KAMILA CABRAL MIELKE REMEDIAÇÃO DE SOLOS...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL

KAMILA CABRAL MIELKE

REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM SULFENTRAZONE EM FUNÇÃO DA SIMBIOSE

ENTRE Bradyrhizobium sp. E Canavalia ensiformis

São Mateus – ES

Julho de 2019

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL

REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM SULFENTRAZONE EM FUNÇÃO DA SIMBIOSE

ENTRE Bradyrhizobium sp. E Canavalia ensiformis

KAMILA CABRAL MIELKE

Dissertação apresentada a Universidade Federal do Espírito Santo, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical, para obtenção do título de mestre em Agricultura Tropical.

Orientador: Prof. Dr. Fábio Ribeiro Pires

São Mateus – ES

Julho de 2019

Ficha catalográfica disponibilizada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBI/UFES e elaborada pelo autor

C117r

Cabral Mielke, Kamila, 1993- Remediação de solos contaminados com sulfentrazone em

função da simbiose entre Bradyrhizobium sp. e Canavalia ensiformis / Kamila Cabral Mielke. - 2019.

45 f. : il.

Orientador: Fábio Ribeiro Pires. Coorientadores: Aloísio José Bueno Cotta, João Carlos

Madalão. Dissertação (Mestrado em Agricultura Tropical) -

Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo.

1. Fitorremediaçao. 2. Biorremediação. I. Ribeiro Pires, Fábio. II. Bueno Cotta, Aloísio José. III. Carlos Madalão, João. IV. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro Universitário Norte do Espírito Santo. V. Título.

CDU: 63

ii

Aos meus pais José Antônio Mielke e Lucy Moreira Cabral Mielke, meus irmãos

Cacio Cabral Mielke e Karina Cabral Mielke pelo apoio e companheirismo.

Dedico

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus pai o criador.

À universidade Federal do Espírito Santo (UFES), por intermédio do Programa

de Pós-Graduação em Agricultura Tropical, pela oportunidade concedida.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão da bolsa de mestrado.

Ao professor Fábio Ribeiro Pires pela orientação, confiança e amizade.

Aos meus coorientadores João Carlos Madalão e Aloísio José Bueno Cotta

pelos ensinamentos, orientações e sugestões.

Aos meus pais, José Antônio e Lucy M., pela vida, incentivo,

companheirismo e amor incondicional.

Aos meus irmãos Cacio Mielke e Karina Mielke, pela amizade, carinho e

amor.

Ao meu namorado, Ricardo Araújo, pelo apoio incondicional e incentivo

diário que foram de grande importância.

Aos graduandos do grupo de Pesquisa em Fitotecnologia, em especial a

Rafaela Bertuani, pela amizade, parceria disponibilidade e apoio. Aos técnicos dos

Laboratórios pela disponibilidade e ajuda nos trabalhos

Às demais pessoas que, de alguma forma, contribuíram para o êxito deste

trabalho.

iv

BIOGRAFIA

Kamila Cabral Mielke, filha de José Antônio Mielke e Lucy Moreira Cabral

Mielke, nasceu no dia 02 de fevereiro de 1993, na cidade de Jarú, Rondônia.

Em agosto de 2011, ingressou no curso de Engenharia Agronômica do

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Rondônia, Campus Colorado

do Oeste.

Em agosto de 2017, iniciou Mestrado em Agricultura tropical pela

Universidade Federal do Espírito Santo, Campus São Mateus. Submeteu-se a

defesa em julho de 2019.

v

SUMÁRIO

REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM SULFENTRAZONE EM FUNÇÃO DA SIMBIOSE ENTRE Bradyrhizobium sp. E Canavalia ensiformis ....... 1

RESUMO ....................................................................................................................... 1

ABSTRACT ................................................................................................................... 2

1. Introdução ........................................................................................................... 3

2. Material e Métodos ............................................................................................. 4

2.1. Detalhes experimentais ........................................................................................ 4

2.2. Tratamentos, delineamento experimental e procedimentos ................................. 5

2.3. Quantificação de resíduos de sulfentrazone no solo por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ........................................................................................... 6

2.3.1. Preparo de uma amostra de solo dopada com Boral 500® SC na concentração de 0,29mg kg-1 ..................................................................................................... 7

2.4. Avaliação microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis ............................................................................................................. 7

2.5. Bioensaio ............................................................................................................. 8

2.6. Avaliações e amostragens na espécie fitorremediadora ...................................... 8

2.7. Análise estatística ................................................................................................ 8

3. Resultados .......................................................................................................... 9

3.1. Performance do método de quantificação de resíduos de sulfentrazone no solo 9

3.2. Avaliação das concentrações residuais de sulfentrazone no solo após cultivo de feijão-de-porco com e sem inoculante ................................................................ 10

3.3. Atividade microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis ........................................................................................................... 12

3.4. Bioensaio ........................................................................................................... 15

3.5. Produção de fitomassa de Canavalia ensiformis................................................ 17

4. Discussão ......................................................................................................... 19

vi

4.1. Avaliação das concentrações residuais de sulfentrazone no solo após cultivo de feijão-de-porco com e sem inoculante ................................................................ 19

4.2. Atividade microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis ........................................................................................................... 20

4.3. Bioensaio ........................................................................................................... 23

4.4. Produção de fitomassa de Canavalia ensiformis................................................ 24

5. Conclusões ....................................................................................................... 26

Referências................................................................................................................. 27

ANEXOS ...................................................................................................................... 33

1

REMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM SULFENTRAZONE EM FUNÇÃO DA SIMBIOSE ENTRE Bradyrhizobium sp. E Canavalia

ensiformis

“Preparado de acordo com as normas do Periódico Agriculture, Ecosystems & Environment”

RESUMO MIELKE, Kamila Cabral; M.Sc.; Universidade Federal do Espírito Santo; Julho de 2019;

Remediação de solos contaminados com sulfentrazone em função da simbiose entre

Bradyrhizobium sp. e Canavalia ensiformis; Orientador: Fábio Ribeiro Pires. Coorientadores:

João Carlos Madalão e Aloísio José Bueno Cotta.

A simbiose entre plantas fitorremediadoras e microrganismos com atividade enzimática

metabolizadora de herbicidas pode ser uma alternativa eficiente para remediação de solos

contaminados com sulfentrazone. Este trabalho objetivou avaliar a eficiência da biorremediação

de solos contaminados com sulfentrazone por meio da simbiose entre bactéria (Bradyrhizobium

sp.) e a leguminosa (Canavalia ensiformis). O experimento foi conduzido, entre 03/2018 e

05/2018, em casa-de-vegetação da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), testando-se

quatro doses de sulfentrazone (0, 400, 800 e 1200 g ha-1 i.a.) na presença ou ausência da

inoculação com Bradyrhizobium sp. BR2003 (SEMIA 6156). Após 80 dias de cultivo, as plantas

foram cortadas, o solo foi coletado para análise cromatográfica e para o bioensaio com milheto.

A concentração de sulfentrazone, nas doses de 400 e 800 g ha-1, foi significativamente reduzida

com a inoculação da planta com Bradyrhizobium sp., sendo, em média 30,7 %, e 23,3% menor

do que sem inoculação, respectivamente. A simbiose promoveu redução de até 75% do

herbicida residual no solo. A inoculação com diazotrófico simbiótico potencializou a microbiota

do solo e consequentemente aumentou a eficiência da biorremediação. Sob efeito da dose de

1200 g ha-1 a descontaminação não foi satisfatória. Os resultados deste trabalho encorajam a

continuidade dos estudos sobre a interação positiva entre microrganismos simbióticos e espécies

leguminosas visando à fitorremediação do herbicida sulfentrazone.

Palavras-chave: leguminosas, microrganismos simbióticos, rizodegradação

2

ABSTRACT MIELKE, Kamila Cabral; M.Sc.; Federal University of Espírito Santo; July 2019; Remediation

of soils contaminated with sulfentrazone according to the symbiosis between

Bradyrhizobium sp. and Canavalia ensiformis; Advisor: Fábio Ribeiro Pires. Co-advisors:

João Carlos Madalão e Aloísio José Bueno Cotta.

The symbiosis between phytoremediation plants and microorganisms with herbicide

metabolizing enzymatic activity may be an efficient alternative for the remediation of soils

contaminated with sulfentrazone. The objective of this study was to evaluate the efficiency of

bioremediation of sulfentrazone contaminated soils by means of symbiosis between bacteria

(Bradyrhizobium sp.) and legume (Canavalia ensiformis). The experiment was conducted

between 03/2018 and 05/2018 in a greenhouse at the Federal University of Espírito Santo

(UFES), testing four doses of sulfentrazone (0, 400, 800 and 1200 g ha-1 i.a.) in the presence or

absence of the inoculation with Bradyrhizobium sp. BR2003 (SEMIA 6156). After 80 days of

cultivation, the plants were cut, the soil was collected for chromatographic analysis and for the

bioassay with millet. The concentration of sulfentrazone, at 400 and 800 g ha-1, was

significantly reduced with the inoculation of the plant with Bradyrhizobium sp., averaging 30,7

and 23,3% lower than without inoculation, respectively. The symbiosis promoted reduction of

up to 75% of the residual herbicide in the soil. The inoculation with symbiotic diazotrophic

potentiated the soil microbiota and consequently increased the efficiency of bioremediation.

Under the 1200 g ha-1 dose the decontamination was not satisfactory. The results of this work

encourage the continuity of the studies on the positive interaction between symbiotic

microorganisms and leguminous species aiming at the phytoremediation of the herbicide

sulfentrazone.

Keywords: legumes, symbiotic microorganisms, rhizodegradation

3

1. Introdução

Os produtos fitossanitários são amplamente utilizados nas atividades agrícolas atuais,

possibilitando o cultivo de extensas áreas. O Brasil comercializou 540 mil toneladas de

ingredientes ativos em 2017 (IBAMA, 2017a), dos quais os herbicidas representam 58%

(IBAMA, 2017b). O controle químico de plantas daminhas destaca-se como técnica

imprescindível no sistema agrícola intensivo, dada eficiência, praticidade e rapidez do

controle.

Alguns herbicidas apresentam elevada persistência no ambiente, o que implica no

efeito residual do composto no solo, impedindo o desenvolvimento de certas plantas

daninhas durante determinado período (Dan et al., 2010). Entretanto, herbicidas com

bioatividade prolongada tornam-se indesejáveis, provocando intoxicações em plantas

sensíveis, cultivadas em sucessão ou rotação de culturas (Oliveira et al., 2014). Tais

compostos podem afetar a atividade microbiana (Imfeld e Vuilleumier, 2012) e contaminar

águas subterrâneas e nascentes (Santos et al., 2015). O sulfentrazone (N - [2,4-dicloro-5- [4-

(difluorometil)- 4,5- dihidro-3 metil -5-oxo- 1H - 1,2,4-triazol -1- il] metanosulfonamida) é

um herbicida pré-emergente, pertencente ao grupo das aril triazolinonas, que apresenta

atividade residual prolongada entre 6 e 24 meses, dependendo do tipo de solo e condições

ambientais (Martinez et al., 2008; Monqueiro et al., 2010).

Estudos para o desenvolvimento de técnicas de remediação/mitigação dos danos

causados pela presença de herbicidas no solo têm sido intensificados (Santos et al., 2018;

Melo et al., 2019; Souza et al., 2017). Uma promissora técnica de descontaminação que utiliza

recursos naturais para recuperar um ambiente contaminado e tóxico a uma condição segura é

a biorremediação (Kang, 2014). O uso de plantas na remediação é chamado fitorremediação,

baseada na ação combinada de plantas e comunidades microbianas associadas para degradar,

remover, transformar ou imobilizar compostos tóxicos (Truu et al., 2015).

No Brasil, diversas espécies foram testadas na fitorremediação de herbicidas, dentre

elas, a Canavalia ensiformis se destacou como eficiente fitorremediadora dos solos

contaminados com sulfentrazone (Belo et al., 2016; Ferraço et al., 2017; Madalão et al.,

2017b; Melo et al., 2019). A degradação da sulfentrazone é fortemente influenciada pela

atividade microbiana do solo (Martinez et al., 2010; Melo et al., 2017a) sendo esta

considerada sua principal forma de dissipação (Madalão et al., 2017a). Isso indica que a

fitorremediação associada ao enriquecimento microbiano são técnicas promissoras para a

biorremediação de solos contaminados (Melo et al., 2017b). Contudo, ainda são poucos os

4

estudos sobre os efeitos obtidos com a utilização de microrganismos diazotróficos

simbióticos, disponibilizados como inoculante comercial, na biorremediação de áreas

contaminadas com sulfentrazone. Além da capacidade degradadora de alguns

microrganismos, as bactérias diazotróficas são classificadas como fixadores de nitrogênio,

convertendo o N2 atmosférico em NH3, que é protonado a NH4+ e assimilado pelas plantas

(Mus et al., 2016).

As bactérias diazotróficas colonizam o sistema radicular alterando os padrões de

enraizamento, o fornecimento de nutrientes e, consequentemente, o crescimento das plantas

(Ahemad e Kibret, 2014). Espécies de bactérias com potencial na degradação de sulfentrazone

foram isoladas de solos contaminados, destacando-se, estirpes de Rhizobium radiobacter

(Martinez et al., 2010, 2008). Em um dos trabalhos com herbicidas, a bactéria endossimbionte

Rhizobium sp. em simbiose com Phaseolus vulgaris L. foi capaz de reduzir a concentração de

atrazina no solo, possivelmente pela degradação da molécula (Madariaga-Navarrete et al.,

2017).

Pesquisas já demonstram o potencial de diferentes microrganismos na degradação de

herbicidas, o que viabiliza seu uso na biorremediação de solos contaminados (Martinez et al.,

2010, 2008; Melo et al., 2017a; Souza et al., 2017). Dessa forma, o estudo de microrganismos

com habilidade ou atividade enzimática metabolizadora dos herbicidas são indispensáveis

para estabelecer a associação com a fitorremediação. A partir desses resultados, pode-se

acelerar o processo de descontaminação do solo, permitindo o cultivo de culturas sensíveis em

sucessão, ao mesmo tempo que se ameniza a contaminação do solo e da água. Assim sendo, a

hipótese subjacente foi que a inoculação com diazotrófico simbiótico potencializa a

microbiota do solo e, consequentemente, aumenta a eficiência da biorremediação de solos

contaminados com doses elevadas de sulfentrazone. Objetivou-se avaliar a eficiência da

biorremediação de solos contaminados com sulfentrazone por meio da simbiose entre bactéria

(Bradyrhizobium sp.) e a leguminosa (Canavalia ensiformis).

2. Material e Métodos

2.1. Detalhes experimentais

O experimento foi conduzido, entre 03/2018 e 05/2018, em casa-de-vegetação

localizada na Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), em São Mateus-ES, (18º 43” S;

30º 51” O). A amostra de solo foi classificada como Argissolo amarelo distrófico de textura

média (EMBRAPA, 2018) característico da região, coletada na Fazenda Experimental

localizada no CEUNES/UFES, em área sem histórico de aplicação de herbicidas, na

5

profundidade de 0,0-20,0 cm. O solo possuía 106, 10 e 884 g kg-1 de argila, silte e areia,

respectivamente, com as seguintes características químicas: pH 4,7; matéria orgânica 21,0 g

kg-1; P e K 1,2 e 16 mg dm3, respectivamente; Ca, Mg, Al e H+Al, CTCefetiva e CTCpH=7 0,4,

0,2, 1,0, 5,8, 1,7 e 6,5 cmolc dm3, respectivamente; e saturação por bases 10,3%.

2.2. Tratamentos, delineamento experimental e procedimentos

O experimento foi conduzido em blocos casualizados com quatro repetições em

esquema fatorial 4x2. O primeiro fator foi composto por quatro doses do herbicida comercial

Boral 500® SC (0, 400, 800 e 1200 g ha-1 i.a.) e o segundo fator foi formado pela presença ou

ausência da inoculação com Bradyrhizobium sp.

O solo foi submetido à esterilização em autoclave vertical, à pressão de 1,0 atm e

temperatura de 120 ºC por 40 minutos. Cada unidade experimental correspondeu a um vaso

de polietileno com 15,0 kg de solo, revestidos com sacos plásticos para impedir a perda de

herbicida juntamente com o solo. A aplicação do sulfentrazone foi realizada, sobre o solo

presente no vaso, utilizando-se pulverizador pressurizado com CO2, com duas pontas

espaçadas por 0,5 m, bico tipo leque XR11002VP, com volume de calda de 147 L ha-1, 24

horas antes do plantio.

O inoculante foi o sólido turfoso para feijão-de-porco, Bradyrhizobium sp. BR2003

(SEMIA 6156), fornecido pela Embrapa Agrobiologia. Para inoculação, procedeu-se

conforme descrito por Signor et al. (2016), onde as sementes foram desinfestadas em álcool

70% por 30s e em seguida imergidas em solução de hipoclorito de sódio 1% por 3 min. Após

a desinfecção, as sementes foram lavadas duas vezes sucessivas em água destilada. Preparou-

se 20 mL de solução açucarada 10% para umedecimento das sementes e foram adicionados 25

g do inoculante sobre as sementes, homogeneizando-se até completa cobertura. As sementes

inoculadas foram secas ao ar por 30 minutos.

Foram semeadas seis sementes de feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) por vaso, na

profundidade de 5,0 cm. Após 15 dias de semeadura, realizou-se o desbaste, deixando-se duas

plantas em cada unidade experimental. As irrigações foram realizadas três vezes ao dia, a fim

de manter a umidade do solo a 60% da capacidade de campo (CC). As irrigações foram

realizadas três vezes ao dia, a fim de manter a umidade do solo a 60% da capacidade de

campo (CC). O valor de CC foi determinado em teste realizado antes da implantação do

experimento, conforme Casaroli e Jong Van Lier (2008), considerando uma taxa de redução

do teor de água de | dθ / dt | = 0,001 d-1.

6

2.3. Quantificação de resíduos de sulfentrazone no solo por cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC)

As concentrações residuais do herbicida foram determinadas em amostras de solo

coletadas de cada unidade experimental após a remoção da espécie fitorremediadora

utilizando o método de extração sólido-líquido com particionamento a baixa temperatura

(Goulart et al., 2008) e modificações propostas por Passos et al. (2018). A amostra de solo

seca em estufa a 60° C, por 4 horas, foi homogeneizada e peneirada (malha 2,00 mm). Foram

pesados 5,0 ± 0,1 g em tubo de polipropileno com tampa rosqueável (50 mL) e adicionado

20,0 mL da mistura de extração, que consistia em 10 mL de água destilada e 10 mL de

acetonitrila (ACN), grau HPLC (Sigma Aldrich). Os tubos foram agitados em Vortex por 2

min e posteriormente, as amostras foram submetidas a congelamento da fase aquosa (-20º C)

em freezer por aproximadamente 12 horas.

Após este período, a fração de solo e água congelada foram descartadas e a fase

orgânica (ACN), contendo o herbicida, foi transferida para um tubo de polipropileno (15 mL)

e centrifugada por 5 minutos, a 2.500 rpm, para decantação de eventuais partículas

remanescentes. Posteriormente, foram pipetados 1,5 mL da fase orgânica para vials de vidro e

submetidos a análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em equipamento

Shimadzu, modelo Prominence LC-20A, com detector de arranjo de diodos, sendo a detecção

e quantificação do sulfentrazone realizadas com os registros de absorção em 210 nm.

As determinações foram realizadas com coluna ODS-C18 (Shimadzu) de 15 cm de

comprimento, 4,6 mm de largura, recheada com partículas de 5 µm, em forno a 40º C. A

análise cromatográfica se deu com fase móvel composta por água ultrapura, solução aquosa

de ácido fosfórico a 0,1% (v/v) e ACN na proporção (50:10:40); com fluxo de 1 mL min -1 e

injeção de 10 μL. Nestas condições, o tempo de retenção para o sulfentrazone foi de

aproximadamente 7,85 minutos, produzindo picos simétricos e livres de interferentes. Isso foi

confirmado pela coincidência dos tempos de retenção e do espectro de absorção registrado

para padrões, amostras e base de dados para o composto (PubChem, 2019).

Uma solução estoque foi preparada a partir do padrão de sulfentrazone, com teor

declarado de 99,5% na concentração de 200 mg L-1, e a partir desta, foi feita uma solução de

trabalho de 10,0 mg L-1, ambas em ACN, armazenadas em congelador para evitar degradação.

Soluções padrão para calibração, entre 0,020 e 0,50 mg L-1, foram preparadas pela diluição da

solução de trabalho em ACN. Amostras de solo (5,0 ± 0,1 g) foram fortificadas pela adição de

150µL da solução de trabalho para obter a concentração de 0.30 mg kg-1. Adicionalmente,

uma amostra dopada com Boral 500® SC foi analisada para o controle de qualidade das

7

análises. Todos os solventes e reagentes utilizados foram de grau HPLC obtidos junto à

Sigma-Aldrich.

2.3.1. Preparo de uma amostra de solo dopada com Boral 500® SC na concentração de

0,29mg kg-1

Uma porção de 103 g de TFSA de solo coletado em região do estudo, livre de

aplicação do herbicida, foi distribuída sobre uma bandeja de plástico de aproximadamente 20

x 30 cm. Sobre o solo, foram borrifados 6,0 mL de uma solução de Boral 500® SC, diluída

com água para a concentração de sulfentrazone igual a 5,00 mg L-1. Em seguida, o solo foi

seco em estufa a 40º C por 3 horas e homogeneizado com uma espátula.

O solo dopado foi armazenado em geladeira. Porções de 5,0 g foram analisadas para

controle de qualidade das determinações e validação do método analítico. A concentração de

0,29 mg kg-1 equivale à dose de 1.6 L ha-1 de Boral 500® SC, conforme recomendação de

aplicação para combate a tiririca (Cyperus rotundus) na cultura da cana-de-açúcar

(Saccharum officinarum) (FMC, 2017).

2.4. Avaliação microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis

Na quantificação da frequência respiratória da microbiota do solo foi utilizado o

método respirométrico de avaliação do C-CO2 evoluído, no qual uma amostra de 150 g de

solo rizosférico de feijão-de-porco, peneirada (malha 2,00 mm) e umedecida a (70% da CC),

foram incubadas durante 40 dias em frascos hermeticamente fechados em temperatura

ambiente. As avaliações ocorreram 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 dias após o início da

incubação. O C-CO2 liberado do solo foi carreado por fluxo contínuo de ar (isento de CO2) até

outro frasco contendo 10 mL de solução de NaOH 0,5 mol L-1. Para sua liberação foram

adicionados 10 mL de BaCl2 0,05 mol L-1, sendo posteriormente titulado com HCl 0,25 mol

L-1, acrescidos de três gotas do indicador fenolftaleína a1% (Curl e Rodriguez-Kabana, 1972)

e (Stotzky, 1965).

Após 40 dias, 17 g de solo de cada frasco foram pesados para determinação do

carbono da biomassa microbiana (CBM) conforme Vance et al. (1987), modificado por Islam

e Weil, (1998). A partir dos valores obtidos de C-CO2 e CBM o quociente metabólico (qCO2)

foi calculado dividindo-se o C-CO2 evoluído do solo pelo CBM determinado no solo

(Anderson e Domsch, 1993).

As raízes de cada planta foram separadas dos vasos e, em seguida, foram retirados

todos os nódulos presentes para contagem do número de nódulos total. A massa seca de

8

nódulos (g/plantas) foi avaliada por meio da secagem dos nódulos em estufa de circulação

forçada de ar (70±2ºC), seguida do registro da massa em balança analítica (precisão 0,1 mg)

até massa constante.

2.5. Bioensaio

O milheto (Pennisetum glaucum) foi utilizado por apresentar elevada suscetibilidade ao

sulfentrazone, conforme reportado por (Belo et al., 2016; Dan et al., 2011). Vasos plásticos

com fundo selado foram preenchidos com 0.5 kg de solo de cada tratamento após o cultivo.

Posteriormente, foram semeadas 15 sementes do milheto (var. ADR7010), mantendo-se seis

plântulas por vaso após o desbaste.

Aos 30 DAS foi avaliada altura de plantas (cm) tendo como referência o meristema

apical. A intoxicação visual foi avaliada utilizando-se escala percentual, onde 0 (zero)

significa ausência de sintomas (redução da altura das plantas, clorose e necrose das folhas), e

100% morte de todas as plantas (Alam, 1974). No mesmo dia, determinou-se a massa seca da

parte aérea, em comparação às plantas do tratamento controle, após secagem até peso

constante, a 70±2ºC.

2.6. Avaliações e amostragens na espécie fitorremediadora

Foi avaliada altura de plantas (cm) aos 80 dias após a semeadura (DAS), tomando-se

como base para medição o meristema apical. As plantas foram cortadas na altura do coleto,

sendo a massa do material vegetal imediatamente registrada, denominada de biomassa fresca

da parte aérea.

As raízes foram cuidadosamente retiradas dos vasos, intactas, separadas, lavadas e

pesadas para obtenção da biomassa fresca. Posteriormente, o material vegetal (parte aérea e

raiz) foi colocado em estufa de circulação forçada de ar (70 ± 2ºC) até massa constante.

2.7. Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F a 5% e 1% de

probabilidade de erro. Interações significativas foram avaliadas e as médias comparadas pelo

teste de Tukey (p <0,05). O efeito dose foi avaliado por análise de regressão e modelos

lineares simples (Ȳ= α + β1X) e quadráticos (Ȳ = α + β1X + β2X2) foram ajustados com base

nos níveis de significância dos coeficientes em suas equações (p <0,05) e no valor do seu

coeficiente de determinação. As análises estatísticas foram realizadas com o software Sisvar®

(Ferreira, 2011). Gráficos de regressão e curvas foram criados usando o software SigmaPlot®

9

(Systat Software, Inc., Chicago, IL, USA).

3. Resultados

3.1. Performance do método de quantificação de resíduos de sulfentrazone no solo

O método utilizado para medir a concentração de sulfentrazone no solo mostrou-se

seletivo, não apresentando interferentes no tempo de retenção do analito em estudo (Fig. 3). A

resposta instrumental foi a linear (y=52193,2x-119,83; r2 =0,999) para a faixa de

concentrações testada, com bom coeficiente de determinação (Fig. 1B). O limite de detecção

(X+3DP) e limite de quantificação (X+10DP) foram de 0,014 e 0,021 mg kg-1, ambos

estimados de acordo com INMETRO (2016), a partir da média (X) e desvio-padrão (DP) dos

dados obtidos para diferentes brancos do método, preparados ao longo de um mês de análises.

Recuperações das quantidades de sulfentrazone dos solos fortificados com 150 µL do

padrão de trabalho (10,0 mg L-1) e dopado com produto comercial (Boral 500® SC) variaram

de 89 a 110%, o tempo de retenção permaneceu 7,8 minutos (Tabela 1). O método foi

reprodutível nos diferentes dias de análise e forneceu dados suficientemente precisos e exatos

(com diferenças entre duplicatas menores que 10%), para as quantidades de sulfentrazone

adicionadas às amostras de controle, em conformidade com os critérios de validação de

SANTE/11813/2017 (2017) e INMETRO (2016).

Fig. 1. (A) Cromatograma obtido pelo método descrito, com injeção de 10 µL de solução padrão de

0,020 mg L-1 e (B) curva analítica de 0,02 a 0,50 mg L-1 de sulfentrazone.

A B

10

Fig. 2. Cromatogramas, registrados em 210 nm, para os padrões de calibração 0,02 (P001), 0,10

(P002), 0,20 (P003) e 0,50 mg L-1 (P004) de sulfentrazone.

Fig. 3. (A) Cromatogramas obtidos nos extratos de solo fortificado com solução de padrão analítico e

(B) dopado com formulação comercial.

Tabela 1. Dados e recuperação de sulfentrazone (Sulf) em amostras de solos dopados com formulação comercial (Boral 500® SC) e fortificada com padrão analítico

Identificação Tempo de retenção

(min) Recuperação (%)

Concentração

(mg kg-1)

Solo fortificado (0,30 mg kg-1 de Sulf) 7,8 100 0,299

Solo fortificado (0,30 mg kg-1 de Sulf) 7,8 89 0,267

Solo dopado (0,29 mg kg-1 de Sulf) 7,8 110 0,320

Solo dopado (0,29 mg kg-1 de Sulf) 7,8 101 0,292

Brancos do método (mg kg-1) - -0,005 a 0,012

Limite de detecção (mg kg-1) - 0,014

Limite de quantificação (mg kg-1) - 0,021

3.2. Avaliação das concentrações residuais de sulfentrazone no solo após cultivo de feijão-

de-porco com e sem inoculante

A simbiose entre feijão-de-porco e Bradyrhizobium sp. atuou de modo significativo

sobre os resíduos de sulfentrazone no solo. A concentração foi reduzida com a inoculação da

planta com Bradyrhizobium sp. (Fig. 4A). Na dose de 400 g ha-1 (0,14 mg kg-1) a redução foi

de 30,7 %, em média, quando comparado com a dose não inoculada (Fig. 4A). O percentual

A B

11

residual no solo, na dose aplicada de 400 g ha-1, foi 57% quando realizada a inoculação da

planta e 71% sem o inoculado (Fig. 5), evidenciando o efeito simbiótico sobre a degradação

do sulfentrazone.

A inoculação associada ao feijão-de-porco reduziu significativamente (23,3%, em

média) a concentração de sulfentrazone do solo, na dose de 800 g ha-1 (0,29 mg kg-1), (Fig.

4A). Conforme apresentado na Fig. 4B, a concentração de sulfentrazone no solo decresceu de

modo linear à medida que aumentaram as doses, independente da inoculação. O percentual

residual de sulfentrazone no solo, na dose (800 g ha-1) foi de 25%, quando associado ao

Bradyrhizobium sp., e de 45%, no solo sem inoculação (Fig.5). A dose 1200 g ha-1 apresentou

concentração residual de 50% após 80 dias, independente da inoculação, indicando um tempo

de meia-vida de igual período (Fig.5).

Fig. 4. Concentração de sulfentrazone no solo após fitorremediação com Canavalia ensiformis,

associada ou não a Bradyrhizobium sp. (A), cultivada em solo contaminado com diferentes doses de

herbicida (B). Valores médios (±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não

diferiram significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05). Concentrações de 0,00; 0,14; 0,29 e 0,43 mg kg-1 i.a. equivalem, respectivamente a 0; 400; 800 e 1200 g ha-1 i.a.

12

Fig. 5. Percentual residual de sulfentrazone no solo, em relação às doses adicionadas, após

fitorremediação com Canavalia ensiformis, associada ou não a Bradyrhizobium sp. Valores médios

(±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05). Concentrações de 0,00; 0,14; 0,29 e 0,43 mg kg-1 i.a. equivalem,

respectivamente a 0; 400; 800 e 1200 g ha-1 i.a.

3.3. Atividade microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis

A inoculação do feijão-de-porco com Bradyrhizobium sp. interferiu de modo

significativo na frequência respiratória (C-CO2). Não foi possível estabelecer uma regressão

entre frequência respiratória e dose, ao longo do tempo, mas houve ajuste de modelo ao C-

CO2 total evoluído. Consequentemente, realizou-se o teste de média Tukey para comparação

do fator inoculação. A testemunha (0 g ha-1) apresentou uma oscilação na frequência

respiratória não havendo diferenças significativas na inoculação (p > 0,05) (Fig. 6A). Na dose

400 g ha-1 de sulfentrazone no solo, a inoculação promoveu um acréscimo médio de 8,59% na

frequência respiratória ao longo dos 40 dias de incubação. Maiores taxas respiratórias

significativas foram observadas no primeiro e no vigésimo dia de incubação (Fig. 6B).

Solo inoculado e tratado com dose de 800 g ha-1 de sulfentrazone apresentou um

incremento médio de 5,17% na taxa respiratória frente ao o solo não inoculado. Os maiores

valores foram encontrados aos 5, 10, 20 e 25 dias após incubação do solo (Fig. 6C). Para a

dose 1200 g ha-1 a inoculação promoveu um aumento médio de 20,87% na frequência

respiratória ao longo dos 40 dias de incubação. No dia primeiro e décimo quinto dia de

incubação a inoculação elevou a respiração microbiana significativamente (Fig. 6D).

13

Para a dose de 1200 g ha-1, o C-CO2 total evoluído diferiu significativamente (p <

0,05) entre os tratamentos com e sem inoculante (Fig. 7B). Os resultados de C-CO2 total

evoluído, na presença do Bradyrhizobium sp., apresentaram uma correlação linear com a dose

de sulfentrazone no solo (Fig. 7A).

O carbono da biomassa (CBM) obteve significância apenas para variável inoculação

sendo os dados submetidos ao teste de média Tukey. O incremento médio no CBM dos solos

inoculados com Bradyrhizobium sp. foi 65% comparado com os solos não inoculados. A

inoculação promoveu maior incremento para testemunha e para as plantas cultivadas no solo

com a dose de 400 g ha-1 (Fig. 8A). O qCO2 do solo não foi significativo para inoculação e

dose (p > 0,05) (Fig. 8B).

Fig. 6. Frequência respiratória do solo sob a dose de 0g ha-1 (A), 400 g ha-1 (B), 800 g ha-1 (C) e 1200 g

ha-1 (D) de sulfentrazone, cultivado com Canavalia ensiformis, associado ou não a Bradyrhizobium sp.

Valores médios (±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, no mesmo dia, não diferiram

significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05).

14

Fig. 7. C-CO2 total evoluído do solo cultivado com Canavalia ensiformis, associado ou não a Bradyrhizobium sp., em função das doses de sulfentrazone. Ajuste de modelo em função das doses (A)

e comparação entre as médias dentro de cada dose (B). Valores médios (±1 desvio padrão) seguidos

pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05).

Fig. 8. Carbono da biomassa microbiana (A) e Quociente metabólico (B) do solo contaminado com

sulfentrazone, cultivado com Canavalia ensiformis, associado ou não a Bradyrhizobium sp. Valores

médios (±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05).

O número de nódulos total foi maior quando realizada a inoculação com

Bradyrhizobium sp., não variando de modo significativo frente as diferentes doses (p > 0,05).

O incremento médio foi de 65,4% para as plantas inoculadas, com resultado significativo

apenas para inoculação na dose de 1200 g ha-1 (Fig. 9A). A massa seca dos nódulos não foi

significativa para inoculação (p > 0,05) (Fig. 9B), apesar da tendência de maiores valores nas

plantas inoculadas, independentemente das doses de sulfentrazone.

15

Fig. 9. Número de nódulos total (A) e Massa seca de nódulos (B) de Canavalia ensiformis, associado

ou não a Bradyrhizobium sp., cultivada em solo contaminado com diferentes doses de sulfentrazone. Valores médios (±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram

significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05).

3.4. Bioensaio

As variáveis analisadas nas plantas de milheto (Pennisetum glaucum) seguiram uma

tendência quadrática à medida que aumentou a dose, independente da inoculação (Fig. 10).

Não houve diferenças significativas para a variável inoculação (p > 0,05). À medida que

aumentou a dose de sulfentrazone no solo, a altura (Fig. 10A) e a massa seca (Fig. 10B) das

plantas de milheto diminuíram, consequentemente, a fitotoxidade (Fig. 10C) na parte aérea

aumentaram com o aumento da dose. Todavia há uma tendência de melhores resultados

quando a fitorremediadora foi associada ao Bradyrhizobium sp.

16

Fig. 10. Altura de planta (A), massa seca da parte aérea (B) e intoxicação visual (C) de Pennisetum

glaucum cultivado em solo fitorremediado com Canavalia ensiformis, associado ou não a

Bradyrhizobium sp.

17

3.5. Produção de fitomassa de Canavalia ensiformis

A altura de plantas diminuiu linearmente conforme aumentou a dose de sulfentrazone

no solo, tanto com e sem inoculação (Fig. 11A). As plantas (com e sem inoculação com

Bradyrhizobium sp.) apresentaram maiores alturas para a testemunha (0 g ha-1), decrescendo

até a dose de 1200 g ha-1 de sulfentrazone (Fig. 11B). Pelos valores das estimativas, temos

que a cada aumento da dose, ocorre um decréscimo na altura de plantas de feijão-de-porco de

0,0167 e 0,0191, respectivamente para solo com e sem inoculação, observando maior

decréscimo para plantas não inoculadas. (Fig. 11A).

A produção aérea de massa fresca e seca não foi influenciada pela inoculação (p >

0,05), no entanto, decréscimo médio de 19,1 e 17,5%, respectivamente na massa fresca e seca

da parte aérea foram observados para a dose de 1200 g ha-1 em relação as plantas inoculadas

(Tabela 2). A massa fresca de raiz diminuiu linearmente com o aumento das doses de

sulfentrazone independente da inoculação (Fig. 12A). Quando inoculadas, as raízes

apresentaram maior massa fresca nas doses 400, 800 e 1200 g ha-1 de sulfentrazone (Fig.

12B). A taxa de perda de massa fresca da raiz com o aumento da dose é maior na ausência da

inoculação, com decréscimo de 0,0114 e 0,0153, respectivamente para solo com e sem

inoculação (Fig. 12A).

Fig. 11. Altura de plantas de Canavalia ensiformis, com e sem inoculação com Bradyrhizobium sp., cultivadas em solo contaminado com diferentes doses de sulfentrazone. Ajuste de modelo em função

das doses (A) e comparação entre as médias dentro de cada dose (B). Valores médios (±1 desvio

padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram significativamente de acordo com o teste t (p > 0,05).

18

Tabela 2. Massa fresca e seca da parte aérea de Canavalia ensiformis, com e sem inoculação com Bradyrhizobium sp., cultivadas em solo contaminado com diferentes doses de sulfentrazone

Doses de

Sulfentrazone (g ha-1)

Massa fresca da parte aérea (g)

Com Bradyrhizobium sp Sem Bradyrhizobium sp Variação Percentual (%)

0 116,65 126,00 -7,4

400 138,75 124,32 11,5

800 132,00 112,00 17,8

1200 124,65 104,65 19,1

*CV (%) 12,19

Doses de

Sulfentrazone (g/ha-1)

Massa seca da parte aérea (g)

Com Bradyrhizobium sp Sem Bradyrhizobium sp Variação Percentual (%)

0 34,74 32,44 7,0

400 35,03 33,32 5,1

800 36,89 31,54 16,8

1200 36,15 30,76 17,5

CV (%) 21,48

* Coeficiente de variação

Fig. 12. Massa fresca de raiz de Canavalia ensiformis, com e sem inoculação com Bradyrhizobium

sp., cultivadas em solo contaminado com diferentes doses de sulfentrazone. Ajuste de modelo em

função das doses (A) e comparação entre as médias dentro de cada dose (B). Valores médios (±1 desvio padrão) seguidos pela mesma letra, na mesma dose, não diferiram significativamente de acordo

com o teste t (p > 0,05).

19

4. Discussão

4.1. Avaliação das concentrações residuais de sulfentrazone no solo após cultivo de feijão-

de-porco com e sem inoculante

A simbiose estabelecida entre Bradyrhizobium sp. e feijão-de-porco foi mais eficiente

na degradação do herbicida no solo do que em solos cultivados sem inoculação, uma vez que

estes últimos apresentaram maiores concentrações residuais de sulfentrazone após o cultivo

(Fig. 4A). Esse resultado favorável decorrente da simbiose estabelecida entre a

fitorremediadora (feijão-de-porco) e o microrganismo Bradyrhizobium sp., mostram

eficiência na biorremediação do solo. As bactérias que povoam a rizosfera promovem o

crescimento e desenvolvimento das plantas desencadeando respostas imunes, modulando o

equilíbrio hormonal, protegendo contra patógenos e mobilizando nutrientes (Glick, 2012;

Venturi e Keel, 2016). Tais organismos podem atuar como biofertilizantes, fitoestimuladores,

rizoremediadores, degradando contaminantes orgânicos e biopesticidas e ainda controlando

doenças através da síntese de antibióticos e metabólitos antifúngicos (Somers et al., 2004).

Todavia, os resultados da pesquisa não permitem afirmar quais mecanismos foram

desenvolvidos pela simbiose de feijão-de-porco e Bradyrhizobium sp. Esse efeito pode ter

sido decorrente da ação rizodegradadora do microrganismo sobre o contaminante, ou mesmo,

o efeito benéfico do microrganismo para a planta, desencadeando melhor eficiência na

degradação do sulfentrazone, uma vez que essa leguminosa foi considerada eficiente

fitorremediadora de sulfentrazone (Ferraço et al., 2017; Madalão et al., 2017b). Martinez et al.

(2010) sugerem que a principal rota de degradação do sulfentrazone no solo é via microbiana,

onde os microrganismos Nocardia brasiliensis e Penicillium sp. foram identificados como

potenciais degradadores do herbicida no solo.

Outro fator importante é o estádio em que as plantas foram manejadas/colhidas. O

experimento foi conduzido até o pleno florescimento. Esta fase é caracterizada pela alta

atividade metabólica das plantas e na qual há maior liberação de exsudados radiculares,

contribuindo para maior número de microrganismos associados à rizosfera (Aulakh et al.,

2001). Este fato pode ter tornado mais eficiente a degradação de sulfentrazone. De forma

semelhante, o cultivo de Stizolobium aterrimum até seu completo florescimento favoreceu o

acúmulo de exsudatos na região das raízes, permitindo crescimento e desenvolvimento de

maior número de grupos de microrganismos (Santos et al., 2007)

Com o aumento da dose de sulfentrazone ocorreu um aumento da concentração

encontrada no solo (Fig. 4B). Porém, observa-se que para as doses de 400 e 800 g ha-1,

quando as plantas foram inoculadas, houve diminuição da concentração e percentual residual

20

do herbicida no solo (Fig. 4A). Isso indica que os microrganismos adicionados conseguiram

estabelecer melhor relação com a planta e atuar na remediação do solo, enquanto para a dose

mais elevada do herbicida comprometeu o desenvolvimento do feijão-de-porco (menores

altura) e apresentou tendência de desequilíbrio microbiológico (alta respiração, baixa CBM e

maiores valores de qCO2) especialmente sem o inoculante. Doses elevadas de herbicida

podem provocar danos para planta e comunidades microbianas do solo (Faria et al., 2018;

Oliveira Júnior, 2011) afetando os resultados da biorremediação. De acordo com os resultados

obtidos por Melo et al. (2019) a inoculação foi importante para C. ensiformis, uma vez que os

solos cultivados sem a presença de microrganismos apresentaram pequena redução na

concentração de sulfentrazone durante os períodos de avaliação.

A dose 1200 g ha-1 apresentou concentração residual de 50% após 80 dias,

independente da inoculação (Fig. 5) tal valor se aproxima do tempo de meia-vida estimado

por Brum et al. (2013) mas inferiores aos 150 dias estimados por Martinez et al. (2008). Em

solos cultivados com C. ensiformis na presença de inoculação, o tempo de meia-vida do

herbicida foi observado perto de 47 dias, enquanto para C. ensiformis, na ausência de

consórcio bacteriano, foi alcançado somente após 76 dias.

4.2. Atividade microbiana da rizosfera e nodulação das raízes de Canavalia ensiformis

O cultivo do feijão-de-porco em simbiose com Bradyrhizobium sp. proporcionou

maior desprendimento de CO2 e, consequentemente, maior respiração microbiana do solo do

que sem o inoculante, nas diferentes doses de sulfentrazone (Fig. 7). O aumento

proporcionado na frequência respiratória indica uma intensa atividade dos microrganismos e

pode ser um indicativo da decomposição rápida de resíduos orgânicos (Santos et al., 2009). A

degradação microbiana do sulfentrazone pode ser através de reações enzimáticas catabólicas,

onde microrganismos do solo podem utilizar o herbicida como fonte de energia, ou através do

cometabolismo, que requer outra fonte de carbono e energia para sustentar o crescimento

microbiano (Brum et al., 2013; Melo et al., 2017a). Logo, o cultivo de espécie

fitorremediadoras em simbiose com microrganismos pode favorecer o crescimento da

microbiota do solo e a liberação de C-CO2 durante o processo de remediação.

Apesar do solo ter sido submetido ao processo de autoclavagem, a frequência

respiratória sem inoculação apresentou-se alta (Fig. 7). Esse fato pode estar relacionado à

morte de microrganismos pelo processo de autoclavagem, o qual fornece a degradação dos

compostos orgânicos usadas como fonte de energia para os microrganismos que cresceram ao

longo do período de cultivo (Souza et al., 2017). O estímulo à atividade microbiana,

21

promovida pela liberação de substâncias radiculares, favorecem a multiplicação de

microrganismos que podem atuar degradando o herbicida no solo, caracterizando, em algumas

plantas, como aptidão rizosférica na remediação desses compostos (Madalão et al., 2016). A

presença do sulfentrazone no solo, e particularmente o cultivo de Canavalia ensiformis e

Helianthus annuus, podem apoiar o crescimento microbiano e induzir a liberação de C-CO2

crescente ao longo do tempo de biorremediação (Melo et al., 2017b). Estudos mostraram que

diferentes microrganismos inoculados em diferentes solos promoveram a degradação do

diuron, liberando CO2 para a atmosfera (Villaverde et al., 2017).

A utilização do feijão-de-porco pode ter favorecido a atividade microbiana, uma vez

que a planta apresenta alta capacidade em estimular os microrganismos no ambiente

rizosférico. Madalão et al. (2016) observaram maior respiração microbiana em solo

rizosférico cultivado com C. ensiformis. Evidências reforçam que C. ensiformis é eficaz em

estimular a microbiota e muito promissora para a remediação de solos contaminados com

sulfentrazone (Melo et al., 2017b).

O efeito positivo da inoculação do feijão-de-porco com o simbiótico Bradyrhizobium

sp. pode ser verificado pela variação na biomassa microbiana do solo (Fig. 8A). O alto CBM

proporcionado pela inoculação está relacionado a maior atividade microbiológica do solo

quando comparado com o solo não inoculado, uma vez que, a microbiota do solo é sensível as

modificações do ambiente. Em outro estudo, C. ensiformis e um consórcio bacteriano

destacaram-se em relação à biomassa e ao quociente microbiano sobre a fitorremediação de

solo contaminado com sulfentrazone ao longo do tempo (Melo et al., 2017b).

A biomassa microbiana é considerada a fração viva da matéria orgânica do solo e um

expressivo reservatório de nutrientes nos solos, atuando ativamente no processo de

decomposição/mineralização de resíduos orgânicos (Kaschuk et al., 2010). Assim, a biomassa

microbiana ativa, associada ao feijão-de-porco, é de grande interesse, pois pode intensificar a

descontaminação do solo com sulfentrazone no processo de biorremediação.

A taxa de respiração por unidade de biomassa microbiana, conhecida como quociente

metabólico (qCO2), foi aceito como um indicador sensível da resposta dos estresses

ambientais sob a comunidade microbiana do solo (Wardle e Ghani, 1995). Altos valores de

qCO2 são encontrados em locais submetidos a condições adversas, ou seja, em solos onde a

biomassa microbiana oxida mais carbono para sua manutenção (Lacerda et al., 2013).

Os baixos valores não significativos para qCO2, independente da inoculação com

Bradyrhizobium sp., para 0 e 400 g ha-1 (Fig. 8B), podem estar relacionados ao efeito não

limitante do herbicida sobre a comunidade microbiana e possivelmente reflete um ambiente

22

mais estável na rizosfera do feijão-de-porco. Valores próximos a 0,18 μg.μg-1 d-1 de qCO2

foram observados durante a biorremediação em solos cultivados com C. ensiformis em

consórcio bacteriano por 85 dias (Melo et al., 2017b). De forma semelhante, a aplicação do

picloram não afetou o carbono da biomassa microbiana e o qCO2 nos solos rizosféricos de P.

maximum e U. brizantha indicando que a rizosfera dessas espécies pode contribuir para a

descontaminação dos solos tratados com picloram (Souza et al., 2017).

Apesar dos resultados não significativos para qCO2, observam-se maiores valores para

as doses crescentes de sulfentrazone e, não obstante, a taxa respiratória também aumentou

conforme elevou a dose (Fig. 7 e 8B). A taxa respiratória dos microrganismos pode aumentar

ou diminuir dependendo dos fatores que contribuem para tais mudanças, incluindo, a

degradação de compostos usados como fonte de nutrientes, ou intoxicação por xenobióticos,

que levam à menor eficiência de utilização do carbono, promovendo, em ambos os casos,

aumento na emissão de CO2 (Santos et al., 2007). Esses fatos indicam que pode estar

ocorrendo maior gasto de energia para a manutenção da comunidade microbiana, ou seja,

devido a um estresse, possivelmente gerado pela alta dose do herbicida no solo (1200 g ha -1

do sulfentrazone), utilizada nesse experimento. Nesse caso, os microrganismos oxidam

carbono de suas células para sua manutenção e sobrevivência no solo (Lacerda et al., 2013).

De acordo com Souto et al. (2013), quanto maior a concentração da mistura de imazetapir +

imazapique houve a tendência de maior produção de C-CO2, observado em solo rizosféricos

de 6 espécies vegetais.

Os resultados revelaram que feijão-de-porco inoculado com Bradyrhizobium sp. atua

de modo satisfatórios sobre os aspectos biológicos do solo, principalmente para a dose de 400

g ha-1 (Fig. 7, 8A e B). No contexto da biorremediação, esta descoberta é importante para o

processo de descontaminação do solo com sulfentrazone, uma vez que o cultivo de plantas

fitorremediadoras em associação com microrganismos estimula a microbiota e melhorar a

eficiência na descontaminação do solo. A comunidade microbiana em equilíbrio se torna mais

eficiente em utilizar os recursos disponíveis e, consequentemente, maior quantidade de

carbono pode ser incorporada aos tecidos microbianos.

A simbiose estabelecida entre Bradyrhizobium sp. e feijão-de-porco foi observada

através da nodulação das raízes das plantas (Fig. 9A). O número de nódulos total foi afetado

pela inoculação e contaminação com sulfentrazone do que a massa seca dos nódulos (Fig.

9B), indicando um efeito direto na iniciação nodular e não no desenvolvimento do nódulo.

Isso indica que as bactérias estavam viáveis e foram capazes de realizar a nodulação das

raízes e consequentemente fornecer produtos nitrogenados como aminoácidos e ureídos e em

23

troca, a planta recebe fotossintatos à bactéria (Mus et al., 2016). As bactérias fixadoras de

nitrogênio têm potencial de modificar diretamente a microflora da rizosfera, melhorando as

condições ambientais e a disponibilidade de nutrientes através do nitrogênio orgânico fixado,

facilitando o crescimento e a atividade de outros biodegradadores do solo (Teng et al., 2015).

A presença desse tipo de bactéria pode contribuir para o crescimento da planta em solos

contaminados (Mandal e Bhattacharyya, 2012) e, consequentemente, resultar em uma maior

taxa de remoção de poluentes (Glick, 2010).

4.3. Bioensaio

Os ganhos proporcionados pela inoculação na redução do sulfentrazone do solo não

foram visualmente percebidos através da intoxicação do milheto (Pennisetum glaucum). Os

resultados mostraram que a massa seca e altura diminuíram e, proporcionalmente à dose de

sulfentrazone aplicada, a fitotoxidade aumentou, independente da simbiose com

Bradyrhizobium sp (Fig. 10A, B e C). Os resultados refletem a sensibilidade do milheto na

detecção do herbicida no solo, principalmente para o residual de doses muito elevadas, como

1200 g ha-1 utilizado nesse trabalho. Resultados semelhantes foram obtidos por (Ferraço et al.,

2017), o qual relatou que a fitotoxicidade do milheto aumentou (a massa seca diminuiu) com

aumento da dose de sulfentrazone após cultivo com diferentes espécies leguminosas Em outro

estudo, o cultivo misto de C. ensiformis e Helliantus annuus e H. annuus como uma única

cultura, independente do solo ter sido inoculado com Pseudomonas sp. mostraram reduções

na concentração aos 85 dias após o desbaste, mas este período não foi suficiente para permitir

o crescimento da planta indicadora sem a ocorrência de toxicidade (Melo et al., 2019).

Entretanto, essas constatações não inviabilizam a fitorremediação, pois resultados satisfatórios

para a redução do resíduo de sulfentrazone no solo foram alcançados.

A eficiência de fitorremediação, nas doses 400 e 800 g ha-1, assemelhou-se muito nos

resultados obtidos e apresentou menores danos às plantas de milheto, mesmo sem o

inoculante. Pela análise de regressão e pelas tabelas nota-se, entretanto, a tendência de

melhores resultados para os tratamentos inoculados. Isso demonstra o efeito sinérgico do

inoculante junto as plantas de feijão-de-porco em remediar o solo contaminado com

sulfentrazone, possivelmente pelo estímulo da atividade microbiana no solo. Estudos

mostraram que plantas de feijão-de-porco podem promover remediação rizosférica, pois os

flavonóides e outros compostos liberados pelas raízes podem estimular o crescimento e a

atividade de microrganismos degradadores, ou mesmo reagir com o herbicida, imobilizando-o

(Leigh et al., 2006, 2002). Assim, cultivo de feijão-de-porco em áreas contaminadas com

24

sulfentrazone pode reduzir os riscos de impactos ambientais por sua eficiência no processo de

remediação do solo.

4.4. Produção de fitomassa de Canavalia ensiformis

Comparando-se os tratamentos com e sem inoculante, o maior desenvolvimento

significativo em altura, mesmo para a dose de 1200 g ha-1 de sulfentrazone (para o tratamento

inoculado) e a maior produção de raiz em todas as doses (plantas com inoculação) (Fig. 11 e

12) provavelmente decorrem da ação dos microrganismos, por meio da produção de

substâncias promotoras de crescimento que podem estimular o aumento de raízes secundárias

e da superfície radicular, traduzindo-se em maior crescimento da planta (Souza et al., 2015).

Os microrganismos podem ajudar no crescimento da planta através da excreção de

substâncias promotoras de crescimento vegetal, como fitormônios (ácido indolacético,

etileno), aminoácidos e substâncias reguladoras do metabolismo (Thuler et al., 2003). Maior

matéria seca de raiz foi observada ao longo do tempo em plantas de feijão-de-porco cultivadas

por 65 e 85 dias após o desbaste em solo inoculado com Pseudomonas spp. do que no solo

não inoculado com bactérias (Melo et al., 2018). Esse incremento resulta em melhoria na

absorção de água e nutrientes, melhorando a capacidade da planta em produzir e suportar

estresses ambientais, ocasionados nesse caso, pelo uso do herbicida sulfentrazone.

As doses mais altas de herbicidas tendem a diminuir a altura e massa seca de raiz,

como observado no gráfico de regressão (Fig. 11A e Fig. 12A), indicando os efeitos negativos

no desenvolvimento da planta, mesmo em se tratando de uma planta tolerante ao

sulfentrazone. Madalão et al. (2013) observaram que a partir de 800 g ha-1 as plantas

potencialmente fitorremediadoras como a Canavalia ensiformis apresentaram

desenvolvimento decrescente na altura, registrando-se, na dose de 1.600 g ha-1, cerca de 58%

de redução no porte das plantas em relação àquelas que cresceram em solo livre da presença

do sulfentrazone.

O solo utilizado nesse estudo foi submetido ao processo de autoclavagem, o que pode

ter alterado algumas características físicas e químicas do solo. Apesar de não ter realizado

análises químicas e físicas do solo após processo de esterilização, tem sido relatado que os

métodos de esterilização frequentemente utilizados causam algum efeito secundário no solo e

alteram suas propriedades físicas e químicas (Fuentes et al., 2017; Razavi Darbar e Lakzian,

2007; Safari Sinegani e Hosseinpur, 2010; Wang et al., 2011; Zamani et al., 2015). A

autoclavagem diminuiu significativamente o pH em solos contaminados e não contaminados

(0,27 e 0,12 unidades, respectivamente) e, em média, a condutividade elétrica foi 30% maior

25

nos solos autoclavados (Zamani et al., 2015). Tais mudanças podem influenciar no processo

de remoção do contaminante do solo, como observado por Fuentes et al. (2017), onde

diferenças na remoção de pesticidas em solos estéreis e não estéreis foi afetada pelo processo

de autoclavagem, alterando o crescimento microbiano ao longo do tempo e a degradação de

pesticidas.

Um fator que pode ter afetado o crescimento das plantas de feijão-de-porco e,

consequentemente, a fitotoxidade das plantas de milheto, são as características químicas e

físicas do solo em estudo. A sorção e mobilidade do sulfentrazone dependem do tipo, pH e

manejo do solo (Passos et al., 2013), sendo considerado um ácido fraco com uma constante de

dissociação (pKa) de 6,56, podendo ser encontrado na forma neutra, quando o pH < 6,56, ou

aniônica, quando o pH > 6,56 (Grey et al., 1997). O pH do solo em estudo foi menor que o

pKa do herbicida, a tendência do sulfentrazone é permanecem principalmente na forma neutra

e assim a sorção pode ter sido favorecida. Langaro et al. (2019) observaram maior sorção do

sulfentrazone em solo com baixo pH (4,7), baixo teor de argila (17%) e baixa matéria

orgânica (2,5). Martinez et al. (2010) observaram baixo valor de pH (5,01) em Latossolo

vermelho, abaixo do valor de pKa do sulfentrazone, observando sua forma neutra, na qual a

solubilidade foi reduzida aumentando a adsorção.

A inoculação do feijão-de-porco com Bradyrhizobium sp. não alterou o

desenvolvimento da planta em relação a massa seca e fresca (Tabela 2) afirmando novamente

certa resistência natural e eficiência em atuar como planta fitorremediadoras do sulfentrazone.

Em outra pesquisa, a alocação de matéria seca na parte aérea de C. ensiformis não foi

influenciado pela ação do sulfentrazone, aplicado em várias doses (Belo et al., 2011).

A inoculação com microrganismos diazotróficos é uma técnica empregada em vários

estudos e mostra-se adequada para uso em espécies de interesse agrícola (Hungria e Mendes,

2015) na aceleração da recuperação de áreas contaminadas (Ferreira et al., 2018; Melo et al.,

2017a) e pode trazer benefícios para remediação do sulfentrazone como mostrado nesse

trabalho. A praticidade, associada ao fácil fornecimento de inoculante comercial para feijão-

de-porco, mostram que esta prática agronômica de baixo custo pode incrementar a técnica de

fitorremediação e alcançar uma recomendação ainda mais adequada e eficiente para

despoluição de áreas contaminadas com sulfentrazone. Assim, estratégias como cultivos

consecutivos do feijão-de-porco na área contaminada ou coinoculação com simbiontes e

endofíticos pode ser uma possibilidade para aumentar o potencial da técnica e a eficiência da

biorremediação.

26

5. Conclusões

A simbiose entre feijão-de-porco e Bradyrhizobium sp. promoveu significativa

redução na concentração residual de sulfentrazone no solo, para as doses de 400 e 800 g ha-1.

A inoculação com diazotrófico simbiótico potencializou a microbiota do solo e

consequentemente aumentou a eficiência da biorremediação de solos contaminados com

doses de sulfentrazone.

Os indicadores microbiológicos mostraram a tendência de estabilidade da rizosfera,

com resultados satisfatórios principalmente para a dose de 400 g ha-1.

Na dose de 1200 g ha-1 do sulfentrazone, o desempenho da fitorremediação por C.

ensiformis não foi satisfatório. Sugerindo que a presença de altos níveis de resíduos do

herbicida no solo alteram e comprometem os mecanismos promotores da remediação.

O feijão-de-porco apresentou boa resistência aos níveis de sulfentrazone no solo,

independentemente do inoculante. Danos foram perceptíveis apenas na dose mais alta, sendo

esta, muito elevada (2,4 L ha-1) em relação aos níveis alcançados nas recomendações

agronômicas (1,6 L ha-1).

Os resultados deste trabalho encorajam a continuidade dos estudos sobre a interação

positiva entre microrganismos simbióticos e espécies leguminosas visando à fitorremediação

do herbicida sulfentrazone.

27

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ANEXOS

Fig. 13. Autoclavagem do solo (A); Pesagem 15 kg de solo (B); Contaminação do solo com sulfentrazone utilizando o pulverizador pressurizado com CO2 (C).

Fig. 14. Inoculante comercial turfoso para feijão-de-porco (A); Sementes de feijão-de-porco inoculadas e não inoculadas (B); Plantio das seis sementes nos vasos 24 h após o processo de contaminação do solo (C e D).

A

B C

A B C D

34

Fig. 15. Desenvolvimento das plantas de feijão-de-porco até 80 dias após plantio.

Fig. 16. Retirada do experimento (A e B); Pesagem da parte aérea das plantas (C); Retirada das raízes (D e E); Separação dos nódulos (F).

Fig. 17. Procedimentos para análise de cromatografia líquida: (A) Pesagem da amostra de solo; Adição de 10 mL de acetonitrila e 10 mL de água destilada (B); Agitação por 2 min (C); Congelamento da amostra (D); Retirada da fase orgânica após congelamento (E); Transferência de 1,5 mL da fase orgânica para vials (F).

A B C D E F

A B C D E F

35

Fig. 18. Avaliação da respiração microbiana do solo (C-CO2): Amostras de solo incubadas em frascos hermeticamente fechados (A e B); Solução de NaOH 0,5 mol L-1 após incubação (C); Solução de BaCl2 0,05 mol L-1 utilizada para liberação do C-CO2 (D); Titulação das amostras com HCl 0,25 mol L-1 acrescidos de três gotas do indicador fenolftaleína (1%) (E e F).

Fig. 19. Processo de extração das amostras para determinação do carbono da biomassa microbiana (CBM): Pesagem da amostra de solo que foram incubadas (A); Irradiação das amostras (B); Adição de 80 mL K2SO4 (C); Agitação das amostras por 1 h (D); Filtragem das amostras (E e F).

Fig. 20. Extração do carbono da biomassa microbiana: Retirada de 10 mL da solução extraída do solo (A); Adição de 2 mL de dicromato de potássio (K2Cr2O7) (B); Adição de 10 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) (C); Aferição do volume para 100 mL com água destilada (D); Titulação das amostras com sulfato de ferro (FeSO4) acrescidos de oito gotas do indicador Ferroin (E e F).

A B C D E F

A B C D E F

A B C D E F

36

Fig. 21. Semeadura e desenvolvimento do Pennisetum glaucum (var. ADR7010) cultivado

após fitorremediação do solo com feijão-de-porco.

Fig. 22. Desenvolvimento das plantas de milheto e análise de fitotoxidade.

Fig. 23. Amostra de solo com 1200 g ha-1 i.a. de sulfentrazone sem inoculação com Bradyrhizobium sp. (A) e com 1200 g ha-1 i.a. de sulfentrazone com inoculação com Bradyrhizobium sp (B).

B

A

37

Fig. 24. Amostra de solo com 800 g ha-1 i.a. de sulfentrazone sem inoculação com Bradyrhizobium sp. (A) e com 800 g ha-1 i.a. de sulfentrazone inoculado com Bradyrhizobium sp (B).

Fig. 25. Amostra de solo com 400 g ha-1 i.a. de sulfentrazone sem inoculação com Bradyrhizobium sp. (A) e com 400 g ha-1 i.a. de sulfentrazone com inoculação com Bradyrhizobium sp. (B).

Fig. 26. Amostra sem presença de sulfentrazone (0 g ha-1 i.a.).

A

B

A

B

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