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Melhoramento genético visando

resistência a insetos

Melhoramento genMelhoramento genéético visando tico visando

resistência a insetosresistência a insetos

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em ão em GenGenéética e Melhoramento de Plantastica e Melhoramento de Plantas

LGN 5799 – SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

LGN 5799 – SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Doutoranda: Michelle da Fonseca Santos

Orientador: José Baldin Pinheiro

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 – Caixa Postal 83, CEP:13400-9710 – Piracicaba – São Paulo – Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 – Fax: (0xx19) 3433-6706 – http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

1782 – 1º registro RI: variedade Underhill de trigo

resistente a mosca-de-Hesse (Mayetiola destructor);

1831 - 1º relato de uso de RPI: macieira Winter Majetin

resistente ao pulgão lanígero (Eriosoma lanigerum);

Panda & Kush, 1995

HISTÓRICO DA RPI

1863 - Caso clássico de sucesso no controle através da

RPI: filoxera-da-videira (Phylloxera vitifoliae);

Variedades americanas – porta-enxertos

Variedades européias – enxertosENXERTIA

Lara, 1991

1881 – Primeiras pesquisas visando à obtenção de

variedades RI (Califórnia-EUA) M. destructor ;

1916/17 - Primeiros estudos de herança da RPI:

resistência de algodão à cochonilha Saissetia nigra e ao

ácaro Eriophies gossypii;

1931 – Liberação dos primeiros materiais resistentes.

Estação Experimental do Kansas – variedades de trigo

resistentes a mosca de Hesse.Panda, 1979

HISTÓRICO DA RPI

Períodos de pesquisa em RPI

1º Anterior à II Guerra Mundial

Ortman & Peters, 1980

2º Imediatamente posterior à II Guerra Mundial

3º Atual (a partir de 1960)

HISTÓRICO DA RPI

MARCADORES MOLECULARES e TRANSGENIA

Vendraminm & Nishikawa, 2001

Novo período na RPI:

Definições:

“RPI é a soma relativa de qualidades

hereditárias apresentadas

pela planta, as quais influenciam

o grau de dano causado pelo inseto”

Painter, 1951

“Planta resistente é aquela que devido a sua

constituição genotípica, é menos danificada que uma

outra, em igualdade de condições”

Rossetto, 1973

RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS

Graus de resistência

Lara, 1991

• Imunidade

• Alta resistência

• Resistência moderada

• Suscetibilidade

• Alta suscetibilidade


Não preferência ou preferência (Antixenose):

Variedade é menos utilizada para alimentação,

oviposição ou abrigo que as outras variedades em

geral.

Antibiose: variedade, embora normalmente consumida

pelo inseto, provoca efeito adverso em

sua biologia

Tolerância: variedade menos danificada que as demais,

sob um mesmo nível de infestação do

inseto, e sem provocar efeito no

comportamento ou biologia desta.

Mecanismos de resistência

Painter, 1951



Genética da RPI

Fehr, 1987

Resistência vertical ou específica

• monogênica ou oligogênica (caráter qualitativo)

• vantagem: mais fácil de ser incorporada

• desvantagem: vulnerabilidade a novos biótipos

Resistência horizontal ou geral

• poligênica (caráter quantitativo)

• vantagem: controla amplo espectro de biótipos

• desvantagem: baixa herdabilidade

MELHORAMENTO VISANDO RPI

Etapas de um programa de melhoramento

Pessoal: equipe multidisciplinar

Definição do inseto praga-chave

Fontes de resistência:

Variabilidade genética do germoplasma inicial

a) Parentes silvestres

b) Populações locais e cultivares primitivas

c) Cultivares obsoletas

d) Linhas avançadas de melhoramento e mutações

e) Cultivares modernas Hoyt, 1992

Definição do método de melhoramento

Vendramim & Nishikawa., 2001

• Grau de melhoramento das fontes de resistência:

Com boas características agronômicas

Espécies selvagens, raças locais e material exótico

Controle quantitativo (Pré-melhoramento)

• Sistema reprodutivo da espécie

Alógama

Autógama

Etapas de um programa de melhoramento


PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)

Hill et al., 2001

Nativo da Ásia

2000: Meio-oeste (EUA) América do Norte

Danos: enrolamento, murcha, amarelecimento e queda prematura das folhas

Hartman et al., 2001

DiFonzo & Hines, 2002

Perda de rendimento > 50%

Redução da qualidade das sementes

Transmissão de vírus

� Identificar resistência ao pulgão da soja

� Determinar o tipo de resistência

� Examinar a variação entre clones do pulgão

� Comparar a performance agronômica de cultivares

resistentes e suscetíveis sob infestação severa do pulgão e

quando protegidas por um inseticida sistêmico.

1542 acessos de soja


Teste com/sem chance de escolha

Figura 1 – Ilustração da escala de classificação visual usada para estabelecer o Índice de Dano (ID)


Teste com chance de escolhaTabela 1 – Populações de pulgões da soja sobre planta nos estágios V1 e V2 de três genótipos de soja resistentes e quatro suscetíveis em dois testes com chance de escolha

6127Média

150c71d‘Ina’

152c55cd‘Pana’

187c48c‘Loda’

186c42c‘Williams 82’

53b19bPI 71506

11a15b‘Dowling’

15a9a‘Jackson’

Estágio VcEstágio V1Genótipos

Número de pulgões por planta



Teste sem chance de escolhaTabela 2 – Populações de pulgões da soja sobre plantas V1 e V2 de 5 genótipos de soja resistentes e 4 suscetíveis em 2 experimentos sem chance de escolha

60c104c‘Loda’

2a1a‘Palmeto’

1113Média

67cnão testado‘Ina’

24bc57c‘Williams 82’

não testado49c‘Pana’

15b35c‘CNS’

28bc29bcPI 71506

1a2a‘Dowling’

1a1a‘Jackson’

Estágio VcEstágio V1Genótipos

Número de pulgões por planta

• 1º relato - germoplasma da América do Norte

• Resistência – Dowling, Jackson e PI71506

• Palmetto e CNS (ancestrais) – doadores de resistência

• Dowling, Jackson e Palmetto – antibiose

• PI71506 e CNS – antixenose ou não preferência

• Expressão da resistência em todos os estágios

• Dowling Imidacloprid

• 3 clones – único biótipo ou mesmo clone



PI 567543C, PI 567597C, PI 567541B e PI 567598B

antixenose antibiose

2147 acessos de soja


Dowling (R) ♀ XLoda (S) ♂

Williams 82 (S) ♂

F1

F2

0, 1 ou 2

F2:3

Teste com chance de escolha

Colonização: 0 - 4

3 ou 4


Tabela 1 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em plantas F2 resultantes de Dowling x Loda e os pais, 21 dias após infestação.

31132Loda

0,1618,01Heterogeneidade0,900,0244,25132,7545132177Grupos

03232Dowling

0,880,023,7511.254111543440,690,164,7514,25415194531

0,720,132,57,5281043100,102,672,06,00884343

18,02Total

0,025,561,54,542643080,410,672,06,03584307

0,630,233,259,7549134309

0,500,443,09,0481243040,053,763,7511,2578154306

02222Dowling x Loda (F1)

0,600,272,758,25291143030,063,672,758,250111143020,560,334,012,03131643010,760,093,510,53111442810,890,024,7514,25514194021

PX2SR SRNo de plantasGenótipos (Família F2)

Esperado (3:1)Observado

3:1


0,0910,8Heterogeneidade

0,143,925,55125,5335019102Grupo

14,7Total

0,223,04,258,54,25782174531

0,870,32,755,52,75362114344

0,900,22,552,5352104309

0,055,93,573,5734144306

0,820,42,552,5262104303

0,114,5363390124301

0,780,5363453124281

1,000,0484484164021

PX2SHRSHR

Esperado (1:2:1)ObservadoNo de famílias F2:3Família F2

Tabela 2 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em famílias F2:3 resultantes de Dowling x Loda 21 dias após infestação.

1:2:1


033Dowling x Williams 82 (F1)

20020Williams 82

01919Dowling

0,890,0044,75134,25441351794041 (família F2)PX2SRSR

No de plantasGenótipos EsperadoObservado

0,810,423264323063351284041

PX2SHRSHR

Esperado (1:2:1)ObservadoNo de famílias F2:3Família F2

Tabela 3 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em plantas F2 resultantes de Dowling x Williams 82 21 dias após infestação pelo pulgão da soja.

Tabela 4 – Reações de famílias F2:3 de soja resultantes de Dowling x Williams 82Loda 21 dias após infestação pelo pulgão da soja.

3:1

1:2:1

Dowling – herança dominante monogênica

Rag 1


1º gene de R a A. glycines

Aphis glycines

Introgressão de Rag 1 retrocruzamentos

SAM


21rr (F2:3 suscetíveis)4Rr (F2:3 resist. e susc.)1RR (F2:3 resistentes)97Suscetível (3-4)

0rr (F2:3 suscetíveis)82Rr (F2:3 resist. e susc.)

42RR (F2:3 resistentes)247Resistente (0-2)

No de famílias F2:3Genótipo de plantas F2No de plantas F2Fenótipo de plantas F2

3:11:2

Jackson – herança dominante monogênica

Gene de Jackson X Rag1 ?

Tabela 1 – Segregação de progênies F2:3 de plantas F2 de Jackson X Loda para resistência ao pulção da soja, 21 após infestação.

123

26

Dowling (R) XLoda

Williams 82F1

F2

F2:3

(S) Jackson (R) X Loda (S)


Objetivos: mapear e localizar Rag1 e o gene de Jackson sobre o mapa genético da soja

F1

F2

F2:3

Figura 2 - Mapas de ligação mostrando a localização dos genes de resistência ao pulgão da soja em Dowling (Rag1) e Jackson (Rag)que foram mapeados sobre o grupo de ligação M.


3,3

9,3

D x L D x W

2,1

8,9

J x L

4,2

7,9

D x LD x W

1º relato da localização de genes de resistência ao pulgão no mapa da soja

Dowling (R) X Loda (S)

F1

F2 (R)

F2:3

X Loda (S)

BC3F2 (R)


� Dowling e Jackson – não adaptados ao meio-oeste

� SAM

PI 243540 (R): < ou = 2 Wyandot (S) : > ou = 4X

Figura 1 - Géis de agarosemostrando que as bandas SSR de ambos pais estápresente nas plantas F1. P1: Wyandot, P2: PI 243540 e números 1 a 11: plantas F1.

Herança monogênica dominante



--10(Titan x PI 567598B) F1

3,0012(E00075 x PI 567598B) F1

3,306(E00075 x PI 567541B) F1

4,0013‘Titan’4,008E00075

1,01212PI 567598B1,099PI 567541B

ClassificaçãoPlantas resistentesPlantas testadasGenótipos

F2 – 15:1 suscetíveis/resistente

Herança: dois genes recessivos

Tabela 1 – Linhas de soja parentais e F1 classificadas como resistentes ao pulgão da soja.


Biótipo de Ohio (0-4)

‘Wyandot’ (S) X PI 243540 (R)

F1

F2

F2:3


F2 - 3R:1S

1,000,000,143,950815746Rag20,152,120,342,132964937Satt4900,670,180,890,242944543Sat_375

0,860,030,960,090944545Sct_1880,370,800,630,931864651Satt3620,600,270,223,038775247Sct_033

0,700,150,124,163815743Satt3340,640,220,461,541875343SOYHSP1760,410,660,601,033844750Sat_234

0,520,410,019,9931052749Sat_229-H (Rr)b (RR)a (rr)

P valorX2 3:1PX2 1:2:1No de F2 em cada

categoria Locus


Tabela 1 – Teste de X2 da segregação do gene (Rag2) de resistência ao pulgão da soja e 9 marcadores SSR entre 184 plantas F2 de uma população de mapeamento de ‘Wyandot’ x PI 243540.

138 R46 SF2:3 - 1:2:1Rag 2


Figura 1 – a) Segmento relevante do grupo de ligação (GL) F (Choi et al, 2007), b) Posição de Rag2 sobre o GL F quando Rag2 foi mapeado como um gene dominante, c) Posição de Rag2 sobre o GL F quando Rag2 foi mapeado como um gene co-dominante.

PI 243540 – Rag2


Mapeamento fino

Clonagem posicional

Mapeamento fino

Clonagem posicional

Figura 1 – Mapa de ligação para o loco de resistência ao pulgão com SNPs (Single NucleotidePolymorphisms) identificados por hibridização.

Grupo de ligação M

cM Marcadores

Rag1

Campo - mistura

Casa de vegetação – um clone



PI 567541B (R) Skylla (S)X

F3:4

50 linhagens

melhoradas

PI 567541B (R) E00003 (S)X

F3:4

Validação de QTL

Figura 1 - Localização dos QTLs de resistência ao afídeo da soja usando

o método de mapeamento por intervalo composto.


Dowling e Jackson

Figura 2 - Produtos de PCR amplificados pelos marcadores

Satt299, Satt435, Satt649 e Satt343 para E00003(E), Skylla(S),

PI567541B (P), Jackson (J) e Dowling (D).


Limitações do melhoramento convencional

Necessidade de cruzamento de muitas plantas durante

gerações múltiplas;

Restrito ao uso de fonte de resistência nas espécies

selvagens;

Longo tempo para obtenção de variedades;

Transferência de porções indesejáveis do genoma.


Redução do tempo para obtenção de novas cultivares;

Transferência de genes entre organismos

filogeneticamente diferentes

> precisão – transferência apenas dos genes desejáveis;

Características podem ser introduzidas de uma única vez

sem complicações de genes extras e retrocruzamento;


Vantagens da engenharia genética

Plantas transgênicas

“Aquelas que possuem genes que originalmente não

constituem seu genoma, isto é, sofreram uma

transferência gênica”

� Estratégias de planta RI

Bacillus thuringienses, lectinas, inibidores de α-amilase, inibidores de proteinases, quitinas, peroxidases, entre outras.

ENGENHARIA GENÉTICA PARA RPI

Ribeiro et al, 1991

Bt

Esporos uma ou várias proteínas Cry

(δ-endotoxinas ou Insecticidal Crystal Proteins (ICPs)

ENGENHARIA GENÉTICA E RPI

Who, 1999

Modo de ação das toxinas Bt em

insetos

Tabela 1 - Plantas modificadas com genes cry de B. thuringiensis, resistentes a insetos-praga de importância agrícola (adaptado de Fontes et al., 2002).

Plantas Bt X Resistência a toxina

Piramidação de genes

2002 – Bollgard II (Cry 1Ac e Cry2Ab2)


Zhao et al., 2003

Utilização de planta transgênica juntamente com suscetível (refúgio);

RR rr

Rr


Tratamentos:

1) Pirâmide - 80% piramidadas (Cry1Ac/Cry1C) + 20% refúgio

2) Mosaico - 40% Cry1Ac + 40% Cry1C + 20% refúgio

3) Sequencial - 80% Cry1Ac + 20% refúgio / 80% Cry1c + 20% refúgio

� 4 populações de Plutella xylostella

Geração

Larv

a e

pulp

apo

r pl

anta

Bt

Figura 1 - Populações de Plutella xylostella resistentes a Cry1Ac/Cr1Cem gaiolas com diferentes tratamentos de brócolis Bt.


Tabela 1 – Sobrevivência de larvas de Plutella xylostella resistentes a Cry1Ac/Cr1Cem gaiolas, sobre diferentes plantas de brócolis Bt.


[0;0;0;1,0][0;0;0;1,0][69;71;74;78]

0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B73 (2,0) BSequencial

[2,1;4,1;4,2;5,1][3,1;6,1;6,3;12][90;95;96;96]

3,9 (0,64) A6,9 (1,9) A94 (1,5) AMosaico

[0;0;0;0][0;0;0;0][3,1;3,2;2,4;6,1]

0 B0 B4,1 (0,7) CPirâmide24

0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B87 (0,38) ASequencial

5,9 (2,8) A6,1 (2,5) A98 (0,98) AMosaico

0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B4,8 (2,9) BPirâmide18

2 genesCry1CCry1Ac

Sobrevivência média (%) sobre plantas BtTratamentoGeração


0,00,00043Freq r1,835 famíliasCN

5781,2Max RR1992-1993 a 2002-2004

64 biótiposEUA

Helicoverpa zea

LC50 (µg Cry 1Ac por ml de dieta)

Pro

porç

ão d

e bi

ótip

os

Figura 1 - Resistência de Helicoverpa zea a algodão Bt. a) Antes da comercialização de algodão Bt (1992-1993), b) após a comercialização de algodão Bt (2002-2004).

a

Pro

porç

ão d

e bi

ótip

os

LC50 (µg Cry 1Ac por ml de dieta)

b



a

Ano

s pa

ra r

esis

tênc

ia

Refúgio (%)

b

Refúgio (%)A

nos

para

res

istê

ncia

Figura 2 – Efeito simulado de abundância de refúgio (%) sobre resistência de pragas à culturas Bt.

Ha, Helicoverpa amigera; Hz, Helicoverpa zea; Hv, Helicoverpa virescens; On, Ostrinia nubilalis,

Pg, Pectinophora gossypiella; Sn, Sesamia nonagrioides.

Polipeptídio produzido pelas plantas

Mecanismo de defesa contra insetos e patógenos

Abundantes principalmente em sementes e órgãos de

reserva de gramíneas, leguminosas e solanáceas

Defesa constitutiva ou induzida pelo dano do inseto


Inibidores de proteinases


Mecanismo de ação dos IP

Pompermayer et al., (2001)


Inibidores de proteinases

• Classificação: proteinases serínicas; cisteínicas; aspárticas e metalo-proteinases.

• 1ª planta transgênica que expressava um gene de inibidor de proteinase.

Manduca sexta

Tabaco (CpTi)

IP serínica de feijão-de-corda (Vigna unguiculata).

Habibi & Fazili, 2007

Tabela 2 – Bioensaios de plantas transgênicas expressando genes de inibidores de proteinases introduzidos.

Hilder & Boulter, 1999

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A engenharia genética aliada ao desenvolvimento

de novos genótipos resistentes nos programas de

melhoramento, contribuirão sobremaneira no manejo

de pragas. Isto porque a incorporação de cultivares

resistentes assume grande importância por ser

compatível com outras táticas de controle

possibilitando a minimização do uso de inseticidas

químicos, o que reflete na redução de custos de

produção e de riscos de impacto ambiental negativo.

OBRIGADA OBRIGADA

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