amostras, recomenda-se

que não seja alterado o comprimento de onda da leitura, que o reativo de cor seja

preparado no dia da análise e que a leitura seja efetuada 30 minutos após o preparo

da amostra, devido o teor de vitexina encontrado (3,94%) no Teste D estar fora da

especificação (3,5 – 3,9%) do Extrato seco de Passiflora Incarnata 3,5%.

38

6 CONCLUSÃO

Este trabalho foi realizado em uma empresa farmacêutica, que tem por

finalidade atender às normas de legislação vigente. Segundo a RDC 17 de 2010, é

por meio da validação que um fabricante pode estabelecer com confiança se os

produtos fabricados irão consistentemente atender as suas especificações.

Segundo a RE 899 de 2003, o objetivo da validação de metodologias

analíticas é demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida e,

por determinação e interesses da empresa, iniciou-se o estudo da validação do

doseamento do teor de vitexina do Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%.

Conforme a RE 899 de 2003, em caso de metodologias analíticas não

descritas em farmacopeias ou formulários oficiais, devidamente reconhecidos pela

ANVISA, a metodologia será considerada validada somente se atender aos

parâmetros de especificidade/seletividade, linearidade, precisão, exatidão e

robustez.

As análises da variação dos parâmetros estudados obtiveram os seguintes

resultados:

a) O espectro de absorção do Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%

corresponde ao espectro de absorção do padrão USP de vitexina. O

branco preparado não apresentou absorvância no comprimento de onda

estipulado, atendendo assim aos parâmetros de seletividade e

especificidade.

b) A linearidade do padrão USP de vitexina apresentou coeficiente de

correlação igual a 0,9913, superior ao especificado 0,98 para

medicamentos fitoterápicos.

c) As amostras de exatidão apresentaram uma média de recuperação igual a

97,83%, estando dentro do intervalo especificado de 90 a 110%.

d) O desvio padrão relativo encontrado nos testes de repetibilidade e

precisão intermediária, respectivamente, foram de 1,68% e 1,28%.

Resultados inferiores aos 5,00% estipulado.

e) No teste de robustez, as variações de resultados obtidos com as variáveis

das análises não causaram interferência significativa nos resultados.

39

Assim, podemos concluir que a metodologia apresentada atende aos

requisitos mínimos de validação. O método de doseamento da substância vitexina

expressa por flavonóides totais do Extrato Seco de Passiflora Incarnata 3,5%,

mostrou aplicabilidade ao uso pretendido.

40

REFERÊNCIAS

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