Lista e descrição dos métodos de análise referidos no...

II

(Comunicações)

COMUNICAÇÕES ORIUNDAS DAS INSTITUIÇÕES, ÓRGÃOS E ORGANISMOS DA UNIÃO EUROPEIA

COMISSÃO EUROPEIA

Lista e descrição dos métodos de análise referidos no artigo 120. o -G, primeiro parágrafo, do Regulamento (CE) n. o 1234/2007 do Conselho ( 1 )

[publicadas em conformidade com o artigo 15. o , n. o 2, do Regulamento (CE) n. o 606/2009 da Comissão, de 10 de Julho de 2009 ( 2 )]

(2010/C 43/01)

O quadro seguinte constitui a lista dos métodos de análise aplicáveis na verificação da observância dos limites e requisitos estabelecidos na regulamentação comunitária para a elaboração de produtos vitivinícolas. A referência constante da terceira coluna do quadro para cada parâmetro é a do método de análise correspondente descrito na edição mais recente (2009) do «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV disponível na data da presente publicação. Apenas os métodos de referência (tipos I e II da classificação da OIV) são descritos para cada parâmetro, excepto quando não se encontre ainda validado um método do tipo I ou II. Os métodos são descritos no anexo da presente comunicação.

Notas:

O «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV define os vários tipos de métodos de análise no anexo A, secção I, nomeadamente o tipo I (método de referência critério), o tipo II (método de referência) e o tipo IV (método provisório).

Os métodos de análise do chumbo e do cádmio são agora descritos no Regulamento (CE) n. o 333/2007 da Comissão ( 3 ), de 28 de Março de 2007 (parte C, ponto C.3, do anexo). Além disso, o Regulamento (CE) n. o 401/2006 ( 4 ), de 23 de Fevereiro de 2006, estabelece critérios gerais para métodos de análise da ocratoxina A no seu anexo II, ponto 4, pelo que não é necessário descrever um método de análise desta substância especificamente aplicável aos produtos vitivinícolas.

LISTA DOS MÉTODOS DE ANÁLISE

Número Parâmetro Método do Compêndio da OIV Tipo

1 Massa volúmica / Densidade AS-2-01-MASVOL I

2 Índice de refracção AS-2-02-SUCREF I

3 Resíduo seco total AS-2-03-EXTSEC I

4 Razão isotópica 18 O/ 16 O da água do vinho AS-2-09-MOUO18 II

PT 19.2.2010 Jornal Oficial da União Europeia C 43/1

( 1 ) JO L 299 de 16.11.2007. ( 2 ) JO L 193 de 24.7.2009, p. 1. ( 3 ) JO L 88 de 29.3.2007, p. 29. ( 4 ) JO L 70 de 9.3.2006, p. 12.

Número Parâmetro Método do Compêndio da OIV Tipo

5 Índice de Folin AS-2-10-INDFOL IV

6 Teor de açúcar (glucose + frutose) AS-311-02-GLUFRU II

7 Teor de sacarose (determinação por HPLC) AS-311-03-SUCRES II

8 Ressonância magnética nuclear do deutério do etanol do vinho

AS-311-05-ENRRMN (em fase de revisão) I

9 Título alcoométrico volúmico (%) AS-312-01-TALVOL I

10 Razão isotópica 13 C/ 12 C do etanol do vinho AS-312-06-ETHANO II

11 Acidez total AS-313-01-ACITOT I

12 Acidez volátil AS-313-02-ACIVOL I

13 Ácido cítrico AS-313-09-ACIENZ II

14 Ácido sórbico AS-313-14-ACISOR IV

15 pH de mostos AS-313-15-PH I

16 Ácido ascórbico AS- 313-22 ACASCO II

17 CO 2 (g/l) AS-314-01-DIOCAR II

18 CO 2 (g/l) (manometria) AS-314-04-CO2MAN II

19 Sobrepressão de CO 2 AS-314-02-SURPRES I

20 Lisozima AS-315-14-LYSOZY IV

21 Sulfato de potássio AS-321-05-SULFAT II

22 Ferro AS-322-05-FER IV

23 Cobre AS-322-06-CUIVRE IV

24 Sulfitos (SO 2 ) ou Dióxido de enxofre total

AS-323-04-DIOSU II

As instâncias da OIV estão a actualizar o descritivo de alguns métodos de análise. Esses descritivos serão publicados numa próxima comunicação da Comissão logo que a OIV publique um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos.

PT C 43/2 Jornal Oficial da União Europeia 19.2.2010

ANEXO

ÍNDICE

1. MASSA VOLÚMICA A 20 °C E DENSIDADE RELATIVA A 20 °C (OIV–AS2–01-MASVOL) — Método do tipo I 4

2. AVALIAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES DOS MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS E MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS, POR REFRACTOMETRIA (OIV - AS2 - 02-SUCREF) — Método do tipo I . . . . . . 8

3. RESÍDUO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Matéria seca total — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . 10

4. DETERMINAÇÃO DA RAZÃO ISOTÓPICA 18 O/ 16 O DA ÁGUA DOS VINHOS (OIV-AS-2-09-MOUO18) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

5. ÍNDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) — Método do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

6. GLUCOSE E FRUTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

7. DOSAGEM DOS AÇÚCARES (SACAROSE) POR HPLC (OIV–AS–311–03–SUCRES) — Método do tipo II . . 17

8. DETECÇÃO, POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE DEUTÉRIO, DO ENRIQUECIMENTO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS E VINHOS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

9. TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . 19

10. DETERMINAÇÃO, POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ISOTÓPICA, DA RAZÃO ISOTÓPICA 13 C/ 12 C DO ETANOL DO VINHO OU DO ETANOL OBTIDO POR FERMENTAÇÃO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS OU MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06- ETHANO) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

11. ACIDEZ TOTAL (OIV-AS-313-01-ACITOT) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

12. ACIDEZ VOLÁTIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

13. ÁCIDO CÍTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

14. ÁCIDO SÓRBICO (OIV -AS-313-14-ACISOR) — Método do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

15. pH (OIV-AS-313-15-PH) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

16. DOSAGEM SIMULTÂNEA DO ÁCIDO l-ASCÓRBICO E DO ÁCIDO D-ISOASCÓRBICO POR HPLC, COM DETECÇÃO NO ULTRAVIOLETA (OIV–AS-313-22-ACASCO) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

17. DIÓXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

18. DOSAGEM DO DIÓXIDO DE CARBONO NO VINHO PELO MÉTODO MANOMÉTRICO (OIV–AS314-04- -CO2MAN) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

19. MEDIÇÃO DA SOBREPRESSÃO EM VINHOS ESPUMANTES E FRISANTES (OIV-AS-314-02-SURPRES) — Método do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

20. DOSAGEM DA LISOZIMA NO VINHO POR HPLC (OIV-AS-315-14) — Método do tipo IV . . . . . . . . . . . . 51

21. SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

22. FERRO (OIV - AS-322-05-FER) — Método do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

23. COBRE (OIV – AS-322-06) — Método do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

24. DIÓXIDO DE ENXOFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) — Método do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58


1 MASSA VOLÚMICA A 20 °C E DENSIDADE RELATIVA A 20 °C (OIV–AS2–01-MASVOL) — MÉTODO DO TIPO I

1. DEFINIÇÕES

A massa volúmica é o quociente entre a massa de um determinado volume de vinho ou de mosto, a 20 °C, e esse volume. Exprime-se em gramas por mililitro e o seu símbolo é ρ20 °C.

A densidade relativa a 20 °C, ou densidade 20 °C/20 °C, é a razão, expressa por um número decimal, entre a massa de um determinado volume de vinho ou de mosto, a 20 °C e a massa do mesmo volume de água à mesma temperatura. O seu símbolo é d 20 °C

20 °C

2. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS

Determinação da massa volúmica e da densidade relativa, a 20 °C, na amostra para ensaio:

por picnometria (método de referência) ou

por densimetria (balança hidrostática ou densimetria electrónica).

Nota:

Para determinações muito precisas, a massa volúmica deve ser corrigida do efeito do dióxido de enxofre:

ρ 20 °C = ρ′ 20 °C – 0,0006S,

ρ 20 °C = massa volúmica corrigida

ρ′ 20 °C = massa volúmica observada

S = dióxido de enxofre total, em g/l.

3. TRATAMENTO PRÉVIO DA AMOSTRA

Se o vinho ou o mosto contiverem quantidades significativas de dióxido de carbono, expulsar a maior quantidade possível, por agitação de 250 ml de vinho num balão de 1000 ml ou por filtração, sob pressão reduzida, através de 2 g de algodão colocado numa alonga.

4. MÉTODO DE REFERÊNCIA

4.1. Equipamento

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

4.1.1. Picnómetro ( 1 ) de vidro pyrex, com cerca de 100 ml de capacidade, dotado de um termómetro amovível com esmerilado, com graduação em décimos de grau de 10 °C a 30 °C. Este termómetro deve ser aferido (ver a figura 1).

Figura 1

Picnómetro e frasco-tara

O picnómetro dispõe de um tubo lateral de 25 mm de comprimento, com diâmetro interno máximo de 1 mm, terminado por uma parte cónica esmerilada. O tubo lateral pode ter uma «tampa receptora», constituída por um tubo cónico com esmerilado e terminado por uma parte afilada. Esta «tampa» serve de câmara de dilatação.


( 1 ) Pode ser utilizado qualquer picnómetro de características equivalentes.

As duas esmerilagens do dispositivo devem ser feitas com muito cuidado.

4.1.2. Frasco-tara com o mesmo volume externo que o picnómetro (aproximação inferior a 1 ml) e massa igual à do picnómetro, cheio de um líquido de densidade 1,01 (solução a 2 % (m/v) de cloreto de sódio).

Camisa termicamente isolada que se adapte exactamente ao picnómetro.

4.1.3. Balança de dois pratos com capacidade de, pelo menos, 300 g, sensível às décimas de miligrama

ou

balança de prato único com capacidade de, pelo menos, 200 g, sensível às décimas de miligrama.

4.2. Calibração do picnómetro

A calibração do picnómetro compreende a determinação das seguintes características:

— tara em vazio,

— volume a 20 °C,

— massa com água, a 20 °C.

4.2.1. Utilização de uma balança de dois pratos

Depois de colocar o frasco-tara no prato esquerdo da balança e o picnómetro, limpo, seco e munido da respectiva «tampa receptora», no prato direito, estabelecer o equilíbrio, colocando ao lado do picnómetro massas marcadas. Seja «p» a massa correspondente, em gramas.

Encher o picnómetro cuidadosamente com água destilada, à temperatura ambiente, e introduzir o termómetro. Enxugar cuidadosamente o picnómetro e colocá-lo na camisa termicamente isolada. Agitar, por inversões sucessivas, até que a temperatura lida no termómetro seja constante. Nivelar a água exactamente pelo bordo superior do tubo lateral. Enxugar o tubo lateral e colocar a «tampa receptora». Ler a temperatura (t °C) com cuidado e, se necessário, corrigi-la em função da inexactidão da escala do termómetro. Pesar o picnómetro cheio de água. Seja «p′» a massa, em gramas, que restabelece o equilíbrio.

Cálculos

Tara do picnómetro vazio:

Tara em vazio = p+m,

m = massa de ar contida no picnómetro

m = 0,0012(p–p′).

Volume a 20 °C:

V 20 °C = (p+m–p′)×F t ,

F t = factor que consta do quadro I para a temperatura t °C

V 20 °C deve ser conhecido com a aproximação de ± 0,001 ml.

Massa de água a 20 °C:

M 20 °C = V 20 °C ×0,998203

0,998203 = massa volúmica da água a 20 °C.

4.2.2. Utilização de uma balança de prato único

Determinar:

— a massa do picnómetro limpo e seco: P,

— a massa do picnómetro cheio de água, a t °C: P1 (seguir as indicações do ponto 4.2.1),

— a massa do frasco-tara: T 0 .


Cálculos

Tara do picnómetro vazio:

Tara em vazio: = P–m,

m = massa de ar contida no picnómetro

m = 0,0012(P 1 –P)

Volume a 20 °C:

V 20 °C = [P 1 –(P–m)]×F t ,

F t = factor que consta do quadro I para a temperatura t °C.

O volume a 20 °C deve ser conhecido com a aproximação de ± 0,001 ml.

Massa de água a 20 °C:

M 20 °C = V 20 °C ×0,998203

0,998203 = massa volúmica da água a 20 °C.

4.3. Técnica de medição

4.3.1. Utilização de uma balança de dois pratos

Pesar o picnómetro cheio com a amostra para ensaio (ponto 3), seguindo as indicações do ponto 4.2.1.

Seja «p″» a massa, em gramas, que restabelece o equilíbrio a t °C.

Massa do líquido contido no picnómetro = p+m–p″.

Massa volúmica aparente a t °C:

ρ t °C = (p+m–p″)/(V 20 °C )

Calcular a massa volúmica a 20 °C por meio de um dos quadros de correcção abaixo referidos, consoante a natureza do líquido estudado: vinho seco (quadro II), mosto natural ou concentrado (quadro III), vinho doce (quadro IV).

Calcula-se a densidade 20 °C/20 °C do vinho dividindo a massa volúmica a 20 °C por 0,998203.

4.3.2. Utilização de uma balança de prato único

Pesar o frasco-tara. Seja «T1» a sua massa.

Calcular dT = T 1 –T o

Massa do picnómetro vazio no momento da medição = P–m+dT

Pesar o picnómetro cheio com a amostra para ensaio (ponto 3), seguindo as indicações do ponto 4.2.2. Seja «P2» a sua massa, a t °C.

Massa do líquido contido no picnómetro, a t °C = P 2 – (P–m+dT)

Massa volúmica aparente, a t °C:

ρ t °C = (P 2 –(P–m+dT)/V 20 °C

Calcular a massa volúmica a 20 °C do líquido estudado (vinho seco, mosto natural ou concentrado, vinho doce) como se indica no ponto 4.3.1.

A densidade 20 °C/20 °C é obtida dividindo a massa volúmica a 20 °C por 0,998203.

4.3.3. Repetibilidade da massa volúmica:

vinhos secos e meio-doces: r = 0,00010,

vinhos doces: r = 0,00018.

4.3.4. Reprodutibilidade da massa volúmica:

vinhos secos e meio-doces: R = 0,00037,

vinhos doces: R = 0,00045.


QUADRO I

Factores F

pelos quais é necessário multiplicar a massa de água contida no picnómetro de vidro pyrex a t °C, para calcular o volume do picnómetro a 20 °C

[Ver o quadro I do anexo II do método AS2 – 01 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]

QUADRO II

Correcções, c, de temperatura à massa volúmica de vinhos secos e de vinhos secos desalcoolizados medida com um picnómetro de vidro pyrex a t °C, para a referir a 20 °C

[Ver o quadro II do anexo II do método AS2 – 01 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]

ρ 20 = ρ t ±(c)/(1 000) – se t °C for inferior a 20 °C + se t °C for superior a 20 °C

QUADRO III

Correcções, c, de temperatura à massa volúmica de mostos naturais e de mostos concentrados medida a t °C com um picnómetro de vidro pyrex, para referir o resultado a 20 °C

[Ver o quadro III do anexo II do método AS2 – 01 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]


QUADRO IV

Correcções, c, de temperatura à massa volúmica de vinhos de 13 % vol ou mais que contenham açúcar residual, medida com um picnómetro de vidro pyrex a t °C, para a referir a 20 °C

[Ver o quadro IV do anexo II do método AS2 – 01 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]



2 AVALIAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES DOS MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS E MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS, POR REFRACTOMETRIA (OIV - AS2 - 02- SUCREF) — MÉTODO DO

TIPO I

1. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Obtenção do teor de açúcares, expresso em gramas por litro e gramas por quilograma, de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados a partir do índice de refracção a 20 °C, expresso em índice absoluto ou em percentagem mássica de sacarose, utilizando a tabela correspondente.

2. EQUIPAMENTO

2.1. Refractómetro de Abbé

O refractómetro utilizado deve dispor de uma escala que indique:

— percentagens mássicas de sacarose com a aproximação de 0,1 % ou

— índices de refracção com 4 casas decimais.

O refractómetro deve dispor de um termómetro cuja escala se situe, pelo menos, entre + 15 °C e + 25 °C e de um dispositivo de circulação de água que permita fazer as medições a 20 °C± 5 °C.

As instruções de utilização deste instrumento devem ser estritamente respeitadas, nomeadamente no que respeita à aferição e à fonte luminosa.

3. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

3.1. Mostos e mostos concentrados

Se necessário, filtrar os mostos através de uma gaze seca dobrada em quatro. Eliminar as primeiras gotas de filtrado e fazer a determinação no produto filtrado.

3.2. Mostos concentrados rectificados

Consoante a concentração do mosto, utilizar directamente o mosto concentrado rectificado ou então a solução obtida diluindo até 500 g, com água, 200 g de mosto concentrado rectificado, pesados com exactidão.

4. PROCEDIMENTO

Levar a amostra a uma temperatura próxima de 20 °C. Colocar uma pequena toma para ensaio no prisma inferior do refractómetro de modo que, quando os prismas estiverem pressionados um contra o outro, a toma cubra uniformemente a superfície do vidro. Efectuar a medição seguindo as instruções de utilização do dispositivo.

Ler a percentagem mássica de sacarose com a aproximação de 0,1 %, ou o índice de refracção com 4 casas decimais.

Efectuar pelo menos duas determinações com cada amostra preparada. Anotar a temperatura, t °C.

5. CÁLCULOS

5.1. Correcção do efeito da temperatura

5.1.1. Dispositivos graduados em percentagem mássica de sacarose: utilizar o quadro I para a correcção de temperatura.

5.1.2. Dispositivos graduados em índice de refracção: a partir do índice medido a t °C, utilizar o quadro II para obter (na coluna 1) o valor correspondente da percentagem mássica de sacarose a t °C. Utilizar o quadro I para corrigir este valor do efeito da temperatura, convertendo-o a 20 °C

5.2. Teor de açúcares de mostos e de mostos concentrados

A partir da percentagem mássica de sacarose a 20 °C, utilizar o quadro II para obter o teor de açúcares em gramas por litro e gramas por quilograma. Exprime-se o teor de açúcares em açúcar invertido, com uma casa decimal.

5.3. Teor de açúcares de mosto concentrado rectificado

A partir da percentagem mássica de sacarose a 20 °C, utilizar o quadro III para obter o teor de açúcares em gramas por litro e gramas por quilograma. O teor de açúcares é expresso em açúcar invertido, com uma casa decimal.

Se a medição tiver sido efectuada com mosto concentrado rectificado diluído, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

5.4. Índice de refracção de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados

A partir da percentagem mássica de sacarose a 20 °C, utilizar o quadro II para obter o índice de refracção a 20 °C. Este índice é expresso com quatro casas decimais.

Nota: O título alcoométrico potencial dos mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados pode ser determinado utilizando o quadro de correspondência constante do anexo I do Regulamento (CE) n. o 1623/2000 da Comissão, de 25 de Julho de 2000 (JO L 194 de 31 de Julho de 2000).


QUADRO I

Correcção a introduzir no caso de a percentagem mássica de sacarose ter sido determinada a uma temperatura diferente de 20 °C.

[Ver o quadro I do anexo do método AS2 – 02 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]

TABELA II

Quadro indicativo de teores de açúcares de mostos e mostos concentrados em gramas por litro e gramas por quilograma, determinados com um refractómetro graduado em percentagem mássica de sacarose, a 20 °C, ou em

índice de refracção a 20 °C. É igualmente indicada a massa volúmica a 20 °C.

[Ver o quadro II do anexo do método AS2 – 02 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]

QUADRO III

Quadro indicativo de teores de açúcares de mostos concentrados rectificados em gramas por litro e gramas por quilograma, determinados com um refractómetro graduado em percentagem mássica de sacarose, a 20 °C, ou em

índice de refracção a 20 °C. É igualmente indicada a massa volúmica a 20 °C.

[Ver o quadro III do anexo do método AS2 – 02 descrito no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV.]


3 RESÍDUO SECO TOTAL(OIV-AS-2-03-EXTSEC) MATÉRIA SECA TOTAL — MÉTODO DO TIPO I

1. DEFINIÇÃO

O resíduo seco total ou matéria seca total é o conjunto de todas as substâncias que, em condições físicas determinadas, não se volatilizam. Essas condições devem ser fixadas de tal modo que as substâncias componentes do resíduo sofram o mínimo de alterações.

O resíduo não redutor é o resíduo seco total diminuído dos açúcares totais.

O resíduo reduzido é o resíduo seco total diminuído dos açúcares totais que excedam 1 g/l, do sulfato de potássio que exceda 1 g/l, do manitol, se estiver presente, e de todas as substâncias químicas eventualmente adicionadas ao vinho.

O resíduo residual é o resíduo não redutor diminuído da acidez fixa, expressa em ácido tartárico.

O resíduo é expresso em gramas por litro e deve ser determinado com a aproximação de 0,5 g.


[As instâncias da OIV estão a actualizar o descritivo deste método de análise. Esse descritivo será publicado numa próxima comunicação da Comissão quando a OIV publicar um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicação, remete-se, a título indicativo, para o capítulo 4 do anexo do Regulamento (CEE) n. o 2676/90 da Comissão.]


4 DETERMINAÇÃO DA RAZÃO ISOTÓPICA 18 O/ 16 O DA ÁGUA DOS VINHOS (OIV-AS-2-09-MOUO18) — MÉTODO DO TIPO II

(p.m.)

[As instâncias da OIV estão a actualizar o descritivo deste método de análise. Esse descritivo será publicado numa próxima comunicação da Comissão quando a OIV publicar um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicação, remete-se, a título indicativo, para o capítulo 43 do anexo do Regulamento (CEE) n. o 2676/90 da Comissão.]


5 ÍNDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) — MÉTODO DO TIPO IV

1. DEFINIÇÃO

O índice de Folin-Ciocalteu é o resultado obtido por aplicação do método a seguir descrito.


Oxidação dos compostos fenólicos do vinho pelo reagente de Folin-Ciocalteu. Este é constituído por uma mistura de ácido fosfotúngstico (H 3 PW 12 O 40 ) e ácido fosfomolíbdico (H 3 PMo 12 O 40 ), que, ao oxidar os fenóis, é reduzida a uma mistura de óxidos azuis de tungsténio (W 8 O 23 ) e de molibdénio (Mo 8 O 23 ).

A coloração azul produzida tem o máximo de absorção próximo de 750 nm e é proporcional ao teor de compostos fenólicos.

3. REAGENTES

Os reagentes devem ser de qualidade analítica. A água utilizada deve ser água destilada ou de pureza equivalente.

3.1. Reagente de Folin-Ciocalteu

Este reagente encontra-se disponível no comércio, pronto a utilizar. Pode ser preparado do seguinte modo: dissolver 100 g de tungstato de sódio (Na 2 WO 4 2H 2 O) e 25 g de molibdato de sódio (Na 2 MoO 4 2H 2 O) em 700 ml de água destilada. Juntar 50 ml de ácido fosfórico a 85 % (ρ 20 = 1,71 g/ml) e 100 ml de ácido clorídrico concentrado (ρ 20 = 1,19 g/ml). Levar à ebulição, mantendo-a sob refluxo durante 10 horas. Juntar em seguida 150 g de sulfato de lítio (Li 2 SO 4 H 2 O) e algumas gotas de bromo e levar de novo à ebulição, mantendo-a durante 15 minutos. Arrefecer e completar o volume até 1 litro com água destilada.

3.2. Solução a 20 % (m/v) de carbonato de sódio (Na 2 CO 3 ) anidro.

4. EQUIPAMENTO

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

4.1. Balões aferidos de 100 ml.

4.2. Espectrofotómetro que permita trabalhar a 750 nm.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Vinhos tintos

Num balão aferido de 100 ml (ponto 4.1), introduzir, respeitando a ordem:

1 ml de vinho diluído 1:5,

50 ml de água destilada,

5 ml de reagente de Folin-Ciocalteu (3.1),

20 ml de solução de carbonato de sódio (3.2).

Completar o volume até 100 ml com água destilada.

Agitar para homogeneizar. Esperar 30 minutos, para estabilizar a reacção. Determinar a absorvância a 750 nm com um percurso óptico de 1 cm, em relação a um branco preparado com água destilada em vez de vinho.

Se a absorvância lida não for próxima de 0,3, modificar a diluição do vinho.

5.2. Vinhos brancos

Proceder do mesmo modo com 1 ml de vinho não diluído.

5.3. Mostos concentrados rectificados

5.3.1. Preparação da amostra

Utilizar a solução com teor mássico de 25 % de açúcares (25 o Brix), preparada como se indica no capítulo «pH», ponto 4.1.2.


5.3.2. Medição

Proceder como foi descrito para os vinhos tintos (ponto 5.1), utilizando 5 ml de amostra, preparada de acordo com o ponto 5.3.1, e medindo a absorvância em relação a um branco preparado com 5 ml de uma solução a 25 % (m/m) de açúcar invertido.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Modo de cálculo

Exprime-se o resultado sob a forma de um índice, obtido por multiplicação da absorvância por 100, no caso dos vinhos tintos diluídos 1:5 (ou pelo factor correspondente à diluição utilizada), ou por 20, no caso dos vinhos brancos. No caso dos mostos concentrados rectificados, multiplica-se a absorvância por 16.

6.2. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente, ou imediatamente uma após a outra, pelo mesmo analista não deve ser superior a 1.

Para se obter uma boa repetibilidade de resultados, há que utilizar equipamento (balões aferidos e células do espectrofotómetro) rigorosamente limpo.


6 GLUCOSE E FRUTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — MÉTODO DO TIPO II

1. DEFINIÇÃO

A glucose e a frutose são doseadas individualmente por um método enzimático, com vista unicamente ao cálculo da razão glucose/frutose.


Fosforilação da glucose e da frutose pelo adenosina-trifosfato (ATP), no decurso de uma reacção enzimática catalisada pela hexocinase (HK), e conversão em glucose-6-fosfato (G6P) e frutose-6-fosfato (F6P):

glucose + ATP ←→G6P + ADP,

frutose + ATP←→F6P + ADP.

Numa primeira fase, o nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADP), em presença da enzima glucose-6- -fosfato-desidrogenase (G6 PDH), oxida o glucose-6-fosfato em gluconato-6-fosfato. A quantidade de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido (NADPH) que se forma corresponde à quantidade de glucose-6- -fosfato e, portanto, à de glucose:

G6P + NADP + ←→Gluconato-6-fosfato + NADPH + H + .

Doseia-se o nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido, com base na sua absorvância a 340 mm.

Depois de terminada esta reacção, utiliza-se fosfoglucose-isomerase (PGl) para converter o frutose-6-fosfato em glucose-6-fosfato:

F6P←→G6P

O glucose-6-fosfato assim formado reage então com o nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato para formar gluconato-6-fosfato e nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reduzido, que é doseado.

3. EQUIPAMENTO

— Espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, máximo de absorção do NADPH. Dado que se trata de medições absolutas (não se recorre a uma calibração, mas sim ao coeficiente de extinção do NADPH), as escalas de comprimentos de onda e de absorvâncias do aparelho devem ser aferidas.

Na falta de um espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, utilizar um espectrofotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar medições a 334 nm ou a 365 nm.

— Células de vidro com 1 cm de percurso óptico, eventualmente descartáveis.

— Pipetas de 0,02 ml, 0,05 ml, 0,1 ml e 0,2 ml para as reacções enzimáticas.

4. REAGENTES

4.1. Solução 1: tampão (trietanolamina 0,3 M, pH 7,6, 4×10 –3 M de Mg 2+ ): dissolver em 150 ml de água bidestilada 11,2 g de cloridrato de trietanolamina (C 2 H 5 ) 3 N HCl) e 0,2 g de Mg SO 4 7H 2 O; adicionar aproximadamente 4 ml de solução 5 M de hidróxido de sódio (NaOH), para obter um pH de 7,6, e completar o volume até 200 ml.

A +4 °C, esta solução-tampão conserva-se 4 semanas.

4.2. Solução 2: solução de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (cerca de 11,5×10 -3 M): dissolver 50 mg de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato dissódico em 5 ml de água bidestilada.

A +4 °C, esta solução conserva-se 4 semanas.

4.3. Solução 3: solução de adenosina-5′-trifosfato (aproximadamente 81 × 10 -3 M: dissolvem-se 250 mg de adenosina-5′-trifosfato dissódico e 250 mg de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO 3 ) em 5 ml de água bidestilada.

A +4 °C, esta solução conserva-se 4 semanas.

4.4. Solução 4: Hexocinase/glucose-6-fosfato-desidrogenase: misturar 0,5 ml de hexocinase (2 mg de proteína/ml ou seja 280 U/ml) com 0,5 ml de glucose-6-fosfato-desidrogenase (1 mg de proteína por ml).

A +4 °C, esta solução conserva-se um ano.


4.5. Solução 5: Fosfoglucose-isomerase (2 mg de proteína por ml, ou seja, 700 U/ml). A suspensão é utilizada sem diluição.

A +4 °C, esta solução conserva-se um ano.

Nota:

Todos os reagentes necessários estão comercializados.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra

Em função da quantidade estimada de glucose + frutose por litro, efectuar as seguintes diluições:

Medição a 340 nm ou a 334 nm Medição a 365 nm Diluição com água Factor de diluição, F

Até 0,4 g/l Até 0,8 g/l — —

Até 4,0 g/l Até 8,0 g/l 1 + 9 10

Até 10,0 g/l Até 20,0 g/l 1 + 24 25

Até 20,0 g/l Até 40,0 g/l 1 + 49 50

Até 40,0 g/l Até 80,0 g/l 1 + 99 100

Mais de 40,0 g/l Mais de 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Dosagem

Com o espectrofotómetro regulado no comprimento de onda de 340 nm, efectuar as medições em relação ao ar (sem célula no percurso óptico) ou em relação a água.

Temperatura: 20 °C a 25 °C.

Introduzir em duas células com 1 cm de percurso óptico:

Branco Dosagem

Solução 1 (4.1) a 20 °C 2,50 ml 2,50 ml

Solução 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml

Solução 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml

Amostra a dosear 0,20 ml

Água bidestilada 0,20 ml

Misturar e, após aproximadamente 3 minutos, ler a absorvância das soluções (A 1 ). Em seguida, desencadear a reacção adicionando:

Solução 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar e esperar 15 minutos. Medir a absorvância e verificar a paragem da reacção após 2 minutos (A 2 ).

Adicionar imediatamente:

Solução 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar. Efectuar a leitura ao fim de 10 minutos. Verificar a paragem da reacção após 2 minutos (A 3 ).

Determinar as diferenças de absorvância

A 2 –A 1 , correspondente à glucose, e

A 3 –A 2 , correspondente à frutose,

para o branco e para a amostra a dosear.


Deduzir a diferença de absorvâncias do branco (ΔA B ) à da amostra a dosear (ΔA D ) e determinar:

para a glucose: ΔA G = ΔA D –ΔA B

para a frutose: ΔA F = ΔA D –ΔA B

Nota:

O tempo necessário para a acção das enzimas pode variar de um lote para outro e é referido apenas a título indicativo. É recomendável que seja determinado para cada lote.

5.3. Expressão dos resultados

5.3.1. Cálculo

A fórmula geral para cálculo das concentrações é a seguinte:

C = (V×PM)/(ε×d×v×1 000)×ΔA (g/l),

V = volume utilizado na dosagem (ml)

v = volume de amostra (ml)

PM = massa molecular da substância a dosear

d = percurso óptico na célula (cm)

ε = coeficiente de absorção do NADPH a 340 nm = 6,3 (mmole –1 ×l×cm –1 )

V = 2,92 ml no caso do doseamento da glucose,

V = 2,94 ml no caso do doseamento da frutose,

v = 0,20 ml

PM = 180,

d = 1.

Obtém-se:

para a glucose: C g/l = 0,417ΔA G

para a frutose: C g/l = 0,420ΔA F

Se tiver sido efectuada uma diluição na preparação da amostra, multiplica-se o resultado pelo factor F.

Nota:

Se as medições forem feitas nos comprimentos de onda de 334 nm ou 365 nm, obtém-se:

— medição a 334 nm: ε = 6,2 (mmole –1 ×l×cm –1 )

para a glucose: C g/l = 0,425ΔA G ,

para a frutose: C g/l = 0,428ΔA F .

— medição a 365 nm: ε = 3,4 (mmole –1 ×l×cm –1 )

para a glucose: C g/l = 0,773ΔA G ,

para a frutose: C g/l = 0,778ΔA F .

5.3.2. Repetibilidade (r)

r = 0,056 x i

5.3.3. Reprodutibilidade (R)

R = 0,12 + 0,076x i

x i = teor de glucose ou de frutose, em g/l.


7 DOSAGEM DOS AÇÚCARES (SACAROSE) POR HPLC (OIV–AS–311–03–SUCRES) — MÉTODO DO TIPO II

(p.m.)

[As instâncias da OIV estão a actualizar o descritivo deste método de análise. Esse descritivo será publicado numa próxima comunicação da Comissão quando a OIV publicar um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicação, remete-se, a título indicativo, para o capítulo 6, ponto 3, do anexo do Regulamento (CEE) n. o 2676/90 da Comissão.]


8 DETECÇÃO, POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE DEUTÉRIO, DO ENRIQUECIMENTO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS

RECTIFICADOS E VINHOS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — MÉTODO DO TIPO I

(p.m.)

[As instâncias científicas da OIV estão a reexaminar o descritivo deste método de análise. Esse descritivo será publicado numa comunicação da Comissão quando a Assembleia-Geral da OIV adoptar um texto definitivo. Enquanto se aguarda essa decisão da OIV, remete-se, a título indicativo, para o capítulo 8 do anexo do Regulamento (CEE) n. o 2676/90 da Comissão.]


9 TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) — MÉTODO DO TIPO I

(p.m.)

[As instâncias da OIV estão a actualizar os descritivos destes métodos de análise. Esses descritivos serão publicados numa próxima comunicação da Comissão quando a OIV publicar um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicação da OIV, remete-se, a título indicativo, para o capítulo 3 do anexo do Regulamento (CEE) n. o 2676/90 da Comissão.]


10 DETERMINAÇÃO, POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ISOTÓPICA, DA RAZÃO ISOTÓPICA 13 C/ 12 C DO ETANOL DO VINHO OU DO ETANOL OBTIDO POR FERMENTAÇÃO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS OU MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-

-ETHANO) — MÉTODO DO TIPO II

1. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

O presente método permite determinar a razão isotópica 13 C/ 12 C do etanol do vinho e do etanol obtido por fermentação de produtos vitícolas (mosto de uvas, mosto de uvas concentrado, mosto de uvas concentrado rectificado).

2. REFERÊNCIAS NORMATIVAS

ISO: 5725:1994 «Fidelidade dos métodos de ensaio – Determinação da repetibilidade e da reprodutibilidade de um método de ensaio normalizado por recurso a ensaios interlaboratoriais».

V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (R PDB = 0,0112372).

Método AS-311-05-ENRRMN da OIV: «Detecção, por ressonância magnética nuclear de deutério (RMN-FINE), do

enriquecimento de mostos de uvas, mostos de uvas concentrados, mostos de uvas concentrados rectificados e vinhos».

3. TERMOS E DEFINIÇÕES

13 C/ 12 C: Razão isotópica do carbono ( 13 C em relação ao 12 C) numa determinada amostra.

δ 13 C: Teor de carbono 13 ( 13 C), expresso em permilagem (‰).

RMN-FINE: Fraccionamento Isotópico Natural Específico, estudado por Ressonância Magnética Nuclear.

V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite. A PDB, referência primária para a determinação das variações naturais de teores isotópicos de carbono 13, é um carbonato de cálcio proveniente de um esporão de belemnite do Cretácico da formação Pee-Dee da Carolina do Sul (Estados Unidos da América). A sua razão isotópica 13 C/ 12 C ou R PDB é R PDB = 0,0112372. A PDB encontra-se esgotada há muito, mas continua a ser a referência primária utilizada para exprimir as variações naturais de teores isotópicos de carbono 13, pela qual são calibrados os materiais de referência disponíveis na Agência Internacional da Energia Atómica (AIEA), em Viena (Áustria). Por convenção, as determinações isotópicas de abundâncias naturais de carbono 13 são, portanto, expressas em relação à V-PDB.

m/z: Razão massa/carga.

4. PRINCÍPIO

A assimilação de dióxido de carbono pelas plantas na fotossíntese realiza-se por duas vias metabólicas principais, o metabolismo C 3 (ciclo de Calvin) e o metabolismo C 4 (Hatch e Slack). Estes dois mecanismos de fotossíntese apresentam um fraccionamento isotópico diferente. Por conseguinte, os produtos, como os açúcares e o álcool de fermentação, provenientes de plantas C 4 possuem teores de carbono 13 superiores aos dos seus homólogos provenientes de plantas C 3 . A maior parte das plantas, nomeadamente a vinha e a beterraba, pertencem ao grupo C 3 . A cana-de-açúcar e o milho pertencem ao grupo C 4 . A determinação do teor de carbono 13 possibilita, pois, a detecção e quantificação do açúcar de origem C 4 (açúcar de cana ou isoglucose de milho) adicionado aos produtos da vinha (mostos de uvas, vinho, etc.). A combinação de informações relativas ao teor de carbono 13 com informações obtidas por RMN-FINE permite também quantificar a adição de misturas de açúcares ou álcoois provenientes de plantas C 3 e C 4 .

Determina-se o teor de carbono 13 no dióxido de carbono resultante da combustão completa da amostra. A partir das correntes iónicas medidas em três colectores diferentes de um espectrómetro de massa isotópico, determinam-se as abundâncias dos principais isotopómeros, de massa 44 ( 12 C 16 O 2 ), 45 ( 13 C 16 O 2 e 12 C 17 O 16 O) e 46 ( 12 C 16 O 18 O), resultantes das diversas combinações possíveis dos isótopos 18 O, 17 O, 16 O, 13 C e 12 C. As contribuições dos isotopómeros 13 C 17 O 16 O e 12 C 17 O 2 podem ser desprezadas, devido à fraca


abundância dos mesmos. Corrige-se a corrente iónica correspondente a m/z = 45 de modo ter em conta a contribuição do 12 C 17 O 16 O, que é calculada em função da intensidade da corrente medida para m/z = 46 e considerando a abundância relativa de 18 O e 17 O (correcção de Craig). A comparação com uma referência calibrada pela referência internacional V-PDB permite calcular o teor de carbono 13 na escala relativa de δ 13 C.

5. REAGENTES

Os materiais e consumíveis dependem do equipamento (6) utilizado pelo laboratório. Os sistemas geralmente utilizados baseiam-se num analisador elementar, que pode ser equipado para a introdução de amostras colocadas em cápsulas metálicas seladas ou para a injecção de amostras líquidas com uma seringa através de um septo.

Consoante o tipo de instrumentos utilizado, podem utilizar-se os seguintes materiais de referência, reagentes e consumíveis:

— Materiais de referência:

— fornecidos pela AIEA:

Denominação Material δ 13 C em relação à V-PDB (9)

— IAEA-CH-6 sacarose – 10,4 ‰

— IAEA-CH-7 polietileno – 31,8 ‰

— NBS22 óleo – 29,7 ‰

— USGS24 grafite – 16,1 ‰

— fornecidos pelo IMMR de Geel (B) (Instituto de Materiais e Medições de Referência):

Denominação Material δ 13 C em relação à V-PDB (9)

— CRM/BCR 656 álcool de vinho – 26,93 ‰

— CRM/BCR 657 glucose – 10,75 ‰

— CRM/BCR 660 solução hidroalcoólica (título alcoométrico volúmico: 12 %)

– 26,72 %

— Amostra-padrão de trabalho, com uma relação 13 C/ 12 C conhecida, calibrada por materiais de referência internacionais.

— Lista indicativa de consumíveis estabelecida para sistemas de fluxo contínuo:

— hélio de qualidade analítica (CAS 07440-59-7),

— oxigénio de qualidade analítica (CAS 07782-44-7),

— dióxido de carbono de qualidade analítica, utilizado como gás de referência secundário para o teor de carbono 13 (CAS 00124-38-9),

— reagente de oxidação para o forno do sistema de combustão – por exemplo óxido de cobre (ΙΙ) para análise elementar (CAS 1317-38-0),

— exsicante destinado a eliminar a água produzida pela combustão – por exemplo anidrona (perclorato de magnésio) para análise elementar (CAS 10034-81-8). Não é necessário no caso de equipamentos munidos de um sistema de eliminação de água por criorretenção ou por um capilar de permeabilidade selectiva).

6. EQUIPAMENTO E MATERIAL

6.1. Espectrómetro de massa de razão isotópica

Espectrómetro de massa de razão isotópica que permita determinar o teor natural relativo de 13 C do CO 2 gasoso com a precisão interna de 0,05 ‰ ou mais, expressa em valor relativo (ponto 9). A precisão interna é aqui definida como a diferença entre duas medições da mesma amostra de CO 2 . Os espectrómetros de massa destinados à medir razões isotópicas dispõem geralmente de um colector triplo, para medir em simultâneo as intensidades correspondentes a m/z = 44, 45 e 46. O espectrómetro de massa de razão isotópica utilizado deve dispor também de um sistema duplo de introdução da amostra, para efectuar alternadamente medições da amostra desconhecida e da amostra de referência, ou de um sistema integrado que efectue a combustão quantitativa das amostras e separe o dióxido de carbono dos restantes produtos de combustão antes das determinações de espectrometria de massa.


6.2. Dispositivo de combustão

Dispositivo de combustão que permita converter quantitativamente etanol em dióxido de carbono e eliminar todos os restantes produtos de combustão, incluindo a água, sem fraccionamento isotópico. O dispositivo pode consistir num sistema de fluxo contínuo integrado no espectrómetro de massa (ponto 6.2.1) ou num sistema de combustão autónomo (ponto 6.2.2). O dispositivo em causa deve permitir obter uma precisão pelo menos equivalente à indicada no ponto 11.

6.2.1. Sistemas de fluxo contínuo

Estes sistemas são constituídos por um analisador elementar ou por um cromatógrafo de fase gasosa equipado de um sistema de combustão em linha.

No caso dos sistemas equipados para a introdução de amostras contidas em cápsulas metálicas, utiliza-se o seguinte material de laboratório:

— microsseringa ou micropipeta volumétrica, com pontas adequadas,

— balança com aproximação mínima de 1 μg,

— pinças encapsuladoras,

— cápsulas de estanho para amostras líquidas,

— cápsulas de estanho para amostras sólidas.

Nota:

Para reduzir o risco de evaporação das amostras de etanol, é possível colocar nas cápsulas um material absorvente (por exemplo chromosorb W 45-60 mesh), desde que se verifique previamente, através de um ensaio em branco, que o mesmo não contém quantidades significativas de carbono, que possam alterar as medições.

Em caso de utilização de um analisador elementar dotado de um injector para líquidos, ou se for utilizado um sistema de preparação por cromatografia-combustão, utiliza-se o seguinte material de laboratório:

— seringa para líquidos,

— frascos com sistema de vedação estanque e septo inerte.

O material de laboratório das listas acima é indicado a título de exemplo e pode ser substituído por outro de desempenho equivalente, em função do dispositivo de combustão e do espectrómetro de massa utilizados pelo laboratório.

6.2.2. Sistemas autónomos de preparação

Neste caso, as amostras de dióxido de carbono resultantes da combustão das amostras a analisar e da amostra de referência são recolhidas em ampolas, as quais são em seguida instaladas no sistema duplo de entrada do espectrómetro para realização da análise isotópica. Podem utilizar-se diversos tipos de dispositivos de combustão descritos na literatura:

— sistema de combustão fechado, com oxigénio gasoso em circulação,

— analisador elementar, com fluxo de hélio e de oxigénio,

— ampola de vidro selada, com um enchimento de óxido de cobre (ΙΙ) como agente de oxidação.

7. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA AS ANÁLISES

É necessário extrair o etanol do vinho antes da determinação isotópica. Efectua-se a extracção por destilação do vinho, como se descreve no ponto 3.1 do método RMN–FINE (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

No caso do mosto de uvas, do mosto de uvas concentrado e do mosto de uvas concentrado rectificado, os açúcares são primeiro fermentados, com formação de etanol, como é descrito no ponto 3.2 do método RMN- -FINE (OIV–MA–AS311–05–ENRRMN).

8. PROCEDIMENTO

Todas as etapas da preparação devem ser efectuadas sem perdas significativas de etanol por evaporação, facto que alteraria a composição isotópica da amostra.


A descrição que se segue diz respeito aos procedimentos geralmente utilizados para a combustão de amostras de etanol em sistemas automatizados de combustão disponíveis no comércio. Pode utilizar-se qualquer outro método de preparação do dióxido de carbono para a análise isotópica que assegure a conversão quantitativa da amostra de etanol em dióxido de carbono, sem perdas de etanol por evaporação.

Procedimento experimental baseado na utilização de um analisador elementar:

a) Colocação das amostras em cápsulas:

— utilizar cápsulas, uma pinça encapsuladora e uma placa de preparação limpas,

— com a pinça encapsuladora, pegar numa cápsula de dimensão adequada,

— com a micropipeta, introduzir na cápsula o volume necessário de líquido,

— Nota:

São necessários 3,84 mg de etanol absoluto ou 4,17 mg de destilado com título alcoólico de 92 % (m/m) para obter 2 mg de carbono; calcular nesta base a quantidade adequada de destilado, atendendo à quantidade de carbono necessária em função da sensibilidade do espectrómetro de massa.

— vedar as cápsulas, utilizando a pinça encapsuladora,

— cada cápsula deve ficar vedada de forma totalmente estanque; caso contrário, deve ser rejeitada, preparando-se uma nova cápsula,

— preparar duas cápsulas para cada amostra,

— colocar as cápsulas, numa posição adequada, na placa do amostrador automático do analisador elementar; cada cápsula deve ser cuidadosamente identificada por um número de ordem,

— colocar sistematicamente, no início e no final de cada série de amostras, cápsulas com as referências de trabalho,

— inserir regularmente amostras de controlo na série de amostras;

b) Verificação e regulação do analisador elementar e do espectrómetro de massa:

— regular a temperatura dos fornos do analisador elementar e os fluxos de hélio e de oxigénio, para optimizar a combustão da amostra,

— verificar a ausência de fugas no sistema de análise elementar e de espectrometria de massa (por exemplo verificando a corrente iónica para m/z = 28, correspondente ao N 2 ),

— regular o espectrómetro de massa para medir as intensidades das correntes iónicas para m/z = 44, 45 e 46,

— utilizando amostras de controlo conhecidas, verificar o sistema antes de iniciar medições com as amostras.

c) Realização de uma série de medições

As amostras colocadas no amostrador automático do analisador elementar (ou do cromatógrafo) são introduzidas sucessivamente. O dióxido de carbono produzido pela combustão de cada amostra é eluído para o espectrómetro de massa, no qual são medidas as correntes iónicas. O computador acoplado ao equipamento regista as intensidades das correntes iónicas e calcula os valores de δ correspondentes a cada amostra (ponto 9).

9. CÁLCULOS

O objectivo do método é determinar a razão isotópica 13 C/ 12 C do etanol extraído do vinho ou de produtos da fermentação de uvas. A razão isotópica 13 C/ 12 C pode ser expressa pelo seu desvio relativamente a uma referência de trabalho. Nesse caso, o desvio isotópico do carbono 13 (δ 13 C) é calculado, numa escala δ/1 000, por comparação dos resultados obtidos para a amostra a analisar com os resultados obtidos para a referência de trabalho, previamente calibrada pela referência primária internacional (V–PDB). Os valores de δ 13 C são expressos em relação à referência de trabalho, de acordo com a fórmula:

δ13C amostra/ref ‰ = 1 000×(R amostra –R ref )/R ref ,

em que R amostra e R ref são, respectivamente, as razões isotópicas 13 C/ 12 C da amostra e do dióxido de carbono utilizado como gás de referência.


Os valores de δ 13 C são então expressos em relação à V-PDB de acordo com a fórmula:

δ 13 C amostra/V-PDB ‰ = δ 13 C amostra/ref + δ 13 C ref/V-PDB +(δ 13 C amostra/ref ×δ 13 C ref/V-PDB )/1 000

em que δ 13 C ref/V-PDB é o desvio isotópico previamente determinado para a referência de trabalho em relação à V–PDB.

Durante a medição em linha, poderão observar-se pequenos desvios atribuíveis à variação das condições instrumentais. Nesse caso, os valores de δ 13 C das amostras devem ser corrigidos em função da diferença entre o valor de δ 13 C medido para a referência de trabalho e o valor real correspondente, previamente calibrado pela V-PDB por comparação com um dos materiais de referência internacionais. Pode presumir-se que, entre duas medições com a referência de trabalho, o desvio e, consequentemente, a correcção a aplicar aos resultados obtidos para as amostras, são lineares. Deve efectuar-se uma medição com a referência de trabalho no início e no final de cada série de amostras. Poderá assim calcular-se, por interpolação linear, a correcção aplicável a cada amostra.

10. GARANTIA E CONTROLO DA QUALIDADE

Verificar se o valor de 13 C para a referência de trabalho não excede em mais de 0,5 ‰ o valor admitido. Caso contrário, verificar e, eventualmente, reajustar as regulações do espectrómetro.

Verificar, para cada amostra, se a diferença de resultados entre duas cápsulas, medidas sucessivamente, é inferior a 0,3 ‰. Nestas condições, o resultado final de uma determinada amostra é o valor médio das duas cápsulas. Se o desvio for superior a 0,3 ‰, devem repetir-se as medições.

Para verificar se as medições estão a ser correctamente efectuadas, pode medir-se a intensidade da corrente iónica para m/z = 44, que é proporcional à quantidade de carbono injectada no analisador elementar. Em condições normais, a intensidade desta corrente iónica deve ser praticamente constante para todas as amostras em análise. A ocorrência de desvios significativos pode ser devida à evaporação de etanol (por exemplo uma cápsula mal vedada) ou a uma instabilidade do analisador elementar ou do espectrómetro de massa.

11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO MÉTODO (PRECISÃO)

Foi realizado um primeiro estudo de colaboração interlaboratorial (ponto 11.1) com destilados alcoólicos de origem vínica, de cana e de beterraba, bem como com diversas misturas destas três origens. Uma vez que o estudo não abrangeu a etapa de destilação, foram também utilizadas informações complementares provenientes de outros ensaios interlaboratoriais realizados com vinhos (ponto 11.2), nomeadamente testes interlaboratoriais de aptidão (ponto 11.3) para medições isotópicas. Os resultados demonstram que a utilização em condições satisfatórias dos diversos sistemas de destilação, nomeadamente de sistemas adaptados às medições RMN–FINE, não introduz variabilidade significativa nas determinações do δ 13 C do etanol do vinho. Os parâmetros de fiabilidade observados para os vinhos são praticamente idênticos aos obtidos no estudo de colaboração interlaboratorial (ponto 11.1) com destilados.

11.1. Estudo de colaboração interlaboratorial com destilados

Ano do ensaio interlaboratorial: 1996

Número de laboratórios: 20

Número de amostras: 6 amostras em duplicado, em teste cego

Parâmetro determinado: δ 13 C do etanol

Código das amostras Álcool de origem vínica Álcool de beterraba Álcool de cana

A & G 80 % 10 % 10 %

B & C 90 % 10 % 0 %

D & F 0 % 100 % 0 %

E & I 90 % 0 % 10 %

H & K 100 % 0 % 0 %

J & L 0 % 0 % 100 %


Amostras A/G B/C D/F E/I H/K J/L

Número de laboratórios considerado, após eliminação dos resultados anómalos

19 18 17 19 19 19

Número de resultados aceite 38 36 34 38 38 38

Valor médio (δ 13 C) (‰) – 25,32 – 26,75 – 27,79 – 25,26 – 26,63 – 12,54

S r 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041

Desvio-padrão de repetibilidade (S r ) (‰) 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06

Limite de repetibilidade, r (2,8×S r ) (‰) 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18

S R 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584

Desvio-padrão de reprodutibilidade (S R ) (‰)

0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24

Limite de reprodutibilidade, R (2,8×S R ) (‰)

0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Estudo interlaboratorial de dois vinhos e um álcool

Ano do ensaio interlaboratorial: 1996

Número de laboratórios: 14 no respeitante à destilação dos vinhos, dos quais sete também para a determinação do δ 13 C do etanol vínico, oito no respeitante à medição do δ 13 C da amostra de álcool.

Número de amostras: três (vinho branco com título alcoométrico volúmico de 9,3 %; vinho branco com título alcoométrico volúmico de 9,6 %; álcool com título alcoométrico mássico de 93 %).

Parâmetro determinado: δ 13 C do etanol.

Amostras Vinho tinto Vinho branco Álcool

Número de laboratórios 7 7 8

Número de resultados aceite 7 7 8

Valor médio (δ 13 C) (‰) – 26,20 – 26,20 – 25,08

Variância de reprodutibilidade, S R 2 0,0525 0,0740 0,0962

Desvio-padrão de reprodutibilidade (S R ) (‰) 0,23 0,27 0,31

Limite de reprodutibilidade, R (2,8×S R ) (‰) 0,64 0,76 0,87

Os laboratórios participantes utilizaram diversos sistemas de destilação. As determinações isotópicas de δ 13 C realizadas num único laboratório ao conjunto dos destilados enviados pelos participantes não mostram valores anómalos nem valores significativamente distintos dos valores médios. A variância dos resultados (S 2 = 0,0059) é comparável às variâncias de repetibilidade, S r

2 do estudo de colaboração interlaboratorial com destilados (11.1).

11.3. Resultados dos testes interlaboratoriais de aptidão para determinações isotópicas

Desde Dezembro de 1994 que têm vindo a ser organizados regularmente testes internacionais de aptidão para determinações isotópicas em vinhos e álcoois (destilados com título alcoométrico volúmico de 96 %). Os resultados obtidos permitem aos laboratórios participantes ter uma noção da qualidade das suas análises. A exploração estatística dos resultados permite avaliar a variabilidade das determinações em condições de reprodutibilidade e, consequentemente, estimar os parâmetros de variância e limite de reprodutibilidade. Os resultados obtidos nas determinações do δ 13 C do etanol vínico e dos destilados são resumidos no quadro seguinte:


Data Vinhos Destilados

N S R S R 2 R N S R S R

2 R

Dezembro de 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42

Junho de 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41

Dezembro de 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32

Março de 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78

Junho de 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53

Setembro de 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63

Dezembro de 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16

Março de 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16

Junho de 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49

Setembro de 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57

Dezembro de 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44

Março de 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69

Junho de 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74

Setembro de 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91

Média ponderada 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59

N: número dos laboratórios participantes.

11.4. Limites de repetibilidade e de reprodutibilidade

Os dados dos diversos estudos interlaboratoriais apresentados nos quadros precedentes permitem estabelecer para o presente método, incluindo a etapa de destilação, os seguintes limites de repetibilidade e de reprodutibilidade:

Limite de repetibilidade, r: 0,24

Limite de reprodutibilidade, R: 0,6.


11 ACIDEZ TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) — MÉTODO DO TIPO I

1. DEFINIÇÃO

A acidez total é a soma das acidezes tituláveis quando se leva o pH a 7 por adição de uma solução alcalina titulada.

O dióxido de carbono não está incluído na acidez total.


Titulação potenciométrica ou titulação em presença de azul de bromotimol (indicador de fim da reacção), por comparação com um padrão de cor.

3. REAGENTES

3.1. Solução-tampão de pH 7,0:

Fosfato monopotássico (KH 2 PO 4 ): 107,3 g,

Solução 1 M de hidróxido de sódio (NaOH): 500 ml,

Água: q. b. para 1 000 ml.

Podem ser utilizadas as soluções-tampão de referência comerciais.

3.2. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH).

3.3. Solução a 4 g/l de azul de bromotimol:

Azul de bromotimol (C 27 H 28 Br 2 O 5 S) ................................................................................................................... 4 g

Álcool neutro a 96 % vol ......................................................................................................................................... 200 ml

Após dissolução, juntar:

Água isenta de CO 2 .................................................................................................................................................... 200 ml

Solução 1 M de hidróxido de sódio

q. b. para coloração azul esverdeada (pH 7) ...................................................................................................... 7,5 ml

Água, q. b. para ........................................................................................................................................................... 1,000 ml

4. EQUIPAMENTO

4.1. Trompa de vácuo a água.

4.2. Balão de vácuo de 500 ml.

4.3. Potenciómetro de escala calibrada em unidades de pH, munido de eléctrodos. O eléctrodo de vidro deve ser conservado em água destilada. O eléctrodo de calomelanos-cloreto de potássio saturado deve ser conservado numa solução saturada de cloreto de potássio. É mais frequentemente utilizado um eléctrodo combinado, que deve ser conservado em água destilada.

4.4. Copos de 50 ml (vinhos) e de 100 ml (mostos concentrados rectificados).

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra

5.1.1. Vinhos

Para eliminar o dióxido de carbono, colocar cerca de 50 ml de vinho num balão de vácuo; agitar e, simultaneamente, fazer vácuo com a trompa de água. A agitação deve durar 1 a 2 minutos.

5.1.2. Mostos concentrados rectificados

Introduzir 200 g de mosto concentrado rectificado, pesados com exactidão, num balão aferido de 500 ml. Completar o volume com água até ao traço de aferição. Homogeneizar.


5.2. Titulação potenciométrica

5.2.1. Calibração do potenciómetro

Calibrar o potenciómetro para 20 °C, seguindo as instruções de utilização do aparelho, com a solução-tampão de pH 7,00, a 20 °C.

5.2.2. Medição

Deitar num copo (ponto 4.4) um volume de amostra, preparado como se indica no ponto 5.1, de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Juntar aproximadamente 10 ml de água destilada e deitar com uma bureta solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2) até atingir pH 7,0, a 20 °C. Adicionar lentamente o titulante alcalino, agitando sempre a solução. Seja «n» o volume, em mililitros, de solução 0,1 M de NaOH adicionado.

5.3. Titulação com indicador (azul de bromotimol)

5.3.1. Ensaio prévio: preparação do padrão de cor

Deitar num copo (ponto 4.4) 25 ml de água destilada fervida, 1 ml de solução de azul de bromotimol (ponto 3.3) e um volume de amostra (preparada como se indica no ponto 5.1) de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2) até se obter uma coloração azul esverdeada. Juntar 5 ml da solução-tampão de pH 7 (ponto 3.1).

5.3.2. Dosagem

Deitar num copo (ponto 4.4) 30 ml de água destilada fervida, 1 ml de solução de azul de bromotimol (ponto 3.3) e um volume de amostra, preparado como se indica no ponto 5.1, de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2) até se obter uma coloração idêntica à obtida no ensaio prévio (ponto 5.3.1). Seja «n» o volume, em mililitros, de solução 0,1 M de hidróxido de sódio adicionado.



6.1.1. Vinhos

A acidez total expressa em miliequivalentes por litro é dada por:

A = 10n

Exprime-se com uma casa decimal.

A acidez total expressa em gramas de ácido tartárico por litro é dada por:

A′ = 0,075A



— Acidez total expressa em miliequivalentes por quilograma de mosto concentrado rectificado: a = 5n;

— Acidez total expressa em miliequivalentes por quilograma de açúcares totais:

A = 500n/(P)

P = percentagem mássica de açúcares totais.


6.2. Repetibilidade (r) da titulação com indicador (5.3)

r = 0,9 meq/l

r = 0,07 gramas de ácido tartárico por litro,

no caso dos vinhos brancos, rosados e tintos.


6.3. Reprodutibilidade (R) da titulação com indicador (5.3)

Vinhos brancos e rosados:

R = 3,6 meq/l

R = 0,3 gramas de ácido tartárico por litro.

Vinhos tintos:

R = 5,1 meq/l

R = 0,4 gramas de ácido tartárico por litro.


12 ACIDEZ VOLÁTIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) — MÉTODO DO TIPO I

1. DEFINIÇÃO

A acidez volátil é constituída pelos ácidos da série acética que se encontram no vinho, no estado livre ou na forma de sais.


Titulação dos ácidos voláteis, separados do vinho por arrastamento com vapor de água e rectificação dos vapores.

Elimina-se previamente o dióxido de carbono do vinho.

A acidez do dióxido de enxofre livre e do dióxido de enxofre combinado destilados nestas condições deve ser descontada da acidez do destilado.

A acidez do ácido sórbico eventualmente adicionado ao vinho deve igualmente ser descontada.

Nota:

O ácido salicílico utilizado em alguns países para estabilizar os vinhos antes das análises passa em parte para o destilado. É necessário doseá-lo e descontá-lo à acidez. O método de doseamento é descrito no ponto 7 deste capítulo.

3. REAGENTES

3.1. Ácido tartárico cristalizado (C 4 H 6 O 6 ).

3.2. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH).

3.3. Solução a 1 % de fenolftaleína em álcool neutro a 96 % vol.

3.4. Ácido clorídrico (ρ20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluído 1:4 (v/v).

3.5. Solução 0,005 M de iodo (I 2 ).

3.6. Iodeto de potássio cristalizado (KI).

3.7. Goma de amido a 5 g/l:

Dissolver 5 g de amido em aproximadamente 500 ml de água. Levar à ebulição, agitando e mantendo a ebulição durante 10 minutos; adicionar 200 g de cloreto de sódio. Completar o volume até um litro depois de arrefecer.

3.8. Solução saturada, aproximadamente 55 g/l a 20 °C, de borato de sódio (Na 2 XB 4 O 7 , 10H 2 O).

4. EQUIPAMENTO

4.1. Dispositivo de arrastamento com vapor de água constituído por:

1) Gerador de vapor de água; o vapor de água produzido deve estar isento de dióxido de carbono;

2) Borbulhador;

3) Coluna rectificadora;

4) Condensador.

Este dispositivo deve cumprir os critérios dos três ensaios seguintes:

a) Colocar no borbulhador 20 ml de água fervida. Recolher 250 ml de destilado. Adicionar ao destilado 0,1 ml de solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2) e 2 gotas de solução de fenolftaleína (ponto 3.3). A coloração rosa deve manter-se estável durante, pelo menos, 10 segundos (vapor de água isento de dióxido de carbono).

b) Colocar no borbulhador 20 ml de uma solução 0,1 M de ácido acético. Recolher 250 ml de destilado. Titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2). O volume utilizado deve ser igual ou superior a 19,9 ml (ácido acético arrastado ≥ 99,5 %).


c) Colocar no borbulhador 20 ml de uma solução 1 M de ácido láctico. Recolher 250 ml de destilado. Titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2).

O volume utilizado deve ser inferior ou igual a 1,0 ml (ácido láctico destilado ≤ 0,5 %).

Qualquer dispositivo ou técnica que satisfaça estes ensaios equivale a um dispositivo ou técnica oficial internacional.

4.2. Trompa de vácuo a água.

4.3. Balão de vácuo.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra: eliminação do dióxido de carbono

Colocar cerca de 50 ml de vinho num balão de vácuo. Agitar e, simultaneamente, fazer vácuo com a trompa de água. A agitação deve durar 1 a 2 minutos.

5.2. Arrastamento com vapor de água

Colocar no borbulhador 20 ml de vinho do qual foi eliminado o dióxido de carbono como se indica no ponto 5.1. Juntar aproximadamente 0,5 g de ácido tartárico (ponto 3.1). Recolher pelo menos 250 ml de destilado.

5.3. Titulação

Titular com a solução 0,1 M de hidróxido de sódio (ponto 3.2) em presença de duas gotas de solução de fenolftaleína (ponto 3.3). Seja «n» ml o volume utilizado.

Adicionar 4 gotas de ácido clorídrico diluído 1:4 (ponto 3.4), 2 ml de goma de amido (ponto 3.7) e alguns cristais de iodeto de potássio (ponto 3.6). Titular o dióxido de enxofre livre com a solução 0,005 M de iodo (3.5). Seja «n′» ml o volume utilizado.

Juntar solução saturada de borato de sódio (ponto 3.8) até ao reaparecimento da coloração rosa. Titular o dióxido de enxofre combinado com a solução 0,005 M de iodo (ponto 3.5). Seja «n″» ml o volume utilizado.



A acidez volátil expressa em miliequivalentes por litro, com uma casa decimal, é dada por:

A = 5(n–0,1n′–0,05n″)

A acidez volátil expressa em gramas de ácido acético por litro, com duas casas decimais, é dada por:

0,300(n–0,1n′–0,05n″)

6.2. Repetibilidade (r)

r = 0,7 meq/l,

r = 0,04 gramas de ácido acético por litro.

6.3. Reprodutibilidade (R)

R = 1,3 meq/l,

R = 0,08 gramas de ácido acético por litro.

6.4. Vinhos adicionados de ácido sórbico

Dado que, no caso de um volume de destilado de 250 ml, a percentagem do ácido sórbico arrastado pelo vapor de água é de 96 %, a acidez correspondente deve ser descontada à acidez volátil, tendo em conta que 100 mg de ácido sórbico correspondem a 0,89 miliequivalentes de acidez, ou a 0,053 g de ácido acético, e conhecendo o teor de ácido sórbico (mg/l) determinado pelo método correspondente.

7. DOSAGEM DO ÁCIDO SALICÍLICO ARRASTADO PARA O DESTILADO DA ACIDEZ VOLÁTIL

7.1. Princípio

Depois da dosagem da acidez volátil e da correcção devida ao dióxido de enxofre, identifica-se a presença de ácido salicílico, após acidificação, pela coloração violeta resultante da adição de um sal de ferro (III).


Efectua-se a dosagem do ácido salicílico arrastado, com a acidez volátil, para o destilado num segundo destilado de volume igual ao utilizado para a dosagem da acidez volátil. Doseia-se o ácido salicílico nesse destilado por um método colorimétrico de comparação, sendo o teor obtido descontado à acidez do destilado da acidez volátil.

7.2. Reagentes

7.2.1. Ácido clorídrico (HCl) (ρ 20 = 1,18 to 1,19 g/ml).

7.2.2. Tiossulfato de sódio (Na 2 S 2 O 3 × 5 H 2 O) 0,1 M.

7.2.3. Solução a 10 % (m/v) de sulfato de ferro (III) e amónio (Fe 2 (SO 4 ) 3 •(NH 4 ) 2 SO 4 •24H 2 O).

7.2.4. Solução 0,01 M de salicilato de sódio (1,60 gramas de salicilato de sódio, NaC 7 H 5 O 3 , por litro).

7.3. Procedimento

7.3.1. Identificação do ácido salicílico no destilado da acidez volátil

Imediatamente após a dosagem da acidez volátil e a correcção devida ao dióxido de enxofre livre e combinado, juntar ao erlenmeyer 0,5 ml de ácido clorídrico (ponto 7.2.1), 3 ml da solução 0,1 M de tiossulfato de sódio (ponto 7.2.2) e 1 ml da solução de sulfato de ferro (III) e de amónio (ponto 7.2.3).

Em presença de ácido salicílico, surge uma coloração violeta.

7.3.2. Dosagem do ácido salicílico

No erlenmeyer referido, marcar com um traço de referência o volume de destilado. Esvaziar e lavar o erlenmeyer.

Submeter uma nova toma de 20 ml de vinho a arrastamento com vapor de água e recolher o destilado no erlenmeyer até ao traço de referência. Juntar 0,3 ml de ácido clorídrico puro (ponto 7.2.1) e 1 ml da solução de sulfato de ferro (III) e de amónio (ponto 7.2.3). O conteúdo do erlenmeyer adquire coloração violeta.

Num erlenmeyer idêntico ao erlenmeyer com o traço de referência, deitar água destilada até ao mesmo nível que o do destilado. Juntar 0,3 ml de ácido clorídrico puro (ponto 7.2.1) e 1 ml da solução de sulfato de ferro (III) e de amónio (ponto 7.2.3). Deitar com uma bureta solução 0,01 M de salicilato de sódio (ponto 7.2.4) até se obter uma coloração violeta da mesma intensidade que a do erlenmeyer que contém o destilado de vinho.

Seja «n′′′» o volume gasto (em mililitros).

7.4. Correcção da acidez volátil

Subtrair o volume 0,1 n′′′ ml ao volume «n» ml de solução de hidróxido de sódio 0,1 M utilizado para titular a acidez do destilado na dosagem da acidez volátil.


13 ÁCIDO CÍTRICO (OIV -AS-313-09-ACIENZ) — MÉTODO DO TIPO II


Transformação do ácido cítrico em oxaloacetato e acetato, numa reacção catalisada pela citrato-liase (CL):

Citrato ←→oxaloacetato + acetato.

Redução do oxaloacetato e do seu derivado de descarboxilação (piruvato) a L-malato e L-lactato, por acção do nicotinamida-adenina-dinucleótido reduzido (NADH), na presença da malato-desidrogenase (MDH) e da lactato- -desidrogenase (LDH):

Oxaloacetato + NADH + H + ←→L-malato + NAD + ,

Piruvato + NADH + H + ←→L-lactato + NAD + .

Nestas reacções, a quantidade de NADH oxidado a NAD + é proporcional ao citrato presente. A oxidação do NADH é medida pela diminuição da sua absorvância no comprimento de onda 340 nm.

2. REAGENTES

2.1. Tampão de pH 7,8

(glicilglicina 0,51 M; pH = 7,8; Zn 2+ : 0,6×10 – 3 M):

Dissolver 7,13 g de glicilglicina em aproximadamente 70 ml de água bidestilada.

Ajustar o pH a 7,8 com cerca de 13 ml de solução 5 M de hidróxido de sódio (NaOH). Juntar 10 ml de solução a 80 mg por 100 ml de cloreto de zinco, ZnCl 2 , e completar o volume até 100 ml com água bidestilada.

A + 4 °C, esta solução mantém-se estável pelo menos 4 semanas.

2.2. Solução aproximadamente 6×10 -3 M de nicotinamida-adenina-dinucleótido reduzido (NADH). Dissolver 30 mg de NADH e 60 mg de NaHCO 3 em 6 ml de água bidestilada.

2.3. Solução de malato-desidrogenase/lactato-desidrogenase (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml):

Misturar 0,1 ml de MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml de solução de sulfato de amónio (3,2 M) e 0,5 ml de LDH (5 mg/ml). A + 4 °C, esta suspensão mantém-se estável pelo menos um ano.

2.4. Citrato-liase (CL) (5 mg de proteína/ml). Dissolver 168 mg do liofilizado em 1 ml de água gelada. A + 4 °C, esta solução mantém-se estável pelo menos uma semana; congelada, mantém-se estável pelo menos 4 semanas.

É aconselhável verificar a actividade da enzima antes da dosagem.

2.5. Polivinilpolipirrolidona (PVPP)

Nota: Todos os reagentes necessários estão comercializados.

3. EQUIPAMENTO

3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm (máximo de absorção do NADH).

Na falta de um espectrofotómetro que permita efectuar medições a 340 nm, utilizar um espectrofotómetro de espectro descontínuo que permita efectuar medições a 334 nm ou a 365 nm. Dado tratar-se de medições absolutas de absorvância (não se recorre a uma calibração, mas sim ao coeficiente de extinção do NADH), as escalas de comprimentos de onda e de absorvâncias do aparelho devem ser aferidas.

3.2. Células de vidro com 1 cm de percurso óptico, eventualmente descartáveis.

3.3. Micropipetas que permitam recolher volumes compreendidos entre 0,02 ml e 2 ml.


De um modo geral, a dosagem do citrato efectua-se directamente no vinho, sem descoloração prévia nem diluição, desde que o teor de ácido cítrico seja inferior a 400 mg/l. Caso contrário, diluir o vinho de modo que a concentração de citrato se situe entre 20 mg/l e 400 mg/l (quantidade de citrato na toma para ensaio compreendida entre 5 μg e 80 μg).


É aconselhável tratar previamente com PVPP os vinhos tintos ricos em compostos fenólicos:

Colocar em suspensão em água aproximadamente 0,2 g de PVPP e deixar repousar 15 minutos. Filtrar com um filtro de pregas.

Num erlenmeyer de 50 ml, juntar a 10 ml de vinho a PVPP húmida retirada do filtro com uma espátula. Agitar 2 a 3 minutos. Filtrar.

5. PROCEDIMENTO

Com o espectrofotómetro regulado no comprimento de onda de 340 nm, efectuar as medições da absorvância em células de 1 cm, regulando a absorvância zero em relação ao ar (sem célula no percurso óptico). Introduzir nas células de 1 cm de percurso óptico:

Branco Dosagem

Solução 2.1 1,00 ml 1,00 ml


Amostra — 0,20 ml

Água bidestilada 2,00 ml 1,80 ml


Misturar e, após cerca de 5 minutos, ler as absorvâncias das soluções branco e de dosagem (A 1 ).

Adicionar em seguida:


Misturar e esperar pelo fim da reacção (cerca de 5 minutos). Ler as absorvâncias das soluções branco e de dosagem (A 2 ).

Determinar as diferenças de absorvâncias (A 1 –A 2 ) para o branco e para a solução de dosagem.

Deduzir a diferença de absorvâncias do branco à da solução de dosagem.

ΔA = ΔA D –ΔA T .

Nota: O tempo necessário para a acção das enzimas pode variar de um lote para outro e é referido apenas a título indicativo. Recomenda-se que seja determinado para cada lote.


Apresenta-se o teor de ácido cítrico em miligramas por litro (mg/l), sem casas decimais.


A fórmula geral para cálculo da concentração em miligramas por litro é a seguinte:

C = V×PM/(ε×d×v)×ΔA

V = volume utilizado na dosagem, em ml (neste caso, 3,14 ml)

v = volume da amostra, em ml (neste caso, 0,2 ml)

PM = massa molecular da substância a dosear (neste caso, ácido cítrico anidro: 192,1)

d = percurso óptico na célula, em cm (neste caso, 1 cm)

ε = coeficiente de absorção do NADH a 340 nm

ε = 6,3 mmole -1 × l × cm -1 .

Obtém-se:

C = 479ΔA

Se tiver sido efectuada uma diluição na preparação da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluição.

Nota: a 334nm: C = 488ΔA (ε = 6,2 mmole – 1 × l × cm – 1 )

a 365 nm: C = 887ΔA (ε = 3,4 mmole – 1 × l × cm – 1 )


6.2. Repetibilidade (r)

Teores de ácido cítrico inferiores a 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Teores de ácido cítrico superiores a 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3. Reprodutibilidade (R)

Teores de ácido cítrico inferiores a 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Teores de ácido cítrico superiores a 400 mg/l: R = 65 mg/l.


14 ÁCIDO SÓRBICO (OIV - AS-313-14-ACISOR) — MÉTODO DO TIPO IV


1.1. Método de dosagem por espectrofotometria de absorção no ultravioleta

Extracção do ácido sórbico (ácido trans,trans-hexa-2,4-dienóico) por arrastamento com vapor de água e dosagem do ácido extraído no destilado de vinho por espectrofotometria de absorção no ultravioleta. Eliminação das substâncias que interferem na medição da absorção no ultravioleta, por evaporação até à secura da toma para ensaio do destilado, ligeiramente alcalinizada com uma solução de hidróxido de cálcio. Os teores inferiores a 20 mg/l devem ser confirmados por cromatografia em camada fina (sensibilidade: 1 mg/l).

1.2. Método de dosagem por cromatografia em fase gasosa

Dosagem por cromatografia em fase gasosa, em presença de um padrão interno, do ácido sórbico extraído com éter etílico.

1.3. Método de pesquisa de vestígios por cromatografia em camada fina

Separação, por cromatografia em camada fina, do ácido sórbico extraído com éter etílico e determinação semi- -quantitativa da sua concentração.

2. MÉTODO DE DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NO ULTRAVIOLETA

2.1. Reagentes

2.1.1. Ácido tartárico (C 4 H 6 O 6 ) cristalizado.

2.1.2. Solução aproximadamente 0,02 M de hidróxido de cálcio, Ca(OH) 2 .

2.1.3. Solução de referência, a 20 mg por litro, de ácido sórbico

Dissolver 20 mg de ácido sórbico, C 6 H 8 O 2 , em aproximadamente 2 ml de solução 0,1 M de hidróxido de sódio. Transferir para um balão aferido de 1 000 ml e completar o volume com água até ao traço de aferição. Pode, igualmente, dissolver-se 26,8 mg de sorbato de potássio, C 6 H 7 KO 2 , em água e completar o volume até 1 000 ml com água.

2.2. Equipamento

2.2.1. Dispositivo de arrastamento com vapor de água (ver «Acidez volátil»).

2.2.2. Banho de água a 100 °C.

2.2.3. Espectrofotómetro que permita efectuar medições no comprimento de onda de 256 nm, equipado com células de quartzo de 1 cm de percurso óptico.

2.3. Procedimento

2.3.1. Destilação

Colocar 10 ml de vinho no borbulhador do dispositivo de arrastamento com vapor de água e adicionar 1 g a 2 g de ácido tartárico (2.1.1). Recolher 250 ml de destilado.

2.3.2. Curva de calibração

Preparar, por meio de diluições com água a partir da solução de referência (ponto 2.1.3), quatro soluções de referência diluídas que titulem, respectivamente, 0,5 mg, 1 mg, 2,5 mg e 5 mg de ácido sórbico por litro. Medir com o espectrofotómetro as absorvâncias destas soluções a 256 nm, em relação a água destilada. Traçar a curva das variações de absorvância em função da concentração das soluções. A variação é linear.

2.3.3. Dosagem

Numa cápsula de 55 mm de diâmetro, colocar 5 ml de destilado e juntar 1 ml de solução de hidróxido de cálcio (ponto 2.1.2). Evaporar até à secura num banho de água em ebulição.

Utilizando alguns mililitros de água destilada, arrastar o resíduo quantitativamente para um balão aferido de 20 ml e completar o volume com as águas de lavagem até ao traço de aferição. Medir com o espectrofotómetro a absorvância a 256 nm, em relação a uma solução branco obtida por diluição de 1 ml de solução de hidróxido de cálcio (ponto 2.1.2) com 20 ml de água.

A partir do valor de absorvância medido, utilizar a recta de calibração para obter a concentração, «C», de ácido sórbico da solução.

Nota: Na prática corrente, pode dispensar-se a evaporação até à secura e medir-se directamente a absorvância no destilado, diluído 1:4, em relação a água destilada.



2.4.1. Modo de cálculo

A concentração de ácido sórbico do vinho, expressa em miligramas por litro, é igual a:

100 × C

C = concentração de ácido sórbico da solução, analisada por espectrofotometria, expressa em miligramas por litro.

3. MÉTODO DE DOSAGEM POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

3.1. Reagentes

3.1.1. Éter etílico, (C 2 H 5 ) 2 O, destilado no momento de utilização.

3.1.2. Solução de padrão interno: solução a 1 g/l de ácido undecanóico, C 11 H 22 O 2 , em etanol a 95 % (vol).

3.1.3. Solução aquosa, diluída 1:3 (v/v), de ácido sulfúrico, H 2 SO 4 (ρ20 = 1,84 g/ml).

3.2. Equipamento

3.2.1. Cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector de ionização de chama e com uma coluna de aço inoxidável (4 m × 1/8 de polegada) previamente tratada com dimetildiclorossilano e cheia com uma fase estacionária, constituída por uma mistura de succinato de dietilenoglicol (5 %) e ácido fosfórico (1 %) (DEGS–H 3 PO 4 ) ou por uma mistura de adipato de dietilenoglicol (7 %) e ácido fosfórico (1 %) (DEGA – H 3 PO 4 ) fixada em Gaschrom Q80 – 100 mesh.

Para o tratamento com o dimetildiclorossilano (DMDCS), passar na coluna uma solução com 2 g a 3 g de DMDCS em tolueno. Lavar imediatamente a coluna com metanol. Passar uma corrente de azoto, a seguir de hexano e, de novo, de azoto. Encher seguidamente a coluna.

Condições operatórias:

Temperatura do forno: 175 °C.

Temperatura do injector e do detector: 230 °C.

Gás vector: azoto (caudal: 20 ml/minuto).

3.2.2. Microsseringa de 10 microlitros, graduada em 0,1 microlitros.

Nota: Há outros tipos de colunas que permitem uma boa separação, especialmente colunas capilares (por exemplo FFAP).

O procedimento a seguir descrito é apresentado a título de exemplo.

3.3. Procedimento

3.3.1. Preparação da amostra a analisar

Num tubo de vidro de aproximadamente 40 ml, com tampa esmerilada, introduzir 20 ml de vinho e juntar 2 ml de solução de padrão interno (ponto 3.1.2) e 1 ml de solução diluída de ácido sulfúrico (ponto 3.1.3).

Após agitação por inversões sucessivas, juntar ao conteúdo do tubo 10 ml de éter etílico (ponto 3.1.1). Extrair o ácido sórbico para a fase orgânica por agitação do tubo durante 5 minutos. Deixar decantar.

3.3.2. Preparação da solução de referência

Seleccionar um vinho cujo cromatograma do extracto etéreo não apresente qualquer pico na zona de eluição do ácido sórbico. Enriquecer este vinho em ácido sórbico até à concentração de 100 mg por litro. Tratar 20 ml de amostra assim preparada pelo processo descrito no ponto 3.3.1.

3.3.3. Cromatografia

Injectar sucessivamente no cromatógrafo, com uma microsseringa, 2 μl de fase etérea obtida como se indica no ponto 3.3.2 e 2 μl de fase etérea obtida como se indica no ponto 3.3.1.

Registar os cromatogramas respectivos. Verificar a identidade dos tempos de retenção do ácido sórbico e do padrão interno. Medir a altura (ou a área) de cada pico registado.




A concentração de ácido sórbico do vinho analisado, expressa em miligramas por litro, é igual a:

100 × (h/H) × l/i

H = altura do pico do ácido sórbico na solução de referência

h = altura do pico do ácido sórbico na amostra a analisar

l = altura do pico do padrão interno na solução de referência

i = altura do pico do padrão interno na amostra a analisar.

Nota: Pode determinar-se do mesmo modo a concentração de ácido sórbico a partir das áreas dos picos respectivos.


15 pH (OIV - AS-313-15-PH) — MÉTODO DO TIPO I


Medição da diferença de potencial entre dois eléctrodos mergulhados no líquido estudado. Um dos eléctrodos tem um potencial que é uma função definida do pH do líquido; o outro, que constitui o eléctrodo de referência, tem um potencial fixo e conhecido.

2. EQUIPAMENTO

2.1. Medidor de pH, graduado em unidades de pH, que permita efectuar medições com a aproximação de pelo menos 0,05 unidades.

2.2. Eléctrodos:

2.2.1. Eléctrodo de vidro, a conservar em água destilada.

2.2.2. Eléctrodo de referência de calomelanos-cloreto de potássio saturado, a conservar numa solução saturada de cloreto de potássio.

2.2.3. Ou eléctrodo combinado, a conservar em água destilada.

3. REAGENTES

3.1. Soluções-tampão:

3.1.1. Solução saturada de tartarato ácido de potássio que contenha pelo menos 5,7 gramas de tartarato ácido de potássio (C 4 H 5 KO 6 ) por litro, a 20 °C. Em presença de 0,1 g de timol por 200 ml, pode conservar-se dois meses.

pH

3,57 a 20 °C

3,56 a 25 °C

3,55 a 30 °C

8 > > > > < > > > > :

3.1.2. Solução 0,05 M de ftalato ácido de potássio, que contém 10,211 gramas de ftalato ácido de potássio (C 8 H 5 KO 4 ) por litro, a 20 °C. Duração máxima de conservação: 2 meses.

pH

3,999 a 15 °C

4,003 a 20 °C

4,008 a 25 °C

4,015 a 30 °C

8 >> > > > > > > > < >> > > > > > > > :

3.1.3. Solução que contenha:

Fosfato monopotássico, KH 2 PO 4 ............................................................................................................................ 3,402 g

Fosfato dipotássico, K 2 HPO 4 .................................................................................................................................... 4,354 g

Água, q.b. para ............................................................................................................................................................... 1 l

(Duração máxima de conservação: 2 meses.)

pH

6,90 a 15 °C

6,88 a 20 °C

6,86 a 25 °C

6,85 a 30 °C

8 >> > > > > > > > < >> > > > > > > > :

Nota: Podem igualmente ser utilizadas as soluções-tampão de referência comerciais.


4. PROCEDIMENTO

4.1. Preparação da amostra a analisar

4.1.1. Mostos e vinhos

Trabalhar directamente com o mosto ou vinho.


Diluir o mosto concentrado rectificado com água, de modo a obter uma concentração de 25 % ± 0,5 % (m/m) de açúcares totais (25 o Brix).

Se «P» for o teor percentual (m/m) de açúcares totais do mosto concentrado rectificado, pesar uma massa de 2 500/P

e completar até 100 g com água. A condutividade da água utilizada deve ser inferior a 2 microsiemens por centímetro.

4.2. Regulação do zero do aparelho

Antes de qualquer medição, regula-se o zero seguindo as instruções de utilização do aparelho.

4.3. Calibração do medidor de pH

Calibrar o aparelho a 20 °C, com as soluções-tampão de pH 6,88 e 3,57, a 20 °C, seguindo as instruções de utilização do aparelho.

Utilizar a solução-tampão de pH 4,00 a 20 °C para verificar a calibração da escala.

4.4. Medição

Mergulhar o eléctrodo na amostra a analisar, cuja temperatura deve situar-se entre 20 °C e 25 °C e ser tão próxima quanto possível de 20 °C. Ler directamente na escala o valor do pH.

Efectuar pelo menos duas determinações com cada amostra.

Tomar como resultado a média aritmética das leituras efectuadas.


O pH do mosto, do vinho ou da solução a 25 % (m/m) (25° Brix) de mosto concentrado rectificado é expresso com duas casas decimais.


16 DOSAGEM SIMULTÂNEA DO ÁCIDO L-ASCÓRBICO E DO ÁCIDO D-ISOASCÓRBICO POR HPLC, COM DETECÇÃO NO ULTRAVIOLETA (OIV–AS-313-22-ACASCO) — MÉTODO DO TIPO II

1. INTRODUÇÃO

O ácido ascórbico é um antioxidante presente naturalmente numa série de géneros alimentícios. A quantidade de ácido ascórbico presente nas uvas diminui durante a elaboração dos mostos e no decurso da vinificação. Dentro de certos limites, pode ser adicionado ácido ascórbico aos mostos e aos vinhos.

O método descrito foi validado no quadro de ensaios interlaboratoriais, por meio de análises de amostras de vinho com quantidades adicionadas de ácido L-ascórbico e de ácido D-isoascórbico de, respectivamente, 30 mg/l a 150 mg/l e 10 mg/l a 100 mg/l.


Este método aplica-se à determinação simultânea de teores, compreendidos entre 3 mg/l e 150 mg/l, de ácido L-ascórbico e de ácido D-isoascórbico (ácido eritórbico) no vinho por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), com detecção no ultravioleta.

É necessário diluir as amostras se o teor exceder 150 mg/l.

3. PRINCÍPIO

Filtração por membrana e subsequente injecção directa das amostras no sistema de HPLC. Separação dos analitos numa coluna de inversão de fases e detecção dos mesmos no ultravioleta, a 266 nm. Determinação quantitativa dos ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico em relação a um padrão externo.

Nota: As colunas e as condições de funcionamento são indicadas a título de exemplo. Também pode conseguir- -se uma boa separação com outros tipos de colunas.

4. REAGENTES E PRODUTOS

4.1. Reagentes

4.1.1. n-Octilamina de pureza ≥ 99,0 %.

4.1.2. Acetato de sódio tri-hidratado de pureza ≥ 99,0 %.

4.1.3. Ácido acético puro (100 %).

4.1.4. Ácido fosfórico, aproximadamente a 25 %.

4.1.5. Ácido oxálico de pureza ≥ 99,0 %.

4.1.6. Ascorbato-oxidase.

4.1.7. Ácido L-ascórbico ultrapuro (≥ 99,5 %).

4.1.8. Ácido D-isoascórbico de pureza ≥ 99,0 %.

4.1.9. Água bidestilada.

4.1.10. Metanol p.a. (99,8 %).

4.2. Preparação da fase móvel

4.2.1. Soluções para a fase móvel

Preparar as seguintes soluções para a fase móvel:

4.2.1.1. 12,93 g de n-octilamina em 100 ml de metanol.

4.2.1.2. 68,05 g de acetato de sódio tri-hidratado em 500 ml de água bidestilada.

4.2.1.3. 12,01 g de ácido acético puro em 200 ml de água bidestilada.

4.2.1.4. Solução-tampão (pH 5,4): 430 ml de solução de acetato de sódio (4.2.1.2) e 70 ml de solução de ácido acético (4.2.1.3).


4.2.2. Preparação da fase móvel

Juntar num copo 5 ml de solução de n-octilamina (4.2.1.1) a cerca de 400 ml de água bidestilada. Ajustar o pH dessa solução entre 5,4 e 5,6, adicionando, gota a gota, solução a 25 % (4.1.4) de ácido fosfórico. Adicionar 50 ml da solução-tampão (4.2.1.4) e transferir o líquido resultante para um balão aferido de 1 000 ml, completando o volume com água bidestilada. Antes de ser utilizada, a fase móvel é filtrada com uma membrana (celulose regenerada de 0,2 μm) e, se possível, desgaseada com hélio (durante cerca de 10 minutos), na medida do necessário para o sistema HPLC utilizado.

4.3. Preparação da solução-padrão

Nota:

As soluções-padrão (solução de reserva 4.3.1 e soluções de trabalho 4.3.2) devem ser preparadas no próprio dia e, de preferência, ser guardadas no frigorífico antes da injecção.

4.3.1. Preparação da solução de reserva (1 mg/ml)

Preparar uma solução aquosa a 2 % de ácido oxálico e eliminar o oxigénio dissolvido com uma corrente de azoto.

Pesar com exactidão 100 mg de ácido L-ascórbico e 100 mg de ácido D-isoascórbico num balão aferido de 100 ml e completar o volume com a solução aquosa a 2 % de ácido oxálico.

4.3.2. Preparação das soluções de trabalho

Para obter as concentrações pretendidas de soluções de trabalho, diluir a solução de reserva (4.3.1) com a solução a 2 % de ácido oxálico. Recomendam-se concentrações compreendidas entre 10 mg/l e 120 mg/l. Por exemplo 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl e 1 200 μl diluídos a 10 ml, o que corresponde a 10 mg/l, 20 mg/l, 40 mg/l, 80 mg/l e 120 mg/l.

5. EQUIPAMENTO

Material corrente de laboratório, em especial o seguinte equipamento:

5.1. Bomba para HPLC.

5.2. Injector de anel de 20 μl.

5.3. Detector de UV.

6. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

Antes da injecção, filtram-se as amostras de vinho por meio de uma membrana com poros de 0,2 μm de diâmetro.

É necessário diluir as amostras se o teor exceder 150 mg/l.

7. PROCEDIMENTO

7.1. Condições de utilização do sistema HPLC

Injectar no cromatógrafo 2 μl de amostra filtrada por uma membrana.

Pré-coluna: Por exemplo Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm).

Coluna: Por exemplo Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm).

Volume injectado: 20 μl.

Fase móvel: Ver 4.2.2; isocrática.

Caudal: 1 ml/minuto.

Detecção no UV: 266 nm.

Ciclo de lavagem: Pelo menos 30 ml de água bidestilada, seguidos de 30 ml de metanol e de 30 ml de acetonitrilo.


7.2. Identificação/Confirmação

Identificam-se os picos comparando os tempos de retenção dos padrões e das amostras. No sistema cromatográfico descrito como exemplo, os tempos de retenção são, respectivamente, 7,7 minutos para o ácido L- -ascórbico e 8,3 minutos para o ácido D-isoascórbico (figura 1, cromatograma A).

Para confirmar resultados positivos, adiciona-se às amostras em causa uma pitada de ascorbato-oxidase e efectua-se nova determinação (figura 1, cromatograma B).

Devido à degradação dos ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico pela ascorbato-oxidase, nenhum sinal deve ser detectado nos tempos de retenção de ambos os ácidos. Caso sejam detectados picos parasitas, deve ser tida em conta a área dos mesmos no cálculo da concentração dos analitos.

Figura 1

Exemplo de cromatograma de um vinho branco: Antes do tratamento com ascorbato-oxidase (traçado A; indicam-se os picos e os tempos de retenção, Rt, dos ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico); após tratamento com ascorbato-oxidase (traçado B; indica-se a posição correspondente aos picos dos ácidos L-ascórbico e D-

-isoascórbico).

Nota: Recomenda-se que a análise de amostras tratadas com ascorbato-oxidase seja efectuada no final de uma sequência e que seja seguida de um ciclo de lavagem, de modo a eliminar da coluna os restos da enzima. Caso contrário, os restos de ascorbato-oxidase poderiam converter os ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico durante as determinações por HPLC, afectando os resultados obtidos.

8. CÁLCULOS

Preparar uma curva de calibração a partir das soluções de trabalho (4.3.2). Seguindo o método do padrão externo, determinam-se quantitativamente o ácido L-ascórbico e o ácido D-isoascórbico medindo as áreas dos picos desses ácidos e obtendo as concentrações correspondentes por comparação com a curva de calibração.

Expressão dos resultados

Exprimem-se os resultados com uma casa decimal em mg/l de ácido L-ascórbico e mg/l de ácido D-isoascórbico (por exemplo 51,3 mg/l).

Se o teor exceder 150 mg/l, há que ter em conta a diluição.

9. FIDELIDADE

O método foi testado no âmbito de um ensaio interlaboratorial organizado em 1994 pelo antigo Bundesgesundheitsamt (Serviço Federal de Higiene Pública) da Alemanha, no qual participaram 27 laboratórios. O programa do ensaio interlaboratorial seguiu o parágrafo 35 da lei alemã dos géneros alimentícios, que foi aceite pelo OIV até à introdução do novo protocolo (OENO 6/2000).


O estudo incidiu em quatro amostras diferentes de vinho – dois brancos e dois tintos –, tendo sido solicitadas cinco repetições de cada amostra. Dado que não era possível preparar amostras nas quais os analitos de mantivessem suficientemente estáveis, devido às velocidades de degradação diferentes, foi decidido enviar aos participantes quantidades definidas de substâncias-padrão puras, juntamente com as amostras de vinhos. Os laboratórios receberam instruções para transferir quantitativamente os padrões para as amostras de vinhos e para efectuarem de imediato a análise das amostras. Foram analisadas concentrações de 30 mg/l a 150 mg/l, no caso do ácido L-ascórbico, e de 10 mg/l a 100 mg/l, no caso do ácido D-isoascórbico. Os resultados pormenorizados do estudo figuram no anexo publicado pela OIV. A avaliação foi realizada de acordo com a norma DIN/ISO 5725 (versão de 1988).

Os desvios-padrão de repetibilidade (s r ) e de reprodutibilidade (s R ) revelaram-se adequados às concentrações dos ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico. Os parâmetros de precisão podem ser calculados do seguinte modo:

Ácido L-ascórbico

s r = 0,011 x+0,31,

s R = 0,064 x+1,39.

x: concentração de ácido L-ascórbico (mg/l)

Ácido D-isoascórbico

s r = 0,014 x+0,31,

s R = 0,079 x+1,29.

x: concentração de ácido D-isoascórbico (mg/l)

Exemplo:

50 mg/l de ácido D-isoascórbico s r = 1,0 mg/l,

s R = 5,2 mg/l.

10. Outras características da análise

10.1. Limiar de detecção

O limiar de detecção deste método é estimado em 3 mg/l para os ácidos L-ascórbico e D-isoascórbico.

10.2. Justeza

A recuperação média calculada a partir dos resultados do ensaio interlaboratorial efectuado com quatro amostras (ver o anexo publicado no «Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos» da OIV) foi a seguinte:

— ácido L-ascórbico: 100,6 %,

— ácido D-isoascórbico: 103,3 %


17 DIÓXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — MÉTODO DO TIPO II


1.1. Vinhos tranquilos (sobrepressão de CO 2 ≤ 0,5 × 10 5 Pa) ( 1 )

Adição de um volume de vinho, tomado da amostra e levado a cerca de 0 °C, a um excesso de solução titulada de hidróxido de sódio, suficiente para se obter um pH de 10 a 11. Titulação com uma solução ácida, em presença de anidrase carbónica. Determinação do teor de dióxido de carbono a partir do volume gasto para passar de pH 8,6 (carbonato ácido) a pH 4,0 (ácido carbónico). De modo a ter em conta o volume de solução de hidróxido de sódio consumido pelos ácidos do vinho, titula-se, nas mesmas condições, um branco de vinho descarbonatado.

1.2. Vinhos frisantes e vinhos espumantes

Refrigeração da amostra de vinho a analisar até uma temperatura próxima do seu ponto de congelação. Toma de um determinado volume de vinho, destinado a servir de branco após descarbonatação, e, em seguida, alcalinização do vinho restante na garrafa, para fixar todo o CO 2 sob a forma de Na 2 CO 3 . Titulação com uma solução ácida em presença de anidrase carbónica. Determinação do teor de dióxido de carbono a partir do volume de solução ácida gasta para passar de pH 8,6 (carbonato ácido) a pH 4,0 (ácido carbónico). Para ter em conta o volume de solução de hidróxido de sódio consumido pelos ácidos do vinho, titula-se nas mesmas condições um branco de vinho descarbonatado.

2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO

2.1. Vinhos tranquilos (sobrepressão de CO 2 ≤ 0,5 × 10 5 Pa)

2.1.1. Equipamento

2.1.1.1. Agitador magnético.

2.1.1.2. Medidor de pH.

2.1.2. Reagentes

2.1.2.1. Solução 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH).

2.1.2.2. Solução 0,05 M de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ).

2.1.2.3. Solução de anidrase carbónica, a 1 grama por litro.

2.1.3. Procedimento

Arrefecer a amostra de vinho, assim como a pipeta de 10 ml a utilizar para retirar a toma para análise, a cerca de 0 °C.

Deitar 25 ml de solução de hidróxido de sódio (ponto 2.1.2.1) num copo de 100 ml. Juntar duas gotas de solução aquosa de anidrase carbónica (ponto 2.1.2.3). Com a pipeta arrefecida a 0 °C, introduzir no mesmo copo 10 ml de vinho.

Colocar o copo no agitador magnético, introduzir o eléctrodo e a barra magnética e agitar moderadamente.

Quando o líquido atingir a temperatura ambiente, deitar, por afusão lenta, solução de ácido sulfúrico (ponto 2.1.2.2) até pH 8,6.

Continuar as afusões de ácido sulfúrico (ponto 2.1.2.2) até atingir o pH 4,0. Seja «n» ml o volume utilizado entre pH 8,6 e 4,0.

Por outro lado, proceder à eliminação do CO 2 em cerca de 50 ml de amostra de vinho, por agitação sob vácuo durante 3 minutos e aquecendo o balão num banho de água até cerca de 25 °C.

Aplicar o procedimento descrito a 10 ml de vinho descarbonatado. Seja «n′» ml o volume utilizado.

2.1.4. Expressão dos resultados

1 ml de solução titulada 0,05 M de ácido sulfúrico corresponde a 4,4 mg de CO 2 .

A quantidade de CO 2 , em gramas por litro de vinho, é dada por

0,44 (n–n′)

e exprime-se com duas casas decimais.

Nota: No caso dos vinhos com pouco CO 2 (teor inferior a 1 g/l), não é necessário adicionar anidrase carbónica para catalisar a hidratação do CO 2 .


( 1 ) 10 5 pascal (Pa) = 1 bar.

2.2. Vinhos frisantes e vinhos espumantes

2.2.1. Equipamento

2.2.1.1. Agitador magnético.

2.2.1.2. Medidor de pH.

2.2.2. Reagentes

2.2.2.1. Solução a 50 % (m/m) de hidróxido de sódio (NaOH).

2.2.2.2. Solução 0,05 M de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ).

2.2.2.3. Solução de anidrase carbónica, a 1 grama por litro.

2.2.3. Procedimento

Na garrafa do vinho a analisar, traçar uma marca no nível de enchimento. Arrefecer em seguida a garrafa até ao início da congelação.

Deixar a garrafa aquecer ligeiramente, agitando-a, até ao desaparecimento dos cristais de gelo.

Desrolhar rapidamente a garrafa e reservar, numa proveta graduada, 45 ml a 50 ml de vinho, que servirão para uma dosagem em branco. Determinar o volume exacto desta toma, «v» ml, lendo-o na escala da proveta, quando for atingida a temperatura ambiente.

Logo a seguir à recolha da toma para o branco, deitar 20 ml de solução de hidróxido de sódio (ponto 2.2.2.1) na garrafa (está prevista uma capacidade de 750 ml).

Esperar que o vinho volte à temperatura ambiente.

Deitar num copo de 100 ml 30 ml de água destilada fervida e duas gotas da solução de anidrase carbónica (ponto 2.2.2.3). Adicionar 10 ml de vinho alcalinizado.

Colocar o copo na placa de agitação magnética, introduzir o eléctrodo e a barra magnética e agitar moderadamente.

Deitar, por afusão lenta, solução de ácido sulfúrico (ponto 2.2.2.2) até pH 8,6.

Continuar as afusões de ácido sulfúrico (ponto 2.2.2.2) até pH 4,0. Seja «n» ml o volume utilizado entre pH 8,6 e 4,0.

Por outro lado, proceder à eliminação do CO 2 nos «v» ml de vinho reservados para a dosagem em branco, por agitação sob vácuo durante três minutos e aquecendo o balão num banho de água até cerca de 25 °C. Juntar 10 ml de vinho descarbonatado a 30 ml de água destilada fervida e adicionar duas a três gotas de solução de hidróxido de sódio (ponto 2.2.2.1), para levar o pH a 10-11. Em seguida, aplicar o procedimento descrito. Seja «n′» ml o volume utilizado de ácido sulfúrico 0,05 M.

2.2.4. Expressão dos resultados

1 ml de solução 0,05 M de ácido sulfúrico corresponde a 4,4 mg de CO 2 .

Esvaziar a garrafa que contém o vinho alcalinizado e determinar, com a aproximação de 1 ml, o volume inicial de vinho, enchendo-a com água até ao traço marcado. Seja esse volume «V» ml.

A quantidade de CO 2 , em gramas por litro de vinho, é dada por:

0,44(n–n′) × (V–v+20)/(V–v)

e exprime-se com duas casas decimais.

2.3. Cálculo da sobrepressão teórica

A sobrepressão a 20 °C, Paph20, expressa em pascal, é dada pela fórmula:

Paph 20 = Q/[1,951 × 10 –5 (0,86–0,01A)×(1–0,00144S)]–Patm,

em que:

Q: teor, em gramas, de CO 2 por litro de vinho,

A: título alcoométrico do vinho a 20 °C

S: teor, em gramas, de açúcares por litro de vinho,

Patm: pressão atmosférica, expressa em pascal.


18 DOSAGEM DO DIÓXIDO DE CARBONO NO VINHO PELO MÉTODO MANOMÉTRICO (OIV–AS314-04- -CO2MAN) — MÉTODO DO TIPO II

(p.m.)

[As instâncias da OIV estão a actualizar o descritivo deste método de análise. Esse descritivo será publicado numa próxima comunicação da Comissão quando a OIV publicar um texto actualizado, na edição de 2010 do seu Compêndio dos Métodos Internacionais de Análise dos Vinhos e Mostos.]


19 MEDIÇÃO DA SOBREPRESSÃO EM VINHOS ESPUMANTES E FRISANTES (OIV-AS-314-02-SURPRES) — MÉTODO DO TIPO I

1. PRINCÍPIO

Estabilização térmica e agitação da garrafa, seguidas de medição da sobrepressão com um afrómetro (medidor de pressão). Expressão da sobrepressão em pascal (Pa) (método do tipo I). Este método também se aplica aos vinhos espumantes gaseificados e aos vinhos frisantes gaseificados.

2. EQUIPAMENTO

Designa-se por «afrómetro» um aparelho que permite medir a sobrepressão em garrafas de vinhos espumantes e de vinhos frisantes. A constituição do aparelho depende do tipo de tampa da garrafa (cápsula metálica, coroa, rolha de cortiça ou de plástico).

2.1. Garrafas com cápsula ou com coroa

O afrómetro é constituído por três partes (figura 1):

— a parte superior (parafuso porta-agulha), constituída pelo manómetro, por um anel de aperto manual, por um parafuso sem-fim (que se enrosca na parte média) e por uma agulha, que atravessa a cápsula. A agulha dispõe de um orifício lateral que comunica a pressão ao manómetro. Uma junta assegura a estanqueidade do conjunto sobre a cápsula da garrafa;

— a parte média (porca), que serve para centrar a parte superior. Enrosca-se na parte inferior, de maneira a manter firmemente o conjunto sobre a garrafa;

— a parte inferior (suporte), munida de uma peça de adaptação que se posiciona sob o anel da garrafa de maneira a fixar o conjunto. Existem anéis adaptados a cada tipo de garrafa.

2.2. Garrafas com rolha

O aparelho é constituído por duas partes (figura 2):

— a parte superior, idêntica à do aparelho anterior, embora a agulha seja mais comprida. Esta é formada por um tubo oco longo, em cuja extremidade é colocada uma ponta que permite perfurar a rolha. A ponta é amovível e cai dentro do vinho, uma vez atravessada a rolha;

— a parte inferior, formada por uma porca e por uma base que se coloca sobre a rolha. Dispõe de quatro parafusos de aperto, que servem para manter o conjunto sobre a rolha.

Figura 2: Afrómetro para rolhas Figura 1: Afrómetro para cápsulas ou coroas


Observações sobre os manómetros que equipam os dois tipos de aparelhos:

— podem ser mecânicos, com tubo de Bourdon, ou digitais, com captador piezoeléctrico. No primeiro caso, o tubo de Bourdon é obrigatoriamente de aço inoxidável;

— são graduados em pascal (abreviatura Pa). No caso dos vinhos espumantes, é mais prático utilizar como unidade 10 5 pascal (10 5 Pa) ou o quilopascal (kPa);

— podem ser de diferentes classes. A classe de um manómetro é a precisão da leitura em relação à escala completa, expressa em percentagem (por exemplo manómetro 1 000 kPa, classe 1 significa pressão de utilização máxima de 1 000 kPa e leitura a ± 10 kPa). Para medições rigorosas, recomenda-se a classe 1.

3. PROCEDIMENTO

A medição efectua-se em garrafas cuja temperatura esteja estabilizada há pelo menos 24 horas. Depois de perfurada a coroa ou a rolha de cortiça ou de plástico, agitar vigorosamente a garrafa, até se obter uma pressão constante para efectuar a leitura.

3.1. Garrafas com cápsula ou com coroa

Posicionar a peça de adaptação do suporte sob o anel da garrafa. Apertar a porca de modo que o conjunto fique bem fixado sobre a garrafa. Enroscar a parte superior na porca. A fim de evitar perdas de gás, a perfuração da cápsula ou coroa deve efectuar-se o mais rapidamente possível, para que a junta fique em contacto com a cápsula ou coroa. Agitar em seguida vigorosamente a garrafa, até a pressão ser constante, para efectuar a leitura.

3.2. Garrafas com rolha

Colocar uma ponta na extremidade da agulha. Posicionar o dispositivo completo sobre a rolha. Apertar os quatro parafusos contra a rolha. Enroscar a parte superior (a agulha perfura e atravessa a rolha). Para que a pressão possa transmitir-se ao manómetro, a ponta deve cair para dentro da garrafa. Efectuar a leitura depois de agitar a garrafa até a pressão ser constante. Recuperar a ponta após a leitura.


Exprime-se a sobrepressão a 20 °C (Paph20) em pascal (Pa) ou quilopascal (kPa), consoante a precisão do manómetro (exemplo: 6,3 × 10 5 Pa ou 630 kPa e não 6,33 × 10 5 Pa ou 633 kPa, no caso de um manómetro de 1 000 kPa, escala completa, de classe 1).

Se a temperatura de medição for diferente de 20 °C, é necessário corrigir o resultado, multiplicando a pressão medida pelo coeficiente apropriado (ver o quadro 1).

Quadro 1

Relação entre a sobrepressão, Paph 20 , de um vinho frisante ou espumante a 20 °C e a sobrepressão, Paph t , à temperatura t

°C

0 1,85

1 1,80

2 1,74

3 1,68

4 1,64

5 1,59

6 1,54

7 1,50

8 1,45

9 1,40

10 1,36

11 1,32

12 1,28

°C

13 1,24

14 1,20

15 1,16

16 1,13

17 1,09

18 1,06

19 1,03

20 1,00

21 0,97

22 0,95

23 0,93

24 0,91

25 0,88


5. AFERIÇÃO DOS RESULTADOS

Método de determinação directa de parâmetros físicos (método critério do tipo I)

Verificação dos afrómetros

Os afrómetros devem ser verificados regularmente (pelo menos uma vez por ano).

A verificação é feita com um banco de calibragem, que permite comparar o manómetro a testar com um manómetro de referência, de classe superior, aferido pelos padrões nacionais e montado em paralelo. Pretende- -se comparar os valores indicados nos dois aparelhos a pressões crescentes e, em seguida, decrescentes. Se houver diferenças entre os dois manómetros, um parafuso de regulação permite efectuar as correcções necessárias.

Os laboratórios e os organismos autorizados estão equipados com estes bancos de calibragem, de que os fabricantes de manómetros também dispõem.


20 DOSAGEM DA LISOZIMA NO VINHO POR HPLC (OIV-AS-315-14) — MÉTODO DO TIPO IV

1. INTRODUÇÃO

É preferível utilizar para a lisozima um método analítico não baseado na actividade enzimática.


Este método permite determinar quantitativamente (em mg de proteína por litro) a lisozima presente em vinhos brancos e tintos sem relação com a actividade enzimática da matriz (que poderia ser afectada por uma desnaturação parcial ou por fenómenos de complexação e de co-precipitação).

3. DEFINIÇÃO

A cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) é uma via analítica baseada nas interacções estereoquímicas, polares ou de adsorção entre a fase estacionária e o analito, não tendo, portanto, relação com a actividade enzimática efectiva da proteína.

4. PRINCÍPIO

Análise por HPLC, associada a um detector espectrofotométrico e a um detector espectrofluorimétrico. Cálculo do teor desconhecido de lisozima da amostra de vinho com base na área do pico cromatográfico e no método do padrão externo.

5. REAGENTES

5.1. Solventes e soluções

Acetonitrilo (CH 3 CN) para HPLC.

Ácido trifluoroacético puro.

Água desionizada para HPLC.

Solução-padrão: ácido tartárico a 1 g/l, álcool etílico a 10 % (v/v), ajustado a pH 3,2 com tartarato de potássio neutro.

5.2. Eluentes

A: 1 % de CH 3 CN, 0,2 % de ácido trifluoroacético, 98,8 % de H 2 O.

B: 70 % de CH 3 CN, 0,2 % de ácido trifluoroacético, 29,8 % de H 2 O.

5.3. Soluções de referência

Dissolver 1 mg a 250 mg de lisozima padrão num litro de solução-padrão, com agitação contínua durante pelo menos 12 horas.

6. MATERIAL

6.1. Aparelho de HPLC com sistema de bombagem preparado para efectuar um gradiente de eluição.

6.2. Forno para termostatização da coluna.

6.3. Detector espectrofotométrico associado a um detector espectrofluorimétrico.

6.4. Anel de injecção de 20 μl

6.5. Coluna polimérica de inversão de fases com grupos fenilo (diâmetro dos poros = 1 000 Å, limite de exclusão = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel fenil 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm de diâmetro interno (a título de exemplo).

6.6. Pré-coluna do mesmo material que a coluna, Tosoh Bioscience TSK-gel fenil 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm de diâmetro interno (a título de exemplo).


Acidificar as amostras de vinho com HCl 10 M diluído 1:10 e, passados 5 minutos, filtrá-las por meio de um filtro de poliamida com poros de 0,22 μm de diâmetro. Efectuar a análise cromatográfica imediatamente após a filtração.

8. CONDIÇÕES OPERATÓRIAS

8.1. Caudal de eluente: 1 ml/minuto.

8.2. Temperatura da coluna: 30 °C.


8.3. Detecção espectrofotométrica: 280 nm.

8.4. Detecção espectrofluorimétrica: λex = 276 nm ; λem = 345 nm ; Ganho = 10.

8.5. Programa do gradiente de eluição

Tempo (minutos) Solução A (%) Solução B (%) Gradiente

0 100 0

isocrático

3 100 0

linear

10 65 35

isocrático

15 65 35

linear

27 40,5 59,5

linear

29 0 100

isocrático

34 0 100

linear

36 100 0

isocrático

40 100 0

8.6. Tempo de retenção médio da lisozima : 25,50 minutos.

9. CÁLCULO

Analisam-se triplicados de soluções de referência com as seguintes concentrações de lisozima: 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l e 250 mg/l. Determinam-se em cada cromatograma as áreas dos picos correspondentes à lisozima e traça-se um diagrama dessas áreas em função das concentrações respectivas, de modo a obterem-se rectas de regressão linear do tipo y = ax+b. O coeficiente de determinação, r 2 , deve ser > 0,999.

10. CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO

A fim de avaliar a adequação do método ao objectivo estabelecido, realizou-se um estudo de validação com base na linearidade, nos limiares de detecção (LD) e de quantificação (LQ) e na precisão do método. Este último parâmetro foi determinado com base nos níveis de precisão e de exactidão do método.

Intervalo de lineari

dade (mg/l)

Declive da recta

Coeficiente de determinação

(r 2 )

LD (mg/l) LQ (mg/l)

Repetibilidade (n=5) desvio- -padrão de repetibilidade (%)

Reprodutibilidade (n=5)

desvio-padrão de reprodutibi

lidade (%)

Padrão 1 V. T. 2 V. B. 3 Padrão 1

UV 5-250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93

Detecção fluorimétrica

1-250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Quadro 1: Dados relativos às características do método (Padrão 1 = solução-padrão; V. T. 2 = vinho tinto; V. B. 3 = vinho branco).


10.1. Linearidade do método

Com base nos resultados obtidos pela análise de regressão linear, o método revelou-se linear nos intervalos indicados no quadro 1.

10.2. Limiares de detecção e de quantificação

Calcularam-se os limiares de detecção e de quantificação como os sinais equivalentes, respectivamente, a 3 vezes e a 10 vezes o ruído de fundo cromatográfico, em condições de trabalho com matriz real (quadro 1).

10.3. Precisão do método

Consideram-se os parâmetros repetibilidade e reprodutibilidade. Indicam-se no quadro 1 os valores desses parâmetros correspondentes à solução-padrão e a vinho branco e tinto, expressos em desvio-padrão percentual das determinações repetidas a diversas concentrações.

10.4. Exactidão do método

Calculou-se a percentagem de recuperação com soluções-padrão que continham 5 mg/l e 50 mg/l de lisozima e às quais foi adicionada uma quantidade determinada de lisozima, como se indica no quadro seguinte.

Concentração inicial nominal

(mg/l) Adição (mg/l)

Concentração teórica (mg/l)

Concentração determinada

(mg/l) Desvio-padrão Recuperação (%)

UV a 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99


50 13,1 63,1 64,5 5,36 102

UV a 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1


5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

Figura 1 Cromatograma de vinho tinto com lisozima pura (adicionou-se ao vinho solução-padrão a 1 000 mg/l de lisozima, de modo a obter uma concentração final de lisozima de 125 mg/l). A: detector UV a 280 nm; B: detector UV a 225 nm; C: detector espectrofluorimétrico (λex = 276 nm; λem = 345 nm).


21 SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) — MÉTODO DO TIPO II


1.1. Método de referência

Precipitação do sulfato de bário e pesagem. Elimina-se o fosfato de bário, que precipita nas mesmas condições, por lavagem do precipitado com ácido clorídrico.

No caso dos mostos e vinhos ricos em dióxido de enxofre, deve efectuar-se uma dessulfitagem prévia, por ebulição ao abrigo do ar.

1.2. Método de ensaio rápido

Classificação dos vinhos em várias categorias pelo método dito dos limites, baseado na precipitação do sulfato de bário com uma solução titulada de bário.


2.1. Reagentes

2.1.1. Solução 2 M de ácido clorídrico.

2.1.2. Solução de cloreto de bário (BaCl 2 •2H 2 O) a 200 g/l.

2.2. Procedimento

2.2.1. Caso geral

Num tubo de centrifugação de 50 ml, introduzir 40 ml da amostra a analisar. Adicionar 2 ml de ácido clorídrico 2 M e 2 ml de solução de cloreto de bário a 200 g/l. Agitar com uma vareta de vidro. Lavar a vareta com um pouco de água destilada e deixar em repouso. Centrifugar durante 5 minutos e, em seguida, decantar com precaução o líquido sobrenadante.

A seguir, lavar o precipitado de sulfato de bário, procedendo do seguinte modo: adicionar 10 ml de ácido clorídrico 2 M, colocar o precipitado em suspensão e centrifugar 5 minutos; separar com precaução o líquido sobrenadante; repetir duas vezes a lavagem do precipitado nas mesmas condições, de cada vez com 15 ml de água destilada.

Transferir o precipitado quantitativamente, lavando com água destilada, para uma cápsula de platina tarada, que se coloca sobre um banho de água a 100 °C, até à secura. Em seguida, calcinar várias vezes sobre uma chama o precipitado seco, pouco tempo de cada vez, até à obtenção de um resíduo branco. Deixar arrefecer num exsicador e pesar.

Seja «m» a massa, em miligramas, de sulfato de bário obtida.

2.2.2. Caso particular: mostos sulfitados e vinho com teor elevado de dióxido de enxofre

Eliminar previamente o dióxido de enxofre.

Num erlenmeyer de 500 ml, munido de uma ampola com torneira e de um tubo de escape, introduzir 25 ml de água e 1 ml de ácido clorídrico puro (ρ20 = 1,15 – 1,18 g/ml). Levar esta solução à ebulição, para expulsar o ar, e introduzir 100 ml de vinho pela ampola, mantendo a solução em ebulição. Prosseguir a ebulição até o volume de líquido no balão estar reduzido a cerca de 75 ml. Após arrefecimento, transvasar quantitativamente esse volume para um balão aferido de 100 ml. Completar o volume com água até ao traço de aferição. Dosear os sulfatos, numa toma para ensaio de 40 ml, como se indica no ponto 2.2.1.


2.3.1. Cálculos

O teor de sulfatos, expresso em miligramas de sulfato de potássio (K 2 SO 4 ) por litro, é o seguinte:

18,67 m

O teor de sulfatos do mosto ou do vinho é expresso em miligramas de sulfato de potássio por litro, sem casas decimais.

2.3.2. Repetibilidade

Até 1 000 mg/l: r = 27 mg/l;

Cerca de 1 500 mg/l: r = 41 mg/l.

2.3.3. Reprodutibilidade

Até 1 000 mg/l: R = 51 mg/l;

Cerca de 1 500 mg/l: R = 81 mg/l.


22 FERRO (OIV - AS-322-05-FER) — MÉTODO DO TIPO IV


MÉTODO DE REFERÊNCIA

Dosagem do ferro por espectrofotometria de absorção atómica, após diluição adequada do vinho e eliminação do álcool.

MÉTODO USUAL

Mineralização do vinho com peróxido de hidrogénio e redução a Fe (II) do ferro que se encontra no estado Fe (III). Dosagem com base na coloração vermelha formada com a ortofenantrolina.


2.1. Reagentes

2.1.1. Solução-padrão concentrada de ferro (III), a 1 g/l

Utilizar uma solução-padrão a 1 g/l comercial. Para preparar esta solução, dissolver 8,6341 g de sulfato de ferro (III) e amónio (FeNH 4 (SO 4 ) 2 12H 2 O) em água destilada, ligeiramente acidificada com ácido clorídrico 1 M, e completar o volume até 1 litro.

2.1.2. Solução-padrão diluída de ferro, a 100 mg/l.

2.2. Equipamento

2.2.1. Evaporador rotativo, com banho de água termostatizado.

2.2.2. Espectrofotómetro de absorção atómica, equipado com um queimador de ar-acetileno.

2.2.3. Lâmpada de cátodo oco, de ferro.

2.3. Procedimento

2.3.1. Preparação da amostra

Eliminar o álcool do vinho, reduzindo o volume da amostra para metade, num evaporador rotativo (50-60 °C). Repor em seguida o volume inicial, com água destilada.

Se necessário, diluir antes da dosagem.

2.3.2. Calibração

Em cinco balões aferidos de 100 ml, colocar 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml e 5 ml da solução de ferro a 100 mg/l (ponto 2.1.2) e completar o volume até 100 ml com água destilada. As soluções assim preparadas contêm, respectivamente, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg e 5 mg de ferro por litro.

Conservar estas soluções em frascos de polietileno.

2.3.3. Dosagem

Seleccionar o comprimento de onda de 248,3 nm. Regular o zero da escala de absorvâncias com água destilada. Aspirar directamente para o queimador do espectrofotómetro a amostra diluída e depois, sucessivamente, as soluções-padrão, preparadas como se indica no ponto 2.3.2. Registar as absorvâncias. Efectuar as determinações em duplicado.



Traçar a curva de variação da absorvância em função da concentração de ferro das soluções-padrão. A partir do valor médio de absorvância obtido para a amostra de vinho diluído, utilizar essa curva para determinar a concentração de ferro, «C».

A concentração de ferro, expressa em miligramas por litro de vinho com uma casa decimal, é dada por:

C × F,

F = Factor de diluição.


23 COBRE (OIV - AS-322-06) — MÉTODO DO TIPO IV


Espectrofotometria de absorção atómica.

2. EQUIPAMENTO

2.1. Cápsula de platina.

2.2. Espectrofotómetro de absorção atómica.

2.3. Lâmpada de cátodo oco, de cobre.

2.4. Gás de alimentação: ar-acetileno ou óxido nitroso-acetileno.

3. REAGENTES

3.1. Cobre metálico.

3.2. Ácido nítrico concentrado a 65 % (HNO 3 , ρ 20 = 1,38 g/ml).

3.3. Ácido nítrico diluído 1:2 (v/v).

3.4. Solução de cobre a 1 g/l

Utilizar uma solução-padrão de cobre a 1 g/l comercial. Para preparar esta solução, pesar 1 000 g de cobre metálico e transferir quantitativamente a massa pesada para um balão aferido de 1 000 ml. Juntar a quantidade de ácido nítrico diluído 1:2 (3.3) estritamente necessária para dissolver o metal. Adicionar em seguida 10 ml de ácido nítrico concentrado (3.2) e completar o volume com água bidestilada, até ao traço de aferição.

3.5. Solução de cobre a 100 mg/l

Tomar 10 ml da solução 3.4 e introduzi-los num balão aferido de 100 ml, completando o volume com água bidestilada até ao traço de aferição.

4. PROCEDIMENTO

4.1. Preparação da amostra e dosagem do cobre

Introduzir 20 ml de amostra num balão aferido de 100 ml e completar o volume com água bidestilada até ao traço de aferição. Se necessário, adaptar a diluição.

Regular o zero da escala de absorvâncias com água destilada e ler em seguida a absorvância da amostra diluída no espectrofotómetro de absorção atómica, ao comprimento de onda de 324,8 nm. Se necessário, preparar uma diluição adequada com água bidestilada.

4.2. Traçado da curva de calibração

Numa série de balões aferidos de 100 ml, introduzir 0,5 ml, 1 ml e 2 ml da solução a 100 mg de cobre por litro (ponto 3.5) e completar o volume com água bidestilada. As soluções obtidas contêm, respectivamente, 0,5 mg/l, 1 mg/l e 2 mg/l de cobre. Traçar a curva de calibração com os valores de absorvância destas soluções, medidos como se descreve no ponto 4.1


A partir da absorvância lida para a amostra de vinho diluído, utilizar a curva de calibração para determinar a concentração «C», em mg/l, correspondente.

Sendo «F» o factor de diluição, o teor de cobre do vinho, expresso em miligramas por litro, é F×C.

O resultado é apresentado com duas casas decimais.

Notas:

a) As soluções para o traçado da curva de calibração e as diluições da amostra são escolhidas em função da sensibilidade do aparelho utilizado e da concentração de cobre da amostra.


b) No caso de concentrações muito baixas de cobre na amostra, o procedimento é o seguinte: introduzir 100 ml de amostra numa cápsula de platina, evaporar num banho de água a 100 °C, até obter uma consistência xaroposa, e juntar, gota a gota, 2,5 ml de ácido nítrico concentrado (ponto 3.2), procurando cobrir todo o fundo da cápsula. Incinerar o resíduo, com precaução, sobre uma placa eléctrica de aquecimento ou sobre uma pequena chama. Em seguida, introduzir a cápsula numa mufla regulada a 500 °C ± 25 °C, deixando-a nessas condições cerca de uma hora. Após arrefecimento, humedecer as cinzas com 1 ml de ácido nítrico concentrado (ponto 3.2), esmagando-as com uma vareta de vidro, e evaporar e incinerar de novo, como anteriormente. Levar novamente a cápsula à mufla durante 15 minutos. Repetir pelo menos três vezes este tratamento com ácido nítrico concentrado. Dissolver as cinzas, juntando à cápsula 1 ml de ácido nítrico concentrado (ponto 3.2) e 2 ml de água bidestilada. Transferir para um balão aferido de 10 ml. Lavar a cápsula três vezes, com 2 ml de água bidestilada de cada vez, e completar o volume com água bidestilada até ao traço de aferição. Efectuar a dosagem como se indica no ponto 4.1, utilizando os 10 ml de solução; ter em conta o factor de concentração na expressão dos resultados.


24 DIÓXIDO DE ENXOFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) — MÉTODO DO TIPO II

1. DEFINIÇÕES

Designa-se por «dióxido de enxofre» o dióxido de enxofre presente num mosto ou num vinho sob as formas H 2 SO 3 e HSO 3 –, cujo equilíbrio é função do pH e da temperatura:

H 2 SO 3 ←→H + + HSO 3

H 2 SO 3 representa o dióxido de enxofre molecular.

Designa-se por «dióxido de enxofre total» o conjunto das diferentes formas de dióxido de enxofre presentes, no estado livre ou combinadas com os componentes do vinho.

2. DIÓXIDO DE ENXOFRE LIVRE E DIÓXIDO DE ENXOFRE TOTAL

2.1. Princípio dos métodos

2.1.1. Método de referência

2.1.1.1. V i n h o s e m o s t o s

Arrasta-se o dióxido de enxofre com uma corrente de ar ou de azoto. Em seguida, fixa-se e oxida-se o dióxido de enxofre, por borbulhagem numa solução diluída neutra de peróxido de hidrogénio. Doseia-se o ácido sulfúrico formado com uma solução titulada de hidróxido de sódio. O dióxido de enxofre livre é extraído do vinho por arrastamento a frio (10 °C).

O dióxido de enxofre total é extraído do vinho por arrastamento a quente (cerca de 100 °C).

2.1.1.2. M o s t o s c o n c e n t r a d o s r e c t i f i c a d o s

Dilui-se o mosto concentrado rectificado e extrai-se o dióxido de enxofre total por arrastamento a quente (cerca de 100 °C).

2.1.2. Método de ensaio rápido (vinhos e mostos)

Doseia-se o dióxido de enxofre livre por titulação iodométrica directa.

Doseia-se a seguir o dióxido de enxofre combinado, por titulação iodométrica após hidrólise alcalina. Somando o dióxido de enxofre combinado ao dióxido de enxofre livre, obtém-se o dióxido de enxofre total.

2.2. Método de referência

2.2.1. Equipamento

2.2.1.1. O dispositivo utilizado deve corresponder ao esquema seguinte, principalmente no que respeita ao condensador.

Figura 1

As dimensões são indicadas em milímetros. Os diâmetros internos dos quatro tubos concêntricos que constituem o condensador são de 45 mm, 34 mm, 27 mm e 10 mm.


O tubo de admissão dos gases ao borbulhador, «B», termina numa pequena esfera de 1 cm de diâmetro, dotada de 20 orifícios de 0,2 mm de diâmetro no seu perímetro horizontal máximo. Esse tubo pode igualmente terminar numa placa de frita de vidro, que assegura a formação de um grande número de microbolhas e permite assim um bom contacto das fases gasosa e líquida.

O dispositivo deve ser percorrido por um caudal gasoso de cerca de 40 l/h. O frasco do lado direito do dispositivo destina-se a limitar a 20-30 cm de água a depressão produzida pela trompa de água. Para se poder regular esta depressão de modo que o caudal seja correcto, é conveniente inserir um caudalímetro de tubo semicapilar entre o borbulhador e o referido frasco.

2.2.1.2. Microbureta.

2.2.2. Reagentes

2.2.2.1. Ácido fosfórico (H 3 PO 4 ) a 85 % (ρ20 = 1,71 g/ml).

2.2.2.2. Solução de peróxido de hidrogénio a 9,1 g de H 2 O 2 /litro (3 volumes).

2.2.2.3. Reagente indicador:

vermelho de metilo .......................................................................................................................................................... 100 mg

azul de metileno ............................................................................................................................................................... 50 mg

álcool a 50 % vol ........................................................................................................................................................... 100 ml

2.2.2.4. Solução 0,01 M de hidróxido de sódio (NaOH).

2.2.3. Dosagem do dióxido de enxofre livre

2.2.3.1. P r o c e d i m e n t o

Antes da dosagem, conserva-se o vinho durante 2 dias a 20 °C, numa garrafa cheia e rolhada.

— Introduzir no borbulhador, «B», 2 ml a 3 ml de solução de peróxido de hidrogénio (ponto 2.2.2.2) e 2 gotas de reagente indicador; neutralizar esta solução com solução 0,01 M de hidróxido de sódio (ponto 2.2.2.4). Ligar o borbulhador ao dispositivo.

— No balão «A», de 250 ml, do dispositivo de arrastamento, introduzir 50 ml de amostra e 15 ml de ácido fosfórico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balão no dispositivo.

— Em seguida, borbulhar ar (ou azoto) durante 15 minutos. O dióxido de enxofre livre arrastado é oxidado a ácido sulfúrico. Retirar o borbulhador do dispositivo e titular o ácido formado com solução 0,01 M de hidróxido de sódio (ponto 2.2.2.4). Seja «n» o volume utilizado, em mililitros.

2.2.3.2. E x p r e s s ã o d o s r e s u l t a d o s

O dióxido de enxofre livre é expresso em miligramas por litro (mg/l), sem casas decimais.

2.2.3.2.1. Cálculo

Dióxido de enxofre livre, em miligramas por litro: 6,4n.

2.2.4. Dosagem de dióxido de enxofre total

2.2.4.1 P r o c e d i m e n t o

2.2.4.1.1. No caso dos mostos concentrados rectificados, diluir a amostra a analisar a 40 % (m/v), como se indica no capítulo «Acidez total», ponto 5.1.2. No balão «A», de 250 ml, do dispositivo de arrastamento, introduzir 50 ml dessa solução e 5 ml de ácido fosfórico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balão no dispositivo.

2.2.4.1.2. Vinhos e mostos

Se o teor previsível de SO 2 total da amostra for inferior ou igual a 50 mg/l, introduzir no balão «A», de 250 ml, do dispositivo de arrastamento 50 ml de amostra e 15 ml de ácido fosfórico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balão no dispositivo.

Se o teor previsível de SO 2 total da amostra for igual ou superior a 50 mg/l, introduzir no balão «A», de 100 ml, do dispositivo de arrastamento 20 ml de amostra e 5 ml de ácido fosfórico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balão no dispositivo.


Introduzir no borbulhador, «B», 2 ml a 3 ml de solução de peróxido de hidrogénio (ponto 2.2.2.2), neutralizar como anteriormente e levar o vinho contido no balão «A» à ebulição por meio de uma pequena chama, de 4 cm a 5 cm de altura, que deve tocar directamente o fundo do balão. Não colocar uma tela metálica debaixo do balão, mas pousá-lo num disco com uma abertura de 30 mm de diâmetro. Evita-se deste modo a pirogenação das matérias extraídas do vinho nas paredes do balão.

Manter a ebulição durante a passagem da corrente de ar (ou de azoto). Em 15 minutos, o dióxido de enxofre total terá sido arrastado e oxidado. Dosear o ácido sulfúrico formado com solução 0,01 M de hidróxido de sódio (ponto 2.2.2.4).

Seja «n» o volume utilizado, em mililitros.

2.2.4.2. E x p r e s s ã o d o s r e s u l t a d o s

O dióxido de enxofre total é expresso em miligramas por litro (mg/l) ou em miligramas por quilograma (mg/kg) de açúcares totais, sem casas decimais.

2.2.4.2.1. Cálculo

— Vinhos e mostos

Dióxido de enxofre total, expresso em miligramas por litro:

— Amostras com baixo teor de dióxido de enxofre (toma para ensaio de 50 ml):

6,4n

— Outras amostras (toma para ensaio de 20 ml):

16n

— Mostos concentrados rectificados:

Dióxido de enxofre, em miligramas por quilograma de açúcares totais (toma para ensaio de 50 ml de amostra preparada (ponto 2.2.4.1.1)):

1,600 × n/P

P=teor percentual (m/m) de açúcares totais.

2.2.3.4.2. Repetibilidade (r)

Teor < 50 mg/l (toma para ensaio de 50 ml): r = 1 mg/l.

Teor > 50 mg/l (toma para ensaio de 20 ml): r = 6 mg/l.

2.2.3.4.3. Reprodutibilidade (R)

Teor < 50 mg/l (toma para ensaio de 50 ml): R = 9 mg/l.

Teor > 50 mg/l (toma para ensaio de 20 ml): R = 15 mg/l.


Lista e descrição dos métodos de análise referidos no...

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