Jéssica Campestrini. Relembrando... Técnica de separação; Fase móvel (solvente) e estacionária...
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Jéssica Campestrini
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Relembrando...
• Técnica de separação;• Fase móvel (solvente) e estacionária (gel);• Retenção maior ou menor de substância;• As menores são capazes de acessar um volume maior (maior retenção)• As maiores não acessam todo o volume da fase estacionária (menor retenção)
HPLC – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência;
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Relembrando...
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Introdução
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Fonte: https://en.wikipedia.org/wiki/A-DNA#/media/File:Dnaconformations.png
Adaptado de Ho & Carter, 2011.
Fonte: https://www.broadinstitute.org/blog/five-questions-david-root-rna-interference-explained
Introdução
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Introdução
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Fonte: https://sabeerhassan.wordpress.com/2013/01/20/quadruple-helix-dna-seen-in-human-cells/
Figura suplementar S1.
Introdução
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Adaptado de: http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2010/cp/c0cp00782j
Estudo do polimorfismo para:i) Biologia sintéticaii) Desenvolvimento de fármacosiii) Engenharia de nanomateriais
Outras técnicas como NMR, raio-X, CD e PAGE necessitam de uma grande quantidade de amostra.
Introdução
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MetodologiaSize-exclusion chromatography (SEC) é um método onde
pode ter acesso aos nucleotídeos em suas conformações nativas.
Foi utilizado aparelho de UHPLC em uma coluna de SEC.Avaliados 110 oligonucleotídeos para determinar sua estrutura secundária,Diferentes pH tampões, concentração de cátions e temperatura.Oligosnucleotídeos em diferentes concentrações e estruturas primárias.
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90°C 2’
4°C overnight
10µl
UltiMate3000 UHPLC
Amostras em fase reversa!
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4.6×300 mm;
5-mhydrophilic polymethacrylate resin spherical particles,
300 ˚A pore size.
d-s e G4 - 0.150 ml/min in Tris•HCl 50mM, pH 7.5, supplemented with KCl (100 mM), with acolumn temperature of 20.0◦C.
Duplex paralelas - mesmo buffer supplemented with MgCl2(10 mM).
RNA Hairpin - Sodium phosphate (20 mM), pH 7.2, supplementedwith NaCl (50 mM) and MgCl2 (3 mM).
I-motif - MES buffer (50 mM), pH 6.0, supplemented with KCl (100 mM).
Triplex - same buffer with MgCl2 (10 mM) substitutingKCl.
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Calibração ss-DNA
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Calibração ds-DNA
Duplex-intermoléculasHairpin
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Calibração G4-DNA
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Calibração G4-DNA
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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Explorando polimorfismo estrutural G4
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i-motif
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Estudo de casoHCV apresenta loops na região 3ÚTR SL2
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Estudo de caso
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Estudo de caso
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ConclusõesPermite distinção entre estruturas secundárias;Quadruplex podem ser discriminadas;Formação de quadruplex pode ser observada e comparada;Comparando com outros métodos é mais rápido e versátil;É possível avaliar amostrar em diversas concentrações;Pode complementar técnicas como NMR, cristalografia, CD e outros
experimentos;Pequenas mudanças nas condições dos experimentos podem mudar
drasticamente as estruturas;
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Obrigada!