IV Curso de Verão em Biologia 05/02/2013Molecular e Genômica … · 2013-02-15 · Eletroforese...
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Eletroforese de DNA
IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013
Elisa Beatriz Prestes
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Arne Tiselius
Prêmio Nobel de Química – 1948
Eletroforese de DNA A partir de 1970, após advento da eletroforese de proteínas
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Grupo fosfato
Pentose
Base nitrogenada
Qual a carga elétrica dos ácidos nucléicos?
Estrutura de um nucleotídeo
Em pH neutro, DNA tem carga elétrica negativa.
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–
+
Cátodo
Ânodo
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Eletroforese de ácidos nucléicos
Agarose
Poliacrilamida
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Eletroforese de ácidos nucléicos
Agarose
Poliacrilamida
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Eletroforese de ácidos nucléicos
Tipo de gel Moléculas pequenas
Moléculas médias
Moléculas grandes
Poliacrilamida 10 pb – 3 Kb
Agarose 100 pb – 60 Kb
PFGE* 50 Kb – 10 Mb
*Eletroforese de Campo Pulsado (do inglês Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Fragmentos de DNA
Fragmentos de DNA
Plasmídeos
Cromossomos
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Eletroforese em Agarose
Polissacarídeo composto por subunidades de galactose
Obtida a partir do ágar
Compõe a parede celular de algas
Agarose
Gel horizontal
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Eletroforese em Agarose
Concentração do gel (%)
Faixa de separação (Kb)
0,3 5 – 60
0,6 1 – 20
0,7 0,8 – 10
0,9 0,5 – 7
1,2 0,4 – 6
1,5 0,2 – 3
2,0 0,1 – 2
Tamanho dos poros na matriz é determinado por % de agarose
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Eletroforese em Poliacrilamida
Poliacrilamida
Acrilamida é monômero neurotoxina absorvida pela pele, com efeitos cumulativos
29 monômeros acrilamida: 1 Bis-acrilamida
Gel vertical
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Eletroforese em Poliacrilamida
Polimerização da poliacrilamida depende de radicais livres (persulfato – APS), estabilizados
por TEMED.
Reação rápida de polimerização.
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Fatores que influenciam a migração
Tamanho do DNA
Migração de forma end-on
Fragmentos pequenos percorrem maiores distâncias
que fragmentos grandes
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Fatores que influenciam a migração
Conformação do DNA
Migração mais rápida de moléculas mais condensadas: supercoiled > linear > circular
Observação de 3 bandas no gel:
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Fatores que influenciam a migração
Voltagem
Taxa de migração do DNA linear é proporcional à voltagem baixa aplicada
Faixa de separação diminui com o aumento
da voltagem
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Fatores que influenciam a migração
Direção do campo elétrico
Direção única em géis de agarose e poliacrilamida
Mas moléculas > 50-100 Kb tendem a migrar na mesma taxa se direção do campo for igual...
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Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Direção do campo elétrico muda, forçando moléculas a mudar de curso moléculas maiores
demoram mais para serem realinhadas
Separação de moléculas de até 10 Mb!
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Fatores que influenciam a migração
Composição de bases e temperatura
Presença de corantes intercalantes
Mais importante para géis de poliacrilamida, em agarose estes fatores influenciam pouco
Brometo de etídio (grupo planar que se intercala entre as bases nitrogenadas) reduz a mobilidade do DNA em 5%
É vantajoso realizar a coloração após a corrida!
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Corantes de ácidos nucléicos
Brometo de Etídio
Agente que se intercala ao DNA luz UV (laranja)
Carcinogênico, mutagênico e teratogênico
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Corantes de ácidos nucléicos
SYBR Green
Agente que se intercala ao DNA luz UV (verde)
Potencialmente carcinogênico
Aplicação em PCR em tempo real (qPCR)
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Fatores que influenciam a migração
Composição do tampão
Força iônica. Resistência ~ igual ao gel
Poucos íons: DNA migra pouco ou nada
Íons demais: condutância gera muito calor (gel derrete e DNA desnatura)
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Aplicações da eletroforese
Separação de DNA por tamanho: Análise de resultado (PCR, diagnóstico) Purificação de fragmentos de interesse Blotting
Obrigada!