JULIANA MENDES YULE VICENTE

Anlise dos eventos tnicos e fsicos do sono dessincronizado em ratos Wistar com leso medular contusa

So Paulo

2009

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Anlise dos eventos tnicos e fsicos do

sono dessincronizado em ratos W

istar com

leso medular contusa

DOUTORADO FMUSP

2009

JULIANA MENDES YULE VICENTE

Anlise dos eventos tnicos e fsicos do sono dessincronizado em ratos Wistar com leso medular contusa

Tese apresentada a Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

rea de concentrao: Fisiopatologia Experimental

Orientadora: Dra. Angela Cristina do Valle

v.1

So Paulo

2009

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Vicente, Juliana Mendes Yule

Anlise dos eventos tnicos e fsicos do sono dessincronizado em ratos Wistar com leso medular contusa / Juliana Mendes Yule Vicente. -- So Paulo, 2009.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.

rea de concentrao: Fisiopatologia Experimental.

Orientadora: ngela Cristina do Valle.

Descritores: 1.Sono REM/fisiologia 2.Traumatismos da medula espinal 3.Ratos Wistar

USP/FM/SBD268/09

FOLHA DE APROVAO

Juliana Mendes Yule Vicente

Anlise dos eventos tnicos e fsicos do sono dessincronizado em ratos Wistar com leso medular contusa

Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

rea de concentrao: Fisiopatologia Experimental

Aprovada em:______________________

Banca Examinadora

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituio:________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituio:________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituio:________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituio:________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr._________________________________________________________

Instituio:________________ Assinatura:____________________________

Esta tese, que a sntese de um trabalho cientfico pessoal de alguns anos visando obteno do grau de doutor, dedicada com grande afeto e

muitssimo respeito:

Aos pais, Guilherme e Isley

Ao marido, Srgio

Ao filho, Joo

Ao mestre, Csar Timo-Iaria (in memorian)

AGRADECIMENTOS

Considero o processo de elaborao de uma dissertao de doutorado, ser fruto de um esforo coletivo, embora de seu desenho at a finalizao de sua redao, inmeras responsabilidade e stress sejam predominantemente individual. Vrias pessoas contriburam para que este trabalho chegasse neste ponto. A todas elas manifesto minha imensa gratido.

Aos pais, Guilherme e Isley, pelo exemplo a ser seguido e pela doao de educao e instruo que sem dvida a origem deste processo de amadurecimento profissional e pessoal.

Ao marido, Srgio, pelo incentivo incansvel, sem o qual vrias das minhas conquistas no aconteceriam como aconteceram.

Ao filho, Joo, pela razo do meu viver.

s tias: Claudete, pela crena interminvel e pelo brilho nos olhos ao me incentivar e apoiar a cada tombo e derrapagem. Eliza, pela alegria de me ensinar a ver as coisas como elas podem vir a ser. Cleusa, que mesmo como tia postia e agregada manifestou seu orgulho e me incentivou a nunca desistir.

amiga Gabiroba, pelo tombo, pelo afago, pela coragem, pela determinao, pela tcnica e muito, muito mais.

Ao Prof. Dr. MaVi, pelo puxo de orelha e pelas aulas da escola da vida.

Prof. Dra. Cinthia Itiki, pela recepo calorosa e acolhedora.

Ao Prof. Dr. Tarcsio Eloi Barros Filho. e Dr. Rafael Marcon, pela autorizao e apoio na utilizao do NYU Impactor no LETRAN.

Ao Prof. Dr. Irineu Tadeu Velasco, pela autorizao de uso de material e processamento histolgico no LIM-51.

s tcnicas, Ftima e Sueli, pelo processamento do material histolgico no LIM-51.

Prof Dra. Elia Tamaso Espin Garcia Caldini, pelo incentivo e orientao.

Aos iniciantes cientficos, Taisa, Vivian e Victor, pela opo escolhida.

secretaria da Fisiopatologia Experimental, Tnia e Snia.

CAPES, pela contemplao da bolsa institucional.

orientadora, Dra. Angela Valle, pela oportunidade.

Querem que vos ensine o modo de chegar cincia verdadeira? Aquilo que se sabe, saber que se sabe; aquilo que no se sabe, saber que no se sabe; na

verdade este o saber.

(Confsio)

RESUMO

Aps a leso medular (LM) ocorre reorganizao estrutural local e em mltiplos nveis do sistema nervoso central (SNC). Comprometimento das funes sensrio-motoras bem como alteraes significativas de outras funes neurais so normalmente relatadas aps um trauma seguido de LM. Os ritmos circadianos, em especial, o ciclo viglia-sono so freqentemente afetados aps um trauma ou interveno no SNC, no entanto, poucos estudos tem relacionado a influncia da leso medular sobre a fisiologia do sono. Estudos fisiopatolgicos so atualmente baseados em modelos experimentais os quais tem possibilitado o esclarecimento dos mecanismos subjacentes a vrios fenmenos biolgicos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo apresentar, primeiramente, uma anlise sistemtica do ciclo viglia-sono em um modelo animal de LM contusa moderada e, em segundo lugar, por ser o sono dessincronizado uma fase importante pela ocorrncia de movimentos espontneos, estudar detalhamente a influencia da LM sobre os eventos tnicos e fsicos desta fase. Para tal, foram realizados registros eletroscilogrficos das reas corticais sensrio-motora (A7) e hipocampais (CA1) de ambos os hemisfrios e, registros eletromiogrficos dos trapzios, elevadores da asa do nariz, gastrocnmios e epicantos oculares. Os resultados mostraram significativo aumento na quantidade total das fases sono sincronizado (p

ABSTRACT

After a spinal cord injury (SCI), structural reorganization occurs locally and at multiple levels of the central nervous system (CNS). Compromising of sensory motor functions and significant alterations of other neural functions are normally related after a SCI. The circardians rhythms, specially the sleep-wake cycle are frequently affected after a trauma or intervention in CNS. Few studies have approached contusive SCI in sleep physiology. Nowadays, physiopatological studies are based on experimental models which offer several possibilities to obtain new signs related to mechanisms to several biological phenomena. Thus, the present research aimed to present a systematic analysis of the sleep-wake cycle in a SCI animal model to detail the influence of SCI over tonic and phasic events during desynchronized sleep (DS), since this sleep phase is important for the occurrence of spontaneous movements. In order to do that, electroencephalogram (EEG) records of the sensory motor cortex (A7) and dorsal hippocampus (CA1) of both hemispheres were carried out, and electromyography (EMG) records of the trapezium, rostrum, gastrocnemius and eyes. The results showed significant increase of total time of synchronized sleep (p

i

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Foto de soquete e eltrodos........................................................ 27

Figura 2 Representao grfica cartesiana das reas cito-arquitetnicas 28

Figura 3 Representao grfica do crtex frontal do encfalo de rato...... 29

Figura 4 Representao esquemtica dos msculos utilizados para implante........................................................................................

30

Figura 5 Representao por fotos das etapas do procedimento cirrgico de implantao de eltrodos enceflicos.....................................

32

Figura 6 Foto de ventilador criado para secagem de acrlico.................... 33

Figura 7 Foto do aparato NYU Impactor para procedimento de leso medular........................................................................................

34

Figura 8 Apresentao de traado de 20 segundos de viglia atenta pr-leso medular ..............................................................................

49

Figura 9 Apresentao de traado de 20 segundos de viglia relaxada pr-leso medular .......................................................................

50

Figura 10 Apresentao de traado de 20 segundos de sono sincronizado pr-leso medular...................................................

50

Figura 11 Apresentao de traado de 20 segundos da transio do sono sincronizado para sono pr-paradoxal pr-leso medular ..........

51

Figura 12 Apresentao de traado de 20 segundos de sono dessincronizado pr-leso medular ............................................

52

Figura 13 Apresentao de traado de 20 segundos de viglia atenta ps-leso medular...............................................................................

52

Figura 14 Apresentao de traado de 20 segundos da transio de viglia relaxada para sono sincronizado ps-leso medular........

53

Figura 15 Apresentao de traado de 20 segundos da transio de sono sincronizado para sono pr-paradoxal ps-leso medular..........

53

ii

Figura 16 Apresentao de traado de 20 segundos de sono dessincronizado ps-leso medular.............................................

54

Figura 17 Representao grfica do tempo total e nmero de fases do ciclo viglia-sono da anlise longitudinal pr e ps leso medular .......................................................................................

57

Figura 18 Representao grfica dos ciclos completos e incompletos da viglia-sono da anlise longitudinal pr e ps leso medular ......

58

Figura 19 Representao grfica dos eventos fsicos do sono dessincronizado da anlise longitudinal pr e ps leso medular........................................................................................

65

Figura 20 Apresentao grfica dos trechos de dois segundos utilizados para anlise espectral e a representao das trs bandas de freqncia utilizada na anlise longitudinal pr e ps leso medular e entre grupos com e sem eventos fsicos durante o sono dessincronizado..................................................................

67

Figura 21 Representao grfica da freqncia delta da anlise longitudinal pr e ps leso medular e entre grupos com e sem eventos fsicos durante o sono dessincronizado........................

69

Figura 22 Representao grfica da freqncia beta da anlise longitudinal pr e ps leso medular e entre grupos com e sem eventos fsicos durante o sono dessincronizado........................

72

Figura 23 Representao grfica das freqncias sigma e beta da anlise longitudinal pr e ps leso medular e entre grupos com e sem eventos fsicos durante o sono dessincronizado........................

74

Figura 24 Representao grfica da evoluo da escala BBB ps leso medular........................................................................................

79

Figura 25 Foto da histologia por Cresil Violeta do posicionamento dos eltrodos hipocampais.................................................................

80

Figura 26 Representao grfica por Blox Plot da descrio histolgica de caracterizao da leso medular............................................

81

iii

Figura 27 Foto da histologia por Hematoxilina Eosina da caracterizao da leso medular e imuno-histoqumica por GFAP para caracterizao de comportamento glial aps leso medular.......

82

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Tempo e ocorrncia de nmero de fases, em cada fase do ciclo viglia-sono..................................................................................

56

Tabela 2 Quantidade de ciclos de viglia-sono: total, completos e incompletos.................................................................................

58

Tabela 3 Quantidade de transies de sono para as demais fases do ciclo viglia-sono..........................................................................

61

Tabela 4 Quantidade dos diversos tipos de eventos fsicos durante o sono dessincronizado.................................................................

64

Tabela 5 Freqncia de registros EEGs, banda , em cada regio e lado mensurado..................................................................................

68

Tabela 6 Freqncia de registros EEGs, banda , em cada regio e lado mensurado..................................................................................

71

Tabela 7 Freqncia de registros EEGs, banda /, em cada regio e lado mensurado..........................................................................

73

Tabela 8 Potncia dos registros EEGs, banda , em cada regio e lado mensurado..................................................................................

76

Tabela 9 Potncia dos registros EEGs, banda , em cada regio e lado mensurado...................................................................................

77

Tabela 10 Potncia dos registros EEGs, banda /, em cada regio e lado mensurado........................................................................

78

Tabela 11 Intensidade dos achados na medula espinhal aps leso da medula espinhal..........................................................................

81

v

LISTA DE SIGLAS

VA Viglia atenta

VR Viglia relaxada

SS Sono sincronizado

PP Sono pr-paradoxal

SD Sono dessincronizado

LM Leso medular

EEG Eletroencefalograma

EOsG Eletroscilograma

OMS Organizao Mundial da Sade

CVS Ciclo viglia-sono

SNC Sistema nervoso Central

SPI Sndrome das pernas inquietas

RF Formao Reticular

LCa Locus Cerleo

PGO Ponto genculo ocipitais

SLD Ncleo pontino sub-laterodorsal

NGC Ncleos gigantocelular

RPC Ncleo caudal da rafe

RPO Ncleo oral da ponte

GFAP Protena cida fibrilar glial

A7 Crtex associativo sensrio motor

CA1 Hipocampo dorsal

C Msculo trapzio

R Rostrum

vi

O Olhos

PPe Pata posterior esquerda

PPd Pata Posterior direita

CROPP Eventos fsicos dos grupos musculares Cabea, Rostrum, Olhos e Patas

vii

SUMRIO

1. INTRODUO ...................................................................................... 1

1.1 Ciclo Viglia-Sono Sono........................................................................ 5

1.2 Leso Medular ..................................................................................... 15

2. OBJETIVO.............................................................................................. 25

3. MTODO ............................................................................................... 26

3.1 Animais................................................................................................. 26

3.2 Implante de Eltrodos........................................................................... 26

3.2.1 Eltrodos........................................................................................... 27

3.2.2 Coordenadas Estereotxicas............................................................. 28

3.2.3 Implante Musculares......................................................................... 29

3.2.4 Anestesia ......................................................................................... 30

3. 2.5 Assepsia .......................................................................................... 31

3.2.6 Procedimento Cirrgico..................................................................... 31

3.2.7 Profilaxia............................................................................................ 33

3.2.8 Manuteno dos animais ................................................................ 34

3.3 Leso Medular...................................................................................... 34

3.3.1 Anestesia.......................................................................................... 35

3.3.2 Laminectomia.................................................................................... 35

3.3.3 Assepsia............................................................................................ 36

3.3.4. Nvel de leso ................................................................................. 36

3.3.5 Profilaxia............................................................................................ 37

3.3.6 Manuteno dos animais................................................................... 37

3. 4 Registros eletroscilogrficos................................................................ 37

3.4.1 Habituao ....................................................................................... 37

3.4.2 Registros eletroscilogrficos.............................................................. 38

viii

3.5 Anlise comportamental........................................................................ 39

3.5.1 Etologia.............................................................................................. 39

3.5.2 Escala BBB........................................................................................ 40

3.6 Anlise espectral ................................................................................. 41

3.7 Histopatologia....................................................................................... 42

3.7.1 Colorao por violeta cresil................................................................ 43

3.7.2 Colorao HE ................................................................................... 43

3.7.2 Dosagem de GFAP............................................................................ 44

3.8 Anlise estatstica................................................................................. 45

4. RESULTADOS........................................................................................ 47

4.1 Ciclo viglia-sono................................................................................... 47

4.1.1 Caractersticas eletrofisiolgicas....................................................... 47

4.1.2 Tempo total............................................................................................. 54

4.2 Nmero de fases do ciclo viglia sono ................................................. 55

4.3 Ciclos completos e incompletos........................................................... 55

4.4 Transio entre fases.......................................................................... 59

4.4.1 Alternncia da viglia para as demais fases do ciclo viglia-sono...... 59

4.4.2 Alternncia de sono para as demais fases do ciclo viglia-sono....... 60

4.5 Eventos fsicos.................................................................................... 63

4.6 Anlise espectral do SD....................................................................... 66

4.6.1 Freqncias...................................................................................... 66

4.6.1.1 Banda delta (0.5 4.0 Hz).......................................................... 66

4.6.1.2 Banda teta (5,0 11,0 Hz).......................................................... 70

4.6.1.3 Banda sigma e beta....................................................................... 70

4.6.2 Potncias.......................................................................................... 75

4.6.2.1 Banda delta.................................................................................... 75

ix

4.6.2.2 Banda teta..................................................................................... 75

4.6.2.3 Banda sigma e beta....................................................................... 75

4.7 Escala BBB.......................................................................................... 79

4.7 Histopatologia....................................................................................... 80

5. DISCUSSO.......................................................................................... 83

5.1 Ciclo viglia-sono.................................................................................. 83

5.2 Anlise Espectral.................................................................................. 89

5.3 Escala BBB.......................................................................................... 92

5.4 Histopatologia....................................................................................... 93

6. CONCLUSO.......................................................................................... 94

7. ANEXOS................................................................................................. 95

8. REFERNCIAS........................................................................................ 97

1

1. INTRODUO

O sono de indivduos portadores de leso medular (LM) ou qualquer

limitao motora tem recebido maior ateno por parte de especialistas. As

alteraes no sono influenciam diretamente a qualidade de vida dos portadores

de LM. So vrios os fatores que influenciam o sono; estresse, ansiedade, que

surgem por modificao do estilo de vida. As alteraes no padro do sono

relacionam-se com o comprometimento da capacidade de locomoo

independente e com o prejuzo na interao social

Segundo dados da Organizao Mundial de Sade (OMS) de 2001, o

nmero de pacientes com LM que apresenta algum tipo de transtorno do sono

alto, representando um elevado custo para a rea da sade (70 bilhes

anuais nos EUA) (Smith e Haythornthwaite, 2004). Indivduos portadores de LM

apresentam uma queixa comum referentes de dificuldade de dormir. Estes

indivduos apresentam frequentemente sndrome das pernas inquietas,

queixam-se de espasmos, dificuldade de iniciar e manter o sono, roncos,

freqentes, despertares nas horas iniciais da manh e como conseqncia

incapacidade de retornar ao sono, e durante o dia estes sentem-se cansados e

sonolentos (De Mello e cols., 1996; Bara-Jimenez e cols., 2000; Clemens e

cols., 2006; Bampi e cols, 2008;).

Podemos assim elencar alguns fatores negativos exibidos em

portadores de LM para a qualidade do sono como a posio de dormir supina,

tendncia obesidade e uso de sedativos. Em tetraplgicos, apnia obstrutiva

do sono e desaturao de oxignio arterial contribuem para a interrupo do

2

sono e pode ser responsvel por diversos sintomas diurnos de desconforto.

(Biering-Srensen e Biering-Srensen, 2001). Todos estes aspectos dificultam

a reintroduo destes indivduos na sociedade e geram um grande desafio para

a economia no sentido de que suas capacidades produtivas esto diminudas,

assim como, os custos se mantm aumentados e em asceno para os

cuidados aos quais so necessrios para a sua manuteno.

Ressalta-se o fato de que a LM a qual, normalmente, causa um

acentuado comprometimento das funes sensrio-motoras promove, tambm,

alteraes significativas de outras funes neurais, nas quais se inclui os ritmos

circadianos, em especial, o ciclo viglia-sono (CVS). Estas funes esto

frequentemente afetadas aps leses ou qualquer tipo de interveno no

sistema nervoso central (SNC) (Scheer e cols., 2006; Kim e cols., 2006;

Herbert e cols. 2007; Esteves e cols., 2007).

Algumas evidncias sugerem a existncia de uma estreita correlao

entre as alteraes do sono e LM, contudo, no se sabe, ainda, como o sono e

seus componentes so influenciados, tampouco como eles podem influenciar

outras funes e o comportamento aps a LM (Biering-Srensen e Biering-

Srensen, 2001; De Mello e cols., 2002; Scheer e cols., 2006; Esteves e cols.,

2007).

Um importante fato observado em indivduos com LM consiste no

aumento da movimentao das pernas durante o sono dessincronizado,

tambm chamado de sono paradoxal ou sono REM Rapid Eyes Movements,

sobretudo, aps reabilitao e atividade fsica.

3

Essa movimentao das pernas durante o sono conhecida como

Sndrome das pernas inquietas (SPI). A SPI pode ser um distrbio tanto

primrio como secundrio. A forma primria da SPI frequentemente

hereditria enquanto que a secundria esta principalmente associada com

uremia, deficincia de ferro, gravidez, alm de ultimante ter sido associada com

LM (De Mello, 2007, Scheer e cols., 2002). A maioria dos pacientes com SPI

apresentam tambm uma movimentao peridica das pernas durante o sono.

A patognese de ambos os eventos de movimentao de pernas prvia e

durante o sono continua especulativa. (Hartmann e cols., 1999). Existe a

possibilidade de a SPI ser apenas um achado coincidente em pacientes com

LM.

Entretanto, existem associaes temporais estreitas entre o incio da

movimentao das pernas com paraparesias. Aps a realizao de cirurgia

para a remoo das massas lesionais das paraparesias ocorre o

desaparecimento completo da SPI ou mudanas severas de acordo com a

evoluo clnica da mielopatia posterior ao procedimento cirrgico o que

reafirma uma suposta relao de causa e efeito entre LM e SPI. (Lee e cols.,

1996)

Pesquisas revelam que a atividade fsica e exerccios podem ser

importantes para uma reduo do risco nas condies de comorbidades da SPI

(Silva e cols., 1995). Entretanto, os efeitos de tais exerccios na severidade da

SPI ainda so desconhecidos. Alm disto, o tratamento atual da SPI

primeiramente de natureza farmacolgica. Recentemente pesquisas tm

mostrado que programas de exerccios mostram-se eficaz na melhora dos

4

sintomas da SPI. (De Melo e cols., 1999; Esteves e cols., 2004; Aukerman e

cols., 2006).

Os estudos clnicos tm apresentado informaes relevantes, porm

limitadas, que no permitem uma interpretao adequada ou completa da

fisiopatologia comum ao sono e LM. Dessa forma, torna-se imprescindvel a

busca por modelos experimentais que mimetizem os diversos aspectos desses

fenmenos e possibilitem o estudo aprofundado dos mecanismos subjacentes

s relaes entre eles.

Na atual prtica de pesquisa, so os modelos experimentais um

instrumental valioso para a busca de ferramentas capazes de sugerir indcios

de respostas conclusivas para diversas perguntas. Estes modelos podem ser

definidos como a materializao de uma parte da realidade, por meio da

representao simples de uma ocorrncia recente ou antiga.

O desenvolvimento de modelos experimentais torna-se importante na

medida em que estes auxiliam na compreenso dos fenmenos naturais. Na

cincia mdica permitem o melhor conhecimento da fisiologia, da etiopatogenia

das doenas, da ao de medicamentos ou dos efeitos das intervenes

cirrgicas. Sua maior importncia est relacionada ao respeito barreira tica

de no interveno primria experimental em anima nobile. Nesse sentido, o

modelo experimental deve ser funcionalmente, o mais semelhante possvel ao

que se objetiva estudar (Ferreira e cols., 2005).

Existem diversos modelos experimentais utilizados em pesquisas

clnico-cirrgicas, tais como, culturas de clulas e tecidos (pesquisa in vitro),

animais de laboratrio (pesquisa in vivo) e estudos anatmicos, geralmente em

cadveres de seres humanos (Hochamann e cols., 2004).

5

1.1. Ciclo Viglia-Sono

O estado de viglia se manifesta subjetivamente pela concincia do que

ocorre no meio externo ou no prprio corpo. O alerta, no se caracteriza por

componentes motores e necessariamente no envolve manifestaes motoras,

so os estmulos externos (seja sensorial ou de ateno) ao organismos que

definem o comportamento motor ou no. O alerta inespecfico permite a

programao de um comportamento seqencial e exploratrio (Morgane e Ster,

1972).

J durante o sono, a principal caracterstica a grosso olhar a

imobilidade. Ao contrrio do se imagina nesta fase o sistema nervoso sede

de intensa atividade, Para manuteno deste comportamento de quietude, o

sistema nervoso processa inibio de vrias funes e ativao de outras.

Alternando-se ritmicamente com o estado de viglia, o sono se desenrola em

diversas fases consecutivas que se repetem ciclicamente (Hodes e Suzuki,

1965).

A gnese do sono uma questo que vem ocupando pesquisadores h

muitos anos. Tanto que na antiguidade era considerada a possibilidade de que

o sono fosse causado pela sada da alma do corpo material. Desde aquela

poca so vrias as hipteses para a explicao do sono. Aristteles

acreditava que o sono ocorria por evaporao de matria nutritiva, para aliviar

o corao que para ele era sede da mente (Timo-Iaria, 1992).

No sculo XVIII Willis e Morgagni aventaram a hiptese de que o sono

ocorresse por congesto cerebral, isto , por acmulo de sangue no sistema

6

nervoso central (SNC). J no sculo XIX, Howel acreditava que o sono

resultasse do contrrio, isto , de anemia do SNC (Timo-Iaria, 1992).

Com a descoberta da sinapse por Cajal, acreditava-se que o sono

resultava da retrao dos botes terminais, desligando os neurnios essenciais

ao estado de viglia. Um pouco mais tarde, Pavlov aventou a hiptese de

inibio cortical. J nos fins do sculo XIX, Mauthner props a hiptese de que

o sono resultava do bloqueio ativo das informaes sensoriais ao crtex

cerebral. A criao da eletrencefalografia, nos anos de 1920 e 1930, por Hans

Berger, favoreceu o estudo dos mecanismos do sono e suas manifestaes.S

ento a proposta de Mauthner foi abordade na dcada de 30 por Bremer, que

reafirmou, por meio experimental, que na transeco mesenceflica ocorria

visualizao eletroscilogrfica de sono no crtex cerebral, o crebro isolado

(Valle, 1992, Valle, 1995).

Uma vez postulada a hiptese de coexistncia de sono e leso da regio

mesodienceflica, Mauthner e Von Economo admitiam que exisita nessa regio

neurnios capazes de produzirem sono. Essa hiptese sugere que o

hipotlamo anterior quem contm um centro gerador ou pelo menos

facilitador de sono, enquanto que o hipotlamo posterior abriga um centro

alertante (Timo-Iaria, 1992).

Em medos dos anos 50, Monnier e Pappenheimer verificaram a

produo de peptdeos que causam sono no lquido cfalo-raquidiano e

espaos ventriculares. Em seguida, so dcadas de pesquisas descrevendo

cada uma novas descobertas com relao a funo do tronco enceflico na

gerao do sono (Timo-Iaria, 1992).

7

A estimulao eltrica em diversas reas como o ncleo lateral do

tlamo e tegmento mesenceflico (Parmeggiani e Zanocco, 1963), rea pr-

ptica, ncleo caudado, ncleos anteriores da rafe (Morgane e Stern, 1972),

interfeririam diretamente no sono, com induo ou com abolio do mesmo.

Concomitante descoberta dos centros geradores ou abolidores de

sono tambm se descreve o sono dessincronizado (SD), e se inicia uma

grande produo cientfica em diversas reas de conhecimento, como a

neurofisiologia, neuroanatomia e neurofarmacologia.

Loomis, Harvey e Hobart (1930), fisiologistas americanos, realizaram o

primeiro estudo sistemtico dos padres eletrencefalogrficos durante o sono

humano, e descreveram as fases do que denominamos sono sincronizado ou

sono de ondas lentas (Valle, 1992, Valle, 1995).

Outrossim, na Frana, em 1950, Passouant descreveu, pela primeira

vez, o sono dessincronizado; fato detalhado, trs anos depois (em 1953), por

Kleitman e Aserinsk. O sono dessincronizado, em humanos, foi chamado de

sono REM e definido por movimentos oculares rpidos. O resto do sono foi

chamado de sono no-REM, sem movimento ocular rpido (Jankel e

Niedermeyer, 1985).

Muitas pesquisas consideravam que o sono REM representa o sono

mais profundo, primariamente pelos achados que para a ocorrncia do

despertar seria necessrio um estmulo muito intenso durante o sono REM do

que durante o sono sincronizado (sono de ondas lentas) (Aserinsky e Kleitman,

1953). Posteriormente, foi confirmado que o estmulo para exibio de

8

movimentos cortico-espinhais baixo em animais acordados, aumenta no

animal sonolento e ainda maior no animal dormindo (Hodes e Suzuki, 1965).

Jouvet demonstrou interesse pelo estudo do sono REM, chamado de

paradoxal em gatos, pelo fato de este apresentar a caracterstica da

dessincronizao, tal como na viglia (Jouvet, 1967).

A dessincronizao cortical consiste em aumento da frequncia dos

potenciais e reduo de sua voltagem o que indica uma evidente ativao

neuronal; a sincronizao, ao contrrio, caracteriza-se pela presena de ondas

de baixa frequncia, mas de alta voltagem, o que, em geral, significa reduo

da ativao neuronal (Roldan e Weiss, 1962; Timo-Iaria e cols., 1970; Valle e

cols., 1992).

Um dos primeiros estudos do ciclo viglia-sono em ratos data de 1962,

quando Roldan e Weiss, produziram um relato preliminar. Eles descreveram 3

diferentes fases do ciclo por meio de eletroencefalograma (EEG): 1) baixa

freqncia e alta voltagem no neocrtex, hipocampo e formao reticular. 2)

dessincronizao cortical e ritmo teta no hipocampo e formao reticular

durante o sono. 3) viglia combinada com dessincronizao neo-cortical e

tambm ritmo teta durante comportamento ativo ou dessincronizao no

hipocampo.

Uma vez identificado padres eletroscilogrficos no rato, a utilizao

deste animal como modelo tornou-se de extensa produo cientfica. Desde

ento, a estrutura do ciclo viglia-sono em roedores tem sido amplamnete

estudada nas ltimas quatro dcadas (Jouvet, 1963, 1967; Timo-Iaria e cols.,

1970; Clancy e cols., 1978; Timo-Iaria e cols., 1990; Valle e cols., 1992;

9

Gottesman, 1992; Valle, 1992 e 1995; Giuditta e cols., 1995; Esteves e cols.,

2004; Esteves e cols., 2007; Lesku e cols., 2009).

A classificao do sono, em fases bem definidas, (sono de ondas lentas

e sono REM), reflete a predominncia estatstica dos respectivos padres

eletroscilogrficos1, visto haver evidente oscilao desses padres ao longo do

tempo.

O rato adulto um animal de hbitos noturnos com maior prevalncia de

viglia, principalmente viglia atenta (VA) durante os comportamentos

exploratrios e sono diurno (Rosemberg e cols., 1976; Coenen e cols., 1983;

Andersen e Tufik, 2003). Assim, por meio de mtodos de implantes crnicos de

eltrodos bipolares em mltiplos pontos do encfalo e minuciosa anlise

eletroscilogrfica, foi possvel realizar a caracterizao do ciclo viglia-sono de

ratos (Timo-Iaria, 1970). Tal caracterizao possibilitou descrever as fases e os

estados, classificando-os em: viglia atenta (VA) e relaxada (VR); sono

sincronizado (SS), de acordo com a prevalncia de fusos (S), fusos e ondas

delta (SW) e ondas delta (W); sono pr-paradoxal (PP) e sono dessincronizado

(SD) (Timo-Iaria e cols., 1970, Valle 1992, Valle e cols., 1992, 1995, Santos e

cols., 2008).

De acordo com esses estudos, os ratos apresentam ciclos completos e

incompletos; os primeiros ciclos de uma seqncia de registros

eletroscilograficos apresentam alta variabilidade quanto durao dos ciclos

1Em nosso laboratrio, criou-se a expresso eletroscilogramas (EOsGs), para denominar as oscilaes de potenciais de populaes neuronais de qualquer regio do sistema nervoso, incluindo o eletrocardiograma, eletroencefalograma, eletroespinograma, etc. Eletroscilograma substitui com grandes vantagens a expresso atividade eltrica cerebral, imprpria, pois restringe a atividade ao crebro e exclui as demais regies enceflicas e medula espinhal.

10

de sono e a sequncia de estgios, quando, ento, os ciclos so geralmente

incompletos e o sono dessincronizado frequentemente irregular e breve.

Quando eles se tornam completos, a variabilidade da durao diminui e a

sequncia de fases tende a ser mais regular. Durante o dia, a viglia atinge

20% da durao do ciclo; o sono sincronizado 60%; o sono pr-paradoxal 7% e

o sono dessincronizado 14% (Roldan e Weiss, 1962; Parmeggiani e Zanocco,

1963; Timo-Iaria e cols., 1970; Clancy e cols., 1978).

Os estudos sobre esse tema progrediram em conjunto com o imenso

salto tecnolgico que teve como marco inicial a segunda metade do sculo XX,

permitindo o aprofundamento dos conhecimentos sobre os processos da viglia

e do sono, o que favoreceu uma descrio detalhada do SD, que se caracteriza

por uma constelao de eventos os quais incluem: (1) um padro de

dessincronizao da atividade eletroencefalogrfica cortical; (2) um ritmo teta

no hipocampo; (3) acentuada atonia nos msculos posturais; (4) potenciais de

campo na ponte, ncleo geniculado lateral e crtex occiptal espcula ponto-

genculo-occiptal (PGO); (5) movimentos rpidos dos olhos; (6) espasmos

mioclnicos, mas aparentes na face e musculatura de membros distais; e (7)

oscilaes cardiorespiratrias acentuadas (Roldan e Weiss, 1962; Vertes,

1981, 1984 e 1988, Giuditta e cols., 1995).

Conforme relatos, no sono dessincronizado de ratos, o crtex pr-frontal

est, sobretudo, dessincronizado, enquanto as ondas teta aparecem sobre

outras reas corticais e hipocampais. Uma das principais caractersticas do

sono dessincronizado a dessincronizao cortical equivalente da viglia e

ritmo teta hipocampal (Parmeggiani e Zanocco, 1963; Timo-Iaria e cols, 1970,

Clancy e cols., 1978).

11

Achados tm sido revisados e discutidos em detalhes, apontando que:

(1) a dessincronizao cortical do sono dessincronizado controlada pela

regio mesenceflica da formao reticular (RF); (2) o ritmo teta hipocampal

controlado pelos ncleos oral pontinos da formao reticular (RF); (3) a tonia

muscular controlada pela rea peri-alpha do locus cerleo (LCa); (4) as

ondas PGO so, primariamente, controladas pela rea 10 (A10); os

movimentos oculares rpidos so controlados pelo ncleo peri-abducem da

formao reticular (RF); abalos musculares pelo ncleo gigantocelular e caudal

do ncleo caudal da ponte; e (7) respostas caridiorespiratrias encontram-se

sob o controle do complexo parabraquial (Vertes, 1981 e 1984, Velayos e cols.,

2007).

A completa atonia muscular e a ocorrncia de movimentao

espontnea de vrios segmentos do corpo constituem-se caractersticas muito

importantes do sono dessincronizado. Tais alteraes, na atividade tnica

espontnea, so similares s mudanas nos reflexos espinhais proprioceptivos.

importante esclarecer que reflexos monossinptico e polissinptico so

tonicamente deprimidos durante o sono dessincronizado. Esses efeitos

ocorrem devido ao aumento da inibio exercida por estruturas supraespinhais

no arco reflexo espinhal, manifestando, consequentemente, a atonia no sono

dessincronizado (Gassel e cols., 1964; Gassel e cols., 1965).

Durante o sono dessincronizado, paradoxalmente, os abalos mioclnicos

da musculatura somtica apresentam ativao muscular pelo aumento da

atividade fsica em diferentes estruturas, que se projetam para a medula

espinhal, ativando motoneurnios-, tais como: os do trato piramidal, do ncleo

rubro, da formao reticular e os ncleos vestibular lateral e medial (Gassel e

12

cols., 1964). A ativao muscular fsica de tal via descrita, por diversos

autores, como uma manifestao onrica durante o sono dessincronizado

(Timo-Iaria e cols., 1990; Slegel e cols., 1990; Valle, 1992; Valle 1995; Simes

e cols., 1996; Timo-Iaria, 1997; Coenen, 2002).

Ressalta-se que estudos voltados descrio dos mecanismos do sono

dessincronizado em ratos demonstraram que o ncleo pontino sub-laterodorsal

(SLD) (que equivalente ao cerleo e sub-cerleo em gatos) a principal

estrutura responsvel pela atonia observada durante o sono(Boeve e cols.,

2007). Neurnios glutamatrgicos do SLD projetam-se para interneurnios na

medula oblonga e medula espinhal, recaem para os motoneurnios do corno

ventral, produzindo hiperpolarizao, o que resulta na atonia durante o sono

dessincronizado (Taepavarapruk e cols., 2003, 2008).

A maioria das espcies estudadas (humanos Slegel e cols., 1991;

Koyama e cols., 1994; gatos Shouse e Siegel, 1992; Mrquez-Ruiz e

Escudero, 2008; ratos Simes e cols., 1996; Koyama 2001) apresentam

abalos e atividade motora localizada (eventos fsicos) durante o sono

dessincronizado, geralmente relacionado atividade onrica, embora a intensa

inibio promovida por centros pontinos e bulboespinhais resulte em completa

atonia.

Verificou-se, nos estudos em ratos em nosso laboratrio, que os

movimentos do focinho, durante o sono dessincronizado, caracterizam a

atividade onrica e predominam acentuadamente sobre a dos olhos, a relao

de 3:1, o que sugere que o rato, como animal macrosmtico, tem muito mais

sonhos olfativos e tcteis do que visuais (Timo-Iaria, 1990).

13

Em outra pesquisa, conduzida em nosso laboratrio, avaliou-se a

prevalncia de movimentao de vrias partes do corpo do rato durante o sono

dessincronizado, o que se deu na seguinte ordem: focinho (62%), olhos (26%),

patas anteriores (6%), orelhas (3.8%), cabea (1,2%) e patas posteries (1%)

(Timo-Iaria, 1995).

O ritmo teta hipocampal constitui-se uma das caractersticas

eletroscilogrficas do sono dessincronizado. Ele apresenta um padro

sinusoidal da atividade eltrica com frequncias que abrangem dos 5 aos

10Hz. Aparentemente, o ritmo teta est presente no sono dessincronizado e

durante condies de viglia, em todos os mamferos. O teta da viglia, por

exemplo, parece estar associado com movimentos voluntrios no rato e no

cachorro; com processos atencionais no gato e com o despertar no coelho

(Vertes 1984 e 1995; Velayos e cols., 2007).

A descoberta do ncleo oral da ponte, como principal foco de gerao

deste ritmo, advm de um trabalho em que foram estimulados os ncleos

gigantocelular (NGC), caudal (RPC) e oral da ponte (RPO). O POR, quando

estimulado, aumentou, tanto a voltagem como a frequncia do ritmo teta, de 6

para 9Hz (Vertes, 1981).

Alm desses fatos, existe uma relao estreita entre movimentos fsicos

durante o sono dessincronizado e ritmo teta hipocampal. Por ocasio da

movimentao fsica, ocorre um evidente aumento na voltagem e frequncia

do ritmo teta hipocampal (Sano e cols., 1973; Sei e Morita, 1996). Em ratos,

acredita-se que esse ritmo influencie na modulao plstica e eficcia

sinptica. Alm disso, pesquisas sugerem que a frequncia e a amplitude do

14

ritmo teta hipocampal sejam controladas por diferentes ncleos envolvidos,

diferentemente, no processo de aprendizado e memria. Presume-se, portanto,

a existncia de um gerador comum de eventos fsicos durante o sono

dessincronizado (Timo-Iaria e cols., 1997; Karashima e cols., 2004;

Montgomery e cols., 2008).

Nesse sentido, surge, ento, uma hiptese sobre um gerador de eventos

fsicos que altera a dinmica do ritmo teta hipocampal. De fato, existe uma

regio na formao reticular, o ncleo tegmento-pednculo-pontino, que

poderia afetar a dinmica dos eventos fsicos, como, tambm, o ritmo teta

hipocampal (Datta, 2000).

Percebe-se que essas caractersticas fsicas do sono dessincronizado

parecem preservadas em animais que sofreram trauma, independente do

segmento medular, apesar de a LM significar a interrupo do fluxo de

informaes sensorial e motora.

Para resumir o tpico, o sono um estado peridico de quiescncia, na

qual h um processamento mnimo de informao sensorial e nenhuma

interao com o ambiente ou outrm. Ainda que o sono tenha uma marca

registrada como a suspenso de atividade do estado de viglia, ele mais do

que a ausncia de estar acordado ele um processo regulado. Mantendo-se

o estado de viglia h o aumenta propenso (tambm conhecida como

presso de sono), como exemplo: necessidade ou prontido para dormir,

apesar de que o excesso de sono tenha um efeito contrrio. Considerando o

tempo gasto no sono, em humanos aproximadamente um tero da vida, este

processo deve ser importante.

15

Todavia, o propsito e funo do sono esto entre o mais obscuros dos

problemas da neurocincia e biologia. Nos ltimos 50 anos, muito tem se

descoberto sobre a estrutura do sono, muitos candidatos para induo qumica

endgena do sono tem sido propostos e interaes circadianas e

homeostticas influenciam a regulao do sono j foi esclarecida. Entre as

explies do propsito do sono, duas principais, porm no exclusivas e

mutuamente, a hiptese que domina a literatura: que o sono restaurador

para o metabolismo cerebral e que ele serve como consolidador de memria.

Muitas peas destes quebra-cabeas so conhecidas, mas nem todas revelam

a figura final.

1.2. Leso Medular

A leso medular (LM) considerada um assunto de abrangncia nos

contextos social, econmico e psicolgico. Seus efeitos so devastadores para

o indivduo portador, para a sociedade e para o Estado. O custo econmico e

social para o atendimento de pessoas portadoras de LM assombroso, pois

soma o atendimento mdico-hospitalar de urgncia ao perodo de reabilitao.

Nos Estados Unidos, existe desde 1937 o National Spinal Cord Injury

Database, que registra informaes oriundas de 21 centros federais de

atendimento a pacientes com LM. Por seus dados, estima-se que a incidncia

anual de LM est entre 30 e 40 casos novos por milho de habitantes. Para

uma populao em torno de 158.000.000 habitantes, poderamos imaginar

cerca de 6.000 casos anuais no Brasil. A prevalncia estimada em torno de

16

700 casos por milho de habitantes, o que daria uma populao de 100.000

pessoas convivendo com esse problema em nosso pas (Vialle e cols., 1999).

As leses medulares so cada vez mais freqentes devido

principalmente ao aumento da violncia urbana. Dentre as causas, o acidente

de trnsito e a agresso por arma de fogo so as mais comuns. Os pacientes

acometidos, em sua maioria, so jovens, do sexo masculino, solteiros e

residentes em reas urbanas. Tais leses causam perda parcial ou total da

motricidade, sensibilidade e funes autonmicas (vasomotora, intestinal,

vesical e sexual). Alm de sua gravidade e irreversibilidade, exigem um

programa de reabilitao longo e oneroso, que na maioria das vezes no leva

cura, mas adaptao do indivduo sua nova condio (Greve, 1999; Bampi

e cols., 2008).

A histria nos mostra que por ocasio da I Guerra Mundial, soldados

com LM completa no sobreviviam. Aps 3 anos de leso, 80% dos soldados

britnicos com paraplegia traumtica morreram. Os sobreviventes eram

doentes crnicos e extremamente dependentes e, por suas perspectivas serem

to lgubres, no foram desenvolvidos programas de reabilitao intensos.

Mesmo nos anos iniciais da II Guerra Mundial, a maioria dos soldados e civis

com LM morriam de sepsia entre 2 e 3 anos, devido a infeces na bexiga e

rins e lceras de decbito, consequncias, essas, inevitveis nas leses

medulares naquela poca (Guttmann, 1976 apud Houle e Tessler, 2003).

Tendo em vista que 94% dos pacientes com LM sobrevivem ao primeiro

ano aps a leso, e dos que sobrevivem ao perodo de hospitalizao em

unidades especiais, 93% so suficientemente independentes e apresentam

condies de retornar sociedade (DeVivo, 2002).

17

Para a Organizao Mundial de Sade (OMS), qualidade de vida a

percepo do indivduo de sua posio na vida, no contexto da cultura e

sistema de valores nos quais ele vive e em relao aos seus objetivos,

expectativas, padres e preocupaes (Andrade, 2001).

No Brasil, ainda so poucos os trabalhos relacionando qualidade de vida

e leso medular. No entanto avaliar a qualidade de vida de grande

importncia para essas pessoas. Uma das principais ferramentas utilizadas

mundialmente para a avaliao de qualidade de vida o questionrio SF-36.

(Ciconelli, 1999). Porm, este questionrio no avalia a qualidade e eficcia do

sono nestes indivduos, a qual uma importantssima medida de qualidade de

vida.

Posteriormente, elaborou-se o instrumento World Health Organization

Quality of Life 100 (WHOQOL100) e sua verso abreviada o WHOQOL-bref

de 1998. No estudo indito no Brasil, Bampi e cols., pesquisaram em nossa

populao de lesados medulares por meio deste questionrio e desta vez,

quantificaram a medida sono. E para a surpresa o resultado manifestou uma

boa qualidade de sono naquela populao, o qual os autores descrevem como

sono preservado (Bampi e cols., 2008).

Mesmo com este incio no seguimento de pesquisas que relacionam

sono e LM ainda so raros os estudos que observem a fisiologia do sono.

Sabe-se, entretanto, que alteraes fisiolgicas e psicolgicas causadas pela

LM podem levar a mudanas no padro do sono. Brito realizou um

levantamento que mostra que 43% dos indivduos com LM apresentam

distrbio de sono.

18

Desse modo, as estratgias de reabilitao motora devem ser

otimizadas visando melhorar a qualidade de vida e favorecer condies para

execuo das tarefas do dia-a-dia e, por consequncia, para que ocorra o

retorno ativo no papel scio-econonmico (Rossingnol e cols., 2007).

Para Hulsebosch (2002), a LM uma ocorrncia devastadora e pode

apresentar uma variedade de efeitos fisiopatolgicos dependendo da gravidade

e o nvel espinhal da leso. As conseqncias da LM causam debilitamento

fsico, dependncia e, consequentemente, perda de auto-estima

As disfunes motoras e sensoriais distais, abaixo do nvel da LM, so o

resultado final de um processo fisiopatolgico complexo e se distingue em trs

fases: aguda, secundria e crnica.

A fase aguda abrange o momento da leso e se extende por alguns

dias, ocasio em que se inicia uma imensa variedade de processos

fisiopatolgicos. Essa fase comea imediatamente aps leso mecnica a qual

afeta, tanto o tecido neuronal (neurnios e glias) assim como o endotlio

celular e vascular. Como resultado do insulto mecnico e isqumico ocorre

morte celular por necrose e, consequentemente, na leso contusa, parece

estar mais evidente na substncia cinzenta do que na substncia branca, uma

vez que, normalmente a sustncia cinza danificada visualizada envolta por

um anel de substancia branca preservada no stio da contuso (Hulsebosch,

2002; Smith e cols., 2006).

Nos minutos que se seguem aps a leso inicial, o potencial de ao

das clulas neuronais sofre uma interrupo induzida pela leso. Essa

caracterstica de barreira eltrica ocorre devido substituio eletroltica,

19

envolvendo, especialmente, ctions monovalentes de Na+ (a concentrao

intracelular aumenta), K+ (a concentrao extracelular aumenta) e Ca2+ (a

concentrao intracelular aumenta a nveis txicos), contribuindo com a falha

na funo neuronal, o que leva ao choque medular. Esse choque dura at 24

(vinte e quatro) horas e representa falha generalizada da circuitaria neuro-

espinhal (Anderson e Hall, 1993; Hulsebosch, 2002; Hubscher e Johnson,

2006).

Ainda na fase aguda da LM, ocorre hemorragia com edema localizado,

perda da microcirculao por trombose, vasoespasmo e leso mecnica, alm

da perda da auto-regulao vascular. Todos esses eventos exacerbam a leso

neuronal (Hulsebosch, 2002; Smith e cols, 2006).

Na fase secundria (que ocorre ao longo de minutos a semanas), as

caractersticas fisiopatolgicas so a morte celular isqumica, substituio

eletroltica e o edema contnuo da fase aguda. Aps 15 minutos de leso,

ocasionadas pela destruio celular, as concentraes extracelulares

glutamatrgicas e outros aminocidos excitatrios atingem concentraes

txicas que so de seis a oito vezes maiores que o nvel basal. Alm disso, as

vias mediadas por glutamato, perioxidao lipdica e produo de radicais livres

tambm ocorrem como resultado da ativao dos receptores glutamatrgicos,

subsequentemente (Anderson e Hall, 1993; Hulsebosch, 2002; Becker e cols.,

2003).

Outra caracterstica da fase secundria a apoptose que ocorre e

envolve gliose reativa que inclui o aumento da expresso da protena cida

fibrilar glial (GFAP) e proliferao astrocitria. Somado a isso, os neutrfilos

20

secretam mieloperoxidase que invadem o parnquima espinhal em 24 horas,

seguidos por linfcitos (os quais secretam uma variedade de citocinas e fatores

de crescimentos) que invadem e atigem picos mximos em 48 horas. Essa

invaso de clulas inflamatrias aumenta a concentrao local de citocinas

(cito = clula; cina = pequena protena) e quimiocinas (citocinas quimiotxicas).

Alm disso, fatores inibitrios e/ou barreiras regenerao so expressas no

stio peri-lesional. A leso cresce em tamanho a partir da regio central, onde

ocorreram as mortes celulares das clulas em risco ou em apoptose na regio

peri-lesional, criando-se uma regio mais ampla de provvel morte celular

(Anderson e Hall, 1993; Hulsebosch, 2002).

Finalmente, na fase crnica, que se caracteriza ao longo de dias a anos,

continuam os processos de apoptse em ambas as direes, antergradas e

retrgradas, incluindo regies enceflicas; a variedade de receptores e canais

inicos alterados em seus nveis expressos e estatos ativos, favorece a

formao cicatrizes e barreiras fsicas na medula; a desmielinizao resulta em

uma condio debilitante; formam-se cistos em regies adjacentes leso

(20%); a recuperao axonal ocorre e se extende por apenas 1mm; circuitos

neuronais mantm-se alterados devido a mudanas na informao aferente e

eferente, tanto inibitria quanto exitatria; e, em muitos outros tipos de clulas,

desenvolve-se hiper-excitabilidade permanente, resultando em dor crnica na

maioria dos pacientes com LM (Anderson e Hall, 1993; Christensen e cols.,

1996 e 1997).

Classicamente, neurnios do sistema nervoso central foram

considerados incapazes de processos de regenerao. Hipteses indicavam

que projees centrais de fibras de aferncia primria poderiam se ramificar na

21

medula espinhal. Ou seja, aps todas as fases descritas acima, ou

concomitante a elas, h uma tentiva intrnseca de recuperao do sistema

nervoso central (Anderson e Hall, 1993; Hulsebosch, 2002).

A habilidade intrnseca de neurnios do sistema nervoso central est

embasada, essencialmente, na presena de protenas envolvidas nos processo

de alongamentos de neurites (protena associada ao crescimento - GAP-43,

expresso imediata por genes recentes, e a proto-oncogene - Bcl-2) para

demonstrar a regenerao axonal (Hulsebosch, 2002). Em algumas

populaes neuronais, sobretudo naquelas sem mielina, pode ocorrer a

regenerao em ramificao na medula espinhal (Christensen e cols., 1996 e

1997).

H indcios que esta habilidade seja mediada pela reorganizao

estrutural do espraiamento no sistema motor, na recuperao espontnea da

funo motora. Essa remodelao compensatria ocorre em mltiplos nveis do

sistema nervoso central (Raineteau e Schwab, 2001).

Tais habilidades espontneas foram observadas no crtex

sensoriomotor de adultos, em resposta a alteraes nas aferncias sensoriais

perifricas ou manipulao comportamental. Muitas linhas de pesquisa

sugerem que a conectividade sinptica no crtex sensoriomotor pode estar

modificada aps LM. Observou-se, nos estudos experimentais de leses

espinhais utilizando gatos e primatas, a redistribuio do mapa cortical de

representao sensorial (Zai e cols., 2005). Exames de imagem funcional e

estimulao magntica transcraniana demonstram significantes alteraes na

22

conectividade entre o crtex motor e a medula espinhal em humanos, assim

como, nas leses medulares (Kim e cols., 2008).

O substrato celular e/ou anatmico sobrevivente ao processo de LM e a

possvel induo de plasticidade cortical ainda no foram totalmente

esclarecidos. O desmascaramento e a potencializao de conexes existentes

podem contribuir para a plasticidade em curto perodo de tempo Alm disso,

alteraes na conectividade cortical, por meses a anos, podem envolver

crescimento de novos axnios e processos dendrticos (Florence e cols., 1998).

De acordo com estudos de Kim e cols. (2006 e 2008) as mudanas

dinmicas na densidade e morfologia dos espinhos dendrticos participam na

reorganizao da conectividade sinptica do crtex motor aps LM. Vias

neurais neocorticais sofrem um desarranjo dinmico em resposta a leses ao

sistema nervoso; esse desarranjo, entretanto, pode promover alteraes na

funo cortical, incluindo a reorganizao sensorial e motora aps a LM.

Informaes aferentes sensoriais para o encfalo ficam alteradas e

reduzidas, aps LM, como resultado de um trauma aos neurnios na medula

espinhal. Essa deaferentao est associada com a reorganizao das

estruturas espinhais para ajustar as mudanas nas funes sensrio-motoras

do encfalo (Christensen e Hulsebosch, 1997). Vale esclarecer que a perda da

informao aferente pode resultar em tentativas de reorganizao que permite,

a ela mesma, ser responsvel pela plasticidade neuronal, levando a processos

patolgicos (Herbert e cols., 2007). Para exemplificar, alguns autores revelaram

a relao entre a plasticidade neuronal do crtex somatossensorial e o

desenvolvimento de sndromes de dor crnica pela exibio de aumento na

23

plasticidade em ambos os domnios, motor e somatossensorial, em amputados

com dor fantasma no membro amputado (Lendvai e cols., 2000; Endo e cols.,

2007; Kim e cols., 2008;).

Outros estudos indicam a existncia de alteraes na atividade eltrica

de regies enceflicas aps LM e tm-se demonstrado que pessoas com LM

apresentam alteraes na atividade neuronal talmica, incluindo regies do

tlamo que perderam a aferncia devido LM comparada com indivduos no-

lesados, (Lenz e cols. 2000; Endo e cols., 2007).

Tambm, estudos em modelos animais demonstraram mudanas na

atividade talmica e cortical no processamento de informaes somato-

sensoriais aps LM (Weng e cols., 2000; Gerke e cols., 2003).

Tais pesquisas, tanto em humanos como em modelos animais, revelam

que a LM encontra-se associada alterao dos ritmos nos circuitos tlamo-

corticais.

Ressalta-se, que a eletroencefalografia (eletrocorticogramas) apresenta-

se como um importante e poderoso instrumento nos estudos de plasticidade

cortical, alm de permitir a identificao de processos patolgicos.

Entretanto, apesar de algumas infomaes que sugiram a partir de

estudos eletrofisiolgicos em pacientes portadores de traumas existem lacunas

importantes para uma melhor compreenso dos mecanismos fisiopatolgicos

subjacentes aos processos de LM. Poucos estudos correlacionam as variaes

nos registros eletroencefalogrficos humanos basais aps LM. Em um estudo

bastante elegante os autores encontraram uma reduo na atividade do ritmo

24

alfa (8-13Hz) e em sua magnitude total de banda, em pessoas com LM (Tran e

cols., 2003).

Herbert e cols. (2007) observaram uma diminuio significativa na banda

alfa e aumento na banda beta, na tentativa de avaliar todas as bandas de

frequncias do eletroencefalograma humano, aps LM. Os mesmos autores

sugerem que, aps LM, no ocorrem alteraes significativas nas bandas de

baixas frequncias (delta e teta).

Admite-se que o melhor animal para essas experincias seja o rato e

que a nica forma de comparar resultados a partir de leses padronizadas e

em grande volume de espcimes (Vialle e cols., 2002; Tebet e cols., 2003;

Diante da relevncia de se conhecer os mecanismos subjacentes a esse

fenmeno e, assim, propiciar subsdios para melhor compreenso da interao

de sono e LM, propomo-nos, primeiramente, apresentar uma anlise

sistemtica do ciclo viglia-sono de ratos portadores de LM contusa moderada

e, na sequncia, estudar detalhamente a influncia da LM sobre os eventos

tnicos e fsicos do sono dessincronizado (SD), visto essa fase do sono ser

importante pela ocorrncia de movimentos espontneos.

25

2. OBJETIVO

Poucos estudos relacionam a influncia da leso medular contusa

incompleta na fisiologia do sono.

Diante da relevncia de se conhecer os mecanismos subjacentes a esse

fenmeno e dessa forma propiciar subsdios para melhor compreenso da

interao de sono e leso medular, propomo-nos:

primeiramente, apresentar uma analise longitudinal do ciclo

viglia-sono de ratos portadores leso medular contusa moderada;

em segundo lugar, por ser o sono dessincronizado a fase do sono

em que observa-se a ocorrncia de movimentos espontneos,

estudar detalhadamente a influncia da leso medular sobre os

eventos tnicos e fsicos do sono dessincronizado.

26

3. MTODO

3.1. Animais

Para o presente estudo foram utilizados dez (10) ratos Wistar (Ratus

norvergicus) adultos jovens, machos com peso entre 250 a 280gr no incio do

protocolo, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo (FMUSP).

Os ratos eram mantidos em caixas individuais e em condies

controladas de temperatura (24C) e ciclo de 12 horas claro-escuro (7:00 s

19:00), alimentao e gua eram oferecidos ad libitum. Todos os

procedimentos experimentais foram aprovados pela Comisso de tica para

Anlise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital da Clnicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (HC-FMUSP) sob n

827/05.

3.2. Implante de Eltrodos

A fim de se registrar os eletroscilogramas de algumas regies do

sistema nervoso central concomitantemente com os movimentos expressos

durante os comportamentos exploratrios e durante o sono dessincronizado

27

dos animais, foi realizada cirurgia estereotxica para implante crnico de

eltrodos e posterior monitoramento eletrofisiolgico.

3.2.1. Eltrodos

Os eletrodos, bipolares de derivao curta eram confeccionados com fio

de nquel-cromo 150m de dimetro e totalmente isolados com teflon montados

em pares solidrios paralelos. Nos eletrodos corticais as pontas eram dobradas

em T e nos terminais, o isolamento era removido em cerca de 0,5 mm de

extenso. Os eletrodos sub-corticais eram mantidos paralelos ate as

extremidades distais, que eram cortadas de modo que as duas pontas, sem

isolamento, distassem 0,5 mm uma da outra. As extremidades proximais dos

eletrodos eram soldadas aos pinos de um soquete fmea de 32 pinos, cortado

para abrigar as 20 conexes (10 pares de eletrodos) do presente protocolo

(Figura 1).

D

Figura 1: A: Soquete preparado com eltrodos corticais e musculares; B: Eltrodos sub-corticais; C e D: Escala para eltrodo corticais e sub-corticais.

28

3.2.2. Coordenadas Estereotxicas

Os eltrodos foram implantados no crtex associativo sensrio-motor

(A7) e hipocampo dorsal (CA1) de ambos os hemisfrios.

Para implantao no encfalo era feito, com broca de 1/8, orifcios com

cerca de trs milmetros de dimetro nas posies previamente determinadas

segundo coordenadas do mapa cortical (A7: AP=-3,5mm; L=4,0mm) ou do

mapa estereotxico para os eletrodos sub-corticais (CA1, AP=-3,8mm;

L=2,0mm; H=3,0mm) (Figuras 2 e 3).

Figura 2: Grfico cartesiano com a representao esquemtica das regies corticais do rato de acordo com as reas cito-arquitetnicas segundo Krieg, 1946 (lado direito) e reas funcionais segundo Zilles, 1990 (lado esquerdo). Escalas a direita e acima em milmetros, em relao aos zeros estereotxicos anteroposterior (AP) e mdiolateral (L), respectivamente. Local de implante cortical - rea somato-sensorial (A7) destacada em amarelo na figura.

29

Figura 3: Esquema de corte frontal do encfalo de rato em que aparece a regio hipocampal dorsal (CA1). O posicionamento para implante dos eletrodos sub-corticais esta destacada em amarelo na figura.

3.2.3. Implantes Musculares

Os registros musculares foram obtidos por meio de eltrodos de 70m

implantados nos msculos trapzios, elevadores da asa do nariz, epicantos

oculares e gastrocnmios (Valle e cols., 1992; Valle, 1995; Andersen e cols.,

2001) (Figura 4).

Os eletrodos destinados ao registro dos movimentos oculares eram

suturados subcutaneamente nos cantos externos dos olhos e os do rostrum

eram conduzidos por agulha de injeo ate a musculatura elevadora da asa do

nariz. Os eletrodos para registro da movimentao da cabea eram suturados

nos msculos trapzios de cada lado e dos membros eram suturados nos

gastrocnmicos, levados por uma agulha 9x100, no interior da qual eram

conduzidos sob a pele desde o soquete (onde eram soldados) ate os msculos.

30

Figura 4: Desenho esquemtico dos grupos musculares do rato nos quais eram implantados os eletrodos para monitoramento dos movimentos. A: Trapzio; B: Rostrum; C: Olhos; D: Gastrocnmios.

3.2.4. Anestesia

O implante de eltrodos era realizado durante cirurgia estereotxica sob

anestesia de Ketamina (0,2,g/100gr, ip) precedida de Diazepam

(0,1mg/100gr, ip) e anestesia local (Xilestesin 0,5ml 2% com vasoconstritor)

aplicada subcutaneamente na regio da inciso. O efeito anestsico iniciava-se

em aproximadamente cinco minutos e tinha durao de cerca de duas horas;

em seguida eram feitas suplementaes com 10% da dose anestsica inicial

de ketamina a fim de se manter o grau anestsico adequado durante todos os

procedimentos cirrgicos. O plano anestsico profundo era confirmado pela

ausncia dos reflexos da crnea e pela ausncia de reao compresso da

cauda.

31

3.2.5. Assepsia

Era realizado tricotomia na regio da cabea, pescoo e patas

posteriores dos ratos, seguida por assepsia local com digluconato de

clorexidina 2% (Hioex).

3.2.6. Procedimento cirrgico

Aps fixao do animal no estereotxico (David KopfTM), era realizada

uma inciso longitudinal mediana desde a regio nasofrontal at a lambdide,

em seguida a pele era rebatida, a facia removida para exposio das suturas

da calota craniana e do bregma. Os pontos a serem trepanados eram

marcados na calota de acordo com as coordenadas estereotxicas de Paxinos

e Watson (1997). Para as trepanaes utilizou-se furadeira Dremel e broca de

1/8 com cuidado para no lesar a dura-mter. Uma vez implantados, os

eltrodos eram soldados a um conector fmea que posteriormente era fixado

no crnio dos ratos com meta-acrilato de polimerizao rpida (Figura 5).

32

A B C

D E F

G H I

Figura 5: A. Esquema do crnio do rato fixado no aparelho estereotxico pelas barras auriculares, introduzidas no conduto auditivo externo para impedir a mobilizao da cabea para os lados, para frente e para trs, e pela presilha nasal, que impede a movimentao para baixo e para cima. B. Inciso da pele, a fim de expor a superfcie ssea do crnio (a) barra auricular introduzida na orelha direita e a presilha (p) que imobiliza cabea, impedindo movimentos para cima e para baixo, o maxilar superior mantido imvel pelo pinamento entre a presilha (p) e a barra inferior (b). C. Exposio do crnio, com os pontos selecionados para a perfurao e introduo de eltrodos. A sutura bregmtica (b) um marco que permite calcular a posio dos implantes. D. Perfurao de um dos pontos de implantao, (br) broca na castanha do motor, j penetrando no osso parietal. E. Posicionamento do eltrodo hipocampal com fixao por acrlico. F. Posicionamento e fixao dos eltrodos corticais. G. Implantao dos eltrodos para registro dos movimentos oculares; a agulha introduzida no ponto de implante e levada at a regio subcutnea. H. Aspecto final dos procedimentos de implante dos eltrodos. I. Preparo do rato para registro.

O procedimento cirrgico era realizado sob rigoroso controle de tempo e

suplementaes anestsicas (Anexo 1 Ficha Cirrgica). O tempo total do

procedimento cirrgico inicialmente era de aproximadamente dez horas. Neste

tempo eram necessrias de seis a oito suplementaes com Ketamina

33

(0,2,g/100gr, ip). A fim de se acelerar as etapas finais dos procedimentos

cirrgicos e com isso prevenir problemas respiratrios nos ratos devido

hipersecreo produzida pelo anestsico, foi desenvolvido um aparato para

auxiliar na secagem do meta-acrilato. O aparato consistia em um conjunto de

ventiladores montados em serie e soldados a uma haste a qual era fixada nas

torres do estereotxico (Figura 6). Tal recurso reduzia em at trs horas a

cirurgia de implante de eletrodos.

A

B

Figura 6: A: Vista diagonal do aparato para acelerao de secagem do meta-acrilato durante o procedimento cirrgico para implante de eltrodos. B. Idem, vista lateral.

3.2.7. Profilaxia

Como conduta profiltica administrava-se, via intramuscular 25mg/kg de

Cefaloxina 1g (Keflin Neutro - Ely Lilly), imediatamente aps cirurgia de

implante de eltrodos e durante cinco dias subseqentes.

Aps a cirurgia de implantes os animais eram mantidos aquecidos at

completa recuperao anestsica.

34

3.2.8. Manuteno dos animais

Os animais eram mantidos em gaiolas plsticas individuais de 60X40cm,

sob condies adequadas de higiene com gua e rao a vontade (Anexo 2

Etiqueta de Identificao).

3.3. Leso Medular

O procedimento de LM era realizado no 11. dia aps a cirurgia de

implante de eltrodos e um (1) dia aps o registro eletroscilografico basal. Para

este estudo, adotou-se o modelo experimental de LM do Multicenter Animal

Spinal Cord Injury Study (MASCIS) padronizado para ratos Wistar por meio de

equipamento New York University (NYU) ImpactorTM (Rodrigues, 1999) (Figura

7).

A

Fonte: Prospectos do NYU Impactor

B

Fonte Rodrigues, 1999

Figura7: A. Vista latero-diagonal do aparato NYU Impactor para realizao do procedimento de LM contusa controlada e padronizada. B. Posicionamento do rato no NYU Impactor.

35

3.3.1. Anestesia

O animal era anestesiado com Ketamina (0,2,g/100gr, ip) precedido de

Diazepam (0,1mg/100gr, ip), e, localmente, lidocana (Xilestesin 0,5ml 2%

com vasoconstritor). O efeito anestsico iniciava-se em aproximadamente cinco

minutos e tinha durao de aproximadamente duas horas; tempo suficiente

para realizao do procedimento cirrgico para LM. O plano anestsico

profundo era confirmado pela ausncia dos reflexos da crnea e pela ausncia

de reao compresso da cauda.

3.3.2. Laminectomia

A exposio da medula para contuso era realizada com auxlio de

microscpio cirrgico. Aps a tricotomia, realizava-se uma inciso na linha

mdia dorsal para expor os arcos posteriores da coluna vertebral, da 8

vrtebra torcica (T8) 12 vrtebra torcica (T12). Os msculos inseridos nos

processos espinhosos e nas lminas da 9 vrtebra torcica (T9) 11 vrtebra

torcica (T11) eram divulsionados e desinseridos. Os processos articulares

destas vrtebras eram expostos. A homeostasia, quando necessria, era

realizada com um coagulador bipolar (Xilestesin 0,5ml 2% com

vasoconstritor). Em seguida eram removidos, com micro saca-bicados, o

processo espinhoso e a lmina da 10 vrtebra torcica (T10) e a metade do

processo espinhoso de T9 at expor a medula e permitir o posicionamento da

36

ponta da haste do NYU-Impactor e um peso de 10g era liberado de 25mm de

altura sobre a medula espinhal exposta a fim de se reproduzir uma leso

contusa moderada (NYU Spinal Cord Contusion System, 1993) (Basso e cols.,

1996). Aps o procedimento a pele era suturada e os animais eram mantidos

aquecidos at completa recuperao anestsica e choque medular.

3.3.3. Assepsia

A laminectomia no nvel torcico T9-T10 foi precedida por tricotomia e

assepsia do local com digluconato de clorexidina 2% (Hioex).

3.3.4. Nvel de leso

As leses medulares realizadas nesta pesquisa, foram leses

moderadas por meio de equipamento especializado para o impacto por queda

de peso NYU-Impactor. O modelo de impacto consiste na queda de haste de

peso de 10g de peso de altura pr-estabelecida de 25mm entre a ponta da

haste e a superfcie da medula espinhal, por meio de um tubo guia, de maneira

a reduzir os fatores de impreciso.

O aparelho foi construdo de modo a produzir um impacto de direto de

alto rendimento, reduzir atritos e a resistncia do ar, permitindo uma contuso

reproduzvel (Rodrigues, 1999).

37

3.3.5. Profilaxia

Antibiticoterapia era administrada via intramuscular 0,1/100g de

Cefaloxina 1g (Cefazolin) imediatamente aps a cirurgia e uma vez ao dia por

sete dias. O esvaziamento vesical manual era realizado duas vezes ao dia por

duas semanas.

3.3.6. Manuteno dos animais

Os animais eram mantidos em gaiolas plsticas individuais de 60X40cm,

sob condies adequadas de higiene, alimentao e hidratao. A manuteno

dos animais em gaiola individuais durante todo o experimento possibilitou uma

melhor adaptao e reduo da agressividade e das auto-mutilaes

(autofagias).

3.4. Registros eletroscilogrficos

3.4.1. Habituao

Para se obter registros eletroscilogrficos que reproduzissem da melhor

forma possvel todos os padres comportamentais da viglia e sono, os ratos

38

eram submetidos a sesses de habituao por dois dias antes do registro

basal. Durante a habituao os animais eram levados sala de registros onde

eram mantidos por 2hs dentro de uma gaiola de Faraday de alumnio

(40X40X40cm) em cujo teto se encontrava o conector por meio do qual o

animal era acoplado ao cabo de registro do aparelho eletroencefalgrafo. A

parede anterior da cmara era livre e permitia a observao visual do rato

3.4.2. Registros eletroscilogrficos

Os registros com durao de 6hs eram realizados entre 9h e 15h,

perodo de maior incidncia de sono no rato. Os eletroscilogramas eram

obtidos por meio de um aparelho eletroencefalgrafo (EEG) Nihon-Kohden de

21 canais modelo NK 4400 acoplado a um sistema computacional com placa

de converso analgico-digital CAD12/32 de 12 bits e programa de aquisio

de sinais biolgicos AqDados da Lynx Tecnologia Eletrnica (So Paulo).

As bandas de corte para os registros corticais e sub-corticais eram entre

35Hz e 0,1Hz, filtros passa baixa (HF) e constante de tempo (TC),

respectivamente. Para os registros musculares utilizava-se HF de 70Hz e TC

0,003Hz. A freqncia de amostragem era de 256 Hz e, aps o termino dos

registros, os dados eram armazenados em formato de arquivos binrios com

extenso *TEM. Foram utilizadas as rotinas lynxeng.m e lyninfo.m

desenvolvidos anteriormente em nosso laboratrio para leitura dos arquivos em

ambiente MatLab, no qual foi realizado a anlise matemtica.

39

Os eletroscilogramas basais eram realizados no 10 dia ps-implante de

eltrodos e os demais eletroscilogramas eram realizados nos 1, 3, 5, 7 e 14

dias ps-LM.

Concomitantemente a aquisio dos registros, os ratos eram

cuidadosamente monitorados e todos os comportamentos emitidos por eles

eram anotados a fim de se estabelecer uma correlao com os registros. A

identificao e quantificao do ciclo viglia-sono eram realizadas por meio de

anlise visual sendo que a varredura manual inclua a identificao e

contabilizao de eventos de at 0,07s (1mm).

3.5. Anlise comportamental

3.5.1. Etologia

O acoplamento da anlise comportamental com a anlise

eletroscilogrfica fundamental para que se possa descobrir as analogias e

compreender parte do que sucede no sistema nervoso central durante

determinada fase do ciclo.

Para tal, os ratos foram monitorados visualmente e por meio de um

sistema de vdeo-cmera durante os registros. A maioria dos comportamentos

vigis e durante o sono foram marcados para posterior anlise de correlao.

40

3.5.2. Escala BBB

Para avaliar a funo motora em ratos com LM foi utilizada a escala

BBB. A escala BBB uma medida para graduao locomotora na qual dois

avaliadores observam as posies das patas e a deambulao de um animal

em campo aberto por um perodo de 4 minutos. A utilizao deste mtodo

amplamente aceita e reconhecida pela comunidade cientfica como o padro

ouro para este tipo de estudo. Esta escala uma modificao do teste em

campo aberto, a qual foi elaborada para graduar a locomoo de patas

posteriores de zero (nenhum atividade locomotora espontnea) at vinte e um

(movimentao normal e coordenao de marcha com posicionamento paralelo

de membros).

A avaliao funcional pela escala BBB (Anexo 3 Ficha da Escala BBB)

considera os movimentos da articulao do quadril, do joelho, do tornozelo, e a

posio do tronco, do rabo e das patas traseiras. Cada avaliador atribui pontos

de zero a 21 (Basso e cols., 2002; Vialle e cols., 2002; Zai e Wrathall, 2005,

Sedy e cols. 2008).

Atribui-se uma pontuao seqencial e acumulativa de acordo

com a observao de um movimento definido pela escala BBB e com a

freqncia de sua ocorrncia nenhuma (0-5%), ocasionais (

41

com ou sem suporte de peso, coordenao de patas dianteiras com

posteriores, rotao interna e externa e, paralelismo de patas na

predominncia do contato inicial e quando a pata elevada, liberao de

dedos, elevao de calda durante a locomoo e estabilidade do tronco.

A avaliao foi realizada utilizando-se uma caixa de vidro transparente

(80X80X30cm) com fundo forrado com material em cor azul marinho para

proporcionar alto contraste com a cor branca dos ratos. Os ratos eram

avaliados por dois pesquisadores todos os dias em que foram coletados os

registros (1, 3, 5, 7 e 14 POs de LM).

A utilizao desta medida comportamental propiciou uma classificao

do comprometimento da funo motora nas fases de viglia e posterior

correlao com os eventos fsicos do SD.

3.6. Anlise Espectral

Foram selecionados trechos de 2 segundos de durao de sono

dessincronizado com presena (N=4.775) e ausncia (N=2.831) de

movimentos dos vrios segmentos do corpo do animal. A densidade espectral

de potncia desses trechos foi estimada pelo periodograma, que proporcional

ao quadrado do mdulo da transformada discreta de Fourier.

Os picos de maior potncia foram selecionados em trs bandas de

frequncia: delta (0,5Hz 4,0Hz), teta (4Hz 11Hz) e sigma/beta (11Hz

35Hz).

42

Para cada animal, foi salvo um arquivo texto (em formato ASCII, com

extenso.TXT), contendo os valores dos maiores picos de potncia (V2/Hz) e

das correspondentes freqncias (Hz) em cada uma das trs bandas. Alm

disso, foram salvos os valores das potncias acumuladas em cada banda (V2)

e das freqncias medianas (Hz), ou seja, das freqncias que dividem a

densidade espectral de potncia em duas partes de mesma rea (cada uma

com 50% da potncia).

3.7. Histopatologia

Para avaliao da posio dos eltrodos foi utilizada a colorao por

Cresil Violeta e para a caracterizao da LM, foi utilizada a colorao com

hematoxilina-eosina (HE) em cortes transversais e longitudinais,

respectivamente. A reao imuno-histoqumica de expresso da protena cida

fibrilar glial (GFAP) foi utilizada para averiguao do comportamento das

clulas gliais mediante o insulto ao sistema nervoso central no segmento

medular.

A perfuso transcardaca foi realizada com soluo fisiolgica seguida

por soluo de formol a 10% em tampo fosfato de Sorensen (pH neutro). Os

ratos foram profundamente anestesiados com ter etlico P.A. e perfundidos

por aproximadamente 15 a 20 minutos ou at serem perfundidos 250 mL de

soluo. Aps perfuso, o enceflico e a medula espinhal foram removidos e

imersos em soluo fixadora de formol a 10% em tampo fosfato de Sorensen

43

(pH neutro). As amostras permaneceram em soluo fixadora por, no mnimo,

72 horas para desidratao, diafanizao e incluso em parafina.

3.7.1. Colorao por Violeta Cresil.

Na anlise dos hipocampos aps a montagem dos cortes nas lminas

silanizadas, foi aguardado 20 minutos, aproximadamente, para secagem.

Posteriormente as lminas foram imersas para hidratao na seqncia a

seguir por dois minutos cada uma: Xilol I; Xilol II; lcool 100 II; lcool 100 I;

lcool 95 II; lcool 95 I; lcool 70; lcool 50; H2O destilada. Para a colorao

as lminas foram submetidas imerso de corante cresil violeta de dois a sete

minutos e posteriormente lavadas em gua destilada. Iniciou-se a etapa de

desidratao com imerso das lminas por 5 mergulhadas rpidas na

seqncia a seguir: lcool 50; lcool 70; Diferenciador (1ml de cido actico

em 100ml de lcool); Para concluso da desidratao as lminas foram

imersas por um minuto em lcool 70, lcool 96 I, lcool 96 II, lcool 100 I;,

lcool 100 II, xilol I e xilol II. Para a finalizao do processo, as lminas foram

fechadas com blsamo do Canad Permount Entelan

3.7.2. Colorao HE

As lminas de medula foram submetidas ao procedimento padro de

hidratao e imersas em hematoxilina de Harris por seis minutos para iniciar a

colorao. Em seguida, foi realizada a lavagem em gua corrente, aplicao de

44

diferenciador, e novamente lavagem em gua corrente. gua amoniacal foi

utilizada como mordente. Lavagens com gua corrente e lcool 95% foram

feitas mais uma vez para preparar as lminas para imerso em eosina, onde

foram mantidas por 30 a 40 segundos. Depois foram realizados dois banhos de

lcool absoluto e trs banhos de xilol. Para finalizar foi realizada montagem

com lamnulas com Entellan (Merck 1.07961).

Para caracterizao e determinar da extenso da LM foi utilizada a

pontuao de avaliao qualitativa de necrose, hemorragia, neo-

vascularizao, degenerao da substncia micside e infiltrado celular na

escala de (1) ausente, (2) 5 a 25% discreto, (3) 26 a 50% moderado e (4) 51 a

100% intenso (Narazaki e cols., 2003).

3.7.3. Dosagem de GFAP

Cortes longitudinais histolgicos dos ratos (medula e hipocampo) foram

colhidos em lminas silanizadas e, posteriormente, os cortes foram

desparafinados. O mtodo de desmascaramento antignico realizado para os

anticorpos anti-GFAP foi por meio de microondas; A peroxidase endgena foi

bloqueada incubando-se as lminas por 30 minutos em metanol contendo 30%

de perxido de hidrognio PA. Para a marcao imuno-histoqumica do GFAP,

o mtodo utilizado foi o da strepto-avidina-biotina-peroxidase, sendo cada

etapa intercalada por lavagem das lminas em soluo salina tamponada com

fosfato. Os cortes foram incubados, em cmara mida, a 44C, por 16 horas,

com o anticorpo primrio anti-GFAP (Camundongo anti-GFAP clone, cdigo

45

nmero M0761, Dako), padronizado na diluio 1:1000. Posteriormente, foi

realizada a incubao dos cortes por 30 minutos com anticorpo secundrio

biotinilado na diluio de 1:100 e, aps, a aplicao por 30 minutos do

conjugado estreptavidina-biotina-peroxidase (Novostain Super ABC Kit,

Novocastra - EP-ABCU), diludo em soluo salina tamponada com fosfato. Foi

aplicada soluo substrato de peroxidase (3,3 Diaminobenzidine

Tetrahydrochloride DAB, Sigma O5637) por 5 minutos a 37C. Finalmente,

os cortes foram lavados, contra corados com hematoxilina, desidratados,

diafanizados e montados com resina sinttica (Sanchez e cols., 2006). Para

contagem da marcao celular, utilizou-se a contagem em trs campos de

grande aumento (40x), considerando as reas de maior concentrao celular

para determinao da mdia populacional.

3.8. Anlise estatstica

Para a avaliao das variveis do ciclo viglia-sono entre as condies

pr-leso e os 1; 3; 5; 7 e 14. dias ps-leso foi utilizado teste no-

paramtrico de Friedman com ps-teste de Dunn. O tempo total e o nmero de

ocorrncia de cada uma das fases do ciclo viglia-sono; os eventos fsicos do

sono dessincronizado; a transio de sono para as demais fases do ciclo

viglia-sono; transio de viglia para as demais fases do ciclo viglia-sono e

nmero total de ciclos completos e incompletos foram comparados entre as

condies pr e ps-LM.

46

A comparao entre as condies pr e ps-leso das bandas de

freqncias dos eletroscilogramas (, e /) do crtex associativo sensrio-

motor e do hipocampo dorsal foi realizada por meio do teste no-paramtrico

de Kruskal-Wallis, seguido pelo ps-teste de Dunn. A comparao entre os

grupos (Grupo 1: com e Grupo 2: sem eventos fsicos) foi realizada por meio

do teste no-paramtrico de Mann-Whitney. A comparao dos dados

resultantes da pontuao na Escala BBB foi realizada por meio do teste de

Friedman, seguido pelo ps-