LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE · Não houve indicação de apoptose usando a marcação com...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE

FUCANA ATIVA VIA DAS MAP QUINASES E INIBE A

PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS (CHO)

NATAL 2011

LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE

FUCANA ATIVA VIA DAS MAP QUINASES E INIBE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER

CHINÊS (CHO)

NATAL 2011

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Nobre, Leonardo Thiago Duarte Barreto.

Fucana ativa via das map quinases e inibe a proliferação de células de ovário de hamster chinês (CHO) /

Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre. – Natal, RN, 2011.

83 f. : Il.

Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.

Departamento de Bioquímica.

1. Polissacarídeos sulfatados – Dissertação 2. Fucoidan. 3. Câncer – Dissertação. I. Rocha, Hugo

Alexandre de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 577.114.4

DEDICATÓRIA

À Deus por ter me presenteado com uma família tão

maravilhosa e me dar forças continuar nos momentos mais

díficeis!!

À meus pais por sempre acreditarem que sou capaz e se

orgulharem quando consigo conquistas importantes!!!

Agradecimentos

Mais uma vez a Deus por tudo que me deu e por tudo que me

permite lutar para conquistar!

Agradeço imensuravelmente a meus pais Barreto e Tânia por

tamanho apoio e fé em mim e por sempre estarem presentes

mesmo quando distantes...um dos momentos mais difíceis da

minha vida!! Obrigado Pai! Obrigado Mãe! Tudo que eu sou e

que conquistei devo a vocês!! Exemplo de vida sempre!!!

Agradeço aos meus irmãos Thalis, Andreza e Andréia por toda

a força e torcida que sempre demonstraram me ajudando

sempre e por todos os momentos de felicidade que me

proporcionaram!!!

Agradeço especialmente a uma pessoinha que muda

completamente meu humor pra melhor!! Amandinha o tio te

ama muito e mesmo quando você me atrapalha não me

deixando estudar pra brincar contigo você ao mesmo tempo me

ajuda proporcionando momentos únicos de felicidade!!O tio

querido lindo vai sentir muitas saudades enquanto estiver

longe, mas você sempre estará no meu coração!!!

Agradeço aos meus avós Lino e Vitória os únicos que tenho hoje

por seu apoio em todas as horas!!!

Agradeço imensamente as minhas tias Baia (também

madrinha) e Ivonete (Titia) por seu apoio incondicional!!

Vocês foram as minhas avós maternas já que não conheci

minha avó Flora. Amo muito vocês!!

Não poderia faltar aqui um agradecimento a Fofinha!! A gata

mais terrorista de todos os tempos por vários momentos de

diversão com seus lugares exóticos para dormir!

Agradeço a Prima, Cresy que me levaram para a Bioquímica e

por várias saídas e conversas importantes além do apoio!

Agradeço também aos demais amigos da Bioquímica: Virgínia,

Tici, Paulinha, Norberto, Celina, Monique, Thuane, Dayse,

Roberta, Fernanda e Raquel dentre outros que o cansaço me

impede de lembrar no momento!

Agradeço aos amigos do Biopol: Arthur, Cinthia, Daniel,

Dayanne,Fernando, Gabriel, Hugo, Ivan, Jailma, Joanna,

Kaline, Karol, Leandro, Letícia, Mariana, Moacir, Nednaldo,

Pablo, Rafael, Raniere, Roni, Sara,Vinícius e Ruth! Em especial

aos mais antigos Ivan (desde a arca de Noé), Leandro (o

tirador de onda), Sara e Mariana (sempre um nome composto),

Jailma (contemporânea de entrada no laboratório e

especialista em assuntos do Microsoft Office) e Nednaldo ou seus

incontáveis apelidos sendo um pilar de referencia dentro do

laboratório! Obrigado a todos pelos ensinamentos e pela

oportunidade de ensiná-los o pouco que sei!! Gostaria de

descrever um pouco de cada um, mas como sabem algumas

informações devem ficar somente nos bastidores!!!

Agradecimento especial não poderia faltar a Rafael

(Magoel) por sua ajuda e apoio nos momentos científicos e

alcoólicos!!! A Ruth ou seus inúmeros apelidos que não posso

citar aqui pela ajuda (sem muito valor!Haha!) prestada nesse

trabalho e pelas conversas sem nenhum cunho científico! E

principalmente pela grande amizade que nós três temos nesses

últimos anos!!Obrigado por me terem como amigo e mesmo a

distância terem me dado tanto apoio!! Vocês também têm

muita sorte em me ter como amigo!!kkkkkk (Sou Phoda)

Aos amigos da turma de mestrado!! Em epecial a Luciana que

até antes do mestrado era uma simples estranha e depois passou

a ser uma figura altamente inoxidável na minha vida!!Muito

obrigado pelo apoio nos momentos de conversas

pabulatórias!!!kkkk

Agradeço também a Jana por ser a grande companheira das

madrugadas no MSN!! O seu apoio mesmo à distância me

ajudou muito!!

Agradeço também a Rominne pelo apoio que sempre me deu! O

fim de um relacionamento não significou o fim de uma

amizade!Obrigado pelo apoio desde o início de tudo!

Agradeço aos professores do Departamento pelos seus

ensinamentos!! Em especial agradeço aos professores da banca

de qualificação: Profa. Adeliana, Profa. Naissandra e Prof.

Carlos Eduardo.

Agradeço aos meus grandes amigos Wladimir e Matheus que

sempre estiveram presentes!!! Vocês são os CARAS!!!

Agradeço aos amigos de São Paulo!!! Impossível nomear todos

aqui, mas cito alguns: Valquíria e Edgar que me ajudaram

imensamente desde o início de minha estadia no INFAR!!

Amigos que fizeram a permanência longe de casa mais fácil

como: Thaís, Rafael, Aninha, Gigi, Tarsis, Vivien, Gabriel, Dayse,

Sheyla, Marcelly, Guilherme, Lívia, todas as Carois (não lembro

todos os sobrenomes), enfim, a todos do INFAR que fizeram parte

dessa jornada!!

Agradeço aqui também aos amigos de fora do INFAR que foram

importantes no momento em que estive longe da família!!

Agradeço especialmente aqui aos companheiros de lar que tive

em terras distantes!! Marcelo, Duda e Renan vocês me

receberam e me fizeram sentir-me em casa!! Duda e Marcelo

que abriram as portas pra um cara não muito silencioso

enquanto dorme quanto eu...Agradeço muito aos dois!!

Agradeço especialmente a Renan e Duda também por terem me

apresentado outros amigos e pelas inúmeras ocorrências

alcoólicas!!!Não que eu beba!!Longe de mim!! Só em dia de

feira!! Renan obrigado por abrir as portas de sua casa e me

permitir conhecer sua família! Com certeza me senti mais em

casa!! Obrigado caras!!Vocês são F..!!!!

Agradeço a um grande amigo dos últimos anos Popó pelas

conversas de futuro e as sem futuro!! Por proporcionar a trilha

sonora do laboratório nos finais de semana!!E principalmente

por ter me apresentado a Piaccelo (a pizza explosão de sabor)!!

Obrigado por tudo meu amigo!!

Agradeço imensamente a Profa. Helena Nader por me receber

no INFAR com toda a estrutura que possibilitou grande parte

desse trabalho ser realizado!! Um exemplo de pesquisadora a ser

seguido!! Obrigado também por me receber como um aluno de

doutorado!!

Faltam até palavras para agradecer a um orientador-amigo

como Hugo!!! O seu apoio e ensinamento durante todos esses

anos de BIOPOL foram extremamente importantes para minha

formação!!! As conversas não científicas, as pedaladas, o

paintball, enfim, todos os momentos que você nos proporciona

na sua companhia fora do laboratório também são

extremamente importantes para nossa formação!!! Não se

preocupe estou indo para longe, mas espero contar sempre com

sua ajuda, apoio e conselhos, como amigo e grande

pesquisador!! Obrigado por me deixar fazer parte do BIOPOL!!

Grandes anos da minha vida passei dentro desse laboratório,

pequeno, mas que cabe uma imensidão de idéias e amigos!!!

Agradeço por fim a todos aqueles que de forma direta ou

indireta fizeram parte dessa jornada! Pelos conselhos

científicos, pelas conversas de corredor, pelas saídas para fumar

(mesmo não fumando), com certeza tudo isso ajudou na minha

formação!!Obrigado!!

Agradeço a CAPES e CNPq que propiciaram os meios para que

esse trabalho fosse realizado!!!

Por fim, mas nunca menos importante, agradeço a mim!!!

Minha força de vontade, meus princípios, minha insistência

(ou teimosia), minha vontade de sempre lutar e nunca desistir

foram extremamente importantes para que esse trabalho fosse

realizado assim como todas as outras pessoas citadas

anteriormente!!Ahhh!!! A minha humildade também!!rsrsrsrs

Passar Bem!!!

“Não são as respostas que movem o mundo, são as perguntas!!!” (propaganda publicitária Canal Futura)

RESUMO

Fucana é um termo utilizado para denominar polissacarídeos sulfatados ricos em L-Fucose. As fucanas têm sido estudadas devido suas atividades farmacológicas: antitrombótica, antiproliferativa e antioxidante. Nós extraímos três frações de fucanas da alga Spatoglossum schröederi. Essas fucanas, denominadas de Fuc B 1, Fuc B 1.5 e Fuc B 2, apresentam uma composição muito similar como demonstrado pela eletroforese em gel de agarose, e conteúdo de açúcar e sulfato. O efeito antiproliferativo foi determinado pelas metodologias de MTT e BrdU em células CHO. O efeito na inibição da proliferação das três frações foi de cerca de 40%. Assim, procedemos somente com a Fuc B 2 devido seu maior rendimento. Não houve indicação de apoptose usando a marcação com anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo. Identificamos uma parada na fase G1 do ciclo celular. Os ensaios de western blotting mostraram que PKC, pFAK e pERK 1/2 são ativadas quando as células são tratadas com Fuc B. O tratamento com o inibidor de MAPK PD98059 aboliu o efeito da fucana. Esses efeitos indicam que a fucana age via ERK para inibir a proliferação das células. Palavras-Chaves: Polissacarídeos Sulfatados, Fucoidan, Câncer, Efeito Citostático, ERK

ABSTRACT

Fucan is a term used to denominate L-fucose rich sulfated polysaccharides. The fucans have been studied due their pharmacological activities like antithrombotic, antiproliferative and antioxidant. We have extracted three fucan fractions from the brown seaweed Spatoglossum schröederi. These fucans were denominated Fuc B 1, Fuc B 1.5 and Fuc B 2. The chemical analyzes show that the fucans have very similar composition as demonstrated by agarose electrophoresis gel, sugar and sulfate content. The antiproliferative effect was determined by MTT and BrdU methodologies in CHO cells. The inhibition of proliferation effect of the three fractions was about 40%. Therefore this we proceed just with the Fuc B 2 due the higher yield. There is no apoptosis indication using the anexin V/propidium iodide test. We found a cell cycle phase G1 arrest. The western blotting show that the PKC; pFAK; pERK 1/2 are activated when the cells were treated with fucans. The treatement with inhibitor of MAPK PD98059 extinguished the fucan effect. These results indicates that fucan act by the ERK pathway inducing the cell death.

Word Keys: Sulfated Polysaccharides, Fucoidan, Cancer, Cytostatic effect, ERK

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C

da alga Spatoglossum schröederi...................................................

22

Figura 2. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998) para a

fucana A da alga S. schröederi.......................................................

24

Figura 3. Estrutura proposta para a fucana B da alga S. schröederi

proposta por Rocha [2005]..............................................................

25

Figura 4. Interações entre célula e matriz extracelular................................... 31

Figura 5. Estrutura das subunidades da integrina, um receptor de

superfície para matriz extracelular..................................................

32

Figura 6. Via de sinalização da FAK em funções celulares normais e no

câncer............................................................................................

33

Figura 7. Alga marinha marrom Spatoglossum schröederi (C. Agardh)

KÜTZING.......................................................................................

36

Figura 8. Obtenção dos polissacarídeos sulfatados da alga S.

schröederi......................................................................................

41

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas........ 47

Figura 10. Eletroforese em gel de agarose das frações obtidas na

cromatografia de troca iônica..........................................................

48

Figura 11. Espectroscopia de infravermelho das fucanas B obtidas da alga

Spatoglossum schröederi................................................................

50

Figura 12. Efeito das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum schröederi na

viabilidade de diferentes células de ovário de Hamster chinês

tratadas por 24 h e avaliadas por MTT............................................

51

Figura 13. Efeito das fucanas obtidas da alga Spatoglossum schröederi na

proliferação de células CHO-K1 tratadas por 24h e analisadas

através da incorporação de BrdU....................................................

52

Figura 14. Efeito do sulfato na atividade antiproliferativa de Fuc B 2 e suas

derivadas dessulfatadas quimicamente por um período de 1h e

5h.....................................................................................................

53

Figura 15. Inibição da proliferação em células CHO-K1 tratadas com a

fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi e

diferentes concentrações de soro fetal bovino................................ 54

Figura 16. Inibição da proliferação das células CHO-K1 plaqueadas sobre

moléculas de matriz extracelular e tratadas com Fuc B 2 por

24h...................................................................................................

55

Figura 17. Expressão de pFAK por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2

por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL............................

56

Figura 18. Expressão de PKC por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h

com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL................................

57

Figura 19. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi

na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do

inibidor de PKC...............................................................................

58

Figura 20. Expressão de Ras por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h

com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL................................

59

Figura 21. Expressão de pErk ½ por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2

por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL............................

60

Figura 22. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi

na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do

inibidor de MEK1/2.........................................................................

61

Figura 23. Citometria de fluxo utilizando marcação com anexina V e iodeto

de Propídeo.....................................................................................

62

Figura 24. Análise do ciclo celular das células CHO-K1 tratadas com a

F2.0M..............................................................................................

63

Figura 25. Representação esquemática do mecanismo de ação proposto

para a fucana Fuc B, da alga Spatoglossum schröederi, exercer

seu efeito antiproliferativo em células CHO-K1...............................

70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fucanas encontradas em algas marrons........................................ 21

Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de polissacarídeos

sulfatados extraídos de algas..........................................................

23

Tabela 3. Composição química parcial dos polissacarídeos sulfatados

obtidos da alga Spatoglossum schröederi.......................................

49

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

ATCC

BIOPOL

BrdU

CDKs

CETAVLON

CHO-K1

CHO-745

CS

DTT

EGTA

ERK

FAK

FITC

FN

Fuc A

Fuc B

Fuc C

GAGs

HL-60

HPLC

HS

HT-29

IP

IUPAC

JNK

MAPK

MEC

mg

mL

American Type Culture Collection

Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais da UFRN

Bromo-deoxi-uridina

Ciclinas dependentes de kinases

Brometo de cetiltrimetilamônio

Linhagem tumorigênica de ovário de hamster chinês

Linhagem mutante em xilosil-transferase de ovário de

hamster chinês

Condroitim sulfato

Ditiotreitol

Ácido etilenoglicol tetraacético

Kinase regulada por sinal extracelular

Quinase de adesão focal

Isotiocianato de Fluoresceína

Fibronectina

Fucana A

Fucana B

Fucana C

Glicosaminoglicanos

Células pro-mielocíticas humanas

Cromatografia líquida de alta performance

Heparam sulfato

Adenocarcinoma de cólon humano

Iodeto de propídio

União Internacional de Química Pura e Aplicada

c-Jun-N-Terminal Kinase

Proteína Quinase ativada por Mitógeno

Matriz extracelular

miligrama

Mililitro

MTT

nm

OMS

ON

PBS

PDA

PGs

PS

SFB

TBS

WHO

µg

µL

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

Nanômetro

Organização Mundial de Saúde

Óxido nítrico

Tampão Fosfato Salino

1,3 diamino propano acetato

Proteoglicanos

Polissacarídeos sulfatados

Soro fetal bovino

Tampão salino Tris

World Health Organization

Micrograma

Microlitro

http://en.wikipedia.org/wiki/Di-

http://en.wikipedia.org/wiki/Di-

http://en.wikipedia.org/wiki/Thiazole

http://en.wikipedia.org/wiki/Phenyl

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

1.1 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS 17

1.1.1 Fucanas 20

1.2 CÂNCER X MORTE CELULAR: UMA VISÃO GERAL 26

1.3 FUCANAS ANTIPROLIFERATIVAS 28

1.4 MATRIZ EXTRACELULAR 29

1.5 INTEGRINAS E SINALIZAÇÃO INTRACELULAR 31

2 OBJETIVOS 35

3 MATERIAIS E MÉTODOS 36

3.1 MATERIAIS 36

3.1.1 Material biológico 36

3.1.2 Linhagens celulares e cultura das células 37

3.1.3 Outros materiais 37

3.1.4 Aparelhos 38

3.2 MÉTODOS 39

3.2.1 Extração e purificação da fucana B 39

3.2.1.1 Obtenção do pó cetônico 39

3.2.1.2 Proteólise 39

3.2.1.3 Fracionamento com concentrações crescentes de acetona 40

3.2.1.4 Cromatografia em coluna de troca iônica 40

3.2.2 Caracterização química dos polissacarídeos obtidos 42

3.2.2.1 Eletroforese em gel de agarose 42

3.2.2.2 Composição monossacarídica 42

3.2.2.3 Dosagem de açúcares totais 42

3.2.2.4 Dosagem de sulfato 42

3.2.2.5 Dosagem de proteínas 43

3.2.2.6. Espectroscopia de infravermelho 43

3.2.3 Atividade antiproliferativa 43

3.2.3.1 MTT 43

3.2.3.2 Incorporação de bromo-deoxi-uridina (BrdU) 44

3.2.3.3 Marcação com Anexina V-FITC e iodeto de propídio 44

3.2.3.4 Western blotting 45

3.2.4 Dessulfatação dos polissacarídeos 46

3.2.5 Análise estatística 46

4 RESULTADOS 47

4.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA

SPATOGLOSSUM SCHRÖEDERI 47

4.2 PURIFICAÇÃO DA FUCANA B POR CROMATOGRAFIA DE

TROCA-IÔNICA 48

4.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES DE FUC B 48

4.4 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO DAS FUCANAS 49

4.5 EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DAS FUCANAS EM CÉLULAS CHO-K1

E CHO-745 50

4.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DE FUC B 2 EM CÉLU-

LAS CHO-K1 ATRAVÉS DA INCORPORAÇÃO DE BrdU 51

4.7 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPOS SULFATO NA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2 52

4.8 LOCALIZAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DE FUCB 2 53

4.9 IDENTIFICAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA FUCANA 55

4.10 MARCAÇÃO UTILIZANDO ANEXINA V E IODETO DE PROPÍDEO 61

4.11 ANÁLISE DO CICLO CELULAR 62

5 DISCUSSÃO 64

6 CONCLUSÃO 71

7 REFERÊNCIAS 72

17

INTRODUÇÃO

Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

1. INTRODUÇÃO

1.1 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

Polissacarídeos sulfatados (PS) são polímeros de açúcar cujos resíduos

podem apresentar como substituinte o grupamento SO3 ligados covalentemente

ao oxigênio remanescente de uma hidroxila, o que leva a formação do grupo SO4

(sulfato). Em muitos casos a substituição pode ocorrer em mais de uma posição

no resíduo, originando os resíduos di ou trissulfatados, porém não há registros de

resíduos naturalmente tetrassulfatados. Há relatos de vários tipos de

monossacarídeos, sulfatados ou não, encontrados em PS, como fucose, xilose,

manose, glicose, arabinose, galactose (Li et al., 2008, Wijesekara et al., 2011),

glucosamina, ácidos urônicos (Nader et al., 2004). Estes resíduos podem ser

unidos pelos organismos para formarem homo e heteropolissacarídeos

sulfatados. Além disso, há relatos da presença de outros substituintes, além do

sulfato, como grupos acetis, aminos, piruvato (Farias et al., 2008, Wijesekara et

al., 2011). Estes fatores, em conjunto, fazem dos PS moléculas muito complexas,

o que dificulta a proposta de estruturas destes compostos, mas por outro lado dá

aos PS um grande potencial farmacológico e biotecnológico (Rocha 1998, Rocha

et al., 2001).

Apesar dos polissacarídeos serem encontrados na quase totalidade dos

seres vivos da Terra, os PS apresentam uma distribuição mais restrita. Eles são

encontrados em todas as espécies de animais, desde esponjas até humanos

(Medeiros et al., 2000); e de algas marinhas (Jiao et al., 2011; Rocha et al.,

2006). Todavia, em outros grupos de seres vivos há raros relatos de sua

presença. Como por exemplo, há o registro da presença de PS em apenas sete

espécies de vegetais, sendo três vegetais de origem marinha (Aquino et al. 2005,

Costa, 2008), três macrófitas de ambiente dulcícola (Dantas, 2007) e um de

origem terrestre (Choosawad et al., 2005).

Em animais, os principais PS encontrados são denominados de

glicosaminoglicanos devido ao fato de apresentarem, na sua estrutura resíduos

de açucares aminados (glucosamina ou galactosamina). São descritos como

glicosaminoglicanos os seguintes polissacarídeos: heparan sulfato, queratan

sulfato, heparina, dermatan sulfato, condroitim sulfato, ácido hialurônico (Nader te

18

INTRODUÇÃO


al., 2004) e acharan sulfato, este último descrito apenas no molusco Achatina

fulica (Park et al., 2008).

Os glicosaminoglicanos, com exceção do ácido hialurônico e do acharan,

aparecem unidos covalentemente a um esqueleto protéico, formando moléculas

denominadas proteoglicanos (PGs). Estes são glicoconjugados encontrados

intracelularmente em grânulos secretórios, na superfície celular, matriz

extracelular e membrana basal. Os proteoglicanos são, portanto, compostos de

alta massa molecular, formados por um esqueleto protéico ao qual se ligam

covalentemente, cadeias de glicosaminoglicanos e oligossacarídeos N- e/ou O-

ligados (Bernfield et al., 1999).

A atividade biológica de cada proteoglicano depende das propriedades do

seu esqueleto protéico, da estrutura química do(s) glicosaminoglicano(s)

covalentemente ligado(s) e sua localização. Os PGs desempenham importantes

papéis biológicos, entretanto são as cadeias de GAGs que determinam a função

dessa classe de moléculas (Teocharis et al., 2010).

O estudo de suas funções biológicas utilizando animais transgênicos tem

indicado que certos proteoglicanos são essenciais para a vida (Teocharis et al.,

2010). Atualmente, são conhecidos mais de 30 tipos diferentes de proteoglicanos,

os quais exercem uma grande variedade de funções biológicas, tais como:

organização de tecido; crescimento celular; maturação de tecidos especializados;

têm um importante papel na formação e permeabilidade de membrana;

modulação da atividade de determinados fatores de crescimento; regulação da

hidrólise de colágeno; crescimento e invasão tumoral; adesão, proliferação,

diferenciação e migração celular; alterações morfológicas durante o

desenvolvimento, remodelagem e mudanças ocorridas durante o ciclo celular;

transparência da córnea; crescimento de neuritos; bem como em patologias

cardiovasculares, diabetes, doenças amilóides, mucopolissacaridoses e

interações com patógenos; entre outras funções. (Teocharis et al., 2010).

Os polissacarídeos de algas se localizam na matriz mucilagenosa desses

organismos e sua função biológica parece estar relacionada com a proteção

contra desidratação solar em períodos de baixa maré. Além disso, oferece uma

maior flexibilidade à alga, permitindo assim, o seu crescimento em ambiente

aquático, e uma rigidez suficiente para permanecer estendida e assim captar a luz

e os nutrientes com mais eficácia (Percival & McDowell, 1967). Recentemente, foi

19

INTRODUÇÃO


proposto que a presença dos PS em algas também seria uma forma de

adaptação destes organismos ao ambiente marinho, ao stress salino, já que eles

não são encontrados em vegetais terrestres, salvo algumas exceções (Aquino,

Gravitol & Mourão, 2011).

As estruturas dos PS de algas marinhas variam de acordo com cada

espécie, além disso, algumas espécies sintetizam mais de um tipo de PS (Dietrich

et al., 1995; Li et al.,2008, Bilan et al., 2002, Jiao et al., 2011). Vale salientar

também que cada um dos três grandes grupos de macroalgas sintetiza um grupo

peculiar de polissacarídeos que lhes são inerentes.

Nas algas vermelhas encontram-se agaranas, carragenanas e outros tipos

de galactanas sulfatadas. Porém, há alguns raros relatos da presença de outros

tipos de polissacarídeos sulfatados que podem ser encontrados nas algas

vermelhas como xilomananas sulfatadas (Cardoso et al., 2007) e

glucogalactomanana sulfatada (Lim & Ryu 2009). Estes polissacarídeos

geralmente são utilizados pela indústria alimentícia e cosmética, principalmente

devido a suas propriedades espessantes e gelificantes. Todavia, existem vários

relatos na literatura sobre atividades farmacológicas atribuídas a galactanas de

algas vermelhas como antiviral (Huheihel et al., 2002; Zhou et al., 2004),

antiparasitária (Adams et al., 2005), antiinflamatória (Zvyagintseva et al., 2000) e

bactericida (Medina, 2001).

Os polissacarídeos sulfatados de algas verdes são ricos em galactose,

manose, xilose, glicose, arabinose e/ou ácidos urônicos (Matsubara, 2004), porém

já foram descritos homopolissacarídeos como arabinanas (Hayakawa et al., 2000)

e galactanas (Farias et al., 2008). Sua importância farmacológica foi evidenciada

por se ter verificado as atividades antiviral, anticoagulante e antitumoral,

entretanto, o número de trabalhos realizados com estes polissacarídeos ainda é

pequeno quando comparado com aqueles descritos para PS de outras algas.

Ultimamente, vários trabalhos têm relatado a estrutura molecular de

polissacarídeos de algas verdes, o que poderá facilitar a elucidação dos

mecanismos de ação destes compostos, bem como a relação atividade/estrutura

(Bilan et al., 2007; Farias et al., 2008; Lahaye & Robic, 2007).

As algas marrons sintetizam homo e heteropolímeros que apresentam na

sua composição L-fucose sulfatada. As fucanas são os PS de algas mais

estudados (Pomin, 2010).

20

INTRODUÇÃO


1.1.1 Fucanas

O termo fucana pode ser utilizado para definir um polissacarídeo que

apresenta na sua composição L-fucose sulfatada (Rocha et al., 2006, Almeida-

Lima et al., 2010). Devido à existência de homo e heterofucanas a IUPAC

recomenda que o termo fucana seja utilizado para definir uma molécula que

contem mais de 90% de fucose, já aqueles polímeros que contém menos de 90%

de fucose sejam denominados de fucoidan (Berteau & Mulloy, 2003). Contudo, a

questão de nomenclatura das fucanas ainda não está totalmente definida. Um

exemplo clássico é o de homofucanas extraídas da alga Fucus vesiculosus, que

devido ao nome da alga são chamadas de fucoidans (Jiao et al., 2011).

Além das algas marrons as fucanas também foram encontradas na camada

de geléia de ovos de ouriços do mar e também da parede do corpo de pepinos do

mar (Pomin, 2010).

Estes polissacarídeos foram primeiramente isolados de algas marinhas no

início do século XX (Berteau & Mulloy, 2003). A fucana mais estudada e

comumente utilizada é o fucoidan de Fucus vesiculosus a qual é comercializado

há décadas e que teve sua estrutura caracterizada inicialmente por Percival e

Ross (1950), porém foi reavaliada por Patankar e col. (1993). Fucanas foram

descritas em diversas ordens de algas marinhas pardas como, por exemplo,

Dictyotales, Fucales, Laminariales, Chordariales, Ectocarpales (Tabela 1).

Fucanas encontram-se presentes em todas as algas pardas até agora estudadas.

Por outro lado não são encontradas nos demais grupos de algas marinhas como

algas verdes e vermelhas (Rocha et al.,2006).

21

INTRODUÇÃO


Tabela 1. Fucanas encontradas em algas marrons

Ordem Gênero Fucanas xilofucoglucuronanas Glucuronogalactofucanas

e/ou glucuronofucogalactanas

Ectocarpales Ectocarpus + Sorocarpos + +

Chordariales Chorda + + Heterochordaria + Leathesia + Nemacystus + Sphaerotrichia + Tinocladia +

Desmerestiales Desmarestia + + + Dictyosiphonales Asperococcus + Seytosiphonales Colpomenia +

Scytosiphon + + Sphacelariales Stypocaulon + Dictyotales Canistrocarpus + +

Dictyopeteris + + Dictyota + Lobophora + + Padina + + Taonia +

Spatoglossum + + Laminariales Alaria +

Ecklonia + Eisenia + + Kjellmaniella + + Laminaria + Lessonia + + Macrocystis + Nereocystis + Undaria + + Ascophyllum + + +

Fucales Bifurcaria + + Fucus + + Halidrys + Himanthalia + + Hizikia + Pelvetia + + Sargassum + + Turbinaria + +

Modificada a partir Kloareg & Quatrano (1988)

O grupo em que está inserido este trabalho tem estudado a presença de

fucanas em diversas espécies de algas marrons encontradas no litoral do Rio

Grande do Norte. A metodologia utilizada combina precipitação com solvente

apolar, cromatografia de troca iônica, gel filtração e eletroforese em gel de

agarose com tampão 1,3 diaminoacetato (Dietrich et al., 1995; Leite et al., 1998;

Rocha et al., 2005). Assim, se confirmou que todas as algas até agora estudadas

sintetizam mais de um tipo de fucana e que estas apresentam mobilidades

diferentes em gel de agarose. Atualmente, estas fucanas são denominadas de

acordo com sua mobilidade eletroforética: fucana A (menor mobilidade), fucana B

22

INTRODUÇÃO


(mobilidade intermediária) e fucana C (maior mobilidade) (Rocha et al., 2005). Na

figura 1 observam-se as três fucanas sintetizadas pela alga Spatoglossum

schröederi.

Figura 1. Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C da alga

Spatoglossum schröederi. Foram aplicados 50 µg de cada fucana e após a corrida foram

coradas com azul de toluidina. Fuc A – fucana A; Fuc B – fucana B; Fuc C - fucana C. Fonte: Hugo

A O Rocha (Rocha, 2002)

As fucanas são os PS de origem não animal mais estudados (Pomin, 2010)

devido ao seu grande potencial farmacológico. Na Tabela 2 têm-se resumo de

algumas das atividades atribuídas as fucanas.

23

INTRODUÇÃO


Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de polissacarídeos sulfatados extraídos de algas.

Atividade Alga Referência

Anti-adesiva S. schröederi, Ascophyllum nodosum (Rocha, Franco et al., 2001), (Liu et

al., 2005) Anti-adipogênica Fucus vesiculosos (Kim, K. J., Lee, O. H. et al., 2010)

Anti-angiogênica F. vesiculosos, A nodosum, (Cumashi, Ushakova et al., 2007)

Anticoagulante Dictyota menstrualis, Laminaria japônica, Canistrocarpus cervicornis, F. vesiculosus

(Albuquerque, Queiroz et al., 2004); (Wang, Zhang et al., 2010); (Câmara, Costa et al., 2011) (Azevedo et al., 2009)

Anticomplemento A. nodosum, Laminaria cichorioides (Tissot e Daniel, 2003); (Zvyagintseva, Shevchenko et al., 2000)

Anti-inflamatória Laminaria saccharina, Fucus evanescens, Lobophora variegata, F. vesiuclosus

(Cumashi, Ushakova et al., 2007) (Cardoso et al., 2010)(Medeiros et al., 2007)

Antimetastática F. vesiculosos (Coombe, Parish et al., 1987)

Antioxidante L. variegata, Padina gymnospora, C. cervicornis, Dictyoperis delicatula, Sargassum filipendula

(Olalye & Rocha, 2007; Paiva et al., 2011;Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011)

Antiproliferativa C. okamuranus, F. vesiculosos, S. filipendula, D. delicatula

(Teruya, Konishi et al., 2007); (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009)(Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011)

Antitrombótica S. schröederi (Leite, Medeiros et al., 1998), (Barroso

et al., 2008)

Antitumoral Sargassum stenophillum, F. vesiculosos

(Dias, Siqueira et al., 2005); (Zhou, Sun et al., 2004); (Kim, K. J., Lee, O. H. et al., 2010)

Anti-úlcera F. vesiculosos (Shibata, 2003)

Antiviral (HIV, Dengue 2, HSV 1 e 2)

C. okamuranu, Cystoseira indica (Hidari, Takahashi et al., 2008); (Mandal, Mateu et al., 2007)

Estimulo da síntese de heparan sulfato

S. schröederi (Rocha et al., 2005); (Rocha, Bezerra et al., 2005)

Hepatoprotetora F. vesiculosos (Hayashi, Itoh et al., 2008)

Proliferativa Capsosiphon fulvescens, A. nodosum

(Go, Hwang et al., 2010); (Jiang, Okimura et al., 2010)

Adaptado de ROCHA (2006)

Apesar deste grande número de atividades atribuídas as fucanas, os

estudos estruturais não caminham na mesma velocidade. Parte deste problema

existe devido à complexidade estrutural que as fucanas apresentam, e ainda,

devido a pouca capacidade que as técnicas existentes atualmente têm para

elucidar as estruturas das fucanas (Li et al., 2008). Apesar disto as estruturas das

fucanas A e B de S. schröederi foram propostas (Leite et al., 1998; Rocha et al.,

2005).

A fucana A de S. schröederi é uma molécula de 21 kDa, é composta por

um esqueleto de ácido glucurônico unidos por ligações β(1-3), com ramificações

em C-4 formadas por trissacarídeos de fucose unidos por ligações α(1-3). A

maioria dos resíduos de fucose geralmente é substituída em C-4 com

24

INTRODUÇÃO


grupamentos sulfato, e algumas ainda são substituídas em C-2 por dissacarídeos

de xilose unidos por ligações β(1-4). 50 % das xiloses são sulfatadas. A estrutura

proposta para a Fuc A está representada na figura 2. Essa fucana A apresenta

uma baixa atividade anticoagulante, entretanto possui efeito antitrombótico in vivo

(Barroso et al., 2008). Foi proposto que esta atividade estava relacionada com a

capacidade desta fucana em estimular células endoteliais a sintetizarem heparam

sulfato (Leite et al.,1998). Além disso, foi demonstrado que essa fucana não

apresenta potencial genotóxico ou mutagênico (Almeida-lima, 2010).

Figura 2. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998) para a fucana A da alga S.

schröederi.

A fucana B por sua vez, trata-se de uma xilogalactofucana de 21,5kDa

composta por um esqueleto de galactoses unidas por ligações β(1-4), sendo que

50 % delas encontra-se sulfatada em C-3. Há ramificações em 25% dos resíduos

de galactose, e estes são compostos por fucoses unidas por ligações α(1-4)

ligadas e sulfatadas em C-3, no terminal não redutor encontram-se um ou dois

resíduos de xilose não sulfatada (figura 3). Essa fucana também apresenta efeito

antitrombótico in vivo, embora não apresente atividade anticoagulante (Rocha et

al., 2005).

25

INTRODUÇÃO


Figura 3. Estrutura proposta para a fucana B da alga S. schröederi proposta por Rocha

[2005]

Estudos com células também foram realizados com esta fucana. Nesses

estudos, utilizou-se as linhagens de ovário de Hamster chinês CHO-K1

(selvagem) e CHO-745 (mutante). Ambas as linhagens celulares, selvagem e

mutante, mostraram-se tumorigênicas quando inoculadas na parede abdominal de

camundongos (Esko et al., 1988; Lebaron et al., 1988). O mutante CHO-745 é

deficiente na enzima xilosiltransferase, enzima que incorpora a xilose ao resíduo

de serina do “core” protéico de proteoglicanos (PG), sendo esse o primeiro passo

para a biossíntese de glicosaminoglicanos (GAGS). Assim, a síntese de heparam

sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS) pelas CHO-745 é deficiente, sendo ela

capaz de sintetizar apenas 5 % da quantidade dos GAGS sintetizados pela CHO

selvagem (Esko, 1991). Devido a tais diferenças, estas se apresentaram como

ferramentas interessantes para se avaliar o potencial efeito de compostos na

adesão celular, pois se há similaridade da potencialidade antiadesiva do

composto nas duas linhagens isto exclui de imediato a possibilidade de observar

um simples efeito de repulsão de cargas, e indica a existência de sítios

específicos para o composto exercer seu efeito. Os estudos com estas células e a

Fuc B mostram que a fucana inibe a adesão celular. Também foi observado que

quando a Fuc B foi biotinilada e utilizada como sonda fluorescente se identificou

que o alvo molecular de Fuc B se encontrava na matriz extracelular (Rocha et al.,

2005).

26

INTRODUÇÃO


1.2 CÂNCER X MORTE CELULAR: UMA VISÃO GERAL

Segundo dados da OMS (Organização Mundial de Saúde) em 2008 três

diferentes tipos de câncer (carcinoma broncopulmonar, carcinoma colo-retal e

câncer de mama) estavam entre as dez principais causas de morte nos países

desenvolvidos (WHO, 2008). Câncer é o termo utilizado para definir neoplasias,

células que proliferam de maneira anormal, malignas (King e Robins, 2006). Para

uma neoplasia, também chamada de tumor, ser considerada um câncer é

necessário que suas células tenham habilidade para invadir os tecidos adjacentes

(Alberts, Wilson et al., 2008). Essa doença é caracterizada como um processo

envolvendo três estágios diferentes: iniciação, proliferação e progressão (Rocha,

2011). A iniciação do tumor requer vários fatores que irão influenciar diretamente

na promoção do mesmo, ou seja, o crescimento desse tumor através da

proliferação das células alteradas. Durante a progressão do tumor há uma

seleção entre as células tumorais com a capacidade de crescer mais

agressivamente (Lewin, 2004). A progressão é responsável pela metástase,

caracterizada pela invasão de outros tecidos do organismo por células do tumor

original. Atualmente, o prognóstico de um câncer é preferencialmente

determinado pela progressão da metástase do câncer do que pelo tumor primário

propriamente dito (Zhu, Liu et al., 2010). Esse prognóstico também é influenciado

pelo tipo de resposta do paciente aos tratamentos utilizados e principalmente se

não há resistência a esses tratamentos. As principais terapias utilizadas no

combate ao câncer envolvem o ataque direto as células tumorais e menos

comumente a o uso de imunoestimulantes (Boon, 1993). O ataque ao tumor pode

ocorrer através de remoção cirúrgica, uso de radioterapia, e principalmente, uso

de quimioterápicos altamente tóxicos. Muitos desses fármacos apresentam

mínimos benefícios à sobrevivência do paciente, incluindo variados fatores como

resistência ao medicamento, efeitos colaterais além da elevada toxicidade

(Macdonald e Astrow, 2001; Rabik e Dolan, 2007). A grande busca dos centros de

pesquisa contra o câncer foca no problema de como promover a morte seletiva

das células cancerígenas (Fentiman, 1991; Pastan & Fitzgerald, 1991; Kim et al.,

2010).

27

INTRODUÇÃO


Nos últimos anos os compostos derivados de fontes naturais têm sido foco

de considerável atenção dos pesquisadores que procuram desenvolver agentes

terapêuticos para o combate ao câncer, devido à ausência de toxicidade que

esses compostos geralmente apresentam (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al.,

2009; Jin, Song et al., 2010). Um dos objetivos é encontrar compostos que

promovam a indução da apoptose ou parada do ciclo celular em células tumorais.

Uma das marcantes características do câncer é a inibição da apoptose, uma via

de suicídio celular universal e eficiente (Hanahan e Weinberg, 2000). O bloqueio

da morte celular programada, apoptose, contribui para o crescimento do tumor,

promove a progressão neoplásica e a resistência a agentes citotóxicos anticâncer

(Bedi, Pasricha et al., 1995). A apoptose pode ocorrer por duas vias principais

conhecidas como: Via Intrínseca ou via mitocondrial e a via extrínseca ou via dos

receptores de morte. A via intrínseca pode ser ativada por uma variedade de

estímulos apoptóticos que levam a mitocôndria liberar o citocromo c para o

citoplasma. As duas vias convergem para ativação da caspase 3 e

subseqüentemente na ativação de outras proteases e nucleases que coordenam

os eventos terminais da apoptose (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009;

Jin, Song et al., 2010; Kim, Park et al., 2010). A via extrínseca, por sua vez, é

ativada através da ligação de ligantes indutores de morte aos respectivos

receptores presentes na superfície celular o que desencadeia todo um processo

com ativação de outros mensageiros no interior da célula culminando na morte

celular. Outra forma de interromper a progressão do crescimento de tumores é

através da parada do ciclo celular das células cancerígenas. Existem vários

fatores relacionados à progressão ou parada do ciclo de uma célula. Dentre esses

fatores podem-se destacar os checkpoints que nada mais são do que pontos

específicos durante o ciclo celular em que a célula realiza uma checagem de sua

maquinaria e material genético para poder prosseguir para a próxima fase (Alberts

et al., 2008). Existem várias vias associadas ao controle da progressão do ciclo

celular. Uma das mais conhecidas e estudadas é a via da MAPK (Mitogen-

Activated Protein Kinase) que abrange proteínas como a MEK (Mitogen-Activated

Proteín Kinase Kinase), ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase) e JNK (c-

Jun N-terminal kinase) (Jin et al., 2010; Kim et al., 2010; Wei, Xie et al., 2010).

Outras proteínas estão também diretamente envolvidas como as ciclinas e as

ciclinas dependentes de kinases, conhecidas como CDKs, que se associam para

28

INTRODUÇÃO


controlar a progressão do ciclo celular (Braun, Holzl et al., 1998; Wei, Xie et al.,

2010). Em linhas gerais, o destino de uma célula é dependente de estímulos

internos e externos que afetem sua integridade e que podem levar a uma parada

total da progressão do seu ciclo celular assim como também pode culminar no

processo apoptótico.

1.3 FUCANAS ANTIPROLIFERATIVAS

O efeito antiproliferativo “in vitro” de fucanas frente a diversas linhagens

tumorais já vem sendo estudado há um longo tempo. Como, por exemplo, pode-

se citar o efeito antiproliferativo de fucanas frente a células oriundas de carcinoma

broncopulmonar (Riou, Colliec-Jouault et al., 1996), hepatoma (Nagamine,

Hayakawa et al., 2009), carcinoma de Ehrlich (Zhuang, Itoh et al., 1995),

adenocarcinoma de mama (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009),

carcinoma de cervix uterino (Costa, Telles et al., 2011), leucemia (Jin, Song et al.,

2010), câncer de colo retal (Kim, Park et al., 2010) e linfoma (Aisa, Miyakawa et

al., 2005). Sua ação sobre a proliferação celular ocorre principalmente por duas

maneiras: promove parada do ciclo celular e/ou induz morte celular, Porém os

estudos aqui citados mostram que esse efeito antiproliferativo se dá devido a uma

ação direta das fucanas. Relata-se também que para que esses PS

desempenhem seus efeitos nas células o teor de sulfato presente em suas

moléculas é de importância crucial (Koyanagi, Tanigawa et al., 2003; Haroun-

Bouhedja, Ellouali et al., 2000)

A fucana mais estudada com relação ao seu mecanismo de ação

antiproliferativo é a fucana de F. vesiculosus conhecida como fucoidan. Este PS

promove a ativação de caspase-3, o que consequentemente induz apoptose de

células de linfoma humano (HS-sultan cells). Contudo, quando estas células

foram incubadas com fucoidan e um inibidor de caspases concomitantemente,

observou-se que o efeito do fucoidan foi parcialmente anulado. Os autores

mostraram que o fucoidan não afetava a via da p38 quinase e da AKT, mas

diminuía a fosforilação de ERK (Extracellular Regulated-Kinase) e que este efeito

também levava as células entrarem em apoptose (Aisa et al., 2005). Quando este

fucoidan de F. vesiculosus foi avaliado com células de carcinoma de colo humano

(HCT-15), observou-se que também estimulava apoptose nas HCT-15 por ativar

29

INTRODUÇÃO


caspases. Contudo, nestas células o fucoidan, ao contrario do visto

anteriormente, aumentava a fosforilação de ERK e de p38 quinase e bloqueava a

via da PI3K/AKT. Os dados mostraram que este efeito era responsável pela

atividade antiproliferativa do fucoidan (Hyun, Kim et al., 2009). Já quando o

mecanismo antiproliferativo deste mesmo fucoidan foi avaliado em células pro-

mielocíticas humanas (HL60), verificou-se que além de ativar as caspases e

aumentar os níveis de fosforilação de ERK, o efeito antiproliferativo do fucoidan

também era dependente do aumento da produção de Óxido Nítrico (ON) e da

diminuição dos níveis de glutationa citoplasmáticos (Jin et al., 2010). Por outro

lado, em células de câncer de colo humano (HT-29), o fucoidan não modificou os

níveis de fosforilação de ERK, porém verificou-se que o fucoidan ativava

caspases, promovia a liberação de fatores mitocondriais pró-apoptóticos

(citocromo C e Smac/Diablo) para o citoplasma e aumentava os níveis de “death

receptor 5 proteins”. Em suma, o mecanismo antiproliferativo do fucoidan nas

células HT-29 é mediado por duas vias: a via mitocondrial (intrínseca) e a via

ativada por receptores de morte (extrínseca) (Kim et al., 2010).

Ainda não se conhecem todos os mecanismos intracelulares que as

fucanas usam para desempenhar suas atividades antiproliferativas. O motivo

principal é a sua diversidade estrutural e o fato desses polissacarídeos poderem

se associar a uma gama de moléculas. Contudo, parece que esse efeito

antiproliferativo não é somente dependente do sulfato presente nas fucanas, mas

também da distribuição desses grupamentos na molécula (Li et al., 2008;

Wijesekara et al., 2011), uma vez que algumas delas não apresentaram efeito

frente algumas linhagens de células tumorais, apesar de serem sulfatadas,

enquanto que outras fucanas se mostraram bastante eficazes (Ellouali et al.,

1993).

Apesar das fucanas apresentarem atividade antiproliferativa em diferentes

tipos celulares e em alguns casos existir semelhança entre os seus mecanismos

de ação, a maioria dos trabalhos existentes na literatura utilizaram o fucoidan de

F. vesiculosus e devido às diferenças estruturais esse mecanismo de ação não

pode ser generalizado para fucanas presentes em outras espécies de algas.

30

INTRODUÇÃO


1.4 MATRIZ EXTRACELULAR

A matriz extracelular (MEC) é uma rede intrincada de macromoléculas que

preenchem o volume de um tecido ou órgão no espaço extracelular. Essa matriz é

composta por uma variedade de proteínas versáteis e polissacarídeos que são

secretados localmente e montados em uma organizada rede em uma íntima

associação com a superfície das células que a produz. A matriz extracelular é

produzida pelas células epiteliais e outras células estromais encontradas na

própria matriz como, por exemplo, fibroblastos. Cada tipo de tecido possui uma

matriz extracelular característica com relativas quantidades de cada tipo de

moléculas de matriz. Essa variação dá origem a uma diversidade de estruturas

adaptadas para a função de cada tecido específicamente (Alberts et al., 2008)

Para que as células desempenhem normalmente suas funções, precisam

estar apropriadamente suportadas, estabelecendo contato com as células

vizinhas e/ou com a matriz extracelular. A MEC provém muito do suporte

estrutural disponível para as células parenquimais nos tecidos. A proteína

primária presente na matriz é o colágeno, uma proteína estrutural helicoidal com

cerca de 30 tipos (Kim et al., 2011). A função primária do colágeno é agir como

suporte estrutural com regiões de ligação a outras proteínas da MEC. Juntamente

com o colágeno a elastina é a principal proteína estrutural da matriz extracelular

(Kielty, Sherratt et al., 2002). Esta proteína responde pela flexibilidade inerente a

diversos tecidos. A MEC contém também algumas proteínas adesivas que

possuem múltiplos domínios, cada uma com sítios específicos de ligação para

outras macromoléculas de superfície e para receptores de superfície celular.

Assim, essas proteínas assim contribuem para a organização da matriz e auxiliam

na adesão das células. A mais bem caracterizada dessas proteínas é a

fibronectina (FN). Esta é uma glicoproteína encontrada em todos os vertebrados.

A FN é um dímero composta de duas imensas subunidades unidas por um par de

pontes dissulfeto (Lehninger et al., 2008; Alberts et al., 2008). A fibronectina

participa diretamente da adesão celular, migração, invasão e sobrevivência

celular através da ligação aos receptores de membrana conhecidos como

integrinas (Kamarajan & Kapila, 2007).

O principal tipo de comunicação entre as células e as moléculas da matriz

extracelular ocorre através da ligação dessas moléculas às integrinas presentes

31

INTRODUÇÃO


na superfície celular como mostrado na figura 4 (Alberts et al., 2008; Zhao &

Guan, 2009). Essa comunicação é responsável pela exposição da célula a fatores

que resultarão em proliferação celular, diferenciação ou parada no crescimento

dependendo do repertório de integrinas que foi ativado assim como a constituição

da matriz extracelular a qual aderiu. Entretanto a natureza desses sinais integrina-

específicos e o mecanismo pelo qual está acoplado a maquinaria celular ainda

não é completamente compreendido (Mettouchi et al., 2001).

Figura 4. Interações entre célula e matriz extracelular. A associação entre células e proteoglicanos da matriz extracelular é mediada pela proteína de membrana (Integrina) e pela proteína da matriz (fibronectina neste exemplo). Adaptado de Lehninger (2005).

1.5 INTEGRINAS E SINALIZAÇÃO INTRACELULAR

A família das integrinas é a maior classe de mediadores da adesão da

célula à matriz extracelular compreendendo proteínas heterodiméricas formadas

por duas subunidades α e β, as quais são glicoproteínas trasmembranares com

um pequeno domínio citoplasmático que se comunica com o citoesqueleto de

32

INTRODUÇÃO


actina no interior da célula (figuras 4 e 5), formando uma estrutura denominada

contato focal (Zhao e Guan, 2009; Guan, 2010). Uma vez perdida essa interação

entre célula e a matriz a célula entra em “anoikis”, um processo de morte celular

induzido por desprendimento da célula da matriz e perda das interações dos

contatos focais, daí a importância dessa interação (Demers, Thibodeau et al.,

2009; Benoit, Larrivee et al., 2010; Gagne, Groulx et al., 2010).

Figura 5. Estrutura das subunidades da integrina, um receptor de superfície para matriz extracelular. Adaptado de Alberts (2008).

Além do grupo de integrinas, múltiplas moléculas de sinalização estão

presentes na adesão focal. A principal dessas moléculas é a FAK (Quinase de

Adesão Focal). A FAK é uma proteína quinase citoplasmática não receptora

predominantemente localizada nas adesões focais de células aderentes. A FAK

possui um importante papel em diversos processos biológicos em células normais

e cancerígenas (figura 6) fazendo com que essa proteína seja um alvo potencial

na terapia contra o câncer (Hao et al., 2009; Benoit et al., 2010; Guan, 2010). A

adesão celular mediada por integrina é o principal evento ativador da FAK. A FAK

ativada encontra-se no estado fosforilada, para sua ativação completa é

33

INTRODUÇÃO


necessária a fosforilação de pelo menos seis sítios de tirosina em diferentes

regiões da proteína. Uma vez ativada a FAK participa da regulação de processos

celulares que envolvem apoptose, migração e diferenciação celular, progressão

do ciclo celular e proliferação (Hao et al., 2009; Zhao & Guan, 2009). A

fosforilação específica do resíduo de tirosina 925 leva a um acoplamento da FAK

a outra molécula de sinalização chamada Grb2 o que resulda na ativação da via

de sinalização Ras-MAPK (Demers, Thibodeau et al., 2009; Zhao e Guan, 2009;

Guan, 2010). Essa via é responsável por diferentes processos relacionados à

sobrevivência e progressão do ciclo celular (Zhao & Guan, 2009).

Figura 6. Via de sinalização da FAK em funções celulares normais e no câncer. FAK é ativada através da ligação da matriz extracelular às integrinas. A FAK ativada irá ativar outras vias que regulam a sobrevivência da célula e apoptose, além da progressão do ciclo celular, diferenciação e proliferação. Adaptado de Zhao & Guan (2009).

A via da MAPK é uma via amplamente estudada devido sua singularidade.

O nome da família das MAP quinases reflete diretamente na sua identificação

como proteíno-quinases ativadas por mitogenos (do inglês, mitogen-activated

protein kinases). Um dos principais efeitos da ativação da Ras é convergir para a

ativação dessa via. A via da MAPK é caracterizada por uma cascata que se inicia

com a ativação da MEK até os produtos finais que irão determinar os efeitos na

célula. Cada quinase é responsável por fosforilar outras proteínas alvo as quais,

por sua vez, irão seguir uma cascata de fosforilações. Resultando na ativação de

fatores de transcrição que desencadeiam mudanças no fenótipo celular variando

de crescimento, diferenciação ou até mesmo morte celular (Lewin, 2004).

Dentre as proteínas que formam a via da MAPK encontra-se a ERK que

está relacionada com as principais funções desempenhadas pela célula. A

inibição da fosforilação de ERK foi associada à morte celular por apoptose

(Pukac, Carter et al., 1997; Religa, Kazi et al., 2000; Aisa, Miyakawa et al., 2005).

Entretanto outros autores afirmam que a ativação da via envolvendo a fosforilação

34

INTRODUÇÃO


de ERK leva também a apoptose (Nabeyrat, Jones et al., 2003; Schweyer, Soruri

et al., 2004; Li, Liu et al., 2005; Liu, Mao et al., 2008; Kim, W. J., Lee, S. J. et al.,

2010).

Existe a possibilidade de varias respostas celulares desencadeadas

através da ativação da Via Ras-MAPK, como já citado anteriormente. O

mecanismo exato associado a cada tipo de resposta decorrente da ativação da

família da MAPK não está completamente compreendido. Entretanto acredita-se e

há comprovações parciais de que essas respostas estão diretamente

relacionadas ao tempo e intensidade do estímulo ativador da via e a localização

da ERK, se citoplasmática ou nuclear (Lewin, 2004; Cagnol e Chambard, 2010).

Foi visto também que a morte celular seja esta por apoptose, ativada pela via

intrínseca ou extrínseca, autofagia ou senescência está diretamente relacionada a

uma ativação de ERK atipicamente prolongada (Cagnol e Chambard, 2010).

O grupo em que está inserido este trabalho vem dando ênfase à

prospecção de fucanas com diversas atividades incluindo antioxidante,

antiproliferativa e antinflamatoria (Costa, Fidelis et al., 2010; Paiva et al.,

2011;Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011). Uma das

fucanas mais estudadas pelo grupo é uma fucana extraída da alga Spatoglossum

schröederi. Esta molécula é denominada fucana B (Fuc B), e foi inicialmente

denominada de banda B por Leite (1995). Esta fucana foi capaz de inibir a adesão

de células CHO-K1 e CHO-745 sobre fibronectina (Rocha et al., 2001, Rocha et

al., 2005). Contudo, os trabalhos com a Fuc B com relação a seu efeito nas

células CHO não tiveram continuidade. Nesta trabalho, resgataram-se os estudos

dos efeitos da Fuc B sobre as células CHO.

35

INTRODUÇÃO


2. OBJETIVOS

2.1 Principal

Este trabalho tem como objetivo geral a extração, purificação e

caracterização de uma fucana obtida da alga Spatoglossum schröederi e a

análise de seu efeito antiproliferativo sobre células tumorigênicas de ovário de

hamster chinês (CHO).

2.2 Específicos

- Avaliar o efeito antiproliferativo da fucana B em células tumorigênicas de ovário

de hamster chinês (CHO).

- Desvendar o mecanismo ativado pela fucana B identificando o alvo molecular

desse composto.

47

DISCUSSÃO


4. RESULTADOS

4.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA

SPATOGLOSSUM SCHRÖEDERI

A extração baseada na proteólise com a enzima prozima seguida de uma

precipitação seqüencial com volumes crescentes de acetona resultou na obtenção

de sete frações polissacarídicas (F0.5; F0.6; F0.7; F0.9; F1.1; F1.3 e F2.0).

Realizada a eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de toluidina

verificou-se (figura 9) que estas frações apresentavam diferentes populações de

polissacarídeos.

Como se pode observar existe uma relativa variedade entre as frações,

devido à presença de populações distintas de polissacarídeos sulfatados

chamados de fucanas. Os PS precipitados com os menores volumes de acetona

correspondentes as frações F0.5 e F0.6 são ricas em Fuc A, a F0.7 contém uma

mistura de Fuc A e Fuc B, enquanto a F0.9V é rica quase exclusivamente em Fuc

B, já as frações F1.1 e F1.3 apresentam-se enriquecidas tanto em Fuc B como

em Fuc C e a fração F2.0 tem como principal característica a presença massiva

de Fuc C.

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas.Foram aplicados 50μg de cada fração em cada poço. Fuc A- Fucana A; Fuc B- Fucana B; Fuc C- Fucana C. As setas indicam a migração eletroforética típica para cada fucana.

48

DISCUSSÃO


4.2 PURIFICAÇÃO DA FUCANA B POR CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA

A fração F0.9 possui um alto teor de Fuc B sem apresentar grande

contaminação com outros tipos de polissacarídeos sulfatados e devido a isto, a

referida fração foi escolhida para purificação de Fuc B. Assim essa fração foi

submetida a cromatografia de troca iônica utilizando volumes de diferentes

molaridades de NaCl. Os PS precipitados com metanol foram secos e em seguida

quando submetidos a uma eletroforese em gel de agarose foi observado que as

três frações obtidas eram constituídas por Fuc B: F1.0M; F1.5M; F2.0M (Figura

10).

Figura 10. Eletroforese em gel de agarose das frações obtidas na cromatografia de troca iônica. Foram aplicados 50μg de cada fração. Or.-Origem. Fuc B- Fucana B.

4.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES DE FUC B

Como as frações F1.0; F1.5 e F2.0 são constituídas por Fuc B passaram a

ser denominadas de Fuc B 1; Fuc B 1.5 e Fuc B 2. As análises químicas das três

fucanas foram realizadas e os resultados estão representados na tabela 3.

49

DISCUSSÃO


Tabela 3. Composição química parcial dos polissacarídeos sulfatados obtidos da alga Spatoglossum schröederi

nd- não detectado.* P<0.05 comparado as outras frações.

Os dados mostram que Fuc B 1.5 e Fuc B 2 são moléculas muito

semelhantes em relação a sua constituição monossacarídica, sendo compostas

por fucose, galactose e xilose, porém Fuc B 2 apresenta-se mais sulfatada (19%)

do que Fuc B 1.5 (17%). Por outro lado, Fuc B 1 apresentou uma menor

quantidade de xilose em comparação com as outras duas fucanas, além disso

apresentou manose em sua constituição, monossacarídeo esse que não foi

detectado em Fuc B 1.5 e Fuc B 2. Além disso, nenhuma das três fucanas

apresentou teor de proteínas detectável em sua constituição.

4.4 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO DAS FUCANAS

A espectroscopia de infravermelho é uma técnica interessante para se

verificar a identidade de um composto. Portanto as fucanas FucB 1, FucB 1.5 e

FucB 2 foram analisadas por espectroscopia de infravermelho e os resultados

obtidos podem ser visualizados na Figura 11. Os picos mais característicos de

fucanas foram encontrados em todos os espectros: em aproximadamente 3448

cm-1 tem-se um sinal decorrente da vibração de elongação de grupos OH dos

anéis glicídicos; em aproximadamente 2931 cm-1 observa-se um sinal

correspondente a grupos C-H dos anéis glicídicos, bem como, dos grupos metis

das fucoses; por volta de 1648 cm-1 observa-se um pico correspondente a

carboxila dos ácidos urônicos, este pico se sobrepõem aos sinais de H de

moléculas de água da camada de solvatação; Os sinais em 1257, 1248 e 848 cm-

1 são provenientes da presença dos grupos sulfato, e este último indica a

presença de fucose sulfatada em posição axial no carbono 3. Uma análise mais

ampla dos espectros mostra uma quase sobreposição dos espectros de Fuc B 1.5

50

DISCUSSÃO


e Fuc B 2, indicando, como visto na análise química, como estas moléculas são

muito semelhantes.

Figura 11. Espectroscopia de infravermelho das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum

schröederi. A- Espectro obtido da Fuc B 1; B- Espectro obtido da Fuc B 1.5; C- Espectro obtido

da Fuc B 2.

4.5 EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DAS FUCANAS EM CÉLULAS CHO-K1 E

CHO-745

Com a composição química das fucanas determinada resolveu-se verificar

se as sutis diferenças detectadas influenciam na atividade antiproliferativa das

Fuc B 1; 1.5 e 2. Essa atividade foi testada utilizando células de ovário de

hamster chinês (CHO) selvagem (K1) e mutante (745). Na figura 12 pode-se

observar efeito das fucanas em ambas as células CHO-K1 (A) e CHO-745 (B).

Em contato com as células selvagens (CHO-K1) todas as fucanas diminuíram a

proliferação celular nas concentrações testadas. Porém apenas com a presença

de Fuc B 1 esse efeito foi dose-dependente, nas outras duas fucanas o efeito foi

semelhante, independentemente das concentrações testadas. Comparando os

resultados entre as fucanas pode-se verificar que não há diferença estatística

quanto a concentração de 400 µg/mL. O percentual de inibição médio de todas as

fucanas foi de aproximadamente 40%.

51

DISCUSSÃO


Figura 12. Efeito das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de diferentes células de ovário de Hamster chinês tratadas por 24 h e avaliadas por MTT. A- células CHO-K1 (linhagem selvagem). B- células CHO-745 (linhagem mutante). CTRL- Controle. * P< 0.05; ** P<0.01; *** P<0.001 quando as células tratadas são comparadas ao controle. a- P<0.001 quando a concentração de 100μg/mL é comparada a 400 μg/mL. b- P<0.05 quando comparada a 100 μg/mL. c- P< 0.01 quando comparada a 200 μg/mL. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

O efeito também foi semelhante na linhagem mutante CHO-745 (Figura

12B), porém um pouco menor, pois na presença das fucanas identificou-se uma

diminuição de aproximadamente 35% da viabilidade das células. Com esta

linhagem, apenas a Fuc B 2 apresentou efeito dose dependente. Os testes

posteriores foram realizados somente com a linhagem selvagem uma vez que os

resultados foram muitos semelhantes entre as duas linhagens.

4.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DE FUC B EM CÉLULAS

CHO-K1 POR INCORPORAÇÃO DE BrdU

Os resultados com o MTT indicam que há uma diminuição na proliferação

celular, e para se confirmar este resultado utilizou-se BrdU como marcador

proliferativo (figura 13). As fucanas inibiram a proliferação quando analisadas

52

DISCUSSÃO


através da incorporação do BrdU. Para realização deste e dos demais testes foi

utilizada somente uma concentração de 500 µg/mL uma vez que essa é próxima a

concentração que obteve os resultados mais significativos para as três frações na

análise de viabilidade por MTT. O efeito antiproliferativo verificado para as

fucanas utilizando o BrdU como marcador foi semelhante àquele observado

através do MTT ocorrendo uma inibição de cerca de 40%. Mais uma vez não

houve diferença entre as taxas de inibição de proliferação das células na

presença das três fucanas.

Ctrl Fuc B 1 Fuc B 1.5 Fuc B 20

20

40

60

80

100

120

*** ******

% p

roli

fera

ção

Figura 13. Efeito das fucanas obtidas da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de

células CHO-K1 tratadas por 24h e analisadas através da incorporação de BrdU. *** P<0.001

comparando tratados e controle. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

Até este momento, as análises físico-químicas e os testes em células

mostraram que as três fucanas apresentam propriedades muito semelhantes,

indicando que as três são compostos similares e a principal diferença entre elas é

o conteúdo de sulfato. Contudo, esta diferença no teor de sulfato não influenciou

na atividade das fucanas B. Assim, como Fuc B 2 foi obtida com maior rendimento

e como a sua estrutura já foi proposta por Rocha e colaboradores em 2005, esta

foi escolhida para os testes posteriores.

4.7 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPOS SULFATO NA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2

Como visto anteriormente a diferença entre o teor de sulfato das três

frações não foi determinante para diferenças entre o efeito antiproliferativo

53

DISCUSSÃO


apresentado por estas. Porém, para se determinar a faixa do teor de sulfato

necessária para se ter atividade antiproliferativa da Fuc B 2 esta foi submetida a

um processo de dessulfatação por 1 e 5 h. Após as dosagens de sulfato do

material resultante do processo de dessulfatação foi obtida uma fucana B com 82

% (Fuc B 2 1h) e 40% (Fuc B 2 5h) do teor de sulfato da fucana original,

respectivamente. Em posse destas fucanas dessulfatadas fez-se o ensaio

antiproliferativo realizado por incorporação de BrdU (figura 14) BrdU. Com a perda

de cerca de 20 % dos grupos sulfato a FucB já fica desprovida de sua atividade

antiproliferativa.

CTRL FucB FucB 1h FucB 5h0

20

40

60

80

100

***

% p

roli

fera

ção

Figura 14. Efeito do sulfato na atividade antiproliferativa de Fuc B 2 e suas derivadas dessulfatadas quimicamente por um período de 1h e 5h. *** P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

4.8 LOCALIZAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE

ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2.

Com intuito de verificar se Fuc B 2 necessitava se associar a alguma

molécula existente no soro fetal bovino, foi realizado um teste antiproliferativo

como descrito anteriormente e a variável que foi utilizada foi a concentração do

SFB. Os resultados deste teste estão resumidos na figura 15. Pode-se verificar

que o soro presente no meio celular quando utilizado na concentração de até 15%

não exerce influência no efeito antiproliferativo da Fuc B 2. Isto comprova que o

alvo molecular desta fucana não está presente no meio de cultivo celular.

54

DISCUSSÃO


CTRL 2.5% 5% 10%0

20

40

60

80

100

*** *** ***

% p

roli

fera

ção

Figura 15. Inibição da proliferação em células CHO-K1 tratadas com a fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi e diferentes concentrações de soro fetal bovino. ** P<0.01; *** P< 0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

Para se verificar se o alvo molecular da fucana se encontrava na matriz

extracelular, superfícies de placas de cultura foram incubadas com diferentes

moléculas de matriz extracelular, e posteriormente, sobre estas, células CHO-K1

foram cultivadas na presença de Fuc B 2. Os resultados podem ser observados

na figura 16. A fucana foi capaz de inibir a proliferação das células CHO já com

0,01mg/mL quando plaqueada sobre a fibronectina, este efeito atingiu um valor

máximo em torno de 60% na concentração em torno de 0,4mg/mL estabilizando-

se. Já quando as células CHO foram plaqueadas sobre vitronectina o efeito

inibitório de Fuc B 2 só foi observado a partir da concentração de 0,4 mg/mL e

chegou ao máximo em torno de 45% com 1,0 mg/mL. Não se observou efeito

antiproliferativo de Fuc B 2 quando colágeno I, colágeno IV ou laminina foram

utilizadas como substrato (dados não mostrados).

A partir da análise dos dados até aqui apresentados pode-se propor que o

alvo molecular de ação da Fuc B localiza-se na matriz extracelular, mais

especificamente, associando-se a fibronectina para exercer seu efeito

antiproliferativo nas células CHO.

55

DISCUSSÃO


Fibronectina Vitronectina0

20

40

60

80

0,01mg/mL

0,1mg/mL

0,2mg/mL

0,4mg/mL

0,5mg/mL

% in

ibiç

ão

Figura 16. Inibição da proliferação das células CHO-K1 plaqueadas sobre moléculas de matriz extracelular e tratadas com diferentes concentrações de Fuc B 2 por 24h. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

4.9 IDENTIFICAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA FUCANA

A fibronectina tem como principal receptor de membrana celular a integrina

α5β1. Esta integrina ativa uma gama de vias intracelulares, inclusive vias de

sobrevivência celular, por ativar a quinase de adesão focal (FAK). Como se

identificou a fibronectina como alvo molecular de Fuc B 2, resolveu-se avaliar o

efeito de Fuc B 2 sobre a FAK. Para isso, utilizou-se a técnica de western blotting.

Observa-se na figura 17 (A e B) que Fuc B 2 promoveu uma elevação nos

níveis da forma fosforilada de FAK (ativação), indicando que essa pode ser uma

proteína chave para o desencadeamento do efeito antiproliferativo da Fuc B 2.

56

DISCUSSÃO


Figura 17. Expressão de pFAK por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2 por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL. A- Expressão da pFAK em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de pFAK das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

A FAK pode levar a ativação da proteína quinase C, que é uma proteína

envolvida em várias vias celulares, inclusive sobrevivência celular. Portanto,

avaliou-se os níveis desta proteína após a exposição das células CHO-K1 a Fuc B

2. Na figura 18 (A e B) observa-se o resultado obtido utilizando-se western

blotting referente aos níveis de PKC ativa. Como pode ser visto houve um

significante aumento nos níveis de PKC após 12h de incubação das células com

Fuc B 2. Estes níveis celulares altos de PKC diminuíram e, após 48 de incubação,

voltaram a valores próximos a aqueles observados no controle.

57

DISCUSSÃO


Figura 18. Expressão de PKC por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h com Fuc B 2 na concentração de 500 µg/mL. Expressão da PKC em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de PCK das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ***P<0.001. Os resultados representam a média de três experimentos realizados em separado.

Para se certificar que a fucana agia unicamente pela via da PKC foi

utilizado um inibidor específico para essa quinase. O bisindolilmaleimido é um

inibidor reversível da PKC. Na presença de inibidor foi realizado um ensaio

proliferativo utilizando o BrdU para analisar se sua presença era capaz de

suprimir o efeito da fucana. Na figura 19 é possível verificar que apesar de haver

uma pequena diminuição no efeito da Fuc B 2 essa diminuição não foi

significativa. O que indica que a FucB 2 pode ativar a expressão de PKC durante

o seu efeito antiproliferativo, entretanto essa proteína não é determinante para

essa atividade.

58

DISCUSSÃO


Ctrl F2.0M F2.0M +BISINDOL0

20

40

60

80

100

******

% p

rolife

ração

Figura 19. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do inibidor de PKC. Ctrl- Controle Não tratado. BISINDOL- Bisindolilmaleimido. *** P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

A FAK é uma proteína que quando ativa apresenta-se fosforilada sendo

responsável pela ativação de outras proteínas de importância para as vias de

sobrevivência celular como, por exemplo, as MAP Quinases. Porém uma proteína

responsável pela ativação da via da MAPK através da ativação da FAK e que

também é alvo da PKC quando esta é ativada é a Ras. Sabendo disso, esse foi o

próximo alvo de investigação. Na figura 20 (A e B) tem-se a alteração nos níveis

de Ras seguindo o mesmo padrão de alteração da FAK e da PKC. Há uma

elevação acentuada no período de tratamento de 12 h e em seguida uma queda

no tratamento com 24h para uma normalização dos níveis em 48 h. Em seguida

as MAPKs ERK 1/2 fosforiladas foram analisadas.

Na figura 21 (A e B) pode-se observar, de forma semelhante às proteínas

investigadas anteriormente, que houve um aumento nos níveis de ERK 1/2

fosforilado (ativo) no período de 12 h com uma posterior diminuição do efeito após

48 h.

59

DISCUSSÃO


Figura 20. Expressão de Ras por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL. Expressão da Ras em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de Ras das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ***P<0.001. Os resultados representam a média de três experimentos realizados em separado.

60

DISCUSSÃO


Figura 21. Expressão de pErk 1/2 por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2 por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL. A- Expressão da pErk 1/2 em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de pErk 1/2 das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

A via que envolve a ativação da ERK 1/2 é uma via complexa na qual

também estão envolvidas outras MAPKs. A utilização de um inibidor da MAPK

MEK 1/2 foi de grande utilidade para determinar se o efeito antiproliferativo

apresentado pela fucana é regulado através dessa importante via. Na figura 22

tem-se o resultado do teste proliferativo utilizando como marcador o BrdU. Pode-

se observar que o efeito de Fuc B 2 foi quase que completamente inibido quando

o inibidor da MAPK MEK 1/2 foi utilizado, não foi detectado diferença significativa

entre a proliferação das células na presença de Fuc B 2 + inibidor e o controle.

Isso indica que a MEK 1/2 uma quinase presente anteriormente à ERK 1/2 na via

da MAPK, está diretamente relacionada à atividade antiproliferativa da fucana.

61

DISCUSSÃO


Ctrl Fuc B 2 Fuc B +PD980590

20

40

60

80

100

***

% p

rolife

ração

a

Figura 22. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do inibidor de MEK1/2. Ctrl- Controle Não tratado. PD98059- inibidor de MEK 1/2. *** P<0.001. a- Diferença significativa entre tratado com Fuc B 2 e Fuc B 2 + inibidor. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

4.10 MARCAÇÃO UTILIZANDO ANEXINA V E IODETO DE PROPÍDEO

Como a Fuc B 2 apresentou atividade antiproliferativa frente as células

CHO-K1, utilizou-se a técnica de citometria de fluxo para verificar se a fucana

estava induzindo morte celular. Para tal as células após período de incubação

com Fuc B 2 foram marcadas com anexina (indicador de apoptose) e iodeto de

propídeo (indicador de necrose). Na figura 23 têm-se gráficos representativos dos

resultados obtidos. Pode-se observar que não houve diferença significativa entre

o controle não tratado e as células tratadas tanto para os valores positivos para

anexina quanto para os valores correspondentes para iodeto de propídeo. Isso

significa que o efeito antiproliferativo de Fuc B 2 não ocorre por apoptose nem por

necrose.

62

DISCUSSÃO


Figura 23. Citometria de fluxo utilizando marcação com anexina V e iodeto de Propídeo. A- Células controle. B- células tratadas com 500 µg/mL de Fuc B 2 por 24h. FL2H- Filtro referente ao Iodeto de Propídeo. FL1H- Filtro referente a Anexina V- FITC (Fluorescein isothiocyanate). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

4.11 ANÁLISE DO CICLO CELULAR

A análise do ciclo celular é uma ferramenta importante na investigação de

compostos com atividade antiproliferativa como a fucana alvo de estudo desse

trabalho. Como se observa na figura 24 o tratamento das células CHO com a Fuc

B 2 foi capaz de alterar o ciclo celular dessas células. Houve um aumento

significativo no número de células na fase G1 enquanto ao mesmo tempo ocorreu

uma diminuição no número de células que estavam na fase S. Isso indica

claramente que a fucana age especificamente no ciclo celular levando a uma

parada do ciclo celular na fase G1.

63

DISCUSSÃO


CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 20

20

40

60

80G1/G0

S

G2/M

**

***

a

b

SubG1

Fases d

o c

iclo

celu

lar

(%)

Figura 24. Análise do ciclo celular das células CHO-K1 tratadas com a F2.0M. a- diferença na fase G1 entre tratada e controle. b- diferença na fase S entre tratada e controle. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P< 0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).

64

DISCUSSÃO


5. DISCUSSÃO

O câncer tem sido considerado um fator altamente danoso a sociedade

humana por apresentar alta taxa de mortalidade e morbidade. Porém, vale

salientar, que a palavra câncer não se refere a um tipo de doença e sim a pelo

menos mais de cem tipos de doenças correlacionadas. Estes fatores têm levado a

uma incessante busca pela descoberta e aprimoramento de ferramentas que

tenham caráter preventivo até curativo do câncer. Um das grandes frentes de

trabalho é a busca por moléculas que isoladamente ou em conjuntos com outras

possam combater ou prevenir o câncer ou seus efeitos no organismo (Bode e

Dong, 2009).

Há uma grande variedade de ferramentas utilizadas na identificação de

compostos que possam combater o câncer. A complexidade dessa doença tem

feito com que sejam utilizados testes in vitro e in vivo não só focalizados na

descoberta de compostos citotóxicos e/ou citostáticos para células tumorais, mas

também, na descoberta de compostos com outras atividades como

imunoestimuladores, antimetastáticos, antiangiogênicos, antioxidantes.

Apesar dos avanços da Química Farmacêutica, que utiliza ferramentas de

bioinformática para o desenho de novas moléculas ativas, os produtos naturais

são de longe as principais fontes de novas moléculas potencialmente utilizáveis

no tratamento e prevenção do câncer. A escolha das fontes de prospecção de

produtos naturais muitas vezes é baseada na cultura de um povo. Como exemplo,

nos países asiáticos algas marinhas (macerados, infusões, etc) vem sendo

utilizadas no tratamento do câncer ha séculos. Isto levou a procura por

compostos antitumorais em algas, dentre aqueles descobertos, pode-se citar os

polissacarídeos sulfatados, e dentre os polissacarídeos sulfatados de algas, os

estudos que mais avançaram foram aqueles referentes à fucanas (Li et al., 2008).

Seguindo nessa linha, o grupo (BIOPOL-UFRN) em que está inserido este

trabalho vem dando ênfase à prospecção de fucanas com diversas atividades

incluindo antioxidante, antiproliferativa e antinflamatoria (Costa et al., 2010;

Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011). Uma das

fucanas mais estudadas pelo grupo é uma fucana extraída da alga Spatoglossum

schröederi. Esta fucana é denominada fucana B (Fuc B), e foi inicialmente

denominada de banda B por Leite (1995). Contudo, sua estrutura molecular só foi

65

DISCUSSÃO


proposta dez anos depois, trata-se de galactofucana que contém resíduos de

xilose em sua estrutura (Rocha et al., 2005) (Figura 3). Esta fucana foi capaz de

inibir a adesão de células CHO-K1 e CHO-745 sobre fibronectina (Rocha et al.,

2001, Rocha et al., 2005). Contudo, os trabalhos com a Fuc B com relação a seu

efeito nas células CHO não tiveram continuidade. Neste trabalho, resgataram-se

os estudos dos efeitos da Fuc B sobre as células CHO.

Utilizando a mesma metodologia proposta por Rocha e colaboradores

(2005) foi possível purificar a Fuc B, que nesta dissertação foi denominada de Fuc

B 2. As análises química e de infravermelho mostraram que a Fuc B 2 é

essencialmente a Fuc B descrita por Rocha (Rocha et al., 2005). Outro fato

relevante, é que Fuc B 1 e principalmente Fuc B 1.5 também são muito

semelhantes a Fuc B 2, sendo a principal diferença entre elas o grau de

sulfatação (tabela 3).

Nos últimos anos o número de artigos publicados demonstrando fucanas

com atividade antiproliferativa aumentou consideravelmente (Nakayasu et al.,

2009; Aisa et al., 2005; Hyun et al., 2009; Costa et al., 2011; Jin et al., 2010). Com

o conhecimento a respeito da composição química das três fucanas resolveu-se

verificar se as sutis diferenças estruturais destas fucanas influenciam de alguma

forma em seus efeitos na proliferação de células de ovário de Hamster chinês

selvagem (CHO-K1) e mutante (CHO-745). Escolheu-se estas células porque a

mutante sintetiza apenas 5% da quantidade de glicosaminoglicanos sintetizados

pelas células CHO-K1 (Esko, 1991). Portanto, se fosse observado o mesmo efeito

nas duas linhagens celulares, poder-se-ia de imediato excluir um simples efeito de

repulsão de cargas ente a Fuc B e os glicosaminoglicanos da superfície das

células. Outro fato que foi relevante é que não há descrição na literatura de

estudos do efeito de fucanas frente a estas linhagens celulares. A partir dos

dados aqui apresentados pode-se propor que as fucanas apresentam efeito

antiproliferativo nas células CHO independente das linhagens utilizadas.

A quantidade e principalmente a distribuição dos grupos sulfato pela

molécula da fucana tem sido revisado por vários autores como uma das

características determinantes para que uma fucana apresente atividade

farmacológica (Li et al., 2008; Wijesekara et al., 2011). No início da década

66

DISCUSSÃO


passada Haroun-Bouhedja e col. (2000) mostram que fucanas quando foram

dessulfatadas tiveram sua atividade anticoagulante diminuída, por outro lado, a

atividade antiproliferativa contra fibroblastos CCL39 não foi afetada com a

dessulfatação. Estes dados mostraram que podem ser importantes para algumas

atividades das fucanas enquanto que para outras atividades não são tão

relevantes. Tendo-se isto em mente, avaliou-se a importância dos grupos sulfato

de Fuc B em sua atividade antiproliferativa utilizando-se três fucanas B com

diferentes graus de sulfatação: Fuc B 2 (19%), Fuc B 1.5 (17.8%), Fuc B 1

(14.1%), a as fucanas B dessulfatadas quimicamente: Fuc B 2 1h (15,%) e Fuc B

2 5h (7,6 %). Observou-se que mesmo a diferença entre o grau de sulfatação

entre Fuc B 2 e Fuc B 1 não influenciou no efeito antiproliferativo de Fuc B, pois

as duas apresentaram atividades semelhantes. Contudo, quando avaliamos Fuc B

2 1h, por exemplo. A mesma apresenta um grau de sulfatação maior do que Fuc

B 1, e mesmo assim, apresentou uma baixíssima atividade antiproliferativa. De

forma semelhante Fuc B 5h também teve um efeito muito baixo na proliferação

das células, semelhante à Fuc B 1h mesmo tendo um grau de sulfatação menor.

A técnica de dessulfatação utilizada neste trabalho promove a retirada dos grupos

sulfato de forma inespecífica. Porém, não foi possível realizar estudos estruturais

com Fuc B 2 1h, portanto, não se sabe quais grupos foram mais afetados pelo

processo de dessulfatação. Contudo, os dados indicam claramente que a

atividade antiproliferativa de Fuc B não é dependente do seu grau de sulfatação,

mas que existem grupos sulfatos que são determinantes para a sua atividade.

Estudos futuros serão realizados para se identificar quais grupos sulfatos são

importantes para estas atividades.

Tendo estes resultados em mãos e considerando também a semelhança

entre as três fucanas B e considerando que a Fuc B 2 foi obtida com maior

rendimento e como a sua estrutura já foi proposta por Rocha e col. (2005), esta foi

escolhida para os testes posteriores.

Neste trabalho, os dados obtidos com ensaio da atividade antiproliferativa

de Fuc B com diferentes concentrações de SFB mostraram que esta não precisa

se associar a nenhuma molécula do soro para inibir a proliferação das células

CHO. Vários trabalhos mostram que polissacarídeos sulfatados como heparina e

67

DISCUSSÃO


heparam sulfato podem se associar a proteínas e a outros fatores solúveis e

assim atuarem sobre diferentes linhagens celulares (Nader et al., 2005; Mulloy,

2005). Fucanas também são capazes de se associarem a diversas proteínas

como cofator II da heparina (Shanmugam & Mody, 2000) e antitrombina (Colliec et

al., 1991), e a componentes do SFB. Quando fucanas sulfatada de baixo peso

molecular foram obtidas de Ascophyllum nodosum estas apresentaram atividade

antiproliferativa sobre algumas das diversas linhagens tumorais estudadas. Foi

observado que esses compostos inibiam em 85% a proliferação celular de células

de adenocarcinoma de cólon (Colo320 DM) (Ellouali et al., 1993). Essa inibição se

mostrou reversível, dependente da concentração de soro fetal bovino (SFB) e não

estava relacionada com a internalização das fucanas (Ellouli et al., 1994).

Logeart e col. (1997) demonstraram que fucanas da alga Ascophyllum

nodosum inibem a proliferação de células de músculo liso (SMC). Neste estudo

observaram que as fucanas eram internalizadas, mas que a sua degradação não

era necessária para as fucanas apresentarem atividade. Contudo, os autores não

conseguiram comprovar se a internalização da fucana era necessária para que

esta desenvolvesse seu efeito. Por outro lado, fucanas também da alga A.

nodosum inibiram a adesão de células sem serem internalizadas, foram capazes

de associarem a fibronectina e inibirem a adesão de células de câncer de mama

(MDA-MB-231) (Liu et al., 2005). Estes dados estão em acordo com os dados

obtidos por Rocha e colaboradores (2005) que mostraram que Fuc B quando

biotinilada e incubada com células CHO era detectada, por miscroscopia confocal,

na matriz extracelular e que não precisa ser internalizada para desenvolver seu

efeito. Quando células CHO plaqueadas sobre diferentes moléculas de matriz

foram tratadas com Fuc B, observou-se que seu alvo molecular encontra-se na

matriz extracelular, principalmente na fibronectina.

A comunicação célula-matriz extracelular ocorre principalmente através da

ligação das proteínas de matriz aos receptores presentes na superfície celular,

que no caso particular da fibronectina, essa ligação ocorre com as integrinas de

membrana (Cabodi et al., 2010). Diante do exposto decidimos investigar quais

proteínas intracelulares que são responsáveis pela sinalização poderiam estar

68

DISCUSSÃO


sendo afetadas pela fucana. A primeira a ser investigada foi a quinase de adesão

focal (FAK), pois esta está intimamente associada à integrinas.

O principal evento que leva a ativação da (FAK) é a adesão celular

mediada por integrina. Quando em seu estado fosforilado (ativado) a FAK irá

sinalizar para a maquinaria celular que controla diversos processos celulares

relacionados à sobrevivência e progressão do ciclo celular. Sua função faz dessa

quinase um alvo no desenvolvimento de fármacos com potencial terapêutico

contra o câncer (Dunn, Heffler et al., 2010). A exposição das células CHO a Fuc B

levou a um aumento significativo na ativação de FAK. Um trabalho anterior com a

fucana A de S. schröederi mostrou que esta era capaz de induzir células

endoteliais sintetizarem um heparan sulfato antitrombótico por promover a

ativação de FAK (Medeiros, 2008). Contudo, não foi possível identificar na

literatura trabalhos que mostram fucanas promovendo a ativação de FAK

induzindo efeito antiproliferativo. Esse é o primeiro relato associando a ativação

de FAK por fucanas com o efeito antiproliferativo em células CHO.

A ativação de FAK leva a ativação de várias vias intracelulares (Cabodi et

al., 2010), dentre elas, a via da proteína quinase C (PKC). Observou-se que as

células após a exposição à Fuc B apresentaram ativação da PKC. Quando as

células foram incubadas com a Fuc B e o inibidor específico da PKC, o efeito

antiproliferativo de Fuc B não foi significantemente afetado, apesar de apresentar

uma tendência em diminuir. Outra via ativada pela ativação de FAK é a via das

MAP quinases, já que FAK que por sua vez ativa Ras e esta ativa a via das MAP

quinases. A ativação desta última tem sido correlacionada com regulação da

proliferação e ciclo celular.

Os dados obtidos por “western blotting” e proliferação na presença de

inibidores levaram a indicação de que Fuc B tem como principal mecanismo

antiproliferativo das células CHO a ativação da via das MAP quinases. Este fato

se mostrou interessante, pois há trabalhos na literatura que mostram que fucanas

possuem atividade antiproliferativa por induzir morte celular ao promover a

inibição da via das MAP quinases (Xu et al., 2011; Roy et al., 2010; Aisa et al.,

2005). Por outro lado, outros estudos mostram fucanas induzindo apoptose de

células tumorais por ativar a via das MAP quinases (Nabeyrat et al., 2003;

69

DISCUSSÃO


Schweyeri et al., 2004; Li et al., 2005; Liu et al., 2008; Kim et al., 2010). Contudo,

análises por citometria de fluxo mostram que Fuc B não aumenta a taxa de

células marcadas por anexina-V, o que indica que Fuc B, apesar de ativar a via

das MAP quinases, não induz apoptose.

Os ensaios de citometria mostraram também que o tratamento com Fuc B

resultou na parada do ciclo celular na fase G0/G1. Outras fucanas também

apresentaram efeito semelhante sobre células em cultura. Fucanas da alga A.

nodosum inibiram a proliferação de células de carcinoma de pulmão NSCLC-N6

bloqueando a passagem das células pela fase G1 (Riou et al.,1996). Fucanas de

Turbinaria ornata também apresentaram atividade antiproliferativa contra células

de carcinoma de pulmão por bloquearem a passagem dessas pela fase G1 do

ciclo celular (Deslande et al., 2001). Contudo, estes autores não mostraram que

vias intracelulares estavam sendo ativadas pelas fucanas e que fossem

responsáveis pelo seu mecanismo.

A ativação da via Ras/MEK/ERK pode promover a parada do ciclo celular

em alguns tipos de câncer (Mccubrey et al., 2007; Chang et al., 2003). Também

tem sido sugerido que algumas terapias objetivando o aumento de Raf, e

posterior aumento das MAP quinases, podem induzir senescência ou parada do

ciclo celular em alguns tipos de câncer de próstata (Ravi et al., 1999). Já em

alguns cânceres avançados pode ser vantajoso induzir a ativação de ERK 1/2

visando promover a parada do ciclo celular (Robertson et al., 2010). Estes dados

da literatura associados aos dados encontrados com a Fuc B levam a proposta de

que o principal mecanismo antiproliferativo de Fuc B sobre as células CHO está

em bloquear a passagem destas pela fase G1 do ciclo celular. A figura 25 resume

os dados encontrados até o momento e propõe o mecanismo de ação de Fuc B.

Inicialmente a Fuc B se associa a matriz extracelular, mais especificamente a

fibronectina, esta, por estar também associada à integrinas, promovem a ativação

destas. As integrinas por sua vez ativam a FAK levando a posterior ativação de

Ras, que então irá ativar MEK 1/2 através da ativação prévia de Raf. MEK 1/2

seguirá o caminho de ativação da via das MAPKs e irá fosforilar ERK 1/2 ativando

esta quinase. Uma vez ativada Erk 1/2 pode ser translocada para o núcleo onde

controla a expressão gênica de diversas proteínas e regular a progressão do ciclo

70

DISCUSSÃO


celular, porém Erk 1/2 também pode desempenhar seu papel no citoplasma

controlando proteínas relacionadas a adesão celular e do citoesqueleto.

Figura 25. Representação esquemática do mecanismo de ação proposto para a fucana Fuc B, da alga Spatoglossum schröederi, exercer seu efeito antiproliferativo em células CHO-K1. Setas azuis- via de ativação. Linha vermelha- inbidor. PD98059- Inibidor de MEK 1/2.

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CONCLUSÕES


6. CONCLUSÕES Com a metodologia utilizada foi possível extrair e caracterizar quimicamente três subfrações de Fuc B da alga S. schröederi, todas as subfrações apresentaram efeito antiproliferativo em células de ovário de Hamster Chinês (CHO) interrompendo o ciclo celular na fase G1. Para que isto ocorra a Fuc B associa-se a matriz extracelular que se liga a integrina de membrana o que ativa FAK e resulta na ativação da via das MAP quinases com ativação de ERK 1/2 que regula a progressão do ciclo celular.

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REFERÊNCIAS


7. REFERÊNCIAS Li, B. et al. Fucoidan: structure and bioactivity. Molecules, v. 13, n. 8, p. 1671-95, 2008. Wijesekara, I.; Pangestuti, R.& Kim, S. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae. Carbohydrate Polymers. v. 84, 1, p. 14-21, 2011. Farias, E. H. et al. A preponderantly 4-sulfated, 3-linked galactan from the green alga Codium isthmocladum. Glycobiology, v. 18, n. 3, p. 250-9, 2008. Nader, H. B. et al. Heparins and heparinoids: occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activities. Curr Pharm Des, v. 10, n. 9, p. 951-66, 2004. Rocha, H.A.O. Extração e purificação de uma fucana da alga marinha Spatoglossum schröederi. Dissertação de Mestrado. São Paulo, 1998 Rocha, H. A. et al. A fucan from the brown seaweed Spatoglossum schroederi inhibits Chinese hamster ovary cell adhesion to several extracellular matrix proteins. Braz J Med Biol Res, v. 34, n. 5, p. 621-6, 2001. Medeiros, G. F. et al. Distribution of sulfated glycosaminoglycans in the animal kingdom: widespread occurrence of heparin-like compounds in invertebrates. Biochimica et biophysica acta, v. 1475, n. 3, p. 287-94, 2000. Jiao, G. et al. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae. Marine drugs, v. 9, n. 2, p. 196-223, 2011. Rocha, H. A. O. et al. Natural sulfated polysaccharides as antithrombotic compounds. Structural characteristics and effects on the coagulation cascade. In: NETWORK, K. T. R. (Ed.), p.127. 2006. Aquino, R. S. et al. Occurrence of sulfated galactans in marine angiosperms: evolutionary implications. Glycobiology, v. 15, n. 1, p. 11-20, 2005. Costa, J. M. S. Caracterização e atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da angiospeerma marinha halodule wrightii. Dissertação de Mestrado. Natal, 2008. Dantas, N. S. Identificação e caracterização química de frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos de macrofítas dulcícolas. Dissertação de Mestrado. Natal, 2007. Choosawad, D. Phongdara, A. & Chotigeat, W. Biological activity of fucoidan from leafy bladderwort (Utricularia aurea Lour). Songklanarin J. Sci. Technol., v. 27. p. 809-815. 2005

73

REFERÊNCIAS


Park, Y. et al. Variation of acharan sulfate and monosaccharide composition and analysis of neutral N-glycans in African giant snail (Achatina fulica). Glycoconjugate journal, v. 25, n. 9, p. 863-77, 2008. Bernfield, M. et al. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annual review of biochemistry, v. 68, p. 729-77, 1999. Theocharis, A. D. et al. Proteoglycans in health and disease: novel roles for proteoglycans in malignancy and their pharmacological targeting. The FEBS journal, v. 277, n. 19, p. 3904-23, Oct 2010. Percival, E. G. V.; McDowell, R. H. Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides. London: Academic Press. [S1], p.219. 1967 Aquino, R. S.; Grativol, C.; Mourao, P. A. Rising from the Sea: Correlations between Sulfated Polysaccharides and Salinity in Plants. PLoS One, v. 6, n. 4, p. e18862, 2011. Dietrich, C. P. F. et al. A new approach for the characterization of polysaccharides from algae: Presence of four main acidic polysaccharides in three species of the class Phaeophyceae. Plant Science, v. 108, p. 143-153, 1995. Li, B. et al. Fucoidan: structure and bioactivity. Molecules, v. 13, n. 8, p. 1671-95, 2008. Bilan, M.I. et al. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag. Carbohydrate Research, 337, 719–730, 2002. Jiao, G. et al. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae. Marine drugs, v. 9, n. 2, p. 196-223, 2011. Cardoso, M. A. et al. Sulfated xylomannans isolated from red seaweeds Chondrophycus papillosus and C. flagelliferus (Ceramiales) from Brazil. Carbohydrate research, v. 342, n. 18, p. 2766-75, 2007. Lim, B. L.; Ryu, I. H. Purification, structural characterization, and antioxidant activity of antioxidant substance from the red seaweed Gloiopeltis tenax. Journal of medicinal food, v. 12, n. 2, p. 442-51, 2009. Huheihel, M. et al. Activity of Porphyridium sp. polysaccharide against herpes simplex viruses in vitro and in vivo. Journal of biochemical and biophysical methods, v. 50, n. 2-3, p. 189-200, 2002. Zhou, G. et al. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society, v. 50, n. 1, p. 47-53, 2004.

74

REFERÊNCIAS


Adams, Y. et al. Carrageenans inhibit the in vitro growth of Plasmodium falciparum and cytoadhesion to CD36. Parasitology research, v. 97, n. 4, p. 290-4, 2005. Zvyagintseva, T. N. et al. Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Comparative biochemistry and physiology. Toxicology & pharmacology : CBP, v. 126, n. 3, p. 209-15, 2000. Medina, M. B. Binding of collagen I to Escherichia coli O157:H7 and inhibition by carrageenans. International journal of food microbiology, v. 69, n. 3, p. 199-208, 2001. Matsubara, K. Recent advances in marine algal anticoagulants. Current medicinal chemistry. Cardiovascular and hematological agents, v. 2, n. 1, p. 13-9, 2004. Hayakawa, Y. et al. Inhibition of thrombin by sulfated polysaccharides isolated from green algae. Biochimica et biophysica acta, v. 1543, n. 1, p. 86-94, 2000. Farias, E. H. et al. A preponderantly 4-sulfated, 3-linked galactan from the green alga Codium isthmocladum. Glycobiology, v. 18, n. 3, p. 250-9, 2008. Bilan, M. I. et al. Structure of a highly pyruvylated galactan sulfate from the Pacific green alga Codium yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta). Carbohydrate research, v. 342, n. 3-4, p. 586-96, 2007. Lahaye, M.; Robic, A. Structure and functional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules, v. 8, n. 6, p. 1765-74, 2007. Pomin, V. H. Structural and functional insights into sulfated galactans: a systematic review. Glycoconjugate journal, v. 27, n. 1, p. 1-12, 2010. Almeida-Lima, J. et al. Evaluating the possible genotoxic, mutagenic and tumor cell proliferation-inhibition effects of a non-anticoagulant, but antithrombotic algal heterofucan. J Appl Toxicol, v. 30, n. 7, p. 708-15, 2010. Berteau, O.; Mulloy, B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. Glycobiology, v. 13, n. 6, p. 29R-40R, 2003. Percival, E.G.V. & Ross, A.G. The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds. J. Chem. Soc., 717-720, 1950. Patankar, M.S. A revised structure for fucoidan may explain some of its

biological activities. J. Biol. Chem., 268, 21770±21776, 1993.

75

REFERÊNCIAS


Kloareg, B. & Quatrano, R. S. - Structure of cell wall of marine algae and ecophysiological function of matrix polysaccharides. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. V. 26. p. 259-315, 1988. Leite, E. L. et al. Structure and pharmacological activities of sulfated xylofucoglucuronan from the alga Spatoglossum schröederi. Plant Science, v. 132, p. 215-228, 1998. Rocha, H. A. et al. Structural and hemostatic activities of a sulfated galactofucan from the brown alga Spatoglossum schroederi. An ideal antithrombotic agent? J Biol Chem, v. 280, n. 50, p. 41278-88, 2005. Liu, J. M. et al. Inhibitory effect of fucoidan on the adhesion of adenocarcinoma cells to fibronectin. Anticancer research, v. 25, n. 3B, p. 2129-33, 2005. Kim, W. J. et al. Decursin inhibits growth of human bladder and colon cancer cells via apoptosis, G1-phase cell cycle arrest and extracellular signal-regulated kinase activation. Int J Mol Med, v. 25, n. 4, p. 635-41, 2010. Cumashi, A. et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology, v. 17, n. 5, p. 541-52, 2007. Albuquerque, I. R. L. et al. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity. Braz. J. Med. Biol. Res, v. 37, p. 167–171, 2004. Wang, J. et al. Structural studies on a novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed Laminaria japonica. Int J Biol Macromol, v. 47, n. 2, p. 126-31, 2010. De Azevedo, T. C. et al. Heparinoids algal and their anticoagulant, hemorrhagic activities and platelet aggregation. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie, v. 63, n. 7, p. 477-83, 2009. TISSOT, B.; DANIEL, R. Biological properties of sulfated fucans: the potent inhibiting activity of algal fucoidan against the human compliment system. Glycobiology, v. 13, n. 12, p. 29G-30G, 2003. ZVYAGINTSEVA, T. N. et al. Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, v. 126, n. 3, p. 209-15, 2000. CUMASHI, A. et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology, v. 17, n. 5, p. 541-52, 2007. CARDOSO, M. L. et al. Assessment of zymosan-induced leukocyte influx in a rat model using sulfated polysaccharides. Planta medica, v. 76, n. 2, p. 113-9, 2010.

76

REFERÊNCIAS


MEDEIROS, V. P. et al. Sulfated galactofucan from Lobophora variegata: anticoagulant and anti-inflammatory properties. Biochemistry. Biokhimiia, v. 73, n. 9, p. 1018-24, 2008. COOMBE, D. R. et al. Analysis of the inhibition of tumour metastasis by sulphated polysaccharides. Int J Cancer, v. 39, n. 1, p. 82-8, 1987. PAIVA, A. A. et al. Antioxidant and anti-inflammatory effect of polysaccharides from Lobophora variegata on zymosan-induced arthritis in rats. International immunopharmacology, 2011. CAMARA, R. B. et al. Heterofucans from the brown seaweed Canistrocarpus cervicornis with anticoagulant and antioxidant activities. Mar Drugs, v. 9, n. 1, p. 124-38, 2011. MAGALHAES, K. D. et al. Anticoagulant, Antioxidant and Antitumor Activities of Heterofucans from the Seaweed Dictyopteris delicatula. International journal of molecular sciences, v. 12, n. 5, p. 3352-3365, 2011. OLALYE, M. T.; ROCHA, J. B. Commonly used tropical medicinal plants exhibit distinct in vitro antioxidant activities against hepatotoxins in rat liver. Experimental and toxicologic pathology : official journal of the Gesellschaft fur Toxikologische Pathologie, v. 58, n. 6, p. 433-8, 2007. COSTA, L. S. et al. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds. Biomed Pharmacother, v. 64, n. 1, p. 21-8, 2010. COSTA, L. S. et al. Heterofucan from Sargassum filipendula Induces Apoptosis in HeLa Cells. Mar Drugs, v. 9, n. 4, p. 603-614, 2011. TERUYA, T. et al. Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon okamuranus TOKIDA in U937 cells. Int J Biol Macromol, v. 41, n. 3, p. 221-6, 2007. YAMASAKI-MIYAMOTO, Y. et al. Fucoidan induces apoptosis through activation of caspase-8 on human breast cancer MCF-7 cells. J Agric Food Chem, v. 57, n. 18, p. 8677-82, 2009. BARROSO, E. M. et al. A non-anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo. Planta medica, v. 74, n. 7, p. 712-8, 2008. DIAS, P. F. et al. Antiangiogenic and antitumoral properties of a polysaccharide isolated from the seaweed Sargassum stenophyllum. Cancer Chemother Pharmacol, v. 56, n. 4, p. 436-46, 2005. ZHOU, G. et al. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacol Res, v. 50, n. 1, p. 47-53, 2004.

77

REFERÊNCIAS


KIM, W. J. et al. Decursin inhibits growth of human bladder and colon cancer cells via apoptosis, G1-phase cell cycle arrest and extracellular signal-regulated kinase activation. Int J Mol Med, v. 25, n. 4, p. 635-41, 2010. HIDARI, K. I. et al. Structure and anti-dengue virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga. Biochem Biophys Res Commun, v. 376, n. 1, p. 91-5, 2008. MANDAL, P. et al. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica. Antivir Chem Chemother, v. 18, n. 3, p. 153-62, 2007. SHIBATA, H. I. et al. Preventive Effects of Cladosiphon Fucoidan Against Helicobacter pylori Infection in Mongolian gerbils. Helicobacter, v. 8, n. 1, p. 59-65, 2003. ROCHA, H. A. O. et al. A xylogalactofucan from the brown seaweed Spatoglossum schröederi stimulates the synthesis of an antithrombotic heparan sulfate from endothelial cells. Planta Med, v. 71, p. 379-381, 2005. HAYASHI, S. et al. Fucoidan partly prevents CCl4-induced liver fibrosis. Eur J Pharmacol, v. 580, n. 3, p. 380-4, 2008. JIANG, Z. et al. Effects of sulfated fucan, ascophyllan, from the brown Alga Ascophyllum nodosum on various cell lines: a comparative study on ascophyllan and fucoidan. J Biosci Bioeng, v. 110, n. 1, p. 113-7, 2010. GO, H.; HWANG, H. J.; NAM, T. J. Polysaccharides from Capsosiphon fulvescens Stimulate the Growth of IEC-6 Cells by Activating the MAPK Signaling Pathway. Mar Biotechnol (NY), 2010. ESKO, J. D.; ROSTAND, K. S.; WEINKE, J. L. Tumor formation dependent on proteoglycan biosynthesis. Science, v. 241, n. 4869, p. 1092-6, 1988. LEBARON, R. G. et al. Adhesion of glycosaminoglycan-deficient chinese hamster ovary cell mutants to fibronectin substrata. J Cell Biol, v. 106, n. 3, p. 945-52, 1988. ESKO, J. D. Genetic analysis of proteoglycan structure, function and metabolism. Curr Opin Cell Biol, v. 3, n. 5, p. 805-16, 1991. ROCHA, H. A. et al. Fucan inhibits Chinese hamster ovary cell (CHO) adhesion to fibronectin by binding to the extracellular matrix. Planta medica, v. 71, n. 7, p. 628-33, 2005. WHO. Ten leading causes of death in 2008. 2008. KING, R. J. B.; ROBINS, M. W. Cancer biology. 3rd. Harlow, England ; New York: Pearson/Prentice Hall, xvii, 292 p. 2006.

78

REFERÊNCIAS


ALBERTS, B.; WILSON, J. H.; HUNT, T. Molecular biology of the cell. 5th. New York: Garland Science, xxxiii, 1601, 90 p. 2008. LEWIN, B. Genes VIII. Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice Hall, xxi, 1027 p. 2004. ZHU, H. et al. Celastrol acts as a potent antimetastatic agent targeting beta1 integrin and inhibiting cell-extracellular matrix adhesion, in part via the p38 mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, v. 334, n. 2, p. 489-99, 2010. BOON, T. Teaching the immune system to fight cancer. Scientific American, v. 268, n. 3, p. 82-9, 1993. MACDONALD, J. S.; ASTROW, A. B. Adjuvant therapy of colon cancer. Semin Oncol, v. 28, n. 1, p. 30-40, 2001. RABIK, C. A.; DOLAN, M. E. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents. Cancer Treat Rev, v. 33, n. 1, p. 9-23, 2007. Fentiman, I.S. The local treatment of cancer. In Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer (L.M. Franks, N.. Teich, eds.), 2nd ed., pp. 434-450. Oxford, UK: Oxford University Press, 1991. HANAHAN, D.; WEINBERG, R. A. The hallmarks of cancer. Cell, v. 100, n. 1, p. 57-70, 2000. BEDI, A. et al. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer. Cancer Res, v. 55, n. 9, p. 1811-6, 1995. KIM, E. J. et al. Fucoidan present in brown algae induces apoptosis of human colon cancer cells. BMC Gastroenterol, v. 10, p. 96, 2010. JIN, J. O. et al. The mechanism of fucoidan-induced apoptosis in leukemic cells: involvement of ERK1/2, JNK, glutathione, and nitric oxide. Mol Carcinog, v. 49, n. 8, p. 771-82, 2010. KIM, K. J.; LEE, O. H.; LEE, B. Y. Fucoidan, a sulfated polysaccharide, inhibits adipogenesis through the mitogen-activated protein kinase pathway in 3T3-L1 preadipocytes. Life Sci, v. 86, n. 21-22, p. 791-7, 2010. WEI, F. et al. Both ERK1 and ERK2 kinases promote G2/M arrest in etoposide-treated MCF7 cells by facilitating ATM activation. Cell Signal, v. 22, n. 11, p. 1783-9, 2010. BRAUN, K. et al. Investigation of the cell cycle regulation of cdk3-associated kinase activity and the role of cdk3 in proliferation and transformation. Oncogene, v. 17, n. 17, p. 2259-69, 1998.

79

REFERÊNCIAS


RIOU, D. et al. Antitumor and antiproliferative effects of a fucan extracted from ascophyllum nodosum against a non-small-cell bronchopulmonary carcinoma line. Anticancer Res, v. 16, n. 3A, p. 1213-8, 1996. NAGAMINE, T. et al. Inhibitory effect of fucoidan on Huh7 hepatoma cells through downregulation of CXCL12. Nutr Cancer, v. 61, n. 3, p. 340-7, 2009. ZHUANG, C. et al. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, umitoranoo (Sargassum thunbergii). Biosci Biotechnol Biochem, v. 59, n. 4, p. 563-7, 1995. AISA, Y. et al. Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways. Am J Hematol, v. 78, n. 1, p. 7-14, 2005. KOYANAGI, S. et al. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities. Biochem Pharmacol, v. 65, n. 2, p. 173-9, 2003. HAROUN-BOUHEDJA, F. et al. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans. Thrombosis research, v. 100, n. 5, p. 453-9, 2000. HYUN, J. H. et al. Apoptosis inducing activity of fucoidan in HCT-15 colon carcinoma cells. Biological & pharmaceutical bulletin, v. 32, n. 10, p. 1760-4, 2009. JIN, J. O. et al. The mechanism of fucoidan-induced apoptosis in leukemic cells: involvement of ERK1/2, JNK, glutathione, and nitric oxide. Mol Carcinog, v. 49, n. 8, p. 771-82, 2010. ELLOUALI, M. et al. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum. Anticancer Res, v. 13, n. 6A, p. 2011-9, 1993. KIM, S. H.; TURNBULL, J.; GUIMOND, S. Extracellular matrix and cell signalling: the dynamic cooperation of integrin, proteoglycan and growth factor receptor. The Journal of endocrinology, v. 209, n. 2, p. 139-51, 2011. KIELTY, C. M.; SHERRATT, M. J.; SHUTTLEWORTH, C. A. Elastic fibres. Journal of cell science, v. 115, n. Pt 14, p. 2817-28, 2002. LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger principles of biochemistry. 5th. New York: W.H. Freeman, 2008. KAMARAJAN, P.; KAPILA, Y. L. An altered fibronectin matrix induces anoikis of human squamous cell carcinoma cells by suppressing integrin alpha v levels and phosphorylation of FAK and ERK. Apoptosis : an international journal on programmed cell death, v. 12, n. 12, p. 2221-31, 2007.

80

REFERÊNCIAS


ZHAO, J.; GUAN, J. L. Signal transduction by focal adhesion kinase in cancer. Cancer Metastasis Rev, v. 28, n. 1-2, p. 35-49, 2009. METTOUCHI, A. et al. Integrin-specific activation of Rac controls progression through the G(1) phase of the cell cycle. Mol Cell, v. 8, n. 1, p. 115-27, 2001. GUAN, J. L. Integrin signaling through FAK in the regulation of mammary stem cells and breast cancer. IUBMB Life, v. 62, n. 4, p. 268-76, 2010. DEMERS, M. J. et al. Intestinal epithelial cancer cell anoikis resistance: EGFR-mediated sustained activation of Src overrides Fak-dependent signaling to MEK/Erk and/or PI3-K/Akt-1. J Cell Biochem, v. 107, n. 4, p. 639-54, 2009. BENOIT, Y. D. et al. Integrin alpha8beta1 confers anoikis susceptibility to human intestinal epithelial crypt cells. Biochem Biophys Res Commun, v. 399, n. 3, p. 434-9, 2010. GAGNE, D. et al. Integrin-linked kinase regulates migration and proliferation of human intestinal cells under a fibronectin-dependent mechanism. J Cell Physiol, v. 222, n. 2, p. 387-400, 2010. HAO, H. et al. Focal adhesion kinase as potential target for cancer therapy (Review). Oncol Rep, v. 22, n. 5, p. 973-9, Nov 2009. RELIGA, P. et al. Fucoidan inhibits smooth muscle cell proliferation and reduces mitogen-activated protein kinase activity. Eur J Vasc Endovasc Surg, v. 20, n. 5, p. 419-26, Nov 2000. PUKAC, L. A. et al. Mechanisms of inhibition by heparin of PDGF stimulated MAP kinase activation in vascular smooth muscle cells. J Cell Physiol, v. 172, n. 1, p. 69-78, Jul 1997. NABEYRAT, E. et al. Mitogen-activated protein kinases mediate peroxynitrite-induced cell death in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, v. 284, n. 6, p. L1112-20, Jun 2003. SCHWEYER, S. et al. Cisplatin-induced apoptosis in human malignant testicular germ cell lines depends on MEK/ERK activation. Br J Cancer, v. 91, n. 3, p. 589-98, Aug 2 2004. LI, D. W. et al. Calcium-activated RAF/MEK/ERK signaling pathway mediates p53-dependent apoptosis and is abrogated by alpha B-crystallin through inhibition of RAS activation. Mol Biol Cell, v. 16, n. 9, p. 4437-53, 2005. CAGNOL, S.; CHAMBARD, J. C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J, v. 277, n. 1, p. 2-21, 2010. DUBOIS, M. et al. Colorimetric method for determination of sugars, and related substances. Analytical Chemistry, [ S.l.], v. 28, n. 3, p. 350-356, 1956.

81

REFERÊNCIAS


DODGSON, K. S.; PRICE, R. G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides. Biochemistry Journal, [S.l.], v. 84, p. 106-110, 1962. MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, v. 65, n. 1-2, p. 55-63, 1983. LEITE, E. L. Estrutura e atividades farmacológicas de uma nova fucana da alga marinha Spatoglossum schröederi. Tese de Doutorado. São Paulo, 1995. NAKAYASU, S. et al. Biological activities of fucose-containing polysaccharide ascophyllan isolated from the brown alga Ascophyllum nodosum. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, v. 73, n. 4, p. 961-4, Apr 23 2009. MULLOY, B. The specificity of interactions between proteins and sulfated polysaccharides. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, v. 77, n. 4, p. 651-64, 2005. SHANMUGAM, M. & MODY, K.H. Heparinoid-active sulphated polysaccharides from marine algae as potential blood anticoagulant agents, Current Science, 79: 1672-1683, 2000. ELLOUALI, M.; BOISSON-VIDAL, C.; JOZEFONVISCZ, J. – Antiproliferative Effect and interaction of fucans with cells. Colloids Surf B: Biointerfaces, 2: 305-314,1994. LOGEART, D. et al. Fucans, sulfated polysaccharides extracted from brown seaweeds, inhibit vascular smooth muscle cell proliferation. II. Degradation and molecular weight effect. Eur J Cell Biol, v. 74, n. 4, p. 385-90, 1997. CABODI, S. et al. Integrins and signal transduction. Advances in experimental medicine and biology. v. 674, p. 43-54, 2010. DUNN, K. B.; HEFFLER, M.; GOLUBOVSKAYA, V. M. Evolving therapies and FAK inhibitors for the treatment of cancer. Anti-cancer agents in medicinal chemistry, v. 10, n. 10, p. 722-34, 2010. MEDEIROS, V. P. Síntese do HS antitrombótico em células endoteliais: Interação da heparina e fucana A da alga Spatoglossum schröederi com a matriz extracelular e vias de sinalização associadas. Tese de Doutorado. São Paulo, 2008. XU, Z. W. et al. Cardiotonic steroids attenuate ERK phosphorylation and generate cell cycle arrest to block human hepatoma cell growth. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, v. 125, n. 3-5, p. 181-91, 2011. ROY, S. K.; SRIVASTAVA, R. K.; SHANKAR, S. Inhibition of PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways causes activation of FOXO transcription factor, leading to

82

REFERÊNCIAS


cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer. Journal of molecular signaling. v. 5, p.10, 2010. DESLANDES, E. Preliminary study of the in vitro antiproliferative effect of ahydroethanolic extract from the subtropical seaweed Turbinaria ornata(Turner J. Agardh) on a human non-small-cell bronchopulmonarycarcinoma line (NSCLC-N6). J. Appl. Phycol., 12: 257. 2000. MCCUBREY, J. A. et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochimica et biophysica acta, v. 1773, n. 8, p. 1263-84, 2007. RAVI, R. K. et al. Raf-1 causes growth suppression and alteration of neuroendocrine markers in DMS53 human small-cell lung cancer cells. American journal of respiratory cell and molecular biology, v. 20, n. 4, p. 543-9, 1999. ROBERTSON, B. W.; BONSAL, L.; CHELLAIAH, M. A. Regulation of Erk1/2 activation by osteopontin in PC3 human prostate cancer cells. Molecular cancer, v. 9, p. 260, 2010.

LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE · Não houve indicação de apoptose usando a marcação com...

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