Leishmania e Leishmanioses. Filo Sarcomastigophora Sub-filo Mastigophora Ordem Kinetoplastida...
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Leishmania eLeishmanioses
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Filo Sarcomastigophora Sub-filo Mastigophora Ordem Kinetoplastida FamíliaTrypanosomatidae
Gênero Leishmania
Classificação Leishmania sp.
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• Protozoário flagelado
• Dois hospedeiros obrigatórios (igual ao T. cruzi /brucei ), heteroxénico
• Habitat: - Vetor: lúmen do trato digestivo
(Subgenus Leishmania: intestino anterior/médio) (Subgenus Viannia: intestino anterior/médio/posterior)
- Hospedeiro vertebrado: células do sistema mononuclear fagocitário (SMF), principalmente Macrófagos
Características gerais
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• Doença benigna ou mortal, na forma cutânea deixa cicatrizes grandes (“botão do oriente”), doença conhecida na America do Sul antes da chegada dos espanhóis
• Agente etiológico descrito primeiramente por Borovsky em 1898 em um paciente no Usbequistão
• Leishman e Donovan (1903) descreveram o parasita independente- mente em um caso de calazar da Índia
Leishmaniose: Aspectos históricos e sociais
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• Ross (quem descreveu o cíclo de vida do plasmódio)
batizou o parasita em 1903 Leishmania donovani, e
Wright denominou um parasita vindo de uma criança
da Armênia (forma cutânea) Leishmania tropica
• Em 1909, Lindenberg, Paranhos & Carini
demonstraram a presença dos parasitos em lesões
de pacientes brasileiros, Gaspar Vianna denominou-
os Leishmania braziliensis e detectou em 1912 a
ação curativa do tártaro emético
• Em 1987, Lainson e Shaw sugerem um novo
subgênero de Leishmania: o subgênero Viannia, que
inclui espécies das Americas
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Macrófago com amastigotas
Inseto
• Polimórfico: Promastigota
Paramastigota
Promastigota metacíclico
Amastigota Hospedeiro mamífero
• Reprodução por divisão binária.
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Organização celular
- Genoma com 36 chromossomos (L. major, Projeto genoma completo), 8305 genes identificados (4/2005).
- K(C)inetoplasto, trans-splicing.
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Ciclo de vida
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Formas promastigotas metacíclicas regurgitadas por mosquitossão depositadas na derme, onde são fagocitados por macrófagos
Diptera, Phlebotomidae: Lutzomiya, Phlebotomus. Vetores:
Brasil: Lutzomiya longipalpis, L. wellcomei e outros
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Promastigotas dentro do fagolisossomo se transformam em amastigotas, que se multiplicam no macrófago.
A célula hospedeira é rompida liberando amastigotas que são fagocitadospor outros macrófagos ou DCs
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Macrófagos infectados com Leishmanias do subgênero Viannia (espécies das Américas) contém menos
parasitas em vários vacúolos parasitóforos.
Subgênero Leishmania Subgênero Viannia
Ajuda no diagnóstico por microscopia
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Macrófagos infectados são ingeridos por Lutzomiya
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Após ingestão, amastigotas se transformam em promastigotase se multiplicam dentro de uma membrana formada pelo vetor
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Promastigotas se desenvolvem para paramastigotas os quais aderem-se em pontos diferentes no trato digestivo.
A proliferação é estimulada se a fêmea ingere sucos vegetais.
(Critério da localização: subgenênero de Leishmania)
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Após 3-5 dias, promastigotas metacíclicos migram ativamentepara partes anteriores do tubo digestivo.
Somente promastigotas metacíclicos são infecciosos para os hospedeiro vertebrado!
Assim, o parasita parece interferir ativamente com a capacidade de ingestão do hospedeiro mosquito!
A saliva do flebotomíneo é muito importante para a infecciosidade da Leishmania (efeito imunomodulador).
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Patogenia e interação parasita-hospedeiro
Após deposição de promastigotas na pele, o sistema complemento se liga na superfície do parasita, mais a clivagem de C3b em iC3b não permite ligação do complexo lítico.
Proteína gp63 cliva o fator do complemento C3b para iC3b.
iC3b
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Figure 1. Immune response against intracellular pathogens.
Khan N, Gowthaman U, Pahari S, Agrewala JN (2012) Manipulation of Costimulatory Molecules by Intracellular Pathogens: Veni, Vidi, Vici!!. PLoS Pathog 8(6): e1002676. doi:10.1371/journal.ppat.1002676http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1002676
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Figure 2. Pathogens modulate the expression of costimulatory molecules for their survival.
Khan N, Gowthaman U, Pahari S, Agrewala JN (2012) Manipulation of Costimulatory Molecules by Intracellular Pathogens: Veni, Vidi, Vici!!. PLoS Pathog 8(6): e1002676. doi:10.1371/journal.ppat.1002676http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1002676
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O sistema complemento ajuda na aderência das promastigotas nos macrófagos (receptor principal CR3).
Interação de LPGs e gp63 com fibronectina também ocorre.
Esta via de internalização não leva a produção de radicais de oxigênio ou NO (“silent entry”).
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Porque uma célula profissional do sistema fagocitário não consegue eliminar um parasita dentro do fagossomo?
1. A sinalização para ativação do macrófago está impedida pela ação do
LPG: Tradução de sinais, mobilização de cálcio, ativação da proteína kinase C.
Essentials of Glycobiology
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2. Indução de resposta disfuncional: inibição da produção de radicais de OH e NO.
Falha na apresentação em MHC2 após estimulação com IFN .
Fosfoglicanos bloqueiam produção de IL-12.
IFN
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3. Proteina-tirosina quinases também são bloqueados
Secreção de EF1 da Leishmania para o citossol.
Ativação de SHP-1(uma Phosphotirosina
fosfatase).
Inativação da Fosfotirosinaquinase:reação atenuada a
IFN .
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A espécie infectante é importante para o fenótipo dapatologia desenvolvida em indivíduos imunocompetentes
A expressão diferencial ou presença/ausência de genes provavelmente causa as diferenças nas patologias observadas
(Leishmanias que ocorrem no Brasil)(Leishmanias que ocorrem no Brasil)
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Os diferentes tipos de Leishmaniose na clínica • Visceral ou Calazar (L. donovani, L.
infantum, no Brasil causada por L. chagasi ):
- Enfermidade crônica
- Caracterizada por:
• Febre irregular e de longa duração.
• Hepatoesplenomegalia.
• Linfoadenopatia.
• Anemia com leucopenia.
• Hipergamaglobulinemia.
• Emagrecimento.
• Edema.
• Caquexia e morte se não for tratado, dentro de 2 anos.
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- Formas clínicas calazar: assintomática, oligossintomática, aguda e crônica
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• Tegumentaria:
a) Cutânea:
- Infecção confinada na derme, com epidermis ulcerada.
- Velho mundo, L. tropica, L. major e L. aethiopica.
- Novo mundo, leishmanias do complexo mexicana e braziliensis.
- No Brasil: L. braziliensis, L. guyanensis,
L. chagasi, L. lainsoni
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Leishmaniose cutânea (“oriental sore” “botão do oriente”, “Úlcera de
Bauru”
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b) Muco-cutânea:
- Infecção na derme (úlceras), invasão de mucosa e destruição da cartilagem.
- No novo mundo: L. braziliensis, L. guyanensis, L. mexicana (“espundia”), no Sudão/Etiópia L. major, L. tropica
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c) Cutânea difusa:
- Infecção confinada na derme, formando nódulos não
ulcerados. Disseminação por todo o corpo
- Associado a deficiência imunológica do paciente
- Novo mundo, L. pifanoi, L. amazonensis
- Velho mundo, L. aethiopica
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Responsável pela patologia é o estado imunológico do hospedeiro.
A predominância da resposta celular (Th1) leva a imunidade e cura, resposta humoral (Th2) leva às formas crônicas.
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1. Lise por complemento
2. Produção de IFN- 3. Ativação de macrófagos
4. Síntese de óxido nítrico
(NO)
Combate da infecção
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Há uma inflamação ativa.
Células dentríticas apresentam antígenos em MHC2 e expressam ICAM-1.
Ativação de Th1 por IFN e TNF resulta no recrutamento de células T CD8+ para a região infectada.
Cura.
Quais são os motivos para tanta diversidade de patologias na infecção?
Forma Cutânea
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Pouco envolvimento ou destruição de células Langerhans (celulas dendríticas na derme), mas há apresentação em MHC2 e células com ICAM1, mas TH1 e Th2 estão ativados.
Pode ter hiperprodução de IL1, TNF e ICAM1, resultado é um estado pró-inflamatório e destruição sucessiva de tecido.
Forma mucocutânea
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Não há resposta Th1 e nem aumento da atividade Th2.
Macrófagos infectados deixam de expressar ICAM1 e CD80 – falha na estimulação da resposta de celulas T CD8.
Possivelmente, lipofosfoglicanos da Leishmania estão
envolvidos.
Forma Visceral
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Diagnóstico:As Leishmanias são vistas nas formas amastigotas
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• Clínico
Caraterísticas da lesão e dados epidemiológicos.
• Laboratorial
- Exame direto de esfregaços corados (Romanowsky, Giemsa ou Leishman).
- Exame histológico.
- Cultura.
- Inóculo em animais.
- PCR (reação em cadeia da polimerase, permite a identificação da espécie infectante).
• Importante para exclusão de tuberculose cutânea, hanseníase, infecções por fungos, úlcera tropical, neoplasmas
Diagnóstico Leishmaniose Tegumentaria
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• Imunológicos
- Teste de Montenegro (teste da resposta contra formas promastigostas mortas do parasita, resposta celular).
- Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) (resposta humoral).
- Hemaglutinação indireta.
Diagnóstico Leishmaniose Tegumentaria
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Diagnóstico Leishmaniose visceral (Calazar)
CLÍNICO:
LABORATORIAL:
1. Exames Parasitológicos
a) Demonstração direta do parasita
Esfregaços corados com Giemsa ou Leishman de:
-Material obtido por punção de medula óssea, fígado ou baço
Sintomas
Febre baixa recorrente, envolvimento linfohepático, esplenomegalia, caquexia e dados epidemiológicos
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- Fase aguda 80-90% de positividade.
- Fase sub-clínica 10%.
- Co-infectados com HIV recomendado exame de medula ossea.
- Aspirado esplênico 100 %, sangue periférico 30%.
b) Isolamento em cultivo in vitro
Aspirado ou biopsia
LIT, MEM, Schneider’s e Evans (Meio monofásico) a 26ºC
Exame microscópico ( 2x semana/4 semanas)
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c ) Isolamento em cultivo in vivo
• Inoculação em animais
- Hamsters ou camundongos isogênicos (BALB/c) - Cepas dermatotrópicas: pata ou tocinho dos animais (positivo após 2 a 4 semanas) - Cepas vicerotrópicas via intraperitoneal (positivo após 6 meses) - Recomendado para o isolamento do parasita nas formas subclínicas
• Xenodiagnóstico
- Flebótomos - Usado em pacientes com AIDS portadores de
Leishmaniose visceral
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2. Testes Imunológicos
a) Teste de Montenegro. b) Testes serológicos.
• Antígenos (parasitas inteiros, inativados)
- Reação de aglutinação direta
Cave: Reatividade cruzada com Chagas e tuberculose.
Visualiza títulos até de 1:51.200. Leishmaniose visceral título > 1:1.600. (sensibilidade 100%) no Brasil
o título > 1:6.400.
c) Detecção do antigeno rK39 na urina.
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a) Por reação em cadeia da polimerase (PCR)
Usa oligonucleotídeos espécie-específicos do DNA dos minicírculos do DNA do cinetoplasto.
100% sensível e mais específico que sorologia.
b) Possibilita discriminação de espécies.
3. Análise do DNA de material recolhido
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Tratamento Leishmaniose Tegumentaria
1. Quimioterapia
• Antimoniais
Tártaro emético
Antimonial trivalente.
Glucantime (antimoniato de N-metil-glucamina)
Antimonial pentavalente.
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- Excreção rápida e pela urina, vida media 24 horas
- Droga recomendada para os três tipos de leishmaniose
• Antimonial pentavalente
• Inibe glicolise e síntese
• Administração intramuscular ou intravenosa absorção rápida
Pentostan (estibogluconato de sodio)
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*
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•Liga ao DNA, inibindo a replicação.
•Inibe a dihidrofolate reductase, interfere com o metabolismo de poliaminas.
•Administração intramuscular.
•Excretado lentamente, é seqüestrado nos tecidos (tem uso profilático contra tripanossomiase).
•Produz hipo- ou hiperglicemia.
Pentamidina
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Anfotericina B
• Lipofílico
• Liga a esteróis (ergosterol) da membrana formando poros. Funciona como um ionóforo.
• 2-5% excretado na urina.
• 90% ligado a proteínas do plasma.
• Meia vida 18 horas
• Muito eficiente em nanopartículas mas muito caro (500-1000 USD)!
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Outras opções tratamento Leishmaniose Tegumentaria
2. Imunoterapia
Leishvacin seriado.
Leishvacin associado ao BCG.
Leishvacin seriado associado ao BCG.
Leishvacin associado ao BCG com Glucantime .
Interferon gamma humano recombinante (Rhifn-g)
anti-IL10-receptor.
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Tratamento Leishmaniose visceral
1. Quimioterapia
• Antimoniais
Tártaro emético
Glucantime
• Pentamidina
• Anfotericina B
• Miltefosin
2. Imunoterapia
Interferon gamma recombinante (Rhifn-g)
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Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30
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Ecologia dos Phlebotomíneos: Desenvolvimento e comportamento
• 40-70 ovos por desova, agrupados em lugares humidos, eclodem depois 6-17 dias.
• Larvas se nutrem de matéria orgânica por mais 15-70 dias, depois pupa (7-14 dias).
• Adultos são ativos no crepúsculo ou a noite, durante o dia permanecem em lugares tranquilos: tocas, arvores ocas, currais, moradias.
• Não sobrevivem bem em ambientes que não tenham pelo menos um mes T acima de 20°C
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Fêmea
“Mosquito palha”
Macho
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Medidas de prevenção
• Identificação de focos de Leishmania. Animais infectados proximos aos domicílios
Silvestres e domésticos: erradicação
• Imunização em massa de cachorros (Leishvaccin)
• Vacinas para seres humanos? Gold standard: uma infecção curada protege contra infecção homóloga com a mesma espécie
• Componentes da saliva de Phlebotomíneos como vacina?
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• Uso de repelentes, telas de proteção
• Borrifação frequente de ambientes
• Tratamento de sintomáticos e assintomáticos em regiões com alta incidência de flebotomíneos
Medidas de prevenção
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Dentistas
Atenção na hora do tratamento de pacientes em área endêmica: eventuais lesões na boca
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Med. oral patol. oral cir.bucal (Internet) v.12 n.4 Madrid ago. 2007
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Literatura
L. Rey: ParasitologiaMarkell´s & Voge´s Medical ParasitologyVários reviews de Trends in Parasitology e outras revistas
Links interessantes:
http://www.hhmi.ucla.edu/parasite_course/Default.htm http://www.genedb.org/genedb/leish/index.jsp http://www.leishmaniasis.info/
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Perguntas “Take home message” T. cruzi
Qual é a forma infectante do T. cruzi para o ser humano?
Por que o T. cruzi não é lisado dentro do fagolissomo?
Além da infecção contaminativa, quais são outras vias de infecção com T. cruzi?
Em qual ou quais ponto(s) do ciclo de vida o T. cruzi se multiplica?
Cite três manifestações clínicas da infecção crônica por T. cruzi.
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Perguntas “Take home message” Leishmania
1. A cura de todas as pessoas portadores de Leishmania com a eliminação temporária de todos os flebotomineos irá eliminar a chance de infecção num município?
2. Qual é a forma infectante da Leishmania para seu hospedeiro mamifero?
3. Tratando alguém com Leishmaniose, como poderia se infectar?
4. Quais formas da Leishmaniose existem?5. Porque o macrófago infectado muitas vezes não
elimina o parasita infectante?
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CITOCINAS IMPORTANTES NA RESPOSTA IMUNE
IL-4 Leva a diminuição da expressão da subunidade da IL-12 nas células Th1. (Leva ao desenvolvimento de Th2)
IL-12 Ativa as células NK, e células T (CD4+ e CD8+) para produzirem IFN-.
IL-10 Abaixa a apresentação de antígenos e de produção de IFN-. Inibe a ativação do macrófago.
NK Representam uma fonte inicial de IFN-
IFN- Mediador da resistência inata contra o parasita, é uma citocina pró-inflamatória.
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No modelo L. major e camundongo