LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAÇÃO DE NERVO ... · pelo conhecimento. Em especial,...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAÇÃO DE NERVO

ISQUIÁTICO DE RATOS APÓS TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE

SILICONE

Giselle Bonifácio Neves Mendonça

Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito

GOIÂNIA

2013

GISELLE BONIFÁCIO NEVES MENDONÇA

LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAÇÃO DE NERVO

ISQUIÁTICO DE RATOS APÓS TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE

SILICONE

Tese apresentada para obtenção do

grau de Doutor em Ciência Animal da

Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás.

Área de Concentração:

Patologia, Clínica e Cirurgia Animal

Orientador:

Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito

Comitê de Orientação:

Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno

Profa. Dra. Neusa Margarida Paulo

GOIÂNIA

2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

GPT/BC/UFG

M539l

Mendonça, Giselle Bonifácio Neves.

Laser de baixa intensidade na regeneração de nervo

isquiático de ratos após tubulização com câmara de silicone

[manuscrito] /Giselle Bonifácio Neves Mendonça. - 2013.

113 f. : il, tabs.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,

Escola de Veterinária e Zootecnia, 2013.

Bibliografia.

1. Nervo isquiático – Regeneração 2. Ruptura de nervo –

Tratamento 3. Nervo – Regeneração – Laser 4. Nervos –

Lesões I. Título.

CDU: 612.8:616-089

iii

Dedico, primeiramente, à minha mãe,

Ivani, pelo incentivo incondicional à

minha formação profissional. Também

ao meu pai, Bonifácio, à minha irmã,

Letícia, que me apoiaram nesta

jornada.

iv

Agradecimentos

Agradeço, em primeiro lugar, a Deus que me proporcionou sabedoria e,

ao mesmo tempo, serenidade para que este trabalho fosse produzido.

Aos meus pais, João Bonifácio Dias e Ivani Francisca Neves Bonifácio,

por terem acompanhado de perto meus estudos e incentivado a busca incessante

pelo conhecimento. Em especial, agradeço imensamente minha mãe que sempre

dedicou seu tempo para ajudar tanto espiritualmente, emocionalmente ou

financeiramente. Sem a senhora, mãe, eu não teria forças para continuar.

À minha querida irmã e também minha melhor amiga, Letícia Bonifácio

Neves de Carvalho, por auxiliar-me várias vezes nos trabalhos acadêmicos e ser

cumplice das conquistas e dos momentos difíceis que passei durante os estudos

experimentais.

Ao meu orientador, professor Luiz Augusto Batista Brito, por me aceitar

como orientanda e ter me ensinado a crescer tanto profissionalmente quanto

pessoalmente. Seus ensinamentos serão válidos por toda a minha vida. Ao

ingressar no Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (PPGCA/EVZ/UFG) me

questionou no que a Fisioterapia tinha a ver com a Patologia. E ao longo desses

anos, espero que tenha, finalmente, compreendido a ligação dessas áreas,

principalmente, por meio deste estudo.

Ao professor Marcus Fraga Vieira, coordenador do Laboratório de

Bioengenharia e Biomecânica da Faculdade de Educação Física (FEF) da UFG,

que me ajudou arduamente na escolha do melhor método biomecânico para

avaliar os ratos neste estudo. Desde 2010, esteve junto a mim com paciência e

muita dedicação realizando diversos estudos pilotos. Serei eternamente grata por

ter me acolhido de forma tão carinhosa e prestativa em seu Laboratório.

Aos meus professores co-orientadores, Adilson Donizeti Damasceno e

Neusa Margarida Paulo, por terem aceitado o convite de co-orientação, e

auxiliado na condução experimental sempre quando precisei.

Ao professor Marcelo Seixo de Brito e Silva, do Instituto de Ciências

Biológicas da UFG, por ter atendido ao convite para realizar a técnica cirúrgica

v

nos animais. Foi muito prestativo e zeloso na condução dos procedimentos

cirúrgicos.

À professora Mara Rúbia Nunes Celes, do Instituto de Patologia

Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da UFG, pela orientação na realização da

técnica de Picrosirius Red e leitura das lâminas coradas por esta solução.

A todos os professores amigos da EVZ/UFG que foram meus mestres

e meus ídolos aos quais inspirei. Muito obrigada, sou imensamente grata a cada

um de vocês que me acompanharam, ficaram na torcida e fizeram parte de minha

vida tanto estudantil, profissional e, algumas vezes, até pessoal de maneira direta

ou indireta.

À minha amiga, Júlia de Miranda Moraes, por ter me convidado a

continuar a linha de pesquisa que iniciou com regeneração de nervo periférico.

Não tenho palavras para expressar o quanto foi importante na execução deste

trabalho. Auxiliou-me na idealização do projeto, na cessão de vários materiais,

nos testes piloto da técnica cirúrgica, na realização da análise morfológica e

imunoistoquímica, na correção do trabalho e em muitas outras ocasiões. Sou

imensamente grata a você também pela amizade dedicada e pelos conselhos nas

horas difíceis.

Aos alunos, da pós-graduação, Danilo Ferreira Rodrigues, e da

graduação, Fernanda Oliveira de Carvalho e Jakeline Ferreira de Araújo Lôbo, por

terem sido ao mesmo tempo o meu braço direito e esquerdo durante toda a

pesquisa. Vocês dedicaram o tempo de estudo e de vida pessoal para auxiliar-me

durante o experimento. Obrigada pela atenção, amizade e compartilhamento tanto

das vitórias quanto das derrotas.

À equipe do Laboratório de Bioengenharia e Biomecânica da FEF/UFG,

Ivan Silveira Avelar, por me auxiliar na condução dos dados no software Visual

3D, Marco Aurélio Borges e Renato Sousa Gomide, por terem se disposto a criar

o software IFC_RATOS. Aos demais alunos da pós-graduação daquela unidade,

Evlyn de Jesus Fernandes, Renata Costa Barbosa e Thailyne Bizinotto, e à

professora Fernanda Grazielle da Silva Azevedo Nora, por serem prestativos

quando precisei.

Aos técnicos do Laboratório de Patologia do Setor de Patologia da

EVZ/UFG, Antônio Souza da Silva e Lorena Cardoso Cintra, por terem sido

vi

atenciosos comigo e pacientes na confecção das lâminas histológicas dos

fragmentos delicados dos nervos.

Aos alunos do PPGCA/EVZ/UFG, Adriana Faria, Danilo Rezende,

Fernanda Figueiredo e Mariana Faleiros, e da graduação da EVZ/UFG, Arielly,

Isabela, Lígia, Paula, Ramon e Vitor, pela ajuda prestada quando solicitados.

Meus sinceros agradecimentos aos funcionários da EVZ/UFG, da pós-

graduação, da limpeza, da segurança e dos laboratórios, por serem prestativos e

solícitos em ajudar sempre que precisei.

A todos os meus familiares e amigos que me auxiliaram direta ou

indiretamente, por terem realizado orações e ficarem na torcida por mim.

Aos meus cães, Burry, Johnnie e Tequila, que sempre me doaram

carinho e alegria, com lambidas, latidos, pulos e abanos de cauda, quando me

viam, mesmo sem eu ter dado atenção por dias.

Aos animais que foram utilizados nesta pesquisa.

A Universidade Federal de Goiás, a EVZ e ao setor de PGCA, por

permitirem a realização deste experimento. A CAPES pela concessão da bolsa de

auxílio à pesquisa; e ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento

(CNPq), pelo financiamento concedido para a execução desta pesquisa.

vii

“Você pode herdar riquezas, mas nunca sabedoria.”

H. Jackson Brown,Jr

viii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................................ x

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ xiv

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................. xvi

RESUMO ............................................................................................................. xviii

ABSTRACT .......................................................................................................... xix

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ......................................................... 1

1 Introdução ............................................................................................................. 1

2 Morfologia do nervo periférico .............................................................................. 3

3 Lesões em nervos periféricos ............................................................................... 5

4 Diagnóstico e recuperação das neuropatias ........................................................ 9

5 Métodos de avaliação funcional do nervo isquiático de rato .............................. 10

6 Tratamento das lesões nervosas periféricas ...................................................... 15

7 Laser de baixa intensidade ................................................................................. 16

8 Dosimetria do laser de baixa intensidade ........................................................... 23

9 Interação do laser de baixa intensidade sobre os tecidos .................................. 24

10 Efeitos do laser de baixa intensidade sobre os nervos periféricos ................... 25

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 29

CAPÍTULO 2 – EFEITO NA FUNÇÃO MOTORA DO LASER DE BAIXA

INTENSIDADE A 830nm EM NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS

À NEUROTMESE E TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE ................... 42

RESUMO ............................................................................................................... 42

ABSTRACT ........................................................................................................... 43

INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 44

MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 45

Procedimento cirúrgico ...................................................................................... 46

ix

Aplicação do laser de baixa intensidade ............................................................ 47

Índice funcional do ciático .................................................................................. 49

Ângulo do Tarso ................................................................................................. 52

Análise Estatística .............................................................................................. 55

RESULTADOS ...................................................................................................... 55

DISCUSSÃO ......................................................................................................... 59

CONCLUSÃO ........................................................................................................ 62

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 62

CAPÍTULO 3 – EFEITOS DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE (830 nm) EM

NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À NEUROTMESE E

TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE .................................................... 67

RESUMO ............................................................................................................... 67

ABSTRACT ........................................................................................................... 68

INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 69

MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 70

Procedimento cirúrgico ...................................................................................... 70

Aplicação do laser de baixa intensidade ............................................................ 72

Colheita de material e análise histomorfológica ................................................. 72

Análise Estatística .............................................................................................. 74

RESULTADOS ...................................................................................................... 74

DISCUSSÃO ......................................................................................................... 81

CONCLUSÃO ........................................................................................................ 84

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 85

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................... 89

ANEXOS ............................................................................................................... 91

x

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Figura 1 - Representação esquemática do processo de degeneração e

regeneração nervosa periférica. Lesão do nervo periférico normal

(A); processo de degeneração retrógrada e Walleriana (B);

formação dos cones de crescimento axonais e Bandas de Büngner

(C); crescimento dos axônios em direção ao alvo distal e início da

formação da bainha de mielina (D). GDNF: fator neurotrófico

derivado da glia; LIF: fator inibitório de leucina; CTNF: fator

neurotrófico ciliar; MAG: glicoproteína associada a mielina; MBP:

proteína básica de mielina; P0: proteína zero; NT: neurotrofinas;

BDNF: fator neurotrófico derivado do encéfalo; NGF: fator de

crescimento do nervo ........................................................................... 7

Figura 2 - Impressão das pegadas de rato para calcular o Índice Funcional do

Ciático (IFC), onde TOF é a distância entre os membros pélvicos,

PL é o comprimento da pegada, TS é a amplitude da pegada no

sentido transversal e IT é a amplitude da pegada entre dedos

intermediários. As letras N e E que antecedem estes parâmetros

representam os valores aferidos, respectivamente, da pata normal

e experimental .................................................................................... 12

Figura 3 - Fase de apoio da marcha de rato. “Initial contact” (A); “opposite toe-

off” (B); “Heel-rise” (C); “Toe-off” (D) .................................................. 14

Figura..4..-.Espectro de cores visíveis com comprimento de onda

correspondente, violeta (440 nm), azul (500 nm), verde (570 nm),

amarelo (590 nm), alaranjado (610 nm) e vermelho (700 nm) e

regiões invisíveis (ultravioleta e infravermelho) .................................. 18

Figura 5 - Característica de coerência da luz laser. Comprimentos de onda

coerente no tempo e espaço (A). Comprimentos de onda

incoerentes no tempo e espaço (B) .................................................... 20

xi

Figura 6 - Característica da luz laser de unidirecionalidade ou colimação. A luz

natural é divergente ao contrário da luz LASER que é paralela ao

tubo onde é produzida .......................................................................... 20

Figura 7 - Característica da luz laser de monocromaticidade que possui apenas

um comprimento de onda, enquanto que a luz branca comum possui

vários comprimentos de onda, portanto várias cores ........................... 20

CAPÍTULO 2 - EFEITO NA FUNÇÃO MOTORA DO LASER DE BAIXA


À NEUROTMESE E TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE

Figura 1 - Tubulização com câmara de silicone do nervo isquiático de rato após

procedimento de neurotmese e fixação ao tubo dos cotos proximal

(CP) e distal (CD) equidistantes 5 mm. ............................................. .47

Figura 2 - Pontos de aplicação do laser de baixa intensidade (830 nm) em

ratos, na região paravertebral esquerda de L2 a L6 e ao longo do

nervo isquiático, após neurotmese e tubulização do nervo

isquiático. ........................................................................................... 48

Figura 3 - Estrutura em MDF e acrílico, confeccionada para ratos realizarem

marcha com abrigo escuro, passarela de acrílico, área para

preparar animal antes de iniciar marcha e espelho posicionado sob

a passarela para visualizar impressões plantares das pegadas dos

animais ............................................................................................... 49

Figura 4 - Eixos da face plantar de rato aferidos para o cálculo do IFC: em

vermelho, comprimento da pegada; em verde, o espalhar total dos

dedos; e em azul, o espalhar dos dedos intermediários .................... 51

Figura 5 - Tela do software IFC_RATOS com as imagens correspondentes de

cada pegada, normal (N) e experimental (E). As retas entre os

pontos vermelhos representa o comprimento da pegada (PL), entre

os pontos verdes representa a distância entre primeiro e quinto

dedo (TS) e entre os pontos azuis, a distância entre o segundo e

quarto dedo (IT). À esquerda, têm-se os valores das medidas

obtidas................................................................................................ 52

xii

Figura 6 - Tela do software Visual 3D mostrando o esqueleto dos segmentos

criados de rato Wistar: perna e pé, para aferir o Ângulo do Tarso ....... 54

Figura 7 - Valores médios do IFC de ratos após neurotmese do nervo isquiático

em cada tempo de avaliação (TØ, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7) dos

grupos experimentais, GC e GL ........................................................... 57



TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE

Figura 1 - Macroscopia do nervo isquiático de rato Wistar submetido à

neurotmese seguido de tubulização com câmara de silicone e

tratamento com laser de baixa intensidade (830 nm), apresentando

completa formação do CR e ausência de fibrose ao redor do tubo.

CP (coto proximal), CR (cabo de regeneração) e CD (coto distal) ....... 75

Figura 2 - Fotomicrografia do nervo periférico de ratos, submetidos à técnica de

tubulização. A: Corte longitudinal do CR do GC com moderada

proliferação axonal (seta amarela) e degeneração Walleriana

(cabeça de seta); B: Corte transversal do CD do GC com moderada

proliferação axonal (seta amarela) e degeneração Walleriana

(cabeça de seta) e presença de hemossiderose (seta azul); C: Corte

longitudinal do CR do GL com intensa proliferação axonal (seta

amarela) e discreta degeneração Walleriana (cabeça de seta); D:

Corte transversal do CD do GL com intensa proliferação axonal (seta

amarela) e discreta degeneração Walleriana (cabeça de seta). HE,

40X.. ..................................................................................................... 76

Figura 3 - Porcentagem média, nas porções (CP, CR e CD) do nervo isquiático

de ratos Wistar submetidos à neurotmese seguida de tubulização

dos grupos GC e GL, de A: proliferação axonal; B: reorganização

dos fascículos; C: degeneração Walleriana; D: infiltrado inflamatório .. 77

xiii

Figura 4 - Fotomicrografia de nervo isquiático de ratos, submetidos à técnica de

tubulização e tratamento com laser de baixa intensidade (830nm). A:

Corte longitudinal do CR no GC; B: Corte transversal do CD com

intensa quantidade de fibras de colágeno (em vermelho) sem

delimitação de fascículos no GC; C: Corte longitudinal do CR do GL;

D: Corte transversal do CD com presença de perineuro (seta) no GL.

Picrosirius Red, 40X ............................................................................. 77

Figura 5 - Porcentagem de fibras colágenas, marcadas pelo Picrosirius Red,

nas porções de CP, CR e CD no nervo isquiático de ratos

submetidos à neurotmese no GC e GL. p>0,05 ................................... 78

Figura 6 - Fotomicrografia de nervo isquiático de ratos, submetidos à técnica de

tubulização e tratamento com laser de baixa intensidade (830nm),

com diferentes quantidades de mielina, corada em azul claro. A:

Mielina em menor quantidade no corte longitudinal do CR do GC; B:

Mielina com menor quantidade e espessura no corte transversal do

CD do GC; C: Mielina em maior quantidade no corte longitudinal do

CR do GL; D: Mielina com maior quantidade e espessura no corte

transversal do CD do GL. Luxol Fast Blue, 40x.. .................................. 79

Figura 7 - Porcentagem de mielina, marcada pelo Luxol Fast Blue, nas porções

de CP, CR e CD no nervo isquiático de ratos submetidos à

neurotmese no GC e GL. p>0,05 ......................................................... 80

Figura 8 - Imunomarcação para os anticorpos S-100, NF e FGF-2 em nervos

isquiáticos de ratos, submetidos à tubulização. Coloração em

marrom pela diaminobenzidinaperoxidase e suas imagens

correspondentes em preto e branco convertidas pelo software Image

J, para análise por densidade óptica em pixels. A e B: cortes

transversais do CD referente à expressão de S-100 do GC; C e D:

cortes transversais do CD referente à expressão de S-100 do GL; E

e F: cortes longitudinais do CR referente à expressão de NF do GC;

G e H: cortes longitudinais do CR referente à expressão de NF do

GL; I e J: cortes transversais do CD referente à expressão de FGF-2

do GC; K e L: cortes transversais do CD referente à expressão de

FGF-2 do GL. Imunoistoquímica, 20X .................................................. 81

xiv

LISTA DE TABELAS


Tabela 1 - Classificação das lesões nervosas periféricas proposta por Sydney

Sunderland em 1951 ............................................................................ 6

CAPÍTULO 2 - EFEITO NA FUNÇÃO MOTORA DO LASER DE BAIXA


À NEUROTMESE E TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE

Tabela 1 - Valores de p comparando o IFC de ratos submetidos à neurotmese

do nervo isquiático seguida de tubulização com câmara de silicone

nos tempos de TØ e T1 com os demais dias de coleta (T1, T2, T3,

T4, T5, T6 e T7) em cada grupo experimental: GC e GL ................... 57

Tabela 2 - Valores de p comparando o IFC de ratos submetidos à neurotmese

do nervo isquiático seguida de tubulização com câmara de silicone

comparando cada tempo de coleta (TØ, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7)

com o subsequente em cada grupo experimental: GC e GL .............. 57

Tabela 3 - Comparação do Ângulo do Tarso de ratos do GC e GL, submetidos

à neurotmese seguida de tubulização com câmara de silicone na

fase final do apoio da marcha, nos tempos experimentais: TØ, T1 e

T7 ....................................................................................................... 58

Tabela 4 - Comparação pareada de cada tempo experimental (TØ, T1 e T7) do

AT no final da fase de apoio no GC e GL, em ratos após

neurotmese do nervo isquiático seguida de tubulização com

câmara de silicone ............................................................................. 59

xv




Tabela 1 - Porcentagem de marcação e desvio padrão para os anticorpos S-

100, NF e FGF-2 nas porções CP, CR e CP e na média entre as

porções no nervo isquiático de ratos submetidos à neurotmese e

tubulização com câmara de silicone no GC e GL ............................... 80

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

µM Micromolar

AMPc Monofosfato de adenosina cíclico

AsGa Arseneto de gálio

AsGaAl Arseneto de gálio e alumínio

ATP Trifosfato de adenosina

BDNF Fator neurotrófico derivado do encéfalo

BSA Albumina de soro bovina

Ca+² Íon cálcio

CD Coto distal

cm Centímetro

cm² Centímetro quadrado

CNTF Fator neurotrófico ciliar

CO2 Dióxido de carbono

COX-2 Cicloxigenase 2

CP Coto proximal

CR Cabo de regeneração

DAB Diaminobenzidinaperoxidase

Er:YAG Érbio: ítrio-alumínio-granada

FGF Fator de crescimento de fibroblastos

GC Grupo controle

GL Grupo laser

H+ Íon hidrogênio

HeNe Hélio-neônio

Ho:YAG Hólmio: ítrio-alumínio-granada

IFC Índice funcional do ciático

IFP Índice funcional do fibular

IFT Índice funcional tibial

IL-1ᵦ Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6

IT Intermediate toes

J/cm² Joules por centímetro quadrado

xvii

kg Quilograma

L1 Laminina 1

LASER Light amplification of stimulated emission of radiation

LIF Fator inibitório de leucina

MASER Microwave amplification by stimulated emissions of radiation

mg Miligrama

mL Mililitro

mm Milimetro

mW Miliwatt

Na+ Íon sódio

N-CAM Molécula de adesão de células neurais

Nd:YAG Neodímio: ítrio-alumínio-granada

NF Neurofilamento

nm Nanômetro

NT-3 Neurotrofina 3

NT-4/5 Nerotrofina 4/5

NT-6 Neurotrofina 6

NT-7 Neurotrofina 7

PGE2 Prostaglandina E2

PL Print length

RNA Ácido ribonucléico

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro

SDS Sodiododecilsulfato

SNC Sistema nervoso central

SNP Sistema nervoso periférico

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TOF To other foot

TS Total spreed

UV Ultravioleta

W Watt

W/cm² Watt por centímetro quadrado

xviii

RESUMO

Os nervos periféricos são alvos constantes de lesões de origem traumática, como esmagamento e secções parciais ou totais que resulta em diminuição ou perda da motricidade e da sensibilidade no território inervado, cuja severidade dependerá do acometimento de estruturas nervosas. O pior quadro de lesão é aquele em que ocorre ruptura total do nervo (neurotmese), o qual requer invariavelmente tratamento cirúrgico. Este estudo teve o objetivo de avaliar os efeitos morfológicos e funcionais da regeneração do nervo isquiático de rato após secção cirúrgica, tubulização com câmara de silicone e tratamento com laser de baixa intensidade (830 nm) em 126 dias. Utilizaram-se dois grupos, controle (GC) e laser (GL) com seis animais em cada. Todos os animais foram submetidos à neurotmese do nervo isquiático esquerdo, seguido de tubulização com câmara de silicone com cinco mm de distância entre os cotos nervosos. Os animais do GL receberam radiação com comprimento de onda de 830nm, densidade de energia de 4,13J/cm², em oito pontos, desde a região da medula espinhal até o local de lesão do nervo, totalizando 40 dias de irradiação divididos em dois momentos distintos. O primeiro momento iniciou-se no pós-cirúrgico imediato em que foram realizadas 20 aplicações de laser, em dias alternados. O segundo momento ocorreu 40 dias antes de realizar a eutanásia dos animais com mais 20 dias de aplicações de laser, em dias alternados. Durante o experimento procedeu-se avaliação funcional por meio do Índice Funcional do Ciático e Ângulo do Tarso. Após 126 dias os animais foram submetidos à eutanásia e os fragmentos dos nervos foram retirados e fixados em formol tamponado a 10% para análise histológica, com as colorações de HE, Luxol Fast Blue e Picrosirius Red, e imunoistoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S100 e FGF-2. Microscopicamente, avaliou-se a presença de proliferação axonal, degeneração Walleriana, reorganização fascicular e infiltrado inflamatório. Para a análise do HE estabeleceram-se escores descritivos e para os demais dados histológicos procedeu-se análise quantitativa por meio do programa Image J. Observou-se no GL melhor proliferação axonal, reorganização dos fascículos, ausência de infiltrado inflamatório, maior quantidade de mielina e menor quantidade de colágeno, maior expressão de S-100 e NF e menor expressão de FGF-2. Com relação à função do nervo isquiático, não se observou melhora funcional.

Palavras-chave: Ângulo do tarso, biomecânica, células de Schwann, fototerapia,

imunoistoquímica .

xix

ABSTRACT

Peripheral nerves are constant targets of traumatic injuries such as crushing and partial or complete sections resulting in decrease or loss of motor function and sensitivity of the innervated area, its severity will depend on the involvement of nervous structures. The worst damage frame is that of total nerve collapse (neurotmesis), which invariably requires surgical treatment. This study aimed to evaluate the morphological and functional effects of rat’s sciatic nerve regeneration after surgical section tubing with silicone chamber and treatment with low-intensity laser (830 nm) in 126 days. We used two groups, control (GC) and laser (GL) with six animals in each. All animals underwent left sciatic nerve neurotmesis followed by tubing with silicone chamber with five mm distance between nerve stumps. Animals in GL received radiation with a wavelength of 830 nm, energy density of 4.13 J/cm², on eight points from the spinal cord to nerve injury site, totaling 40 days of irradiation divided into two distinct periods. The first stage began at the immediate post-operative period where 20 laser applications were performed on alternate days. The second stage occurred 40 days before performing euthanasia in animals submitted to more than 20 days of laser applications on alternate days. During the experiment, we performed functional assessment through the Sciatic Functional Index and Ankle Angle. After 126 days, the animals were euthanized and the fragments of the nerves were removed and fixed in 10% formalin buffered for histological analysis with HE, Luxol Fast Blue and Picrosirius Red staining, and immunohistochemistry with neurofilament antibody (NF), FGF-2 and S-100. Microscopically, we observed the presence of axonal growth, Wallerian degeneration, inflammatory infiltrate and fascicular reorganization. For HE analysis, we stablished descriptive scores and for the other histological data we carried out quantitative analysis through program Image J. In GL we observed better axonal growth, reorganization of issues, absence of inflammatory infiltrate, greater amount of myelin and less collagen, increased expression of S-100 and NF and lower expression of FGF-2. Regarding the function of the sciatic nerve, no functional improvement was observed. Keywords: Ankle angle, biomechanics, immunohistochemical, phototherapy, Schwann cells


1 Introdução

Os nervos periféricos são alvos constantes de lesões de origem

traumática, como esmagamento e secções parciais ou totais que resulta em

diminuição ou perda da motricidade e da sensibilidade no território inervado, cuja

severidade dependerá do acometimento de estruturas nervosas (RODRÍGUEZ et

al., 2004). Estas lesões representam um dos grandes problemas econômicos e

sociais na área da saúde, sendo que em medicina veterinária é também um

obstáculo ao bem-estar animal (KINGHAM et al., 2007).

O pior quadro de lesão é aquele em que ocorre ruptura total do nervo

(neurotmese), o qual requer invariavelmente tratamento cirúrgico (SEDDON 1942;

PAASSEN et al., 2004; MOHAMMADI et al., 2012). De acordo com MELLO et al.

(2001), a restauração anatômica do nervo pode ser obtida por meio da utilização

de bainhas com o propósito de melhorar a reinervação, favorecendo o

direcionamento do cone axonal e prevenindo o crescimento de tecido cicatricial

circundante.

Materiais têm sido sugeridos para serem utilizados como uma forma de

ligação entre os cotos nervosos, destacando-se os de origem sintética, como os

copolímeros e os de origem biológica como as artérias e veias. Desses materiais,

a câmara de silicone é o material sintético mais utilizado, pois, provoca pequena

ou nenhuma reação tecidual, não é absorvível e induz pouca reação inflamatória.

O desenvolvimento axonal, migração celular e crescimento de capilares podem

ser estudados e o ambiente químico da câmara pode ser analisado ou alterado

por manipulação extrínseca. Este material tem como vantagem ser transparente,

suficientemente rígido e de fácil manipulação cirúrgica (CHEN et al., 2000;

PAASSEN et al., 2004; DELISTOIANOV et al., 2006).

Além disso, é prática comum nos procedimentos da fisioterapia a

utilização de equipamentos com a finalidade terapêutica e regenerativa. Para

lesões nervosas periféricas, a estimulação elétrica (MENDONÇA et al., 2003; LU

et al., 2008), o ultrassom terapêutico (RASO et al., 2005) e o laser de baixa

2

intensidade (GIGO-BENATO et al., 2005; GONÇALVES et al., 2010) têm sido

empregados com intuito de acelerar os processos regenerativos, buscando o

retorno precoce da funcionalidade do paciente. O laser de baixa intensidade, ou

também chamado laser terapêutico, começou a ser utilizado no processo de

regeneração e na recuperação funcional de lesões nervosas periféricas a partir de

meados 1980, havendo vários relatos e divergências sobre os resultados obtidos

(BASFORD, 1995).

Vários comprimentos de onda do laser estão sendo avaliados. Em

inúmeras publicações, a descrição dos parâmetros de irradiação, dose e potência

média, tempo e modo de aplicação entre outros, não seguem uma métrica

padrão, o que remete a interpretações discordantes dos resultados obtidos e

dificuldades comparativas dos mesmos (REIS et al., 2009).

Contudo, os avanços na neurologia têm propiciado inúmeras respostas

biológicas sobre os fatores que influenciam na recuperação nervosa, o que pode

ser constatado pelo desenvolvimento de técnicas cirúrgicas e equipamentos.

Apesar das inovações tecnológicas, a recuperação funcional após uma lesão do

tipo neurotmese em nervo periférico é geralmente desfavorável (PAASSEN et al.,

2004; KINGHAM et al., 2007; SULAIMAN & GORDON, 2013).

Há a necessidade de se comprovar a eficácia do tratamento com laser

de baixa intensidade a 830nm na regeneração de nervo periférico por meio de

avaliações histológicas, expressão de proteínas específicas para

neurorregeneração e testes funcionais nos ratos avaliados, após neurotmese e

procedimento de tubulização dos cotos nervosos com câmara de silicone.

Este estudo tem o objetivo de avaliar os efeitos morfológicos e

funcionais da regeneração do nervo isquiático de rato após secção cirúrgica,

tubulização com câmara de silicone e tratamento com laser de baixa intensidade

(830 nm) em 126 dias.

3

2 Morfologia do nervo periférico

Os nervos periféricos, parte integrante do sistema nervoso periférico

(SNP), correspondem à parte do sistema nervoso localizado fora do crânio e da

coluna vertebral. Podem ser formados por fibras motoras e sensitivas em conjunto

ou separadas. As fibras motoras ou também chamadas de eferentes possuem os

corpos celulares localizados no corno ventral da substância cinzenta da medula

espinhal ou em núcleos do tronco encefálico. Os impulsos elétricos deixam o

sistema nervoso central (SNC) para inervar vários órgãos efetores, como os

músculos estriados esqueléticos. Já as fibras sensitivas ou aferentes originam-se

de várias terminações nervosas espalhadas pelo corpo e recebem estímulos

referentes à dor, pressão, temperatura e propriocepção geral. Têm seu corpo

celular localizado nos gânglios espinhais na raiz dorsal do nervo espinhal

(DORETTO, 2005; LUNDY-EKMAN, 2008).

Morfologicamente, o nervo periférico é formado por duas principais

classes de células: célula nervosa (neurônio) e células da neuroglia (células de

Schwann). O neurônio é a unidade morfofuncional fundamental do sistema

nervoso e, geralmente, é dividido em corpo celular ou soma, dendrito e axônio

(KANDEL et al., 2000; GARTNER & HIATT, 2007).

O corpo celular de um neurônio é o centro metabólico que contém o

núcleo e pericário (citoplasma que circunda o núcleo). No pericário estão

presentes as organelas como o corpúsculo de Nissl que corresponde ao retículo

endoplasmático rugoso responsável pela síntese das proteínas da célula; retículo

endoplasmático liso que pode armazenar íons cálcio; neurofilamentos e

microtúbulos que promovem sustentação mecânica; aparelho de Golgi, o qual se

acredita ser responsável pelo armazenamento de substâncias

neurotransmissoras; e mitocôndrias. A partir do corpo celular são emitidos os

dendritos e o axônio da célula nervosa (GENESER, 2003; GARTNER & HIATT,

2007; KIERSZENBAUM & TRES, 2012).

Os dendritos são prolongamentos curtos que carreiam informações

para o corpo celular. Já o axônio é um prolongamento único e longo que leva o

impulso nervoso até seu terminal pré-sináptico para outra célula. Possui

membrana plasmática denominada de axolema e citoplasma axonal (axoplasma)

4

que contém mitocôndrias esparsas, vesículas em trânsito, neurofilamentos e

microtúbulos, que são essenciais para conferir sustentação e realizar o fluxo

axoplasmático. O axônio pode conter, ainda, bainha de mielina, a qual é formada

pelas células de Schwann (SUMMERS et al., 1995; KANDEL et al., 2000;

KIERSZENBAUM & TRES, 2012).

Os neurônios têm três tipos de proteínas citoesqueléticas:

microfilamentos, microtúbulos e neurofilamentos (NF). Os microfilamentos e os

microtúbulos estão envolvidos nas funções de transporte de substâncias pelo

citoplasma neuronal. Já os NF são os principais elementos estruturais dos

neurônios. Estes formam uma rede tridimensional que converte o axoplasma em

um gel extremamente resistente e estruturado. Têm como principal papel a

sustentação estrutural e possuem cerca de 10 nm de diâmetro (NOLTE, 2008;

WOOLF et al., 2009).

Além disso, os NF são compostos por três grupos de proteínas: NF-L,

NF-H e NF-M. Esses dois últimos possuem prolongamentos que se projetam para

a superfície, mantendo as propriedades de espaçamento entre os NF paralelos do

axônio. Em estágios iniciais de diferenciação, quando o axônio em crescimento se

projeta para a célula-alvo, há poucos NF no axoplasma, mas um grande número

de microtúbulos. Assim que as células nervosas atingem com sucesso a região-

alvo, são preenchidas com NF que proporcionam sustentação bem como

aumento acentuado no diâmetro do axônio (KARP, 2005).

As células de Schwann, por sua vez, são as células da neuroglia do

SNP que formam a bainha de mielina para recobrir o axônio. Ao longo de um

único axônio existem várias células de Schwann formando sua bainha de mielina.

Cada segmento de mielina é chamado de internodo. São separados uns dos

outros pela região conhecida como nodo de Ranvier. Neste local, desprovido de

bainha de mielina, contém alta concentração de canais de sódio dependente de

voltagem, o que facilita a propagação do impulso nervoso (potencial de ação) de

forma saltatória (GENESER, 2003; KIERSZENBAUM & TRES, 2012).

Os nervos periféricos possuem, ainda, três envoltórios de tecido

conjuntivo: epineuro, perineuro e endoneuro. O epineuro é a camada mais

externa do nervo e é formada por colágeno tipo I e fibroblastos. As fibras

colágenas estão alinhadas e orientadas para impedir danos por distensão

5

excessiva dos nervos. O perineuro, por sua vez, recobre o fascículo nervoso que

é constituído pelo agrupamento de vários axônios. A superfície interna do

perineuro é formada por várias camadas de células epitelióides unidas por

zônulas de oclusão e circundadas por lâmina basal que isola o ambiente neural.

Entre as camadas de células epitelióides estão presentes fibras colágenas

esparsas dispostas longitudinalmente e entrelaçadas com fibras elásticas. O

endoneuro é a camada mais interna dos três envoltórios. Recobre os axônios

individualmente e fica em contato direto com a lâmina basal da célula de

Schwann. É formado por tecido conjuntivo frouxo composto por fibrilas de

colágeno tipo II, fibroblastos, vasos sanguíneos e mastócitos (GARTNER &

HIATT, 2007; KIERSZENBAUM & TRES, 2012).

3 Lesões em nervos periféricos

Existem vários tipos de lesões atribuídas aos nervos. Em uma lesão

traumática, podem ser comprimidos, distendidos e algumas vezes rompidos.

Quando o nervo encontra-se exposto, pode estar seccionado, lacerado ou

esmagado. Em quaisquer destes exemplos, a lesão do nervo provoca alterações

orgânicas ou funcionais no músculo e na pele que é inervada (ROSA FILHO,

2004).

A primeira proposta de classificação de lesões do nervo periférico foi

feita por Herbert John Seddon, em 1942, que dividiu as lesões traumáticas do

nervo em: neuropraxia, axonotmese e neurotmese. Esta classificação foi baseada

no grau de ruptura das estruturas internas do nervo que estavam relacionadas

com o prognóstico de recuperação. A neuropraxia é a forma mais branda de lesão

nervosa caracterizada por desmielinização segmentar das fibras nervosas de

grande calibre, sem interrupção axonal que leva ao comprometimento da

condução nervosa por tais fibras. Neste tipo existe apenas um bloqueio fisiológico

capaz de causar paralisia, porém não há degeneração. Terminado o bloqueio,

observa-se regeneração completa dos axônios em poucos dias com nenhuma

sequela. Na axonotmese há interrupção axonal, levando à degeneração

Walleriana distal, porém o tecido conectivo permanece intacto e, dessa maneira,

6

poderá ou não haver regeneração da fibra nervosa. Já na neurotmese há

interrupção completa do nervo. Em lesões desta maneira somente um

procedimento cirúrgico com aproximação das extremidades poderá favorecer a

regeneração dos axônios seccionados. Além da classificação proposta por

Seddon, existe outra proposta por Sydney Sunderland, em 1951, na qual este

autor subdivide a lesão de nervo periférico em cinco subtipos descritos na Tabela

1 (BURNETT & ZAGER, 2004; CAMPBELL, 2008).

TABELA 1 – Classificação das lesões nervosas periféricas proposta por Sydney

Sunderland em 1951

TIPO LESÃO

I Bloqueio da condução nervosa sem lesão axonal

II Lesão axonal com preservação do tubo endoneural

III Lesão axonal com ruptura dos tubos endoneurais, mas perineuro e

epineuro permanecem intactos

IV Ruptura das fibras nervosas é total, mas epineuro permanece intacto

V Ruptura total do nervo

Fonte: Adaptado de BURNETT & ZAGER (2004) e CAMPBELL (2008)

Quando um axônio no sistema nervoso periférico sofre lesão, há

interrupção de sua integridade. O segmento axonal situado distalmente ao ponto

de transecção não recebe mais suprimento a partir do corpo celular do neurônio e

a transmissão sináptica é interrrompida. Neste segmento, o axônio e a bainha de

mielina degeneram, fragmentam-se em pedaços menores, e são fagocitados e

removidos por macrófagos e células de Schwann. Essa sequência de eventos é

referida como degeneração Walleriana (Figura 1) (LENT, 2005; NOLTE, 2008;

STOPIGLIA & PEDRO, 2009). No coto proximal da fibra nervosa, o axônio sofre

degeneração semelhante até o próximo nódulo de Ranvier, em direção retrógrada

(STOPIGLIA & PEDRO, 2009).

7

FIGURA 1 - Representação esquemática do processo de degeneração e regeneração

nervosa periférica. Lesão do nervo periférico normal (A); processo de

degeneração retrógrada e Walleriana (B); formação dos cones de

crescimento axonais e Bandas de Büngner (C); crescimento dos axônios

em direção ao alvo distal e início da formação da bainha de mielina (D).

GDNF: fator neurotrófico derivado da glia; LIF: fator inibitório de leucina;

CTNF: fator neurotrófico ciliar; MAG: glicoproteína associada a mielina;

MBP: proteína básica de mielina; P0: proteína zero; NT: neurotrofinas;

BDNF: fator neurotrófico derivado do encéfalo; NGF: fator de crescimento

do nervo

Fonte: Adaptado de STANG et al. (2009)

Concomitantemente, há tumefação do corpo celular do neurônio,

deslocamento do núcleo para a periferia e formação de múltiplos nucléolos. Os

corpúsculos de Nissl parecem se retrair, porque o retículo sarcoplasmático

granular se dispersa, uma vez que o neurônio tenta sintetizar os componentes

necessários para se reconstruir e o seu RNA total aumenta em quantidade. Essa

série de modificações é chamada de cromatólise, caracterizada pela reduzida

coloração citoplasmática e granularidade celular (LUNDBORG, 1987; MÜLLER &

STOLL, 1999; LENT, 2005; NOLTE, 2008; STOPIGLIA & PEDRO, 2009).

Quanto mais distal ao corpo celular a lesão ocorrer, será mais

favorável, e isso depende do tipo (esmagamentos ou transecções do tronco

8

nervoso) e da extensão da lesão, bem como da vitalidade dos tecidos

circundantes ao nervo periférico (STOPIGLIA & PEDRO, 2009). Se houver lesão

próxima ao corpo do neurônio poderá ocorrer morte por apoptose do corpo

celular. Entretanto, se houver restabelecimento deste, a fibra nervosa poderá

apresentar regeneração (LUNDBORG, 1987; MÜLLER & STOLL, 1999;

STOPIGLIA & PEDRO, 2009).

Neste processo de regeneração da fibra nervosa periférica as células

de Schwann apresentam papel fundamental. Com a extrusão inicial da bainha de

mielina no coto distal, estas células são estimuladas a proliferarem e dividirem-se,

alinhando-se dentro do tubo da lâmina basal para formar uma coluna chamada de

banda de Büngner. Dispostas em colunas, as células de Schwann propiciam um

tropismo mecânico, guiando os axônios em regeneração aos seus alvos

(GRIFFIN & HOFFMAN, 1993; IDE, 1996; MÜLLER & STOLL, 1999; DAHLIN &

BRANDT, 2004; PURVES et al., 2005).

Antecedendo ao encontro do axônio com seu alvo, no segmento

proximal do axônio, muitos brotamentos (neuritos) emergem, formando o cone de

crescimento, acompanhado de filopódios. Esses são orientados pelo contato com

as glicoproteínas da lâmina basal das células de Schwann, entre elas a laminina e

fibronectina, além das moléculas de adesão, como molécula neural de adesão

celular (N-CAM), laminina 1 (L1), N-caderina e E-caderina (IDE, 1996; DAHLIN &

BRANDT, 2004; STOPIGLIA & PEDRO, 2009).

Para que ocorra o crescimento do cone, faz-se necessária a presença

de substâncias que auxiliem na sobrevivência, extensão e maturação do axônio.

Essas substâncias são os fatores de crescimento, ou também chamados de

fatores tróficos. Em nervos normais intactos, estes fatores são produzidos nos

órgãos alvos e conduzidos ao corpo celular do neurônio por transporte retrógrado.

Se ocorrer interrupção da comunicação entre o axônio e o corpo celular por

alguma lesão, as células de Schwann produzem estes fatores, incluindo

neurotrofinas como fator de crescimento neural (NGF), fator neurotrófico derivado

do encéfalo (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3), neurotrofina 4/5 (NT-4/5), neurotrofina

6 (NT-6), neurotrofina 7 (NT-7), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator inibitório de

leucina (LIF), interleucina 6 (IL-6) e fator de crescimento fibroblástico 1 e 2 (FGF-1

9

e FGF-2) (DODD & JESSELL, 1988; LEE & WOLF, 2000; SOFRONIEW et al.,

2001; MADDURI & GRANDER, 2012).

Desta forma, os cones de crescimento, orientados por seus neuritos,

crescem em direção distal, até atingirem o local da lesão, conectando-se com o

segmento distal do nervo, que apresenta seus tubos endoneurais prontos para

receber o axônio em regeneração. Durante a regeneração, o contato entre o

axônio e as células de Schwann vai estimular a remielinização dos axônios já

regenerados e, a partir deste processo, a transmissão eletroquímica entre o corpo

celular e o órgão alvo é restabelecida (FAWCETT & KEYNES, 1990; IDE, 1996).

Finalmente, o corpo do neurônio cromatólico recupera sua aparência original

(KANDEL et al., 2000).

4 Diagnóstico e recuperação das neuropatias

O diagnóstico de lesão no nervo periférico pode ser realizado pelo

histórico e exame clínico do animal. Podem estar presentes diminuição do tônus e

trofismo muscular, arreflexia e parestesia ou hiperestesia, que pode induzir o

comportamento de automutilação (ARIAS & STOPIGLIA, 1997; CRUZ et al., 1998;

ALONSO & REIS, 2000; OLBY et al., 2008).

Segundo LUNDBORG (1987), com a denervação do músculo,

rapidamente sobrevém hipotrofia. No primeiro mês há uma perda no peso

muscular de 30%, no segundo 60% e em quatro meses pode chegar a 80%. E

como sequelas da denervação muscular, há a possibilidade do desenvolvimento

de contratura muscular que em pacientes em fase de crescimento pode-se gerar

deformidades esqueléticas (OLBY et al., 2008).

Para diagnosticar com precisão o tipo e a extensão da lesão existente,

faz-se necessário a eletromiografia, que consiste no estudo da atividade da

unidade motora. Essa unidade é composta por uma célula do corno anterior, um

axônio, suas junções neuromusculares e as fibras musculares inervadas

especificamente por aquele axônio (ARIAS et al., 1997; CRUZ et al., 1998;

PORTEY & ROY, 2004).

10

Outra técnica utilizada para estabelecer diagnóstico e recuperação de

neuropatias é a biopsia de nervos, por meio da coleta de fascículos. Esta técnica

preserva a integridade eletrofisiológica do nervo e não provoca alterações clínicas

ou sensoriais. A formação de neuroma é pequena e não produz parestesia clínica

durante o pós-operatório (BRAUND et al., 1979). É importante que a biopsia não

lesione vasos sanguíneos, tendões e articulações, não cause desconforto pós

operatório e não predisponha o nervo a futuras lesões. Estes cuidados fazem com

que a biopsia seja pouco utilizada na rotina clínica, pela dificuldade do

procedimento (BRAUND et al., 1979; BRAUND, 1991; ARIAS et al., 1997).

Entretanto, experimentalmente é uma técnica muito utilizada por

pesquisadores (ROSSETO et al., 2001; MAZZER et al., 2006) pois permite, pelo

exame histológico, a análise morfológica e morfométrica. A primeira permite obter

informações como presença de hematoma, infiltrado inflamatório, proliferação

axonal, células espumosas, vasos endoneurais íntegros e fibras nervosas

lesadas. Já a análise morfométrica permite contar ou medir o diâmetro das fibras

mielínicas e amielínicas e quantificar a perda global destas (CHIMELLI, 1998;

MAZZER et al., 2006).

5 Métodos de avaliação funcional do nervo isquiático de rato

O nervo ciático ou isquiático (INTERNATIONAL COMMITTEE ON

VETERINARY GROSS ANATOMICAL NOMENCLATURE, 2012), de interesse

para este estudo, origina-se dos segmentos espinhais de L3 a L6 (ASATO et al.,

2000; RIGAUD et al., 2008), passa pela região glútea, segue caudalmente ao

fêmur e se divide na região caudal ao joelho em três grandes ramos: o nervo

fibular comum, tibial e sural. O nervo isquiático inerva os músculos do

compartimento caudal do membro pélvico (DYCE et al., 2010). Para avaliar

funcionalmente este nervo podem ser utilizados dois métodos: Índice Funcional

do Ciático (IFC) e o Ângulo do Tarso (AT).

Em 1982, DE MEDINACELI et al. desenvolveram o IFC, método

quantitativo para avaliar o grau de lesão e recuperação funcional do nervo

isquiático de ratos. Para implementar este método, os animais foram

11

condicionados a caminharem em uma passarela de madeira de 43 cm de

comprimento e 8,7 cm de largura, que terminava em uma casinhola escura na

qual os ratos se abrigavam. Após bem treinados, sobre o piso da passarela era

colocada uma tira de filme radiográfico e a face plantar era molhada em líquido

revelador. Em seguida, os animais eram colocados para caminhar sobre o filme,

deixando as impressões das patas. Os dados mensuráveis obtidos manualmente

representam a distância entre as patas dos membros posteriores (TOF – to other

foot); o comprimento da pata (PL – print length) que representa a distância entre

os dois pontos mais extremos da pegada no sentido longitudinal; o espalhar total

dos dedos (TS - total spread) que corresponde à distância entre os dois pontos

mais extremos da pegada no sentido transversal e o espalhar dos dedos

intermediários (IT - intermediate toes) que é a distância entre os dois dedos

intermediários (Figura 2) e, então, introduzidos na seguinte Equação (1) (MONTE-

RASO et al., 2008):

[ (

) (

) (

) (

)]

(1)

Na qual, ETOF corresponde à distância do pé experimental ao normal;

NTOF é a distância do pé normal ao experimental; NPL é o comprimento da

pegada do pé normal; EPL corresponde ao comprimento da pegada do pé

experimental; NTS é a amplitude da pegada no sentido transversal do pé normal;

ETS é a amplitude da pegada no sentido transversal do pé experimental; NIT é a

amplitude da pegada entre dedos intermediários do pé normal e EIT é a amplitude

da pegada entre dedos intermediários do pé experimental (MONTE-RASO et al.,

2008).

O resultado desta equação é expresso em porcentagem, indicando que

a função normal tem um índice de 0%, enquanto que -100% representa a perda

completa da função, ou seja, lesão total do nervo (DE MEDINACELI et al., 1982).

12

FIGURA 2 - Impressão das pegadas de rato para calcular o

Índice Funcional do Ciático (IFC), em que TOF

é a distância entre os membros pélvicos, PL é

o comprimento da pegada, TS é a amplitude da

pegada no sentido transversal e IT é a

amplitude da pegada entre dedos

intermediários. As letras N e E que antecedem

estes parâmetros representam os valores

aferidos, respectivamente, da pata normal e

experimental

Fonte: Adaptado de DE MEDINACELI et al. (1982)

Este índice foi modificado posteriormente por CARLTON & GOLBERG

(1986) que acrescentaram uma avaliação funcional também para lesões nos

nervos fibular (IFP) e tibial (IFT), eliminando o parâmetro TOF preconizado por DE

MEDINACELI et al. (1982) que induzia a muitos erros de cálculo.

Em sequência, BAIN et al. (1989), baseados na análise de regressão

linear múltipla de fatores derivados das medidas das impressões das pegadas de

ratos, modificaram os Índices Funcionais do Ciático (Equação 2), do Tibial

(Equação 3) e do Fibular (Equação 4) acrescentando um fator de correção para

cada uma das variáveis:

13

I C - ( -

) 1 (

-

) 1 (

I - I

I ) - (2)

I - ( -

) 1 (

-

) (

I - I

I ) - (3)

I 1 ( -

) (

-

) -1 (4)

A fórmula de cálculo do IFC proposto por BAIN et al. (1989) para

análise funcional da marcha é a mais empregada pela maioria dos autores para

medir índice de recuperação funcional do nervo isquiático (BUERGER et al.,

2004; MONTE-RASO et al., 2006a; MONTE-RASO et al., 2006b; GASPARINI et

al., 2007; REIS et al., 2009, GOUDARZI et al., 2013).

DIJKSTRA et al. (2000) foram os primeiros a empregar um método de

análise digital para avaliar as pegadas do IFC. O método consistia na filmagem

das pegadas em uma passarela de acrílico, com espelho posicionado a 45° sob

esta. Posteriormente, as imagens retiradas dos vídeos foram utilizadas para a

aferição das medidas em computador. Segundo estes autores, a análise digital

teve a vantagem, com relação ao método convencional, de permitir a visualização

da superfície plantar do animal e de observar, ao mesmo tempo, o

posicionamento do pé e de seus dedos.

Desde então, diversos autores como VAREJÃO et al. (2001),

GASPARINI et al. (2007), MONTE-RASO et al. (2008), DINH et al. (2009),

JUNGNICKEL et al., 2010), MARCOLINO et al. (2010), MONTE-RASO et al.

(2010) e MARCOLINO et al. (2013) vêm utilizando o método digital por ser mais

rápido e prático, que evita “borrões” nas pegadas obtidas nos papéis após pintar a

superfície plantar e dedos dos animais com tinta.

VAREJÃO et al. (2003), PATEL et al. (2006), AMADO et al. (2010),

JOÃO et al. (2010) e AMADO et al. (2011) propuseram outro método de análise

funcional após lesão em nervo isquiático de ratos, a aferição do Ângulo do Tarso,

obtido durante a fase de apoio da marcha. Segundo estes autores, este método é

preferível ao IFC por ser mais sensível em detectar alterações funcionais e não

sofrer influência das contraturas musculares desenvolvidas por animais que

sofreram lesão de nervo periférico.

14

Contudo, para analisar o Ângulo do Tarso de ratos é preciso identificar

corretamente o posicionamento da articulação tibiotársica durante a marcha

destes animais que é dividida em duas fases: apoio e balanço. A primeira inicia-se

assim que o animal toca a extremidade dos dedos no solo e termina quando os

retira desta superfície. A fase de balanço, porém, inicia-se quando termina a fase

de apoio, enquanto o membro está sem apoiar no solo. A fase mais importante

para analisar a função do membro, após lesões de nervo periférico, é a de apoio,

pois os músculos plantiflexores têm maior ação (VAREJÃO et al., 2002).

Acrescentam, ainda, que a fase de apoio divide-se em “initial contact” (IC),

quando se inicia contato dos dígitos com a superfície; “oppposite toe-off” quando

os segmentos proximal e distal do pé se aproximam do solo; “hell-rise” quando o

membro oposto passa a frente do membro que está apoiado; e “toe-off” ( O) que

é o término da fase de apoio, quando o membro é retirado do solo (Figura 3).

FIGURA 3 - Fase de apoio da marcha de rato. “Initial contact” (A);

“opposite toe-off” (B); “Heel-rise” (C); “Toe-off” (D)

Fonte: VAREJÃO et al. (2002)

15

VAREJÃO et al. (2003) compararam o IFC com o Ângulo do Tarso de

ratos que sofreram axonotmese do nervo isquiático. Após oito semanas, os

animais apresentaram 100% de melhora funcional pelo IFC. Porém, pelo Ângulo

do Tarso, estes animais ainda apresentavam déficit funcional ao final do

experimento, o que demonstrou que o método de avaliação funcional pelo Ângulo

do Tarso foi mais preciso em detectar pequenas mudanças funcionais. Com isso,

concluíram que os animais não se recuperaram 100% em oito semanas como foi

demonstrado pelo IFC.

6 Tratamento das lesões nervosas periféricas

Em lesões do tipo axonotmese, dependendo da porcentagem de fibras

lesionadas, e neurotmese, o nervo deverá ser submetido à intervenção cirúrgica

para a recuperação funcional do paciente (STOPIGLIA & PEDRO, 2009). A

reparação cirúrgica pode ser realizada por meio de várias técnicas, dentre elas

ressalta-se a neurorrafia epineural (DELISTAIANOV et al., 2006), neurorrafia

fascicular, neurorrafia epineural-fascicular combinada, enxertos nervosos, sutura

em padrão axial central, aplicação de adesivos de fibrina e tubulização com

câmaras constituídas de diferentes materiais (CONTESINI et al., 1992; CHEN et

al., 2000; SUFAN et al., 2001; ALLET et al., 2003; DELISTOIANOV et al., 2006).

A técnica de tubulização pode ser otimizada com acréscimo de fatores

neurotróficos, componentes da matriz extracelular ou componentes celulares

como as células de Schwann, entre os cotos nervosos no interior da câmara, a fim

de promover uma regeneração nervosa periférica precoce e de melhor qualidade

(CONTESINI et al., 1992; CHEN et al., 2000; SUFAN et al., 2001; ALLET et al.,

2003).

Coadjuvante ao tratamento cirúrgico faz-se necessário o tratamento

fisioterapêutico para promover de maneira precoce o retorno funcional do membro

acometido. Este tratamento tem como objetivo acelerar processos regenerativos,

prevenir contraturas musculares, deformidades esqueléticas e escaras, e

promover melhora da força muscular, sensibilidade, equilíbrio, propriocepção e

coordenação motora (OLBY et al., 2008; STOPIGLIA & PEDRO, 2009).

16

Na fisioterapia é comum a utilização de agentes físicos com finalidade

regenerativa. Para lesões nervosas periféricas, a estimulação elétrica

(MENDONÇA et al., 2003; LU et al., 2008), o ultrassom terapêutico (RASO et al.,

2005; MONTE-RASO et al., 2006b) e o laser de baixa intensidade (GIGO-

BENATO et al., 2005; REIS et al., 2009; GONÇALVES et al., 2010; SOUSA et al.,

2013) são utilizados com intuito de acelerar os processos regenerativos, e buscar

o retorno antecipado da funcionalidade do paciente.

Não há consenso sobre o tempo exato para se iniciar o tratamento

fisioterapêutico. Entretanto, alguns estudos mostram que uma intervenção

precoce deve ser realizada para uma boa recuperação funcional e para evitar

atrofia muscular, neuromas, contraturas musculares e alterações no mapa cortical

(PACTHER & EBERSTEIN, 1989; VAN MEETEREN et al., 1997; AL-MAJED et

al., 2000).

7 Laser de baixa intensidade

A utilização terapêutica da energia luminosa remonta aos primórdios da

civilização humana (MIKAIL, 2009). Em 1903, o prêmio Nobel de medicina foi

destinado ao Dr. Nielo Ryberg Finsen pela pesquisa relativa ao tratamento

realizado com a luz solar em pacientes que apresentavam Lupus vulgaris. Os

princípios que guiaram este tratamento foram propostos em 1917 por Albert

Einstein que descreveu a teoria dos quanta, que explicava, pela primeira vez, o

princípio da emissão estimulada de fótons, ou seja, como um átomo poderia

produzir energia. Entretanto, a primeira aplicação com sucesso da emissão

estimulada de microondas foi relatada por Gordon et al., em 1955. Estes

princípios, juntamente com o desenvolvimento de ressonadores ópticos, formaram

a base dos conhecimentos que levaram Schalow e Townes a desenvolverem um

aparelho chamado Optical MASER (Microwave Amplification by Stimulated

Emissions of Radiation) (PINHEIRO & FRAME, 1992; SÁNCHEZ, 2007).

Em 1960, Maiman, físico do Hughes Research Laboratories (Malibu,

Califórnia, USA) baseado nas teorias de Albert Einstein, obteve a emissão

estimulada de radiação no espectro visível, por meio da estimulação de um cristal

17

de rubi com intensos pulsos luminosos, denominado Stimulated Optical Radiation

(VARANDAS & GENOVESE, 2000; MIKAIL, 2009).

A partir disso, os aparelhos passaram a ser denominados de laser, que

é um acrônimo com origem na língua inglesa (Light Amplification of Stimulated

Emission of Radiation), que em português literal traduz-se por “Amplificação da

uz por missão stimulada de Radiação” ( Á CH Z ; MIKAI ).

Em 1965, foi criado por Sinclair e Knoll, um aparelho de laser com

efeito de bioestimulação dos tecidos, o chamado laser terapêutico (MESTER et

al., 1985; MAVROGIANNIS et al., 2004). Com isso, após a década de 1970, as

pesquisas nesta área se intensificaram principalmente na Europa e Estados

Unidos (MESTER et al., 1985).

Somente a partir da década de 1990, o laser foi reconhecido

cientificamente. Isto ocorreu após os trabalhos de iina Karu considerada “mãe

da laserterapia” que comprovou a ação dos diferentes comprimentos de onda no

metabolismo durante o processo de fosforilação oxidativa, resultando no aumento

da produção de ATP (adenosina trifosfato) (CHAVANTES & TOMIMURA, 2009a).

Para se compreender as características físicas do laser, faz-se

necessário entender os mecanismos da formação da luz. Trata-se de uma forma

de energia eletromagnética que é transmitida por partículas de energia

denominadas fótons que caminham em ondas no espaço (SÁNCHEZ, 2007;

MIKAIL, 2009).

De acordo com o comprimento dessas ondas, que tem como unidade

de medida o nanômetro (nm), a luz será representada por uma cor (Figura 4). A

luz visível se encontra apenas numa parte do espectro eletromagnético, entre 440

nm (violeta) e 700 nm (vermelho). Com comprimento de onda menor, tem-se a luz

ultravioleta, e com comprimento de onda maior, a infravermelha, que apesar de

não ser visível também faz parte do espectro óptico. A maioria dos aparelhos de

laser utilizados com fins terapêuticos emite ondas entre 600 e 1000 nm (DIFFERY

& KOCHEVAR, 2007; MIKAIL, 2009).

18

FIGURA 4 – Espectro de cores visíveis com comprimento de onda correspondente,

violeta (440 nm), azul (500 nm), verde (570 nm), amarelo (590 nm),

alaranjado (610 nm) e vermelho (700 nm) e regiões invisíveis

(ultravioleta e infravermelho)

Fonte: Adaptado de DIFFERY & KOCHEVAR (2007)

A luz do laser apresenta características especiais que a diferem da luz

comum. Para que ocorra a radiação, o aparelho de laser precisa conter uma

substância radioativa (cristal de Rubi ou Hélio-neônio). Essa deve ser capaz de

absorver energia de uma fonte externa, mudar sua configuração subatômica e

emitir fótons. A menor parte dessa substância é o átomo. Cada átomo é composto

por partículas fundamentais: prótons e nêutrons no núcleo e elétrons que vão

estar dispostos ao redor, em camadas orbitais com diferentes níveis de energia.

Os átomos da substância radioativa geralmente estão nos orbitais com níveis

mais baixos de energia, ou seja, no estado de repouso (LUI & ANDERSON,

2007).

Quando um elétron absorve energia necessária para ir a um orbital

com nível mais elevado de energia, muda para esse orbital. Quando isso ocorre,

diz-se que o átomo está num estado de excitação. Como essa nova estrutura é

muito instável, permanece pouco tempo nesse estado e logo retorna ao orbital de

origem, mas libera o excesso de energia na forma de fóton. A esse fenômeno dá-

se o nome de emissão espontânea (AGNE, 2005; DIFFERY & KOCHEVAR, 2007;

LUI & ANDERSON, 2007; MIKAIL, 2009).

Esse fenômeno se inicia ao ligar o aparelho, gerando uma descarga

elétrica por meio da qual os elétrons da substância radioativa passam a mudar de

órbita e emitir fótons. Quando um desses fótons colide com um elétron do átomo

vizinho, também permite que esse átomo mude de orbital temporariamente e, ao

retornar ao estado de repouso, também libere um fóton idêntico ao que foi

absorvido. Esse fóton pode colidir com o elétron de outro átomo, e assim por

19

diante. Deste modo, dentro do aparelho há dois espelhos nos extremos que

fazem com que a emissão estimulada se multiplique por reflexão, e parte da luz

emitida e amplificada sai por meio de um dos espelhos que é semirrefletor

(AGNE, 2005; LUI & ANDERSON, 2007; MIKAIL, 2009).

Os equipamentos de laser que possuem substância radioativa de

diodos, como o Arseneto de gálio e o Arseneto de gálio e alumínio, possuem o

mecanismo de funcionamento um pouco diferente da maioria dos outros

aparelhos. Consistem num "sanduíche" de pólos positivo e negativo, sendo a

radiação emitida pelas laterais desse “sanduíche”. Se as faces laterais forem bem

polidas perpendicularmente à saída do feixe, podem servir como os espelhos do

ressonador. Isso faz com que esses aparelhos sejam bem compactos (NICOLAU,

2001).

Devido a esses processos de formação, o laser tem três características

que o diferem da luz comum: é coerente, colimado e monocromático. Coerente,

porque todos os fótons são emitidos no mesmo comprimento de onda, e essas

ondas caminham em fase, ou seja, são sincrônicas no tempo e no espaço, sem

que haja colisão dos fótons na trajetória, o que acarretaria perda de energia. Não

havendo essa perda no caminho, a energia que sai do aparelho é a mesma que

chega ao tecido. Já a luz comum é composta por vários comprimentos de onda,

que partem de forma desordenada em várias direções, portanto não caminham

em fase (Figura 5). E, em razão da sobreposição das ondas, há colisão de fótons

e perda de energia na trajetória. Colimado, porque os feixes de luz são paralelos,

ou seja, todos os fótons caminham na mesma direção. Isto permite seu

direcionamento para um ponto determinado com mínima dispersão, possibilitando

o foco em diâmetro muito pequeno sem perda da intensidade conforme sua

distância (Figura 6). Finalmente, é caracterizado como monocromático, pois sua

luz possui apenas um comprimento de onda, portanto, uma única cor (Figura 7)

(AGNE, 2005; LUI & ANDERSON, 2007; MIKAIL, 2009).

20

FIGURA 5 – Característica de coerência da luz laser.

Comprimentos de onda coerente no tempo

e espaço (A). Comprimentos de onda

incoerentes no tempo e espaço (B)

Fonte: Adaptado de NEVES et al. (2005)

FIGURA 6 – Característica da luz laser de unidirecionalidade

ou colimação. A luz natural é divergente ao

contrário da luz LASER que é paralela ao tubo

onde é produzida

Fonte: Adaptado de NEVES et al. (2005)

FIGURA 7 – Característica da luz laser de

monocromaticidade que possui

apenas um comprimento de onda,

enquanto que a luz branca comum

possui vários comprimentos de onda,

portanto várias cores

Fonte: Adaptado de NEVES et al.( 2005)

LASER

21

Os aparelhos de laser são nomeados de acordo com a substância

radioativa que eles contêm. Essas substâncias podem estar na forma de cristais

sólidos, como o Rubi sintético, Neodímio: ítrio-alumínio-granada (Nd:YAG),

Hólmio: ítrio-alumínio-granada (Ho:YAG) e Érbio: ítrio-alumínio-granada (Er:YAG);

na forma de gases, como o Hélio-Neônio (HeNe), Argônio e o Dióxido de Carbono

(CO2); ou na forma de semicondutores diodos, como Arseneto de Gálio (AsGa) e

Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl) (DEDERICH & BUSHIK, 2004; AGNE,

2005; SÁNCHEZ, 2007; MIKAIL, 2009).

São classificados, também, pela potência, dividindo-se em laser de alta

intensidade (cirúrgico) e de baixa intensidade (terapêutico). O primeiro produz

efeito térmico, tem potência superior a 1 W (Watt) (CHAVANTES & TOMIMURA,

2009a) e é largamente empregado em cirurgias para coagular, seccionar ou

vaporizar tecidos, sendo os principais os de Rubi, CO2, Er:YAG, Ho:YAG e

Nd:YAG (DEDERICH & BUSHIK, 2004; AGNE, 2005).

Algumas especialidades médicas utilizam rotineiramente os efeitos do

laser cirúrgico, tais como: oftalmologia, dermatologia, angiologia, neurologia,

oncologia e também odontologia (OLK et al., 1999; BADER, 2000; FERRARIO et

al., 2000; HORLOCK et al., 2000; NELSON et al., 2000; ALIÓ et al., 2001;

NAVARRO et al., 2001; JALLO et al., 2002; AGARWAL & BHAGWAT, 2003;

AUTRATA & REHUREK, 2003; OH et al., 2003; PROEBSTLE et al., 2003;

MARMUR et al., 2004; VOGL et al., 2004; MUNDY et al., 2005; FERNANDES et

al., 2006; RODRIGUES DOS SANTOS et al., 2007; SIRKO et al., 2009;

STUKAVEC et al., 2009).

Ao contrário do laser cirúrgico, o laser terapêutico por ser de baixa

potência, não produz efeito térmico, emite no máximo 1 W de potência, portanto

seus efeitos são biomodulantes (CHAVANTES & TOMIMURA, 2009a). Entre as

substâncias que compõem os aparelhos de laser de baixa intensidade encontram-

se HeNe e os diodos AsGa e AsGaAl (NEVES et al., 2005; SÁNCHEZ, 2007;

MIKAIL, 2009).

O laser de HeNe é o mais antigo e surgiu na década de 1970. Emite

ondas de luz no espectro visível, geralmente em torno de 630 nm. Trabalha em

modo contínuo, mas pode ser pulsado. Sua potência é de 1mW a 10 mW. A

profundidade de penetração é de 6 mm a l0 mm, dependendo de sua potência. O

22

diodo semicondutor de Arseneto de gálio (AsGa) surgiu na década de 1980.

Possui comprimento de onda de 904nm no espectro infravermelho e usualmente

trabalha no modo pulsado, penetrando mais profundamente nos tecidos,

chegando a alcançar 30 mm a 50 mm. Já o diodo semicondutor de Arseneto de

Gálio e Alumínio (AsGaAl) tem comprimentos de onda de 780 a 870 nm. Sua luz é

invisível e está no espectro infravermelho. Alguns diodos AsGaAI possuem

comprimento de onda no espectro vermelho. Seu modo de operação é contínuo

na maioria dos aparelhos. A profundidade de penetração é de 20 a 30 mm. Esse

laser adquiriu muita popularidade nos anos de 1990 por ser um aparelho

pequeno, leve e de baixo custo, utilizando potências de até 40 mW (AGNE, 2005;

SÁNCHEZ, 2007).

A liberação dos feixes de luz do laser ocorre por um pequeno orifício

na ponta da caneta do aparelho, sendo útil para tratar áreas pequenas. Com isso,

existem duas técnicas de aplicação do laser terapêutico, a pontual e a por

varredura, que podem ser empregadas isoladas ou combinadas. Na primeira, a

caneta deve ficar em contato com a pele, de maneira perpendicular à área a ser

tratada. Isto é necessário para evitar reflexão dos raios na superfície da pele, o

que reduz a quantidade de energia absorvida pelos tecidos e, consequentemente,

a eficácia do tratamento. Recomenda-se distanciar os pontos entre um e dois

centímetros, de forma que é necessário irradiar vários pontos para abranger toda

a lesão. No caso de feridas, pode-se utilizar um filme plástico entre a superfície

desta e a do equipamento para possibilitar um melhor contato entre eles (AGNE,

2005).

Já na técnica por varredura, não há contato da ponta da caneta do

laser com a área a ser irradiada, devendo-se manter uma distância de 0,5 cm

entre eles, segundo recomendações de STEFANELLO & HAMERSKI (2006).

Realiza-se movimento lento, contínuo sobre toda a superfície da lesão, de

maneira a depositar uniformemente a energia no local. A caneta também deve

estar perpendicular ao alvo para evitar reflexão. Este método é bastante

empregado nas lesões dermatológicas como úlceras de decúbito e diabéticas

(AGNE, 2005; MIKAIL, 2009).

As principais indicações do uso do laser de baixa intensidade são para

tratamentos de áreas que manifestem inflamação, edema e dor ou regeneração e

23

cicatrização de tecidos. Deste modo, indica-se para cicatrização de feridas

(queimaduras e úlceras de pressão), regeneração de nervos, reparação óssea,

osteoartrites, osteoartroses, gengivites, hidrolipodistrofia (celulite), miosites e

tendinites. No entanto, recomenda-se evitar a aplicação do laser na região dos

olhos, gônadas, útero gravídico, placa epifisária, gânglios simpáticos, nervo vago

e tumores (AGNE, 2005; MILLIS et al., 2008; MIKAIL, 2009).

8 Dosimetria do laser de baixa intensidade

Diversos são os parâmetros que descrevem a radiação emitida pelos

equipamentos de laser e que são necessários para saber a dose de tratamento.

São eles: o comprimento de onda (nm); potência de saída, que é a energia

emitida em segundos, cuja unidade é expressa em watts (W); densidade de

potência, definida como a potência de saída de luz por área de irradiação e

unidade expressa em watts por centímetro quadrado (W/cm²); e a densidade de

energia, que expressa a dose emitida em joule por centímetro quadrado (J/cm²).

Estes fatores são importantes nos efeitos fisiológicos da radiação laser, pois

determinam principalmente a absorção da radiação pelas biomoléculas e a sua

profundidade de penetração (CHOW et al., 2004; AGNE, 2005).

A quantidade de energia depositada no tecido, chamada de densidade

de energia ou fluência, é expressa em joules por centímetro quadrado (J/cm2) e

está diretamente relacionada ao tempo de exposição da radiação. Para o cálculo

da fluência, deve-se levar em consideração a potência de saída do laser; o tempo

de irradiação; e a área de saída do feixe de luz. Desta forma, tem-se (Equação 5)

(CHAVANTES & TOMIMURA, 2009b):

P x T DE = _ ____ (5) A

24

Na qual DE é a densidade de energia (J/cm²); P é a potência de saída

(W); T é o tempo de aplicação em segundos; e A é a área de saída do feixe de luz

(cm²).

9 Interação do laser de baixa intensidade sobre os tecidos

Quando a energia liberada pelo aparelho de laser é absorvida pelas

células, criará uma série de efeitos biológicos. Essa energia entregue ao tecido

por intermédio dos campos eletromagnéticos causa uma espécie de ressonância

desses campos com as biomoléculas, alterando cargas específicas nas

membranas e nas proteínas da superfície. Quando um fóton é absorvido por uma

molécula, essa fica em estado de excitação e pode-se mudar a configuração dos

seus elétrons. Tal fenômeno provoca modificações na conformação molecular ou

na configuração espacial dessas substâncias, o que desencadeia diferentes

respostas. Dessa forma, o laser funciona como uma fonte de sinal

eletromagnético que acelera as reações de transferência de elétrons (MIKAIL,

2009).

O laser de baixa intensidade tem ação principalmente nas organelas

celulares, em especial nas mitocôndrias, lisossomos e membrana celular,

promove aumento de ATP (adenosina trifosfato) e modifica o transporte iônico. Há

fotorreceptores celulares, sensíveis a determinados comprimentos de onda que,

ao absorverem fótons, desencadeiam reações químicas. Desta forma, o laser de

baixa intensidade acelera o transporte de elétrons e aumenta a síntese de ATP,

pela glicólise e fosforilação oxidativa, e o gradiente de prótons, que acarreta em

aumento do transporte de Na+/H+ e de Ca+²/Na+. O ATP controla também o nível

de AMPc (adenosina monofosfato cíclico) que favorece processos regenerativos

por estimular eventos de transcrição em células o que desencadeia aumento de

mitose celular (KARU, 1999; HAMBLIN & DEMIDOVA, 2006; HUANG et al.,

2011).

KARU (1988) concluiu que vários tipos de laser aumentam a

concentração de AMPc em fibroblastos de hamster, o que favorece os processos

25

regenerativos. LUBART et al. (1990) também comprovaram que a radiação laser

acelera a mitose celular em fibroblastos.

Existem várias teorias para explicar a ação do laser na célula. Uma

delas refere-se à formação de uma pequena quantidade de óxido nítrico. Esse

radical livre em grande quantidade é prejudicial à célula, mas em pequena

quantidade atua como mensageiro na cascata de eventos que sucedem a

irradiação, influenciando, por exemplo, a formação de ATP, que é a fonte de

energia da célula (KARU et al., 2005; HUANG et al., 2011).

A influência do laser de baixa intensidade nos processos oxidativos foi

demonstrada por trabalho de KARU (1988) que sugeriu que o citocromo c oxidase

é um importante fotorreceptor. A irradiação neste fotorreceptor muda sua forma

para um estado mais reduzido, o que promove transporte de elétrons. Além disso,

o laser acelera a transferência de elétrons na cadeia respiratória devido às

mudanças nas propriedades de oxidação e redução dos carreadores após a

fotoexcitação dos seus estados eletrônicos (KARU, 1988).

BJORDAL et al. (2006) realizaram revisão sistemática sobre os efeitos

biológicos e clínicos de curto prazo da terapia laser de baixa intensidade em dor

aguda provocada por lesões em tecidos moles. Destacaram forte evidência que o

laser pode modular a dor inflamatória por reduzir os níveis de mediadores

inflamatórios (PGE2, RNAm de COX-2, IL-1β α) o influxo de células

neutrofílicas, o estresse oxidativo, a formação de edema e a hemorragia, de forma

dose-dependente, com dose media de 7,5 J/cm², com variação de 0,3-19 J/cm².

No entanto, apesar do grande número de estudos que exploram como

o laser de baixa intensidade funciona, o exato mecanismo de sua ação ainda

necessita ser completamente elucidado (HASHMI et al., 2010).

10 Efeitos do laser de baixa intensidade sobre os nervos periféricos

O laser começou a ser utilizado no processo de regeneração e

recuperação funcional de lesões de nervos periféricos na década de 1980,

havendo diversos relatos sobre os resultados obtidos (BASFORD, 1995).

26

Vários comprimentos de onda do laser foram avaliados, sendo o do

HeNe um dos primeiros a serem estudados em regeneração nervosa periférica.

Posteriormente, outros comprimentos de onda foram desenvolvidos, como o

AsGaAl, que entretanto revelou a necessidade de maiores investigações dos

efeitos desta substância radioativa no tecido nervoso periférico. Em inúmeras

publicações, a descrição dos parâmetros de irradiação, dose e potência média,

tempo e modo de aplicação entre outros, não seguem uma métrica padrão, o que

remete a interpretações discordantes dos resultados obtidos e dificuldades

comparativas dos mesmos (REIS et al., 2009).

NISSAN et al. (1986), por meio da irradiação transcutânea dos nervos

isquiáticos de ratos com laser HeNe, com doses variando entre quatro e 10

J/cm², observaram um aumento significativo no potencial de ação, efeito que

poderia perdurar por até oito meses após a última aplicação.

Contrariando esses achados, WU et al. (1987) não obtiveram respostas

neurofisiológicas ou alteração do potencial de ação provocados pela estimulação

transcutânea do nervo mediano de nove indivíduos com laser HeNe.

SHAMIR et al. (2001) realizaram neurotmese de nervo isquiático de

ratos, seguido de neurorrafia e tratados com aplicação pontual de laser (780 nm)

por 30 minutos sobre o segmento espinhal correspondente ao nervo lesado, por

21 dias consecutivos. Os resultados deste trabalho mostraram, por avaliação

morfométrica, que houve aumento significativo do diâmetro e do número de

axônios do grupo tratado em relação ao não-tratado, sugerindo que o laser

acelerou a regeneração de nervos periféricos após transecção completa seguida

de neurorrafia.

ROCHKIND et al. (2007) após realizarem neurotmese do nervo

isquiático de ratos, fizeram a tubulização do segmento em tudo de ácido

poliglicólico e trataram por 14 dias consecutivos com aplicação pontual de laser

(780 nm, 200 mW) sobre o segmento espinhal na medula (15 minutos)

correspondente ao nervo lesado e sobre a ferida cirúrgica (15 minutos). Após três

meses, 70% do grupo irradiado com laser apresentou resposta evocada

somatossensorial positiva e somente 30% do grupo controle (não-irradiado)

apresentou melhora semelhante. Em ambos os grupos os nervos foram

27

reconectados, mas no grupo irradiado houve maior número de axônios

mielinizados avaliados por morfometria.

TAKHTFOOLADI et al. (2012) avaliaram os efeitos do laser com

comprimento de onda de 680 nm em lesão do tipo neurotmese em ratos.

Relataram que, 30 dias após a lesão, no grupo tratado houve maior quantidade de

células de Schwann e com presença de núcleo ativo, característico de célula em

proliferação. Além disso, observou-se maior quantidade de vasos sanguíneos e

menor degeneração Walleriana.

STAINKI et al. (1998) estudaram o uso do AsGa, 904 nm, na forma

pontual com 6 J/cm2 e na forma de varredura com 1 J/cm2, em neurorrafia

secundária em cães, tratados por 10 dias, verificaram redução da reação

inflamatória ao fio de sutura, mas maior possibilidade de formação de neuromas

devido à intensa proliferação de tecido conjuntivo. Observaram, ainda,

recuperação funcional dos animais tratados, pela característica da deambulação,

teste de sensibilidade e avaliação motora.

Já BAGIS et al. (2003) não encontraram diferenças morfológicas e

eletrofisiológicas nos nervos axonotomizados e submetidos ao tratamento com

laser de baixa intensidade com comprimento de onda de 904 nm. Porém estes

autores utilizaram como controle o mesmo animal e sabe-se que o laser possui

efeito sistêmico (ROCHKIND et al., 1989). Além disso, pôde-se atribuir aos

resultados que foi pequeno o tempo de tratamento empregado com o laser, de

apenas sete dias.

Com relação à utilização do laser AsGaAl, em pesquisa realizada por

REIS et al. (2009), em nervos isquiáticos de ratos submetidos à neurotmese e

tratados com densidade de energia de 4 J/cm² por 21 dias, avaliou-se o Índice

Funcional do Ciático (IFC). Não encontraram diferenças significativas no IFC entre

o grupo controle e o irradiado. Entretanto, o grupo irradiado apresentou IFC maior

que o outro grupo a partir do sétimo dia de tratamento, além disso, o grupo

tratado não apresentou infecções e deiscência da ferida cirúrgica, as quais

estiveram presentes no grupo controle.

Em outro estudo envolvendo tubulização com câmara de

politetrafluoretileno do nervo alveolar inferior de coelhos associado ao uso do

laser AsGaAl (70 mW), também reportaram por morfometria aumento do número

28

de axônios mielinizados nos animais irradiados. Além disso, observaram maior

quantidade de tecido perineural intrafascicular nos animais não tratados com laser

(MILORO et al., 2002).

CAMBIER et al. (2000) estudaram os efeitos do laser de baixa

intensidade a 830 nm, sobre as características de condução nervosa sensitiva em

15 sujeitos saudáveis. Relataram que houve diminuição significativa na

velocidade de condução nervosa no tratamento com 5,1 J/cm2, sendo que tal

resultado explicou o alívio da dor mediado pelo laser.

SOUSA et al. (2009) reportaram melhora na avaliação funcional de

ratos submetidos à axonotmese do nervo fibular comum com aplicação da

radiação laser a 830 nm por 21 dias e fluência de 20 J/cm², somente no 14º dia de

avaliação funcional, tanto no grupo tratado no local da lesão do nervo quanto no

grupo tratado na região da medula espinhal.

Já MARCOLINO et al. (2013) avaliaram a função do nervo isquiático

por meio do IFC em ratos submetidos a axonotmese e tratados com laser a 830

nm, com fluências de 10, 40 e 80 J/cm². Após 21 dias, observaram que os

animais tratados com laser de baixa intensidade nas fluências maiores, de 40 e

80 J/cm², obtiveram os melhores resultados funcionais. Contudo, afirmam que não

há consenso na literatura quanto aos parâmetros ideais para utilização do laser

na regeneração de nervos periféricos.

Os estudos experimentais retratam o uso do laser a 830 nm em lesões

de nervo periférico do tipo axonotmese. Em lesões do tipo neurotmese os

experimentos são realizados e seus efeitos são avaliados em curto prazo, com

tempo inferior a 30 dias. Necessita, entretanto, de maiores estudos da utilização

deste comprimento de onda em lesões do tipo neurotmese, e a avaliação de seus

efeitos em longo prazo.

29

REFERÊNCIAS

1. AGARWAL, S.; BHAGWAT, A. S. Ho: Yag laser-assisted lumbar disc

decompression: a minimally invasive procedure under local anesthesia. Neurology India, Madras, v. 51, n. 1, p. 35-38, 2003.

2. AGNE, J. E. Eletrotermoterapia prática. Santa Maria: Editora Orium, 2005.

365p. 3. ALIÓ, J. L.; BELDA, J.; SHALABY, A. M. M. Correction of irregular

astigmatism with excimer laser assisted by sodium hyaluronate. Ophthalmology, Rochester, v. 108, n. 7, p. 1246–1260, 2001.

4. AL-MAJED, A. A.; NEUMAN, C. M.; BRUSHART, T. M.; GORDON, T. Brief

electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal re-generation. The Journal of Neuroscience, Baltimore, v. 20, n. 7, p. 2602-

2608, 2000. 5. ALLET, M. A.; LEITE, V. M.; ALBERTONI, W. M.; FERNANDES, F. A. S.;

FERNANDES, M.; FALOPPA, F. nxerto “versus” enxerto coberto com tubo de veia nas reparações nervosas. Revista Brasileira de Ortopedia, São Paulo, v. 38, n. 4, p. 193-200, 2003.

6. ALONSO, J. L.; REIS, R. G. Neuropatias do nervo acessório espinhal

secundárias a cirurgias cervicais estudo clínico e eletrofisiológico de sete casos. Arquivos de Neuropsiquiatria, São Paulo, v. 58, n. 3A, p. 704-712,

2000.

7. AMADO, S.; ARMADA-DA-SILVA, P. A. S.; JOÃO, F.; MAURÍCIO, A. C.; LUÍS, A. L.; SIMÕES, M. J.; VELOSO, A. P. The sensitivity of two-dimensional hindlimb joint kinematics analysis in assessing functional recovery in rats after sciatic nerve crush. Behavioural Brain Research, Amsterdam, v. 225, n. 2, p.

562-573, 2011.

8. AMADO, S.; RODRIGUES, J. M.; LUÍS, A. L.; ARMADA-DA-SILVA, P. A. S.; VIEIRA, M.; GARTNER, A.; SIMÕES, M. J.; VELOSO, A. P.; FORNARO, M.; RAIMONDO, S.; VAREJÃO, A. S. P.; GEUNA, S.; MAURÍCIO, A. C. Effects of collagen membranes enriched with in vitro-differentiated N1E-115 cells on rat sciatic nerve regeneration after end-to-end repair. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation, London, v. 7, n. 7, p. 1-13, 2010.

9. ARIAS, M. V. B.; BRACARENSE, A. P. F. L.; STOPIGLIA, Â. J. Avulsão do

plexo braquial em cães – 2: biópsia fascicular e histologia dos nervos radial, mediano, ulnar e musculocutâneo. Ciência Rural, Santa Maria, v.27, n.1,

p.81-85, 1997.

30

10. ARIAS, M. V. B.; STOPIGLIA, Â. J. Avulsão do plexo braquial em cães – 1: aspectos clínicos e neurológicos. Ciência Rural, Santa Maria, v. 27, n. 1, p. 75-80, 1997.

11. ASATO, F.; BUTLER, M.; BLOMBERG, H.; GORDH, T. Variation in rat sciatic

nerve anatomy: implications for a rat model of neuropathic pain. Journal of the Peripheral Nervous System, Malden, v. 5, p. 19-21, 2000.

12. AUTRATA, R.; REHUREK, J. Laser-assisted subepithelial keratectomy for

myopia: Two-year follow-up. Journal of Cataract and Refractive Surgery, Manchester, v. 29, n. 4, p. 6616-6668, 2003.

13. BADER, H. I. Use of lasers in periodontics. Dent Clinics of North America,

Saint Louis, v. 44, n. 4, p. 779-791, 2000.

14. BAGIS, S.; COMELEKOGLU, U.; COSKUN, B.; MILCAN, A.; BUYUKAKILLI, B. No effect of GA-AS (904 nm) laser irradiation on the intact skin of the injured rat sciatic nerve. Lasers in Medical Science, London, v. 18, n. 1, p. 83-88, 2003.

15. BAIN, J. R.; MACKINNON, S. E.; HUNTER, R. T. Functional evaluation of

complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery, Baltimore, v. 83, n. 1, p. 129-136, 1989.

16. BASFORD, J. R. Low intensity laser therapy: still not an established clinical

tool. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 6, n.4, p. 331-342, 1995. 17. BJORDAL, J. M.; JOHNSON, M. I.;IVERSEN, V.; AIMBIRE, F.; LOPES-

MARTINS, R. A. B. Low-level laser therapy in acute pain: a systematic review of possible mechanisms of action and clinical effects in randomized placebo-controlled trials. Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v. 24, n. 2,

p. 158-168, 2006. 18. BRAUND, K. G. Nerve and muscle biopsy techniques. Progress in

Veterinary Neurology, Santa Barbara, v.2, n.1, p.35-39, 1991.

19. BRAUND, K. G.; WALTER, T. L.; VANDEVELDE, M. Fascicular nerve biopsy

in the dog. American Journal of Veterinary Research, Chicago, v.40, n.7, p. 1025-1030, 1979.

20. BUERGER, C.; IMME, J. L.; SILVA, E. S.; ANDRÉ, E. S. Efeitos da

laserterapia de baixa potência sobre os processos de regeneração do tecido nervoso periférico. Fisioterapia em Movimento, Curitiba, v. 17, n. 2, p. 67-

74, 2004. 21. BURNETT, M. G.; ZAGER, E. L. Pathophysiology of peripheral nerve injury: a

brief review. Neurosurgical Focus, Charlottesville, v. 16, n. 5, p. 1-7, 2004.

31

22. CAMBIER, D.; BLOM, K.; WITVROUW, E.; OLLEVIER, G.; MUYNCK, M.; VANDERSTRAETEN, G. The influence of low intensity infrared laser irradiation on conduction characteristics of peripheral nerve: a randomised, controlled, double blind study on the sural nerve. Lasers in Medical Science, London, v. 15, n. 3, p. 195-200, 2000.

23. CAMPBELL, W. W. Evaluation and management of peripheral nerve injury.

Clinical Neurophysiology, Amsterdam, v. 119, p. 1951–1965, 2008. 24. CARLTON, J. M.; GOLDBERG, N. H. Quantitative integrated muscle function

following reinervation. Surgical Fórum, Chicago, v. 37, n. 1, p. 611-612,

1986.

25. CHAVANTES, M. C.; TOMIMURA, S. Classificação dos lasers. In: CHAVANTES, M. C. Laser em bio-medicina: princípios e prática: guia para iniciantes, pesquisadores e discentes na área de saúde e exatas. São Paulo: Editora Atheneu, 2009a. p. 41-68.

26. CHAVANTES, M. C.; TOMIMURA, S. Parâmetros dosimétricos do laser. In:

CHAVANTES, M. C. Laser em bio-medicina: princípios e prática: guia para iniciantes, pesquisadores e discentes na área de saúde e exatas. São

Paulo: Editora Atheneu, 2009b. p. 35-39. 27. CHEN, Y. S. et al. Peripheral nerve regeneration using silicone rubber

chambers filled with collagen, laminin and fibronectin. Biomaterials, Surrey, v.

21, n. 15, p. 1541-1547, 2000. 28. CHIMELLI, L. Valor da biópsia de nervo no diagnóstico da hanseníase –

auxílio à clínica nos casos de forma neural pura e reativação. Hansenologia Internationalis, Bauru, v. 23, n. 1, p. 89-92, 1998.

29. CHOW, R. T.; BARNSLEY, L.; HELLER, G. Z.; SIDDALL, P. J. A pilot study of

low laser therapy in the management of chronic neck pain. Journal of Musculoskeletal Pain, Binghamton, v. 12, n. 2, p. 71-81, 2004.

30. CONTESINI, E. A.; WITZ, M. I.; PIPPI, N. L.; GRAÇA, D. L. Avaliação clínico-

morfológica da regeneração nervosa periférica mediante alinhamento por tubo de silicone em caninos. Ciência Rural, Santa Maria, v. 22, n. 1, p. 65-71, 1992.

31. CRUZ, M. W.; CORREA, R. B.; PUCCIONI-SOHLER, M.; NOVIS, S. A. P.

Eletroneuromiografia e potenciais evocados somatossensitivos na mielopatia pelo HTLV-I. Arquivos de Neuropsiquiatria, São Paulo, v. 56, n. 4, p. 756-

762, 1998.

32. DAHLIN, L. B.; BRANDT, J. Basic science of peripheral nerve repairs: wallerian degeneration/ growth cones. Operative Techniques in Orthopaedics, Philadelphia, v. 14, n. 3, p. 138-145, 2004.

http://www.springerlink.com/content/102825/?p=5b5619db932943748dcc5341ae96d083&pi=0

32

33. DEDERICH, D. N.; BUSHIK, R. D. Lasers in dentistry: separating science from hype. Journal of the American Dental Association, Chicago, v. 135, n. 2, p. 204-212, 2004.

34. DELISTOIANOV, N.; MACORIS, D. G.; GODOY, R. F.; ALESSI, A. C.

Comparação entre duas técnicas de neurorrafia do digital palmar em eqüinos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.

58, n. 1, p. 44-51, 2006. 35. DE MEDINACELI, L.; DERENZO, E.; WYATT, R.J. An index of the functional

condiction of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology, San Diego, v. 77, n. 3, p. 634-643, 1982.

36. DIFFERY, B. L.; KOCHEVAR, I. E. Basic principles of photobiology. In: LIM,

H. W.; HÖNIGSMANN, H.; HAWK, J. L. M. Photodermatology. 1.ed. New

York: Informa Healthcare, 2007. p. 15-28. 37. DIJKSTRA, J. R.; MEEK, M. F.; ROBINSON, P. H.; Gramsbergen, A. Methods

to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 96, n. 2, p. 89-96, 2000.

38. DINH, P.; HAZEL, A.; PALISPIS, W.; SURYADEVARA, S.; GUPTA, R.

Functional assessment after sciatic nerve injury In a rat model. Microsurgery, New York, v. 29, n. 8, p. 644-649, 2009.

39. DODD, J.; JESSELL, T. M. Axon guidance and the patterning of neuronal

projections in vertebrates. Science, New York, v. 242, n. 4879, p. 692-699, 1988.

40. DORETTO, Dario. Fisiopatologia Clínica do Sistema Nervoso

Fundamentos da Semiologia. 2.ed. São Paulo. Editora: Atheneu, 2005. 466p.

41. DYCE, K. M.; SACK, W. O.; WENSING, C. J. G. Textbook of veterinary

anatomy. 4.ed. Saunders: Saint Louis, 2010. 864p. 42. FAWCETT, J. W.; KEYNES, R. J. Peripheral nerve regeneration. Annual

Review of Neuroscience, Palo Alto, v. 13, n. 1, p. 43-60, 1990.

43. FERNANDES, A. M. M.; FARIAS, L. P.; MOROSOLLI, A. R. C.; NICCOLI-

FILHO, W. Estudo clínico comparativo entre cirurgia convencional e a radiação laser de CO2 em fenômeno de retenção de muco. Ciência Odontológica Brasileira, São José dos Campos, v. 9, n. 1, p. 54-61, 2006.

44. FERRARIO, A.; TIEHI, K. F. V.; RUCKER, N.; SCHWARZ, M. A.; GILL, P. S.;

GOMER, C. J. Antiangiogenic treatment enhances photodynamic therapy responsiveness in a mouse mammary carcinoma. Cancer Research, Baltimore, v. 60, n. 15, p. 4066-4069, 2000.

33

45. GASPARINI, A. L. P.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N. Correlação entre diferentes métodos de avaliação funcional da marcha de ratos com lesão por esmagamento do nervo isquiático. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v.

15, n. 5, p. 285-289, 2007. 46. GARTNER, L. P.; HIATT, J. L. Tratado de Histologia em Cores. 3.ed.

Editora Elsevier: Rio de Janeiro, 2007. 576p. 47. GENESER, F. Histologia. Editorial Medica Panamericana S.A.C.F.: Buenos

Aires, 2003. 616p. 48. GIGO-BENATO, D.; GEUNA, S.; ROCHKIND, S. Phototherapy for enhancing

peripheral nerve repair: a review of the literature. Muscle Nerve, Malden, v.

31, n. 6, p. 694-701, 2005. 49. GONÇALVES, R. B.; MARQUES, J. C.; MONTE-RASO, V. V.; ZAMARIOLI,

A.; CARVALHO, L. C.; FAZAN, V. P. S.; TAVARES, M. R. Efeitos da aplicação do laser de baixa potência na regeneração do nervo isquiático de ratos. Fisioterapia e Pesquisa, São Paulo, v. 17, n. 1, p. 34-39, 2010.

50. GOUDARZI, M. M.; AZARNIA, M.; KAKA, G.; SADRAII, S. H.; AGHDA, A. K.

Study of bone marrow stromal cells, nerve growth factor, and marginal on nerve regeneration in rat crushed sciatic nerve. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, v. 23, n. 102, p. 102-111, 2013.

51. GRIFFIN, J. W.; HOFFMAN, P. N. Degeneration and regeneration in the

peripheral nervous system. In: DYCK, P. J.; THOMAS, P. K. (eds). Peripheral neuropathy. 3.ed. Philadelphia: Saunders, 1993. p. 361-376.

52. HAMBLIN, M. R.; DEMIDOVA, T. N. Mechanisms of low level light therapy.

Society of Photographic Instrumentation Engineers, Los Angeles, v. 6140,

n. 1, p. 1-12, 2006.

53. HASHMI, J. T.; HUANG, Y.; OSMANI, B. Z.; SHARMA, S. K.; NAESER, M. A.; HAMBLIN, M. R. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R Journal, Maryland Heights, v. 2, n. 12S, p. 293-307, 2010.

54. HORLOCK, N.; GROBBELAAR, A. O.; GAULT, D. T.Can the carbon dioxide

laser completely ablate basal cell carcinomas? A histological study. British Journal of Plastic Surgery, Edinburgh, v. 53, n. 4, p. 283-293, 2000.

55. HUANG, Y.; SHARMA, S. K.; CARROLL, J.; HAMBLIN, M. R. Biphasic dose

response in Low Level Light Therapy: an update. Dose-Response,

Massachusetts, v. 9, p. 602-618, 2011. 56. IDE. C. Peripheral nerve regeneration. Neuroscience research, Shannon, v.

25, sup. 1, p. 101-121, 1996.

34

57. INTERNATIONAL COMMITTEE ON VETERINARY GROSS ANATOMICAL NOMENCLATURE. Nomina Anatomica Veterinaria. 5.ed. Hannover, Columbia, Ghent, Sapporo: Editorial Committee, 2012. 160p.

58. JALLO, G. I.; KOTHBAUER, K. F.; EPSTEIN, F. J. Contact laser microsurgery.

Child’s Nervous System, Berlin, v. 18, n. 6-7, p. 333-336, 2002.

59. JOÄO, F.; AMADO, S.; VELOSO, A.; ARMADA-DA-SILVA, P.; MAURICIO, A. C. Anatomical reference frame versus planar analysis: implications for the kinematics of the rat hindlimb during locomotion. Reviews in the Neurosciences, Berlin, v. 21, p. 469-485, 2010.

60. JUNGNICKEL, J.; HAASTERT, K.; GRZYBEK, M.; THAU, N.; LIPOKATIC-

TAKACS, E.; RATZKA, A.; NÖLLE, A.; CLAUS, P.; GROTHE, C. Mice lacking basic fibroblast growth factor showed faster sensory recovery. Experimental Neurology, San Diego, v. 223, n. 1, p. 166-172, 2010.

61. KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J. H.; JESSELL, T. M. Principles of Neural

Science. 4.ed. Appleton & Lange: New York, 2000. 1414p.

62. KARP, G. O citoesqueleto e a motilidade celular. In: KARP, G. Biologia

celular e molecular. 3.ed. Barueri: MAnole, 2005. p. 333-396. 63. KARU, T. Molecular mechanism of therapheutic effect of low intensity laser

irradiation. Lasers in the Life Science, Piscataway, v. 2, n. 1, p. 53-74, 1988.

64. KARU T. Primary and secondary mechanisms of action of visible-to-near IR

radiation on cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Lausanne, v. 49, p. 1-17, 1999.

65. KARU, T. I.; PYATIBRAT, L. V.; AFANASYEVA, N. I. Cellular effects of low

power laser therapy can be mediated by nitric oxide. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 36, p. 307–314, 2005.

66. KIERSZENBAUM, A. L; TRES, L. L. Histologia e Biologia Celular: uma

Introdução à Patologia. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012. 704p. 67. KINGHAM, P.J.; KALBERMATTEN, D.F.; MAHAY, D.; ARMSTRONG, S.J.;

WIBERG, M.; TERENGHI, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Experimental Neurology, San Diego, v. 207, n. 2, p. 267-274, 2007.

68. LEE, S. K.; WOLFE, S. W. Peripheral nerve injury and repair. Journal of the

American Academy of Orthophaedic Surgeons, Rosemont, v. 8, n. 4, p. 243-252, 2000.

69. LENT, R. Cem bilhões de neurônios: conceitos fundamentais de

neurociência. São Paulo: Editora Atheneu, 2005. 698p.

35

70. LU, M.; Ho, C.; Hsu, S.; Lee, H.; Lin, J.; Yao, C.; Chen, Y. Effects of electrical stimulation at different frequencies on regeneration of transected peripheral nerve. Neurorehabilitation and Neural Repair, Thousand Oaks, v. 22, n. 4, p.

367-373, 2008. 71. LUBART, R.; MALIK, Z.; ROCHKIND, S.; FISHER, T. A possible mechanism

of low level laser-living cell interaction. Laser Therapy, Tokyo, v. 2, n. 1, p.

65–68, 1990. 72. LUI, H.; ANDERSON, R. R. Radiation source and interaction with skin. In: LIM,

H. W.; HÖNIGSMANN, H.; HAWK, J. L. M. Photodermatology. 1.ed. New

York: Informa Healthcare, 2007. p. 29-40. 73. LUNDBORG, G. Nerve regeneration and repair. Acta Orthopaedica

Scandinavica, Copenhagen, v. 58, n. 2, p. 145-169, 1987.

74. LUNDY-EKMAN, L. Neurociências: Fundamentos para Reabilitação. 3.ed.

Rio de Janeiro: Editora Elsevier, 2008. 536p.

75. MADDURI, S.; GRANDER, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. Journal of Controlled Release,

Amsterdam, v. 161, n. 2, p. 274-282, 2012. 76. MARCOLINO, A. M.; BARBOSA, R. I.; NEVES, L. M. S.; MAZZER, N.;

GUIRRO, R. R. J.; FONSECA, M. C. R. Assessment of functional recovery of sciatic nerve in rats submitted to low-level laser therapy with different fluences. An experimental study. Journal of Hand and Microsurgery, Madurai, v. 5, n.

2, p. 49-53, 2013. 77. MARCOLINO, A. M.; BARBOSA, R. I.; NEVES, L. M. S.; VINAS, T. S.;

DUARTE, D. T. B.; MAZZER, N.; FONSECA, M. C. R. Laser de baixa intensidade (830nm) na recuperação funcional do nervo isquiático de ratos. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 18, n. 4, p. 207-211, 2010.

78. MARMUR, E. S.; SCHMULTS, C. D.; GOLDBERG, D. J. A review of laser and

photodynamic therapy for the treatment of nonmelanoma skin cancer. Dermatologic Surgery, New York, v. 30, n. 2, p. 264-271, 2004.

79. MAVROGIANNIS, M.; THOMASON, J. M.; SEYMOUR, R. A. LASERs in

periodontology. Dental Update, Guildford, v. 31, n. 9, p. 535-538, 2004. 80. MAZZER, P. Y. C. N.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; FAZAN, V. P. S.

Qualitative and quantitative evaluation of rats' acute injuries caused by ischiatic nerve smashing. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 14, n. 4, p. 220-225, 2006.

36

81. MELLO, L.R.; FELTRIN, Y.; SELBACH, R.; MACEDO JUNIOR, G.; SPAUTZ, C.; HAAS, L.J. Uso da celulose liofilizada em lesões de nervos periféricos com perda de substância. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, São Paulo, v. 59, n.

2B, p. 372-379, 2001. 82. MENDONÇA, A. C.; BARBIERI, C.H.; MAZZER, N. Directly applied low

intensity direct electric current enhances peripheral nerve regeneration in rats. Journal Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 129, n. 2, p. 183-190, 2003.

83. MESTER, E.; MESTER, A. F.; MESTER, A. The biomedical effects of LASER

applications. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 5, n. 1, p. 31-39,

1985. 84. MIKAIL, S. Laser terapêutico. IN: MIKAIL, S.; PEDRO, C. R. Fisioterapia

veterinária. 2.ed. São Paulo: Editora Manole, 2009. p. 81-90.

85. MILLIS, D. L.; FRANVIS, D.; ADAMSON, C. Novas modalidades terapêuticas

na reabilitação veterinária. In: LEVINE, D.; MILLIS, D. L.; MARCELLIN-LITLLE, D. J.; TAYLOR, R. Reabilitação e fisioterapia na prática de pequenos animais. São Paulo: Editora Roca, 2008. p. 95-117.

86. MILORO, M.; HALKIA, L. E.; MALLERY, S.; TRAVERS, S.; RASHID, R. G.

Low-level laser effect on neural regeneration in Gore-Tex tubes. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics, Saint Louis, v. 93, n. 1, p. 27-34, 2002.

87. MOHAMMADI, R.; AMINI, K.; CHAREHSAZ, S. Homeopathic treatment for

peripheral nerve regeneration: an experimental study in a rat sciatic nerve transection model. Homeopathy, London, v. 101, n. 3, p. 141-146, 2012.

88. MONTE-RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N. Índice funcional do

ciático nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: avaliação da reprodutibilidade do método entre examinadores. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 14, n. 3, p. 133-136, 2006a.

89. MONTE-RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; FAZAN, V. P. S. Os

efeitos do ultra-som terapêutico nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: análise funcional da marcha. Revista Brasileira de Fisioterapia, São Carlos, v. 10, n. 1, p. 113-119, 2006b.

90. MONTE-RASO, V. V.; FONSECA, M. C. R.; MAZZER, N.; BARBIERI, G.;

ROSA, R. C.; ZAMARIOLI, A.; BARBIERI, C. H. Esteira com velocidade controlada para captação da marcha. Acta Ortopédica Brasileira, São

Paulo, v. 18, n. 1, p. 49-53, 2010.

91. MONTE-RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; YAMASITA, A. C.; BARBIERI, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible? Journal of Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 170, n. 2, p. 255-261, 2008.

37

92. MÜLLER, H. W.; STOLL, G. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathology, Zurich, v. 9, n. 2, p. 313-325, 1999

93. MUNDY, L.; MERLIN, T. L.; FITRIDGE, R. A.; HILLER, J. E. Systematic

review of endovenous laser treatment for varicose veins. British Journal of Surgery, Guildford, v. 92, n. 10, p. 1189-1194, 2005.

94. NAVARRO, L.; MIN, R. J.; BONE, C. Endovenous laser: a new minimally

invasive method of treatment for varicose veins – preliminary observations using an 810 nm diode laser. Dermatologic Surgery, New York, v. 27, n. 2, p.

117-122, 2001. 95. NELSON, J. S.; MAJARON, B.; KELLY, K. M. Active skin cooling in

conjunction with laser dermafologic surgery. Seminars In cutaneous Medicine and Surgery, Philadelphia, v. 19, n. 4, p. 253-266, 2000.

96. NEVES, L. S.; SOUZA E SILVA, C. M.; HENRIQUES, J. F. C.; CANÇADO, R.

H.; HENRIQUES, R. P.; JANSON, G. A utilização do laser em ortodontia. Revista Dental Press de Ortodontia e Ortopedia Facial, Maringá, v. 10, n. 5, p. 149-156, 2005.

97. NICOLAU, R. A. Efeito do Laser de baixa potência (AsGaAI) em tecido

ósseo de rato submetida á lesão, analisado por histomorfometria óssea. 2001. 104 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos.

98. NISSAN, M.; ROCHKIND, S.; RAZON, N.; BARTAL, A. He-Ne laser irradiation

delivered transcutaneously: its effect on the sciatic nerve of rats. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 6, n. 5, p. 435-438, 1986.

99. NOLTE, J. Neurociência. Rio de Janeiro: Editora Elsevier: 2008. 265p.

100. OH, C. K.; JUNG, D. S.; JANG, H. S.; KWON, K. S. Endovenous laser

surgery of the incompetent greater saphenous vein with a 980-nm diode laser. Dermatologic Surgery, New York, v. 29, n. 11, p. 1135-1140, 2003.

101. OLBY, N.; HALLING, K. B.; GLICK, T. R. Reabilitação neurológica. In:

LEVINE, D.; MILLIS, D. L.; MARCELIN-LITTLE, D. J.; TAYLOR, R. Reabilitação e fisioterapia na prática de pequenos animais. 1.ed. São

Paulo: Roca, 2008. p. 157-180. 102. OLK, R. J.; FRIBERG, T. R.; STICKNEY, K. L.; AKDUMAN, L.; WONG, K. L.;

CHEN, M. C.; LEVY, M. H.; GARCIA, C. A.; MORSE, L. S. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration - two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology, Rochester, v. 106, n. 11, p. 2082-2090, 1999.

38

103. PAASSEN, J. I.; JANSENB, K.; GRAMSBERGENA, A.; MEEK, M. F. Transection of peripheral nerves, bridging strategies and effect evaluation. Biomaterials, Surrey, v. 25, n. 9, p. 1583–1592, 2004.

104. PACTHER, B. R.; EBERSTEIN, A. Passive exercise and reinnervation of the

rat denervated extensor digitorum longus muscle after nerve crush. American Journal of Physical Medicine and Rehabilitation, Baltimore, v. 68, n. 4, p. 179-182, 1989.

105. PATEL, M.; VANDEVORD, P. J.; MATTHEW, H.; WU, B.; DESILVA, S.;

WOOLEY, P. H. Video-gait analysis of functional recovery of nerve repaired with chitosan nerve guides. Tissue Engineering, New York, v. 12, n. 11, p.

3189-3199, 2006. 106. PINHEIRO, A. L. B.; FRAME, J. W. Laser em odontologia: seu uso atual e

perspectivas futuras. Revista Gaúcha de Odontologia, Porto Alegre, v. 40,

n. 52, p. 327-332, 1992. 107. PORTNEY, L. G.; ROY, S. H. Eletromiografia e testes de velocidade de

condução nervosa. In: O’ U IVA . B.; CHMI Z . Fisioterapia: avaliação e tratamento. 4.ed. São Paulo: Manole, 2004. p. 214-234.

108. PROEBSTLE, T. M.; GUL, D.; KARGL, A.; KNOP, J. Endovenous laser

treatment of the lesser saphenous vein with a 940-nm diode laser: early results. Dermatologic Surgery, New York, v. 29, n. 4, p. 357-361, 2003.

109. PURVES, D.; AUGUSTINE, G. J.; FITZPATRICK, D.; KATZ, L. C.;

LAMANTIA, A. S.; MCNAMARA, J. O.; WILLIAMS, S. M. (org). Neurociências. 2.ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 728p.

110. RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; FASAN, V. S. Can therapeutic

ultrasound influence the regeneration of the peripheral nerves? Journal of Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 142, n. 2, p. 185-192, 2005.

111. REIS, F. A.; BELCHIOR, A. C. G.; CARVALHO, P. T. C.; SILVA, B. A. K.;

PEREIRA, D. M.; SILVA, I. S.; NICOLAU, R. A. Effect of laser therapy (660 nm) on recovery of the sciatic nerve in rats after injury through neurotmesis followed by epineural anastomosis. Lasers in Medical Science,

London, v. 24, n. 5, p. 741-747, 2009.

112. RIGAUD, M.; GEMES, G.; BARABAS, M.; CHERNOFF D. I.; ABRAM, S. E.; STUCKY, C. L.; HOGAN, Q. H. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neurophatic pain. Pain, Amsterdam, v. 136, p. 188-201, 2008.


http://www.springerlink.com/content/lg1828646625/?p=5b5619db932943748dcc5341ae96d083&pi=0

39

113. ROCHKIND, S.; ROUSSO, M.; NISSAN, M.; VILLARREAL, M.; BARR-NEA, L.; REES, D. G. Systemic effects of low-power laser irradiation on the peripheral and central nervous system, cutaneous wounds, and burns. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 9, n. 2, p. 174–182, 1989.

114. ROCHKIND, S.; LEIDER-TREJO, L.; NISSAN, M.; SHAMIR, M. H.;

KHARENKO, O.; ALON, M. Efficacy of 780-nm laser phototherapy on peripheral nerve regeneration after neurotube reconstruction procedure (double-blind randomized study). Photomedicine and Laser Surgery,

Larchmont, v. 25, n. 3, p. 137-143, 2007. 115. RODRIGUES DOS SANTOS, E. S.; IMPARATO, J. C. P.; ADDE, C. A.;

MOREIRA, L. A.; PEDRON, I. G. Frenectomia a laser (Nd:YAP) em odontopediatria. Revista Odonto, São Paulo, v. 15, n. 29, p.107-113, 2007.

116. RODRÍGUEZ, F.J.; VALERO-CABRÉ, A.; NAVARRO, X. Regeneration and

functional recovery following peripheral nerve injury. Drug Discovery Today: Disease Models, La Jolla, v. 1, n. 2, p. 177-185, 2004.

117. ROSA FILHO, B. J.; AGUIAR, D.; GAMA, F.; ANDRADE, L.; SILVA, L.;

PIRES, S. ...Lesões ..traumáticas ..de ..nervos ..periféricos: ..axonotmese. Fisioweb Wgate, 2004. Disponível em: http://www.wgate.com.br/conteudo/medicinaessaude/fisioterapia/neuro/axonotmese/axonotmese.htm. Acesso em: 22 de set. 2009.

118. ROSSETO, M; FAGUNDES, D. J.; TAHA, M. O.; SOUZA, H. S.; AYDOS, R.

D.; GUIMARÄES, R. B; NOVO, N. F.; JULIANO, Y. Regeneração de nervo periférico após anastomose término-lateral, com manutenção do epineuro, em ratos. Acta Cirúrgica Brasileira, São Paulo, v. 16, n. 3, p. 155-

159, 2001. 119. SÁNCHEZ, M. E. C. El láser de media potencia y sus aplicaciones en

medicina. Plasticidad e Restauración Neurológica, Distrito Federal do

México, v. 6, n. 1, p. 45-53, 2007. 120. SEDDON, H. J. A classification of nerve injuries. British Medical Journal,

London, v. 2, n. 4260, p. 237-239, 1942. 121. SHAMIR, M. H.; ROCHKIND, S.; SANDBANK, J.; ALON, M. Double-blind

randomized study evaluating regeneration of the rat transected sciatic nerve after suturing and postoperative low-power laser treatment. Journal of Reconstructive Microsurgery, New York, v. 17, n. 2, p. 133-137, 2001.

122. SIRKO, S.; NEITZ, A.; MITTMANN, T.; HORVAT-BRÖCKER, A.; HOLST, A.

V.; EYSEL, U. T.; FAISSNER, A. Focal laser-lesions activate an endogenous population of neural stem/progenitor cells in the adult visual cortex. Brain Advance Access, Oxford, v. 132, n. 8, p. 2252-2264, 2009.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lsm.v9:2/issuetoc

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17603852?ordinalpos=9&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum



http://www.wgate.com.br/conteudo/medicinaessaude/fisioterapia/neuro/axonotmese/axonotmese.htm

http://www.wgate.com.br/conteudo/medicinaessaude/fisioterapia/neuro/axonotmese/axonotmese.htm

40

123. SOFRONIEW, M. V.; HOWE, C. L.; MOBLEY, W. C. Nerve growth factor signaling, neuroprotection, and neural repair. Annual Review of Neuroscience, Palo Alto, v. 24, n. 1, p. 1271-1281, 2001.

124. SOUSA, F. F. A.; ANDRAUS, R. A. C.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.

Influência da irradiação do laser na regeneração nervosa em diferentes locais de tratamento. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 17, n. 6, p.

331-335, 2009.

125. SOUSA, F. F. A.; RIBEIRO, T. L.; FAZAN, V. P. S.; BARBIERI, C. H. Lack of effectiveness of laser therapy applied to the nerve course and the correspondent medullary roots. Acta Ortopedica Brasileira, São Paulo, v.

21, n. 2, p. 92-97, 2013. 126. STAINKI, D. R.; RAISER, A. G.; GRAÇA, D. L.; BECKER, C.; FERNANDEZ,

G. M. S. A radiação laser arseneto de gálio (AsGa) na regeneração do nervo radial submetido a reparação cirúrgica secundária. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v. 35, n. 2, p. 37-40,

1998. 127. STANG, F.; KEILHOFF, G.; FANSA, H. Biocompatibility of different nerve

tubes. Materials, Basel, v. 2, n. 4, p. 1480-1507, 2009.

128. STEFANELLO, T. D.; HAMERSKI, C. R. Tratamento de úlcera de pressão

através do laser AsGa de 904 nm - um relato de caso. Arquivos de Ciências da Saúde da Unipar, Umuarama, v. 10, n. 2, p. 99-103, 2006.

129. STOPLIGLIA, A. J.; PEDRO, C. R. Lesões de nervos periféricos. In: MIKAIL,

S.; PEDRO, C. R. Fisioterapia Veterinária. 2.ed. São Paulo: Manole, 2009. p. 167-174.

130. STUKAVEC, J.; DUCHAC, V.; HORAK, L.; POUCKOVA, P. Photodynamic

therapy of human colorectal carcinoma cell line. Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v. 27, n. 1, p. 107-110, 2009.

131. SUFAN, W.; SUZUKI, Y.; TANIHARA, M.; OHNISHI, K.; SUZUKI, K.; ENDO,

K.; NISHIMURA, Y. Sciatic nerve regeneration through alginate with tubulation or nontubulation repair in cat. Journal of Neurotrauma, New

York, v. 18, n. 3, p. 329-339, 2001. 132. SULAIMAN, W.; GORDON, T. Neurobiology of peripheral nerve injury,

regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. The Ochsner Journal: Spring, Basel, v. 13, n. 1, p. 100-108, 2013.

133. SUMMERS, B. A.; CUMMINGS, J. F.; LAHUNTA, A. Veterinary

Neuropathology. Saint Louis: Mosby-Year Book, 1995. 527p.

41

134. TAKHTFOOLADI, A. T.; SHARIF, D.; HAGHDOST, I. S.; ABEDI, G. Effects of Laser therapy (680) on recovery of the sciatic nerve in rabbits. Advances in Environmental Biology, Amman, v. 6, n. 12, p. 4057-4061, 2012.

135. VAN MEETEREN, N. L. U.; BRAKKE, J. H.; HAMERS, F. P. T.; HELDERS,

P. J. M.; GISPEN, W. H. Exercise training improves functional recovery and motor nerve conduction velocity after sciatic nerve crush lesion in the rat. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, Philadelphia, v. 78, n. 1, p. 70-77, 1997.

136. VARANDAS, E. T.; GENOVESE, W. J. O uso do laser de CO2 em cirurgia

bucal. Revista da Associação Brasileira de Odontologia Nacional, São Paulo, v. 8, n. 2, p. 312-317, 2000.

137. VAREJÃO, A. S. P.; CABRITA, A. M.; MEEK, M. F.; BULAS-CRUZ, J.;

FILIPE, V. M.; GABRIEL, R. C.; FERREIRA, A. J.; GEUNA, S. WINTER, D. A. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve, New York, v. 27, p. 706–714, 2003.

138. VAREJÃO, A. S. P.; CABRITA, A. M.; MEEK, M. F.; BULAS-CRUZ, J.;

GABRIEL, R. C.; FILIPE, V. M.; MELO-PINTO, P.; WINTER, D. A. Motion of the foot and ankle during the stance phase in rats. Muscle and Nerve, New York, v. 26, p. 630-635, 2002.

139. VAR O A. . .; M K M. .; RR IRA A. .; A R CIO . A. B.;

CABRITA, A. M. S. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. Journal of Neuroscience Methods,

Amsterdam, v. 108, n. 1, p. 1-9, 2001. 140. VOGL, T. J.; STRAUB, R.; EICHLER, K.; SÖLLNER, O.; MACK, M. G.

Colorectal carcinoma metastases in liver: laser-induced interstitial thermotherapy – local tumor control rate and survival data. Radiology, Easton, v. 230, n. 2, p.450-458, 2004.

141. WOOLF, N. J.; PRIEL, A.; TUSZYNSKI, J. A. Nanoneuroscience:

Structural and Functional Roles of the Neuronal Cytoskeleton in Health and Disease. Londres: Editora Springer, 2009. 292p.

142. WU, W.; PONNUDURAI, R.; KATZ, J.; POTT, C. B.; CHILCOAT, R.; UNCINI,

A.; RAPOPORT, S.; WADE, P.; MAURO, A. Failure to confirm of light-evoked response of peripheral nerve to low power helium-neon laser light stimulus. Brain Research, Amsterdam, v. 401, n. 2, p. 407-408, 1987.

42

CAPÍTULO 2 – EFEITO NA FUNÇÃO MOTORA DO LASER DE BAIXA

INTENSIDADE A 830nm EM NERVO ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS À

NEUROTMESE E TUBULIZAÇÃO COM CÂMARA DE SILICONE

RESUMO

A regeneração completa das fibras nervosas após lesão do tipo neurotmese associada à recuperação da função motora correspondente ao nervo lesionado, ainda é um desafio para os cientistas. Vários recursos terapêuticos têm sido investigados na regeneração tecidual e o laser de baixa intensidade têm demonstrado efeitos positivos na regeneração neural. Este trabalho tem o objetivo de relatar os efeitos funcionais da aplicação do laser de baixa intensidade a 830 nm em nervo isquiático de ratos submetidos à neurotmese seguida de tubulização com câmara de silicone, utilizando o Índice Funcional do Ciático (IFC) e o Ângulo do Tarso (AT). Usaram-se seis animais em cada grupo: grupo controle, sem laser, e grupo laser, tratados com laser de baixa intensidade de diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio, 830 nm, densidade de energia de 4,13 J/cm². As aplicações foram realizadas na medula e ao longo do trajeto do nervo até o joelho, em oito pontos distintos, em dias alternados, totalizando 40 aplicações distribuídas em dois momentos, sendo 20 aplicações no pós-cirúrgico imediato e após um intervalo de 45 dias, realizou-se mais 20 aplicações. A mensuração do IFC foi realizada em oito momentos iniciando-se no pré-operatório, um dia após a cirurgia e a cada 21 dias até o final do experimento no 126º dia de pós operatório. Para a aferição do AT realizaram-se três coletas em tempos diferentes: pré-operatório, primeiro dia pós-operatório e 126º dia do pós-operatório, utilizando o software Visual 3D. Ao final do experimento, os animais do GC e GL apresentaram valor de

IFC respectivamente de -83,4 e -92,1 e de AA de 21,2º e 13,2º, sem diferença significativa entre os grupos (p>0,05). Concluiu-se que não houve melhora funcional motora do nervo isquiático dos ratos submetidos à neurotmese e tratados com laser a 830 nm. Palavras-chave: Ângulo do tarso, biomaterial, biomecânica, índice funcional do ciático, fototerapia, laser terapêutico

43

MOTOR FUNCTION EFFECT OF LOW-LEVEL LASER AT 830nm ON SCIATIC

NERVE OF RATS SUBMITTED TO NEUROTMESIS AND TUBING IN

CHAMBER SILICONE

ABSTRACT

The complete regeneration of nerve fibers after neurotmesis injury associated with

recovery of motor function corresponding to the damaged nerve is still a challenge

for scientists. Several therapeutic resources have been investigated in tissue

regeneration and low intensity laser have shown positive effects on neural

regeneration. This study aimed to report the functional effects the application of

low intensity laser at nm on rat’s sciatic nerves submitted to neurotmesis and

tubing with silicone chamber using the Sciatic Functional Index (SFI) and the

Ankle Angle (AA). We used two groups, control (GC) and laser (GL), with six

animals in each. All animals underwent left sciatic nerve neurotmesis followed by

tubing with silicone chamber with five mm distance between the nerve stumps.

Animals in GL received radiation with a wavelength of 830 nm, energy density of

4.13 J/cm², on eight points from the spinal cord to nerve injury site, totaling 40

days of irradiation divided into two distinct periods. The first stage began at the

immediate post-operative period where 20 laser applications were performed on

alternate days. The second stage occurred 40 days before performing euthanasia

in animals submitted to more than 20 days of laser applications on alternate days.

The IFC measurement was performed in eight days starting preoperatively, one

day after surgery and every 21 days until the end of the experiment at 126 days

postoperatively. We measured the AA at three different times: preoperative, first

postoperative day and 126 days postoperatively, using Visual 3D software. At the

end of this study, the animals showed IFC values, in GC and GL, respectively, of -

83.4 and -92.1 and AA of 21.2º and 13.2º, with no significant difference between

groups (p>0,05). We concluded that there was no functional motor improvement in

sciatic nerve of rats submitted to neurotmesis and treated with laser at 830 nm.

Keywords: Ankle Angle, biomechanics, sciatic functional index, phototherapy

44

INTRODUÇÃO

Os nervos periféricos são comumente afetados por lesões de origem

iatrogênica ou traumática em animais domésticos (OLBY et al., 2005; FORTERRE

et al., 2007; NEVES et al., 2008). A regeneração e a recuperação funcional

dependem da severidade da injúria. Nos casos graves, em que há ruptura total do

nervo, ou seja, neurotmese é necessário procedimento cirúrgico para aproximar

os cotos nervosos (SEDDON, 1942; SIEMIONOW & BRZEZICKI, 2009).

Além disso, a regeneração completa das fibras nervosas associada à

recuperação da função motora correspondente ao nervo lesionado, ainda é um

desafio para os cientistas e tem sido objeto de estudo de diversas pesquisas

(ENDO et al., 2008; REIS et al., 2009; SUN et al., 2011; BENNETT et al., 2012;

GOUDARZI et al., 2013).

Entre os vários métodos propostos para melhorar a reparação nervosa,

o laser de baixa intensidade começou a ser empregado no processo de

regeneração e na recuperação funcional de lesões nervosas periféricas a partir de

1980, havendo vários relatos positivos e negativos sobre seus efeitos (BASFORD,

1995; BAGIS et al., 2003; GIGO-BENATO et al., 2005; CAMARGO et al., 2006;

ROCHKIND et al., 2007; CUNHA et al., 2008). No entanto, a maioria das

pesquisas mais recentes têm demonstrado resultados positivos com a utilização

deste recurso terapêutico (REIS et al., 2009; MEDALHA et al., 2012;

TAKHTFOOLADI et al., 2012; ALCANTARA et al., 2013).

Para VAREJÃO et al. (2001), se o objetivo da pesquisa é analisar a

funcionalidade do método para regeneração do nervo lesionado, a análise da

marcha deve ser a principal ferramenta para avaliar a função do músculo

correspondente.

Diversos autores como VAREJÃO et al. (2001), GASPARINI et al.

(2007), MONTE-RASO et al. (2008), DINH et al. (2009), JUNGNICKEL et al.

(2010), MARCOLINO et al. (2010), MONTE-RASO et al. (2010) e MARCOLINO et

al. (2013) vêm utilizando o Índice Funcional do Ciático (IFC), proposto por DE

MEDINACELI (1982) e modificado por BAIN et al. (1989), para analisar a

funcionalidade dos músculos inervados pelo nervo isquiático de ratos. Este índice

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0074774209870086


45

baseia-se no espalhar dos dedos e no comprimento da pegada do membro

lesionado do animal experimental.

Já VAREJÃO et al. (2003), PATEL et al. (2006), AMADO et al. (2010),

JOÃO et al. (2010) e AMADO et al. (2011) propuseram outro método de análise

funcional de ratos após lesão em nervo isquiático que é o da aferição do Ângulo

do Tarso (AT), obtido durante a fase de apoio da marcha. Segundo estes autores,

este método é preferível ao IFC por ser mais sensível em detectar alterações

funcionais.

Este trabalho tem o objetivo de relatar os efeitos funcionais da

aplicação do laser de baixa intensidade a 830 nm em nervo isquiático de ratos

submetidos à neurotmese seguida de tubulização com câmara de silicone,

utilizando o IFC e o AT.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Biotério Experimental da Escola de

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (EVZ/UFG) e no

Laboratório de Bioengenharia e Biomecânica da Faculdade de Educação Física

da UFG (FEF/UFG), Goiânia-GO. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFG protocolado sob

o nº 051/11 (Anexos).

Utilizaram-se 12 ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, machos,

provenientes do Biotério Central da UFG, com peso médio de 350 g. Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com três ratos em cada. A ração

peletizada e a água foram oferecidas ad libitum durante todo o experimento. A

temperatura do biotério foi mantida entre 20 e 22 ºC com umidade relativa do ar

de 55 ± 10% e ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais passaram por um

período de adaptação de 15 dias antes de iniciar os procedimentos experimentais.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com dois

grupos e seis repetições. Os animais foram alocados em dois grupos com seis

animais cada, sendo um o Grupo Controle (GC) submetido à técnica de

tubulização com câmara de silicone associada à aplicação de laser de baixa

46

intensidade (830 nm) com aparelho desligado; e o outro, Grupo Laser (GL)

submetido à técnica de tubulização com câmara de silicone associada à aplicação

de laser de baixa intensidade (830 nm).

Procedimento cirúrgico

Os ratos receberam aplicação pré-anestésica por via intraperitoneal de

cloridrato de tramadol (Tramal® solução injetável, Pfizer, Stolberg, Alemanha) na

dose de 20 mg/kg e cloridrato de xilazina (Anasedan® injetável 10 mL, Vetbrands,

São Paulo, Brasil) na dose de 10 mg/kg. Foram mantidos em indução e

manutenção anestésica com isofluorano (Vetflurano®, Virbac, São Paulo, Brasil)

em fluxo diluente de 250 mL/min de O2 em circuito de reinalação de gases com

auxílio de máscara para roedores, em aparelho de anestesia volátil (Takaoka®

KT15, São Paulo, Brasil). Os animais foram posicionados em decúbito lateral

direito, promovendo-se o acesso ao nervo isquiático na face lateral da coxa

esquerda, desde o trocanter maior até o joelho. Após divulsão entre os músculos

semitendinoso e bíceps femoral, localizou-se o nervo isquiático. Procedeu-se,

então, a neurotmese com bisturi a 5 mm proximal da divisão dos três ramos

principais do nervo isquiático (tibial, fibular comum e sural), seguida da

aproximação dos cotos nervosos pela técnica de tubulização.

Para realizar a tubulização os cotos nervosos foram inseridos em uma

câmara flexível de silicone (Perfimed®, Distrito Industrial – Salto, São Paulo,

Brasil), com comprimento de 1,0 cm, diâmetro interno de 1 mm e espessura de

parede de 0,6 mm, previamente esterilizado em autoclave. Para a imobilização o

coto proximal (CP) do nervo foi fixado à camara, com ponto único em “U” no

epineuro, utilizando fio de náilon 6-0 (Shalon® suturas, São Luís de Montes Belos,

Goiás, Brasil). Em seguida, o coto distal (CD) foi imobilizado e fixado à câmara da

mesma maneira do CP, respeitando-se um espaço de 5 mm entre os cotos

(Figura 1). Esta distância foi previamente marcada com régua com um furo com

agulha de insulina (0,45 x 0,13 mm) no tubo de silicone. Entre os cotos nervosos,

dentro da câmara, foram colocados 0,02 mL de solução de ringer com lactato

para preencher o espaço entre os cotos. Finalizado o procedimento cirúrgico, foi

47

realizado o reposicionamento do tecido muscular e a sutura da pele com pontos

contínuos, com fio de náilon 5.0 (Somerville, Jaboatão do Guararapes,

Pernambuco, Brasil). A analgesia pós-cirúrgica se deu pela aplicação subcutânea

de cloridrato de tramadol (20 mg/kg) diluído em igual quantidade de soro

fisiológico, de oito em oito horas por três dias.

FIGURA 1 – Tubulização com câmara de

silicone do nervo isquiático de

rato Wistar após

procedimento de neurotmese

e imobilização e fixação à

câmara dos cotos nervosos

proximal (CP) e distal (CD)

equidistantes 5 mm

Aplicação do laser de baixa intensidade

Para as aplicações do laser de baixa intensidade, utilizou-se aparelho

de laser (Laserpulse, Ibramed Equipamentos Médicos, Rio Grande do Sul, Brasil)

de diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl), previamente calibrado pelo

fabricante, com comprimento de onda de 830 nm, potência de saída de 30 mW,

modo contínuo e área de radiação efetiva de 0,116 cm². Realizou-se em todos os

animais dos dois grupos experimentais a tricotomia do local da irradiação uma vez

por semana. Foram irradiados quatro pontos sobre a medula espinhal, na região

paravertebral esquerda, nos segmentos medulares de L3 até L6, e quatro pontos

acompanhando o trajeto do nervo ao longo da face caudolateral do fêmur até

articulação do joelho (Figura 2).

5 mm CP CD

48

FIGURA 2 – Pontos de aplicação do laser de baixa intensidade (830

nm) em ratos Wistar, na região paravertebral esquerda

de L3 a L6 e ao longo do nervo isquiático, após

neurotmese e tubulização do nervo isquiático.

Irradiaram-se no total oito pontos com 1 cm de equidistância em cada

dia de aplicação do laser, sendo 40 dias de irradiação divididos em dois

momentos distintos. O primeiro momento iniciou-se no pós-cirúrgico imediato em

que foram realizadas 20 aplicações de laser, em dias alternados. O segundo

momento ocorreu 40 dias antes de realizar a eutanásia dos animais com mais 20

dias de aplicações de laser, em dias alternados.

O método de aplicação foi o pontual, posicionando a caneta a 90º em

relação ao tecido cutâneo, com densidade de energia de 4,13 J/cm², por 16

segundos em cada ponto, totalizando 76,8 J de energia em cada momento.

Durante as aplicações do laser, os ratos foram imobilizados manualmente, sendo

que os procedimentos de contenção dos animais do GC foram os mesmos do GL,

porém com o aparelho desligado.

49

Índice funcional do ciático

A mensuração do índice funcional do ciático (IFC) foi realizada no pré-

operatório, um dia após a cirurgia e a cada 21 dias até o final do experimento.

Desta forma, totalizaram-se oito coletas do IFC de cada rato em tempos

diferentes: pré-operatório (TØ), primeiro dia pós-operatório (T1), 21º dia (T2), 42º

dia (T3), 63º dia (T4), 84º dia (T5), 105º dia (T6) e 126º dia (T7) do pós-operatório.

Para realizar o IFC por meio de técnica digital, fez-se necessária a

confecção de uma passarela de acrílico transparente, com 2 mm de espessura,

43 cm de comprimento e 9 cm de largura e altura. Sob a passarela, posicionado a

45º de inclinação, foi colocado um espelho com 43 cm de comprimento e 11 cm

de largura. Em uma das extremidades da passarela foi acoplado um abrigo

escuro de placa de fibra de madeira de média densidade (MDF) com

comprimento, largura e altura, respectivamente, de 18,5 cm, 16,5 cm e 10 cm,

com abertura circular para entrada dos animais com 6 cm de diâmetro. Do outro

lado foi acoplada uma área sem cobertura, para preparar o animal antes de iniciar

a marcha sobre o acrílico, também confeccionada em MDF com comprimento de

13,5 cm, largura de 18 cm e altura de 10 cm. Ao sair desta área, o animal iniciava

a marcha em um corredor de 16,5 cm de comprimento em MDF antes de entrar

na passarela transparente (Figura 3).

FIGURA 3 – Estrutura em MDF e acrílico, confeccionada para ratos realizarem marcha

com abrigo escuro, passarela de acrílico, área para preparar animal antes

de iniciar marcha e espelho posicionado sob a passarela para visualizar

impressões plantares das pegadas dos animais

Abrigo

Espelho

Área de preparação Passarela

50

Para realizar a filmagem dos animais ao caminharem pela passarela

utilizou-se câmera digital (Sony Cybershot - HX7) posicionada em tripé em frente

ao espelho, na mesma altura da passarela de acrílico, a 50 cm de distância. Cada

rato era filmado três vezes ao passar na passarela, em cada dia de coleta. Após

os filmes serem transferidos por meio de cabo USB para um computador e

processados no software PMB (Picture Motion Browser), selecionaram-se os

quadros correspondentes à melhor pegada, tanto do membro pélvico

experimental (E) quanto do normal (N). Isto ocorreu no momento de maior

impressão da face plantar sobre a superfície da passarela, no frame em que o

membro oposto iniciou a fase de balanço. As imagens obtidas foram recortadas

no formato 400 X 280 pixels e transferidas para o software Paint em formato png.

Três medidas foram obtidas de cada um dos membros pélvicos: o

comprimento da pegada (PL ou “print length") que era aferida entre os dois pontos

mais extremos da pegada no sentido longitudinal; o espalhar total dos dedos (TS

ou “total spread”) que foi obtida pela distância entre o primeiro e o quinto dedo; e

o espalhar dos dedos intermediários (IT ou “intermediate toes”) que era a

distância entre o segundo e o quarto dedo (Figura 4).

A mensuração das distâncias foi realizada de forma automática, após

selecionar os pontos, mediante o software IFC_RATOS desenvolvido pelo

Laboratório de Bioengenharia e Biomecânica da Faculdade de Educação Física

da UFG (FEF/UFG). Inseriu-se neste software a fórmula matemática desenvolvida

por BAIN et al. (1989) (Equação 1):

(

) (

) (

) (1)

51

FIGURA 4 – Eixos da face plantar de rato

aferidos para o cálculo do

IFC: em vermelho,

comprimento da pegada; em

verde, o espalhar total dos

dedos; e em azul, o espalhar

dos dedos intermediários

Após abrir as imagens correspondentes aos lados N e E e marcar

todos os pontos, o valor do IFC era automaticamente calculado pelo programa

(Figura 5).

Os valores do IFC próximos a zero foram considerados resultados de

marcha normal e -100 considerados com perda total da função do membro

lesionado. Foi atribuído, também, valor de -100 quando os pontos não estavam

nítidos, devido à disfunção motora, nos casos de apoio do dorso do pé e presença

de contratura intensa dos flexores digitais, ao apoiar a face dorsal das falanges

distais.

52

FIGURA 5 – Tela do software IFC_RATOS com as imagens correspondentes de cada

pegada, normal (N) e experimental (E). As retas entre os pontos

vermelhos representa o comprimento da pegada (PL), entre os pontos

verdes representa a distância entre primeiro e quinto dedo (TS) e entre

os pontos azuis, a distância entre o segundo e quarto dedo (IT). À

esquerda, têm-se os valores das medidas obtidas

Para realizar este teste os animais foram condicionados pelo mesmo

treinador, antes da lesão, três vezes, sendo uma a cada 48 horas, totalizando seis

dias, a caminharem sobre a passarela. O condicionamento consistiu em

posicionar o rato no início da passarela, direcionando o animal manualmente,

quando necessário, até ao abrigo escuro e o deixando permanecer neste local por

10 segundos. Este processo foi repetido cinco vezes com cada animal em cada

dia de treinamento. Apenas no primeiro dia, colocou-se um dos animais no abrigo

escuro para servir de estímulo para os demais.

Ângulo do Tarso

Obteve-se o Ângulo do Tarso em três tempos diferentes: pré-operatório

(TØ), primeiro dia de pós-operatório (T1) e 126º dia de pós-operatório (T7). Para

aferir o Ângulo do Tarso utilizou-se o software Visual 3D e fez-se necessária a

colocação de três marcadores passivos (retrorreflexivos), com 6 mm de diâmetro,

em cada animal. Estes marcadores foram fixados com fita dupla face nas

53

seguintes regiões anatômicas do membro pélvico esquerdo, previamente

tricotomizadas: côndilo lateral da tíbia, maléolo lateral e entre dorso das cabeças

do quinto e quarto metatarsos. A localização anatômica e a fixação dos

marcadores foram sempre realizadas pelo mesmo pesquisador.

Os animais foram colocados para caminhar na mesma passarela

utilizada para o IFC, porém sem o espelho. A passarela foi instalada sobre uma

mesa, com 67 cm de altura, e, frontalmente a 1,20 m de distância, foi posicionado

o sistema Optitrack® (Natural point, Optical Motion Capture Solutions) composto

por duas câmeras Flex (V100R2) fixadas em tripés, equidistantes 1,60 m, e

formando ângulo 45o com a passarela para os procedimentos de captura de

imagens dos marcadores retroflexivos fixados nos animais, nos pontos

anatômicos previamente determinados. Coletaram-se três imagens da marcha por

dia de cada animal.

As câmeras operavam a 100 Hz com captura de imagem em tempo

real e sinal sincronizado através de cabo USB. Para a captura dos pontos

previamente marcados com os marcadores retroflexivos foi empregado o software

Amass® no qual também se processaram os dados. Em seguida, estes foram

transferidos para o software Visual 3D® (C-Motion®), para a construção do modelo

biomecânico e a análise cinemática.

A construção do modelo biomecânico baseou-se no modelo proposto

por JOÃO et al. (2010). Primeiramente, fez-se a aquisição estática de um rato

com os marcadores passivos fixados nos pontos anatômicos previamente

descritos. Em seguida, criaram-se três marcas virtuais localizadas medialmente

aos marcadores reais. Para isso, aferiu-se a medida do raio do joelho, tarso e pé

que foi respectivamente: 30 mm, 15 mm e 20 mm. Com isso, criaram-se dois

segmentos: perna esquerda e pé esquerdo, finalizando a construção do modelo

biomecânico (Figura 6).

54

FIGURA 6 - Tela do software Visual 3D mostrando o esqueleto dos segmentos criados

de rato Wistar: perna e pé, para aferir o Ângulo do Tarso

Criado o modelo biomecânico, o software Visual 3D® processou os

dados referentes aos animais em postura dinâmica, que foram interpolados e

filtrados usando o filtro do tipo low pass Butterworth de quarta ordem, com o

objetivo de diminuir ruídos.

A variável analisada foi o Ângulo do Tarso no plano sagital no instante

da retirada do pé do solo, na fase final do apoio. Valores de ângulos positivos

indicavam flexão dorsal e os ângulos negativos, flexão plantar.

Para calibrar o sistema de análise de movimento foi posicionado sobre

a mesa, em que ficava a passarela, um esquadro, com três marcadores

retroflexivos, devidamente nivelado que identificou a origem do sistema de

referência adotado na captura das imagens. As coordenadas de referência global

determinaram-se pela leitura das marcas sobre esta estrutura, definindo o eixo X

como mediolateral, o eixo Y como anteroposterior e o Z como vertical. Em

seguida, fez-se a varredura de todos os pontos localizados na região da

passarela, por 30 segundos, conforme recomendações de calibração do sistema

de análise do movimento, com haste de calibração contendo seis marcadores

retroflexivos equidistantes, e um não colinear aos demais.

Péa

Perna

Péa

Perna

55

Análise Estatística

Após obter-se a média dos valores mensurados de cada grupo em

cada tempo analisado, tanto para o IFC quanto para o AT, aplicou-se o teste

Mann-Whitney para verificar as diferenças entre os grupos experimentais.

Realizaram-se também comparações dentro de cada grupo entre os tempos de

avaliação empregando-se o teste Wilcoxon. O nível se significância adotado foi de

5% (p<0,05) utilizando o software IBM SPSS Statistic versão 15.0.

RESULTADOS

Os valores médios do IFC dos animais dos dois grupos experimentais,

antes da neurotmese, ou seja, tempo zero (TØ), foram -9,6 (± 10,3) para o GC e -

8,0 (± 20,3) para o GL, ou seja, próximos de zero. Após a neurotmese, houve

nítida alteração da marcha de todos os animais, de ambos os grupos, devido à

desnervação dos músculos flexores plantares, apresentando adução dos dedos,

discreta flexão das articulações interfalangeanas e intensa flexão dorsal com

descarga de peso no calcâneo do membro lesionado. Os valores do IFC no T1

ficaram próximos a -100, sendo de -103,3 (± 20,2) para o GC e -94,7 (± 12,8) para

o GL. Três ratos do GL arrastaram o dorso do pé no solo na fase de apoio, no T1,

e atribuiu-se valor -100 ao IFC destes animais devido à impossibilidade de marcar

os pontos pesquisados.

Foi atribuído, também, o valor -100 ao IFC dos animais de ambos os

grupos que apresentaram contratura dos flexores das articulações

interfalangeanas nos seguintes momentos: um animal do GC e um animal do GL

no 63º dia, em um animal do GC e dois do GL no 84º dia do pós-operatório, em

um animal do GC e em dois animais do GL no 105º dia, em três animais do GC e

em quatro animais do GL 126º dia.

56

O valor médio do IFC no grupo GC nos tempos T2 a T7 foi

respectivamente -112,7 (± 8,2), -87,4 (± 27,7), -69,3 (± 25,4), -69,2 (± 27,4), -67, 9

(± 28,3) e -83,4 (± 34,2). Já no GL foi respectivamente -105,7 (± 10,3), -87,6 (±

20,8), -86,0 (± 20,2), -84,5 (± 13,8), -83,9 (± 23,8) e -92,1 (± 14,4). Verificou-se

que não houve diferença significativa nos valores do IFC nos oito tempos de

avaliação (p>0,05) ao comparar os dois grupos (Figura 7).

FIGURA 7 - Valores médios do IFC de ratos após neurotmese do nervo isquiático em

cada tempo de avaliação (TØ, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7) dos grupos

experimentais: GC e GL

Tanto no GC e quanto no GL, o teste Wilcoxon mostrou que os valores

de IFC pré-lesão foram diferentes estatisticamente quando comparados com

todos os demais dias (p=0,028). Ao comparar o valor do IFC do primeiro dia após

a lesão (T1) com os demais, houve diferença significativa (p=0,046) apenas no

GC no T6 (Tabela 1).

TØ T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

GC -9,6 -103,3 -112,8 -87,4 -69,3 -69,2 -67,9 -83,4

GL -8,0 -94,7 -105,7 -87,6 -86,0 -84,5 -83,9 -92,1

-120,0

-110,0

-100,0

-90,0

-80,0

-70,0

-60,0

-50,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

IFC

57

TABELA 1 - Valores de p comparando o IFC de ratos submetidos à neurotmese do nervo

isquiático seguida de tubulização com câmara de silicone nos tempos de TØ

e T1 com os demais dias de coleta (T1, T2, T3, T4, T5, T6 e T7) em cada

grupo experimental: GC e GL

Tempo de coleta Tempo de coleta Grupo (valor de p)

GC GL

TØ T1 0,028 0,028

T2 0,028 0,028

T3 0,028 0,028

T4 0,028 0,028

T5 0,028 0,028

T6 0,028 0,028

T7 0,028 0,028

T1 T2 0,225 0,463

T3 0,249 0,600

T4 0,075 0,345

T5 0,075 0,225

T6 0,046 0,345

T7 0,249 0,893 Teste Wilcoxon, p<0,05

Contudo, ao comparar o IFC de cada dia de coleta com o subsequente,

houve diferença significativa (p<0,05) apenas no GC comparando-se T2 com T3

(p=0,046) e T3 com T4 (p=0,043) (Tabela 2).

TABELA 2 - Valores de p comparando o IFC de ratos submetidos à neurotmese do nervo

isquiático seguida de tubulização com câmara de silicone comparando cada

tempo de coleta (TØ, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7) com o subsequente em

cada grupo experimental: GC e GL

Tempo de coleta Tempo de coleta Grupo (valor de p)

GC GL

TØ T1 0,028 0,028

T2 T3 0,046 0,116

T3 T4 0,043 0,753

T4 T5 0,917 0,893

T5 T6 0,786 1,000

T6 T7 0,138 0,197 Teste Wilcoxon, p<0,05.

58

Com relação ao AT, após o procedimento cirúrgico, nos dois grupos

experimentais, houve intensa flexão dorsal do membro operado em toda a fase de

apoio, com suporte de peso sobre os metatarsos, tarso e calcâneo. Na fase final

do apoio, no momento de saída do pé do solo, houve ausência de flexão plantar.

Neste momento, as articulações do joelho e quadril fizeram extensão. Já na fase

de balanço, ocorreu a tríplice flexão simultânea do quadril, joelho e tarso,

evidenciando que os músculos flexores dorsais estavam intactos.

Os valores angulares da articulação do tarso obtidos nos tempos TØ,

T1 e T7 foram respectivamente para o GC: 6,5 ± 24,4º; 41,2 ± 22,5º e 21,2 ± 6,0º.

Para o GL foram respectivamente: 7,0 ± 31,2º; 38,6 ± 14,6º e 13,2 ± 9,1º,

mostrados na Tabela 3. Não houve diferença estatística (p>0,05) entre os grupos

em nenhum tempo experimental.

TABELA 3 - Comparação do Ângulo do Tarso de ratos do GC e GL, submetidos à

neurotmese seguida de tubulização com câmara de silicone na fase final

do apoio da marcha, nos tempos experimentais: TØ, T1 e T7

Tempo experimental GC GL

p Ângulo do Tarso (graus)

Ângulo do Tarso (graus)

TØ 6,5 ± 24,4 7,0 ± 31,2 0,818

T1 41,2 ± 22,5 38,6 ± 14,6 0,937

T7 21,2 ± 6,0 13,2 ± 9,1 0,065 Teste Mann-Whitney, p<0,05, valores expressos como média e desvio padrão

Quando se comparou o AT de cada tempo de coleta com o

subsequente em cada grupo experimental, houve diferença significativa no GL

quando se comparou TØ com T1 (p=0,046). Também houve diferença estatística

em ambos os grupos quando se comparou T1 com T7 (p=0,028) (Tabela 4).

59

TABELA 4 - Comparação pareada de cada tempo experimental (TØ,

T1 e T7) do AT no final da fase de apoio no GC e GL,

em ratos após neurotmese do nervo isquiático seguida

de tubulização com câmara de silicone

Grupo Tempo experimental Valor de p

GC TØ x T1 0,116 TØ x T7 0,345 T1x T7 0,028

GL TØ x T1 0,046 TØ x T7 0,917 T1x T7 0,028 Teste Wilcoxon, p<0,05

DISCUSSÃO

No presente experimento os parâmetros de irradiação do laser

terapêutico foram rigorosamente descritos de acordo com a World Association for

Laser Therapy (2013) que exige que conste na metodologia das pesquisas com

laser o número de sessões, método estacionário em contato com a pele,

comprimento de onda, potência de saída em mW, tempo em segundos do

tratamento, dose de energia em joules, área efetiva de saída da radiação,

densidade de potência, energia acumulada em todas as sessões em joules.

Estes parâmetros são em parte discordantes entre os diversos autores

que afirmaram que a utilização do laser terapêutico em lesões de nervos

periféricos ainda não está bem estabelecida na comunidade científica,

principalmente devido à grande possibilidade de combinações dos parâmetros de

irradiação, como frequência, densidade de energia, potência, local da irradiação,

total de pontos de aplicação e tempo do tratamento, bem como às dificuldades de

reprodução metodológicas dos mesmos decorrentes de divergências nos

protocolos de utilização. No entanto, a maioria dos estudos relataram efeitos

benéficos desta terapia sobre o tecido nervoso periférico (REIS et al., 2009;

MEDALHA et al., 2012; TAKHTFOOLADI et al., 2012; ALCANTARA et al., 2013).

A irradiação do laser proposta neste estudo tanto no segmento da

medula espinhal correspondente ao nervo lesionado quanto no trajeto do nervo

está de acordo com ANDERS et al. (2004) que propuseram que o efeito da

60

irradiação do laser de baixa intensidade na recuperação nervosa periférica

poderia ser aumentado se irradiasse tanto o trajeto do nervo quanto o segmento

correspondente da medula espinhal. SAHMIR et al. (2001) e ROCHKIND et al.

(2007) que investigaram a influência do laser na regeneração nervosa quando

irradiado na medula e no nervo, após neurotmese do nervo isquiático, mostraram

uma melhora na regeneração nervosa, quando comparados com seus respectivos

placebos. No entanto, SOUSA et al. (2009) relataram que não obtiveram melhora

na regeneração nervosa periférica de ratos submetidos à axonotmese por meio

da avaliação funcional da marcha no grupo tratado com laser de AsGaAl (830nm)

em ambos os locais, no segmento da medula espinhal e no trajeto do nervo.

Observou-se que no 21º e no 42º dia de pós-cirúrgico os valores do

IFC do GL foram melhores do que os do GC, porém sem diferença estatística,

como observado também por REIS et al. (2009) que obtiveram melhor resposta

no grupo tratado com laser no 21º dia de pós-operatório, sem diferença

significativa. Estes resultados são discordantes de MEDALHA et al. (2012) cujos

valores de IFC, após neurotmese, em animais tratados com laser foram melhores

estatisticamente. No entanto, estes autores não relataram a presença de

contraturas como observado neste estudo.

SOUSA et al. (2009) sugeriram excluir das avaliações os animais que

apresentavam contratura muscular, no entanto esta metodologia não foi adotada

neste estudo, pois considerou-se que a presença da contratura muscular

desenvolvida em animais que sofreram lesão de nervo periférico foi uma variável

observada que fez parte dos resultados.

A adoção do valor de -100 ao IFC dos animais que apresentaram

contratura muscular ocorreu pela impossibilidade de marcação da região plantar

dos dígitos destes animais que estavam apoiados sobre o dorso das falanges

distais, impedindo uma mensuração equivalente aos animais que não

apresentavam contratura do membro, interferindo no valor real do IFC. O fato dos

animais terem apresentado contraturas dos músculos flexores permitiu concluir

que houve perda da função motora, impossibilitando a aplicação do método do

IFC proposto por DE MEDINACELLI (1982). O método de análise proposto por

este autor tem o objetivo de investigar a medida da abdução dos dedos bem

como o comprimento da pegada. Entretanto nesta pesquisa, em alguns animais

61

as falanges distais se flexionaram havendo encurtamento do comprimento da

pegada, quando da aferição da extremidade do terceiro dedo que estava

flexionado até à região de maior apoio no calcâneo, constituindo-se assim em

uma variação do método original.

Os dados obtidos indicaram que o IFC em lesões do tipo neurotmese,

com recuperação em longo prazo, não foi adequado para analisar a marcha de

ratos devido às contraturas musculares desenvolvidas, confirmando os achados

descritos por DINH et al. (2009).

Em contraste ao IFC, o AT obtido no momento de retirada do pé do

solo, no final da fase de apoio, revelou ser mais fidedigno como método de

avaliação da funcionalidade da musculatura desnervada. Este método

demonstrou que a medida do AT não sofreu influência das contraturas

musculares desenvolvidas durante o experimento nos membros lesionados dos

animais, estando de acordo com os postulados por diversos autores como

VAREJÃO et al. (2003), PATEL et al. (2006), AMADO et al. (2010), JOÃO et al.

(2010) e AMADO et al. (2011).

Embora o método de mensuração do AT tenha se revelado melhor do

que o IFC, deve-se ressaltar, que o AT sofreu influência do movimento da pele

sobre a proeminência óssea na região proximal da tíbia durante a marcha, como

observado também por BAUMAN & CHANG (2010) e JOÃO et al. (2010).

Assim, em adição ao tratamento com laser de baixa intensidade é

oportuno associar-se outras terapias como alongamentos, estímulos elétricos e

exercícios em esteira para evitar ou minimizar contraturas musculares e favorecer

o fortalecimento muscular, conforme amplamente descrito por autores como

ASENSIO-PINILLA et al. (2009), HAASTERT-TALINI et al. (2011) e TEODORI et

al. (2011). Provavelmente com a combinação destes recursos estima-se que haja

uma melhora funcional em longo prazo.

62

CONCLUSÃO

Não foi possível observar melhora funcional motora do nervo isquiático

dos ratos submetidos à neurotmese e tratados com laser a 830 nm. O método de

aferição pelo Ângulo do Tarso demonstrou ser mais adequado para detectar

alterações motoras em longo prazo do nervo isquiático submetido à neurotmese

por não sofrer influência das contraturas musculares.

REFERÊNCIAS

1. ALCANTARA, C. C.; GIGO-BENATO, D.; SALVINI, T. F.; OLIVEIRA, A. L. R.; ANDERS, J. J.; RUSSO, T. L. Effect of low-level laser therapy (LLLT) on acute neural recovery and inflammation-related gene expression after crush injury in rat sciatic nerve. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 45, p. 246–252, 2013.

2. AMADO, S.; ARMADA-DA-SILVA, P. A. S.; JOÃO, F.; MAURÍCIO, A. C.; LUÍS, A. L.; SIMÕES, M. J.; VELOSO, A. P. The sensitivity of two-dimensional hindlimb joint kinematics analysis in assessing functional recovery in rats after sciatic nerve crush. Behavioural Brain Research, Amsterdam, v. 225, n. 2, p. 562-573, 2011.

3. AMADO, S.; RODRIGUES, J. M.; LUÍS, A. L.; ARMADA-DA-SILVA, P. A. S.; VIEIRA, M.; GARTNER, A.; SIMÕES, M. J.; VELOSO, A. P.; FORNARO, M.; RAIMONDO, S.; VAREJÃO, A. S. P.; GEUNA, S.; MAURÍCIO, A. C. Effects of collagen membranes enriched with in vitro-differentiated N1E-115 cells on rat sciatic nerve regeneration after end-to-end repair. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation, London, v. 7, n. 7, p. 1-13, 2010.

4. ANDERS, J. J.; GEUMA, S.; ROCHKIND, S. Phototherapy promotes

regeneration and functional recovery of injured peripheral nerve. Neurological Research, Chicago, v. 26, p. 233-239, 2004.

5. ASENSIO-PINILLA, E.; UDINA, E.; JARAMILLO, J.; NAVARRO, X. Electrical

stimulation combined with exercise increase axonal regeneration after peripheral nerve injury, Experimental Neurology, San Diego, v. 219, p. 258-

265, 2009.

6. BAGIS, S.; COMELEKOGLU, U.; COSKUN, B.; MILCAN, A.; BUYUKAKILLI, B. No effect of GA-AS (904 nm) laser irradiation on the intact skin of the injured rat sciatic nerve. Lasers in Medical Science, London, v. 18, n. 1, p. 83-88, 2003.

63

7. BAIN, J. R.; MACKINNON, S. E.; HUNTER, R. T. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery, Baltimore, v. 83, n. 1, p. 129-136, 1989.

8. BASFORD, J. R. Low intensity laser therapy: still not an established clinical

tool. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 6, n. 4, p. 331-342, 1995.

9. BAUMAN, J. M.; CHANG, Y-Η. High-speed X-ray vídeo demonstrates significant skin movement errors with standard optical kinematics during rat locomotion. Journal of Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 186, p. 18-

24, 2010.

10. BENNETT, S. W.; LANOVAZ, J. L.; MUIR, G. D. The biomechanics of locomotor compensation after peripheral nerve lesion in the rat, Behavioural Brain Research, Amsterdam, n. 229, p. 391-400, 2012.

11. CAMARGO, V. M.; COSTA, J.; ANDRÉ, E. S. A comparative study between two types of low-power lasers and their respective effects in peripheral nerve regeneration. Fisioterapia em Movimento, Curitiba, v. 19, n. 2, p. 127-134, 2006.

12. CUNHA, N. B.; MOESCH, J.; MALLMANN, J. S.; CIENA, A. P.; BERTOLINI, G. R. F. Uso do laser, 670 nm, no quadro álgico de ratos submetidos à modelo experimental de ciatalgia. Revista Brasileira de Medicina do Esporte, São Paulo, v. 14, n. 2, p. 115-118, 2008.

13. DE MEDINACELI, L.; DERENZO, E.; WYATT, R.J. An index of the functional

condiction of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology, San Diego, v. 77, n. 3, p. 634-643, 1982.

14. DINH, P.; HAZEL, A.; PALISPIS, W.; SURYADEVARA, S.; GUPTA, R. Functional assessment after sciatic nerve injury In a rat model. Microsurgery,

New York, v. 29, n. 8, p. 644-649, 2009.

15. ENDO, C.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; FASAN, V. S. Low-power laser therapy accelerates peripheral nerves regeneration. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 16, n. 5, p. 305-310, 2008.

16. FORTERRE, F.; TOMEK, A.; RYTZ, U.; BRUNNBERG, L.; JAGGY, A.;

SPRENG, D. Iatrogenic sciatic nerve injury in eighteen dogs and nine cats (1997-2006). Veterinary Surgical, Malden, v. 36, n. 5, p. 464-471, 2007.

17. GASPARINI, A. L. P.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N. Correlação entre diferentes métodos de avaliação funcional da marcha de ratos com lesão por esmagamento do nervo isquiático. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 15, n. 5, p. 285-289, 2007.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Forterre%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tomek%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rytz%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brunnberg%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jaggy%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Spreng%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17614928

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17614928

64

18. GIGO-BENATO, D.; GEUNA, S.; ROCHKIND, S. Phototherapy for enhancing peripheral nerve repair: a review of the literature. Muscle Nerve, Malden, v. 31, n. 6, p. 694-701, 2005.

19. GOUDARZI, M. M.; AZARNIA, M.; KAKA, G.; SADRAII, S. H.; AGHDA, A. K. Study of bone marrow stromal cells, nerve growth factor, and marginal on nerve regeneration in rat crushed sciatic nerve. Journal Mazandaran of University of Medical Science, Sari, v. 23, n. 102, p. 102-111, 2013.

20. HAASTERT-TALINI, K.; SCHMITTE, R.; KORTE, N.; KLODE, D.; RATZKA, A.; GROTHE, C. Electrical stimulation accelerates axonal and functional peripheral nerve regeneration across long gaps. Journal of Neurotrauma, New York, v. 28, n. 4, p. 661-674, 2011.

21. JOÄO, F.; AMADO, S.; VELOSO, A.; ARMADA-DA-SILVA, P.; MAURICIO, A. C. Anatomical reference frame versus planar analysis: implications for the kinematics of the rat hindlimb during locomotion. Reviews in the Neurosciences, Berlin, v. 21, p. 469-485, 2010.

22. JUNGNICKEL, J.; HAASTERT, K.; GRZYBEK, M.; THAU, N.; LIPOKATIC-TAKACS, E.; RATZKA, A.; NÖLLE, A.; CLAUS, P.; GROTHE, C. Mice lacking basic fibroblast growth factor showed fast sensory recovery. Experimental Neurology, San Diego, v. 223, p. 166–172, 2010.

23. MARCOLINO, A. M.; BARBOSA, R. I.; NEVES, L. M. S.; MAZZER, N.;

GUIRRO, R. R. J.; FONSECA, M. C. R. Assessment of functional recovery of sciatic nerve in rats submitted to low-level laser therapy with different fluences. An experimental study. Journal of Hand and Microsurgery, Madurai, v. 5, n. 2, p. 49-53, 2013.

24. MARCOLINO, A. M.; BARBOSA, R. I.; NEVES, L. M. S.; VINAS, T. S.; DUARTE, D. T. B.; MAZZER, N.; FONSECA, M. C. R. Laser de baixa intensidade (830nm) na recuperação funcional do nervo isquiático de ratos. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 18, n. 4, p. 207-211, 2010.

25. MEDALHA, C. C.; DI GANGI, G. C.; BARBOSA, B. C.; FERNANDES, M.; AGUIAR, O.; FALOPPA, F.; LEITE, V. M.; RENNO, A. C. M. Low-level laser therapy improves repair following complete resection of the sciatic nerve in rat. Lasers in Medical Science, London, v. 27, p. 629–635, 2012.

26. MONTE-RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; YAMASITA, A. C.;

BARBIERI, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible? Journal of Neuroscience Methods, Amsterdam, v. 170, n. 2,

p. 255-261, 2008. 27. MONTE-RASO, V. V.; FONSECA, M. C. R.; MAZZER, N.; BARBIERI, G.;

ROSA, R. C.; ZAMARIOLI, A.; BARBIERI, C. H. Esteira com velocidade controlada para captação da marcha. Acta Ortopédica Brasileira, São Paulo, v. 18, n. 1, p. 49-53, 2010.

65

28. NEVES, G. B.; CUSIELO, L. V. C.; SOUZA, A. N.; BARBOSA, V. T.; ALVES, R. O.; SILVA, L. A. F.; SILVA, O. C.; PEIXOTO, F. J. G. Emprego da fisioterapia em eqüinos com paralisia facial, Ciência Animal Brasileira,

Goiânia, v. 9, n. 2, p. 449-454, 2008.

29. OLBY, N; HALLING, K. B.; GLICK, T. R. Rehabilitation for the neurologic patient. Veterinary Clinics Small Animals Practice, Philadelphia, v. 35, p.

1389-1409, 2005.

30. PATEL, M.; VANDEVORD, P. J.; MATTHEW, H.; WU, B.; DESILVA, S.; WOOLEY, P. H. Video-gait analysis of functional recovery of nerve repaired with chitosan nerve guides. Tissue Engineering, New York, v. 12, n. 11, p. 3189-3199, 2006.

31. REIS, F. A.; BELCHIOR, A. C. G.; CARVALHO, P. T. C.; SILVA, B. A. K.; PEREIRA, D. M.; SILVA, I. S.; NICOLAU, R. A. Effect of laser therapy (660 nm) on recovery of the sciatic nerve in rats after injury through neurotmesis followed by epineural anastomosis. Lasers in Medical Science, London, v. 24, n. 5, p. 741-747, 2009.

32. ROCHKIND, S.; LEIDER-TREJO, L.; NISSAN, M.; SHAMIR, M. H.; KHARENKO, O.; ALON, M. Efficacy of 780-nm laser phototherapy on peripheral nerve regeneration after neurotube reconstruction procedure (double-blind randomized study). Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v. 25, n. 3, p. 137-143, 2007.

33. SEDDON, H. J. A classification of nerve injuries. British Medical journal,

London, v. 2, n. 4260, p. 237-239, 1942.

34. SHAMIR, M. H.; ROCHKIND, S.; SANDBANK, J.; ALON, M. Double-blind randomized study evaluating regeneration of the rat transected sciatic nerve after suturing and postoperative low-power laser treatment. Journal of Reconstructive Microsurgery, New York, v. 17, n. 2, p. 133-137, 2001.

35. SIEMIONOW, M.; BRZEZICKI, G. Chapter 8: current techniques and concepts

in peripheral nerve repair. International Review of Neurobioloy, New York, v. 87, p. 141-172, 2009.

36. SOUSA, F. F. A.; ANDRAUS, R. A. C.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N. Influência da irradiação do laser na regeneração nervosa em diferentes locais de tratamento. Acta Ortopedica Brasileira, São Paulo, v. 17, n. 6, p. 331-

335, 2009.

37. SUN, F.; ZHOU, K.; MI, W.; QIU, J. Repair of facial nerve defects with decellularized artery allografts containing autologous adipose-derived stem cells in a rat mode. Neuroscience Letters, Ireland, v. 499, p. 104-108, 2011.








66

38. TAKHTFOOLADI, A. T.; SHARIF, D.; HAGHDOST, I. S.; ABEDI, G. Effects of Laser therapy (680) on recovery of the sciatic nerve in rabbits. Advances in Environmental Biology, Amman, v. 6, n. 12, p. 4057-4061, 2012.

39. TEODORI, R. M.; SILVA, A. M.; SILVA, M. T.; OLIVEIRA, L. S.; POLACOW,

M. L. O.; GUIRRO, E. C. O. High-voltage electrical stimulation improves nerve regeneration after sciatic crush injury. Revista Brasileira de Fisioterapia,

São Carlos, v. 15, n. 4, p. 325-31, 2011.

40. VAREJÃO, A. S. P.; CABRITA, A. M.; MEEK, M. F.; BULAS-CRUZ, J.; FILIPE, V. M.; GABRIEL, R. C.; FERREIRA, A. J.; GEUNA, S. WINTER, D. A. Ankle kinematics to evaluate functional recovery in crushed rat sciatic nerve. Muscle and Nerve, New York, v. 27, p. 706–714, 2003.

41. VAR O A. . .; M K M. .; RR IRA A. .; A R CIO . A. B.;

CABRITA, A. M. S. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. Journal of Neuroscience Methods,

Amsterdan, v. 108, n. 1, p. 1-9, 2001.

42. WORLD ASSOCIATION OF LASER THERAPY - WALT. Consensus agreement on the design and conduct of clinical studies with low level laser therapy and light therapy for musculoskeletal pain and disorders. Disponível em: http://waltza.co.za/wp-content/uploads/2012/08/walt_ standard_for _conduct_ of randomized_controlled_trials.pdf. Acesso em: 30 out. 2013.

http://waltza.co.za/wp-content/uploads/2012/08/walt_%20standard_for%20_conduct_%20of%20randomized_controlled_trials.pdf

http://waltza.co.za/wp-content/uploads/2012/08/walt_%20standard_for%20_conduct_%20of%20randomized_controlled_trials.pdf

67




RESUMO

Em lesões de nervos periféricos do tipo neurotmese faz-se necessário procedimento cirúrgico para que ocorra regeneração. No entanto, os processos regenerativos são lentos e muitas vezes incompletos. A utilização do laser de baixa intensidade nestas lesões demonstra os benefícios deste tratamento no tecido. Desse modo, o objetivo deste estudo foi relatar os efeitos morfológicos do laser de baixa intensidade na regeneração de nervo isquiático de ratos submetidos ao procedimento de tubulização com câmara de silicone após neurotmese. Utilizaram-se dois grupos, controle (GC) e laser (GL) com seis animais em cada. Todos os animais foram submetidos à neurotmese do nervo isquiático esquerdo, seguido de tubulização com câmara de silicone com cinco mm de distância entre os cotos nervosos. Os animais do GL receberam radiação com comprimento de onda de 830nm, densidade de energia de 4,13J/cm², em oito pontos, desde a região medular até o local de lesão do nervo, totalizando 40 dias de irradiação divididos em dois momentos distintos. O primeiro momento iniciou-se no pós-cirúrgico imediato em que foram realizadas 20 aplicações de laser, em dias alternados. O segundo momento ocorreu 40 dias antes de realizar a eutanásia dos animais com mais 20 dias de aplicações de laser, em dias alternados. Após 126 dias, os animais foram submetidos à eutanasia e os fragmentos dos nervos foram retirados e fixados em formol tamponado a 10% para análise histológica, com as colorações de HE, Luxol Fast Blue e Picrosirius Red, e imunoistoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S100 e FGF-2. Microscopicamente, avaliou-se a presença de proliferação axonal, degeneração Walleriana, reorganização fascicular e infiltrado inflamatório. Para a análise do HE estabeleceram-se escores descritivos e para os demais dados histológicos procedeu-se análise quantitativa por meio do programa Image J. Observou-se no GL melhor proliferação axonal, reorganização dos fascículos, ausência de infiltrado inflamatório, maior quantidade de mielina e menor quantidade de colágeno, maior expressão de S-100 e NF e menor expressão de FGF-2. Palavras-chave: Bainha de mielina, biomaterial, células de Schwann, fototerapia, imunoistoquímica

68

LOW-LEVEL LASER THERAPY (830 nm) EFFECTS ON SCIATIC NERVE OF

RATS SUBMITTED TO NEUROTMESIS AND TUBING WITH SILICONE

CHAMBER

ABSTRACT

In peripheral nerve neurotmesis injury, surgical procedure is necessary for regeneration to occur. However, the regenerative processes are slow and often incomplete. The use of low-level laser in these lesions demonstrates the benefits of this treatment on tissue. Thus, the objective of this study was to report the morphological effects of low-intensity laser on the regeneration of the sciatic nerve of rats submitted to the tubing procedure with silicone chamber after neurotmesis. We used two groups, control (GC) and laser (GL), with six animals in each. Animals in GL received radiation with a wavelength of 830 nm, energy density of 4.13 J/cm², on eight points from the spinal cord to nerve injury site, totaling 40 days of irradiation divided into two distinct periods. The first stage began at the immediate post-operative period where 20 laser applications were performed on alternate days. The second stage occurred 40 days before performing euthanasia in animals submitted to more than 20 days of laser applications on alternate days. After 126 days, the animals were euthanized and the fragments of the nerves were removed and fixed in 10% formalin buffered for histological analysis with HE, Luxol Fast Blue and Picrosirius Red staining, and immunohistochemistry with neurofilament antibody (NF), FGF-2 and S-100. Microscopically, we observed the presence of axonal growth, Wallerian degeneration, inflammatory infiltrate and fascicular reorganization. For HE analysis, we stablished descriptive scores and for the other histological data we carried out quantitative analysis through program Image J. In GL we observed better axonal growth, reorganization of issues, absence of inflammatory infiltrate, greater amount of myelin and less collagen, increased expression of S-100 and NF and lower expression of FGF-2. Keywords: Biomaterial, immunohistochemical, myelin sheath, phototherapy, Schwann cells

69

INTRODUÇÃO

Os nervos periféricos são alvos constantes de lesões de origem

traumática, resultando em diminuição ou perda da sensibilidade e motricidade no

local inervado. Em lesões graves, como na neurotmese, é necessário que se

realize procedimento cirúrgico para que ocorra a regeneração (SEDDON 1942;

MOHAMMADI et al., 2012). No entanto, os processos regenerativos são lentos e

muitas vezes incompletos (ANDERS et al., 2004; YEGIYANTS et al., 2010).

Assim, equipamentos terapêuticos como a eletroestimulação (LU et al., 2008;

HAASTERT-TALINI et al., 2011; TEODORI et al., 2011), o ultrassom terapêutico

(MONTE-RASO et al., 2006; PARK et al., 2011) e o laser de baixa intensidade

(ANDERS et al., 2004; GIGO-BENATO et al., 2004; REIS et al., 2009; SOUSA et

al., 2013) são utilizados com o intuito de acelerar e melhorar os processos de

regeneração tecidual.

Existem várias teorias para explicar a ação do laser na célula. Uma

delas refere-se à formação de uma pequena quantidade de óxido nítrico. Esses

radicais livres em grande quantidade são prejudiciais à célula, mas em pequena

quantidade atuam como mensageiros na cascata de eventos que sucedem a

irradiação, influenciando, por exemplo, a formação de ATP (KARU et al., 2005).

Apesar dos mecanismos moleculares que envolvem a atuação do laser

na regeneração dos nervos periféricos ainda não estarem totalmente

esclarecidos, há forte evidência que o laser promove efeito benéfico sobre o

tecido nervoso. Estudos in vitro têm demonstrado que o laser de baixa

intensidade pode influenciar nos processos celulares incluindo alteração da

síntese de DNA e expressão gênica (CHEN et al., 2008), produção de proteína

(HOU et al., 2008), biomodulação na organização citoesquelética (RICCI et al.,

2009) e proliferação e diferenciação celular (YAZDANI et al., 2012).

O objetivo deste experimento é verificar os efeitos morfológicos do

laser de baixa intensidade (830nm) na regeneração de nervo isquiático de ratos

submetidos ao procedimento de tubulização após neurotmese.

70

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no Biotério Experimental e nos

Laboratórios de Imunopatologia e Histopatologia no Setor de Patologia Animal da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (UFG),

Goiânia-GO. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pró-

Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFG protocolado sob o nº 051/11

(Anexos).

Utilizaram-se 12 ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, machos,

provenientes do Biotério Central da UFG, com peso médio de 350 g. Os animais

foram alojados em gaiolas de polipropileno com três ratos em cada. A ração

peletizada e a água foram oferecidas ad libitum durante todo o experimento. A

temperatura do biotério foi mantida entre 20 e 22 ºC com umidade relativa do ar

de 55 ± 10% e ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais passaram por um

período de adaptação de 15 dias antes de iniciar os procedimentos experimentais.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com dois

grupos e seis repetições. Os animais foram alocados em dois grupos com seis

animais cada, sendo um o Grupo Controle (GC) submetido à técnica de

tubulização com câmara de silicone associada à aplicação de laser de baixa

intensidade (830 nm) com aparelho desligado; e o outro, Grupo Laser (GL)

submetido à técnica de tubulização com câmara de silicone associada à aplicação

de laser de baixa intensidade (830 nm).

Procedimento cirúrgico

Os ratos receberam aplicação pré-anestésica por via intraperitoneal de

cloridrato de tramadol (Tramal® solução injetável, Pfizer, Stolberg, Alemanha) na

dose de 20 mg/kg e cloridrato de xilazina (Anasedan® injetável 10 mL, Vetbrands,

São Paulo, Brasil) na dose de 10 mg/kg. Foram mantidos em indução e

manutenção anestésica com isofluorano (Vetflurano®, Virbac, São Paulo, Brasil)

em fluxo diluente de 250 mL/min de O2 em circuito de reinalação de gases com

auxílio de máscara para roedores, em aparelho de anestesia volátil (Takaoka®

71

KT15, São Paulo, Brasil). Os animais foram posicionados em decúbito lateral

direito, promovendo-se o acesso ao nervo isquiático na face lateral da coxa

esquerda, desde o trocanter maior até o joelho. Após divulsão entre os músculos

semitendinoso e bíceps femoral, localizou-se o nervo isquiático. Procedeu-se,

então, a neurotmese com bisturi a 5 mm proximal da divisão dos três ramos

principais do nervo isquiático (tibial, fibular comum e sural), seguida da

aproximação dos cotos nervosos pela técnica de tubulização.

Para realizar a tubulização os cotos nervosos foram inseridos em uma

câmara flexível de silicone (Perfimed®, Distrito Industrial – Salto, São Paulo,

Brasil), com comprimento de 1,0 cm, diâmetro interno de 1 mm e espessura de

parede de 0,6 mm, previamente esterilizado em autoclave. Para a imobilização o

coto proximal (CP) do nervo foi fixado à camara, com ponto único em “U” no

epineuro, utilizando fio de náilon 6-0 (Shalon® suturas, São Luís de Montes Belos,

Goiás, Brasil). Em seguida, o coto distal (CD) foi imobilizado e fixado à câmara da

mesma maneira do CP, respeitando-se um espaço de 5 mm entre os cotos. Esta

distância foi previamente marcada com régua com um furo com agulha de insulina

(0,45 x 0,13 mm) no tubo de silicone. Entre os cotos nervosos, dentro da câmara,

foram colocados 0,02 mL de solução de ringer com lactato para preencher o

espaço entre os cotos. Finalizado o procedimento cirúrgico, foi realizado o

reposicionamento do tecido muscular e a sutura da pele com pontos contínuos,

com fio de náilon 5.0 (Somerville, Jaboatão do Guararapes, Pernambuco, Brasil).

A analgesia pós-cirúrgica se deu pela aplicação subcutânea de cloridrato de

tramadol (20 mg/kg) diluído em igual quantidade de soro fisiológico, de oito em

oito horas por três dias.

72

Aplicação do laser de baixa intensidade

Para as aplicações do laser de baixa intensidade, utilizou-se aparelho

de laser (Laserpulse, Ibramed Equipamentos Médicos, Rio Grande do Sul, Brasil)

de diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl), previamente calibrado pelo

fabricante, com comprimento de onda de 830 nm, potência de saída de 30 mW,

modo contínuo e área de radiação efetiva de 0,116 cm². Realizou-se em todos os

animais dos dois grupos experimentais a tricotomia do local da irradiação uma vez

por semana. Foram irradiados quatro pontos sobre a medula espinhal, na região

paravertebral esquerda, nos segmentos medulares de L3 até L6, e quatro pontos

acompanhando o trajeto do nervo ao longo da face caudolateral do fêmur até

articulação do joelho.

Irradiaram-se no total oito pontos com 1 cm de equidistância em cada

dia de aplicação do laser, sendo 40 dias de irradiação divididos em dois

momentos distintos. O primeiro momento iniciou-se no pós-cirúrgico imediato em

que foram realizadas 20 aplicações de laser, em dias alternados. O segundo

momento ocorreu 40 dias antes de realizar a eutanásia dos animais com mais 20

dias de aplicações de laser, em dias alternados.

O método de aplicação foi o pontual, posicionando a caneta a 90º em

relação ao tecido cutâneo, com densidade de energia de 4,13 J/cm², por 16

segundos em cada ponto, totalizando 76,8 J de energia em cada momento.

Durante as aplicações do laser, os ratos foram imobilizados manualmente, sendo

que os procedimentos de contenção dos animais do GC foram os mesmos do GL,

porém com o aparelho desligado.

Colheita de material e análise histomorfológica

Ao término do experimento, os animais foram submetidos à eutanasia

por sobredose de Isoflurano. Imediatamente após, procedeu-se a retirada de 0,5

cm proximal e distal ao local da lesão localizado na câmara de silicone, sendo

fixado este material em formol tamponado a 10% por 24 horas e, em seguida,

mantidos em álcool 70% até o processamento histológico. Foi selecionado um

73

fragmento de 0,5 cm do coto distal (CD) e outro fragmento de 1 cm

compreendendo o cabo de regeneração (CR) e o coto proximal (CP) de cada

animal. Em blocos de parafina, os fragmentos do CD foram cortados

transversalmente e os do CR e CP foram cortados longitudinalmente a 5 µm

distendidos sobre lâminas histológicas silanizadas (Starfrost Adhäsiv-Silan –

Knittel, Alemanha) e corados para as técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE),

Picrosirius Red e Luxol Fast Blue. Todos os fragmentos colhidos foram

submetidos ao procedimento de imunoistoquímica, adaptado de MORAES (2012),

utilizando os anticorpos S-100 (1:500, Polyclonal Rabbit Anti-S100 – Z0311, Dako

Cytomation, Carpinteria, EUA), FGF-2 (1:300, Polyclonal Rabbit Anti FGF-2 [147]:

sc-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA) e NF (1:200, Monoclonal

Mouse Anti-human Neurofilament Protein, Clone 2F11 – M 0762, Dako

Cytomation, Carpinteria, EUA).

Macroscopicamente, avaliaram-se os nervos quanto à regeneração

completa entre os cotos e presença de aderências entre as estruturas do feixe

vasculonervoso. Microscopicamente, pela coloração de HE avaliaram-se a

proliferação axonal, a reorganização dos fascículos, a degeneração Walleriana e

o infiltrado inflamatório. Para identificar e quantificar as fibras de colágeno utilizou-

se a coloração de Picrosirius Red e para identificar e quantificar a bainha de

mielina empregou-se o Luxol Fast Blue.

Para cada um dos parâmetros analisados pelo HE, foram realizadas

análises descritivas e semiquantitativas de todo o fragmento do nervo de cada

animal, por meio de microscopia óptica em objetiva de 10x. Estabeleceram-se

escores de zero a três, sendo: escore 0 para ausente (sem alterações); escore 1

para discreto (1-25% do fragmento); escore 2 para moderado (26-50% do

fragmento); e escore 3 para acentuado (51-100% do fragmento).

As marcações das fibras de colágeno pelo Picrosirius Red, da bainha

de mielina pelo Luxol Fast Blue e de todos os anticorpos corados por DAB-

peroxidase foram analisadas quantitativamente, por densidade óptica, pelo

software analisador de imagens, o Image J (Image Processing and Analysis in

Java, versão 1.36b - Research Services Branch, National Institute of Mental

Health, Bethesda, Maryland, USA, disponível em: http://rsbweb.nih.gov/ij/). Desta

forma, capturaram-se cinco imagens de forma aleatória de cada um dos

http://rsbweb.nih.gov/ij/

74

fragmentos, das porções CP, CR e CD de cada animal, com câmera digital

acoplada ao microscópio óptico (Leica TM DFC 290, Weztlar, Alemanha), com a

objetiva de 40x para as lâminas coradas com Picrosirius Red e Luxol Fast Blue e

objetiva de 20x para as lâminas coradas com DAB-peroxidade. Os dados obtidos

foram expressos em porcentagem da área marcada em cada imagem.

Análise Estatística

Após obter a média de cada porção do nervo de cada animal, realizou-

se a média das porções por grupo e também a média entre as porções de cada

grupo. Analisaram-se as lâminas histológicas coradas pelo HE por meio de

análise descritiva. Para as lâminas coradas pelo Luxol Fast Blue, Picrosirius Red

e DAB-peroxidase (S-100, NF e FGF-2) comparou-se o CP, CR, CD e o valor

médio entre os grupos por meio do teste de Mann-Whitney. O nível se

significância adotado foi de 5% (p<0,05), utilizando o software IBM SPSS Statistic

versão 15.0.

RESULTADOS

Houve formação do CR, ligando o CP ao CD em todos os nervos

lesionados, tanto no GC quanto no GL. Além disso, macroscopicamente,

observou-se nas amostras de ambos os grupos, ausência ou discreta proliferação

de tecido fibroso e de áreas de aderência ao redor da câmara de silicone e nas

regiões adjacentes aos feixes vasculonervosos (Figura 1).

75

FIGURA 1 – Macroscopia do nervo isquiático de rato

submetido à neurotmese seguido de

tubulização com câmara de silicone e

tratamento com laser de baixa intensidade

(830 nm), apresentando completa formação

do CR e ausência de fibrose ao redor do

tubo. CP (coto proximal), CR (cabo de

regeneração) e CD (coto distal)

Observou-se, microscopicamente, proliferação axonal no CR e no CD

em todos os animais dos dois grupos experimentais. Porém, o GL apresentou

axônios maiores e com maior proliferação axonal em todas as amostras quando

comparado com o GC (Figura 2).

A proliferação axonal no GC foi mais intensa em 50% das amostras,

seguido do escore discreto em 33,3 % e de 16,7 % como escore moderado. No

GL foi intenso em 55,6%, moderado em 38,8% e discreto em 5,6%. Já na

reorganização dos fascículos ocorreu uma equivalência do escore intenso nos

dois grupos, representados por 44,5% e 44,4% respectivamente nos GC e GL.

Observou-se uma predominância de 50% de escore moderado no GL na

reorganização dos fascículos indicando fascículos mais organizados neste grupo

do que no GC. A degeneração Walleriana apresentou predominância do escore

discreto de 61,4% no GC e 55,7% no GL. Constatou-se discreto infiltrado

inflamatório caracterizado pela presença de 5,6% de eosinófilos no GC. Já no GL

não foram encontradas células inflamatórias (Figura 3).

CP CR CD

D

76

FIGURA 2 – Fotomicrografia do nervo periférico de ratos, submetidos à técnica de

tubulização. A: Corte longitudinal do CR do GC com moderada

proliferação axonal (seta amarela) e degeneração Walleriana (cabeça de

seta); B: Corte transversal do CD do GC com moderada proliferação

axonal (seta amarela) e degeneração Walleriana (cabeça de seta) e

presença de hemossiderose (seta azul); C: Corte longitudinal do CR do

GL com intensa proliferação axonal (seta amarela) e discreta

degeneração Walleriana (cabeça de seta); D: Corte transversal do CD do

GL com intensa proliferação axonal (seta amarela) e discreta

degeneração Walleriana (cabeça de seta). HE, 40X.

A coloração das fibras de colágeno pelo Picrosirius Red facilitou a

visualização microscópica do perineuro delimitando os fascículos nervosos

quando estes estavam presentes. Observou-se que o GC apresentou fibras de

colágeno desorganizadas e dispostas aleatoriamente entre os axônios. Já o GL

demonstrou maior organização dos fascículos. As fibras de colágeno mostraram-

se menos alinhadas no GC do que no GL (Figura 4).

A

D

B

C

77

FIGURA 3 - Porcentagem média, nas porções (CP, CR e CD) do nervo

isquiático de ratos Wistar submetidos à neurotmese seguida de

tubulização do GC e GL, de A: proliferação axonal; B:

reorganização dos fascículos; C: degeneração Walleriana; D:

infiltrado inflamatório

FIGURA 4 – Fotomicrografia de nervo isquiático de ratos, submetidos à técnica

de tubulização e tratamento com laser de baixa intensidade

(830nm). A: Corte longitudinal do CR no GC. B: Corte transversal

do CD com intensa quantidade de fibras de colágeno (em

vermelho) sem delimitação de fascículos no GC; C: Corte

longitudinal do CR do GL; D: Corte transversal do CD com

presença de perineuro (seta) no GL. Picrosirius Red, 40X.

Ausente Discreto Moderado Intenso

0

20

40

60

80

100

GC GL

B

0

20

40

60

80

100

GC GL

A

0

20

40

60

80

100

GC GL

C

0

20

40

60

80

100

GC GL

D

B A

D

B

A

C

A

A

D

78

CP CR CD Média

GC 28,87 19,43 24,72 24,34

GL 24,91 19,39 19 21,1

0

5

10

15

20

25

30

Po

rce

nta

gem

de

fib

ras

colá

gen

as

A quantidade de fibras colágenas foi maior no GC do que no GL em todos

os segmentos do nervo isquiático (CP, CR e CD). Não houve diferença

significativa entre os grupos em nenhuma porção (p>0,05) (Figura 5).

FIGURA 5 - Porcentagem de fibras colágenas, marcadas pelo Picrosirius Red, nas

porções de CP, CR e CD no nervo isquiático de ratos submetidos à

neurotmese no GC e GL. p>0,05

A coloração por Luxol Fast Blue demonstrou a presença de mielina em

todas as amostras e em todas as porções dos dois grupos experimentais, porém

com maior intensidade de marcação da mielina no GL (Figura 6).

A maior quantidade de mielina no GL em relação ao GC pôde ser

constatada quando se comparou as médias dos dois grupos. O GL foi 28,8% mais

eficiente na produção de mielina que o GC, porém não houve diferença

significativa entre os grupos (p>0,05) (Figura 7).

79

FIGURA 6 - Fotomicrografia de nervo isquiático de ratos, submetidos à

técnica de tubulização e tratamento com laser de baixa

intensidade (830nm), com diferentes quantidades de

mielina, corada em azul claro. A: Mielina em menor

quantidade no corte longitudinal do CR do GC; B: Mielina

com menor quantidade e espessura no corte transversal

do CD do GC; C: Mielina em maior quantidade no corte

longitudinal do CR do GL; D: Mielina com maior

quantidade e espessura no corte transversal do CD do

GL. Luxol Fast Blue, 40x.

A intensidade de marcação do anticorpo S-100 demonstrou que o GL

apresentou as maiores médias em todas as porções analisadas. Houve diferença

estatística no valor médio entre as porções do nervo isquiático dos ratos entre os

grupos experimentais, com valor de p=0,041. O GL também apresentou maiores

médias de intensidade de marcação para o anticorpo NF em todas as porções e

no valor médio. Com relação à intensidade de marcação do anticorpo FGF-2, esta

foi maior em todas as porções do nervo bem como no valor médio para o GC. No

entanto, não houve diferença significativa entre os dois grupos em nenhuma

D

B A

C

80

porção para os anticorpos NF e FGF-2, com valor de p>0,05 (Tabela 1 e Figura

8).

FIGURA 7 - Porcentagem de mielina, marcada pelo Luxol Fast Blue, nas porções de

CP, CR e CD no nervo isquiático de ratos submetidos à neurotmese no GC

e GL. p>0,05

TABELA 1 – Porcentagem de marcação e desvio padrão para os anticorpos S-100,

NF e FGF-2 nas porções CP, CR e CP e na média entre as porções

no nervo isquiático de ratos submetidos à neurotmese e tubulização

com câmara de silicone no GC e GL

GC: Grupo Controle; GL: Grupo Laser; CP: coto proximal; CR: cabo de regeneração; CD: coto distal. * na mesma coluna indica diferença significativa entre grupos pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05)

CP CR CD Média

GC 15,82 7,05 4,3 9,06

GL 17,45 11,01 9,75 12,73

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Po

rce

nta

gem

de

Mie

lina

CP CR CD Média

S-100

GC 11,37 ± 2,48 10,0 ± 3,17 10,67 ± 1,91 10,68 * ± 1,81

GL 17,84 ± 5,85 11,84 ± 5,95 13,65 ± 3,53 14,44 * ± 3,70

NF

GC 13,06 ± 4,55 8,74 ± 2,27 11,15 ± 3,26 10,98 ± 2,69

GL 14,20 ± 2,65 10,93 ± 4,24 12,25 ± 2,89 12,46 ± 2,00

FGF-2

GC 5,63 ± 3,20 6,11 ± 5,66 5,63 ± 3,20 5,80 ± 2,90

GL 3,83 ± 0,98 5,07 ± 1,22 3,83 ± 0,98 4,24 ± 0,95

81

FIGURA 8 - Imunomarcação para os anticorpos S-100, NF e FGF-2 em nervos

isquiáticos de ratos, submetidos à tubulização. Coloração em marrom

pela diaminobenzidinaperoxidase e suas imagens correspondentes em

preto e branco convertidas pelo software Image J, para análise por

densidade óptica em pixels. A e B: cortes transversais do CD referente

à expressão de S-100 do GC; C e D: cortes transversais do CD

referente à expressão de S-100 do GL; E e F: cortes longitudinais do

CR referente à expressão de NF do GC; G e H: cortes longitudinais do

CR referente à expressão de NF do GL; I e J: cortes transversais do

CD referente à expressão de FGF-2 do GC; K e L: cortes transversais

do CD referente à expressão de FGF-2 do GL. Imunoistoquímica, 20X

DISCUSSÃO

A técnica cirúrgica adotada neste experimento foi eficaz para promover

o crescimento do cabo de regeneração unindo os cotos nervosos separados 5

mm. Outros experimentos também obtiveram resposta positiva com tubulização

com distância entre cotos variando de 5 mm até 15 mm em roedores

(MOHAMMADI et al., 2012; LICHTENFELS et al., 2013; MOHAMMADI &

MAHMOODI, 2013; SHEN et al., 2013). Além disso, o presente estudo

HGF

A CB

LKJ

E F G H

I

D

82

demonstrou a tendência de associar técnicas já consagradas, como a tubulização,

com outras terapias, como a aplicação do laser de baixa intensidade na

regeneração de nervos periféricos, conforme ROCHKIND et al. (2007), SHEN et

al. (2011) e SHEN et al. (2013).

A aplicação imediata do laser de baixa intensidade após o

procedimento cirúrgico, adotada por este experimento, está de acordo com

ALCANTARA et al. (2013). Estes autores comprovaram que o laser aplicado

imediatamente após a lesão de nervo periférico, na fase aguda, é capaz de

modular a inflamação, aumentando a atividade de matriz de metaloproteinase-9 e

de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) que auxiliam o crescimento axonal.

A ausência de infiltrado inflamatório no GL demonstrou que a aplicação

do laser foi benéfica estando de acordo com outros autores que comprovaram

que o laser de baixa intensidade é um potente agente antinflamatório (BJORDAL

et al., 2006; PAIVA CARVALHO et al., 2013). BJORDAL et al. (2006) observaram

que este recurso terapêutico reduz os níveis de mediadores inflamatórios como

PGE2, COX-2 e IL-1β o influxo de células neutrofílicas e o estresse oxidativo de

forma dose-dependente, com variação de 0,3-19 J/cm².

O comprimento de onda de 830 nm e a densidade de energia de 4,13

J/cm² utilizados estão de acordo com as recomendações de GIGO-BENATO et al.

(2005) e HUANG et al. (2011). Estes autores afirmaram que efeitos positivos em

nervos periféricos são observados quando se utiliza comprimento de onda menor

que 904 nm e densidade de energia menor que 10 e maior que 150 J/cm². A

metodologia está também em concordância com HUANG et al. (2011) que ao

comparar os efeitos do laser a 810 nm, em cultura de neurônios de ratos, com

diferentes densidades de energia, de 0,03, 0,3, 3, 10 e 30 J/cm², concluíram que

houve maior produção de ATP com 3 J/cm².

A baixa densidade de energia do laser utilizada, associada com

intervalo de tratamento sem aplicação do laser, teve como objetivo evitar um

excesso de radiação acumulada, favorecendo a proliferação celular e evitando

apoptose. Este procedimento está de acordo com o relatado por HUANG et al.

(2011) que demonstraram que a resposta à dose bifásica do laser com baixa

densidade de energia induz a diminuição de radicais livres dentro da célula, em

particular da fração espécie reativa de oxigênio. Isso aumenta a permeabilidade

83

da membrana da mitocôndria e favorece uma maior produção de ATP, estando

relacionado com a proliferação e sobrevivência das células. Mas, de acordo com

estes mesmos autores, à medida que se aumenta a densidade de energia do

laser, aumenta-se também o pico de espécie reativa de oxigênio, o que diminui a

produção do ATP, por lesionar a membrana mitocondrial e, consequentemente,

iniciar a apoptose celular.

O tratamento com laser de baixa intensidade promoveu maior

proliferação de células de Schwann, comprovado pela maior expressão de

proteína S-100 encontrada nos nervos do GL, estando de acordo com estudo in

vitro realizado por YAZDANI et al. (2012). A característica demonstrada pelo laser

de baixa intensidade de promover o aumento da produção das células de

Schwann em longo prazo favoreceu a proliferação axonal similarmente relatado

por GONÇALVES et al. (2010), TAKHTFOOLADI et al. (2012) e SHEN et al.

(2013).

A maior quantidade de mielina encontrada no GL, evidenciada pela

coloração pelo Luxol Fast Blue, justifica-se pela maior quantidade de células de

Schwann produzidas neste grupo. Da mesma forma, a menor quantidade do fator

neurotrófico FGF-2 observado no GL favoreceu a maior mielinização encontrada

neste grupo em relação ao GC que apresentou efeito inverso, caracterizado por

maior expressão de FGF-2 e menor mielinização. Estes dados confirmam os

achados de JUNGNICKEL et al. (2010) que encontraram 125% a mais de mielina

nos axônios de ratos com deficiência de FGF-2 do que em ratos com níveis

normais de FGF-2, após duas semanas de axonotmese.

A maior proliferação axonal observada no GL em relação ao GC

explica a maior mielinização daquele grupo. Estes dados concordam com os de

GROTHE et al. (2000) que afirmaram que à medida que as células de Schwann

entram em contato com o axônio em crescimento, cessa-se a ativação da

produção de fatores de crescimento, como o FGF-2, favorecendo a produção de

mielina pelas células de Schwann. O processo de mielogênese neuronal parece

envolver a interação da membrana plasmática do axônio e da célula de Schwann.

Os axônios fornecem o sinal que aumenta a expressão de enzimas responsáveis

pela síntese de mielina (PODUSLO et al., 1985).

84

A maior quantidade de neurofilamento (NF) observada no GL em

relação ao GC proporcionou maior sustentação dos axônios no axoplasma, bem

como aumentou o diâmetro destes. SHEN et al. (2011) também obtiveram maior

expressão de NF no grupo tratado com laser de baixa intensidade, porém com

irradiação apenas no local da lesão do nervo isquiático, demonstrando que a

produção de NF ocorre por estímulo local.

A aplicação do laser de baixa intensidade no GL determinou uma

menor quantidade de fibras colágenas e uma proliferação axonal discretamente

maior em relação ao GC, justificando a menor quantidade de tecido cicatricial ao

longo do cabo de regeneração, facilitando o crescimento dos axônios em direção

ao órgão-alvo. Esta constatação reafirma os postulados de ROCHKIND (2001).

A maior organização fascicular do GL demonstrou que este grupo

estava numa fase mais avançada do processo de regeneração. Isto permitiu que

as fibras de colágeno se tornassem mais organizadas, formando perineuro, o que

contribuiu para a proliferação axonal e, consequentemente, para o processo de

mielinização dos axônios.

Embora não tenham sido encontradas diferenças estatísticas entre os

grupos na maioria das variáveis, não se pode desconsiderar que houve melhor

desempenho nos nervos tratados com a radiação laser quando se compararam os

valores médios dos dois grupos experimentais estudados. Somado a isso, um

estudo funcional da marcha, para se avaliar a real recuperação motora dos

animais se faz necessário para a complementação do estudo.

CONCLUSÃO

O tratamento com laser de baixa intensidade a 830 nm em nervo

isquiático de ratos após lesão do tipo neurotmese e tubulização com câmara de

silicone aumentou a proliferação de células de Schwann, demonstrando que a

melhor reorganização dos fascículos e a maior produção de neurofilamento e de

mielina contribuíram positivamente para a regeneração dos nervos periféricos.

85

REFERÊNCIAS

1. ALCANTARA, C. C.; GIGO-BENATO, D.; SALVINI, T. F.; OLIVEIRA, A. L. R.; ANDERS, J. J.; RUSSO, T. L. Effect of low-level laser therapy (LLLT) on acute neural recovery and inflammation-related gene expression after crush injury in rat sciatic nerve. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 45, p. 246–

252, 2013.

2. ANDERS, J. J.; GEUMA, S.; ROCHKIND, S. Phototherapy promotes regeneration and functional recovery of injured peripheral nerve. Neurological Research, Chicago, v. 26, p. 233-239, 2004.

3. BJORDAL, J. M.; JOHNSON, M. I.;IVERSEN, V.; AIMBIRE, F.; LOPES-

MARTINS, R. A. B. Low-level laser therapy in acute pain: a systematic review of possible mechanisms of action and clinical effects in randomized placebo-controlled trials. Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v. 24, n. 2,

p. 158-168, 2006.

4. CHEN, C. H.; HUNG, H. S.; HSU, S. Low energy laser irradiation increases endothelial cell proliferation, migration, and eNOS gene expression possibly via PI3K signal pathway. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 40, p. 46-54, 2008.

5. GIGO-BENATO, D.; GEUNA, S.; RODRIGUES, A. C.; TOS, P.; FORNARO,

M.; BOUX, E.; BATTISTON, B.; GIACOBINI-ROBECCHI, M. G. Low-power laser biostimulation enhances nerve repair after end-to-side neurorrhaphy: a double-blind randomized study in the rat median nerve model. Lasers in Medical Science, London, v. 19, n. 1, p. 57-65, 2004.

6. GIGO-BENATO, D.; GEUNA, S.; ROCHKIND, S. Phototherapy for enhancing

peripheral nerve repair: a review of the literature. Muscle Nerve, Malden, v. 31, n. 6, p. 694-701, 2005.

7. GONÇALVES, R. B.; MARQUES, J. C.; MONTE-RASO, V. V.; ZAMARIOLI,

A.; CARVALHO, L. C.; FAZAN, V. P. S.; TAVARES, M. R. Efeitos da aplicação do laser de baixa potência na regeneração do nervo isquiático de ratos. Fisioterapia e Pesquisa, São Paulo, v. 17, n. 1, p. 34-39, 2010.

8. GROTHE, C.; HEESE, K.; MEISINGER, C.; WEWETZER, K.; KUNZ, D.;

CATTINI, P.; OTTEN, U. Expression of interleukin-6 and its receptor in the sciatic nerve and cultured Schwann cells: relation to 18-kD fibroblast growth factor-2. Brain Research, Amsterdam, v. 885, p. 172-181, 2000.

9. HAASTERT-TALINI, K.; SCHMITTE, R.; KORTE, N.; KLODE, D.; RATZKA,

A.; GROTHE, C. Electrical Stimulation Accelerates Axonal and Functional Peripheral Nerve Regeneration across Long Gaps. Journal of Neurotrauma,

New York, v. 28, n. 4, p. 661-674, 2011.

86

10. HOU, J.; ZHANG, H.; YUAN, X.; LI, J.; WEI, Y.; HU, S. In vitro effects of low level laser irradiation for bone marrow mesenchymal stem cells: proliferation, growth factors secretion and myogenic differentiation. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 40, p. 726–733, 2008.

11. HUANG, Y.; SHARMA, S. K.; CARROLL, J.; HAMBLIN, M. R. Biphasic dose response in Low Level Light Therapy: an update. Dose-Response,

Massachusetts, v. 9, p. 602-618, 2011.

12. JUNGNICKEL, J.; HAASTERT, K.; GRZYBEK, M.; THAU, N.; LIPOKATIC-TAKACS, E.; RATZKA, A.; NÖLLE, A.; CLAUS, P.; GROTHE, C. Mice lacking basic fibroblast growth factor showed fast sensory recovery. Experimental Neurology, San Diego, v. 223, p. 166-172, 2010.

13. KARU, T. I.; PYATIBRAT, L. V.; AFANASYEVA, N. I. Cellular effects of low

power laser therapy can be mediated by nitric oxide. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 36, p. 307-314, 2005.

14. LICHTENFELS, M.; COLOMÉ, L.; SEBBEN, A. D.; BRAGA-SILVA, J. Effect of

platelet rich plasma and platelet rich fibrin on sciatic nerve regeneration in a rat model. Microsurgery, New York, v. 33, n. 5, p. 383-390, 2013.

15. LU, M.; HO, C.; HSU, S.; LEE, H.; LIN, J.; YAO, C.; CHEN, Y. Effects of

electrical stimulation at different frequencies on regeneration of transected peripheral nerve. Neurorehabilitation and Neural Repair, Thousand Oaks, v.

22, n. 4, p. 367-373, 2008. 16. MOHAMMADI, R.; AMINI, K.; CHAREHSAZ, S. Homeopathic treatment for

peripheral nerve regeneration: an experimental study in a rat sciatic nerve transection model. Homeopathy, London, v. 101, p. 141-146, 2012.

17. MOHAMMADI, R.; MAHMOODI, H. Improvement of peripheral nerve regeneration following nerve repair by silicone tube filled with curcumin: A preliminary study in the rat model. International Journal of Surgery,

Bridgetown, v. 11, n. 9, p. 819-825, 2013.

18. MONTE-RASO, V. V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N.; FAZAN, V. P. S. Os efeitos do ultra-som terapêutico nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: análise funcional da marcha. Revista Brasileira de Fisioterapia, São Carlos, v. 10, n. 1, p. 113-119, 2006.

19. MORAES, J. M. Células-tronco da medula óssea e do tecido adiposo na regeneração do nervo ulnar em equinos. 2012. 108f. Tese (Doutorado em

Ciência Animal) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia.

87

20. PAIVA CARVALHO, R. L.; LEAL-JUNIOR, E. C.; PETRELLIS, M. C.; MARCOS, R. L.; CARVALHO, M. H.; DE NUCCI, G.; LOPES-MARTINS, R. A. Effects of low-level laser therapy (LLLT) and diclofenac (topical and intramuscular) as single and combined therapy in experimental model of controlled muscle strain in rats. PhotochemIstry and Photobiology, Oxford,

v. 89, n. 2, p. 508-512, 2013.

21. PARK, S. C.; OH, S. H.; SEO, T. B.; NAMGUNG, U.; KIM, J. M.; LEE, J. H. Ultrasound-stimulated peripheral nerve regeneration within asymmetrically porous PLGA/Pluronic F127 nerve guide conduit. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, Hoboken, v. 94B, n. 02,

p. 359-366, 2011.

22. PODUSLO, J. F.; BERG, C. T.; ROSS, S. M.; SPENCER, P. S. Regulation of myelination: axons not required for byosinthesis of basal levels of the major myelin glycoprotein by Schwann cells in denervated distal segments of the adult cat sciatic nerve. Journal of Neuroscience Research, New York, v. 14,

p. 177-185, 1985. 23. REIS, F. A.; BELCHIOR, A. C. G.; CARVALHO, P. T. C.; SILVA, B. A. K.;

PEREIRA, D. M.; SILVA, I. S.; NICOLAU, R. A. Effect of laser therapy (660 nm) on recovery of the sciatic nerve in rats after injury through neurotmesis followed by epineural anastomosis. Lasers in Medical Science,

London, v. 24, n. 5, p. 741-747, 2009.

24. RICCI, R.; PAZOS, M.; BORGES, R. E.; PACHECO-SOARES, C. Biomodulation with low-level laser radiation induces changes in endothelial cell actin filaments and cytoskeletal organization. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Lausanne, v. 95, p. 6-8, 2009.

25. ROCHKIND, S.; LEIDER-TREJO, L.; NISSAN, M.; SHAMIR, M. H.;

KHARENKO, O.; ALON, M. Efficacy of 780-nm laser phototherapy on peripheral nerve regeneration after neurotube reconstruction procedure (double-blind randomized study). Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v. 25, n. 3, p. 137-143, 2007.

26. ROCHKIND, S.; NISSAN, M.; ALON, M.; SHAMIR, M.; SALAME, K. Effects of

laser irradiation on the spinal cord for the regeneration of crushed peripheral nerve in rats. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v. 28, n. 3, p.

216-219, 2001.

27. SEDDON, H. J. A classification of nerve injuries. British Medical Journal, London, v. 2, n. 4260, p. 237-239, 1942.

28. SHEN, C.; YANG, Y.; LIU, B. Effects of large-area irradiated laser

phototherapy on peripheral nerve regeneration across a large gap in a biomaterial conduit. Journal of Biomedical Materials Research Part A,

Hoboken, v. 101A, n. 1, p. 239-252, 2013.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Paiva%20Carvalho%20RL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leal-Junior%20EC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petrellis%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marcos%20RL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Carvalho%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Nucci%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lopes-Martins%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22989160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22989160






88

29. SHEN, C.; YANG, Y.; LIU, B. Large-area irradiated low-level laser effect in a biodegradable nerve guide conduit on neural regeneration of peripheral nerve injury in rats. Injury, Bristol, v. 42, n. 8, p. 803-813, 2011.

30. SOUSA, F. F. A.; RIBEIRO, T. L.; FAZAN, V. P. S.; BARBIERI, C. H. Lack of

effectiveness of laser therapy applied to the nerve course and the correspondent medullary roots. Acta Ortopedica Brasileira, São Paulo, v. 21,

n. 2, p. 92-97, 2013.

31. TAKHTFOOLADI, M. A.; SHARIFI, D.; HAGHDOST, I. S.; ABEDI, G. Effects of laser therapy (680 nm) on recovery of the sciatic nerve in rabbits. Advances in Environmental Biology, Amman, v. 6, n. 12, p. 4057-4061, 2012.

32. TEODORI, R. M.; SILVA, A. M.; SILVA, M. T.; OLIVEIRA, L. S.; POLACOW, M. L. O.; GUIRRO, E. C. O. High-voltage electrical stimulation improves nerve regeneration after sciatic crush injury. Revista Brasileira de Fisioterapia, São Carlos, v. 15, n. 4, p. 325-31, 2011.

33. YAZDANI, S. O.; GOLESTANEH, A. F.; SHAFIEE, A.; HAfiZI, M.; OMRANI, H. G.; SOLEIMANI, M. Effects of low level therapy on proliferation and neurotrophic factor gene expression of human Schwann cells in vitro. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Lausanne, v. 107, p. 9-13, 2012.

34. YEGIYANTS, S.; DAYICIOGLU, D.; KARDASHIAN, G.; PANTHAKI, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: a wartime review. Journal of Craniofacial Surgery, Boston, v. 21, n. 4, p. 998-1001, 2010.

89

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS

A capacidade de regeneração dos nervos periféricos após lesão já é

conhecida há mais de um século, mas até nos dias atuais é frustrante a perda

funcional e as limitações que alguns casos apresentam. Isto tem estimulado a

comunidade científica a desenvolver várias pesquisas com diferentes métodos e

procedimentos, a fim de se obter a melhora funcional motora do paciente.

A utilização do laser terapêutico nos seus mais variados matizes de

comprimento de onda em neuropatias periféricas deve ser incentivada na rotina

clínica veterinária, que carece de protocolos específicos para as diversas

espécies animais.

A busca incessante do melhor método de utilização do laser

combinando parâmetros como comprimento de onda, densidade de energia,

potência de saída de energia, número total de sessões, intervalos entre as

sessões e energia total depositada no tecido têm demonstrado que esta

irradiação provoca diferentes resultados nos tecidos biológicos. Assim, necessita-

se padronizar a escolha destes parâmetros no tecido nervoso periférico

almejando respostas cada vez mais satisfatórias com a aplicação desta terapia e

acelerando a recuperação neurológica.

Este recurso fisioterapêutico, além de diminuir o tempo de regeneração

dos nervos periféricos, reduz as complicações inerentes a procedimentos

cirúrgicos de reparação nervosa, culminando com retorno precoce do paciente às

suas funções da vida diária, favorecendo seu bem-estar.

Os avanços apresentados nos últimos anos em relação à utilização de

materiais biocompatíveis tem revolucionado o campo das pesquisas científicas,

permitindo resultados cada dia mais alvissareiros. A busca de novos materiais,

sintéticos ou biológicos, a serem utilizados para a ligação entre os cotos nervosos

é um dos maiores desafios da atualidade no campo das cirurgias reconstrutivas.

Outra ferramenta disponível para a avaliação dos resultados das

neuropatias periféricas é a introdução dos conceitos de biomecânica que dispõe

de inúmeros métodos de aferição da marcha dos animais tais como Índice

Funcional do Ciático (IFC) e o Ângulo do Tarso (AT). Neste experimento foi

possível avaliar a eficiência individual destes dois métodos, apontando os

90

aspectos positivos e negativos de cada um. Pôde-se também desenvolver um

software específico denominado de “I C_RA O ” para a mensuração do IFC dos

ratos, em colaboração como o Laboratório de Bioengenharia e Biomecânica da

Faculdade de Educação Física da UFG (FEF/UFG). Também se desenvolveu

neste laboratório o modelo biomecânico para tarso de ratos para se utilizar no

software Visual 3D®.

A avaliação funcional dos nervos isquiáticos deste estudo não

comprovou o melhor desempenho do grupo laser demonstrada pela avaliação

morfológica. As contraturas musculares desenvolvidas de forma mais intensa no

grupo laser puderam ser atribuídas a duas hipóteses: reconexão dos axônios à

musculatura antagonista ou presença intensa de tecido conjuntivo entre as fibras

musculares esqueléticas que pode ter ocorrido pelo efeito do laser neste tecido.

Sugere-se realizar avaliação muscular para detectar o real fator indutor

das contraturas musculares. Acrescenta-se, ainda, a necessidade de realizar

exames eletroneuromiográficos para avaliar a condutividade elétrica do nervo.

Para prevenir alterações musculares neste tipo de estudo recomenda-se a

associação de outras técnicas como eletroestimulação neuromuscular,

alongamentos e exercícios como natação ou esteira.

As etapas experimentais conduzidas neste estudo proporcionaram

conhecimento adicional da utilização do laser de baixa intensidade como

elemento coadjuvante da regeneração dos nervos periféricos submetidos à

tubulização em câmara flexível de silicone.

Portanto, fica a sugestão, ao final deste trabalho, para a continuidade

das pesquisas direcionadas ao emprego do laser terapêutico em lesões dos

nervos isquiáticos e o uso de conhecimentos de biomecânica e bioengenharia

como métodos para a aferição dos resultados dos procedimentos de regeneração

nervosa periférica associada ao laser de baixa intensidade.

91

ANEXOS

92

ANEXO 1

LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAÇÃO DE NERVO ... · pelo conhecimento. Em especial,...

Documents

Transcript of LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA REGENERAÇÃO DE NERVO ... · pelo conhecimento. Em especial,...