· JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS Análise da associação dos perfis de expressão gênica e das...

JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS

Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das

concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento

antitabagismo

Tese apresentada agrave Faculdade de Medicina da

Universidade de Satildeo Paulo para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo

de Doutor em Ciecircncias

Programa de Ciecircncias Meacutedicas

Aacuterea de concentraccedilatildeo Distuacuterbios Geneacuteticos de

Desenvolvimento e Metabolismo

Orientador Prof Dr Paulo Caleb Juacutenior de Lima

Santos

Satildeo Paulo

2020




antitabagismo








Santos

(Versatildeo corrigida Resoluccedilatildeo CoPGr 601811 de 13 de outubro de 2011 A versatildeo original estaacute disponiacutevel na

Biblioteca da FMUSP)

Satildeo Paulo

2020

Dedicatoacuteria

Dedico esse trabalho primeiramente a Deus meu Pai querido que me guia e sempre

me concede ao que haacute de melhor

Aos meus pais Gedeatildeo e Deolinda ao meu marido Sidnei e aos irmatildeos e sobrinhos que

sempre me incentivaram e me apoiaram em todos os momentos

Agradecimentos

Ao meu orientador Dr Paulo Caleb

Obrigada Paulo por ter apostado e confiado em mim eu natildeo tenho palavras

para agradecer diante de tudo que vocecirc me ensinou Hoje me sinto mais confiante e

parte dessa confianccedila devo a vocecirc Obrigada por me ajudar a amadurecer e por ter

sido tatildeo compreensiacutevel em momentos difiacuteceis Te considero mais que um mentor vocecirc eacute

tambeacutem um grande amigo

Ao meu amigo mestrando Paulo Roberto

Muito obrigada por tudo Fico feliz que Deus meu deu a graccedila de ter vocecirc como

amigo A sua participaccedilatildeo foi essencial neste trabalho Obrigada por me ouvir e me

ajudar acredito que ainda faremos muitas coisas juntos

Aos Doutores Alexandre Pereira Jaqueline Issa Patriacutecia Gaya Tacircnia Ogawa

Abe e Regina

Obrigada pelas dicas instruccedilotildees correccedilotildees e pelo conhecimento

proporcionado Jaque Paty Tania e Regina esse estudo natildeo teria existido sem o

excelente trabalho que vocecircs executam no ambulatoacuterio do tabagismo Vocecircs foram

fundamentais

Aos meus amigos do laboratoacuterio de Geneacutetica e cardiologia molecular Leiliane

Emanuelle Mariana Faacutebinho Faacutebio Bruna Gabriela Venturini Pamela Tamiris

Kalliandra Michelle Sabrina Liacutegia Gabriele Darezzo Theacuteo Mauriacutecio Isabela Almir

Fernanda Karina Mariliza Renata Carmona Ana Piesco Ednalva e Andreacuteia e

Maacutercio

Agradeccedilo a instruccedilatildeo e auxiacutelio na parte teacutecnica desse trabalho e muito obrigada

pela amizade companhia conselhos brincadeiras e almoccedilos juntos

Aos doutores Eduardo Costa de Figueiredo Henrique Dipe Faria e Isarita

Martins do LATF (Unifal MG)

Obrigada pela colaboraccedilatildeo neste trabalho Obrigada por esse produto maravilhoso

desenvolvido no laboratoacuterio de vocecircs (o novo RAM) Tenho a certeza que seraacute de

grande aplicabilidade Obrigada pela mensuraccedilatildeo das amostras Henrique muito

obrigada pela paciecircncia em explicar o trabalho que vocecircs realizaram Muito obrigada

pelo tempo disponibilizado e pelos dados fornecidos

Ao Prof Dr Joseacute Eduardo Krieger e ao LGCM (FMUSP)

Obrigada por disponibilizar a infraestutura do laboratoacuterio equipamentos

materiais e reagentes para execuccedilatildeo deste trabalho

Aos membros titulares e suplentes da banca examinadora

Muito obrigada pelo aceite do convite e por todas as sugestotildees e contribuiccedilotildees

Agrave FAPESP agrave CAPES e agrave CNPQ

Agradeccedilo o apoio financeiro para a execuccedilatildeo desse trabalho

A Deus

Pai muito obrigada pelo Senhor ter me dado essa oportunidade maravilhosa O

Senhor sempre me preparou o melhor e creio que continuaraacute preparando Obrigada

por me dar forccedilas em todos os momentos Te amo

Agrave minha famiacutelia

Obrigada por toda compreensatildeo Obrigada pelo apoio e por terem acreditado

na minha capacidade Vocecircs satildeo uma becircnccedilatildeo e essenciais na minha vida Amo vocecircs

Ao meu marido Sidnei

Lindo te amo muito Obrigada por ter me incentivado Obrigada pelos chaacutes

chocolates e comindinhas que vocecirc sempre ia me trazendo enquanto eu estava

escrevendo este trabalho Obrigada por ter me ajudado nas tarefas domeacutesticas tambeacutem

para que eu pudesse ter tempo para me dedicar Obrigada por todo amor carinho e

cumplicidade Vocecirc eacute um marido excelente

ldquoPorque os meus pensamentos natildeo satildeo os vossos pensamentos nem os vossos

caminhos os meus caminhos diz o Senhor Porque assim como os ceacuteus satildeo mais

altos do que a terra assim satildeo os meus caminhos mais altos do que os vossos

caminhos e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos rdquo

Isaiacuteas 5589

Esta tese estaacute de acordo com as seguintes normas em vigor no momento desta

publicaccedilatildeo

Referecircncias adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver)

Universidade de Satildeo Paulo Faculdade de Medicina Divisatildeo de Biblioteca e

Documentaccedilatildeo Guia de apresentaccedilatildeo de dissertaccedilotildees teses e monografias Elaborado

por Anneliese Carneiro da Cunha Maria Julia de A L Freddi Maria F Crestana

Marinalva de Souza Aragatildeo Suely Campos Cardoso Valeacuteria Vilhena 3a ed Satildeo Paulo

Divisatildeo de Biblioteca e Documentaccedilatildeo 2011 Abreviaturas dos tiacutetulos dos perioacutedicos

de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus

SUMAacuteRIO

LISTA DE ABREVIATURAS SIacuteMBOLOS E SIGLAS

LISTA DE EQUACcedilOtildeES

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUCcedilAtildeO 1

11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica 3

12 Faacutermacos antitabagismo 5

121 Vareniclina 6

1211 Farmacodinacircmica 6

1212 Farmacocineacutetica 7

122 Bupropiona 9



13 Pesquisa de biomarcadores 11

131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e bupropiona 12

132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em amostras

bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20

41 Casuiacutestica 20

42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes 23

43 Coleta e armazenamento das amostras dos pacientes tratados com vareniclina e

bupropiona 26

44 Nuacutemero amostral 27

45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com vareniclina 28

451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA 28

452 Siacutentese de cDNA 31

453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo gecircnica 31

454 Ensaio de expressatildeo gecircnica 35

455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica 37

46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-MSMS 38

461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos analitos apoacutes

validaccedilatildeo do meacutetodo 38

462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise 41

463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra 43

464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM 46

4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA 46

4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro 46

4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs 47

465 Paracircmetros espectromeacutetricos 47

466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional 48

467 validaccedilatildeo analiacutetica 49

47 Anaacutelise estatiacutestica 49

5 RESULTADOS 51

51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica 51

511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos 51

512 Dados de expressatildeo gecircnica 53

513 Anaacutelise de associaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica entre os desfechos e os tempos de

tratamento 54

52 Mensuraccedilatildeo dos analitos 58

521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da matriz 58

522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos 60

523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional 61

524 Validaccedilatildeo analiacutetica 64

525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos analitos

69

526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento 72

6 DISCUSSAtildeO 75

61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica 75

62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos 80

7 CONCLUSOtildeES 87

8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS 88

9 REFEREcircNCIAS 89

APEcircNDICE ndash TCLE

ANEXO 1 ndash Aprovaccedilatildeo no Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa

ANEXO 2 ndash Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)

ANEXO 3 - Escore de consumo situacional Issa

ANEXO 4 - Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na

escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo

ANEXO 5 -Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo

da Universidade Federal de Alfenas-MG


API Ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacuterica - Atmospheric pressure ionization

ACTB Gene que codifica a proteiacutena β actina

ANKK1 Gene codificador da proteiacutena quinase envolvida em vias de transduccedilatildeo de sinal

B2M Gene que codifica a microbulina subunidade β2

BC3 Tampatildeo de reaccedilao de transcriptase reversa

BR1 Tampatildeo de ressuspensatildeo

BR2 Tampatildeo de ligaccedilatildeo

BR3 Tampatildeo de lavagem 1


BR5 Tampatildeo de eluiccedilatildeo

BRT Tubos PAXgene

BSA Albumina de soro bovino

[C14] Carbono 14 (isoacutetopo radioativo do carbono de massa atocircmica 14)

cDNA DNA complementar sintetizado a partir de uma moleacutecula de RNA

CHRNA3 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3

CHRNA4 Gene codificador da subunidade α4 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos




CHRNB2 Gene codificador da subunidade β2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos



CHRNG Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade δ

CNTs Nanotubos de carbono - Carbon nanotubes

COMT Gene codificador da enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)

CS ndash SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching

CT Ciclo de linha de base ndash threshold cicle (nuacutemero de ciclo em que a amostra

amplificou)

CYP2B6 Gene codificador do receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ

CYP2B6 Gene codificador da isoenzima CYP2B6

Disco QC Disco para a realizaccedilatildeo do controle de qualidade de amostras que seratildeo utilizadas

para o ensaio de expressatildeo gecircnica

DN Dependecircncia agrave nicotina

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

DNAse Enzima que degrada moleacuteculas de DNA

dNTP Dinucleotiacutedeos dATP dCTP dGTP e dTTP

DRD1 Gene codificador do receptor dopamineacutergico do tipo 1




E Erro relativo

EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico

Escore Issa Escore de consumo situacional Issa

ESI+ Ionizaccedilatildeo positiva por electrospray - positive Electrospray ionization

FDA Orgatildeo de controle de alimentos e medicamentos americano ndash Food and drug

administration

FTND Teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fargestroumlm test for nicotine

dependence

g Velocidade de rotaccedilatildeo em forccedila g a qual considera a aceleraccedilatildeo da gravidade

GDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do disco QC

GE Tampatildeo de degradaccedilatildeo de DNA genocircmico

HGDC Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico do ensaio de expressatildeo gecircnica

HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia ndash High Performance Liquid

Cromatograph

HPLC-MSMS Cromatografica liacutequida de alta eficiecircncia seguida por espectrometria de massas

em tandem ndash High Performance Liquid Cromatograph fowed by tandem Mass

Spectrometric

HPRT1 Gene que codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1

HTR3A Gene codificador da subunidade 3A do receptor de serotonina

HTR3B Gene codificador da subunidade 3B do receptor de serotonina

KV Energia de colisatildeo em quilovolt

LC-MS Cromatografia liacutequida seguida de espectrometria de massas - Liquid

Cromatograph fowed by Mass Spectrometric

LD Limite de detecccedilatildeo

LLE Extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (com o uso de solvente)

LQ Limite de quantificaccedilatildeo

LogP Coeficiente de particcedilatildeo relaccedilatildeo das concentraccedilotildees da substacircncia em um solvente

orgacircnico e em aacutegua dado que ambos os solventes satildeo necessariamente imisciacuteveis

MCT Microtubos de 15 mL

MS Espectrometria de massas - Mass Spectrometric

MRM Muacuteltiplas transiccedilotildees de monitoramento de reaccedilatildeo - multiple reaction monitoring

MSMS Espectrometria de massas em tandem

mz Relaccedilatildeo massacarga dos analitos

nAChR(s) Receptor(es) acetilcoliacutenico (s) nicotiacutenico (s)

NMR Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina ndash Nicotine metabolite ratio

NTC Controle negativo

NTR Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa

OCT2 Transportador catiocircnico orgacircnico

P2 Controle externo de RNA

PAF Programa de Assistecircncia ao Fumante

PBMC Ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico - Peripheral blood mononuclear cell

PCR Amplificaccedilatildeo em cadeia da polimerase

PIs Padrotildees internos

PK Enzima proteinase K

pKa Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido

pKb Valor negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de uma base

PP Extraccedilatildeo por preciptaccedilatildeo de proteiacutenas

PPC Controle positivo de PCR

PRC Coluna de rotaccedilatildeo de RNA vermelho

PSC Coluna de rotaccedilatildeo do homogeneizador lilaacutes

PT Tubo de processamento

RAM Material de acesso restrito ndash restrict access material

Rcf Forccedila centriacutefuga relativa ndash Relative centrifugal force

RDD Tampatildeo de digestatildeo de DNA

RE3 Mix de transcriptase reversa

RNA Aacutecido ribonucleico

RNase Enzima ribonuclease a qual degrada as moleacuteculas de RNA

RNFD Soluccedilatildeo matildee de DNase

RNFW Aacutegua livre de RNase

RFLP Restriccedilatildeo enzimaacutetica - Restriction fragment length polymorphism

RP‐HPLC Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa ndash Reverse-Phase High

Performance Liquid Cromatograph

Rpm Rotaccedilatildeo por minuto

RSD Desvio padratildeo relativo

SLC6A3 Gene codificador da proteiacutena transportadora de dopamina

SLC22A2 Gene codificador da proteiacutena OCT2 transportadora de caacutetions orgacircnicos

(transporta vareniclina)

SNC Sistema nervoso central

SPE Extraccedilatildeo em fase soacutelida

Sty I Enzima de restriccedilatildeo proveniente da Salmonella Typhi

TAE Tampatildeo formado com Tris Acetato e EDTA

TRN Terapia de reposiccedilatildeo nicotiacutenica

UGT2B7 Gene codificador da enzima UGT2B7 a qual metaboliza a vareniclina

UPLC Cromatografica liacutequida de ultra eficiecircncia - Ultra Performance Liquid

Cromatograph

UV Detector ultravioleta

α3 Subunidade alfa 3 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais





β2 Subunidade beta 2 dos receptores acetilcoliacutenicos nicotiacutenicos neuronais


T-1 Visita inicial

T0 Visita de iniacutecio do tratamento (coleta realizada antes de comeccedilar o tratamento no

mesmo dia)

T2 Visita de 2 semanas apoacutes tratamento farmacoloacutegico



TFC Cromatografia liacutequida turbulenta - Turbulent flow-liquid chromatography


∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de CThousekeeping genes) Normalizaccedilatildeo da expressatildeo

gecircnica dos genes alvo atraveacutes de valores de expressatildeo de genes fisioloacutegicos

2-∆CT Transformaccedilatildeo dos valores de ∆CT em escala logariacutetmica para a realizaccedilatildeo

dos testes de hipoacutetese

∆∆CT= (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) Foacutermula

utilizada para posterior caacutelculo de fold change Considera-se os dois grupos

envolvidos no teste de hipoacutetese

2-∆∆CT Transformaccedilatildeo dos dados de ∆∆CT em escala logariacutetmica Atraveacutes dessa

foacutermula se obteacutem o fold change (diferenccedila de expressatildeo entre dois grupos)

NMR=(trans-3-hidroxicotininacotinina) Taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina

NMRlt031=metabolizador lento NMRgt031 metabolizador normal ou raacutepido

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo

otimizados

40

Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados

com vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica

52


com vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo

com o desfecho de tratamento

52

Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os

tempos de tratamento e grupos de desfecho

53

Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de

tratamento e grupos de desfecho

54

Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos

antitabagismo em soro humano

68


com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos

69


com vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de

acordo com o desfecho de tratamento

70


com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos

71

Tabela 10 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes

tratados com bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos

analitos de acordo com o desfecho de tratamento

71

Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes

submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os

medicamentos antitabagismo

72

Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos

pacientes tratados com vareniclina

73

Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de

tratamento com vareniclina

73


pacientes tratados com bupropiona

74


tratamento com bupropiona

74

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e

serotonineacutergicas e sistema de recompensa

2

Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico 4

Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina 5

Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina 7

Figura 5 - Metabolismo da vareniclina em humanos 8

Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona 9

Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativo 11

Figura 8 - Desenho do estudo 22

Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc100 33

Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) 33

Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold 34

Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo

planilhada)

37

Figura 13 - Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) 45

Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de

tratamento e desfecho

56

Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de


57

Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica 58

Figura 17 ndash Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de

BSA

59

Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de

soro diluiacuteda

59

Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas 60

Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de

backflush

62

Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em

aacutegua ultra pura

65

Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com

os analitos no niacutevel meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados

65

Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos


67

Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de


67

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes 25

Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC 34

Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo 36

Quadro 4 - Housekeeping genes 36

Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos 42

Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos 85

RESUMO

Santos JR Anaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica e das concentraccedilotildees

de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismo [tese] Satildeo Paulo

Faculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulo 2020

Introduccedilatildeo O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade

evitaacutevel no mundo Estudos tecircm buscado a identificaccedilatildeo de preditores de resposta aos

tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica Os principais objetivos deste estudo foram analisar a

possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes alvo e das concentraccedilotildees de analitos

(faacutermacos antitabagismo nicotina e seus metaboacutelitos) com a resposta ao tratamento

Meacutetodos Foram incluiacutedos 105 pacientes fumantes que iniciariam o tratamento com

vareniclina (n=74) ou bupropiona (n=31) As anaacutelises de expressatildeo gecircnica foram

realizadas atraveacutes do ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR Array com a inclusatildeo de 17

genes para a anaacutelise em ceacutelulas mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMC) A

preparaccedilatildeo das amostras de soro para a mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada atraveacutes de

uma coluna extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados

com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (material de acesso restrito - RAM) desenvolvida

no LATF Unifal MG A mensuraccedilatildeo dos analitos foi realizada por cromatografia

liacutequida de alta eficiecircncia em modo column switching seguida de espectrometria de

massa em tandem (HPLC-MSMS) Os tempos para a coleta de amostras foram para as

anaacutelises de expressatildeo gecircnica (sangue total) antes de iniciar o tratamento (T0) duas e

quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento (T2 e T4 respectivamente) e para a

mensuraccedilatildeo dos analitos (soro) as amostras foram coletadas na T2 Resultados Para as

anaacutelises de expressatildeo gecircnica selecionamos 14 pacientes que obtiveram sucesso e 13

pacientes resistentes ao tratamento com vareniclina Foi considerado sucesso quando o

paciente alcanccedilava abstinecircncia ao tabaco ateacute a 4 ordf semana de tratamento e resistente

quando o paciente natildeo conseguia parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Foi

observada diferenccedila significativa para a expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo

resistente amostras dos tempos T2 e T4 apresentaram menor expressatildeo comparadas ao

tempo T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente)

Para a mensuraccedilatildeo dos analitos a coluna RAM desenvolvida mostrou alta capacidade

para a remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e de anaacutelise conjunta dos diferentes analitos aleacutem

de poder ser reutilizada diversas vezes (cerca de 400 ciclos) Os pacientes do grupo

resistente tratados com ambos os faacutermacos apresentaram maior concentraccedilatildeo de

metaboacutelitos da nicotina na T2 No entanto natildeo houve associaccedilatildeo dos faacutermacos e seus

metaboacutelitos com desfecho de tratamento Conclusotildees Para as anaacutelises de expressatildeo

gecircnica este estudo exploratoacuterio mostrou um possiacutevel preditor de efetividade no

tratamento com vareniclina reafirmando a associaccedilatildeo da subunidade α7 para os

processos de dependecircncia agrave nicotina e tratamento antitabagismo Estes resultados

podem contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma terapia

individualizada Contudo estudos futuros satildeo necessaacuterios para o entendimento do papel

da subunidade α7 dos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos no tratamento com

vareniclina Para a mensuraccedilatildeo dos analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de

extremo valor cientiacutefico podendo apresentar diversas aplicaccedilotildees em anaacutelise de amostras

com matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das

concentraccedilotildees dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com o desfecho de tratamento satildeo

necessaacuterios estudos com um maior nuacutemero amostral

Descritores Vareniclina Bupropiona Nicotina Abandono do haacutebito de fumar

Expressatildeo gecircnica Biomarcadores farmacoloacutegicos

ABSTRACT

Santos JR Association analysis of gene expression profiles and metabolite

concentrations with response for smoking cessation treatment [thesis] Satildeo Paulo

ldquoFaculdade de Medicina Universidade de Satildeo Paulordquo 2020

Introduction Smoking is considered the largest cause of preventable morbidity and

mortality in the worldwide Studies have sought to identify predictors of responses to

smoking cessation treatments The main objectives of this study were to analyze the

possible association of the expression of target genes and concentrations of analytes

(drugs for smoking cessation nicotine and their metabolites) with the response to

treatment Methods We included 105 smoker patients who would start treatment with

varenicline (n=74) or bupropion (n=31) Gene expression analysis was performed

through custom RTsup2 Profiler PCR array assay including 17 genes for analysis in

peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Serum sample preparation for the

measurement of analytes was performed by an extraction column composed of hybrid

carbon and silica nanotubes modified with the addition of hydrophilic groups (restricted

access material - RAM) developed by LATF Unifal MG The measurement of analytes

was performed by high efficient liquid chromatography in column switching mode

followed by tandem mass spectrometry (HPLC-MSMS) Times for sample collection

were for gene expression analysis (total blood) before start of therapy (T0) two and

four weeks after start of treatment (T2 and T4 respectively) and for measurement of

analytes (serum) the samples were collected at T2 Results For gene expression

analysis we selected 14 patients who had success and 13 patients resistant to the

varenicline treatment Success was considered to be when a patient achieved tobacco

abstinence until the 4th week of treatment and resistant was when a patient had not

stopped smoking as of the 4th week of treatment We observed a significant difference

for CHRNA7 gene expression in the resistant group samples from T2 and T4 had lower

expression compared with T0 (fold change 038 P=0007 fold change 067 P=0004

respectively) For measurement of analytes the developed RAM column showed high

capacity to remove macromolecules and joint analyzes of different analytes besides

being able to be reuse manny times (about 400 cycles) Patients from resistant group of

the both drugs treatment had a higher concentration of nicotine metabolites in T2

However there was no association of drugs for smoking cessation and their metabolites

with outcome treatment Conclusions For gene expression analysis this exploratory

study showed a possible predictor of effectiveness in the treatment with varenicline

reaffirming the association of the α7 subunit for nicotine dependence and smoking

therapy processes These results may contribute at least in part to the development of

individualized therapy However further studies are needed to understand the role of the

α7 subunit of acetylcholinic-nicotinic receptors in varenicline treatment For the

measurement of analytes the new synthesized RAM is a product of extreme scientific

value being able of several applications in the analysis of samples with complex

matrices without much prior preparation For an association of drugs for smoking

cessation and their metabolites with outcome treatment studies with a larger sample

size are needed

Descriptors Varenicline Bupropion Nicotine Smoking cessation Gene expression

Biomarkers pharmacological

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

O tabagismo eacute considerado a maior causa de morbidade e mortalidade evitaacutevel

em todo o mundo 1 Doenccedilas cardiacuteacas cerebrovasculares cerca de um quinto de todos

os tipos de cacircnceres doenccedilas pulmonares como apneia e enfisema aleacutem de distuacuterbios

preacute-natais estatildeo associadas ao consumo do tabaco 2-5

Dados recentes da Vigitel mostraram que no conjunto das 27 capitais brasileiras

a frequecircncia de adultos fumantes foi de 93 com valores duas vezes maior no sexo

masculino (121) do que no feminino (69) As menores frequecircncias foram

encontradas na populaccedilatildeo de jovens adultos (antes dos 25 anos) e em pessoas de mais

de 65 anos As maiores frequecircncias foram encontradas entre homens em Porto Alegre

(173) Campo Grande e Satildeo Paulo (156) 6

A nicotina eacute o principal componente do tabaco causador de dependecircncia Esta

age nos receptores acetilcoliacutenicos-nicotiacutenicos (nAChRs) promovendo a liberaccedilatildeo de

diversos neurotransmissores e neuroreguladores tais como dopamina acetilcolina

epinefrina norepinefrina serotonina beta-endorfina vasopressina e GABA O principal

neurotransmissor estudado eacute a dopamina pois a nicotina promove aumento de seus

niacuteveis na regiatildeo mesocorticoliacutembica cerebral principalmente em um circuito conhecido

como ldquosistema de recompensardquo (aacuterea tegmental ventral nuacutecleo accumbens e coacutertex preacute-

frontal) gerando sensaccedilotildees de prazer e bem-estar 7-15

O processo de adiccedilatildeo agrave nicotina eacute complexo e nem todos os mecanismos estatildeo

elucidados Aleacutem da ativaccedilatildeo do sistema de recompensa haacute a formaccedilatildeo de memoacuterias

associativas do efeito hedocircnico com os ambientes e situaccedilotildees de disponibilidade e uso

do tabaco resultando em reforccedilo positivo apoacutes o fumante entrar em contato com fatores

relacionados ao seu consumo Este tipo de memoacuteria aprendida envolve a amigdala o

hipocampo o coacutertex preacute-frontal e o coacutertex parietal 15-17 Evidecircncias tambeacutem satildeo

2

consistentes com a hipoacutetese da ativaccedilatildeo do estriado dorsal o qual estaacute envolvido no

processamento de memoacuterias de formaccedilatildeo de haacutebito em processos motores o que

poderia automatizar o ato de fumar 15 18 (Figura 1)

O uso continuado do tabaco promove a desensibilizaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo dos

nAChRs causando toleracircncia e diminuiccedilatildeo dos efeitos de recompensa naturais Como

resultado o indiviacuteduo experimenta fissura ansiedade humor deprimido e irritabilidade

na ausecircncia da nicotina Estes sintomas acabam promovendo um reforccedilo negativo para o

fumo e o nuacutemero de cigarros consumidos aumenta cada vez mais 14 15

Todos os fatores acima mencionados contribuem para o mecanismo de

dependecircncia agrave nicotina (DN) Os efeitos hedocircnicos estatildeo relacionados com o processo

de iniciaccedilatildeo do tabagismo enquanto os efeitos negativos da falta da nicotina estatildeo mais

associados agrave manutenccedilatildeo do fumo 15

Para os indiviacuteduos que desejam parar de fumar o tratamento farmacoloacutegico

antitabagismo eacute o que apresenta maior eficaacutecia na reduccedilatildeo da prevalecircncia de fumantes

19

Figura 1 - Aacutereas estimuladas atraveacutes de vias dopamineacutergicas e serotonineacutergicas e sistema de recompensa A

Principais vias ativadas na dependecircncia como a aacuterea tegmental ventral nuacutecleos accumbens e da rafe coacutertex-frontal

estriado susbstacircncia negra e hipocampo As setas em rosa indicam aacutereas estimuladas pelas vias serotonineacutergicas de

transmissatildeo e em azul pelas vias dopamineacutergicas gerando diversos comportamentos B Sistema de recompensa

(composto pela VTA nuacutecleo accumbeacutens e coacutertex preacute-frontal) A nicotina age nos nAChRs no SNC gerando uma

3

descarga de dopamina no sistema de recompensa Haacute uma adaptaccedilatildeo desses receptores com o fumo continuado

fazendo com que haja a necessidade de maior consumo de nicotina e o desenvolvimento da dependecircncia VTA= aacuterea

tegmental ventral SNC sistema nervoso central nAChR= receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico Fonte adaptado de

Habermann A Brain awareness week addiction and the brainrsquos reward system Sovereign Health Group 2016 e de

Koob amp Volkow 2009 14

11 Nicotina farmacodinacircmica e farmacocineacutetica

O fumo permite uma titulaccedilatildeo precisa da dose de nicotina por parte do fumante

Sua absorccedilatildeo eacute raacutepida chegando em cerca de 10 segundos em todo o sistema nervoso

central (SNC) onde se liga nos nAChRs 20 21 22

Os nAChRs satildeo receptores de canais iocircnicos compostos por cinco subunidades

que podem estar combinadas de diferentes formas (Figura 2) 20 Os subtipos desses

receptores mais abundantes no ceacuterebro humano satildeo os α4β2 α3β4 e α7 (homomeacuterico)

Os receptores compostos pelas subunidades α4β2 (o asterisco indica que outras

subunidades podem estar presentes) possuem um papel fundamental na DN O nocaute

da subunidade β2 em ratos resultou na eliminaccedilatildeo dos efeitos comportamentais da

nicotina 23 Quanto agrave subunidade α4 parece estar envolvida na sensibilidade agrave nicotina

o que pode impactar nos efeitos de recompensa dessensibilizaccedilatildeo e toleracircncia24 25 Os

receptores compostos pelas subunidades α3β4 acredita-se mediar os efeitos

cardiovasculares 26 Os nAChRs α7 homomeacuterico estatildeo envolvidos na velocidade de

sinapses em processos de aprendizagem e controle sensorial 27 28 Os receptores

compostos pelas subunidades α4β2lowast podem conter outras subunidades como por

exemplo α5 α6 eou β3 as quais podem modificar a sensibilidade e funccedilatildeo do receptor

21 29

Como um agonista desses receptores a nicotina promove a sua abertura

permitindo a entrada de soacutedio e caacutelcio despolarizando assim a membrana dos

neurocircnios Aleacutem da entrada de caacutelcio atraveacutes dos nAChRs haacute tambeacutem a abertura de

4

canais de caacutelcio voltagem dependentes fazendo com que as vesiacuteculas que armazenam

os neurotransmissores sejam liberadas 20 21 O resultado da ativaccedilatildeo dos nAChRs em

neurocircnios poacutes-sinaacutepticos eacute a liberaccedilatildeo de diversos neurotransmissores ativando vaacuterias

aacutereas como jaacute mencionado

Figura 2 - Receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico O receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico funciona como um

canal iocircnico transmembracircnico Sua composiccedilatildeo eacute pentacircmera ou seja eacute formada por 5 subunidades que

podem se combinar de diferentes formas As subunidades satildeo classificadas de acordo com diferenccedilas nos

domiacutenios da sua estrutura proteiacuteca A acetilcolina e a nicotina satildeo agonistas desses receptores fazendo

com que os mesmos sejam abertos Assim ocorre a entrada de soacutedio despolarizando a membrana

gerando o potencial de accedilatildeo ACh= acetilcolina Nicot= Nicotina Na+= soacutedio K+= potaacutessio α =

subunidade alfa β= subunidade beta δ= subunidade delta γ= subunidade gama Fonte adaptado de Rang

amp Dale Farmacologia 5 ed Elsevier 2012

Haacute oscilaccedilatildeo dos picos de nicotina entre um cigarro e outro mas as quantidades

se acumulam entre 6 e 9 horas em um fumo regular saturando os nAChR causando

desensibilizaccedilatildeo adaptaccedilatildeo toleracircncia sintomas de abstinecircncia na falta do fumo e DN

30

A nicotina eacute rapidamente e extensivamente metabolizada pelo fiacutegado atraveacutes da

isoenzima CYP2A6 (e em menor grau pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP2E1) agrave nicotina

-iacuteon iacuteminio e apoacutes pela enzima aldeiacutedo oxidase agrave cotinina O tempo de meia vida da

nicotina eacute de aproximadamente 2 horas e da cotinina 16 horas Posteriormente a

5

cotinina eacute metabolizada em trans-3-hidroxicotinina quase que exclusivamente pela

CYP2A6 (outros isocircmeros da hidroxicotina representam menos de 2 da dose) 31 32

(Figura 3) Esta eacute a maior via de metabolizaccedilatildeo da nicotina (70 - 80 do metabolismo

da nicotina em todo o corpo) 33 no entanto haacute vias menores como por exemplo a

glucoronidaccedilatildeo que pode ser a maior determinante no clearence da nicotina em

indiviacuteduos com menor atividade da CYP2A6 31

Figura 3 - Via primaacuteria do metabolismo da nicotina A nicotina eacute

metabolizada marjoritaramente pela isoenzima CYP2A6 em nicotina-

iacuteon imiacutenio e atraveacutes da enzima aldeiacutedo oxidase eacute convertida em

cotinina A cotinina eacute posteriomente metabolizada em trans-3-

hidroxicotinina novamente pela isoenzima CYP2A6 Fonte adaptado

de Llaquet et al 2010 34

12 Faacutermacos antitabagismo

Os medicamentos de primeira escolha aprovados pela Agecircncia Nacional de

Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) incluem tratamentos com base na terapia de reposiccedilatildeo

nicotiacutenica (TRN) como adesivo goma e pastilha e tambeacutem satildeo utilizados vareniclina e

bupropiona Estes uacuteltimos possuem maior eficaacutecia terapecircutica na cessaccedilatildeo tabaacutegica 35 36

6

121 Vareniclina

1211 Farmacodinacircmica

A vareniclina eacute o faacutermaco mais recentemente utilizado para a interrupccedilatildeo do

tabagismo este foi desenvolvido especificamente para atuar nos nAChRs A sua

farmacodinacircmica estaacute mais associada agrave atuaccedilatildeo como um agonista parcial nos nAChRs

compostos pelas subunidades α4β2 37 os quais satildeo importantes alvos de accedilatildeo da

nicotina pois satildeo necessaacuterios e suficientes para a recompensa toleracircncia e

sensibilizaccedilatildeo 25 38 39 (Figura 4)

Estudos mostraram que em relaccedilatildeo agrave nicotina a vareniclina possui 15 vezes

maior afinidade pelas subunidades α4β2 e ativa em torno de 50 a liberaccedilatildeo de

dopamina no sistema mesocorticoliacutembico 37 O faacutermaco atua tambeacutem em outros

nAChR como nos nAChRs (α3β4) age fracamente nos receptores contendo a

subunidade α6 e em nAChRs (α3β2) aleacutem de exercer atividade agonista total nos

receptores α7 40

Quanto agraves reaccedilotildees adversas no uso do faacutermaco a naacuteusea eacute a mais comum (cerca

de 10 a 45 dos indiviacuteduos tratados) a qual muitas vezes leva agrave natildeo aderecircncia ao

tratatamento 41-43

7

Figura 4 - Mecanismo de accedilatildeo da vareniclina A Na ausecircncia da vareniclina a nicotina se liga aos

nAChRs aumentando a ativaccedilatildeo nesses receptores Aleacutem disso haacute o estiacutemulo endoacutegeno (promovido

pela acetilcolina) B A vareniclina eacute um agonista parcial de nAChR (α4β2) ou seja tambeacutem estimula

os nAChRs mas em menor niacutevel do que a nicotina e ao mesmo tempo eacute antagonista na presenccedila de

nicotina fazendo com que ela natildeo consiga se ligar ao receptor Fonte do autor baseado nas

informaccedilotildees de Kassem et al 2012 37

1212 Farmacocineacutetica

A vareniclina eacute rapidamente absorvida pelo trato intestinal com absorccedilatildeo gt90

logo apoacutes a administraccedilatildeo oral As concentraccedilotildees plasmaacuteticas maacuteximas satildeo alcanccediladas

no periacuteodo entre 3 e 4 horas 44 e o estado de equiliacutebrio da sua concentraccedilatildeo ocorre

dentro de 4 dias 37 44-46 O faacutermaco possui baixa ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas

sendo que de acordo com ensaios in vitro a fraccedilatildeo de vareniclina (100 ngmL) livre foi

de 797 47 A sua biodisponibilidade natildeo eacute afetada pelo tempo de administraccedilatildeo ou

ingestatildeo de alimentos 37 45 46 Aleacutem disso a vareniclina possui ampla distribuiccedilatildeo nos

tecidos sendo que o volume meacutedio de distribuiccedilatildeo aparente eacute de 415 litros

apresentando um coeficiente de variaccedilatildeo (CV) de 50 48

Na circulaccedilatildeo humana a vareniclina se encontra em quantidade marjoritaacuteria satildeo

tambeacutem encontrados os metaboacutelitos conjugados vareniclina N-carbomoil glucoroniacutedeo

8

N-formilvareniclina e oxovareniclina O tempo de meia vida da vareniclina eacute em torno

de 24 horas independente da dose administrada

A eliminaccedilatildeo do faacutermaco e metaboacutelitos se daacute principalmente pela urina (99) 49

A eliminaccedilatildeo renal exibe cineacutetica linear e a sua excreccedilatildeo ocorre pela filtraccedilatildeo

glomerular na qual estaacute associada agrave secreccedilatildeo tubular realizada pelo transportador

catiocircnico orgacircnico OCT2 O clearence estimado da vareniclina eacute de 88 a 155 mLmin

apoacutes administraccedilatildeo de dose uacutenica e 92 a 143 mLmin apoacutes doses repetidas A

depuraccedilatildeo de vareniclina eacute reduzida na presenccedila de doenccedila renal Na urina cerca de

90 do produto eliminado eacute encontrado como vareniclina em sua forma inalterada e

menos de 10 eacute encontrado na forma de 2 metaboacutelitos a hidroxivareniclina e a

vareniclina-N-carbomoil glucoroniacutedeo 37 49-51

Nenhum dos metaboacutelitos da vareniclina eacute acreditado ser farmacologicamente

ativo Aleacutem disso esses metaboacutelitos estatildeo presentes em concentraccedilotildees muito baixas 37

46-49 A Figura 5 mostra os metaboacutelitos provenientes da vareniclina

A formaccedilatildeo dos metaboacutelitos da vareniclina natildeo eacute catalisada pelo complexo

enzimaacutetico CYP450 Ensaios realizados com microssoma hepaacutetico humano mostraram

que a formaccedilatildeo do conjugado vareniclina N-carbomilglucoroniacutedeo eacute provavelmente

catalisado pela enzima UGT2B7 37 49

Figura 5 ndash Metabolismo da vareniclina em humanos Fonte adaptado de Obach et al 2006 49

9

122 Bupropiona


A bupropiona eacute um antidepressivo no entanto tem sido utilizado como faacutermaco

antitabagismo devido o seu potencial em diminuir o desejo de fumar (o qual foi

percebido durante o tramento de iacutendiviacuteduos fumantes) Como mecanismo de accedilatildeo a

bupropiona atua como um inibidor relativamente se

letivo da recaptaccedilatildeo de norepinefrina e dopamina com pequeno efeito na

recaptaccedilatildeo de serotonina (Figura 6) aleacutem de ser um antagonista de nAChR natildeo

competitivo Essas propriedades minimizam os sintomas de retirada da nicotina

aumentando a probabilidade do indiviacuteduo se abster do fumo 52

Insocircnia e boca seca satildeo as reaccedilotildees adversas mais comumente relatadas ao uso da

bupropiona (30-40 e 10 dos pacientes respectivamente) 53

Figura 6 - Mecanismo de accedilatildeo da bupropiona A Na ausecircncia da bupropiona neurotransmissores

como a noradrenalina serotonina e a dopamina satildeo recaptados endogenamente pela bomba de

recaptaccedilatildeo B Na presenccedila da bupropiona a qual eacute inibidora da bomba de recaptaccedilatildeo desses

neurotransmissores haacute a estimulaccedilatildeo do sistema de recompensa mais especificamente atraveacutes do

aumento da concentraccedilatildeo de dopamina Dessa forma o sistema continua sendo estimulado mas em

menor grau que a nicotina e as chances de abstinecircncia ao tabaco satildeo aumentadas Fonte do autor

baseado nas informaccedilotildees de Slemmer et al 2000 52

10


Conforme ensaios em voluntaacuterios sadios os picos maacuteximos de concentraccedilatildeo

plasmaacutetica de bupropiona satildeo alcanccedilados aproximadamente 3 horas apoacutes a sua

administraccedilatildeo oral O volume de distribuiccedilatildeo aparente eacute de aproximadamente 2000L e

a ligaccedilatildeo com proteiacutenas plasmaacuteticas eacute de 84 para a bupropiona e de 77 para a

hidroxibupropiona (o seu principal metaboacutelito ativo) 54

A bupropiona eacute metabolizada primariamente em uma seacuterie de metaboacutelitos ativos

como a hidroxibupropiona a threohidrobupropiona e a eritrohidrobupropiona (Figura

7) A CYP2B6 eacute a principal enzima que converte a bupropiona em hidroxibupropiona

em humanos No entanto a formaccedilatildeo de threohidrobupropiona e a

eritrohidrobupropiona que ocorre atraveacutes de reaccedilatildeo redutiva natildeo eacute mediada pela

CYP2B6 55 56 A eritroidrobupropiona natildeo pode ser mensurada no plasma apoacutes a

administraccedilatildeo de uma uacutenica dose de bupropiona Os metaboacutelitos ativos satildeo

posteriormente metabolizados em inativos e estes satildeo excretados na urina 54

Inibidores da CYP2B6 como por exemplo a ticlodipina um agente

antiplaquetaacuterio derivado da tienopiridina interagem com a bupropiona diminuindo a sua

hidroxilaccedilatildeo 57 58

Apoacutes a administraccedilatildeo crocircnica de doses de 150 a 300 mgdia a bupropiona e seus

metaboacutelitos assumem cineacutetica linear A bupropiona possui meia vida de 20 horas

aproximadamente e apresenta clearence meacutedio aparente correspondente a cerca de

200Lh A eliminaccedilatildeo da bupropiona ocorre principalmente atraveacutes da urina (87) e das

fezes (10) e eacute excretada em apenas 05 de forma inalterada nos mostrando um

extenso metabolismo 54

11

Figura 7 - Metabolismo da bupropiona em seus principais metaboacutelitos ativos A bupropiona eacute

extensamente metabolizada em hidroxibupropiona pela isoenzima CYP2B6 Os demais metaboacutelitos ativos

aatildeo metabolizados por outras enzimas Fonte adaptado de Hesse et al 2000 55

13 Pesquisa de biomarcadores

A variabilidade interindividual em resposta a faacutermacos antitabagismo sugere que

os tratamentos podem ser mais efetivos em subgrupos de fumantes 59-64 No contexto de

medicina personalizada diversos pesquisadores tecircm buscado a identificaccedilatildeo de

preditores de resposta aos tratamentos de cessaccedilatildeo tabaacutegica os quais geralmente estatildeo

envolvidos em aspectos farmacocineacuteticos e farmacodinacircmicos ou via de atuaccedilatildeo do

faacutermaco como por exemplo os fatores geneacuteticos o perfil de expressatildeo gecircnica de

proteiacutenas e de metaboacutelitos 65-68

Aleacutem de refletir a efetividade do tratamento estes biomarcadores tambeacutem

poderiam indicar a toxicidade ou a ocorrecircncia de efeitos adversos A combinaccedilatildeo

desses fatores com outras variaacuteveis individuais pode ser utilizada para adequar as

estrateacutegias preventivas e terapecircuticas 65-68

12

131 Estudos farmacogeneacuteticos e de expressatildeo gecircnica para vareniclina e

bupropiona

Diversos polimorfismos geneacuteticos tecircm sido associados com resposta agrave

vareniclina e agrave bupropiona 41 65 67-71

King et al 65 mostraram a associaccedilatildeo de polimorfismos de nucleotiacutedeos uacutenicos

(SNPs - single nucletide polimorfisms) nos genes CHRNA4 CHRNA5 CHRNA7

CHRNB2 (codificadores das subunidades α4 α5 α7 e β2 dos nAChRs

respectivamente) com abstinecircncia contiacutenua em resposta agrave vareniclina O mesmo

trabalho tambeacutem encontrou associaccedilatildeo dos polimorfismos nos genes CHRNA3

CHRNA5 CHRNB4 CHRNG (codificam as subunidades α3 α5 β4 e γ dos nAChR

respectivamente) Aleacutem disso os autores demonstraram a associaccedilatildeo de polimorfismos

nos genes HTR3A e HTR3B (codificadores dos receptores serotonineacutergicos) com a

frequecircncia de recaiacuteda no tratamento antitabagismo

Swan et al 41 verificaram a associaccedilatildeo de polimorfismos no gene CHRNB2 com

naacuteusea severa em pacientes tratados com vareniclina

Nosso grupo de pesquisadores encontrou a associaccedilatildeo do polimorfismo

rs10443196 no gene CHRNA4 e do polimorfismo 785AgtG no gene CYP2B6

(codificador da principal isoenzima metabolizadora da bupropiona) com uma maior taxa

de sucesso no tratamento com vareniclina e bupropiona respectivamente 67 68

O gene CYP2B6 eacute um dos alvos mais importantes de estudos farmacogeneacuteticos

no tratamento com bupropiona Diversos polimorfismos neste gene satildeo preditores de

metabolizaccedilatildeo lenta ou raacutepida os quais foram associados com as diferenccedilas de

concentraccedilotildees do faacutermaco e de seu principal metaboacutelito ativo hidroxibupropiona em

amostras bioloacutegicas Essas concentraccedilotildees tambeacutem se associaram agrave variabilidade na

resposta ao tratamento com bupropiona 72-74

13

Polimorfismos podem implicar em diversos mecanismos moleculares como por

exemplo alteraccedilatildeo constituiccedilatildeo ou conformaccedilatildeo de proteiacutenas mudanccedilas poacutes-

traducionais e a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica gerando variabilidade interindividual

nos niacuteveis de RNA transcrito o que poderiam explicar as diferenccedilas de resposta aos

faacutermacos antitabagismo 72

O polimorfismo CHRNA4 (rs2236196) assim como diversos polimorfismos

presentes no gene CYP2B6 os quais foram associados agrave resposta ao tratamento com

vareniclina e bupropiona respectivamente foram tambeacutem associados a maiores e

menores niacuteveis de expressatildeo gecircnica 72-75 Tambeacutem vale salientar que assim como a

expressatildeo gecircnica pode afetar a resposta ao tratamento a expressatildeo gecircnica tambeacutem pode

ser alterada em resposta aos faacutermacos 76 Neste sentido Smith et al 76 mostraram que a

vareniclina pode afetar a expressatildeo gecircnica da enzima DNA metiltransferase-1 (DNMT)

que mostrou estar envolvida em mecanismos epigeneacuteticos em neurocircnios corticais

GABaeacutergicos os quais estatildeo relacionados a processos cognitivos em indiviacuteduos

esquizofrecircnicos fumantes

O tratamento crocircnico com vareniclina modificou a expressatildeo dos nAChRs em

ceacuterebros de camundongos O upregulation dos nAChRs (α4β2) pelo uso crocircnico da

vareniclina foi similar ao promovido ao uso crocircnico da nicotina Similar dowregulation

foi visto para os nAChRs (α6β2) A vareniclina aumentou significantemente ambos

nAChRs (α3β4) e α7 enquanto a nicotina teve menor efeito nestes siacutetios 77

Em estudos com pacientes voluntaacuterios a obtenccedilatildeo de amostras do sistema

nervoso central eacute inviaacutevel Como alternativa a esse problema estudos tecircm proposto a

anaacutelise de expressatildeo gecircnica em sangue perifeacuterico 78-80 Embora natildeo seja o tecido alvo da

farmacodinacircmica dos medicamentos antitabagismo o sangue possui muitas

similaridades a niacutevel transcricional com muacuteltiplas regiotildees cerebrais 81

14

Hennings et al 82 mostraram diferenccedilas no perfil de expressatildeo gecircnica em ceacutelulas

mononucleares de sangue perifeacuterico (PBMCs) de pacientes respondedores e natildeo

respondedores a tratamentos com antidepressivos e muitos dos genes diferentemente

expressos satildeo codificadores de receptores tambeacutem presentes no SNC

Ota et al 83 mostraram que os genes GABRR2 (codificador de receptor

GABAeacutergico) e CHRNA3 (codificador da subunidade α3 de nAChR) foram

diferentemente expressos em sangue perifeacuterico em resposta ao tratamento com

risperidona em pacientes com esquizofrenia

Em outro estudo Kordi-Tamandani et al 84 mostraram que os niacuteveis de

expressatildeo gecircnica de SLC6A3 em leucoacutecitos diferiram entre indiviacuteduos dependentes de

opioacuteides e voluntaacuterios saacutedios Este gene eacute codificador de uma importante proteiacutena

recaptadora de dopamina em neurocircnios chamada DAT

Wongsriraksa et al 85 mostraram a expressatildeo das subunidades α4 α5 α7 β1 e

β2 em um estudo de caracterizaccedilatildeo de nAChRs em amostras de PBMC de humanos

atraveacutes de nicotina radioligante sugerindo conter as subunidades α4β2 α4β2α5 eou α7

Por fim diversos estudos tecircm mostrado que os nAChRs satildeo importantes para processos

imunoloacutegicos 86-91

Estudos tecircm evidenciado a expressatildeo de receptores dopamineacutergicos em

leucoacutecitos humanos Embora a dopamina natildeo ultrapasse a barreira hematoencefaacutelica as

diferenccedilas nos niacuteveis de dopamina do sistema nervoso central poderiam alterar a

expressatildeo desses receptores em leucoacutecitos ainda durante a sua formaccedilatildeo via inervaccedilatildeo

da coluna espinal doenccedilas como Parkinson Alzheimer e adiccedilatildeo agraves substacircncias

psicoativas poderiam influenciar na expressatildeo desses receptores em sangue perifeacuterico 92

15

132 Mensuraccedilatildeo de nicotina bupropiona vareniclina e seus metaboacutelitos em

amostras bioloacutegicas

A nicotina possui um baixo tempo de meia-vida e a isoenzima CYP2A6 eacute

predominante responsaacutevel pelo metabolismo da nicotina em cotinina e trans-3-

hidroxicotinina (seus principais metaboacutelitos) 93 94 Estes e a nicotina satildeo marcadores de

exposiccedilatildeo ao tabaco e indicativo de fumo 95

A taxa de metabolizaccedilatildeo da nicotina (NMR) obtida pela relaccedilatildeo da

concentraccedilatildeo de trans-3-hidroxicotininacotinina tem sido associada com DN com

desfecho e com escolha farmacoloacutegica de tratamento antitabagismo 95 96 Os valores

contiacutenuos e categoacutericos de NMR (metabolizadores lentos vs normais e raacutepidos) se

mostraram estaacuteveis em fumantes independente da carga tabaacutegica 32 97 98

A bupropiona eacute um faacutermaco extensamente metabolizado e a principal isoenzima

envolvida em seu metabolismo eacute a CYP2B6 a qual medeia quase que exclusivamente o

processo de hidroxilaccedilatildeo desse faacutermaco formando o metaboacutelito hidroxibupropiona 55

Diversos estudos tecircm associado as concentraccedilotildees de bupropiona e de hidroxibupropiona

em amostras de soro plasma e urina com a resposta ao faacutermaco 73 74

Zhu et al 73 em um estudo cliacutenico duplo-cego e placebo controlado os

indiviacuteduos foram tratados com bupropiona ou placebo por 6 meses Na terceira semana

de tratamento foram colhidas amostras de plasma para mensuraccedilatildeo de bupropiona e seu

principal metaboacutelito ativo a hidroxibupropiona As concentraccedilotildees mais elevadas de

hidroxibupropiona resultaram em melhores resultados de cessaccedilatildeo do tabagismo

Laib et al 74 apresentaram que as concentraccedilotildees de hidroxibupropiona em soro

foram correlacionadas com as diferentes respostas agrave bupropiona em pacientes com

depressatildeo analisadas atraveacutes de uma escala de impressatildeo clinica global

16

Quanto agrave vareniclina este eacute um faacutermaco pouco metabolizado sendo que 5 a

10 da dose pode ser encontrada na forma metaboacutelitos (soro plasma e urina) 49 Os

metaboacutelitos de vareniclina jaacute identificados em humanos em estudos preacutevios satildeo

hidroxivareniclina vareniclina N-carbomoilglucoroniacutedeo oxovareniclina N-

glicosilvareniclina e N-formilvareniclina 47 49 99 Pouco se conhece sobre as enzimas

que metabolizam a vareniclina Obach et al 49 mostrou o envolvimento da enzima

UG2B7 com o processo de glucoronidaccedilatildeo do faacutermaco Ainda natildeo haacute estudos que

associam os metaboacutelitos de vareniclina com resultados de desfecho de tratamento

17

2 JUSTIFICATIVA

Considerando a elevada prevalecircncia do tabagismo e a dificuldade dos indiviacuteduos

fumantes em se abster do tabaco estudos que apontem uma terapecircutica farmacoloacutegica

mais efetiva podem contribuir enormemente para o processo de cessaccedilatildeo tabaacutegica

Neste cenaacuterio a anaacutelise da expressatildeo de genes de interesse e a mensuraccedilatildeo de analitos

podem ser ferramentas uacuteteis na identificaccedilatildeo de marcadores e de subgrupos de resposta

ao tratamento antitabagismo

Escolhemos a realizaccedilatildeo da mensuraccedilatildeo de analitos nas amostras de soro dos

pacientes tratados com ambos os faacutermacos antitabagismo (vareniclina e bupropiona) e

especialmente para os pacientes tratados com vareniclina foram realizadas anaacutelises de

expressatildeo gecircnica de ceacutelulas mononucleares provenientes de amostras de sangue

perifeacuterico (do inglecircs Peripheral Blood Mononuclear Cell - PBMC) O ensaio

customizado para as anaacutelises da expressatildeo de 17 genes foi um grande investimento

financeiro nesta pesquisa e portanto o priorizamos para analisar as amostras dos

pacientes tratados com vareniclina jaacute que eacute o faacutermaco mais novo eficaz e custoso no

tratamento antitabagismo

As anaacutelises de expressatildeo gecircnica em amostras de PBMC satildeo de grande valia pois

seria importante encontrar em amostras de tatildeo faacutecil obtenccedilatildeo como amostras de sangue

um marcador de resposta que poderia ter correlaccedilatildeo com a expressatildeo gecircnica do sistema

nervoso central

Identificar um possiacutevel marcador preditivo de sucesso na utilizaccedilatildeo de um

determinado faacutermaco no iniacutecio da sua administraccedilatildeo foi uma das investigaccedilotildees deste

protocolo Os resultados desse estudo exploratoacuterio podem ser uacuteteis no entendimento do

comportamento de expressatildeo dos genes escolhidos (mais comumente expressos no

18

SNC) em amostras de sangue e na elaboraccedilatildeo de pesquisas mais amplas para a

identificaccedilatildeo de biomarcadores de resposta ao tratamento antitabagismo

19

3 OBJETIVOS

31 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo da expressatildeo de genes de interesse em amostras de

sangue perifeacuterico com a resposta ao tratamento com vareniclina

32 Analisar a possiacutevel associaccedilatildeo das concentraccedilotildees de faacutermacos antibagismo nicotina

e seus metaboacutelitos com a resposta ao tratamento com vareniclina e bupropiona

20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica

Foi realizado um estudo de coorte prospectivo no qual foram incluiacutedos 105

pacientes homens e mulheres fumantes provenientes do Programa de Assistecircncia ao

Fumante (PAF) do Instituto do Coraccedilatildeo do Hospital das Cliacutenicas da Faculdade de

Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (InCor) com idade ge 18 anos IMC ge 185 e lt

30 kgm2 e que iniciariam o tratamento com vareniclina (n=74 para a mensuraccedilatildeo dos

analitos destes n=27 para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica) ou com bupropiona (n=31

para a mensuraccedilatildeo dos analitos) (Figura 8)

A inclusatildeo dos pacientes ocorreu atraveacutes do protocolo de pesquisa ldquoEficaacutecia do

uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo o

qual foi aprovado no processo de submissatildeo ao Comitecirc de Eacutetica Institucional (CAAE

60133816000000068) - SDC 434116007 (Anexo 4) O presente estudo foi aprovado

como subprojeto do anterior atraveacutes do parecer nordm 2118913 (Anexo 1) Os pacientes

foram informados do estudo e consentiram a sua participaccedilatildeo ao assinar o termo de

consentimento livre e esclarecido (Apecircndice)

Foram excluiacutedos do estudo os pacientes que possuiacutessem desordens hepaacutetica

renal e gastrointestinal que comprometessem o metabolismo e eliminaccedilatildeo dos faacutermacos

os pacientes que faziam uso de medicamentos indutores ou inibidores das enzimas do

citocromo P450 nas uacuteltimas 6 semanas os pacientes etilistas e usuaacuterios de droga os

pacientes com doenccedilas psiquiaacutetricas instaacuteveis as mulheres em risco de gravidez e os

pacientes com contra-indicaccedilatildeo ao tratamento com bupropiona ou vareniclina

mencionados acima

21

Os pacientes foram acompanhados pela equipe do PAF e o tratamento

farmacoloacutegico foi conduzido por 12 semanas Foram considerados os seguintes

desfechos no tratamento ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de

tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf

semana de tratamento

22

Bupropiona

n=31

Visita T-1 Visita T0

(iniacutecio da medicaccedilatildeo)

Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74

RNA Basal Vareniclina

n= 27

RNA RNA

Mensuraccedilatildeo de analitos vs Desfecho (T2)

vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina


bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina

Soro

Soro

Figura 8 - Desenho do estudo O nuacutemero amostral total do estudo foi de 105 pacientes Foram incluiacutedos 74 pacientes tratados com vareniclina e 31 pacientes tratados com bupropiona Esses foram

submetidos agrave coleta de amostras de sangue no periacuteodo de 2 semanas (T2) apoacutes o iniacutecio da terapecircutica Apoacutes foi realizada a mensuraccedilatildeo de analitos e a anaacutelise de associaccedilatildeo com os desfechos de

tratamento Aleacutem disso os pacientes tratados com vareniclina tambeacutem foram submetidos agrave coleta de amostras para a obtenccedilatildeo de RNA em trecircs distintos periacuteodos de tempo antes de iniciar a

terapecircutica (T0) 2 semanas (T2) e 4 semanas apoacutes iniciar a terapecircutica farmacocoloacutegica (T4) Amostras de 14 pacientes que obtiveram sucesso no tratamento e de 13 que obtiveram resistecircncia (n=27)

foram analisadas quanto agrave expressatildeo de 17 genes candidatos (52 amostras ao todo 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos

do T4 vide toacutepico 42 Nuacutemero amostral) Apoacutes foram realizadas as anaacutelises de associaccedilatildeo entre os niacuteveis dos transcritos e os desfechos e tempos de tratamento Os pacientes foram acompanhados por

12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico no entanto o desfecho foi definido na 4 ordf semana (T4) pois apoacutes esse periacuteodo o tratamento seria reavaliado e poderia haver mudanccedila na medicaccedilatildeo T-

1= visita inicial T0= antes do iniacutecio da terapecircutica T2= 2 semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento T4= 4 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento T12= 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento Desfecho na

visita T4 = ldquosucessordquo se o paciente parasse de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento (T4) e ldquoresistenterdquo se o paciente natildeo conseguisse parar de fumar ateacute a 4ordf semana de tratamento Fonte do autor

Visita T12

Final do tratamento farmacoloacutegico

RNA vs Desfecho (T0 T2 e T4)

14 sucessos e 13 resistentes

CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2

CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3 DRD4

HTR3A HTR3B COMT e SLC6A3

23

42 Fluxo de procedimentos adotados no atendimento aos pacientes

O tratamento farmacoloacutegico antitabagismo possui a duraccedilatildeo de 3 meses (12

semanas) No estudo de ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticosrdquo foram coletados

dados cliacutenicos em 7 visitas T-1 (visita inicial) T0 (visita de iniacutecio do tratamento) T2

T4 T6 T8 e T12 (2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico)

Neste projeto foram utilizados os tempos de visita dos pacientes nas consultas

para a realizaccedilatildeo da coleta de amostras Dessa forma foi facilitado o comparecimento

desses pacientes ao procedimento Os pacientes precisavam estar comprometidos em

administrar os medicamentos todos os dias no horaacuterio combinado e terem

disponibilidade de tempo para as coletas as quais natildeo necessariamente coincidiram

com o horaacuterio das consultas pois as coletas foram realizadas no mesmo horaacuterio de

tomada do medicamento para que as anaacutelises de todos os pacientes pudessem ser

comparaacuteveis

Na visita T-1 foi aplicado o TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores

geneacuteticosrdquo bem como o questionaacuterio para coletar informaccedilotildees cliacutenicas Aleacutem disso os

pacientes foram avaliados quanto agrave DN atraveacutes do teste de Fagerstroumlm para DN (FTND)

100 e do escore de consumo situacional Issa (escore Issa) 101 (Anexos 2 e 3

respectivamente) O escore Issa eacute utilizado pelo PAF para a reclassificaccedilatildeo como

moderados ou altamente dependentes os pacientes que obteacutem o escore de FTND abaixo

de 5 mas que no entanto possuem niacutevel de DN consideraacutevel em relaccedilatildeo aos efeitos

psicoativos da nicotina A reclassificaccedilatildeo ocorre quando os pacientes obtecircm escore Issa

ge3 Apoacutes os pacientes foram randomizados em dois braccedilos do estudo tratamento com

vareniclina ou tratamento baseado na farmacogeneacutetica Os pacientes realizaram coleta

de sangue com o objetivo de obtenccedilatildeo do DNA para o estudo ldquoEficaacutecia do uso de

marcadores geneacuteticosrdquo

24

Apoacutes a genotipagem das amostras e escolha da medicaccedilatildeo dos pacientes

(vareniclina ou conforme geneacutetica) foi realizada ligaccedilatildeo telefocircnica para o paciente

informando o medicamento que iria tomar Nesta mesma ligaccedilatildeo o paciente tambeacutem foi

convidado a participar do presente estudo e todas as informaccedilotildees quanto agrave necessidade

de tomar o medicamento antitabagismo sempre no mesmo horaacuterio quanto aos dias das

coletas bem como as informaccedilotildees de preparaccedilatildeo para os procedimentos foram

transmitidas aos pacientes

Para os pacientes que seriam tratados com vareniclina ainda foi importante levar

em consideraccedilatildeo o horaacuterio que o paciente costumava tomar cafeacute da manhatilde para entatildeo

decidir o horaacuterio de administraccedilatildeo do faacutermaco pois o mesmo precisava ser

administrado apoacutes refeiccedilatildeo generosa com o intuito de diminuir o risco de naacuteusea

As coletas foram padronizadas para serem realizadas agraves manhatildes no mesmo

horaacuterio que o paciente tomaria a primeira dose do dia do medicamento antitabaacutegico O

horaacuterio de coleta entre os pacientes foi fixado entre 7 e 10 horas da manhatilde para evitar

variaccedilatildeo circadiana interpacientes No entanto entre as coletas do mesmo paciente o

horaacuterio de coleta e de administraccedilatildeo do medicamento foi sempre o mesmo com

variaccedilatildeo natildeo superior agrave 1 hora (esta variaccedilatildeo foi registrada)

Os pacientes foram orientados a realizar jejum de 10 horas (sendo liberada a

ingestatildeo de aacutegua e outros medicamentos ateacute 1 hora antes da coleta) e trazer o

medicamento antitabaacutegico para tomar apoacutes o procedimento A dose diurna dos

medicamentos antitabagismo natildeo foi administrada antes da coleta para evitar efeitos

agudos nas anaacutelises O periacuteodo de jejum foi realizado para que a amostra tivesse menor

quantidade de interferentes possiacutevel e tambeacutem para natildeo promover efeitos agudos dos

alimentos na expressatildeo gecircnica Um dia antes de cada coleta foi realizada ligaccedilatildeo

telefocircnica ou envio de mensagem para os pacientes com o objetivo de lembraacute-los do

25

procedimento das orientaccedilotildees de preparo e confirmar o uso e o cumprimento do horaacuterio

de administraccedilatildeo do medicamento antitabagismo (essa confirmaccedilatildeo da adesatildeo foi

realizada para as coletas nas visitas T2 e T4 quando os pacientes jaacute haviam iniciado o

tratamento farmacoloacutegico)

Na visita T0 para os pacientes que iniciariam o tratamento com vareniclina foi

aplicado o TCLE do presente projeto e colheu-se uma amostra de sangue para a

obtenccedilatildeo do RNA ainda antes de iniciarem o tratamento Foram fornecidas aos

pacientes as orientaccedilotildees de como tomar o medicamento e informaccedilotildees para a proacutexima

coleta Os pacientes foram orientados agrave tomarem o medicamento neste mesmo dia ou no

dia seguinte

Na visita T2 foram coletadas amostras de soro dos pacientes tratados com

bupropiona e amostras de soro e RNA dos pacientes tratados com vareniclina

Na visita T4 foram coletadas amostras de RNA dos pacientes tratados com

vareniclina

No Quadro 1 abaixo estatildeo resumidos os procedimentos orientaccedilotildees e coletas de

amostras

Quadro 1 - Procedimentos do protocolo em relaccedilatildeo aos pacientes

T-1 Aplicaccedilatildeo do TCLE do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores

geneacuteticosrdquo

Aplicaccedilatildeo de questionaacuterios

Coleta de DNA

1 dia antes de T0 Ligaccedilatildeo para informar o medicamento que o paciente iria tomar

Convite para participar do presente estudo

Determinar com o paciente qual era o melhor horaacuterio para

26

administraccedilatildeo do medicamento antibagismo (neste mesmo horaacuterio

que foram realizadas todas as coletas)

Orientaccedilotildees para a coleta em T0

T0 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo

Coleta de amostra de RNA (para os pacientes que seriam tratados

com vareniclina)

Orientaccedilotildees para iniciar o tratamento no mesmo dia ou dia

seguinte

1 dia antes de T2 Orientaccedilotildees para coleta em T2

Confirmaccedilatildeo se o paciente estava tomando o medicamento e no

horaacuterio combinado

T2 Aplicaccedilatildeo do TCLE do presente estudo para os pacientes tratados

com bupropiona

Coleta de soro para os pacientes tratados com bupropiona e coleta

de RNA e soro dos pacientes tratados com vareniclina




T4 Coleta de RNA dos pacientes tratados com vareniclina


bupropiona

Os pacientes tratados com vareniclina foram submetidos agrave coleta de sangue para

a obtenccedilatildeo de RNA em 3 periacuteodos de tempo T0 (ainda antes de iniciar o tratamento T2

27

e T4 Para isto foram utilizados os tubos PAXgene Blood RNA Tubes BRT (Qiagen

USA) para a obtenccedilatildeo de RNA Apoacutes a coleta os tubos PAXgene foram encubados em

bancada por 2 horas agrave temperatura ambiente para garantir a lise completa das ceacutelulas

sanguiacuteneas e apoacutes os tubos foram armazenados a -20degC ateacute a extraccedilatildeo do RNA das

amostras

No periacuteodo T2 tambeacutem foram coletadas amostras para a obtenccedilatildeo do soro dos

pacientes tratados com vareniclina e bupropiona Neste periacuteodo as concentraccedilotildees dos

metaboacutelitos dos faacutermacos jaacute se encontravam em estado de equiliacutebrio Para isto foram

utilizados tubos sem aditivo (Vacuette Greiner Bio-one) Os tubos foram mantidos a

temperatura ambiente ateacute a formaccedilatildeo de coaacutegulo Apoacutes os tubos foram centrifugados a

4degC a 3000 rpm por 10 min para se obter amostras de soro As amostras foram entatildeo

aliquotadas em 4 criotubos de soro e armazenadas em freezer a -80ordmC ateacute o momento

das anaacutelises

44 Nuacutemero amostral

Quanto ao nuacutemero amostral para o ensaio de expressatildeo gecircnica dos 74 pacientes

tratados com vareniclina foram escolhidas amostras de 27 pacientes (14 do grupo

sucesso e 13 do grupo resistente) baseado em estudos anteriores 83 102 que seguiram

corretamente o jejum que realizaram a tomada do medicamento nos horaacuterios

combinados e compareceram em todos e tempos de coleta Sendo ao todo 81 amostras

devido aos de 3 tempos de tratamento (T0 T2 e T4)

No entanto algumas amostras natildeo apresentaram bons resultados para a anaacutelise

de expressatildeo gecircnica e realizamos o ensaio de expressatildeo para 60 amostras de diversos

tempos Oito amostras natildeo apresentaram resultados de amplificaccedilatildeo e finalizamos com

52 amostras ao todo (9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistentes do T4

28

9 sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4) provenientes de 14 pacientes

do grupo sucesso e 13 do grupo resistente Esse tamanho amostral para cada grupo de

anaacutelise eacute comparaacutevel agrave estudos anteriores 102

Quanto ao nuacutemero amostral para a mensuraccedilatildeo dos analitos houve a inclusatildeo de

74 pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados com bupropiona Nuacutemero amostral

semelhante foi utilizado no estudo de Laib et al 74 Das 105 amostras 3 amostras dos

pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado com bupropiona apresentaram

concentraccedilotildees abaixo do limite de quantificaccedilatildeo (LQ) e estas foram excluiacutedas das

anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos ficando com nuacutemero amostral final de 71 para

vareniclina e 30 para bupropiona

45 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica para amostras de pacientes tratados com

vareniclina

451 Concentraccedilatildeo purificaccedilatildeo e extraccedilatildeo de RNA

O processo de purificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo do RNA foi realizado atraveacutes do

PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen USA) Antes de iniciar o procedimento a

temperatura dos tubos PAXgene Blood tubes (BRT) (Qiagen USA) os quais estavam

armazenados em freezer -20degC foi estabilizada mantendo os tubos em temperatura

ambiente em torno de 4 horas ou over night

Para o processo de purificaccedilatildeo do RNA primeiramente realizou-se a

homogeneizaccedilatildeo do sangue total contido no tubo PAXgene Blood tubes (BRT) e a

centrifugaccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos por 10 min em 3000 rcf havendo a formaccedilatildeo de um

pellet e o sobrenadante foi desprezado Apoacutes foi realizada a lavagem do pellet

adicionando-se 4 mL de aacutegua livre de RNase (RNFW) mistura foi submetida ao voacutertex

ateacute a dissoluccedilatildeo visiacutevel do pellet e o conteuacutedo foi centrifugado por 10 minutos a 3000

29

rcf sendo descartado o sobrenadante O pellet foi ressuspendido com 350 μL de tampatildeo

de ressuspensatildeo (BR1) atraveacutes de voacutertex ateacute a sua dissoluccedilatildeo e transferido para o tubo

de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) Foram adicionados no tubo MCT 300 μL de

tampatildeo de ligaccedilatildeo (BR2) e 40 μL de proteinase K (PK) a mistura foi submetida ao

voacutertex durante 5 segundos e incubada durante 10 minutos a 55degC com agitaccedilatildeo de 1400

rpm provocando dessa forma a digestatildeo de proteiacutenas

Apoacutes o processo de incubaccedilatildeo foram realizados diversos processos de remoccedilatildeo

de impurezas em colunas de rotaccedilatildeo O lisado foi transferido para a coluna de rotaccedilatildeo

do homogeneizador PAXgene (PSC lilaacutes) a qual foi colocada em um tubo de

processamento (PT) de 2 mL e centrifugado durante 3 minutos agrave velocidade de 16100

rcf dessa forma foi realizada a homogeneizaccedilatildeo do lisado de ceacutelulas e remoccedilatildeo dos

detritos celulares residuais Em seguida o sobrenadante da fraccedilatildeo residual foi

transferido para o tubo de microcentrifugaccedilatildeo (15 mL MCT) novo (sem interferir no

pellet) e foram adicionados 350 μL de etanol (96-100 grau de pureza PA) a mistura

foi submetida ao voacutertex e centrifugada por breves instantes (1-2 segundos 500-1000 x g)

para remover as gotas presentes no interior da tampa do tubo

Foram transferidos 700 μL de amostra para a coluna de rotaccedilatildeo de RNA

PAXgene (PRC vermelho) esta foi colocada e um tubo de processamento (PT) de 2

mL no qual foi centrifugado durante 1 minuto a 12000 rcf Apoacutes a coluna de rotaccedilatildeo

foi colocada em um tubo PT novo (o tubo PT utilizado anteriormente foi descartado) O

restante da amostra foi colocado na mesma coluna de rotaccedilatildeo PRC e o processo de

centrifugaccedilatildeo foi repetido por mais 2 vezes sempre transferindo a coluna para um tubo

de processamento novo Antes da uacuteltima centrifugaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de

tampatildeo de lavagem 1 (BR3) na coluna PRC

30

Em seguida foram adicionados 10 μL de soluccedilatildeo-matildee de DNase I (RNFD) a 70

μL de tampatildeo de digestatildeo de DNA (RDD) em um tubo de microcentrifugaccedilatildeo de 15

mL (MCT) O conteuacutedo foi misturado suavemente e centrifugado durante breves

instantes para colher o liacutequido residual dos lados do tubo Apoacutes 80 μL dessa mistura

foram transferidos diretamente para a membrana da coluna PRC e esta foi incubada agrave

temperatura ambiente (20-30degC) durante 15 minutos

Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados 350 μL de tampatildeo de lavagem

1 (BR3) para a membrana da coluna e esta foi centrifugada durante 1 min a 12000 rcf

Apoacutes a coluna PRC foi colocada em um tubo (PT) novo e foram adicionados 500 μL de

tampatildeo de lavagem 2 (BR4) na membrana da coluna A centrifugaccedilatildeo foi repetida o

tubo PT foi descartado e a coluna PRC foi colocada em um novo tubo PT A lavagem

com 500 uL de BR4 e a centrifugaccedilatildeo foi repetida novamente (poreacutem o tempo de

centrifugaccedilatildeo foi de 3 minutos) Apoacutes foi realizada uma centrifugaccedilatildeo adicional em um

tubo PT novo durante 1 minuto a 12000 rcf (sem adiccedilatildeo de tampatildeo)

A coluna de rotaccedilatildeo (PRC) foi colocada em tubo de 15 mL (MCT) Foram

adicionados diretamente na membrana da coluna 80 μL de tampatildeo de eluiccedilatildeo (BR5) a

qual foi encubada agrave temperatura ambiente por 5 minutos e centrifugada por 1 minuto a

12000 rcf para eluir o RNA

As amostras foram quantificadas atraveacutes de leitura em espectrofotocircmetro no

comprimento de onda 260 nm (utilizando como branco o tampatildeo BR5) e foram

armazenadas a -20ordmC ateacute o momento das anaacutelises Para avaliar a qualidade do RNA

gerado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose para a verificaccedilatildeo da

integridade do RNA ribossomal

31

452 Siacutentese de cDNA

O processo de siacutentese de cDNA foi realizado atraveacutes do RT2 First Strand Kit

(Qiagen USA) Os reagentes do kit foram descongelados e centrifugados brevemente

(10-15 segundos)

Primeiramente foi preparada uma mix para a degradaccedilatildeo do DNA genocircmico

composta por 2microL de tampatildeo GE 800 ng de RNA e quantidade variaacutevel de aacutegua livre

de RNase ateacute o volume final de 10 μL ou 8 μL de RNA (para amostras com

concentraccedilotildees abaixo de 100 ngμL) sem a aacutegua livre de RNase A mistura foi incubada

a 42ordmC por 5 minutos Apoacutes a incubaccedilatildeo a mistura foi colocada imediatamente em gelo

durante pelo menos 1 min

Apoacutes foi preparada uma mix para a realizaccedilatildeo da transcriccedilatildeo reversa esta foi

composta por 4 microL tampatildeo 5x (BC3) 1 microL de controle P2 (controle externo de RNA) 2

microL de mix de transcriptase reversa (RE3) e 3 microL de aacutegua livre de Rnase Foram

adicionados 10 μL da mix preparada em cada tubo contendo a mix de eliminaccedilatildeo de

DNA genocircmico A mistura foi homogeneizada delicadamente com a pipeta e incubada a

42 degC durante exatamente 15 min em seguida a reaccedilatildeo foi interrompida por incubaccedilatildeo

a 95 degC durante 5 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foram adicionados a cada reaccedilatildeo

91 μL de aacutegua livre de RNase e a mistura foi homogeneizada atraveacutes de pipeta diversas

vezes O produto final foi armazenado a -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo em cadeia da

polimerase (PCR) em tempo real

453 Ensaio de controle de qualidade das amostras para o ensaio de expressatildeo

gecircnica

Todas as amostras de cDNA foram analisadas quanto sua qualidade pelo ensaio

de controle de qualidade (disco QC Qiagen) em disco de 100 poccedilos (representaccedilatildeo do

32

disco nas Figuras 9 e 10) atraveacutes do PCR em tempo real com equipamento Rotor Gene

6000 (Corbett) Cada disco QC tem a capacidade de analisar 12 amostras sendo

necessaacuterios 5 discos para analisar 60 amostras

O disco QC eacute composto por primers especiacuteficos para a amplificaccedilatildeo de 2

Housekeeping genes ndash ACTB e HPRT1 (genes constitutivos que satildeo necessaacuterios para a

manutenccedilatildeo baacutesica da funccedilatildeo celular e satildeo expressos em todas as ceacutelulas de um

organismo em condiccedilotildees normais e fisiopatoloacutegicas) e 6 controles 1 controle de

transcriccedilatildeo reversa (RTC) 1 controle positivo de PCR (PPC) 1 controle de

contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (GDC) 1 controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa

(NTR) 1 PPC (sem amostra) e 1 controle negativo NTC (mapa na Figura 10)

Foram preparadas 12 mixes para cada uma das amostras de cDNA Sendo 92 μL

de aacutegua livre de RNase e 08 μL de cDNA essas quantidades foram multiplicadas por 6

para se ter sobra e distribuir em 5 poccedilos cada mix de amostra (poccedilos que continham

pares de primers para 2 housekeeping genes e 3 controles) Foram distribuiacutedos 10 μL de

mix e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA) em cada

poccedilo (linhas A a E) Essa master mix conteacutem corante fluorescente intercalante de DNA

Apoacutes foram preparadas 12 mixes uma para cada amostra matildee de RNA (diluiacutedo

1100) Foram utilizados 963 μL de aacutegua livre de RNase e 072 μL de RNA (1100)

essas quantidades foram multiplicadas por 3 para se ter sobra Foram pipetados 1037

μL de mix de RNA e 963 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix em

cada poccedilo da linha F para a anaacutelise do controle de transcriccedilatildeo reversa NTR

Apoacutes foram preparadas mixes sem as amostras para os 2 uacuteltimos controles PPC

e NTC compostas por 10 μL de aacutegua e 10 μL de RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR

Master Mix (multiplicados por 24) para as linhas G e H

33

O disco foi submetido agrave seguinte programaccedilatildeo 1 ciclo de 10 minutos a 95degC

(temperatura de ativaccedilatildeo da Taq polimerase) e 40 ciclos de 15 segundos a 95degC e 30

segundos a 60degC (para a amplificaccedilatildeo e realizaccedilatildeo da captura dos dados de

fluorescecircncia) Atraveacutes do software real-time cycler (Qiagen USA) foi ajustada a linha

de base (Threshold) do graacutefico de amplificaccedilatildeo logariacutetimica do cDNA para dessa

forma remover ruiacutedos na anaacutelise e verificar em qual ciclo de PCR que cada amostra

amplificou (cicle threshold ndash CT) (Figura 11) Os valores de CT foram planilhados e

analisados conforme os paracircmetros de qualidade (Quadro 2)

Figura 9 - Representaccedilatildeo do Rotor-Disc 100 Refere-se a um disco de material plaacutestico contendo 100

poccedilos Este veio de faacutebrica personalizado com primers para os ensaios QC ou RT2 profiler PCR array As

amostras e mixes satildeo pipetadas em cada poccedilo O disco eacute posteriormente colocado em um anel metaacutelico

proacuteprio para o encaixe no equipamento Rotor-Gene Cada poccedilo eacute nomeado com uma letra e um nuacutemero

iniciando no A1 ateacute o H12 Os quatro uacuteltimos poccedilos natildeo satildeo nomeados e natildeo conteacutem ensaio (no entanto

preenchemos com mix para equilibrar o peso do disco) Fonte do autor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB

B HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 HPRT1

C RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC RTC

D PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC

E GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC GDC

F NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR NTR

G PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC PPC

H NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC NTC

Figura 10 - Mapa do disco QC (representaccedilatildeo planilhada) Do A1 ao B12 housekeeping genes para 12

amostras C1 ao H12 controles Cada grupo de cor representa a colocaccedilatildeo de uma mix Do A1 ao E1 mix de

A1

C1

E1

G1

34

cDNA da amostra 1 do A2 ao E2 mix de cDNA da amostra 2 (assim por diante ateacute A12 e E12) Linha F controle

com RNA diluiacutedo (1100) Linhas G e H controles com aacutegua livre de RNase Fonte do autor

Figura 11 - Exemplo de ajuste de Threshold A linha de base (Threshold) eacute ajustada na fase linear do ciclo

de amplificaccedilatildeo Dessa forma eacute possiacutevel remover os ruiacutedos e se obter o ciclo em que cada amostra foi

amplificada na PCR (CT) Fonte do autor imagem do equipamento Rotor Genereg

Quadro 2 - Paracircmetros de qualidade do ensaio QC

Controles Teste Passa no teste Falha no teste

Controle de transcriccedilatildeo reversa CT RTC (linha B) ndash CTPPC (linha G) lt5 gt5

Controle positivo de PCR CT PPC (linha G)

CT PPC (linha D) - CT PPC (linha G)

14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3

Controle de contaminaccedilatildeo de DNA genocircmico CT GDC (linha E) gt33 lt33

Controle de natildeo transcriccedilatildeo reversa CT NTR (linha F) ge 33 ou NA lt33

Controle negativo CT NTC (linha H) ge 33 ou NA lt33

10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35

De 60 amostras analisadas 52 passaram no teste quanto aos criteacuterios de

qualidade e prosseguiram para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica do painel de genes

escolhidos

454 Ensaio de expressatildeo gecircnica

O protocolo de expressatildeo foi realizado por PCR em tempo real atraveacutes do

equipamento Rotor Gene 6000 (Corbett) com ensaio customizado RTsup2 Profiler PCR

Array em disco com capacidade de 100 poccedilos (Rotor-Disc 100 Qiagen USA) Nos 100

poccedilos de cada disco estavam distribuiacutedos primers especiacuteficos para o ensaio de expressatildeo

de 17 genes (Figuras 9 e 12 e Quadro 3) (17 pares de primers para cada gene repetidos 4

vezes na placa pois foi possiacutevel a anaacutelise de 4 amostras de cDNA por disco) 4 pares de

primers para os Housekeeping genes B2M GAPDH HPRT1 e ACTB (Quadro 4) e 3

controles 1 controle de contaminaccedilatildeo com DNA genocircmico (HGDC) 1 controle de

transcriccedilatildeo reversa (RTC) e 1 controle positivo de PCR (PPC) Os 4 Housekeeping

genes e os 3 controles tambeacutem satildeo repetidos 4 vezes no disco (Figura 5) Para as

reaccedilotildees foi utilizada a RTsup2 FAST SYBR GreenROX pPCR Master Mix (Qiagen USA)

Primeiramente foi preparada 4 mixes (uma para cada amostra de cDNA) para um

disco de 100 poccedilos composta por 275 μL de 2X RT2 SYBR Green ROX FAST

Mastermix 2262 microL de aacutegua livre de RNase e 488 microL de amostra de cDNA cada Em

cada um dos poccedilos do disco foram adicionados 20 μL da mix preparada (utilizando

mixes de diferentes amostras a cada 24 poccedilos) Apoacutes deste processo o disco foi selado

com o Rotor-Disc Heat Sealer (Qiagen USA) e colocado no equipamento Rotor-Gene

6000 (Corbett) O real-time foi programado para ciclagem de PCR nas seguintes

condiccedilotildees 1 ciclo a 95deg C com duraccedilatildeo de 10 minutos 40 ciclos a 95degC por 15

segundos e 60degC por 30 segundos

36

Quadro 3 - Genes escolhidos para o ensaio de expressatildeo

CHRNA3 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade α3





CHRNB2 Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade β2



CHRNG Codifica o receptor acetilcoliacutenico-nicotiacutenico subunidade γ

DRD1 Codifica o receptor de dopamina tipo 1




HTR3A Codifica o receptor 3A de serotonina

HTR3B Codifica o receptor 3B de serotonina

COMT Codifica a enzima catecol-O-metiltransferase (metaboliza dopamina)

SLC6A3 Codifica a proteiacutena DAT que promove a recaptaccedilatildeo de dopamina DAT

Quadro 4 - Housekeeping genes

B2M Codifica a microbulina subunidade β2

GAPDH Codifica a enzima gliceraldeiacutedo ndash 3 fosfato desidrogenase

HPRT1 Codifica a enzima hipoxantina fosforribosiltransferase 1

ACTB Codifica a β actina

37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3

B DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC

C CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3

D DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC

E CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3

F DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC

G CHRNA3 CHRNA4 CHRNA5 CHRNA6 CHRNA7 CHRNB2 CHRNB3 CHRNB4 CHRNG DRD1 DRD2 DRD3

H DRD4 HTR3A HTR3B COMT SLC6A3 B2M GAPDH HPRT1 ACTB RTC PPC HGDC

Figura 12 - Mapa do disco do ensaio RT2 profiler PCR array (representaccedilatildeo planilhada) O disco conteacutem 100 poccedilos no

entanto apenas 96 poccedilos contecircm ensaios sendo que 4 poccedilos ficam vazios A1 ao B5 = genes escolhidos para anaacutelise de

expressatildeo Do B6 ao B9= Housekeeping genes Do B10 ao B12= controles C1 ao D12 E1 ao F12 e G1 ao H12= repeticcedilatildeo dos

ensaios permitindo a anaacutelise completa de 4 amostra Cada cor diferente (a cada 2 linhas) representam a anaacutelise de uma

amostra Fonte do autor

455 Anaacutelise dos dados de expressatildeo gecircnica

Para a anaacutelise de expressatildeo gecircnica foi utilizado o meacutetodo de 2-∆∆CT 103 Apoacutes o

teacutermino da corrida do ensaio de expressatildeo gecircnica atraveacutes do software real-time cycler

(Qiagen USA) foi ajustada a linha de base (threshold) no graacutefico de amplificaccedilatildeo em

escala logariacutetmica (Figura 11) Todos os discos (total de 13) foram analisados com o

mesmo valor de threshold (010869) para que os valores de CT de todas as amostras

fossem comparaacuteveis

Os dados de CT tambeacutem foram inseridos no programa SPSS para as anaacutelises

estatiacutesticas Os valores de CT foram normalizados atraveacutes da expressatildeo dos

housekeeping genes utilizando a seguinte foacutermula ∆CT= (CTamostra ndash a meacutedia de

CThousekeeping genes) Os valores de mediana de 2-∆CT (em escala logariacutetmica) de cada grupo

foram utilizados para os testes de hipoacutetese Apoacutes foram obtidos os valores de ∆∆CT

(mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana de ∆CT grupo referecircncia) e o fold change (aumento ou

diminuiccedilatildeo da expressatildeo dos genes em relaccedilatildeo ao grupo referecircncia) foi calculado

atraveacutes da foacutermula 2-∆∆CT

38

46 Mensuraccedilatildeo de bupropiona vareniclina e de seus metaboacutelitos por HPLC-

MSMS

461 Materiais equipamentos e condiccedilotildees adotadas para a mensuraccedilatildeo dos

analitos apoacutes validaccedilatildeo do meacutetodo

Padrotildees analiacuteticos e padrotildees internos (PIs) deuterados bupropiona

hidroxibupropiona vareniclina (Santa Cruzreg) vareniclina d4 (TRCreg) nicotina

(ChemCruzreg) cotinina (Sigma-Aldrichreg) hidroxicotinina (Torontoreg) e

hidroxibupropiona d6 nicotina d4 cotinina d3 hidroxicotinina d3 (Cerilliantreg)

Solventes orgacircnicos Metanol acetonitrila (JT Baker) e sais acetato de amocircnio

fosfato de soacutedio (Vetecreg) fosfato de soacutedio monobaacutesico (Proquimiosreg) fosfato

de amocircnio (Reagenreg) formiato de amocircnio (Sigma-Aldrichreg)

Equipamentos e acessoacuterios

o HPLC Shimadzureg (Kyoto Japatildeo) equipado com uma vaacutelvula comutadora

de 6 vias automaacutetica

o Auto-amostrador Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)

o Vaacutelvula comutadora de 6 vias 11R-0016H (Valcoreg Houston TX USA)

o Espectrocircmetro de massas LCMS-8030 Shimadzureg (Kyoto Japatildeo)

o Analisador de massa triplo quadrupolo (Shimadzureg Kyoto Japatildeo)

o Coluna analiacutetica ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento

diacircmetro interno e tamanho de partiacutecula)

o Preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)

39

o Coluna de extraccedilatildeo coluna contendo aproximadamente 70 mg do novo

RAM

Software

o LabSolutionsreg para anaacutelise dos dados e programaccedilatildeo do meacutetodo no

HPLC-MSMS

Condiccedilotildees espectrometricas e cromatograacuteficas

o Temperatura da forno da coluna 40ordmC

o Temperatura da linha de dessolvataccedilatildeo 250ordmC

o Temperatura do bloco de aquecimento 400ordmC

o Fluxo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 20 ml min-1

o Fluxo de gaacutes para secagem 150 ml min-1

o Energias de colisatildeo precursores e fragmentos dos analitos (Tabela 1)

o Fase moacutevel de carregamento (liberada pela bomba A) Aacutegua ultra pura

em um fluxo de 04 mL min-1

o Fase moacutevel de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeoionizaccedilatildeo (liberada pela bomba C)

metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH=42 (9010 vv)


o Fase moacutevel de limpeza (liberada pela bomba B) acetonitrila aacutegua ultra

pura isopropanol (751510 vvv) em um fluxo de 10 mL min -1

o Sistema de anaacutelise ULPC-MSMS no modo columns switching em

configuraccedilatildeo backflush modo de ionizaccedilatildeo positiva por electrospray

(ESI+)

40

Tempos

o Fase de carregamento e condionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo

1) 0 - 30 min

o Fase de eluiccedilatildeo (vaacutelvula na posiccedilatildeo 2) 03 min

o Fase de limpeza separaccedilatildeo e anaacutelise por MS (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 67

min

o Recondiocionamento do sistema (vaacutelvula na posiccedilatildeo 1) 50 min

o Tempo total incluindo todos os processos 15 min

o

Tabela 1 - Analitos precursores fragmentos e energias de colisatildeo otimizados

Analitos Precursor (mz) Fragmentos (mz) Energia de colisatildeo

(KV)

Vareniclina 212 169 -23

183 -24

141 -43

Bupropiona 240 131 -28

139 -26

103 -39

Hidroxibupropiona 256 139 -29

131 -29

167 -29

Nicotina 163 117 -28

130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34

Hidroxicotinina 193 80 -30

134 -19

118 -21

Fragmentos quantificados

41

462 Visatildeo geral do desenvolvimento da coluna e padronizaccedilatildeo da anaacutelise

Todos os padrotildees para as anaacutelises dos analitos foram adquiridos e armazenados

conforme recomendaccedilatildeo do fabricante ateacute o momento da padronizaccedilatildeo das anaacutelises As

anaacutelises foram realizadas atraveacutes da colaboraccedilatildeo com o Prof Dr Eduardo Costa de

Figueiredo Dr Henrique Dipe Faria e Prof Dra Isarita Martins do Laboratoacuterio de

Anaacutelises de Toxicantes e Faacutermacos ndash LATF da Faculdade de Ciecircncias Farmacecircuticas da

Universidade Federal de Alfenas (Unifal MG) A escolha de cada analito foi

determinada atraveacutes de sua importacircncia cliacutenica e tambeacutem devido agrave disponibilidade dos

padrotildees dos analitos no mercado Os analitos mensurados para as amostras provenientes

dos pacientes tratados com os faacutermacos antitabagismo foram bupropiona

hidroxibupropiona vareniclina nicotina cotinina e hidroxicotinina (os trecircs uacuteltimos satildeo

proveninentes do fumo) Foi realizado um levantamento das propriedades fiacutesico-

quiacutemicas dos metaboacutelitos conforme Quadro 5

Para a remoccedilatildeo das macromoleacuteculas (como proteiacutenas) presentes na matriz de

soro foi desenvolvida uma coluna extratora de acesso restrito a partir de nanotubos

hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com ligaccedilotildees hidrofiacutelicas (novo RAM) O

material foi desenvolvido e caracterizado antes mesmo da padronizaccedilatildeo das condiccedilotildees

de anaacutelise nos equipamentos

Foram obtidas as condiccedilotildees espectomeacutetricas (modo de ionizaccedilatildeo e as condiccedilotildees

de sua fonte temperatura do bloco de calor fluxo de gaacutes nebulizador e fluxo do gaacutes

secante) e cromatograacuteficas (tempo de retenccedilatildeo e separaccedilatildeo e aacutereas obtidas dos picos de

cada analito) Apoacutes as condiccedilotildees foram otimizadas em sistema de cromatografia liacutequida

de alta eficiecircncia multidimensional seguida por espectrometria de massa (HPLC-

MSMS) O sistema multimensional constituiacutedo por vaacutelvulas comutadoras permite a

anaacutelise online e automatizada com configuraccedilatildeo via software As vaacutelvulas permitem

42

diferentes posiccedilotildees promovendo a ocorrecircncia de eventos distintos no sistema como a

concentraccedilatildeo dos analitos e remoccedilatildeo de macromoleacuteculas atraveacutes da coluna extratora

(posiccedilatildeo 1) a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna extratora para a coluna analiacutetica (posiccedilatildeo 2)

e novamente na posiccedilatildeo 1 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos da coluna analiacutetica para o

espectrocircmetro de massas a limpeza da coluna extratora e o recondionamento do

sistema

Quadro 5 - Propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos

Bupropiona

Peso molecular 27620 gmol

Ponto de fusatildeo 243-246deg C

Solubilidade em aacutegua 00693 mgmL

pKa (aacutecido forte) 1829

pKa (mais forte baacutesico) 822

Aacuterea da superfiacutecie polar 291 Aring2

Log P 36

Hidroxibupropiona


Ponto de fusatildeo 121-123degC





Log P 222

Vareniclina


Pressatildeo de vapor 25degC

Solubilidade em aacutegua 877 x 10-2 gL

pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina


Pressatildeo de vapor 618 degC

Solubilidade em aacutegua 100 mM

pKa 85 pKb1 616 a 15degC e pKb2 1096


Log P 117

Cotinina


Solubilidade em aacutegua 10 x10-6 mgL a 25degC

Aacuterea da superfiacutecie polar 332 Åsup2

Log P 007

Hidroxicotinina


Aacuterea da superfiacutecie polar 53 Å2

ACDLog P -148

Fonte Banco de dados Pubchem e ChemSpider Obs Algumas informaccedilotildees referentes agraves

propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos analitos ainda natildeo estatildeo disponiacuteveis na literatura pKa= valor

negativo do logaritmo da constante de dissociaccedilatildeo de um aacutecido pKb= valor negativo do logaritmo

da constante de dissociaccedilatildeo de uma base LogP= coeficiente de particcedilatildeo

463 Desenvolvimento da coluna RAM para a purificaccedilatildeo da amostra

As amostras de soro e plasma satildeo matrizes ricas em moleacuteculas que interferem na

mensuraccedilatildeo dos analitos como lipiacutedios e principalmente proteiacutenas Estas podem

obstruir colunas analiacuteticas e diminuir a concentraccedilatildeo dos analitos jaacute que muitos destes

estatildeo ligados a essas proteiacutenas Devido a esse fato geralmente eacute realizada uma

preparaccedilatildeo das amostras antes de sua mensuraccedilatildeo Essa preparaccedilatildeo envolve processos

como a extraccedilatildeo com o uso de solventes precipitaccedilatildeo entre outros os quais geram

custo de materiais aumento do tempo de trabalho e de erros 104 105 51 106 Dessa forma

44

diversos estudos vecircm tentando desenvolver meacutetodos que natildeo exijam tanta manipulaccedilatildeo

das amostras Os materiais de acesso restrito (RAMs) estatildeo sendo utilizados para a

menor preparaccedilatildeo da amostra e sua injeccedilatildeo direta Dentre os RAMs estatildeo os nanotubos

de carbono (CNTs) modificados 107-109 Nesta colaboraccedilatildeo foi desenvolvida a coluna

extratora composta por nanotubos hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados com a

adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos Esse material entrou com pedido de patente na Agecircncia

de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da Universidade Federal de Alfenas-MG atraveacutes do

Processo 230870001282019-84 e portanto a sua composiccedilatildeo e os resultados de

alguns testes da sua caracterizaccedilatildeo seratildeo mantidos em sigilo (vide declaraccedilatildeo Anexo

5)

Diferentes RAMs foram sintetizados a partir de CNTs para que fosse obtido o

melhor desempenho na remoccedilatildeo de macromoleacuteculas e retenccedilatildeo dos analitos da amostra

Os CNTs utilizados foram compostos por paredes muacuteltiplas pois apresentam uma

elevada aacuterea superficial e consequentemente uma maior capacidade de adsorccedilatildeo Os

CNTs foram adquiridos comercialmente e inicialmente foram funcionalizados a partir

de reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo aacutecida com aacutecido niacutetrico como desenvolvido por Barbosa et al 109

Os CNTs oxidados foram utilizados em etapas de siacutentese posteriores

adicionando grupos quiacutemicos hidrofiacutelicos que fossem capazes de realizar a exclusatildeo de

proteiacutenas e permitir a adsorccedilatildeo dos analitos As reaccedilotildees de siacutentese posteriores foram

semelhantes as promovidas para a realizaccedilatildeo de revestimento externo de poliacutemeros

poliacutemeros biomimeacuteticos nanomagneacuteticos com e sem acesso restrito 107 110-112 poreacutem

foram utilizadas estrateacutegias e proporccedilotildees de reagentes distintas na tentativa de obter o

RAM mais eficiente Aleacutem disso tambeacutem foi priorizada a siacutentese mais simples e

reprodutiacutevel bem como o material que apresentar maior vida uacutetil Os diferentes

materiais sintetizados foram testados em relaccedilatildeo agrave exclusatildeo de proteiacutenas e adsorccedilatildeo dos

45

analitos e tambeacutem foram realizados testes de caracterizaccedilatildeo para determinar suas

propriedades fiacutesico-quiacutemicas e confirmar a estrutura originada

A anaacutelise termogravimeacutetrica foi realizada com a finalidade de determinar a

variaccedilatildeo de massa (ganho ou perda) do RAM em funccedilatildeo de emprego de temperatura

programada proporcionando informaccedilotildees importantes a respeito da estabilidade do

material e de sua composiccedilatildeo Outras teacutecnicas tambeacutem foram utilizadas com o objetivo

de obter dados relacionados agrave estrutura e composiccedilatildeo do novo RAM como o

infravermelho e anaacutelise elementar Anaacutelises de microscopias eletrocircnicas de varredura e

de transmissatildeo tambeacutem foram realizadas para a determinaccedilatildeo da composiccedilatildeo da

superfiacutecie externa e arranjo estrutural do material com as modificaccedilotildees realizadas

Apoacutes o teacutermino do preparo do novo RAM eles foram colocados dentro de uma

coluna (aproximadamente 70 mg) conforme (Figura 13) A coluna foi posteriormente

empregada no preparo de amostras online no sistema cromatograacutefico

Figura 13 ndash Representaccedilatildeo da composiccedilatildeo da coluna extratora (Novo RAM) O novo RAM formado

a partir de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica dotado de muacuteltiplas camadas e modificados com grupos

hidrofiacutelicos promovem a retenccedilatildeo de analitos e exclusatildeo de macromoleacuteculas como proteiacutenas O RAM foi

posteriormente empacotado em coluna para a utilizaccedilatildeo em sistema cromatograacutefico Fonte adaptado do

colaborador Dr Henrique Dipe de Faria Unifal-MG

46

464 Caracterizaccedilatildeo do novo RAM

4641 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA

Na ausecircncia da coluna extratora foi preparada primeiramente uma soluccedilatildeo

aquosa de albumina de soro bovino (BSA) em uma concentraccedilatildeo de 44 mgmL-1

(semelhante agrave concentraccedilatildeo de proteiacutenas presentes no plasma humano) Foram injetados

10 microl desta soluccedilatildeo em triplicata diretamente em sistema cromatograacutefico com detector

UV ajustado a 255 nm utilizando como fase moacutevel o tampatildeo formiato de amocircnio 10

mM pH=42 em um fluxo de 04 mL min-1 O sinal detectado foi de 100 BSA

Posteriormente a coluna preenchida com 70 mg do novo RAM foi inserida no sistema

cromatograacutefico entre o injetor e o detector A soluccedilatildeo de BSA foi analisada em triplicata

novamente no entanto com a presenccedila da coluna extratora desenvolvida (novo RAM)

A aacuterea do sinal obtido nesta segunda anaacutelise dividida pela aacuterea do sinal de 100 BSA

obtida na primeira anaacutelise foi correspondente agrave porcentagem de BSA excluiacuteda pela

coluna

4642 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas no soro

Para analisar a exclusatildeo total de macromoleacuteculas (como lipiacutedios proteiacutenas e

sacariacutedeos) agora nas amostras de soro foi utilizado procedimento semelhante Na

ausecircncia da coluna extratora injetou-se no sistema cromatograacutefico em triplicata 100 μL

de amostra de soro humano branco foram testados pools de soro puros e diluiacutedos 14 A

aacutegua ultra pura foi utilizada como fase moacutevel em um fluxo de 04 mL min-1 e o sinal

obtido foi relacionado a 100 dos interferentes Apoacutes a coluna extratora (o novo

RAM) foi adionado ao sistema e a amostra foi inserida novamente A divisatildeo entre a

aacuterea do pico na primeira anaacutelise pelo pico da segunda anaacutelise refere-se agrave porcentagem

de exclusatildeo de interferentes As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram as mesmas do teste

com BSA

47

4643 Capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas com BSA em diferentes pHs

O teste de exclusatildeo de proteiacutenas tambeacutem foi realizado nas mesmas condiccedilotildees

cromatograacuteficas que a anaacutelise anterior utilizando soluccedilatildeo de BSA em triplicata no

entanto diferentes soluccedilotildees como fase moacutevel (variaccedilatildeo de pH de 22 a 70) foram

testadas pois o pH pode influenciar na ionizaccedilatildeo dos analitos dos grupos funcionais

presentes na superfiacutecie do novo RAM e na interaccedilatildeo entre eles o que pode resultar em

diferentes taxas de exclusatildeo de proteiacutenas Estas soluccedilotildees foram os tampotildees fosfato de

soacutedio 10 mM (pHs 22 e 26) formiato de amocircnio 10 mM (pHs 30 a 46) acetato de

amocircnio 5 mM (pHs 52 a 66) e fosfato de soacutedio 5mM (pH 70)

465 Paracircmetros espectromeacutetricos

Com a finalidade de se obter um meacutetodo de anaacutelise capaz de detectar e

quantificar menores niacuteveis possiacuteveis de concentraccedilatildeo dos analitos foram otimizados os

paracircmetros espectromeacutetricos fluxos dos gases secantes e nebulizador modo de

ionizaccedilatildeo temperaturas da linha de dessolvataccedilatildeo e de bloco de aquecimento e as

energias de colisotildees utilizadas para fragmentar os iacuteons precursores para originar os

fragmentos iocircnicos de cada analito Foram realizadas soluccedilotildees padrotildees de cada analito e

dos padrotildees internos (PIs) deuterados (vareniclina d-4 hidroxibupropiona d6 nicotina

d4 cotinina d3 e hidroxicotinina d3) na concentraccedilatildeo de 1 mg L-1 em metanol Cada

uma destas soluccedilotildees foram injetadas separadamente no sistema em um volume de 5 microL

A fase moacutevel utilizada foi constituiacuteda por metanol tampatildeo formiato de amocircnio 001

mol L-1 pH=42 (9010 vv) em um fluxo de 04 mL min-1 e o modo de ionizaccedilatildeo

positiva (ESI+) foi utilizado pois demonstrou ser mais eficiente para ionizar as

moleacuteculas analisadas Essa otimizaccedilatildeo foi obtida utilizando o software Labsolutionsreg

48

466 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico multidimensional

Para esta otimizaccedilatildeo foi utilizado um HPLC de dotado de vaacutelvula comutadora

automaacutetica de 6 vias e um injetor automaacutetico de amostras o que permitiu a

automatizaccedilatildeo do processo Ainda o sistema cromatograacutefico foi acoplado a um

espectrocircmetro de massas em tandem (HPLC-MSMS) dotado de um analisador de

massa triplo quadrupolo o qual possui alta sensibilidade e seletividade Incorporou-se

neste sistema uma coluna extratora preenchida com o RAM desenvolvido

O forno foi mantido a 40ordmC e o detector UV operando em um comprimento de

onda de 255 nm A fim de padronizar a anaacutelise foram testadas colunas anaacuteliticas de

diversos tamanhos e composiccedilotildees e variadas proporccedilotildees de fases de moacuteveis

Atraveacutes da anaacutelise do cromatograma foram avaliados o tempo de retenccedilatildeo e

separaccedilatildeo e as aacutereas obtidas dos picos de cada analito O sistema foi utilizado no modo

columns switching na configuraccedilatildeo backflush e as condiccedilotildees da anaacutelise foram

otimizadas como os tempos de exclusatildeo de proteiacutenas de adsorccedilatildeo e eluiccedilatildeo dos

analitos de separaccedilatildeo cromatograacutefica de limpeza da coluna extratora e de

recondicionamento do sistema bem como a composiccedilatildeo das fases moacuteveis de

carregamento de eluiccedilatildeoseparaccedilatildeo e de limpeza

Para a otimizaccedilatildeo dos paracircmetros de anaacutelise foi utilizado um pool de amostras

de soro humano branco em sexplicata Este soro foi dopado com os analitos vareniclina

bupropiona hidroxibupropiona nicotina cotinina e hidroxicotinina em 3 concentraccedilotildees

01 100 e 1000 microg L -1 e com os PIs deuterados na concentraccedilatildeo de 500 microg L -1 Como

o soro eacute uma matriz com alta concentraccedilatildeo de interferentes foram testados pools de

soro branco dopados e injetados sem diluiccedilatildeo diretamente no sistema e diluiacutedos em aacutegua

ultra pura (11) e os perfis analiacuteticos foram entatildeo avaliados

49

467 validaccedilatildeo analiacutetica

Testes para a validaccedilatildeo da anaacutelise otimizada foram realizadas conforme

diretrizes do US Department of Health and Human Services e do Food and Drug

Administration (FDA) 2013 113 Os paracircmetros avaliados foram a seletividade limite

de detecccedilatildeo (LD) limite de quantificaccedilatildeo (LQ) linearidade estabilidade dos analitos

efeito residual e de matriz e recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo

Os ensaios foram realizados em seis repeticcedilotildees (n=6) exceto o ensaio de

recuperaccedilatildeo (n=3) e foi utilizado um pool de amostras de soro branco dopadas com cada

um dos analitos nas concentraccedilotildees de 5 10 20 50 75 100 μg L-1 para vareniclina 1 5

50 250 500 1000 μg L-1 para bupropiona 1 10 100 500 1000 2000 para

hidroxibupropiona 5 10 50 250 500 1000 μg L-1 para nicotina cotinina e

hidroxicotinina Os PIs deuterados foram utilizados na concentraccedilatildeo de 200 μg L-1

47 Anaacutelise estatiacutestica

Em relaccedilatildeo agraves caracteriacutesticas demograacuteficas as variaacuteveis contiacutenuas foram

apresentadas como meacutedia e desvio padratildeo e as categoacutericas como frequecircncias Os testes

Shapiro-Wilk e KolmogorovndashSmirnov foram realizados para verificar a normalidade da

distribuiccedilatildeo das variaacuteveis quantitativas e assim escolher testes parameacutetricos ou natildeo

parameacutetricos Foram realizados os testes Qui-quadrado Exato de Fisher t de Student ou

Mann-Whitney para as anaacutelises comparativas de caracteriacutesticas gerais entre os grupos

de desfecho dos pacientes tanto no ensaio de expressatildeo como de mensuraccedilatildeo dos

analitos Para as anaacutelises de expressatildeo gecircnica o meacutetodo 2-∆∆CT foi utilizado 103 Como os

dados de expressatildeo natildeo apresentaram distribuiccedilatildeo normal foi realizado o teste natildeo

parameacutetrico de Mann-Whitney para testar a hipoacutetese de diferenccedila (valores de 2-∆CT)

intra e entre os grupos de desfechos (sucesso e resistente e tempos de tratamento

50

farmacoloacutegico T0 T2 e T4) Os valores de ∆∆CT (mediana de ∆CTgrupo teste ndash mediana

de ∆CTgrupo referecircncia) foram obtidos para o caacutelculo do fold change O fold-change (2-∆∆CT)

foi calculado para verificar o aumento ou diminuiccedilatildeo de expressatildeo gecircnica entre os

grupos analisados O graacutefico heat map foi construiacutedo atraveacutes do software Gene-globe

(Qiagen USA) para verificar as diferenccedilas no perfil de expressatildeo dos genes estudados

de acordo com os tempos (T0 T2 e T4) e de acordo com a efetividade de tratamento

com vareniclina (sucesso e resistente) O teste de Manny-Whitney foi utilizado para

analisar os niacuteveis de concentraccedilotildees de vareniclina de bupropiona de nicotina e de seus

metaboacutelitos de acordo com os desfechos de tratamento (sucesso e resistente) pois natildeo

apresentaram distribuiccedilatildeo normal A taxa de metabolizaccedilatildeo de nicotina (NRM) foi

calculada pela seguinte foacutermula NMR= trans-3-hidroxicotininacotinina A

hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina

para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros da hidroxicotinina satildeo

irrelevantes 31 32 Os pacientes foram classificados em metabolizadores lentos se

NMRlt031 e normais ou raacutepidos se NMRgt031 Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram

realizadas utilizando o software SPSS (versatildeo 20 IBM New York NY) considerando

o niacutevel de significacircncia de P lt005

51

5 RESULTADOS

Este projeto incluiu 105 pacientes sendo 74 tratados com vareniclina e 31

com bupropiona Dos 74 pacientes tratados com vareniclina amostras de 27 pacientes

foram analisadas quanto agrave expressatildeo gecircnica (14 pacientes do grupo de desfecho sucesso

e 13 do grupo resistente) Sendo provenientes destes pacientes 52 amostras ao todo (de

diversos tempos) 9 resistentes do tempo T0 7 resistentes do T2 8 resistente do T4 9

sucessos do T0 8 sucessos do T2 e 11 sucessos do T4 (vide toacutepico 42 Nuacutemero

amostral)

Quanto a mensuraccedilatildeo dos analitos foi desenvolvida uma coluna extratora para a

purificaccedilatildeo da amostra agrave base de nanotubos hiacutedridos de carbono e siacutelica modificados

com a adiccedilatildeo de grupos hidrofiacutelicos (novo RAM) o meacutetodo HPLC-MSMS

multidimensional no modo column switching e na configuraccedilatildeo backflush foi

otimizado e validado Setenta e quatro pacientes tratados com vareniclina e 31 tratados

com bupropiona foram submetidos agrave anaacutelise Apenas 4 amostras das 105 apresentaram

valores abaixo do LQ (3 de pacientes tratados com vareniclina e 1 de paciente tratado

com bupropiona) e estas foram excluiacutedas das anaacutelises dos analitos (vide toacutepico 42

Nuacutemero amostral)

51 Anaacutelise de expressatildeo gecircnica

511 Dados cliacutenicos e demograacuteficos

As Tabelas 2 e 3 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes

selecionados para o ensaio de expressatildeo gecircnica do grupo total e por grupo de desfecho

respectivamente A variaacutevel idade apresentou diferenccedila significativa entre os grupos

resistente e sucesso

52

Tabela 2 - Caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos pacientes tratados com

vareniclina selecionados para os ensaios de expressatildeo gecircnica (n=27)

Idade (anos) 50 plusmn 13

Gecircnero mulheres () 464

Etnia autodeclarada brancos () 740

Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 50

Cigarrosdia 17 plusmn 7

FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607

Escore Issa ge 3 () 857

Hipertensatildeo () 179

Dislipidemia () 250

Diabetes melito tipo 2 () 107

Depressatildeo () 71

Ansiedade () 286

FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash

Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10

pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala

de 0 a 4 pontos)


vareniclina submetidos aos ensaios de expressatildeo gecircnica de acordo com o desfecho

de tratamento

Resistente (n=13) Sucesso (n=14) Valor de P

Idade (anos) 55 plusmn 11 45 plusmn 12 0045

Gecircnero mulheres () 538 357 045

Etnia autodeclarada brancos () 769 786 100

Iacutendice de massa corporal (Kgm2) 271 plusmn 46 273 plusmn 54 092

Cigarrosdia 20 plusmn 6 15 plusmn 6 006

FTND 63 plusmn 22 59 plusmn 19 058

FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100

Hipertensatildeo () 231 71 033

Dislipidemia () 231 286 100

Diabetes melito tipo 2 () 231 00 010

Depressatildeo () 77 71 100

53

Ansiedade () 308 357 100

FTND = teste de Fagerstroumlm para dependecircncia agrave nicotina ndash Fagerstroumlm test for nicotine

dependence (escala de 0 a 10 pontos) Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala

de 0 a 4 pontos)

512 Dados de expressatildeo gecircnica

Dos 17 genes escolhidos para testar com a resposta ao tratamento apenas 4

apresentaram valores de amplificaccedilatildeo aceitaacuteveis para uma interpretaccedilatildeo de qualidade

mais especificamente valores de CT lt 33 Os valores das expressotildees dos genes (CTs)

foram normalizados atraveacutes das meacutedias de CT dos housekeeping genes para cada

amostra obtendo-se os valores de ∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CT housekeepings genes) A

Tabela 4 mostra os valores de mediana de ∆CT dos genes analisaacuteveis de acordo com os


Tabela 4 - Valores de mediana de ∆CT dos genes de acordo com os tempos de


∆CT = (CTgene alvo ndash meacutedia CThousekeepings genes) T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico

T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do

tratamento farmacoloacutegico IC 95 = Intervalo de confianccedila de 95

Resistente T0 Resistente T2 Resistente T4

∆CT IC 95 ∆CT IC 95 ∆CT IC 95

CHRNA5 818 (732 ndash 870) 845 (748 ndash 887) 767 (727 ndash 905)


CHRNG 620 (579 ndash 695) 647 (601 ndash 668) 663 (602 ndash 702)

COMT 467 (440ndash 501) 480 (443 ndash 503) 487 (452 ndash 524)

Sucesso T0 Sucesso T2 Sucesso T4





COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento

A Tabela 5 mostra o fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos de

tempos de tratamento e grupos de desfecho Foi observada diferenccedila significativa para a

expressatildeo do gene CHRNA7 no grupo resistente amostras dos tempos T2 e T4

apresentaram menor expressatildeo comparadas com amostras do T0 (fold change 038

P=0007 fold change 067 P=0004 respectivamente) Para a expressatildeo do gene

CHRNG amostras do grupo sucesso mostraram menor expressatildeo comparadas com

amostras do grupo resistente no tempo T2 (fold change= 077 P=0006)

Tabela 5 - Fold change e anaacutelise de associaccedilatildeo entre os tempos de tratamento e

grupos de desfecho

Resistente T2 vs T0 Resistente T4 vs T0 Resistente T4 vs T2

Genes 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P 2 -∆∆CT (IC 95) P

CHRNA5 083 (034 ndash 233) 057 142 (030 ndash 269) 095 172 (034 ndash 303) 089


CHRNG 083 (054 ndash 192) 037 074 (043 ndash 190) 044 090 (050 ndash 158) 036

COMT 091 (065 ndash 149) 092 087 (056 ndash 140) 063 095 (057 ndash 142) 073

Sucesso T2 vs T0 Sucesso T4 vs T0 Sucesso T4 vs T2






Sucesso vs resistente T0 Sucesso vs resistente T2 Sucesso vs resistente T4





55

T0= Tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= Duas semanas apoacutes o iacutenicio do tratamento

farmacoloacutegico T4= Quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico 2-∆∆CT = Fold change (diferenccedila de

expressatildeo) P valor (anaacutelise de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos) IC 95 = Intervalo de confianccedila

de 95

As Figura 14 e 15 mostram graacuteficos de barras das diferenccedilas de expressatildeo dos

genes CHRNA7 e CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho respectivamente

O heat map (Figura 16) mostra que natildeo houve diferenciaccedilatildeo nos perfis de expressatildeo

gecircnica em uma anaacutelise conjunta dos genes de acordo com os desfechos e tempos de

tratamento

Devido agrave diferenccedila significativa nas meacutedias de idade entre os grupos sucesso e

resistente foi realizada regressatildeo linear multipla na anaacutelise de expressatildeo dos quatro

genes analisaacuteveis A regressatildeo foi ajustada por idade e tambeacutem gecircnero e cigarros por

dia No entanto os resultados de expressatildeo dos genes natildeo foram impactados por estas

covariaacuteveis


56

Figura 14 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNA7 entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do

desfecho resistente B Anaacutelise intragrupo do desfecho sucesso T0= tempo inicial antes do tratamento farmacoloacutegico T2= duas

semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico P= 0007

(resistente T2 vs T0 fold change de 038) P=0004 (resistente T4 vs T0 fold change de 067) Valor de P (anaacuteliacutese de

associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor

57

Figura 15 - Diferenccedila de expressatildeo do gene CHRNG entre os tempos de tratamento e desfecho A Anaacutelise intragrupo do



(sucesso vs resistente T2 fold change de 077) Valor de P (anaacuteliacutese de associaccedilatildeo entre as medianas de 2-∆CT dos grupos em uma

comparaccedilatildeo dois a dois) Fonte do autor

58

Figura 16 - Heat map de expressatildeo gecircnica A figura mostra a magnitude de expressatildeo gecircnica entre os grupos A cor mais clara

(verde) nos indica menor expressatildeo e a cor mais escura (vermelho) indica maior expressatildeoT0= tempo inicial antes do tratamento

farmacoloacutegico T2= duas semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento farmacoloacutegico T4= quatro semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento

farmacoloacutegico Fonte do autor gerada pelo software Gene Globe QIAGENreg

52 Mensuraccedilatildeo dos analitos

521 Caracterizaccedilatildeo da coluna teste exclusatildeo de proteiacutenas e interferentes da

matriz

Em relaccedilatildeo ao teste de capacidade de exclusatildeo de proteiacutenas o pico de BSA sem

e com a nova coluna extratora apresentou tempo de retenccedilatildeo semelhante no entando a

aacuterea da curva do BSA na presenccedila do novo RAM foi bem menor do que na sua

ausecircncia conforme a Figura 17 A reduccedilatildeo de proteiacutenas (da soluccedilatildeo de BSA) pela

coluna foi de aproximadamente 98 e nas amostras de pools soro diluiacutedas (14) a

remoccedilatildeo foi de 99 (Figura 18)

A Figura 19 mostra a influecircncia do pH (escala de de 22 a 70) na exclusatildeo de

proteiacutenas fato que estaacute diretamente relacionado com a estrutura fiacutesico-quiacutemica do

RAM Diferentes pHs influenciaram na taxa de exclusatildeo de proteiacutenas esse

comportamento pode ser explicado devido agrave interaccedilotildees eletrostaacuteticas do novo RAM

com as proteiacutenas Valores de pH menores que o do ponto isoeleacutetrico das proteiacutenas

59

podem promover a prevalecircncia de proteiacutenas carregadas positivamente enquanto que

valores de pH superiores podem promover proteiacutenas carregadas negativamente 114

Dessa forma acredita-se que o comportamento de exclusatildeo de proteiacutenas do novo

material eacute semelhante ao descrito em outros estudos 108 109 115 116

Figura 17 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com soluccedilatildeo de BSA Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 10 microL de uma soluccedilatildeo aquosa de BSA (44 mg mL-1) no

sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A - aacuterea do pico 10142590 B - aacuterea

do pico 9713614 Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF

Unifal-MG

Figura 18 - Cromatograma de teste de remoccedilatildeo de proteiacutenas com amostra de soro

diluiacuteda Graacuteficos obtidos apoacutes injeccedilatildeo de 100 microL de soro diluiacutedo em aacutegua ultra pura

(14 vv) no sistema sem coluna (A) e com coluna extratora (B) A aacuterea do pico

53981550 B - aacuterea do pico 53552824 Fonte do autor e do colaborador DrHenrique

Dipe de Faria LATF Unifal-MG

60

Figura 19 - Influecircncia do pH na exclusatildeo de proteiacutenas Fonte do autor e do colaborador Dr

Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG

522 Otimizaccedilatildeo dos paracircmetros espectromeacutetricos

No processo de otimizaccedilatildeo das condiccedilotildees espectromeacutetricas foi adotado o modo

de ionizaccedilatildeo positivo (ESI+) isto eacute a ionizaccedilatildeo promove a protonaccedilatildeo (adiccedilatildeo de H+)

dos analitos e de seus fragmentos As energias de colisatildeo ideais e as muacuteltiplas transiccedilotildees

de monitoramento de reaccedilatildeo (MRM) foram otimizadas para cada analito separadamente

vide valores de energia de colisatildeo e fragmentos obtidos jaacute mostrados na Tabela 1 (no

toacutepico 461) A presenccedila de 3 fragmentos de cada analito foi necessaacuteria para a

identicaccedilatildeo qualitativa e a quantificaccedilatildeo foi dependente da concentraccedilatildeo do fragmento

mais abundante

As seguintes temperaturas foram utilizadas 40ordmC para o forno da coluna 250ordmC

para a linha de dessolvataccedilatildeo e 400ordmC para o bloco de aquecimento Foram utilizadas as

taxas de 20 ml min-1 de fluxo de gaacutes de nebulizaccedilatildeo e 150 ml min-1 de fluxo de gaacutes

para a secagem

61

523 Otimizaccedilatildeo do sistema cromatrograacutefico multidimensional

Quanto a composiccedilatildeo e proporccedilatildeo da fase moacutevel responsaacutevel pela eluiccedilatildeo

separaccedilatildeo e ionizaccedilatildeo dos analitos (fase moacutevel de eluiccedilatildeo) testes foram realizados com

os solventes orgacircnicos acetonitrila ou metanol combinados com o tampatildeo formiato de

amocircnio 10 mM em diferentes pHs com proporccedilotildees que variaram de 973 vv a 7525

vv (fase orgacircnica fase aquosa) Os solventes orgacircnicos utilizados satildeo menos viscosos

em relaccedilatildeo agrave aacutegua por isso fluem mais facilmente no sistema e por serem volaacuteteis

favorecem tambeacutem a ionizaccedilatildeo dos analitos e evaporaccedilatildeo do solvente A fase moacutevel que

apresentou melhores resultados foi a composiccedilatildeo de metanol formiato de amocircnio 001

mol L-1 pH 42 (9010 vv)

Variados tipos de colunas analiacuteticas foram testadas sendo elas A NSTreg (150

mm 46 mm e 5 microm) a ACEreg (150 mm x 46 mm x 5 microm) a Phenomenexreg (250 x 46

mm x 5 microm) e a Atlantis T3 e da Watersreg (100 mm x 21 mm x 3 microm) (comprimento x

diacircmetro interno x tamanho de partiacutecula) no entanto essas colunas aumentaram o

tempo de retenccedilatildeo dos analitos pioraram o perfil cromatograacutefico gerando picos largos e

fragmentados Portanto os testes foram realizados com uma nova coluna analiacutetica a

ACEreg C18 (100 mm x 21 mm x 3 microm comprimento diacircmetro interno e tamanho de

partiacutecula) com preacute-coluna ACEreg C18 (21mm x 3 microm diacircmetro tamanho de partiacutecula)

obtendo-se um menor tempo de anaacutelise (maior frequecircncia analiacutetica) e melhor perfil

cromatograacutefico (picos simeacutetricos) para os analitos

Trecircs volumes de injeccedilatildeo de amostra foram testados (5 10 e 100 microL) devido a

baixa concentraccedilatildeo dos analitos foi adotada a maior quantidade (100 μL) pois forneceu

melhores sinais analiacuteticos Tambeacutem foi avaliado o uso do pool de soro sem diluiccedilatildeo e

diluiacutedo (11 vv) os perfis cromatograacuteficos de ambos foram oacutetimos no entanto

62

escolheu-se trabalhar com a amostra diluiacuteda para diminuir a presenccedila de interferentes e

consequentemente diminuir efeito matriz e aumentar o tempo de durabilidade da coluna

analiacutetica

Jaacute obtidas as melhores condiccedilotildees espectromeacutetricas e cromatograacuteficas foi

otimizado o sistema columm switching na configuraccedilatildeo de backflush o qual apresenta

trecircs eventos como mostrado na Figura 20

Figura 20 - Ilustraccedilatildeo do sistema de columm switching na configuraccedilatildeo de backflush Na posiccedilatildeo 1

correspondente ao evento 1 ocorre exclusatildeo dos interferentes e adsorccedilatildeo dos analitos a coluna extratora Na

posiccedilatildeo 2 durante o evento 2 ocorre a eluiccedilatildeo dos analitos adsorvidos No retorno para a posiccedilatildeo 1

correspondente ao evento 3 ocorre limpeza da coluna extratora separaccedilatildeo e detecccedilatildeo dos analitos e por fim

o recondicionamento do sistema BA = bomba A BB = bomba B BC = bomba C MS = espectrocircmetro de

massas UV = detector UV e W = descarte Fonte Traduzido de (De Faria et al 2017)

Com as vaacutelvulas do sistema na posiccedilatildeo 1 (evento 1) a bomba A promoveu a

liberaccedilatildeo da fase moacutevel de carregamento (aacutegua ultra pura) em um fluxo de 04 mL min-1 O

tempo de 3 minutos foi o necessaacuterio para a adsorccedilatildeo dos analitos e sua preacute-concentraccedilatildeo

aleacutem da eliminaccedilatildeo de macromoleacuteculas A aacutegua mostrou ser um solvente oacutetimo como fase

moacutevel de carregamento aleacutem de ser um recurso barato e natildeo causar danos ao meio

ambiente De forma simultacircnea a fase moacutevel de eluiccedilatildeo fornecida pela bomba C passa

para a coluna analiacutetica de forma a condionaacute-la ainda na ausecircncia dos analitos Ambas as

bombas operaram com uma taxa de fluxo inicial de 04 mL min -1

63

Na posiccedilatildeo 2 da vaacutelvula (evento 2) a bomba C liberou a fase moacutevel de eluiccedilatildeo

(metanol formiato de amocircnio 001 mol L-1 pH 42 (9010 vv) em direccedilatildeo agrave coluna

analiacutetica em fluxo contraacuterio ao que a fase moacutevel de carregamento percorreu (backflush) A

velocidade do fluxo da bomba C foi aumentada para 08 mL min -1 e o tempo determinado

para esta etapa foi de 03 minutos o qual promoveu um oacutetimo perfil cromatograacutefico dos

analitos

No evento 3 as vaacutelvulas foram colocadas na posiccedilatildeo 1 novamente A fase moacutevel

de eluiccedilatildeo (vinda da bomba C) novamente com um fluxo de 04 mL min-1 passou pela

coluna analiacutetica promovendo a separaccedilatildeo dos analitos e sua chegada no detector de

massas De forma simultacircnea a bomba B em um fluxo de 10 mL min -1 liberou a fase

moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua ultra pura isopropanol 751510 vvv) a qual

passou pela coluna extratora (RAM) promovendo a remoccedilatildeo de resiacuteduos proveniente da

anaacutelise anterior tornando-a pronta para a reutilizaccedilatildeo em uma nova anaacutelise A fase de

limpeza ocorreu no tempo de 33 a 10 min O recondionamento do sistema agraves condiccedilotildees

iniciais de anaacutelise ocorreu nos uacuteltimos 5 min em que a fase moacutevel de limpeza foi

substituiacuteda pela fase moacutevel de carregamento O tempo total para cada anaacutelise foi de 15

minutos

Para a avaliaccedilatildeo da capacidade da fase moacutevel de limpeza (acetonitrila aacutegua

ultra pura isopropanol 751510 vvv) pools de soro branco dopado na maior

concentraccedilatildeo foram injetados no sistema (com a posiccedilatildeo 1 das vaacutelvulas mantida) e apoacutes

a realizaccedilatildeo da fase de limpeza foram injetados pools de soro branco diluiacutedos (11 vv)

O experimento foi realizado em triplicata O cromatograma do soro branco natildeo

apresentou sinal analiacutetico no mesmo tempo de retenccedilatildeo dos analitos o que mostra que a

fase moacutevel de limpeza foi eficiente em seu propoacutesito evitando o chamado efeito

residual (carry-over) De Faria et al 110

64

524 Validaccedilatildeo analiacutetica

Para os testes de validaccedilatildeo foram utilizados pools de amostras de soro branco

dopadas com cada um dos analitos nas concentraccedilotildees conforme o toacutepico 467

concentraccedilotildees menores foram utilizadas no entanto essas natildeo apresentaram bons sinais

analiacuteticos precisatildeo e exatidatildeo Os resultados dos testes de validaccedilatildeo estatildeo demonstrados

na Tabela 6

O teste de linearidade foi expresso como coeficiente de determinaccedilatildeo (r2)

calculado a partir das curvas de calibraccedilatildeo intra-ensaio Para esse teste foram utilizados

os analitos em diferentes concentraccedilotildees em soro branco conforme jaacute citado as

repeticcedilotildees geraram 6 curvas de calibraccedilatildeo para cada analito Os intervalos lineares

foram baseados nos intervalos terapecircuticos 51 117 118

As mesmas concentraccedilotildees dos analitos em soro no ensaio de linearidade foram

utilizadas no ensaio dos LD e LQ Estes foram calculados atraveacutes das 6 curvas de

calibraccedilatildeo e foram definidos como 3 e 10 vezes a relaccedilatildeo sinalruiacutedo respectivamente

para o LD e LQ

Para avaliar a precisatildeo e a exatidatildeo intra e inter-ensaios foram realizados 6

repeticcedilotildees de concentraccedilotildees de calibraccedilatildeo dos analitos Os testes intra-ensaio foram

realizados no mesmo dia e os testes inter-ensaios foram realizados em dias diferentes A

exatidatildeo foi calculada atraveacutes do erro relatico (E) e a precisatildeo atraveacutes do desvio

padratildeo relativo (RSD)

No teste de seletividade foi avaliado se houve a presenccedila picos de interferentes

nos mesmos tempos de retenccedilatildeo dos analitos e dos PIs deuterados As Figuras 21 e 22

mostram os cromatogramas obtidos apoacutes a injeccedilatildeo de soro branco e de soro dopado com

os analitos respectivamente mostrando que natildeo houve a presenccedila de interferentes nos

tempos de retenccedilatildeo dos analitos e PIs deuterados

65

Figura 21 - Cromatograma obtido de amostras de soro branco diluiacutedas em aacutegua ultra pura

Volume de injeccedilatildeo = 100 microL A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-

Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-

Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz

244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr

mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG

Figura 22 - Cromatograma obtido apoacutes anaacutelise de soro diluiacutedo e dopado com os analitos no niacutevel

meacutedio de calibraccedilatildeo e mais os padrotildees internos deuterados A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz

240rarr mz 131) C- Hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz

80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G- Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr

mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr


Foram realizados os testes de estabilidade de bancada longo prazo e de

congelamento e descongelamento Para a anaacutelise de estabilidade de bancada soluccedilotildees de

soro dopada com os analitos foram analisadas imediatamente apoacutes a sua preparaccedilatildeo e

apoacutes 4 e 24 horas verificando assim a estabilidade da amostra a curto prazo Para uma

66

anaacutelise a longo prazo as amostras foram armazenadas a -20degC por 30 dias e apoacutes foram

avaliadas Quanto anaacutelises de congelamento e descongelamento foram realizados 3

ciclos de congelamento -20degC e posterior descongelamento e as amostras foram

avaliadas

O ensaio de recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo foi realizado em triplicata A anaacutelise

avaliou a recuperaccedilatildeo relativa comparando-se a extraccedilatildeo dos analitos a partir da matriz

de soro com a de aacutegua atraveacutes da passagem da amostra pela coluna de extraccedilatildeo (RAM)

A recuperaccedilatildeo relativa se daacute pela relaccedilatildeo das concentraccedilotildees nas duas matrizes

(concentraccedilatildeo no soro concentraccedilatildeo na aacutegua) x 100

O efeito residual (carry-over) foi avaliado injetando-se uma amostra de soro

branco antes de uma amostra de soro dopado na maior concentraccedilatildeo e apoacutes foi injetada

novamente uma amostra de soro branco foram inferior a 20 daqueles obtidos no LQ

Para avaliar o efeito matriz foram comparados os resultados da anaacutelise das

amostras de soro dopadas com os analitos em diferentes concentraccedilotildees em matrizes

diferentes (aacutegua e soro) O resultado para ser aceito precisava ser inferior a 15

Posteriormente foi realizada a mensuraccedilatildeo dos analitos em amostras reais de

soro provenientes de pacientes submetidos ao tratamento antitabagismo com doses

conforme bula As Figuras 23 e 24 mostram os cromatogramas de amostras de pacientes

submetidos ao tratamento com bupropiona e vareniclina respectivamente No momento

da coleta das amostras os pacientes estavam fumando e aleacutem de apresentarem os

analitos provenientes dos faacutermacos tambeacutem mostraram a presenccedila de analitos

provenientes da nicotina

67

Figura 23 - Cromatograma obtido atraveacutes da anaacutelise das amostras de soro dos pacientes

tratados com bupropiona (150 mg 2xdia) Os pacientes estavam fumando em torno de 10

cigarrosdia no dia da coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C-

hidroxibup (mz 256rarr mz 238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F-


244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz 134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz

196rarr mz 80) Fonte do autor e do colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG

Figura 24 - Cromatograma obtido atraveacutes da analise de amostras de soro de pacientes tratados

com vareniclina (10 mg 2xdia) Os pacientes fumavam em torno de 10 cigarrosdia no dia da

coleta A- Var (mz 212rarr mz 169) B- Bup (mz 240rarr mz 131) C- hidroxibup (mz 256rarr mz

238) D- Nic (mz 163rarr mz 117) E- Cot (mz 177rarr mz 80) F- Hidroxicot (mz 193rarr mz 80) G-

Var d-4 (mz 216rarr mz 48) H- Hidroxibup d-6 (mz 262rarr mz 244) I- Nic d-4 (mz 167rarr mz

134) J- Cot d-3 (mz 180rarr mz 80) K- Hidroxicot d-3 (mz 196rarr mz 80) Fonte do autor e do

colaborador Dr Henrique Dipe de Faria LATF Unifal-MG

68

Tabela 6 - Paracircmetros de validaccedilatildeo obtidos na determinaccedilatildeo de faacutermacos antitabagismo em soro humano

Meacutedia plusmn Desvio padratildeo (n=6) amenor bmeacutedio e calto niacutevel de calibraccedilatildeo 1Estabilidade de bancada (4 a 24 horas) Precisatildeo RSD = [Desvio padratildeomeacutedia] x 100 E = [(Meacutedia experimental da

concentraccedilatildeo Concentraccedilatildeo nominal) x 100] ndash 100 2Efeito matriz E= [(Meacutedia da concentraccedilatildeo experimental no solventeMeacutedia experimental da concentraccedilatildeo no soro) x 100] ndash 100

Paracircmetros de validaccedilatildeo Vareniclina Bupropiona Hidroxibupropiona Nicotina Cotinina Hidroxicotinina

Intervalo linear (microg L-1) 5-100 1-1000 1-2000 5-1000 5-1000 5-1000

r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999

Decliacutenio (α) ( n=6) 00196plusmn 00095 00045plusmn00059 00051plusmn00057 00087plusmn00012 00073plusmn00048 00075plusmn00074

Intercepto ( n=6) -00316plusmn00004 -00022plusmn00020 00230plusmn00025 -00046plusmn00065 00767plusmn00012 01918plusmn00013

Tempo de retenccedilatildeo (min) 521 501 485 497 446 441

LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50

Precisatildeo intra-ensaio RSD ( n=6) 93a

30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c

Precisatildeo inter-ensaio RSD ( n=18 trecircs dias) 185a

115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c

Acuraacutecia intra-ensaio E ( n=6) 196a

54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c

Acuraacutecia inter-ensaio E ( n=18 trecircs dias) 82a

-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c

Recuperaccedilatildeo da extraccedilatildeo ( n=3) 883a

1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69

525 Dados cliacutenicos e demograacuteficos dos pacientes submetidos a mensuraccedilatildeo dos

analitos

As Tabelas 7 a 10 mostram as caracteriacutesticas cliacutenicas e demograacuteficas dos

pacientes submetidos agraves anaacutelises de concentraccedilatildeo dos analitos

As Tabelas 7 e 8 referem-se aos pacientes tratados com vareniclina sendo

considerado o grupo total e os grupos de desfecho respectivamente Os pacientes do

grupo resistente agrave vareniclina fumavam um maior nuacutemero de cigarrosdia (antes do

tratamento) em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso (21 vs 17

cigarrosdia P= 005)

As Tabelas 9 e 10 referem-se aos pacientes tratados com bupropiona no grupo

total e de acordo com desfecho respectivamente O grupo resistente ao tratamento com

bupropiona apresentou maior frequecircncia de pacientes com alta DN (atraveacutes dos escores

FTND e Issa categorizados) e de pacientes que fumavam no dia da coleta em

comparaccedilatildeo ao grupo sucesso (FTNDge6= 833 vs 429 P= 005 Escore Issage3=

1000 vs 429 P= 0001 fumo no dia da coleta= 1000 vs 429 P= 0001

respectivamente)


vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 74)





10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1

Cigarrosdia inicial 19 plusmn 10

Fumo no dia da coleta () 919

FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176


Fagerstroumlm test for nicotine dependence (escala de 0 a 10 pontos)

Escore Issa = escore de consumo situacional Issa (escala de 0 a 4

pontos)


vareniclina submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com o

desfecho de tratamento

Resistente (n=41) Sucesso (n=33) P valor






Fumo no dia da coleta () 976 848 008


FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71


bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos (n= 31)







FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)


bupropiona submetidos agraves anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com

o desfecho de tratamento









FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)

526 Anaacutelise de associaccedilatildeo dos analitos com desfecho de tratamento

A Tabela 11 mostra a frequecircncia do desfecho de tratamento de acordo com os

medicamentos antitabagismo pacientes estes cujas amostras de soro foram submetidas agrave

mensuraccedilatildeo dos analitos

Tabela 11 ndash Frequecircncia do desfecho de tratamento nos pacientes submetidos agraves

anaacutelises das concentraccedilotildees dos analitos de acordo com os medicamentos

antitabagismo

Medicamento Resistente () Sucesso ()

Vareniclina (n=74) 544 446

Bupropiona (n=31) 774 226

As Tabelas de 12 a 15 mostram as concentraccedilotildees dos analitos nas amostras de

soro dos pacientes tratados com vareniclina e bupropiona no grupo total e de acordo


Os pacientes do grupo resistente tanto os pacientes tratados com vareniclina

(Tabela 13) quanto com bupropiona (Tabela 15) apresentaram concentraccedilatildeo

significativamente maior de cotinina e hidroxicotinina do que os grupos sucesso

(tratamento com vareniclina cotinina= 1182 vs 706 μgL P= 0009 hidroxicotinina=

845 vs 516 μgL P= 002 Tratamento com bupropiona cotinina= 1346 vs 160 μgL

P= 0005 hidroxicotinina= 972 vs 374 μgL P= 0004) No entanto quanto ao NMR

natildeo houve diferenccedila entre os desfechos de tratamento de ambos os faacutermacos Aleacutem

73

disso somente o grupo de pacientes tratados com vareniclina continha pacientes com

NMRlt031 (metabolizadores lentos para nicotina) e ainda sua frequecircncia foi baixa

(100 e 43 para os grupos de desfecho resistente e sucesso respectivamente)

Tabela 12 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos nas amostras de soro dos pacientes tratados

com vareniclina

Vareniclina μgL n=71 83 (81 ndash 95)

Nicotina μgL n=31 75 (76 ndash 112)

Cotinina μgL n=65 1007 (923 ndash 1225)

Hidroxicotinina μgL n=65 681 (638 ndash 874)

NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79

Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de

95) NMR=trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031=

metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido A

hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo

trans-3- hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade

de outros isocircmeros satildeo irrelevantes

Tabela 13 ndash Concentraccedilatildeo dos analitos de acordo com o desfecho de tratamento

com vareniclina

Resistente Sucesso P

valor Vareniclina μgL n=71 84 (78 ndash 99) 83 (77 ndash 97) 096

Nicotina μgL n=31 83 (74 ndash 127) 70 (59 ndash 105) 032


111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009

Hidroxicotinina μgL n=65 845 (702 ndash 1032) 516 (434 ndash 721) 002

NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064

Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=trans-3-

hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e

raacutepido A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina

para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes

74


com bupropiona

Bupropiona μgL n=30 369 (332 ndash 493)

Hidroxibupropiona μgL n=23 7368 (5860 ndash 7824)




NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0

Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR=

trans-3-hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR

ge031= metabolizador normal e raacutepido Natildeo houve pacientes com NRM lt031 A

hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3-

hidroxicotinina para o caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros

satildeo irrelevantes


com bupropiona


valor Bupropiona μgL n=30 372 (331 ndash 533) 300 (214 ndash 481) 048

Hidroxibupropiona μgL n=23 7795 (6078 ndash 8308) 5128 (2957 ndash 8195) 012

Nicotina μgL n=13 71 (62 ndash 109) - -

Cotinina μgL n=27 1346 (1097 ndash 1784) 160 (-195 ndash 712) 0005


NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -

Valores de mediana das concentraccedilotildees (Intervalo de confianccedila de 95) NMR= trans-3-

hidroxicotininacotinina NMR lt031= metabolizador lento NMR ge031= metabolizador normal e raacutepido

No grupo sucesso somente 1 paciente apresentou concentraccedilatildeo de nicotina Natildeo houve pacientes com NRM

lt031 A hidroxicotinina mensurada no soro foi considerada como sendo trans-3- hidroxicotinina para o

caacutelculo do NMR jaacute que a quantidade de outros isocircmeros satildeo irrelevantes

75

6 DISCUSSAtildeO

61 Para os dados da anaacutelise de expressatildeo gecircnica

O presente estudo cliacutenico e exploratoacuterio identificou resultados significativos para

expressatildeo dos genes CHRNA7 e CHRNG de acordo com os tempos de coleta e o

desfecho de tratamento com vareniclina Amostras do grupo resistente nos tempos T2 e

T4 isto eacute jaacute com o uso da vareniclina apresentaram menores niacuteveis de expressatildeo

gecircnica do CHRNA7 comparado agraves amostras do T0 (antes de iniciar o tratamento

farmacoloacutegico) Estes resultados sugerem que o downregulation de α7 pode ter sido

responsaacutevel pela natildeo cessaccedilatildeo do fumo nos indiviacuteduos do grupo resistente o que natildeo foi

observado nas amostras do grupo sucesso

O gene CHRNA7 codifica a subunidade α7 dos nAChRs Esta possui grande

importacircncia estaacute presente em diversos tecidos e possui associaccedilatildeo consistente em

vaacuterios estudos com o processo de dependecircncia agrave nicotina processos cognitivos e

imunoloacutegicos 119-124 Estudos tambeacutem mostraram que haacute um locus contendo duplicaccedilatildeo

do gene CHRNA7 truncada composta pelos exons 5-10 do gene CHRNA7 precidida de

4 exons uacutenicos e uma deleccedilatildeo de dois pares de bases no eacutexon 6 o qual nomearam como

CHRNFAN7 A maioria dos indiviacuteduos possui uma ou duas coacutepias deste gene e satildeo

raros os casos em que esta coacutepia natildeo estaacute presente 125 126

No ceacuterebro de ratos Sprague-Dawley Ryan e Loiacono 119 detectaram niacuteveis de

α7 transcritos em diversos locais como na substacircncia negra compacta (SNpc) na

substacircncia negra reticular (SNpr) na aacuterea tegmental ventral (VTA) no coacutertex e no

hipocampo Os ratos submetidos ao tratamento crocircnico com nicotina mostraram maiores

niacuteveis de mRNA da subunidade α7 em SNpc SNpr e VTA em comparaccedilatildeo ao grupo

controle A VTA faz parte do sistema de recompensa mesoliacutembico o qual eacute muito

estudado nos processos de ND 12 15 No presente estudo (em amostras de PBMC) o

76

grupo de pacientes resistentes tambeacutem apresentou maior expressatildeo de α7 no momento

em que somente a nicotina estava presente no fumo crocircnico Ao introduzir a vareniclina

as expressotildees foram diminuiacutedas nos tempos T2 e T4 provavelmente devido ao

antagonismo competitivo da vareniclina com a nicotina no receptor

Benhammou et al 127 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem

de fumantes e com amostras de sangue de voluntaacuterios fumantes e natildeo fumantes Atraveacutes

do uso de nicotina radiomarcada nas amostras de ceacuterebro mostraram que os siacutetios de

ligaccedilatildeo agrave nicotina foram aumentados proporcionamente conforme o nuacutemero de cigarros

por dia O mesmo estudo ao analizar a expressatildeo gecircnica e proteiacutenas em linfoacutecitos e

ceacutelulas polimorfonucleares para um subconjunto de subunidades de receptores

nicotiacutenicos essas ceacutelulas assim como no tecido cerebral exibiram maiores nuacutemeros de

siacutetios de ligaccedilatildeo de alta afinidade agrave nicotina em fumantes em comparaccedilatildeo com natildeo

fumantes

A vareniclina em estudos funcionais mostrou ter atividade agonista total nos

receptores α7 40 Em um estudo realizou-se o tratamento crocircnico com vareniclina eou

nicotina em camundongos (10 dias) os niacuteveis das drogas no ceacuterebro e no plasma e a

toleracircncia e a expressatildeo de 4 subtipos de nAChR apoacutes dose aguda de nicotina foram

checados usando autoradiografia O upregulation de receptores α4β2 devido ao

tratamento crocircnico com vareniclina foi similar ao promovido pela nicotina e tambeacutem

ocorreu dowregulation de α6β2 assim como ocorreu com o uso de nicotina A

vareniclina aumentou significantemente os siacutetios de α3β4 e α7 enquanto a nicotina teve

menor efeito nestes siacutetios A combinaccedilatildeo da nicotina com a vareniclina foi similar agrave

vareniclina sozinha para os siacutetios de α3β4 enquanto para o siacutetio de α7 a combinaccedilatildeo

promoveu upregulation em menos regiotildees cerebrais em comparaccedilatildeo com a vareniclina

em monoterapia 77

77

No presente estudo os pacientes do grupo resistente apresentaram efeito

semelhante associado ao uso combinado de vareniclina e nicotina (devido ao fumo) os

niacuteveis de expressatildeo de CHRNA7 natildeo foram mantidos como nos pacientes que obtiveram

sucesso no tratamento No entanto o grupo sucesso soacute estava utilizando a vareniclina na

ausecircncia de nicotina entre os tempos T2 e T4 o que sugere que esse dowregulation

pode ocorrer em subgrupo de resposta

Diversos estudos mostraram diferenccedilas na expressatildeo gecircnica de a7 em

amostras de pacientes com diagnoacutesticos psiquiaacutetricos em comparaccedilatildeo com indiviacuteduos

sadios 102 128-134

Kunii et al 128 mostraram diferenccedila na expressatildeo de a7 em coacutertex preacute-frontal

dorsolateral post mortem de pacientes com depressatildeo ansiedade e transtorno bipolar e

inuacutemeros estudos mostraram menores niacuteveis de expressatildeo de α7 em pacientes com

esquizofrenia 102 129-134

Estudos de indiviacuteduos com esquizofrenia satildeo oacutetimos modelos para o

entendimento da importacircncia do receptor a7 em processos cognitivos em ND e em

como esses mecanismos estatildeo intimamente relacionados Diversos estudos mostraram

que haacute uma maior prevalecircncia de tabagismo em indiviacuteduos com esquizofrenia

comparados agrave populaccedilatildeo geral 135 136

Mexal el al 102 realizaram um estudo com amostras de ceacuterebro post mortem

provenientes de indiviacuteduos de 4 grupos distintos controle natildeo fumante controle

fumante pacientes com esquizofrenia natildeo fumantes e pacientes com esquizofrenia

fumantes O estudo realizou ensaio de expressatildeo de mRNA e de proteiacutena atraveacutes de

PCR quantitativo em tempo real e western blot As sondas da PCR foram desenhadas

para amplificar o gene completo CHRNA7 e sua coacutepia duplicada o CHRFAM7A Natildeo

fumantes com esquizofrecircnia apresentaram expressatildeo reduzida de mRNA e de proteiacutena

78

em relaccedilatildeo aos pacientes com esquizofrenia fumantes Natildeo fumantes com esquizofrenia

apresentaram menor expressatildeo em relaccedilatildeo ao controle natildeo fumante mas essa diferenccedila

foi estatisticamente significativa apenas no niacutevel do mRNA Outros estudos post

mortem cerebral mostraram menor expressatildeo dos receptores nicotiacutenicos no coacutertex e no

hipocampo de indiviacuteduos com esquizofrecircnia comparado aos controles saudaacuteveis 129-134

O CHRFAM7A assim como o CHRNA7 eacute polimoacuterfico e variantes neste gene

foram associadas agrave patologia auditoacuteria em casos de esquizofrenia Processos

diferenciados nos mecanismos de transcriccedilatildeo podem contribuir para um funcionamento

anormal de a7 como variaccedilotildees em promotor splicing alternativo eou desequiliacutebrio de

ligaccedilatildeo com o SNP do gene de neuroregulina -1 (gene que codifica moleacutecula de adesatildeo

celular envolvida em processos de neuroplasticidade sinaacuteptica) Estes processos podem

estar envonvidos em endofenoacutetipos da doenccedila 122 126 137-144

A nicotina parece melhorar a audiccedilatildeo em indiviacuteduos com deacuteficit auditoacuterio na

esquizofrenia associado ao α7 permitindo uma melhor filtragem dos estiacutemulos

auditivos estranhos A nicotina melhora a cogniccedilatildeo na esquizofrenia e agentes

alternativos que ativam o receptor nicotiacutenico foram testados e esses compostos

melhoraram a atenccedilatildeo a memoacuteria de trabalho e os sintomas negativos em um estudo

complementar de pacientes natildeo fumantes com esquizofrenia 145

Os estudos citados nos mostram grandes evidecircncias da associaccedilatildeo do α7 com

ND processos cognitivos e de resposta agrave vareniclina Esses achados podem explicar

nossos resultados em relaccedilatildeo agrave diminuiccedilatildeo da expressatildeo de 7 no grupo de pacientes

resistentes ao tratamento Os pacientes do grupo sucesso mantiveram os niacuteveis de

expressatildeo gecircnica em resposta agrave vareniclina jaacute no grupo resistente houve um

dowregulation Sugerimos que essa diminuiccedilatildeo pode ter sido a responsaacutevel ao menos

em parte pelos indiviacuteduos natildeo terem conseguido deixar de fumar A nicotina pode estar

79

compensando um deacuteficit de α7 que os indiviacuteduos resistentes podem apresentar No

entanto natildeo sabemos como seria a expressatildeo de α7 nestes indiviacuteduos na ausecircncia do

fumo

Quanto ao gene CHNRG natildeo haacute muitos resultados na literatura Este codifica

a subunidade γ dos receptores nicotiacutenicos A maioria dos estudos aponta associaccedilatildeo da

subunidade com distuacuterbios esqueleacutetico-musculares 146-149

No entanto King et al 65 encontraram a associaccedilatildeo de polimorfismos neste

gene com nausea no tratamento com vareniclina E Keskitalo-Vuokko 150 et al

encontraram associaccedilatildeo de SNPs em loci do cluster de genes CHRNGCHRND (genes

muitos proacuteximos o uacuteltimo codifica a subunidade delta dos nAChRs) com o niacutevel de

cotinina Saccone et al 151 encontraram a associaccedilatildeo de 4 loci no cluster

CHRNDCHRNG com ND Em outro estudo variantes nos genes CHRNDCHRNG

mostraram associaccedilatildeo modesta com o risco de ND em amostras de afro-americanos 152

Em um estudo o qual foi utilizado um modelo de esquizofrenia em ratos no

grupo de animais tratados com clozapina foi encontrado downregulation do Chrng no

nuacutecleo accumbens Neste mesmo estudo Santoro et al natildeo conseguiram formular uma

hipoacutetese para o achado devido ao lack de informaccedilotildees na literatura com o foco em ND

ou performance cognitiva 153

Haacute algumas limitaccedilotildees no estudo Primeira o ensaio da anaacutelise de expressatildeo

gecircnica foi realizado com amostras de sangue perifeacuterico e natildeo no SNC o que poderia nos

mostrar uma relaccedilatildeo mais clara e direta do faacutermaco com a via de resposta No entanto a

obtenccedilatildeo desta amostra eacute inviaacutevel Em contrapartida estudos jaacute demonstraram que haacute

similaridade entre a expressatildeo gecircnica de ceacutelulas do SNC e de ceacutelulas de sangue

perifeacuterico para alguns destes genes de receptores nicotiacutenicos 102 Segunda natildeo foi

realizado ensaio de expressatildeo gecircnica para amostras de indiviacuteduos natildeo fumantes o que

80

poderia fornecer mais paracircmetros de comparaccedilatildeo com os grupos resistente e sucesso

Terceira natildeo conseguimos qualidade necessaacuteria nas anaacutelises de genes potencialmente

importantes

62 Para os dados da mensuraccedilatildeo dos analitos

Um dos maiores desafios em anaacutelises de amostras bioloacutegicas eacute eliminar os

interferentes de sua matriz sem alterar substancialmente as quantidades dos analitos

presentes A matriz de amostras de soro e plasma satildeo complexas e envolve a presenccedila

de inuacutemeras macromoleacuteculas como lipiacutedios e proteiacutenas que obstruem colunas anaacuteliticas

diminuem o tempo de duraccedilatildeo de equipamentos e inviabilizam a interpretaccedilatildeo dos

dados devido a imensos picos e ruiacutedos formados nos cromatogramas e espectros de

massa Inumeros trabalhos executam uma preparaccedilatildeo preacutevia das amostras que envolve

processos como a extraccedilatildeo com uso de solventes preciptaccedilatildeo de proteiacutenas entre outros

os quais podem promover uma baixa recuperaccedilatildeo dos analitos tempo prolongado de

bancada e gasto de materiais 51 104-106

Devido agrave esse fato inuacutemeros estudos propuseram o uso de materiais de acesso

restrito (RAMs) para a purificaccedilatildeo da amostra sem tanto manuseio dentre eles estatildeo os

nanotubos de carbono (CNTs) modificados 109 110 114-116

O presente estudo desenvolveu uma coluna extratora composta por nanotubos

hiacutebridos de carbono e siacutelica modificados quimicamente com a adiccedilatildeo de grupos

hidrofiacuteficos Essa coluna permitiu uma oacutetima exclusatildeo de macromoleacuteculas (98) A

aacutegua ultra pura foi o suficiente para ser utilizada como fase moacutevel de carregamento o

que eacute sustentaacutevel aleacutem de natildeo causar danos ao meio ambiente e o uacutenico preparo da

amostra foi uma diluiacuteccedilatildeo 11 tambeacutem em aacutegua O novo RAM desenvolvido foi

81

encaminhado para pedido de patente (Anexo 5) e portanto os processos para o seu

desenvolvimento foram mantidos em sigilo

Os CNTs possuem uma grande aacuterea superfiacutecial e oacutetima estabilidade em anaacutelise

de compostos no entanto o material natildeo promove a remoccedilatildeo de proteiacutenas com

eficiecircncia 110 115 Os poros dos CNTs formam uma barreira fiacutesica excluindo ou

permitindo a entrada de moleacuteculas por tamanho e os grupos hidrofiacutelicos adicionados ao

RAM desenvolvido natildeo permitem a ligaccedilatildeo de proteiacutenas de forma irreversiacutevel

formando uma barreira fiacutesico-quiacutemica Os demais CNTs natildeo modificados disponiacuteveis

natildeo promovem a exclusatildeo de macromoleacuteculas com tanta efetividade quanto o material

desenvolvido aleacutem disso o novo RAM apoacutes limpeza pode ser reutilizado cerca de 400

vezes (valor calculado durante os experimentos com amostras controle)

Quanto a otimizaccedilatildeo do meacutetodo de mensuraccedilatildeo a anaacutelise multidimensional

atraveacutes de equipamentos conectados por vaacutelvulas comutadoras promoveu a realizaccedilatildeo

da extraccedilatildeo eluiccedilatildeo anaacutelise limpeza e recondicionamento do sistema automaacuteticamente

A anaacutelise completa de uma amostra foi realizada em apenas 15 minutos O sistema

permitiu a mensuraccedilatildeo conjunta de diversos analitos com caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas

diferentes de uma mesma amostra mostrando bons sinais analiacuteticos e perfis

cromatograacuteficos

Quanto aos dados de validaccedilatildeo o meacutetodo permitiu uma oacutetima recuperaccedilatildeo dos

analitos com valores proacuteximos a 100 semelhante a outros estudos 104 117 154 155 A

maior dificuldade encontrada neste estudo foi a configuraccedilatildeo de paracircmetros

espectromeacutetricos e cromatograacuteficos que pudessem obter o maacuteximo de recuperaccedilatildeo e o

menor LQ possiacutevel para a anaacutelise de vareniclina ainda em um contexto de anaacutelise

multianalito

82

A dose posoloacutegica da vareniclina eacute muito baixa (1mg 2 vezes ao dia a partir do

8deg dia de tratamento) em comparaccedilatildeo com a da bupropiona (150 mg 2 vezes ao dia a

partir do 8deg dia de tratamento) dessa forma as concentraccedilotildees plasmaacuteticas de

vareniclina satildeo muito baixas Apesar do valor de LQ obtido (5 μg L-1) estar entre as

meacutedias plasmaacuteticas de intervalo terapecircutico (40 -70 μg L-1 de vareniclina em plasma e

soro) 51 118 ao mensurar amostras de pacientes em um cenaacuterio real de tratamento de 74

pacientes apenas 3 amostras apresentaram concentraccedilatildeo plasmaacutetica de vareniclina

abaixo do limite de quantificaccedilatildeo

Quanto a recuperaccedilatildeo do analito da matriz a vareniclina tambeacutem mostrou menor

taxa (883) em relaccedilatildeo aos outros analitos (valores proacuteximos ao 100) no entanto

essa taxa de recuperaccedilatildeo eacute considerada alta e foi semelhante ao estudo de Dobrinas et al

156 o qual realizou a extraccedilatildeo da amostra atraveacutes de coluna extratora de fase soacutelida

(SPE) disponiacutevel no mercado e a mensuraccedilatildeo tambeacutem foi realizada em um contexto

multianalito E ainda a recuperaccedilatildeo de vareniclina no presente estudo foi maior do que

a obtida pelo trabalho de Al-Haj et al 105 o qual realizou a preparaccedilatildeo preacutevia da amostra

por extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido (LLE) e a mensuraccedilatildeo foi realizada para somente um

analito (4759 - 4872) e obteve recuperaccedilatildeo semelhante ao estudo de os qual

tambeacutem realizou a anaacutelise de vareniclina em um cenaacuterio multianalito (830 ndash 920)

Para nicotina e cotinina os valores de LQ obtidos no presente estudo (50 μg L-1)

se assemelham aos obtidos nos estudos de Abdallah et al 104 (70 μg L-1 para cotinina)

Onoue et al 157 (50 μg L-1 para nicotina e cotinina) Petersen et al 117 (50 μg L-1) Para

bupropiona e hidroxibupropiona o meacutetodo proposto eacute capaz de mensurar pequenas

quantidades do faacutermaco e de seu metaboacutelito (LQ 10 μg L-1 para ambos) quantidades

menores do que os LQs obtidos nos estudos de 158 (55 para bupropiona e 60 μgL para

83

hidroxibupropiona) e de 155 (100 μg L-1 para hidroxibupropiona) apesar das

concentraccedilotildees de metaboacutelitos em estado de equiliacutebrio em pacientes tratados com doses

terapecircuticas do faacutermaco serem bem maiores (45 ndash 75 μg L-1 e de 500 ndash 1500 μg L-1)

respectivamente para bupropiona e hidroxibupropiona 118

O Quadro 6 mostra os paracircmetros analiacuteticos do presente estudo comparados com

outros estudos presentes na literatura

Quanto agraves mensuraccedilotildees das amostras dos pacientes natildeo encontramos associaccedilatildeo

dos faacutermacos e seus metaboacutelitos com desfecho de tratamento Esse fato poderia ser

explicado pelo pequeno nuacutemero amostral do presente estudo

Encontramos diferenccedila significativa entre os grupos resistente e sucesso ao

tratamento quanto aos paracircmetros relacionados ao fumo e agrave DN Os pacientes do grupo

resistente tratados com vareniclina (ainda antes do iniacutecio do tratamento) fumavam um

maior nuacutemero de cigarrosdia em comparaccedilatildeo com os pacientes que obtiveram sucesso

O grupo resistente ao tratamento com bupropiona apresentou maior frequecircncia de

pacientes com alta DN (antes do tratamento) e de pacientes que fumavam no dia da

coleta em comparaccedilatildeo ao grupo sucesso Os dados tambeacutem mostraram que os pacientes

resistentes tratados com ambos os faacutermacos no dia da coleta apresentaram maiores

concentraccedilotildees dos metaboacutelitos da nicotina Esses dados podem indicar maior exposiccedilatildeo

ao fumo e maior DN podendo implicar na resposta ao tratamento antitabagismo

Haacute algumas limitaccedilotildees nesse estudo Primeira os pacientes natildeo fizeram exames

de funccedilatildeo hepaacutetica antes da inclusatildeo no entudo no entanto a presenccedila de comorbidades

hepaacuteticas foram questionadas Segunda natildeo podemos obter total rigor nos horaacuterios de

tomada dos medicamentos por parte dos pacientes no entanto os pacientes foram

84

orientados agrave tomar o medicamento sempre no mesmo horaacuterio e foram questionados

quanto ao cumprimento do protocolo Terceira o nuacutemero amostral para a anaacutelise dos

analitos e de NRM em estudos de associaccedilatildeo com desfecho de tratamento eacute considerado

modesto e consequentemente pode ter implicado nos resultados de natildeo associaccedilatildeo

85

Quadro 6 ndash Comparaccedilatildeo dos dados de validaccedilatildeo com outros estudos

Analitos Purificaccedilatildeo da

amostraextraccedilatildeo Meacutetodo Amostra Intervalo Linear (μg L-1) Recuperaccedilatildeo () LD μg L-1 LQ μg L-1 Referecircncia

Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo

RAM) HPLC-MSMS Soro humano

50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna

Cotinina LLE (LCndashMSMS) Soro humano

03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona

Hidroxibupropiona PP + SPE online TFCndashMSMS) Soro humano 50 ndash 10000

1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158

Vareniclina LLE HPLCndashMSMS

(API) Plasma humano 01ndash100 4759 - 4872 005 01

Al-Haj et al 105

Vareniclina LLE HPLC-

APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10

mg 96-well extraction

plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina

Cotinina Centrifugaccedilatildeo

Diluiccedilatildeo

isotoacutepica estaacutevel

ndash UPLC-

MSMS

Urina 50 ndash 350000 968ndash1051

943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154

Nicotina e Cotinina LLE PP SPE

(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato

100 ndash 6000 (plasma)

80 (nicotina e

cotininacom

precipitaccedilatildeo)

25 50 Onoue et al

157

Cotinina LL SPE (coluna

Zorbaxs XDB C8) HPLCUV Soro e urina 50 ndash 5000 978 ndash 102 018 50

Petersen et

al 117

hidroxibupropiona PP + SPE online RP‐HPLCUV Plasma humano 1000 - 25000 6118 1000 1000

Scherf-

Clavel et al 155

CS ndash SPE= Extraccedilatildeo em fase soacutelida no modo column switching LLE= extraccedilatildeo liacutequido-liacutequido PP=precipitaccedilatildeo de proteiacutenas SPE=extraccedilatildeo em fase soacutelida HPLC= cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia

UPLC=cromatografia liacutequida de ultra eficiecircncia RP‐HPLC=Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia em fase reversa TFC=Cromatografia liacutequida turbulenta API=ionizaccedilatildeo em pressatildeo atmosfeacutericaUV=

detector ultravioleta MSMS= espectometria de massas em tandem

87

7 CONCLUSOtildeES

Para a anaacutelise da expressatildeo gecircnica este estudo exploratoacuterio mostra a associaccedilatildeo

das subunidades α7 e γ com a efetividade do tratamento com vareniclina Estes

resultados poderiam contribuir ao menos em parte para o desenvolvimento de uma

terapecircutica individualizada

Para a mensuraccedilatildeo de analitos o novo RAM sintetizado eacute um produto de


de matrizes complexas sem muita preparaccedilatildeo preacutevia Para a associaccedilatildeo das



88

8 SUGESTOtildeES PARA ESTUDOS FUTUROS

Sugerimos estudos que promovam maior entendimento das subunidades α7 e γ

dos nAChRs nos processos de dependecircncia agrave nicotina e no tratamento com vareniclina

Sugerimos tambeacutem estudos de investigaccedilatildeo para novas aplicabilidades do novo RAM

desenvolvido

89

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cessation Nicotine Tob Res 20079(8)821-833

70 Lerman C Shields PG Wileyto EP Audrain J Pinto A Hawk L Krishnan S

Niaura R Epstein L Pharmacogenetic investigation of smoking cessation

treatment Pharmacogenetics 200212(8)627-634

71 Han DH Joe KH Na C Lee YS Effect of genetic polymorphisms on smoking

cessation a trial of bupropion in Korean male smokers Psychiatr Genet

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72 Zanger UM Klein K Pharmacogenetics of cytochrome P450 2B6 (CYP2B6)

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2013424

73 Zhu AZ Cox LS Nollen N Faseru B Okuyemi KS Ahluwalia JS Benowitz

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95

74 Laib AK Brunen S Pfeifer P Vincent P Hiemke C Serum concentrations of

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bupropion Ther Drug Monit 201436(4)473-479

75 Hutchison KE Allen DL Filbey FM Jepson C Lerman C Benowitz NL Stitzel

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gene regulation to treatment outcome Arch Gen Psychiatry 200764(9)1078-

1086

76 Smith RC Zhubi A Maloku E Sershen H Lajtha A Davis JM Costa E

Guidotti A Varenicline treatment decreases DNMT1 mRNA expression in

lymphocytes of schizophrenic patients who are cigarette smokers Schizophr

Res 2010119(1-3)269-270

77 Marks MJ ONeill HC Wynalda-Camozzi KM Ortiz NC Simmons EE Short

CA Butt CM McIntosh JM Grady SR Chronic treatment with varenicline

changes expression of four nAChR binding sites in mice Neuropharmacology

201599142-155

78 Middleton FA Pato CN Gentile KL McGann L Brown AM Trauzzi M Diab

H Morley CP Medeiros H Macedo A Azevedo MH Pato MT Gene

expression analysis of peripheral blood leukocytes from discordant sib-pairs

with schizophrenia and bipolar disorder reveals points of convergence between

genetic and functional genomic approaches Am J Med Genet B Neuropsychiatr

Genet 2005136B(1)12-25

79 Takahashi M Hayashi H Watanabe Y Sawamura K Fukui N Watanabe J

Kitajima T Yamanouchi Y Iwata N Mizukami K Hori T Shimoda K Ujike H

Ozaki N Iijima K Takemura K Aoshima H Someya T Diagnostic

classification of schizophrenia by neural network analysis of blood-based gene

expression signatures Schizophr Res 2010119(1-3)210-218

80 Lee J Goh LK Chen G Verma S Tan CH Lee TS Analysis of blood-based

gene expression signature in first-episode psychosis Psychiatry Res

2012200(1)52-54

81 Sullivan PF Fan C Perou CM Evaluating the comparability of gene expression

in blood and brain Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet

2006141B(3)261-268

82 Hennings JM Uhr M Klengel T Weber P Putz B Touma C Czamara D Ising

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suggests retinoid-related orphan receptor alpha as a biomarker for antidepressant

response Transl Psychiatry 20155e538

83 Ota VK Noto C Gadelha A Santoro ML Silva PN Melaragno MI Smith Mde

A Cordeiro Q Bressan RA Belangero SI Neurotransmitter receptor and

regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-

96

episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment Psychiatry

Res2013210(3)1290-1292

84 Kordi-Tamandani DM Tajoddini S Salimi F Promoter Methylation and BDNF

and DAT1 Gene Expression Profiles in Patients with Drug Addiction

Pathobiology 201582(2)94-99

85 Wongsriraksa A Parsons ME Whelan CJ Characterisation of nicotine receptors

on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Inflamm Res

200958(1)38-44

86 Kawashima K Fujii T Expression of non-neuronal acetylcholine in

lymphocytes and its contribution to the regulation of immune function Front

Biosci 200492063-2085

87 St-Pierre S Jiang W Roy P Champigny C LeBlanc E Morley BJ Hao J

Simard AR Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate Bone Marrow-Derived

Pro-Inflammatory Monocyte Production and Survival PLoS One

201611(2)e0150230

88 Zdanowski R Krzyzowska M Ujazdowska D Lewicka A Lewicki S Role of

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pathways Cent Eur J Immunol 201540(3)373-379

89 Baez-Pagan CA Delgado-Velez M Lasalde-Dominicci JA Activation of the

Macrophage alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor and Control of

Inflammation J Neuroimmune Pharmacol 201510(3)468-476

90 Kalkman HO Feuerbach D Modulatory effects of alpha7 nAChRs on the

immune system and its relevance for CNS disorders Cell Mol Life Sci

201673(13)2511-2530

91 Zakrzewicz A Richter K Agne A Wilker S Siebers K Fink B Krasteva-Christ

G Althaus M Padberg W Hone AJ McIntosh JM Grau V Canonical and

Novel Non-Canonical Cholinergic Agonists Inhibit ATP-Induced Release of

Monocytic Interleukin-1beta via Different Combinations of Nicotinic

Acetylcholine Receptor Subunits alpha7 alpha9 and alpha10 Front Cell

Neurosci201711189

92 Arreola R Alvarez-Herrera S Perez-Sanchez G Becerril-Villanueva E Cruz-

Fuentes C Flores-Gutierrez EO Garces-Alvarez ME de la Cruz-Aguilera DL

Medina-Rivero E Hurtado-Alvarado G Quintero-Fabian S Pavon L

Immunomodulatory Effects Mediated by Dopamine J Immunol

Res20163160486

93 Nakajima M Yamamoto T Nunoya K Yokoi T Nagashima K Inoue K Funae

Y Shimada N Kamataki T Kuroiwa Y Role of human cytochrome P4502A6 in

C-oxidation of nicotine Drug Metab Dispos 199624(11)1212-1217

97

94 Messina ES Tyndale RF Sellers EM A major role for CYP2A6 in nicotine C-

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1997282(3)1608-1614

95 Chen A Krebs NM Zhu J Muscat JE Nicotine metabolite ratio predicts

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Depend201819089-93

96 Shahab L BL McNeill Tyndale RF Does the nicotine metabolite ratio

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97 Lea RA Dickson S Benowitz NL Within-subject variation of the salivary

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98 Mooney ME Li ZZ Murphy SE Pentel PR Le C Hatsukami DK Stability of

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99 Piestansky J Marakova K Veizerova L Galba J Mikus P On-line column

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time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods

200125(4)402-408

104 Abdallah IA Hammell DC Stinchcomb AL Hassan HE A fully validated LC-

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using nicotine transdermal delivery systems with standard heat application in

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77

98

105 Al-Haj A Alawi M Arafat T Hourani MK Method development validation

and bioequivalence of varenicline in human plasma by liquid chromatography

tandem mass spectrometry J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci

2013931134-139

106 Hegstad S Stray-Pedersen A Olsen L Vege A Rognum TO Morland J

Christophersen AS Determination of cotinine in pericardial fluid and whole

blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Anal Toxicol

200933(4)218-222

107 Santos MG Moraes Gde O Nakamura MG dos Santos-Neto AJ Figueiredo

EC Restricted access molecularly imprinted polymers obtained by bovine serum

albumin andor hydrophilic monomers external layers a comparison related to

physical and chemical properties Analyst 2015140(22)7768-7775

108 de Lima MM Vieira AC Martins I Boralli VB Borges KB Figueiredo EC

On-line restricted access molecularly imprinted solid phase extraction of

ivermectin in meat samples followed by HPLC-UV analysis Food Chem

2015197(Pt A)7-13

109 Barbosa AF Barbosa VM Bettini J Luccas PO Figueiredo EC Restricted

access carbon nanotubes for direct extraction of cadmium from human serum

samples followed by atomic absorption spectrometry analysis Talanta

2016131213-220

110 de Faria HD Abrao LC Santos MG Barbosa AF Figueiredo EC New

advances in restricted access materials for sample preparation A review Anal

Chim Acta 201795943-65

111 FRANQUI L S et al Synthesis and characterization of a magnetic molecularly

imprinted polymer for the selective extraction of nicotine and cotinine from

urine samples followed by GC-MS analysis Anal Methods 2015 7(21) 9237ndash

9244 2015

112 Santos MG Tavares IM Barbosa AF Bettini J Figueiredo EC Analysis of

tricyclic antidepressants in human plasma using online-restricted access

molecularly imprinted solid phase extraction followed by direct mass

spectrometry identificationquantification Talanta 20171638-16

113 US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration

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114 GOMES Raphael A B et al Evaluation of the pH influence on protein

exclusion by restricted access carbono nanotubes coated with bovine serum

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99

115 de Faria HD Rosa MA Silveira AT Figueiredo EC Direct extraction of

tetracyclines from bovine milk using restricted access carbon nanotubes in a

column switching liquid chromatography system Food Chem 201722598-106

116 de Faria HD Bueno CT Krieger JE Krieger EM Pereira AC Santos P

Figueiredo EC Online extraction of antihypertensive drugs and their metabolites

from untreated human serum samples using restricted access carbon nanotubes

in a column switching liquid chromatography system J Chromatogr A

2017152841-52

117 Petersen GO Leite CE Chatkin JM Thiesen FV Cotinine as a biomarker of

tobacco exposure development of a HPLC method and comparison of matrices

J Sep Sci 201033(4-5)516-521

118 Brunen S Vincent PD Baumann P Hiemke C Havemann-Reinecke U

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disorders literature review using a therapeutic drug monitoring appropriateness

rating scale Ther Drug Monit 201133(5)561-572

119 Ryan RE Loiacono RE Nicotine regulates alpha7 nicotinic receptor subunit

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120 Cameli C Bacchelli E De Paola M Giucastro G Cifiello S Collo G Cainazzo

MM Pini LA Maestrini E Zoli M Genetic variation in CHRNA7 and

CHRFAM7A is associated with nicotine dependence and response to varenicline

treatment Eur J Hum Genet 201826(12)1824-1831

121 Wallace TL Bertrand D Importance of the nicotinic acetylcholine receptor

system in the prefrontal cortex Biochem Pharmacol 201385(12)1713-1720

122 Dempster EL Toulopoulou T McDonald C Bramon E Walshe M Wickham H

Sham PC Murray RM Collier DA Episodic memory performance predicted by

the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene

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123 Enioutina EY Myers EJ Tvrdik P Hoidal JR Rogers SW Gahring LC The

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124 Sinkus ML Graw S Freedman R Ross RG Lester HA Leonard S The human

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function Neuropharmacology 201596(Pt B)274-288

125 Gault J Robinson M Berger R Drebing C Logel J Hopkins J Moore T Jacobs

S Meriwether J Choi MJ Kim EJ Walton K Buiting K Davis A Breese C

Freedman R Leonard S Genomic organization and partial duplication of the

human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene (CHRNA7)

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100

126 Riley B Williamson M Collier D Wilkie H Makoff A A 3-Mb map of a large

Segmental duplication overlapping the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor

gene (CHRNA7) at human 15q13-q14 Genomics 200279(2)197-209

127 Benhammou K Lee M Strook M Sullivan B Logel J Raschen K Gotti C

Leonard S [(3)H]Nicotine binding in peripheral blood cells of smokers is

correlated with the number of cigarettes smoked per day Neuropharmacology

200039(13)2818-2829

128 Kunii Y Zhang W Xu Q Hyde TM McFadden W Shin JH Deep-Soboslay A

Ye T Li C Kleinman JE Wang KH Lipska BK CHRNA7 and CHRFAM7A

mRNAs co-localized and their expression levels altered in the postmortem

dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders Am J Psychiatry

2015172(11)1122-1130

129 Breese CR Lee MJ Adams CE Sullivan B Logel J Gillen KM Marks MJ

Collins AC Leonard S Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors

in subjects with schizophrenia Neuropsychopharmacology 200023(4)351-

364

130 Freedman R Hall M Adler LE Leonard S Evidence in postmortem brain tissue

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Psychiatry 199538(1)22-33

131 Guan ZZ Zhang X Blennow K Nordberg A Decreased protein level of

nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain

Neuroreport 199910(8)1779-1782

132 Martin-Ruiz CM Haroutunian VH Long P Young AH Davis KL Perry EK

Court JA Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal

cortex in schizophrenia Biol Psychiatry 200354(11)1222-1233

133 Marutle A Zhang X Court J Piggott M Johnson M Perry R Perry E

Nordberg A Laminar distribution of nicotinic receptor subtypes in cortical

regions in schizophrenia J Chem Neuroanat 200122(1-2)115-126

134 Leonard S Breese C Adams C Benhammou K Gault J Stevens K Lee M

Adler L Olincy A Ross R Freedman R Smoking and schizophrenia abnormal

nicotinic receptor expression Eur J Pharmacol 2000393(1-3)237-242

135 Kumari V Postma P Nicotine use in schizophrenia the self medication

hypotheses Neurosci Biobehav Rev 200529(6)1021-1034

136 de Leon J Diaz FJ A meta-analysis of worldwide studies demonstrates an

association between schizophrenia and tobacco smoking behaviors Schizophr

Res 200576(2-3)135-157

101

137 Flomen RH Collier DA Osborne S Munro J Breen G St Clair D Makoff AJ

Association study of CHRFAM7A copy number and 2 bp deletion

polymorphisms with schizophrenia and bipolar affective disorder Am J Med

Genet B Neuropsychiatr Genet 2006141B(6)571-575

138 Gault J Hopkins J Berger R Drebing C Logel J Walton C Short M Vianzon

R Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R Leonard S Comparison of

polymorphisms in the alpha7 nicotinic receptor gene and its partial duplication

in schizophrenic and control subjects Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet

2003123B(1)39-49

139 Perl O Strous RD Dranikov A Chen R Fuchs S Low levels of alpha7-

nicotinic acetylcholine receptor mRNA on peripheral blood lymphocytes in

schizophrenia and its association with illness severity Neuropsychobiology

200653(2)88-93

140 Raux G Bonnet-Brilhault F Louchart S Houy E Gantier R Levillain D Allio

G Haouzir S Petit M Martinez M Frebourg T Thibaut F Campion D The -2

bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene is a risk

factor for the P50 sensory gating deficit Mol Psychiatry 20027(9)1006-1011

141 Leonard S Gault J Hopkins J Logel J Vianzon R Short M Drebing C Berger

R Venn D Sirota P Zerbe G Olincy A Ross RG Adler LE Freedman R

Association of promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor

subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia Arch Gen

Psychiatry 200259(12)1085-1096

142 Mathew SV Law AJ Lipska BK Davila-Garcia MI Zamora ED Mitkus SN

Vakkalanka R Straub RE Weinberger DR Kleinman JE Hyde TM Alpha7

nicotinic acetylcholine receptor mRNA expression and binding in postmortem

human brain are associated with genetic variation in neuregulin 1 Hum Mol

Genet 200716(23)2921-2932

143 Severance EG Yolken RH Novel alpha7 nicotinic receptor isoforms and

deficient cholinergic transcription in schizophrenia Genes Brain Behav

20087(1)37-45

144 Severance EG Dickerson FB Stallings CR Origoni AE Sullens A Monson

ET Yolken RH Differentiating nicotine- versus schizophrenia-associated

decreases of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor transcript CHRFAM7A

in peripheral blood lymphocytes J Neural Transm (Vienna) 2009116(2)213-

220

145 Olincy A Freedman R Nicotinic mechanisms in the treatment of psychotic

disorders a focus on the alpha7 nicotinic receptor Handb Exp Pharmacol

2012 (213)211-232

146 Kariminejad A Almadani N Khoshaeen A Olsson B Moslemi AR Tajsharghi

H Truncating CHRNG mutations associated with interfamilial variability of the

102

severity of the Escobar variant of multiple pterygium syndrome BMC

Genet201617(1)71

147 Liu Y Wang L Yang YK Liang Y Zhang TJ Liang N Yang LM Li SJ Shan

D Wu QQ Prenatal diagnosis of fetal skeletal dysplasia using targeted next-

generation sequencing an analysis of 30 cases Diagn Pathol 201914(1)76

148 Natera-de Benito D Topf A Vilchez JJ Gonzalez-Quereda L Dominguez-

Carral J Diaz-Manera J Ortez C Bestue M Gallano P Dusl M Abicht A

Muller JS Senderek J Garcia-Ribes A Muelas N Evangelista T Azuma Y

McMacken G Paipa Merchan A Rodriguez Cruz PM Camacho A Jimenez E

Miranda-Herrero MC Santana-Artiles A Garcia-Campos O Dominguez-Rubio

R Olive M Colomer J Beeson D Lochmuller H Nascimento A Molecular

characterization of congenital myasthenic syndromes in Spain Neuromuscul

Disord 201727(12)1087-1098

149 Seo J Choi IH Lee JS Yoo Y Kim NK Choi M Ko JM Shin YB Rare cases

of congenital arthrogryposis multiplex caused by novel recurrent CHRNG

mutations J Hum Genet 201560(4)213-215

150 Keskitalo-Vuokko K Pitkaniemi J Broms U Heliovaara M Aromaa A Perola

M Ripatti S Salminen O Salomaa V Loukola A Kaprio J Associations of

nicotine intake measures with CHRN genes in Finnish smokers Nicotine Tob

Res201113(8)686-690

151 Saccone NL Saccone SF Hinrichs AL Stitzel JA Duan W Pergadia ML

Agrawal A Breslau N Grucza RA Hatsukami D Johnson EO Madden PA

Swan GE Wang JC Goate AM Rice JP Bierut LJ Multiple distinct risk loci

for nicotine dependence identified by dense coverage of the complete family of

nicotinic receptor subunit (CHRN) genes Am J Med Genet B Neuropsychiatr

Genet 2009150B(4)453-466

152 Saccone NL Schwantes-An TH Wang JC Grucza RA Breslau N Hatsukami

D Johnson EO Rice JP Goate AM Bierut LJ Multiple cholinergic nicotinic

receptor genes affect nicotine dependence risk in African and European

Americans Genes Brain Behav 20109(7)741-750

153 Santoro ML Ota VK Stilhano RS Silva PN Santos CM Diana MC Gadelha

A Bressan RA Melaragno MI Han SW Abilio VC Belangero SI Effect of

antipsychotic drugs on gene expression in the prefrontal cortex and nucleus

accumbens in the spontaneously hypertensive rat (SHR) Schizophr Res

2014157(1-3)163-168

154 Kuhn J Vollmer T Martin C Hendig D Knabbe C Fast and sample cleanup-

free measurement of nicotine and cotinine by stable isotope dilution ultra-

performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry J Pharm

Biomed Anal 201267-68137-143

103

155 Scherf-Clavel M Wahl O Menke A Unterecker S Determination of

hydroxybupropion in human serum for routine therapeutic drug monitoring in

psychiatry A tool for dose-individualization in treatment with bupropion

Biomed Chromatogr 201933(10)e4609

156 Dobrinas M Choong E Noetzli M Cornuz J Ansermot N Eap CB

Quantification of nicotine cotinine trans-3-hydroxycotinine and varenicline in

human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry

procedure for a clinical study on smoking cessation J Chromatogr B Analyt

Technol Biomed Life Sci 2011879(30)3574-3582

157 Onoue S Yamamoto N Seto Y Yamada S Pharmacokinetic study of nicotine

and its metabolite cotinine to clarify possible association between smoking and

voiding dysfunction in rats using UPLCESI-MS Drug Metab Pharmacokinet

201126(4)416-422

158 Petrides AK Moskowitz J Johnson-Davis KL Jannetto PJ Langman LJ Clarke

W Marzinke MA The development and validation of a turbulent flow-liquid

chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous

quantification of citalopram sertraline bupropion and hydroxybupropion in

serum Clin Biochem 201447(15)73-79

Rubrica participante Rubrica pesquisador

APEcircNDICE - TCLE

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

HOSPITAL DAS CLIacuteNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SAtildeO

PAULO-HCFMUSP

Registro das explicaccedilotildees do pesquisador ao paciente ou seu representante legal sobre a pesquisa consignando

Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar de um projeto de pesquisa Este projeto tem

como objetivos principais para os indiviacuteduos fumantes submetidos aos tratamentos

farmacoloacutegicos antitabagismo associar o efeito das caracteriacutesticas geneacuteticas (DNA ou RNA) e do

metabolismo (concentraccedilatildeo dos produtos de metabolismo dos medicamentos no sangue) com a

eficiecircncia do tratamento antitabagismo O objetivo do estudo eacute saber por que algumas pessoas

respondem bem aos medicamentos antitabagismo enquanto outras pessoas natildeo respondem e

consequentemente natildeo conseguem parar de fumar Para isto precisaremos de amostras de

sangue cuja quantidade eacute comumente solicitada em exames laboratoriais de rotina (2 tubos a

cada visita = 20mL) Precisaremos tambeacutem do seu consentimento para que dados de seu

prontuaacuterio meacutedico sejam consultados Para os pacientes que utilizaratildeo o medicamento

bupropiona precisaremos de amostras de sangue na primeira consulta (visita T-1) e duas

semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) Para os pacientes que utilizaratildeo

o medicamento vareniclina precisaremos de uma amostra de sangue na primeira consulta (visita

T-1) na segunda consulta ndash ainda antes de iniciar o tratamento com medicamento (visita T0) duas

semanas apoacutes o iniacutecio do tratamento medicamentoso (visita T2) e quatro semanas apoacutes o iniacutecio

do tratamento medicamentoso (visita T4) Os desconfortos mais comuns que podem ocorrer com

sua participaccedilatildeo neste estudo satildeo os mesmos de uma coleta de sangue no braccedilo por exemplo

leve dor no local da punccedilatildeo e eventualmente hematoma local Este sangue seraacute encaminhado

ao Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular do Instituto do Coraccedilatildeo onde seraacute

armazenado somente para a pesquisa Sua participaccedilatildeo eacute totalmente voluntaacuteria Apoacutes ler

entender e esclarecer suas duacutevidas vocecirc assinaraacute 2 vias de igual teor desse documento (termo de

consentimento Livre e Esclarecido) Ainda vocecirc poderaacute solicitar o seu desligamento deste projeto

a qualquer momento bastando para tal entrar em contato os pesquisadores no tel (11) 2661-5592

ou 2661-5995 Em qualquer etapa do estudo vocecirc teraacute acesso aos profissionais responsaacuteveis

pela pesquisa para esclarecimento de eventuais duacutevidas O pesquisador responsaacutevel eacute a Dra

Jaqueline Scholz que pode ser encontrada no endereccedilo Av Dr Eneacuteas de Carvalho Aguiar 44

Instituto do Coraccedilatildeo Bloco 2 andar 1 Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo

INCOR-HCFMUSP telefone (11) 2661-5592 Se vocecirc tiver alguma consideraccedilatildeo ou duacutevida sobre

a eacutetica da pesquisa entre em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa (CEP) ndash Rua Oviacutedio

Pires de Campos 225 ndash 5ordm andar ndash tel (11) 2661-7585 FAX (011) 2661-7585 ndash e-mail


cappesqadmhcfmuspbr Poderaacute tambeacutem solicitar a destruiccedilatildeo das amostras que estaratildeo

armazenadas no mesmo laboratoacuterio

As informaccedilotildees obtidas seratildeo analisadas em conjunto com outros pacientes natildeo sendo

divulgada a identificaccedilatildeo de nenhum paciente Natildeo haveraacute nenhuma despesa por parte do

participante Tambeacutem natildeo haacute compensaccedilatildeo financeira relacionada agrave sua participaccedilatildeo

Benefiacutecio direto para o participante eacute a possibilidade de parar de fumar e ser bem monitorado

durante todo o processo de 12 semanas

Estas informaccedilotildees poderatildeo auxiliar na elaboraccedilatildeo de programas eficazes para o uso

da informaccedilatildeo das caracteriacutesticas individuais em usuaacuterios de medicamentos antitabagismo

Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informaccedilotildees que li ou que

foram lidas para mim descrevendo o estudo ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de

expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de

metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo Eu discuti com o Dra Jaqueline

Scholz com a Juliana da Rocha dos Santos eou Paulo Roberto Xavier Tomaz sobre a minha

decisatildeo em participar nesse estudo Ficaram claros para mim quais satildeo os propoacutesitos do

estudo os procedimentos a serem realizados seus desconfortos e riscos as garantias de

confidencialidade e de esclarecimentos permanentes Concordo voluntariamente em participar

deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento antes ou durante o

mesmo sem penalidades ou prejuiacutezo ou perda de qualquer benefiacutecio que eu possa ter

adquirido ou no meu atendimento neste Serviccedilo

_____________________________________________________________________________________

Assinatura do pacienterepresentante legal Data

____________________________________________________________________________

Assinatura da testemunha Data

para casos de pacientes menores de 18 anos analfabetos semi-analfabetos ou portadores de deficiecircncia auditiva ou visual

(Somente para o responsaacutevel do projeto)

Declaro que obtive de forma apropriada e voluntaacuteria o Consentimento Livre e Esclarecido deste

paciente ou representante legal para a participaccedilatildeo neste estudo

____________________________________________________________________________

Assinatura do pesquisador Data


DADOS DE IDENTIFICACcedilAtildeO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSAacuteVEL LEGAL

1NOME

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nordm SEXO M F

DATA NASCIMENTO

ENDERECcedilO NordmAPTO

BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()

2RESPONSAacuteVEL LEGAL

NATUREZA (grau de parentesco tutor curador etc)

DOCUMENTO DE IDENTIDADE SEXO M F

DATA DE NASCIMENTOENDERECcedilO

Nordm APTO

BAIRROCIDADE ESTADOCEPTELEFONE() ___________________________________________________________________________________________________________________________

DADOS SOBRE A PESQUISA

1 TIacuteTULO DO SUBPROJETO DE PESQUISA ldquoAnaacutelise da associaccedilatildeo dos perfis de expressatildeo gecircnica dos genoacutetipos

preditores de metabolizaccedilatildeo e das concentraccedilotildees de metaboacutelitos com a resposta ao tratamento antitabagismordquo

PESQUISADOR RESPONSAacuteVEL Dr Jaqueline Scholz

CARGOFUNCcedilAtildeO Meacutedico Assistente Meacutedico Pesquisador ndash InCor ndash HCFMUSP CRM SP nordm 60179

UNIDADE DO HCFMUSP Programa Ambulatorial de Tratamento Tabagismo InCor-HCFMUSP

PESQUISADOR EXECUTANTE Juliana da Rocha dos Santos CRF SP nordm 62776

CARGOFUNCcedilAtildeO POacuteS-GRADUANDAndash InCor ndash HCFMUSP

UNIDADE DO HC-FMUSP Laboratoacuterio de Geneacutetica e Cardiologia Molecular InCor-HCFMUSP

3 AVALIACcedilAtildeO DO RISCO DA PESQUISA

RISCO MIacuteNIMO RISCO MEacuteDIO

RISCO BAIXO x RISCO MAIOR

4 DURACcedilAtildeO DA PESQUISA 4 anos


ANEXO 2 - Teste de Fagerstroumlm para a dependecircncia agrave nicotina (versatildeo em Portuguecircs)

Fonte Pietrobon RC Barbisan JN Manfroi WC Utilizaccedilatildeo do teste de dependecircncia agrave nicotina de

Fagerstroumlm como um instrumento de medida do grau de dependecircncia Versatildeo em Portuguecircs Rev HCPA

200727(3)31-6


Fonte Issa J S Um novo escore para dependecircncia a nicotina e uma nova escala de conforto do paciente durante

o tratamento do tabagismo J Bras Pneumol 38(6) 761-5

ANEXO 4 ndash Desenho de estudo do projeto ldquoEficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismordquo

Desenho do estudo Seraacute randomizado em dois braccedilos um nuacutemero amostral total de 300 pacientes No braccedilo da esquerda 150 pacientes seratildeo tratados com base em teste geneacutetico para os

polimorfismos CYP2B6 (rs2279343) e CHRNA4 (rs1044396) No braccedilo da direita 150 pacientes faratildeo o tratamento tradicional com vareniclina (o faacutermaco de maior efetividade no tratamento

antitabagismo) Em um estudo anterior nosso grupo de pesquisadores 5152 mostrou maior sucesso terapecircutico nos pacientes portadores dos genoacutetipos AA para o gene CYP2B6 nos pacientes

tratados com bupropiona e nos portadores dos genoacutetipos CT e TT para o gene CHRNA4 nos pacientes tratados com vareniclina A escolha do tratamento no braccedilo farmacogeneacutetico prioriza o

tratamento mais barato (bupropiona) dessa forma primeiramente eacute analisado o genoacutetipo para o rs2279343 se o paciente apresentar o genoacutetipo AA o mesmo eacute tratado com bupropiona se ele tiver

o genoacutetipo AG ou GG eacute analisado o genoacutetipo para o polimorfismo rs1044396 Se o paciente apresentar o genoacutetipo CT ou TT para o rs1044396 ele eacute tratado com vareniclina se ele apresentar o

genoacutetipo CC (natildeo favoraacutevel a nenhum dos faacutermacos) ele eacute tratado com vareniclina e bupropiona em uso concomitante Seraacute comparado o custo-efetividade do tratamento baseado em

farmacogeneacutetica em relaccedilatildeo ao tratamento com vareniclina Os pacientes satildeo acompanhados por 12 semanas durante o tratamento farmacoloacutegico visita inicial (T-1) antes do iniacutecio da terapecircutica

(T0) 2 4 6 8 e 12 semanas apoacutes o tratamento (T2 T4 T6 T8 T12) Obs Os pacientes que natildeo conseguirem parar de fumar ateacute a 4 ordf semana de tratamento em monoterapia eacute adicionada a

segunda medicaccedilatildeo Fonte Eficaacutecia do uso de marcadores geneacuteticos na escolha do tratamento farmacoloacutegico do tabagismo InCor-HCFMUSP Projeto de doutorado da Dra Patriacutecia Viviane Gaya

sob a orientaccedilatildeo da Dr Jaqueline R Scholz desenvolvido a partir dos resultados dos estudos da nossa equipe de pesquisadores Rocha Santos et al 2015 67 e Tomaz et al 2015 68

ANEXO 5 ndash Pedido de depoacutesito de patente na Agecircncia de Inovaccedilatildeo e Empreendedorismo da

Universidade Federal de Alfenas-MG




antitabagismo








Santos

(Versatildeo corrigida Resoluccedilatildeo CoPGr 601811 de 13 de outubro de 2011 A versatildeo original estaacute disponiacutevel na

Biblioteca da FMUSP)

Satildeo Paulo

2020

Dedicatoacuteria





Agradecimentos












Abe e Regina




fundamentais





Maacutercio

















A Deus

















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6


















Dedicatoacuteria





Agradecimentos












Abe e Regina




fundamentais





Maacutercio

















A Deus

















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6


















Agradecimentos












Abe e Regina




fundamentais





Maacutercio

















A Deus

















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6



















Maacutercio

















A Deus

















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6


















A Deus

















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6






















Isaiacuteas 5589




(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6





















(Vancouver)







SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































_____________________________________________________________________________________


____________________________________________________________________________






____________________________________________________________________________




1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6


















SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE QUADROS

RESUMO

ABSTRACT




121 Vareniclina 6



122 Bupropiona 9






bioloacutegicas 15

2 JUSTIFICATIVA 17

3 OBJETIVOS 19

4 METODOLOGIA 20




bupropiona 26





















5 RESULTADOS 51





tratamento 54







69


6 DISCUSSAtildeO 75

























BRT Tubos PAXgene

















amplificou)













E Erro relativo





administration


dependence






Cromatograph



Spectrometric


























































Cromatograph









T-1 Visita inicial


mesmo dia)

















LISTA DE TABELAS


otimizados

40



52




52



53



54



68



69




70



71




71




72



73



73



74



74

LISTA DE FIGURAS



2












planilhada)

37




56



57



BSA

59


soro diluiacuteda

59



backflush

62



65



65



67



67

LISTA DE QUADROS







RESUMO
















































ABSTRACT










































size are needed



1


























2















19






3























21 29




4
















30





5


















6

121 Vareniclina













receptores α7 40



tratatamento 41-43

7



















8




















9

122 Bupropiona



















10
























11
















12


bupropiona
























13


























14
























15

























16









17

2 JUSTIFICATIVA



















nervoso central





18



19

3 OBJETIVOS





20

4 METODOLOGIA

41 Casuiacutestica





















mencionados acima

21






22

Bupropiona

n=31



Visita T2 Visita T4

Desfecho

Vareniclina

n=74


n= 27

RNA RNA





Soro

Soro










Visita T12







23













comparaacuteveis













24


























25










dia seguinte




vareniclina


amostras



geneacuteticosrdquo


Coleta de DNA




26






com vareniclina)


seguinte





com bupropiona








bupropiona



27





amostras








das anaacutelises












28












vareniclina













29

























30
























31




(10-15 segundos)


















gecircnica



32

























33















1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12











A1

C1

E1

G1

34











14 plusmn 2

lt3

gt16

gt3




10-02

10-04

10-06

10-08

10-10

10-12

10-14

10-16

10-18

10-20

10-22

10-24

10-26

10-28

5 10 15 20 25 30 35 40

Ciclos

Flu

ore

scecircn

cia

No

rmal

izad

a

Fase Linear

35



escolhidos






















36
























37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





























38


MSMS




















39


RAM

Software


HPLC-MSMS

















(ESI+)

40

Tempos


1) 0 - 30 min



min



o



(KV)


183 -24

141 -43


139 -26

103 -39


131 -29

167 -29


130 -22

77 -44

Cotinina 177 80 -24

98 -21

70 -34


134 -19

118 -21


41


























42






sistema


Bupropiona







Log P 36

Hidroxibupropiona







Log P 222

Vareniclina




pKa1 182 pKa2 = 973


Log P 103

43

Nicotina






Log P 117

Cotinina




Log P 007

Hidroxicotinina



ACDLog P -148













44










5)
















45



















46














coluna











com BSA

47
























48

























49

























50


















51

5 RESULTADOS







amostral)
















52








FTND 62 plusmn 20

FTND ge 6 () 607



Dislipidemia () 250



Ansiedade () 286




de 0 a 4 pontos)



de tratamento








FTND ge 6 () 538 643 070

Escore Issa ge 3 () 846 857 100





53

Ansiedade () 308 357 100



de 0 a 4 pontos)

























COMT 488 (430 ndash 511) 458 (433 -515) 481 (448 ndash 516)

54


tratamento









grupos de desfecho


















55




de 95





tratamento





covariaacuteveis


56






57






58







matriz












59








Unifal-MG






60











mais abundante




para a secagem

61










mol L-1 pH 42 (9010 vv)















62



analiacutetica


















63






analitos











minutos









64






na Tabela 6









para o LD e LQ











65

















66




avaliadas



















67















68






r2 ( n=6) 09952 09998 09998 09997 09998 09999




LD (microg L-1) 25 07 06 19 24 37

LQ (microg L-1) 50 10 10 50 50 50


30a

100c

153a

37b

21c

140a

06b

06c

90a

26b

11c

117a

34b

61c

128a

138b

92c


115b

66c

82a

27b

20c

109a

17b

10c

83a

27b

14c

158a

41b

31c

161a

44b

92c


54b

-30c

-55a

-24b

-11c

-65a

19b

-04c

158a

09b

-26c

-87a

47b

-24c

71a

18b

05c


-16b

035c

41a

-01b

-01c

-87a

27b

-20c

146a

40b

018c

-120a

25b

-110c

58a

-35b

30c


1104b

1014c

1101a

1009b

1028c

945a

1094b

1078c

1098a

1088b

1146c

941a

1093b

1116c

1167a

1112b

1141c

Estabilidade1 E

( n=6)

98a

11b

-50c

71a

-32b

-38c

140a

-16b

-79c

40a

-79b

-110c

-132a

-94b

-32c

86a

125b

-54c

Efeito matriz2 E

( n=6)

-117a

104b

14c

101a

09b

28c

-55a

94b

78c

98a

88b

146c

-59a

93b

116c

167a

112b

141c

69


analitos







cigarrosdia P= 005)







respectivamente)







10 1 4 1

7 1 3 1

8 1 3 1

9 1 3 1

8 1 4 1

5 0 3 1

8 1 4 1

8 1 4 1

7 1 4 1

7 1 3 1

9 1 3 1

7 1 4 1



FTND 62 plusmn 23

FTND ge 6 () 644

70



Dislipidemia () 392



Ansiedade () 176




pontos)












FTND ge 6 () 659 625 077

Escore Issa ge 3 () 829 879 075





Ansiedade () 146 212 046



de 0 a 4 pontos)

71









FTND 68 plusmn 21

FTND ge 6 () 742



Dislipidemia () 323



Ansiedade () 194




de 0 a 4 pontos)












FTND ge 6 () 833 429 005

Escore Issa ge 3 () 1000 429 0001


72




Ansiedade () 250 00 029



de 0 a 4 pontos)







antitabagismo














73





com vareniclina





NMR n=63 069 (067 ndash 102)

NMR lt031 () n=63 79








com vareniclina





111114143ndash

1421426)

706 (643 ndash 1037) 0009


NMR n=63 074 (062 ndash 107) 061 (055 ndash 113) 064

NMR lt031 () n=63 100 43 064





74


com bupropiona






NMR n=27 090 (074 ndash 149)

NMR lt031 () n=27 0








com bupropiona







NMR n=27 084 (076 ndash 109) 132 (-371 ndash 884) 014

NMR lt031 () n=27 0 0 -






75

6 DISCUSSAtildeO

























76













fumantes












em monoterapia 77

77









sadios 102 128-134

















78


























79



fumo























80



importantes





















81
























multianalito

82

























83
























84





85




Vareniclina

Bupropiona

Hidroxibupropiona

Nicotina

Cotinina

Hidroxicotinina

CS ndash SPE (novo


50 ndash 1000

10 ndash 10000

10 ndash 20000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

50 ndash 10000

883

1101

945

1098

941

1167

25

07

06

19

24

37

50

10

10

50

50

50

Presente

estudo

Nicotitna


03 ndash 525

70 ndash15000

978 ndash 1114

973 ndash1156 -

03

70

Abdalla et al 104

Bupropiona


1580

1160

13

45

55

60

Petrides et

al 158



Al-Haj et al 105


APIMSMS

Plasma

Urina

01 - 500

10 ndash 5000 - -

lt01

100

Faessel et al 51

Nicotina

cotinina

trans-3 ndash

hidroxicotinina

vareniclina

SPE (Oasis MCX 10


plate)

UPLCndashMSMS

Soro humano

100 ndash 5000

100 ndash 5000

100 - 5000

100 ndash 2500

860 ndash 940

700 ndash 870

490 ndash 540

830 ndash 920

-

20

10

20

10

Dobrinas et

al 156

86

Nicotina


Diluiccedilatildeo


ndash UPLC-

MSMS


943ndash992

07

04

17

11

Kuhn et al 154


(UPLC-

MSMS)

Sangue urina e

outros tecidos de

rato


80 (nicotina e

cotininacom


25 50 Onoue et al

157



Petersen et

al 117


Scherf-

Clavel et al 155




87

7 CONCLUSOtildeES










88





desenvolvido

89

9 REFEREcircNCIAS









Sleep Med 20173732-37








(wwwincagovbr) 2004













20001(3)199-207



90


200935(1)217-238



176


2001108(6)755-765






2008363(1507)3125-3135





















2004306(5698)1029-1032



Res 2001892(1)138-146

91



199910(6-7)675-680






1222


















399








Methodol 201237389-411



199818(12)4461-4472

92





Pharmacol 200670(3)801-805













200864(11)1101-1109






998






200968(5)669-681




Metab Dispos 200634(1)121-130





93




1448










200028(10)1176-1183




1230






Metab Dispos 200735(11)2053-2059








Pharmacol201975(11)1541-1545





94















201820(4)403-413







71(9)1067-73










200818(1)11-16



2013424




95







1086




Res 2010119(1-3)269-270




201599142-155






Genet 2005136B(1)12-25








2012200(1)52-54



2006141B(3)261-268








96


Res2013210(3)1290-1292






200958(1)38-44



Biosci 200492063-2085




201611(2)e0150230









201673(13)2511-2530






Neurosci201711189





Res20163160486




97



1997282(3)1608-1614



Depend201819089-93







200630(6)386-389












765






200125(4)402-408






77

98




2013931134-139




200933(4)218-222








2015197(Pt A)7-13




2016131213-220



Chim Acta 201795943-65




9244 2015












99








2017152841-52



J Sep Sci 201033(4-5)516-521







572










Am J Psychiatry 2006163(10)1832-1834











Genomics 199852(2)173-185

100







200039(13)2818-2829





2015172(11)1122-1130




364






Neuroreport 199910(8)1779-1782














Res 200576(2-3)135-157

101









2003123B(1)39-49




200653(2)88-93









Psychiatry 200259(12)1085-1096





Genet 200716(23)2921-2932



20087(1)37-45





220



2012 (213)211-232



102


Genet201617(1)71











Disord 201727(12)1087-1098







Res201113(8)686-690






Genet 2009150B(4)453-466









2014157(1-3)163-168




Biomed Anal 201267-68137-143

103













201126(4)416-422







APEcircNDICE - TCLE



PAULO-HCFMUSP





















































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1NOME


DATA NASCIMENTO


BAIRROCIDADE

ESTADOCEPTELEFONE()





Nordm APTO



















200727(3)31-6


















· JULIANA DA ROCHA DOS SANTOS Análise da associação dos perfis de expressão gênica e das...

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