i

Agradecimentos

Professora Doutora Helena Neto Ferreira

Obrigada por ter aceitado orientar este meu percurso e pela generosidade com que

partilhou comigo os seus conhecimentos.

Doutora Fernanda Teixeira

minha amiga incondicional m uito obrigada pela disponibilidade p ermanente para

me ajudar.

Famlia

Obrigada minha querida famlia, meu suporte fsico e emocional, pai Ben, me N,

irmo Pedro, filhos Zz e Jojo, destacando-se a ajuda indispensvel e constante

do meu marido Jonas.

ii

Resumo

As Enterobacteriaceae produtoras de beta-lactamase d e espectro al argado t m si do

consideradas importantes agentes patognicos hospitalares durante as ltimas dcadas.

Hoje em dia a disseminao da resistncia na comunidade uma verdadeira ameaa,

nomeadamente em nichos especficos, como os lares para idosos. A colonizao fecal de

pessoas saudveis, pr incipalmente co m enzimas do t ipo C TX-M, um a r ealidade que

pode co mprometer o co ntrolo de infeco nos cu idados de sa de h ospitalares e na

prestao de cuidados continuados. A ssim, o r astreio d e p ortadores de

Enterobacteriaceae produtoras de beta-lactamases de espectro alargado na admisso

hospitalar de gr ande i mportncia na d eteco d e su rtos nas enfermarias,

particularmente, nas de m aior r isco. O utros genes de r esistncia s o t ambm

disseminados horizontalmente sendo a m ultirresistncia uma realidade nesses isolados.

A contribuio de animais, domsticos e selvagens, para a disseminao outra ligao

que j foi a bordada n a t ransmisso e ntre espcies de est irpes multirresistentes de

humano para animal e vice-versa. Outra contribuio para a disperso pode ser os

produtos alimentares.

A co lonizao fecal de cr ianas com Enterobacteriaceae produtoras de beta-lactamase

de espectro alargado uma realidade j relatada em Portugal que pode comprometer a

admisso peditrica hospitalar e o tratamento das infeces por estas estirpes.

Esta r ealidade deve se r t omada em co nta n a pr tica cl nica n a co munidade, co m

consequncias nos tratamentos empricos adequados, nomeadamente nas infeces do

tracto urinrio, por estas estirpes, devido limitao teraputica. Tambm na admisso

hospitalar de grupos especficos da populao deve-se ter em conta a probabilidade de

colonizao f ecal por Enterobacteriaceae produtoras de be ta-lactamase d e es pectro

alargado. Isto u m novo desafio d a s ade pblica para os m dicos, l aboratrios d e

microbiologia, hospitais e servios de sade em geral.

Palavras-chave: Resistncia aos antibiticos, beta-lactamases de espectro alargado, disseminao.

iii

Abstract

Extended-spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae have been considered

important nos ocomial pathogens during the l ast dec ades. Nowadays community

dissemination of this resistance t hreat i s a r eality namely in p articular ni ches, a s old

people ca re se ttings. F ecal co lonization of healthy p eople, m ostly with CT XM-type

enzymes, is a reality that might compromise effective infection control in acute care

hospitals and long term care facilities and in that way, extended-spectrum beta-lactamase

producing Enterobacteriaceae carriers screening on hospital admission, might be of

importance in detection of outbreak installation in particular wards. Other resistance genes

are also dispersed most of the times horizontally and multi-resistance is a reality in these

isolates. Contribution of animals, domestic and wild, for dissemination is another link that

has already been addressed showing inter-species transmission of these multiresistant

strains from human to animal and vice versa. Another contribution for dispersion might be

food products.

Fecal colonization of children with Extended-spectrum beta-lactamase producing

Enterobacteriaceae is a reality already reported in Portugal that might compromise

paediatric hospital admission and treatment of infection by these strains.

This reality should b e a ddressed i n c ommunity cl inical pr actice w ith c onsequences in

terms of adequate empirical treatment namely in urinary tract infections, by these strains,

because of restriction of active antibiotics. Also hospital admission of particular population

settings should consider the probability of Extended-spectrum beta-lactamase producing

Enterobacteriaceae fecal colonization. This is a new Public health challenge for clinicians,

microbiology laboratories, hospitals and in general the health care setting.

Keywords: Antibiotic resistance, extended-spectrum beta-lactamases, dissemination.

iv

ndice

Agradecimentos ............................................................................................................................................ i

Resumo ....................................................................................................................................................... ii

Abstract ...................................................................................................................................................... iii

ndice .......................................................................................................................................................... iv

Lista de Abreviaturas e Smbolos .................................................................................................................. v

Introduo ....................................................................................................................................................1

Contribuio do Laboratrio de Microbiologia para a deteco de Enterobacteriaceae produtoras de beta-

lactamases de espectro alargado ..................................................................................................................2

Contributos para a disseminao de resistncia ............................................................................................6

Contributo dos alimentos e da produo animal para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs ....... 15

Contributo dos animais selvagens para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs ........................... 25

Contributo dos animais de estimao para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs ...................... 30

Contributo de diversos ambientes para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs ............................ 31

Disseminao de Enterobacteriaceae produtoras de ESBL na comunidade ................................................. 35

Unidades prestadoras de cuidados de sade e hospitais, a maior origem de ESBLs .................................... 46

Rastreio na admisso Hospitalar ................................................................................................................. 51

Disseminao de Enterobacteriaceae produtoras de ESBL nas crianas ...................................................... 56

Tratamento ................................................................................................................................................ 63

Concluso .................................................................................................................................................. 78

Referncias Bibliogrficas ........................................................................................................................... 79

v

Lista de Abreviaturas e Smbolos

ACF Cuidados intensivos AmpC Beta-lactamase do tipo AmpC ATCC American Type Culture Collection bla Genes de beta-lactamase CB Bacteremia da comunidade CFU Unidades formadoras de colnias CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CM Amostras de carcaas de galinha no cozinhadas CMY Beta-lactamase do tipo CMY CRATAS Centro de Recepo, Acolhimento e Tratamento de Animais Selvagens CSF Lquido cefalorraquidiano CTX Cefotaxima CTX-M Beta-lactamase do tipo CTX-M DNA cido desoxirribonucleico E. coli-MDR Escherichia coli produtoras de ESBLs resistentes a fluoroquinolonas EGNR Bacilos entricos de gram negativo ERIC-PCR Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase ESBL Extended-spectrum beta-lactamase ESBLEC Escherichia coli produtoras de beta-lactamase de espectro alargado ESBL-KP Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBLs EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FDA Food and Drug Administration HB Bacteremia hospitalar HCF Amostras de fezes de galinhas saudveis HSF Amostras de fezes de sunos saudveis ICBAS Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar ICs Casos ndice ICU Unidade de cuidados intensivos IFs Formulas Infantis intI1 Integron Integrase intl1 intI2 Integron Integrase intl2 LTCF Instituies de cuidados de sade por tempo prolongado

LTCF-B Bacteremia de i nstituies prestadoras de cuidados de sade por t empo prolongado MBLs Metalo-beta-lactmicos MDR Enterobacteriaceae resistentes a multidrogas MIC Concentrao mnima inibitria MIC50 Concentrao mnima inibitria para 50% dos isolados MIC90 Concentrao mnima inibitria para 90% dos isolados MRSA Staphylococus aureus meticilina resistente NAG N-acetilglucosamina

vi

NAL cido nalidxico NAM cido N-acetilmurmico NICU Unidade de cuidados intensivos neonatais NIs Infeces nosocomiais OXA Beta-lactamase do tipo OXA PBPs Penicillin-binding proteins PCR Polymerase chain reaction PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism PFGE Pulsed-field gel electrophoresis QSNICH Queen Sirikit National Institute of Child Health RAPD Random amplified polymorphic DNA analysis RAPD Anlise aleatria amplificada de DNA polimrfico SHV Beta-lactamase do tipo SHV ST Tipo de sequncia TEM Beta-lactamase do tipo TEM TMP-SXZ Trimetoprim-sulfametoxazol UTI Infeco do tracto urinrio L Litro mg Miligrama mL Mililitro g Micrograma

1

Introduo

A resistncia bacteriana aos antibiticos uma realidade preocupante nos ltimos

tempos, particularmente em relao a determinados agentes patognicos como so as

Enterobactericaeae produtoras de beta-lactamases de espectro alargado. A realidade da

disseminao d esta ameaa de Sade P blica t em vi ndo a m erecer a a teno da

comunidade cientfica internacional de forma a conhecer a r ealidade da sua disperso.

Neste sentido, foi objectivo deste trabalho a recolha da informao internacional

publicada recentemente que possa contribuir para a explicitao das vrias contribuies

para a disseminao comunitria deste t ipo de isolados, quer provocando infeco quer

colonizando a populao.

2

Contribuio do Laboratrio de Microbiologia para a deteco de Enterobacteriaceae produtoras de beta-lactamases de espectro alargado

No L aboratrio de M icrobiologia s o processados vrios pr odutos, bi olgicos,

alimentares e de outras origens, para identificar e determinar o perfil de susceptibilidade

aos a ntibiticos d o(s) a gente(s) patognico(s) i solados. D os est udos m icrobiolgicos

pretende-se que os resultados obtidos in vitro sejam o mais prximo possvel do que se

passa in vivo, n o es quecendo q ue falta a i nteraco d o m icrorganismo co m o

hospedeiro que muito complexa e est longe de ser completamente compreendida e

no pos svel ser simulada laboratorialmente. O que se sabe q ue a i nteraco entre

estas duas entidades vivas desempenha um importante papel na prtica do diagnstico

microbiolgico e no controlo de doenas infecciosas. O Laboratrio de Microbiologia

fornece dados sobre resistncias as quais s vezes no so as esperadas. Os resultados

obtidos permitem aos clnicos a seleco da teraputica mais adequada ao tratamento,

substituindo os agentes de largo espectro e de alto custo, por vezes seleccionados

empiricamente, qu e t m co nsequncias indesejveis quando us ados por p erodos de

tempo prolongados. A relao das bactrias com o hospedeiro no de agr esso, mas

sim de sobrevivncia e reproduo e alguns conceitos devero ser clarificados. Um

microrganismo comensal o que vive no/ou com outro organismo no qual tem benefcio

sem causar dano. A colonizao a presena contnua de bactrias durante um perodo

de tempo, sem agresso nem invaso dos tecidos; infeco controlada, hospedeiro e

microrganismo desenvolvem uma relao de comensalismo. A infeco provocada por

qualquer microrganismo que causa doena; a maioria dos agentes deriva da prpria flora

comensal e /ou co lonizante, h avendo m ultiplicao, i nvaso e persistncia do s

microrganismos no hospedeiro podendo conduzir a si tuao de doena do hospedeiro

(Murray et al., 2003).

Os bacilos entricos de gram negativo compreendem um grande nmero e gnero

de bac trias muito semelhantes quanto ao seu habitat, estrutura e biologia mas que

diferem su bstancialmente q uanto su a vi rulncia, qu adros de doena qu e ca usam e

perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. A necessidade de uma identificao

correcta das estirpes isoladas pois fundamental para avaliar o prognstico da doena e

orientar a t eraputica. A s semelhanas entre o s diversos bacilos entricos tm co mo

consequncia a quase i nexistncia de ca racteres exclusivos d e gr upo ( marcadores)

obrigando portanto necessidade de recorrer ao estudo de um grande nmero de

caracteres bioqumicos e outros para a sua caracterizao. Os bacilos de gram negativo

3

entricos partilham um grande nmero de caractersticas: so bacilos de gram negativo

no esporulados, cu jo habitat o i ntestino, pouco exigentes nutricionalmente, i sto ,

crescem em m eios simples. D entro d os bacilos ent ricos a famlia E nterobacteriacea

compreende importantes bactrias patognicas, patognicas oportunistas e comensais

distingue-se dos outros grupos por algumas caractersticas fundamentais:

-metabolismo energtico fermentativo;

-a maior parte so anaerbios facultativos crescendo em aerobiose e anaerobiose e

fermentam a glicose com ou sem a produo de gs;

-possibilidade de utilizao dos nitratos como aceitadores finais de electres na

cadeia respiratria reduzindo-os a nitritos ou azoto molecular;

-ausncia de citocromo oxidase (reaco de pesquisa das oxdases negativa);

-quando so mveis possuem flagelos pertricos (Texto de Apoio s Aulas Tericas

de Microbiologia Mdica do ICBAS, 1993/ 1994).

O t ratamento das i nfeces b acterianas c ada ve z m ais complicado p orque as

bactrias desenvolvem r esistncia aos a gentes a ntimicrobianos. E stes so

frequentemente cl assificados de acordo com o se u m ecanismo de aco pr incipal. O s

principais mecanismos de resistncia aos antimicrobianos so:

- interferncia com a sntese da parede celular (betalactmicos e glicopeptdeos);

- inibio da sntese proteica (macrlidos e tetraciclinas);

- interferncia com a sntese dos cidos nucleicos (fluoroquinolonas e rifampicina);

- inibio de uma via metablica (trimetoprim-sulfametoxazol);

- desorganizao da estrutura da membrana citoplasmtica (polimixinas e

daptomicina) (Tenover et al., 2006).

4

Os antibiticos beta-lactmicos tm uma utilizao teraputica generalizada dada a

sua fraca toxicidade, caractersticas farmacocinticas e actividade antimicrobiana. Sendo

dos agentes antimicrobianos mais usados em todo o mundo, no de estranhar que, nas

ltimas dcadas aps a i ntroduo de antibiticos de l argo espectro antibacteriano, se

tenha observado r esistncia a c efalosporinas de t erceira e q uarta g erao,

monobactamos e carbapenemos, o que constitui actualmente, e para futuro, um enorme

problema. A s ce falosporinas p odem di vidir-se em geraes de ac ordo c om o s eu

desenvolvimento no tempo e de espectro de aco, fruto da necessidade de ultrapassar a

resistncia que foi surgindo ao longo do tempo devido evoluo das beta-lactamases.

Assim, medida que se alarga o espectro de aco contra bacilos gram negativo, perde-

se actividade contra bactrias gram positivo. Alguns exemplos de cefalosporinas:

- 1 gerao: cefadroxil, cefalexina, cefatrizina, cefradina

- 2 gerao: cefaclor, cefeprozil, cefonicida, cefoxitina (cefamicina), cefuroxima

- 3 gerao: cefixima, cefodizima, cefotaxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftriaxona

- 4 gerao: cefepime, cefpiroma

Os antibiticos beta-lactmicos englobam quatro grandes grupos: as penicilinas, as

cefalosporinas, os m onobactamos e os carbapenemos. T odos t m em co mum o anel

beta-lactmico. Os radicais alteram o espectro de aco, a resistncia ao suco gstrico

(via oral ou parenteral) e a farmacocintica. Os antibiticos beta-lactmicos tm como

alvo de aco a parede celular bacteriana. A parede bacteriana envolve a c lula, dando

corpo ao m icrorganismo, e l ocaliza-se e xternamente m embrana ci toplasmtica. N as

bactrias de gram positivo esta parede constituda por uma camada grossa de

peptidoglicano. Nas bactrias de gram negativo esta ca mada mais fina e com uma

membrana externa. Esta membrana apresenta canais formados por protenas, qu e se

denominam porinas, e por onde entram os compostos hidroflicos, como os antibiticos

beta-lactmicos. No caso de bactrias de gram positivo a barreira da membrana externa

lipoflica n o se co loca. O p eptidoglicano um a m olcula qu e s exi ste n as clulas

bacterianas. constitudo por unidades repetidas de N-acetilglucosamina (NAG) e cido

N-acetilmurmico (NAM), a que est ligada uma cadeia de aminocidos. Um aminocido

liga-se com o outro da cadeia adjacente, formando uma rede que envolve a bactria. As

enzimas que catalisam este cross-linking so denominadas penicillin-binding proteins

(PBPs), e so elas o alvo especfico dos beta-lactmicos. A inactivao das PBPs leva

5

inibio da sntese do peptidoglicano, induzindo a lise celular, por isso os beta-lactmicos

so considerados bacterioltico (http://www.farbeira.pt/Portals/farbeira/documentos/Artigo

%20Plural%20 GJ%20Silva%20Resist%C3%AAncia.pdf).

6

Contributos para a disseminao de resistncia

Os genes de r esistncia a dquirida podem tornar a bactria ca paz d e pr oduzir

enzimas que destroem o frmaco antibacteriano, capaz de expressar sistemas de efluxo

que evitam que o frmaco alcance o alvo, capaz de modificar o alvo de aco do frmaco

ou produzir um caminho metablico alternativo que contorna a sua aco. A resistncia

bacteriana a ant ibiticos beta-lactmicos pode dever-se a t rs m ecanismos principais:

impermeabilidade, pr oduo de b eta-lactamases e al terao d o l ocal d e ac o. A

resistncia a os antibiticos beta-lactmicos nos bacilos de gr am n egativo

maioritariamente m ediada p or b eta-lactamases. E stas inactivam os agentes

antimicrobianos por hidrlise do anel beta-lactmico. As carboxipeptidases so enzimas

elaboradas por um grande nmero de microrganismos, particularmente bactrias, e tm

como m isso r omper, d e forma t ransitria, a prpria p arede bacteriana para permitir

intercalar blocos de murena necessrios para o crescimento e multiplicao. Por outro

lado exi stem gr andes analogias entre as beta-lactamases e as protenas fixadoras de

penicilinas (PBPs) o que sugere a existncia de uma or igem comum. Foram descritas,

at data, centenas de be ta-lactamases diferentes. A s mais importantes so as

cefalosporinases plasmdicas e as ESBLs - extended-spectrum beta-lactamases (Forbes

et al., 2007).

As beta-lactamases de espectro alargado (ESBLs) so classificadas geralmente de

acordo co m d ois esquemas: a cl assificao m olecular (estrutural) de A mbler e a

classificao funcional d e B ush-Jacoby-Medeiros. O esquema de Ambler divide as

ESBLs em quatro classes, de A a D. Esta classificao baseia-se na homologia proteica

e no nas caractersticas fenotpicas. Na classificao de Ambler, as beta-lactamases da

classe A, C , e D so beta-lactamases de se rina. A s beta-lactamases de cl asse B so

metalo-enzimas. A classificao de B ush-Jacoby-Medeiros d e acordo co m a

semelhana funcional ( substrato e perfil i nibidor); este esquema de m aior r elevncia

para os mdicos ou microbiologistas no diagnstico laboratorial porque so considerados

relevantes clinicamente os inibidores de b eta-lactamases e os substratos beta-

lactmicos. No h consenso na d efinio das ESBLs. A comummente usada q ue as

ESBLs so b eta-lactamases capazes de c onferir r esistncia s penicilinas e s

cefalosporinas de pr imeira, segunda e terceira gerao, e ao aztreonamo (mas no s

cefamicinas ou aos carbapenemos) por hidrlise destes antibiticos, e so inibidas pelo

cido clavulnico, isto , degradam os oxiimino-beta-lactmicos e so inibidas pelo cido

clavulnico. E sta pr opriedade di ferencia as ESBLs das beta-lactamases tipo A mpC

7

(grupo 1) produzidas p or or ganismos tais como Enterobacter cloacae em q ue as

cefalosporinas de terceira gerao so o seu substrato mas no so inibidas pelo cido

clavulnico. As cefalosporinas de quarta gerao, por exemplo o cefepime, so usadas

no tratamento contra organismos produtores de beta-lactamases AmpC, mas so menos

usadas no tratamento de organismos produtores de ESBLs pois podem ser degradadas

pelas ESBLs. E xistem v rios tipos de E SBLs: SHV, T EM, C TX-M, O XA e out ras. A s

ESBLs do t ipo SHV ( varivel s ulfidril), hi drolisam m elhor a c efotaxima do q ue a

ceftzidima. As primeiras beta-lactamases t ipo TEM (doente grego chamado Temoniera)

no so ESBLs, como por exemplo as TEM-1, TEM-2, e TEM-13, mas uma mutante, a

TEM-3, uma ESBL porque tem actividade sobre a cefotaxima. As ESBLs tipo CTX-M

tm uma potente act ividade h idroltica s obre a ce fotaxima e al ta eficincia hidroltica

sobre o cefepime sendo actualmente as mais espalhadas mundialmente. O tazobactamo

tem um a act ividade inibidora so bre est as enzimas dez vezes maior do qu e o ci do

clavulnico. A s ESBLs tipo OXA hidrolisam a o xacilina; as primeiras no eram E SBLs

mas apareceram m utantes como as OXA-11, -14, -16 em q ue el as tm um a forte

resistncia cefotaxima e, s vezes, ceftazidima e ao aztreonamo (Paterson and

Bonomo, 2005).

A a ctual v erso da cl assificao das b eta-lactamases atingiu um alto nvel de

complexidade, t ornando-se menos ac essvel aos mdicos, pr ofissionais do controlo de

infeco e da gesto hospitalar. Do ponto de vista clnico, uma reviso do esquema de

nomenclatura torna-se necessria. A designao beta-lactamases de espectro alargado

atingiu um pblico mais amplo ao longo do tempo, mas actualmente est restrita classe

2be funcional /classe A molecular, enzimas inibidas pelo cido clavulnico com actividade

contra as cefalosporinas de espectro alargado. Uma nova classificao proposta amplia a

definio de ESBL para outras beta-lactamases importantes adquiridas clinicamente com

actividade contra cefalosporinas de espectro alargado e /ou ca rbapenemos. A classe A

clssica de E SBLs foi d esignada n esta classificao por ESBLA, enquanto as ESBLs

OXA e Amp C mediadas por pl asmdeos so classificadas como ESBLs miscelnea

(ESBLM). P or l timo, as carbapenemases foram designadas por E SBLCARBA, a s E SBLs

com actividade hidroltica contra os carbapenemos. Esta classificao simplificada pode

incentivar novos grupos de profissionais de sade a participarem no esforo para impedir

a propagao de beta-lactamases adquiridas. O nmero crescente de beta-lactamases

altamente eficientes desafia t odos os profissionais de sa de d e v rias m aneiras. Os

problemas decorrentes da complexidade da actual terminologia cientfica poderia ter uma

8

soluo relativamente simples atravs do estabelecimento de uma terminologia de beta-

lactamases simplificada para u so cl nico e co ntrolo de i nfeco. N a v erdade, est a foi

recentemente sugerida por Livermore, que lanou uma ampla definio de ESBL, em que

se deve mencionar sempre a famlia da enzima, por exemplo TEM-ESBL ou OXA-ESBL.

Embora est a s eja um a es tratgia a dequada para as publicaes ci entficas, e sta

abordagem ainda exige que os grupos de diversos profissionais de sade necessitem de

se r elacionar co m os nomes de um gr ande nmero de famlias de enzimas. D eve se r

considerado q ue a r esposta d o c ontrolo d e i nfeco se r se melhante,

independentemente do t ipo de bet a-lactamase. A ssim, poderia ar gumentar-se qu e,

mesmo c om t ermos mais simplificados n ecessria uma definio m ais alargada d e

ESBL. Parece ser prudente preservar a designao ESBL uma vez que j muito

utilizada. Um certo nvel de discriminao seria necessrio na nova classificao de beta-

lactamases. Para a maioria das classes de ESBL, falta um consenso internacional sobre

os testes fenotpicos e genotpicos apropriados e deve ser uma tarefa prioritria nacional

e i nternacional qu e as comisses de m etodologia t rabalhem em cr iar or ientaes. A s

opes de tratamento de isolados que tm vrias categorias de beta-lactamases com

beta-lactmicos, podem variar substancialmente entre as diferentes variantes de enzimas

em cada um dos grupos. Geralmente, isolados que tm ESBLA e ESBLM so resistentes

maioria dos beta-lactmicos, exc epto aos carbapenemos, e nquanto i solados co m

ESBLCARBA em muitos casos, so resistentes a todos os beta-lactmicos. No entanto, h

uma srie de excepes a esta regra geral, e os autores acreditam que a seleco da

terapia no deve ser determinada pela enzima ESBL detectada, mas sim pelo resultado

dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos. Possivelmente, o agrupamento de beta-

lactamases num esquema de classificao si mplificada pode excl uir diferenas

importantes entre as vrias categorias das enzimas dentro dos grupos. Contudo, esta

proposta dum esquema pragmtico no se destina a substituir a classificao actual,

mas sim a co mplement-la para o benefcio dos profissionais de sade que no esto

directamente env olvidos na pesquisa das beta-lactamases. O esq uema seria um a

poderosa ferramenta para os profissionais do controlo de infeco e para os cientistas da

sade pblica, visando determinar o impacto clnico e econmico de transmisso das

beta-lactamases. P ara os clnicos de d oenas infecciosas, a cl assificao po deria

fornecer uma estrutura para melhorar a compreenso das inter-relaes entre as beta-

lactamases clinicamente i mportantes co m o g rande i mpacto das terapias empricas e

rotinas de t ratamento, que no devem se r co mbatidas s pelo pessoal do co ntrolo de

9

infeco. Acredita-se que a nova classificao incentivar novos grupos, a f im de tentar

evitar maior disseminao destes determinantes de resistncia (Giske et al., 2009).

No final de 2 009, o n mero d e s equncias pr oteicas exclusivas para b eta-

lactamases excedeu 890. Assim, importante ser estabelecido um processo sistemtico

para m onitorizar estas enzimas. A cl assificao d as beta-lactamases tem si do

tradicionalmente baseada tanto nas caractersticas funcionais das enzimas como na sua

estrutura primria. A forma mais simples de classificao por sequncia proteica, em

que as beta-lactamases so classificadas em quatro classes moleculares, A, B, C e D,

com base na conservao e na distino dos aminocidos. As classes A, C e D incluem

enzimas que hi drolisam os substratos, formando um a enzima aci l a travs da se rina,

enquanto as beta-lactamases da classe B so metalo-enzimas que utilizam pelo menos

um io de zinco para facilitar a hi drlise de beta-lactmicos. E mbora um a abordagem

estrutural se ja a m ais fcil e m enos controversa d e cl assificar est a di versidade de

enzimas, um a classificao funcional permite relacionar es ta variedade de enzimas n o

seu papel clnico, ou seja, proporcionando resistncia selectiva para diferentes classes de

antibiticos beta-lactmicos. Os grupos funcionais, podem ser mais subjectivos do que as

classes est ruturais, m as auxiliam o m dico e o m icrobiologista n a relao das

propriedades duma enzima especfica com o perfil de resistncia observado num isolado

clnico. Historicamente, a funcionalidade tem sido o elemento essencial na definio do

papel de uma beta-lactamase em particular em ambientes clnicos. Assim, parece

adequado c ontinuar a a grupar es tas diferentes enzimas de a cordo c om as suas

propriedades hidrolticas e de inibio. Idealmente, uma relao forte estrutura - funo

deve ser observada entre os diversos grupos de beta-lactamases. O resultado ideal seria

um esq uema d e ca tegorizao que co loca t odas as beta-lactamases numa grelha de

classificao nica e al inha a estrutura e funo. E ste t ipo d e r elacionamento es t a

comear a ser realizado com os metalo-beta-lactmicos. No entanto, no momento actual,

muitas beta-lactamases so descritas apenas com base numa sequncia de protenas,

com pouco da descrio funcional. Portanto, um conjunto de critrios foi proposto para a

descrio de uma nova beta-lactamase, incluindo as informaes estruturais e funcionais.

As razes para a diversidade das beta-lactamases so muitas. Pelo menos as variedades

baseadas na serina so enzimas antigas, estimando-se que vm evoluindo h mais de 2

bilhes de a nos a partir d o m omento an terior se parao das bactrias em gram

negativo e gram positivo. E las so encontradas em bac trias que vi vem numa grande

variedade de ambientes e, portanto, esto sujeitas a diferentes presses selectivas.

10

Estas enzimas esto b em est udadas uma ve z que t m at rado a ateno d e m uitos

investigadores desde q ue foram des critas h 7 0 an os. S o e nzimas adaptveis que

evoluram para e vitarem os co mpostos i nibidores e destinam-se ao at aque d os

antibiticos beta-lactmicos concebidos para resistir su a aco. Finalmente, os genes

bla tm lucrado com os diversos mecanismos de transferncia horizontal de genes entre

as bactrias que se espalharam p ara novos hos pedeiros e t ornaram-se par te de

plasmdeos multirresistentes hoje co muns em i solados clnicos resultantes da

disseminao promscua. Tendo em conta estes factores, uma previso segura que

as beta-lactamases continuaro a evoluir, assim como os sistemas de classificao para

a sua descrio (Bush and Jacoby, 2010).

Algumas bactrias so n aturalmente r esistentes a alguns antibiticos, m as a

resistncia bacteriana nor malmente associada resistncia adquirida pelas bactrias.

Esta pode se r a dquirida atravs de m utaes que o correm n uma b aixa frequncia.

Contudo, se a mutao for favorvel sobrevivncia da bactria, aquela manter-se- nas

geraes seguintes. Este tipo de resistncia adquirida ocorre, por exemplo, no bacilo da

tuberculose. No entanto, a forma mais comum de adquirir resistncia aos antibacterianos

atravs da aquisio de DNA exgeno, a que se chama transferncia horizontal de

genes referida por Bush and Jacoby. Os mecanismos so: i ) a t ransformao, em que

bactria adquire D NA d o m eio-ambiente; i i) a transduo, em q ue fagos (vrus que

infectam bactrias) ao recombinar o seu material gentico com o DNA bacteriano

adquirem ge nes de resistncia bac terianos, t ransportando-os no seu genoma e

transferindo-os para outras bactrias quando as infectam; iii) a conjugao, transferncia

de pl asmdeos entre estirpes ou espcies bacterianas diferentes. Estes so pequenas

molculas de DNA, no pertencentes ao cromossoma, com replicao autnoma, que

podem conter vrios genes de resistncia aos antibiticos e de factores de virulncia. Os

plasmdeos so co nsiderados elementos genticos mveis, q ue p or su a v ez podem

integrar outros elementos mveis como integres e/ou transposes contendo genes de

resistncia. Estes podem existir tambm no cromossoma. Com estes elementos

possvel que genes contidos em plasmdeos possam saltar para o cromossoma, e ser

definitivamente i ntegrados no D NA cr omossmico b acteriano, e vice-versa, alm d e

terem a capacidade de integrar novos genes de resistncia. A mobilidade gentica um

assunto c omplexo, m as deveras interessante par a se c ompreender co mo f eita a

seleco de diversos genes. Estes elementos genticos mveis contm nor malmente

genes que codificam a resistncia a diversos grupos de antimicrobianos. Este facto pode

11

significar que a restrio do uso de um dado antimicrobiano nem sempre leva

erradicao da estirpe resistente, se no mesmo elemento mvel existirem outros genes

de r esistncia a o utras classes de a ntibiticos. P or exe mplo, os integres integram

frequentemente genes de resistncia a diversos grupos de beta-lactmicos e de

aminoglicosdeos. Os genes de resistncia aos antibiticos beta-lactmicos encontram-se

em todos estes elementos genticos mveis, o que permite explicar o elevado aumento

da resistncia a estes antibiticos e disseminao por variadas espcies bacterianas ao

longo dos anos. (http://www.farbeira.pt/Portals/farbeira/documentos/Artigo%20Plural%20

GJ%20Silva%20Resist%C3%AAncia.pdf)

Os plasmdeos so el ementos g enticos ca pazes de r eplicao autnoma, q ue

podem c odificar funes m uito di ferentes, l ocalizados n o ci toplasma bacteriano,

constitudo por DNA, de tamanho muito varivel. A maioria dos plasmdeos transferida

por conjugao (pelo contacto atravs do pili sexual ou ponte de unio entre a bactria

dadora e a receptora). Com o objectivo da clula dadora no perder o plasmdeo, este

duplica-se antes do fenmeno de conjugao, ficando as duas bactrias portadoras do

plasmdeo. A lgumas bactrias possuem p equenos plasmdeos capazes de s erem

transferidos por fagos (transduo). G eralmente co dificam b eta-lactamases i ndutveis.

Tambm est descrita a exi stncia de plasmdeos de maior t amanho que codificam a

sntese de be ta-lactamases e a resistncia a outros antibiticos. Uma bactria pode ter

mais de um pl asmdeo se mpre q ue e stes per tenam a di ferentes grupos de

compatibilidade, visto que, ao competirem pela mesma funo bioqumica um deles ter

que ser segregado. Os transposes so tambm determinantes de resistncia bacteriana

aos antibiticos. O material gentico (DNA) que codifica estas propriedades capaz de

saltar de um plasmdeo para outro plasmdeo, de um plasmdeo para o cromossoma ou

do plasmdeo para um bacterifago. A sua replicao no precisa de homologia entre a

clula dadora e receptora. O transposo no s cria o seu prprio lugar de insero como

o seu desprendimento de um material gentico e p osterior ligao a o utro que est

seguramente catalisado por enzimas codificadas pelo prprio transposo. Ao contrrio da

resistncia bacteriana a antibiticos adquirida por mutao, que pontual e dificilmente

transfervel, a resistncia adquirida por um plasmdeo ou transposo pode ser mltipla a

vrios antibiticos e transfervel, fundamentalmente por conjugao, a outras bactrias

da mesma ou de diferente espcie. A resistncia cromossmica, no transfervel, s se

expressar m ediante pr esso se lectiva d o an tibitico que, ao eliminar as clulas

sensveis, pe em evidncia a populao resistente. Genes de resistncia a antibiticos,

12

antes associados a plasmdeos ou cromossomas, em forma no transfervel, podem unir-

se a um pl asmdeo t ransfervel. I gualmente, um d eterminante de r esistncia

transposvel pode ser unido a um genoma de bacterifago e dispersar-se desta forma

(Forbes et al., 2007).

A E. coli, um m embro da F amlia Enterobacteriaceae, um habitante comum do

intestino dos humanos e a nimais. o m ais comum d os bacilos de gr am negativo

causadores de i nfeces nosocomiais e ad quiridas na co munidade. A di fuso d a

resistncia a os antibiticos tem si do r econhecida em i solados de E. coli de origem

humana, animal e ambiental. Embora a t axa de pr evalncia de est irpes de E. coli

resistentes seja significativamente distinta em vrias populaes e ambientes, o impacto

da resistncia aos antimicrobianos uma realidade (von Baum and Marre, 2005).

O microrganismo resistente o que adquire resistncia a antibiticos aos quais era

anteriormente sensvel. A heterogeneidade da expresso da resistncia causa problemas

na deteco de estirpes resistentes e dificulta a execuo da teraputica adequada. Cada

antibitico ca racterizado p or um espectro n atural d e actividade a ntibacteriana. E ste

espectro co mpreende as espcies bacterianas que, no es tado n ativo, t m o se u

crescimento inibido por concentraes de antibiticos susceptveis de serem atingidas in

vivo (naturalmente sensveis). A resistncia natural um carcter constante de todas as

estirpes de uma mesma espcie bacteriana que permite prever a inactividade e ajudar a

identificao. A resistncia adquirida uma caracterstica prpria de certas estirpes, no

seio de um a espcie b acteriana s ensvel, cu jo pa trimnio g entico foi alterado pe la

mudana ou aq uisio de um gene. Contrariamente s resistncias naturais, so

evolutivas e a sua frequncia , por vezes, dependente da utilizao dos antibiticos. A

concentrao m nima inibitria ( MIC) de um agente antimicrobiano t raduzida como a

menor co ncentrao do a gente qu e i nibe o c rescimento do organismo ( visual e /ou

automtico). O conhecimento da MIC do agente antimicrobiano, a via de administrao e

os nveis clinicamente atingveis do agente antimicrobiano no local da infeco permitem

a classificao do organismo como susceptvel (S), intermedirio (I) ou resistente (R) ao

agente microbiano em questo (Brochura Tcnica do Sistema ATB).

A aquisio de novo material gentico pelas bactrias sensveis aos antibiticos a

partir das estirpes bacterianas resistentes, pode ocorrer por conjugao, transformao,

ou t ransduo, co m t ransposes ou pl asmdeos que frequentemente facilitam a

incorporao de genes de resistncia mltipla no genoma. O uso de agentes

13

antimicrobianos cria presso selectiva para o aparecimento de estirpes resistentes. O s

nveis de r esistncia s o n ormalmente altos para penicilinas de l argo es pectro e

trimetoprim, e baixos para cefalosporinas de 3 gerao e nitrofurantona. O

aparecimento de resistncia s fluoroquinolonas e a pr oduo d e beta-lactamases de

espectro alargado ( ESBL) p or est irpes de E. coli multirresistentes tem l evado ao

aumento, na l tima dcada, de l imitaes de opes teraputicas. Um dos factores de

risco predominantes para a disseminao dos genes e bactrias resistentes a presso

selectiva d e a ntibiticos por uso ( abuso) d e ant ibiticos nos humanos, a nimais,

alimentao e agricultura. A maioria dos antibiticos usados na clnica consumida fora

do hospital o que levou a um impacto substancial no desenvolvimento da resistncia nos

patognicos bacterianos. A grande utilizao de antimicrobianos na medicina veterinria

e como promotores de crescimento animal (actualmente banida) originou o aparecimento

de estirpes resistentes a antibiticos na microflora endgena dos animais. A populao

humana pode ter ficado colonizada e/ou infectada via contacto, exposio ocupacional ou

pela cadeia al imentar, adquirindo os genes de resistncia da flora bacteriana residente

nos animais. A bactria pode ser intrinsecamente resistente a uma ou mais classes de

agentes antimicrobianos, ou pode adquirir resistncia por nova mutao ou por aquisio

de genes de resistncia de outros organismos (Tenover, 2006).

A epi demiologia a ci ncia q ue es tuda, qu antitativamente, a di stribuio d os

fenmenos sade/doena e os factores condicionantes nas populaes humanas. O

conhecimento actualizado dos padres epidemiolgicos fundamental, possibilitando

ajustar as intervenes de preveno/diagnstico a subgrupos populacionais de maior

risco.

A presso selectiva refere-se a condies ambientais, incluindo no apenas o uso

de antibiticos mas tambm a qualquer outro factor ambiental tal como, a forma como os

pacientes esto relacionados por caractersticas epidemiolgicas, outras drogas usadas,

ou poluentes ambientais (Baquero et al., 1998). um co nceito geral que s e r efere a

muitos factores e q ue cr ia um p anorama ambiental p ermitindo, a os organismos com

mutaes novas ou ca ractersticas recentemente adquiridas, so breviverem e

proliferarem. A pr esso selectiva por ant ibiticos o pr incipal f actor para ex plicar o

aumento da resistncia. A prevalncia actual da resistncia deve ser monitorizada

continuadamente cada ano. O impacto da resistncia a um antibitico e o seu mecanismo

especfico, i ncluindo a transmisso, d eve ser est udado c uidadosamente. T ais

14

informaes podem ajudar na orientao das estratgias a seguir para maximizar o

sucesso teraputico e minimizar o aparecimento de resistncia (Siu, 2002).

A resistncia embora classicamente atribuda a mutaes cromossmicas, est

mais associada a elementos extracromossmicos adquiridos de o utra bactria do

ambiente. Estes incluem diferentes tipos de s egmentos mveis de DNA, tais como os

plasmdeos, os transposes e os integres. C ontudo o s mecanismos intrnsecos

normalmente no especificados por elementos mveis tais como as bombas de efluxo

que expulsam vrios tipos de antibiticos, so agora reconhecidos como dos principais

contribuidores para a multiresistncia bacteriana. Uma vez estabelecida, os organismos

resistentes a multidrogas persistem e espalham-se pelo mundo, causando falhas clnicas

no tratamento de infeces e crises de sade pblica (Alekshun and Levy, 2007).

A diferenciao entre enzimas mediadas por plasmdeos e cromossomas pode ser

difcil devido possibilidade de translocao de genes entre plasmdeos e cromossomas.

A importncia epidemiolgica da r esistncia cromossmica e pl asmdica , sem dvida,

muito di ferente se ndo a pl asmdica a que o rigina m aior di fuso das resistncias

bacterianas o que d l ugar a numerosos surtos epidmicos por bac trias resistentes

(Forbes et al., 2007).

A t ransferncia horizontal p arece s er o m ecanismo pr incipal para a dquirir

resistncia aos antibiticos. Os antibiticos alm de se lectores da resistncia bacteriana

so t ambm pr omotores da r esistncia. A aplicao d e n ovas tecnologias levou a o

desenvolvimento de novos antibiticos. Contudo a ca pacidade destas novas molculas

para originar resistncia nos microrganismos tem sido largamente ignorada. Talvez seja

tempo d e i ncluir um novo p asso n o d esenvolvimento e est udo das propriedades dos

novos antibiticos: a s ua capacidade de produzir resistncia. Este estudo deve ser feito

usando todo o conhecimento di sponvel so bre a f isiologia e ge ntica bac terianas. Os

novos antibiticos devem se r avaliados pela su a ca pacidade de s eleccionar va riantes

mutantes, de a umentar as taxas de m utao, e de pr omover t rocas genticas. A s

molculas devem se r estruturalmente m odificadas para r eduzir, s e possvel, estas

capacidades sem di minuir as propriedades antimicrobianas. F inalmente, usando os

conhecimentos mais actualizados sobre as bases genticas da mutao e recombinao

e do seu papel na aquisio da resistncia aos antibiticos, pode-se ento tirar partido

das estratgias que as bactrias utilizam para ultrapassar a aco dos antibiticos, para

melhorar os frmacos anti-infecciosos (Blzquez et al., 2002).

15

Contributo dos alimentos e da produo animal para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs

A resistncia aos antibiticos um problema importante de sade pblica a qual

acaba num surto causado por bactrias patognicas que no se eliminam por antibiticos

conhecidos. A maioria dos genes que confere resistncia adquirida horizontalmente das

bactrias comensais ou d as bactrias ambientais. A co ntaminao al imentar p or

bactrias resistentes pode se r uma fonte significativa de genes de r esistncia para as

bactrias humanas mas no tem sido r igorosamente ava liada, nem co nhecido se h

diferenas entre pr odutos bi olgicos e os de pr oduo c onvencional. N um es tudo em

trezentos e noventa e nove produtos verificou-se que, independentemente do modo de

produo, os vegetais e frutos crus estavam muito contaminados por bactrias de gram

negativo r esistentes a m ltiplos antibiticos. A m aior par te d estas bactrias so

originrias do solo e do ambiente. Este estudo focou-se em bactrias de gram negativo

resistentes a c efalosporinas de t erceira g erao, q ue ca usam um gr ande i mpacto na

sade humana. Entre elas, existem raras espcies potencialmente patognicas para

hospedeiros imunocompremetidos. Dos produtos testados, treze por cento tinham

bactrias produtoras de beta-lactamases de espectro alargado, todas identificadas como

Rahnella spp agrupadas em dois filotipos e todas portadoras do gene bla(RAHN). Deste

modo, vegetais e frutos de produo biolgica ou convencional constituem uma fonte de

bactrias resistentes e de genes de resistncia (Ruimy et al., 2009).

Os alimentos de produo animal so os principais reservatrios de patognicos

zoonticos, e a deteco de produtores de ESBL em estirpes de E. coli e Salmonella tem

aumentado nos ltimos anos. A s ESBLs so ext ensamente de tectadas em v rias

instituies de sade mas no so assim to f requentes na populao bacteriana dos

animais, podendo indicar que estas enzimas so menos prevalentes nos animais que nos

humanos, mas tambm no tm sido to procuradas. O aumento da ocorrncia de

produtores de E SBLs nos animais tem-se destacado e di scutido d evido ci rculao

destes factores de resistncia entre os patognicos humanos (Carattoli, 2008).

Durante a monitorizao de amostras de leite no pasteurizado de vacas saudveis

para a pr esena de bac trias resistentes aos antibiticos, um isolado de Klebsiella

pneumoniae era resistente s oxiimino-cefalosporinas e aztreonamo. Descobriu-se uma

beta-lactamase de espectro alargado, codificada cromossomicamente, que f oi descrita

16

anteriormente, chamada SHV-60. de esperar que esta estirpe se dissemine entre

animais de produo alimentar e assim constitua um reservatrio desta estirpe resistente

e que o gene de resistncia possa ser transferido causando problemas para o tratamento

dos humanos. Este estudo confirma a hiptese de que alguns dos novos antibiticos a

que as bactrias zoonticas patognicas so r esistentes apareceram em a nimais

destinados alimentao e foram referenciados pela primeira vez no Japo. Colonizao

das tetas de v acas saudveis com patognicos zo onticos resistentes a m ulti-drogas

durante a lactao ou perodos de seca um dos maiores perigos afectando no s a

indstria leiteira mas tambm a sade pblica. Recentemente, populaes de pases em

desenvolvimento foram mal informados atravs de sesses em muitos sites na internet

que di ziam q ue o l eite em br uto m ais nutritivo e t em m elhor s abor q ue o l eite

pasteurizado. Fez-se um estudo para monitorizar bactrias resistentes a multi-drogas no

leite em bruto d e v acas saudveis da C alifrnia t endo em c onta q ue no r eceberam

nenhum a ntibitico n a comida e que no foram tratadas com antibiticos pelo menos

durante trs meses. s estirpes identificadas foram feitos testes de susceptibilidade aos

antibiticos pelos mtodos de difuso em disco e determinao da MIC, de acordo com

as guidelines de 2005, do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A estirpe

identificada como Klebsiella pneumoniae, KPHUF-100, t em um fentipo pouco comum,

sugerindo a presena d e um a b eta-lactamase de esp ectro al argado qu e degrada as

oxiimino-cefalosporinas e aztreonamo. A determinao da MIC na presena de uma

concentrao fixa de cido clavulnico, 4g/mL, confirma que este isolado uma

produtora de ESBL e excluiu a possibilidade da resistncia ser devida presena de uma

beta-lactamase do tipo AmpC ou a efeitos de permeabilidade resultantes de alteraes

nas p orinas d a m embrana ext erna. A Klebsiella pneumoniae est e ntre os b acilos de

gram negativo mais encontrados pelos mdicos em todo mundo e tem sido considerada

patognica pulmonar desde que foi descoberta h mais de 100 anos; contudo, a razo

para a preponderncia geogrfica de manifestaes severas de infeces por Klebsiella

pneumoniae, incluindo bacteremias e meningites adquiridas na comunidade, na sia, so

desconhecidas. No Japo, tem havido um aumento de infeces causadas por Klebsiella

pneumoniae resistente a m ulti-drogas constituindo um a am eaa n o s por se t ornar

mais difcil se leccionar os antibiticos eficazes para o t ratamento d os pacientes, m as

tambm por ser uma causa frequente de surtos nosocomiais nos hospitais. Contudo, a

origem de sta b actria de sconhecida. E stes r esultados sugerem que s ob ce rtas

condies, as tetas de animais saudveis podem se r co lonizadas por bac trias

resistentes a multi-drogas e suscita uma pergunta: Quais so os mecanismos envolvidos

17

na seleco de bactrias resistentes a multi-drogas nas tetas dos animais saudveis?

Assumiram que a seleco ocorre fora da teta, que a invaso feita atravs do esfncter

da teta e que estas bactrias permanecem num estado latente. Alm disso, as fezes e a

urina dos animais contm quer as bactrias resistentes quer os resduos de antibiticos

que f icam acumulados no so lo habitado por estas vacas leiteiras. possvel que este

ambiente de presso com antibiticos seleccione alguns grupos de bactrias para

mutaes pontuais. Este tipo de ambiente favorece a resistncia, transferncia de genes

e amplificao de estirpes resistentes que podem colonizar, durante meses, o canal da

teta e a cisterna, dur ante a lactao ou perodos de seca, sendo um reservatrio

daquelas bactrias no l eite br uto, m esmo e m ani mais saudveis. A dicionalmente,

microrganismos resistentes tm sido encontrados em quintas de produo convencional

ou orgnica, o que demonstra que o fenmeno de disseminao de bactrias resistentes

est nas quintas. necessria vigilncia para avaliar se isto uma situao nica, numa

quinta, ou se a resistncia devida a ESBL est presente entre outras populaes animais,

no Japo (Hammad et al., 2008).

Poucos estudos tm d emonstrado a presena de Escherichia coli resistentes,

expressando ESBL em alimentos e animais de produo alimentar. Num estudo espanhol

de 2003, a prevalncia de resistncia de E. coli que expressam ESBL foi de 2,8% nos

isolados testados em ani mais doentes e os genes identificados foram d o t ipo CTX-M,

SHV e TEM. Num estudo dinamarqus de 2000-2002 em isolados de E. coli e Salmonella

spp no foram detectadas ESBLs. Num estudo na Holanda de 2001 a 2002 em isolados

de aves, de produtos de aves e de pacientes (34 isolados de Salmonella spp produtores

de ESBL) havia uma alta prevalncia de bla(TEM-52), e ESBLs do tipo CTX-M da classe C

de Ambler entre os isolados testados de origem de animal. Nove isolados no

relacionados de origem animal, uma Salmonella spp e oito E. coli do Reino Unido eram

produtores de ESBL. Todas as E. coli tinham mutaes de AmpC e na Salmonella spp foi

detectada uma enzima de classe C de Ambler, CMY-2. Como parte de vigilncia contnua

de r esistncia antimicrobiana nos animais de produo al imentar, nos alimentos e nos

seres humanos foram obtidos isolados de E. coli a partir de ca rne vendida a retalho na

Dinamarca num total de 732 amostras de aves, de ca rne bovina e de carne de porco,

sendo identificado pela primeira vez em 2004 o primeiro i solado de E. coli produtor de

ESBL. Esta E. coli resistente foi isolada de carne cortada importada da Alemanha e foi,

tambm, r esistente s q uinolonas, s su lfonamidas, t etraciclina e ao t rimetoprim.

Utilizando primers previamente concebidos para os genes do tipo TEM, foi obtido um

18

amplico de E. coli e por sequenciao foi identificado como bla(TEM-52). Anteriormente, a

bla(TEM-52) foi encontrada com alta prevalncia em E. coli nos pacientes hospitalizados em

hospitais canadianos. R ecentemente, i solados bacterianos contendo bla(TEM-52) foram

detectados em Salmonella enterica s erovares Blockley, T homsen, L ondon, E nteritidis,

paratyphi B, Virchow e Typhimurium de aves de capoeira e em pacientes na Holanda e

em pacientes na Esccia. Estes resultados mostram a importncia da monitorizao da

prevalncia da resistncia antimicrobiana no s dos animais de produo alimentar, mas

tambm em ca rne ve ndida a r etalho. P rogramas nacionais para l imitar a s eleco d a

resistncia tero de ser co mbinados com medidas internacionais e regulamentos para

assegurar que os consumidores no esto expostos a riscos desnecessrios de bactrias

resistentes a antimicrobianos em alimentos comprados a retalho. Alm disso, os genes

de r esistncia, i dentificados neste es tudo, es to l ocalizados em el ementos de DNA

mveis e a resistncia po de ser t ransferida e ntre as estirpes no intestino hum ano,

originando a reduo de op es de t ratamento antimicrobiano e pr olongamento da

hospitalizao (Jensen et al., 2006).

As Escherichia coli produtoras da enzima CTX-M-15 espalharam-se rapidamente no

Reino Unido por volta de 2003, mas outros tipos tambm apareceram, especialmente a

CTX-M-14. Examinaram-se peitos de galinha criados no Reino Unido (n=62) e importadas

(n=27), como potencial f onte de E. coli resistentes s quinolonas co m genes bla(CTX-M).

Foram examinadas mais quarenta amostras em que o pas de criao no foi possvel

identificar. Durante 2006, 1 29 filetes de p eito de g alinhas frescos e congelados foram

comprados em West Midlands. Foram cultivados em meio de CLED contendo 8mg/L de

ciprofloxacina e co m di sco d e 10 g d e ce fpodoxima. I solados resistentes foram

identificados e tipados por RAPD (random amplified polymorphic DNA analysis); bla(CTX-M)

foi identificada por PCR (polymerase chain reaction) e sequenciao. O pas de criao

foi identificado pela embalagem para 89 das 129 amostras compradas. Apenas uma das

62 amostras de galinhas criadas no Reino Unido era portadora de E. coli produtora da

enzima CTX-M-1, enquanto 10 de 27 amostras criadas noutros pases tinham E. coli com

enzimas CTX-M, especificamente, 4/10 Brasileiras, 3/4 Brasileiras/Polacas/Francesas, e

2/2 Alems tm E. coli com enzimas CTX-M-2. Seis das 40 amostras em que o pas de

criao no conhecido tm enzimas CTX-M e 5 so CTX-M-14. As E. coli resistentes s

quinolonas co m vrias b eta-lactamases C TX-M, as q uais so c omuns em i nfeces

humanas em t odo o m undo, foram e ncontradas em p eitos de g alinha i mportada,

indicando uma possvel fonte para colonizao intestinal. O tipo dominante de CTX-M em

19

infeces h umanas no R eino U nido n o foi encontrado n os isolados de g alinhas,

sugerindo que galinhas criadas neste pas no so um r eservatrio de C TX-M-15. F oi

posta como hiptese que os produtos de galinha importados fossem a grande fonte de

colonizao intestinal p or estirpes avirias de E. coli portadoras de genes de E SBLs

bla(CTX-M). C ozinhar os al imentos no i mpede a colonizao d os intestinos pelos

microrganismos das g alinhas cruas, q uando manuseadas e c ozinhadas em l ocais

domsticos. A colonizao intestinal, quando seguida de uma cateterizao urinria ou

problemas de higiene pessoal, pode explicar a epidemiologia actual dos produtores de

ESBLs, os quais aparecem particularmente nos idosos, nos hospitais e na comunidade

do Reino Unido. As estirpes avirias podem transferir resistncia ou factores de virulncia

para os h umanos por E. coli patognicas, embora isto n o exp lique a di sseminao

clonal m ultifocal. A C TX-M-15 t em si do ag ora descr ita na ca rne d e f rango ve ndida a

retalho nos EUA em simultneo com as primeiras descries de casos na comunidade

com este gentipo. Embora estirpes de E. coli com a enzima dominante CTX-M-15 no

tenha sido encontrada em amostras de carne de galinha no Reino Unido, no se pode

ignorar a possi bilidade d a su a or igem t er co mo f onte os gneros alimentcios. O utra

explicao que estirpes com CTX-M-15 apareceram devido emigrao ou imigrantes

da ndia, onde a enzima est extremamente disseminada. Contudo vrios epicentros de

E. coli clonal com CTX-M-15, por exemplo U lster ( Irlanda) e Shrewsbury (Inglaterra), e

que n o t m gr ande populao i migrante, contrariam o ar gumento de que a

disseminao m ediada pelos viajantes. Devido e norme presena de estirpes de E.

coli com r esistncia a q uinolonas e c om g enes CTX-M n os peitos de frango cr us

necessrio uma vigilncia sustentada paralela, das fontes de comida crua i mportada e

infeces nos humanos, para estabelecer se h uma relao, ou uma mudana gradual

na prevalncia de tipos de CTX-M e se genes de resistncia e p lasmdeos nos isolados

de comida crua so os progenitores das mudanas na epidemiologia clonal nos isolados

das enzimas CTX-M. Embora a epidemiologia molecular no tenha demonstrado que a

carne crua de aves domsticas uma fonte das infeces correntes no Reino Unido, esta

carne pode s er uma fonte de colonizao fecal com E. coli produtoras de E SBLs por

infeces extra-intestinais (Warren et al., 2008).

Em 200 6 n a T unsia foi a valiada a ocorrncia de be ta-lactamases de es pectro

alargado em isolados de Escherichia coli em quarenta amostras de fezes animal e em

trinta e oito amostras de alimentos, para caracterizar o tipo de ESBLs, os seus ambientes

genticos e os genes de r esistncia associados. O s isolados de E. coli produtores de

20

ESBLs foram de tectados em dez d e t rinta e oito amostras de al imentos e n o foi

detectada nenhuma nas amostras de fezes animal. A diferena observada nos isolados

de E. coli ESBL positivos em amostras de alimentos em relao s amostras de fezes de

animais pode ter vrias razes; as amostras de alimentos e as amostras de fezes foram

obtidas de qui ntas diferentes e, p or out ro l ado, a c ontaminao po de oc orrer no

matadouro e durante os processos de t ransformao ou comercializao alimentar. Os

genes encontrados nos isolados foram os seguintes: bla(CTX-M-1) em cinco, bla(CTX-M-1) mais

bla(TEM-1b) em um, bla(CTX-M-14) mais bla(TEM-1b) em dois, bla(CTX-M-8) em um e bla(SHV-5) em um.

Todos os isolados com ESBLs mostraram padres no relacionveis por PFGE (pulsed-

field gel electrophoresis). As ESBLs da classe CTX-M foram detectadas pela primeira vez

em estirpes de E. coli de origem alimentar em frica (Jouini et al., 2007).

Recentemente, tem sido referida uma alta diversidade de ESBLs na Escherichia coli

em qui ntas de av es domsticas na B lgica sendo as enzimas CTX-M a f amlia

predominante. As estirpes de Salmonella entrica serovar Virchow e Salmonella entrica

serovar Infantis produtora de TEM-52 tm sido tambm isoladas de aves domsticas na

Blgica. A presena de ESBLs nos animais de produo alimentar pode representar um

perigo p ara a s ade humana um a vez que e stas bactrias podem r epresentar um

reservatrio de genes de resistncia de patognicos causando doena nos humanos e

nos animais. Portanto para demonstrar o conjunto de genes comuns de ESBLs existentes

entre os i solados dos diferentes hospedeiros, ca racterizaram-se os plasmdeos,

determinaram a localizao e a pos sibilidade de t ransferncia de E SBLs bla(TEM-52),

bla(CTX-M-2) e bla(CTX-M-15) presentes nos isolados das diferentes estirpes de

Enterobacteriaceae de h umanos, d e frangos e de sunos. C atorze es tirpes n o

relacionadas clonalmente, portadoras de bla(TEM-52), bla(CTX-M-2) ou bla(CTX-M-15) foram

usadas n este es tudo. A s es tirpes d e E. coli humana f oram isoladas em pacientes do

Hospital Universitrio de Ghent. Todos os isolados de aves domsticas foram obtidos de

fezes de frangos saudveis mas os 2 isolados de E. coli eram de sunos com diarreia. A

resistncia pl asmdica qu e co difica as ESBLs parece m over-se r apidamente ent re os

diferentes microrganismos e os diferentes ecossistemas. Os organismos portadores de

TEM-52, d e C TX-M-2 ou C TX-M-15 r esistentes s c efalosporinas, podem se r

transmitidos dos alimentos de produo animal para os humanos ou vice-versa, contudo,

permanece pouco claro, principalmente devido ao desconhecimento da maleabilidade e

velocidade de evoluo dos plasmdeos que as transportam (Smet et al., 2009).

21

As ESBLs, principalmente as da famlia CTX-M, tm sido associadas com estirpes

de Escherichia coli de or igem animal na Europa. U ma experincia foi r ealizada in vivo

para e studar os efeitos de dr ogas beta-lactmicas em ve terinria n a se leco e

persistncia de E. coli produtora de ESBL na flora intestinal de sunos. Vinte sunos foram

aleatoriamente distribudos em trs grupos de tratamento e um grupo de controlo. Todos

os sunos foram inoculados intragastricamente com 1010 CFU (unidades formadoras de

colnias) de mutantes resistentes ao cido nalidxico derivados de estirpes de E. coli

produtoras de C TX-M-1 de su nos. O s tratamentos com a am oxicilina, a ce ftiofur

(cefalosporina d e 3 gerao), ou a ce fquinoma ( cefalosporina d e 4 g erao) foram

iniciados imediatamente aps inoculao bacteriana. As fezes foram co lhidas antes da

inoculao e nos dias 4, 8, 15, 22 e 25 aps o incio do tratamento. O total de coliformes

resistentes foram contados em meio de MacConkey com e sem cefotaxima (CTX). Para

alm disso, MacConkey com CTX e cido nalidxico (NAL) foi usado para contar o

nmero de CFU da estirpe inoculada. Foram observadas contagens significativamente

mais altas de coliformes resistentes ao CTX nos trs grupos de tratamento vinte e dois

dias aps a d escontinuao do t ratamento qu e no gr upo de c ontrolo. A ce ftiofur e a

cefquinoma exercem um maior efeito selectivo que a amoxicilina, e os efeitos persistem

para alm do tempo de tratamento recomendado para estas cefalosporinas. As estirpes

inoculadas foram detectadas em apenas nove animais no dia 25. O aumento do nmero

de co liformes resistentes ao CTX f oi pr incipalmente devido pr oliferao de e stirpes

produtoras de CTX-M nativas e possibilidade de outras estirpes adquirirem genes CTX-

M por transferncia horizontal. O tratamento com amoxicilina, ceftiofur, ou cefquinoma

resulta numa seleco de E. coli produtora de CTX-M na flora intestinal dos sunos. Com

a excepo da cefquinoma, observou-se um aumento na contagem de E. coli produtora

de CTX-M que no foi devida estirpe inoculada mas s estirpes de E. coli presentes na

flora nativa dos sunos. A maioria dos sunos (19/20) era portadora de E. coli produtora

de CTX-M ant es da inoculao, incluindo as variantes CTX-M-1 e C TX-M-14. E mbora

no haja i nformao di sponvel acerca da contribuio de factores seleccionadores de

patognicos especficos oriundos de quintas, esta descoberta sugere que pode ser difcil

controlar o r isco d a co lonizao animal c om E. coli produtoras de ESBL. A s estirpes

produtoras de CTX-M nativas tm uma predominncia ecolgica sobre a estirpe

inoculada observada na contagem das placas contendo NAL e por caracterizao

gentica dos isolados obtidos no fim da experincia. Vrios factores podem ter

contribudo para este resultado, tais como factores do hospedeiro ou um possvel

enfraquecimento da estirpe inoculada devida mutao que condiciona a resistncia

22

quinolona, a qual pode ter reduzido a capacidade da estirpe para colonizar os sunos. Foi

observado, anteriormente, q ue um cl one d e E. coli predominante es t n ormalmente

associado com uma flora intestinal e a co lonizao com estirpes externas dificultada

devido competio com a flora nativa adaptada. Em mdia, a diferena estimada entre

a contagem de E. coli produtoras de C TX-M nas fezes de sunos tratados com

cefalosporinas e das do grupo de controlo foi cerca de cem vezes mais alto no primeiro

grupo e p ersistiu p elo menos durante vinte e dois dias aps o fim do tratamento. Da

mesma forma, os efeitos selectivos exercidos por ceftiofur e cefquinoma persistem para

alm do fim do tratamento (o tempo requerido para assegurar que os resduos da droga

estejam a baixo d o l imite do r esduo m ximo disponvel no s tecidos), q ue s o n ove e

cinco dias r espectivamente. O t ratamento co m a amoxicilina i nduz um a umento

significativo na contagem de coliformes resistentes a CTX, existindo uma diferena dez

vezes inferior relativamente contagem do grupo de controlo, sendo o tempo de

eliminao desta droga de t rinta dias e portanto o r isco da contaminao da carne no

matadouro p arece s er m enor p ara est e m edicamento. E ste estudo in vivo indica

claramente que as cefalosporinas de uso veterinrio seleccionam as E. coli produtoras de

ESBLs na flora intestinal dos sunos e isto produz um efeito selectivo que persiste por um

perodo longo, maior que o tempo de tratamento necessrio com estes antimicrobianos.

O t ratamento dos animais com cefalosporinas deve ser limitado e apenas quando os

antimicrobianos de espectro mais estreito no se podem usar devido s resistncias ou

por falta de eficcia clnica por drogas antimicrobianas alternativas (Cavaco et al., 2008).

Em vi nte e nov e isolados de E. coli de uma amostragem de oi tenta qui ntas

produtoras de sunos distribudos em treze pr ovncias espanholas demonstraram

reduzida susceptibilidade ou r esistncia a cefalosporinas de es pectro alargado. Foram

encontradas as seguintes ESBLs: SHV-12 em 12 i solados, C TX-M-1 em t rs i solados,

CTX-M-9 em trs isolados e CTX-M-14 em trs isolados; os restantes oito isolados no

eram fenotipicamente E SBLs. D iferentes ESBLs e out ros mecanismos associados

resistncia a cefalosporinas de espectro alargado esto muito disseminados em E. coli de

origem fecal de matadouros de sunos em Espanha (Escudero et al., 2010).

Num es tudo r ealizado em ci nco q uintas produtoras de frangos, em I tlia, foram

caracterizados sessenta e s ete i solados de Escherichia coli com r eduzida

susceptibilidade c efotaxima ou ce ftiofur. F oram i dentificados os genes das beta-

lactamases bla(CTX-M-1), bla(CTX-M-32) e bla(SHV-12). Detectou-se uma considervel diversidade

gentica entre os isolados produtores de ESBLs, e foram identificadas estirpes iguais em

23

diferentes quintas e plasmdeos iguais em estirpes geneticamente distintas. A deteco

de plasmdeos com alta mobilidade sugere um potencial reservatrio para genes de beta-

lactamases (Bortolaia et al., 2010).

Em Portugal, foi feito um estudo em setenta e seis amostras de fezes de f rangos

obtidas num matadouro. F oi d eterminada a susceptibilidade a dezasseis antibiticos e

oitenta e cinco por cento dos isolados apresentavam um fentipo multirresistente a pelo

menos quatro famlias de antimicrobianos. As ESBLs dos grupos TEM e C TX-M f oram

detectadas em trinta e um isolados de E. coli. O resultado deste estudo demonstra que o

tracto intestinal de aves domsticas saudveis um reservatrio de isolados de E. coli

com ESBLs (Costa et al., 2009).

Para investigar a diversidade de integres e beta-lactamases de espectro alargado

entre Enterobacteriaceae de g alinhas e d e s unos, em Portugal, e a nalisar a r elao

clonal entre os isolados produtores de ESBLs portugueses de origem animal e humano,

analisaram-se amostras de fezes de sunos saudveis (HSF, n=35) carcaas de galinha

no co zinhadas (CM, n= 20) e f ezes de g alinhas saudveis (HCF, n= 20). A s

Enterobacteriaceae produtoras de E SBLs foram i dentificadas nas seguintes amostras:

60% d e C M, 10% de H CF e 5, 7% d e H SF, a m aioria co rrespondente a E. coli dos

filogrupos A, D e D 1. As ESBLs TEM-52, S HV-2 e C TX-M-1 foram detectadas em

amostras de galinha e SHV-12 em amostras de sunos. Foi observada alta diversidade

clonal e a maioria d as ESBLs foi transferida ( 67%). N as amostras foram i dentificados

integres de classe 1 e classe 2, 80% nas CM, 10% nas HCF e 63 % nas HSF, sendo a

classe 1 mais frequente que a c lasse 2. Este estudo o pr imeiro de ESBLs e integres

de galinhas e sunos em Portugal e destaca as bactrias resistentes aos antibiticos e/ou

genes de resistncia que os humanos podem adquirir at ravs da cadeia al imentar. Os

isolados com susceptibilidade di minuda a cefalosporinas de esp ectro al argado f oram

encontradas em todas as amostras de carne de galinha, em duas amostras de HCF e em

trs amostras HSF. Um total de cento e quarenta e nove isolados representativos de

colnias com diferentes morfotipos foi determinada a susceptibilidade aos antibiticos nas

HSF (n=48), nas HCF (n=33) e nas CM (n=68). A resistncia a pelo menos um antibitico

foi observada em 113 i solados sendo r esistentes estreptomicina 65%, s sulfamidas

51% e ao trimetoprim 40%. A maioria dos isolados portadores de ESBLs tem resistncia

a est es antibiticos que so us ados na produo animal i ntensiva. A s taxas de

resistncia para as sulfamidas e para o trimetoprim foram semelhantes entre isolados de

galinhas e sunos (50% versus 54% para su lfamidas e 43% versus 35% par a

24

trimetoprim). As taxas de resistncia para os antibiticos no beta-lactmicos so mais

frequentemente en contradas entre produtores de E SBLs do qu e ent re isolados no

produtores de ESBLs: estreptomicina (83% versus 63%), sulfamidas (67% versus 49%) e

trimetoprim ( 61% ve rsus 31%). As ESBLs frequentemente i dentificadas nos humanos,

associadas com os hospitais ou a comunidade dos pases europeus, tm sido cada vez

mais encontradas entre os animais. A frequente deteco de Enterobacteriaceae

produtoras ESBLs e/ou portadoras d e i ntegres de cl asse 1 e /ou d e c lasse 2 nas

amostras de fezes de g alinhas e su nos para produo al imentar, am bos de m arcas

comerciais diferentes, e galinhas criadas em di ferentes quintas de Portugal, confirma o

papel dos animais como possvel reservatrio para a disseminao de genes resistentes

na comunidade. A presena de ESBLs entre amostras de galinha de marcas comerciais

diferentes e de galinhas criadas em diferentes quintas pode ser a razo da contaminao

de algumas linhas genticas de grande nmero de r eproduo que so vendidos pelo

mesmo pr odutor. A s ESBLs s o m ais frequentemente o bservadas entre E. coli

principalmente p ertencendo a o gr upo filogentico A ( 58,3%), a q ual ass ociada c om

estirpes comensais de E. coli animal ou humana, de acordo com outros estudos. Contudo

tambm f oi d etectado E. coli produtora de ESBL do grupo filogentico D , o qual est

associado a infeces humanas extra-intestinais. Todos os genes de ESBL identificados

neste estudo j foram identificados nos hospitais portugueses, e as ESBLs mais comuns

entre o s animais, T EM-52 e S HV-12, s o tambm os t ipos mais frequentes e ntre os

humanos. A bla(TEM-52) tambm t em sido detectada entre pr oduo al imentar e animais

selvagens, animais domsticos e humanos saudveis da Blgica, da Frana, da Grcia,

de Portugal ou de Espanha e associada a um plasmdeo epidmico conjugativo entre

amostras de a nimais em r eas com al ta pr evalncia d este t ipo d e E SBLs. Os outros

genes de E SBL e ncontrados, bla(CTX-M-1), bla(SHV-2) ou bla(SHV-12), es to l argamente

disseminados entre Enterobacteriaceae de diferentes continentes por di sseminao

plasmdica e cl onal e tm si do r ecentemente detectados em Portugal. A diversidade

clonal dos isolados portadores destes genes sugere que a transmisso horizontal pode

ser a responsvel pela recente e rpida disseminao destas variantes no pas. Algumas

das ESBLs e integres que foram encontrados j tinham sido detectados entre

Enterobacteriaceae de diferentes nichos ecolgicos em Portugal e n outros pases,

sugerindo que as suas estruturas genticas mveis esto di sseminadas. necessria

uma poltica mais restrita do uso de antibiticos em veterinria (Cavaco et al., 2008), para

prevenir o ap arecimento e a di sseminao destas estirpes entre a nimais e h umanos,

limitando os futuros problemas de falha teraputica (Machado et al., 2008).

25

Contributo dos animais selvagens para a disseminao de estirpes produtoras de ESBLs

Num estudo, de 2006 a 2008, na Repblica Checa e Eslovquia para determinar a

presena de E. coli resistentes aos antibiticos nas fezes de populaes de mamferos

selvagens, encontraram nas fezes de j avalis cinco i solados de E. coli multirresistentes

produtores de ESBLs : um isolado com bla(CTX-M-1) e bla(TEM-1), trs com bla(CTX-M-1) e um

com bla(TEM-52b). Este estudo demonstra o impacto dos mamferos selvagens como

reservatrios de estirpes produtoras de ESBLs (Literak et al., 2009).

As E. coli produtoras de ESBLs foram isoladas em oito amostras de setenta e sete

amostras de fezes de javalis em Portugal. Os tipos de ESBLs sequenciados e

identificados por PCR f oram bla(CTX-M-1) em 6 i solados e bla(CTX-M-1) + bla(TEM1-b) em 2

isolados. A dicionalmente foram d etectados genes de r esistncia t etraciclina em 3

isolados, estreptomicina em 3 i solados, ao cloranfenicol em 1 isolado e em todos os

isolados foram detectados genes de resistncia sulfonamida. O gene intl 1 que codifica

a integrase da classe 1 foi detectado em todos isolados de E. coli. Este estudo evidencia

que os javalis podem ser um reservatrio de genes de resistncia antimicrobiana (Poeta

et al., 2009).

As ESBLs tm si do l argamente distribudas nas bactrias d e diferentes

ecossistemas, em bora se ja n ecessria m ais informao, es pecialmente p ara

ecossistemas selvagens. O estudo de Poeta e colaboradores tem como objectivo analisar

os isolados de E. coli portadores de ESBLs em amostras de fezes de gaivotas das Ilhas

Berlengas e tambm caracterizar o tipo de ESBLs e o grupo filogentico dos isolados. As

Ilhas Berlengas so uma parte da reserva natural das Berlengas, localizada a 5,7 milhas

da costa Portuguesa, e pertencem a uma rede nacional de reas protegidas. No passado

pescadores habitaram na ilha, que agora desabitada, embora haja visitas tursticas e

poucas pessoas permanecem nas frias. Diversas espcies de gaivotas fazem os seus

ninhos nesta i lha; n estes ltimos anos a p opulao de g aivotas tem aum entado

significativamente e c onsiderada um a v erdadeira pr aga. A mostras fecais frescas de

cinquenta e sete gaivotas foram obtidas em diferentes reas das Ilhas Berlengas durante

o ms de Setembro de 2007 e foram testadas para a presena de ESBLs em isolados de

E. coli. Os genes de be ta-lactamases detectados foram os seguintes: bla(TEM-52) em 8

isolados, bla(CTX-M-1) mais bla(OXA-1) em um isolado, bla(CTX-M-14a) em um isolado, e bla(CTX-M-

26

32) em um isolado. interessante que 73% dos isolados com ESBL tm o gene bla(TEM-52)

e 27% tm o gene bla(CTX-M). A alta prevalncia de TEM-52 tem sido recentemente

observada em i solados de E. coli de a nimais sa udveis para pr oduo al imentar e

produtos de c arne d e frango de Portugal. importante realar a alta prevalncia e a

diversidade m oderada d e ESBLs d etectadas n as E. coli das fezes das gaivotas que

habitam numa reserva natural. No caso das Ilhas Berlengas, que no so muito longe da

costa portuguesa, no est excluda a possibilidade destes animais comerem os restos

dos alimentos das pessoas. Este estudo d um a n ova evidncia para a l arga

disseminao de ESBLs nos isolados de E. coli de animais selvagens, como o caso das

gaivotas (Poeta et al., 2008).

Infeces com bacilos resistentes a multidrogas no ocorrem s nos hospitais mas

tambm na comunidade. Estudos anteriores demonstraram resistncia a multidrogas em

aves selvagens. A costa do Porto em Portugal, incluindo a baixa do Porto, tem uma larga

populao de gaivotas (Larus fuscus, Gaivota-d'asa-escura, e L. cachinnans, gaivota de

pernas amarelas). As gaivotas tm si do d escritas como um pr ovvel r eservatrio d e

bactrias resistentes a m ultidrogas. D urante a dca da passada, beta-lactamases de

espectro alargado com importante crescimento epidemiolgico, as enzimas

cefotaximasas ( CTX-M), f oram r elatadas mundialmente em Enterobacteriaceae de

humanos; f oram encontradas maioritariamente na Escherichia coli. As razes para o

rpido a parecimento de enzimas de C TX-M em i solados de humanos permanecem

desconhecidas. A dicionalmente E. coli CTX-M posi tivas foram i dentificadas em av es

domsticas, em qui ntas de outros animais, e ani mais selvagens (aves de r apina,

raposas). As estirpes de E. coli podem ser classificadas em quatro grupos f ilogenticos

(A, B1, B2 e D). Os isolados extra-intestinais virulentos pertencem maioritariamente ao

grupo B2, sendo o de menor extenso o do grupo D, enquanto a m aioria das estirpes

comensais pertencem aos grupos A e B 1. O obj ectivo deste estudo avaliar a

disseminao e os tipos de E. coli produtoras de ESBLs nas fezes de aves selvagens nas

praias do P orto. O t ipo d e be ta-lactamases CTX-M a E SBL em cr escente

predominncia. Este estudo forneceu uma pista adicional de que as gaivotas selvagens

so p ortadoras de E. coli produtoras de E SBLs, em bora num a m enor t axa do que a

referida anteriormente. Os determinantes de ESBLs so TEM-52, CTX-M-1, CTX-M-14a e

CTX-M-32. Outro estudo em aves domsticas referia que a principal CTX-M identificada

era do grupo CTX-M-1 (CTX-M-1, CTX-M-15, C TX-M-32) como f oi enc ontrado pel os

autores. A CTX-M-15 era o principal tipo de CTX-M identificada entre as aves residentes

27

na maioria das praias do Porto, o que est de acordo com o facto de a CTX-M-15 ser a

mais prevalente nas E. coli nos pacientes hospitalizados no P orto. E sta observao

contrria ao estudo de Poeta et al., 2008, em que a m aioria dos animais selvagens era

produtor de TEM-52 numa reserva perto do Porto onde o contacto com os humanos era

menor. Estudos anteriores demonstraram a associao de isolados de E. coli do grupo

B2 e D com infeces extra-intestinais. Os resultados mostram que 37% de t odos os

isolados com E SBLs pertencem a o filogrupo B2 ou D , c om um a t axa su perior

anteriormente encontrada (27% de todas ESBLs) e esta descoberta pode ser um assunto

de i nteresse para a sa de h umana. C ontudo, f oi d emonstrado que o t ipo ST131

conhecido c omo o m ais frequentemente isolado nos humanos e f requentemente

associado com produo de CTX-M-15 muito raro (9%). Os resultados sugerem que as

praias, desta forma, podem ter um papel fundamental na disseminao de determinantes

de resistncia e podem ser a fonte de CTX-M-15 relacionadas com as infeces

adquiridas na comunidade. As aves migratrias, tais como as gaivotas que atravessam

grandes extenses da costa europeia entre Portugal e a Escandinvia, podem ser os

reservatrios do aparecimento destes determinantes de resistncia (Simes et al., 2010).

No nordeste da Repblica Checa analisou-se a superfcie da gua de uma lagoa,

procura d e Escherichia coli e Salmonella resistentes aos antibiticos, com gaivotas

jovens ( Laurus Ridibundus) que a ni dificam. Um t otal de 16% ( n=87) de am ostras de

gua e 24% (n=216) de amostras de f ezes de gai votas revelaram Salmonella. A s

Salmonella resistentes aos antibiticos foram i soladas em 12% ( n=14) na gua e 28%

(n=51) nas gaivotas. As Escherichia coli foram isoladas em 83 (95%) amostras de gua

da lagoa e 213 (99%) amostras de fezes gaivotas. Os isolados de E. coli num total de

18% ( n=83) da gua e 2 8% ( n=213) d as gaivotas eram r esistentes a os agentes

antimicrobianos testados. O s isolados de E. coli resistentes aos antibiticos co m

integres de classe 1 foram encontrados em 21% (n=14) na gua e 15% (n=60) n as

gaivotas. Nos isolados de E. coli das gaivotas com integres de classe 2 e produtores de

beta-lactamases de espectro alargado c om bla(CTX-M-1), bla(CTX-M-15), bla(SHV-2) e bla(SHV-12)

dos quais 13% eram resistentes aos antimicrobianos. Foram encontrados isolados de E.

coli resistentes aos antibiticos com padres idnticos (PFGE) nas gaivotas ou na gua.

As Salmonella do mesmo sertipo e perfil de PFGE foram encontradas nas gaivotas e na

gua. As gaivotas e a gua da superfcie da lagoa foram analisadas como importantes

reservatrios de E. coli e Salmonella resistentes aos antibiticos, i ncluindo i solados

produtores de beta-lactamases de espectro alargado (Dolejsk et al., 2009).

28

Existem apenas alguns estudos anteriores em que as ESBLs foram detectadas em

estirpes de E. coli nas fezes de animais selvagens, mas no do conhecimento que

estirpes de E. coli tenham sido isoladas nas fezes de btios (Buteo buteo). Trinta e t rs

amostras de fezes de btios de Portugal foram obtidas de Setembro de 2007 a Fevereiro

de 2 008 e foram es tudadas quanto presena de estirpes de E. coli produtoras de

ESBLs. T odas as amostras de fezes foram o btidas com a co laborao do C RATAS

(Centro de Recepo, A colhimento e T ratamento de Animais Selvagens). Este ce ntro

est l ocalizado n a U niversidade de T rs-os-Montes e Alto D ouro e r ecebe animais

feridos. Nenhum dos btios tinha sido previamente alimentado por seres humanos ou

tratado com antibiticos. A maioria dos animais habitava no Parque Natural da Peneda

Gers ou noutras reas rurais protegidas de Portugal. As amostras de fezes foram

seleccionadas para a presena de ESBLs utilizando o meio de Levine agar suplementado

com 2 mg / L cefotaxima (Levine-CTX). Duas colnias com morfologia tpica de E. coli

foram seleccionadas e identificadas por mtodos bioqumicos clssicos (Gram, catalase,

oxidase, indol, Metil Red-Voges-Proskauer, citrato e urease) e p elo sistema API 20E de

cada amostra fecal. A susceptibilidade a 16 antibiticos (ampicilina, amoxicilina / cido

clavulnico, ce foxitina, ce fotaxima, ce ftazidima, azt reonamo, i mipenemo, gentamicina,

amicacina, t obramicina, estreptomicina, ci do n alidxico, ci profloxacina,

trimetoprim/sulfametoxazol, t etraciclina e cl oranfenicol) f oi d eterminada p elo m todo

difuso em a gar r ecomendado pelo C LSI par a todas as estirpes d e E. coli. A E. coli

ATCC 25922 f oi ut ilizada como um a est irpe d e controlo de qualidade. O s isolados

resistentes s cefalosporinas de t erceira gerao (cefotaxima ou ceftazidima) f oram

seleccionados para est udos posteriores (um por am ostra de f ezes, ou doi s se

apresentassem diferentes fentipos de resistncia aos antibiticos). O teste de difuso de

duplo disco ( cefotaxima, c eftazidima e aztreonamo n a pr esena o u a usncia d e

amoxicilina / cido cl avulnico) foi r ealizado p ara detectar a pr oduo de ESBL. A

presena de genes que codificam beta-lactamases do tipo TEM, SHV, OXA e CTX-M foi

estudado p or P CRs especficos, e am plices posi tivos foram se quenciados para

determinar o g ene especfico do t ipo de be ta-lactamase. F oram estudados por P CR o

ambiente gentico dos genes bla(CTX-M) e sequenciados em todos os isolados que tinham

bla(CTX-M), os genes de resistncia a ant ibiticos, a presena dos genes intI1 e intI2 que

codificam as integrases de classe 1 e 2, e a deteco dos grupos filogenticos de

estirpes de E. coli. As colnias de E. coli foram isoladas em 5 das 33 (15,2%) amostras

fecais n o m eio de L evine-CTX. F oram o btidos 2 i solados de E. coli de cada amostra

quando mostraram diferentes perfis fenotpicos e genmicos. Os 10 isolados exibiram um

29

fentipo de resistncia para a cefotaxima e/ou ceftazidima, e o t este d e pr oduo de

ESBL f oram positivos. O s genes de be ta-lactamase detectados nos isolados f oram os

seguintes: bla(CTX-M-32) + bla(TEM-1) (sete isolados) e bla(CTX-M-1) + bla(TEM-1) (trs isolados). A

alta prevalncia de bla(CTX-M-32) nos isolados de E. coli comensais dos btios neste estudo

notvel (15,2%), porque este gene no frequentemente encontrado em isolados de

animais, tendo sido referido em poucos estudos anteriores. Os isolados contendo CTX-M

eram todos multirresistentes. Todos os isolados produtores de bla(CTX-M-1) pertenciam ao

filogrupo B1. Os isolados produtores de bla(CTX-M-32) pertenciam aos filogrupos: B2 (quatro

isolados), A (dois isolados) ou B1 (um isolado). O filogrupo B2 foi associado em estudos

anteriores com i solados mais virulentos e t ambm t em si do r elacionado co m al guns

mecanismos especficos de resistncia, como o caso da beta-lactamase CTX-M-15. A

possvel associao em isolados bla(CTX-M-32) do filogroupo B2 deve ser monitorizada no

futuro. E sta a pr imeira ve z que i solados de E. coli produtores de CTX-M f oram

detectados nos btios. O s btios so p ssaros carnvoros, e p odem vo ar l ongas

distncias pr ocura d e c omida e territrio. possvel que estes hbitos al imentares

possam exp-los ao material f ecal de a nimais de quintas ou mesmo de humanos. Isto

poder explicar a aquisio e di sseminao de bactrias com genes de resistncia aos

antibiticos na populao d e b tios, m esmo na ausncia d a presso directa p or

antibiticos. Este estudo d estaca q ue as E SBLs so encontradas em ecossistemas

mesmo naqueles que no esto relacionados de per to com os s