ISSN 2238-1589 RATOS ISOGÊNICOS F344: … · Data de recebimento: 10/10/2011 ... como em trauma...

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ISSN 2238-1589

RESU

MO1 Disciplina de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental FMUSP – LIM 26

2 Laboratório de Patologia Cardíaca – INCOR-HCFMUSP

* Autor para correspondência: Sueli B. Damy

E-mail: [email protected]

Data de recebimento: 10/10/2011Aceito para publicação: 02/04/2012

artIgo orIgINal

RATOS ISOGÊNICOS F344: MODELO BIOLÓGICO PARA ACESSO EM ABDÔMEN INFECTADO

Nagamassa Yamaguchi1; Sueli Blanes Damy1*; Márcia M. reis2; Sergio Murilo M. Borges1; Maria de lourdes Higuchi2; Junko takano osaka1; José otoch Pinhata1

objetivo: Desenvolvimento de um modelo biológico para acesso cirúrgico em abdômen infectado, em ratos isogênicos F344, com 10-11 meses de idade, submetidos à peri-tonite por E.coli (Escherichia coli) e anastomose de cólon ascendente, estudando as

e baço. Material e Método: Foram formados 4 grupos de machos e 4 grupos de fêmeas: G1 inoculado com uma suspensão contendo 1-8 x 106 UFC (Unidade formadoras de colônias)/mL de E.coli; G2 submetido a anastomose de cólon ascendente; G3 inoculado com a suspensão de E.coli e submetido à anastomose de cólon ascendente 24 horas após a infecção; G4 controle. Decorridas 48 horas da infecção e 24 da cirurgia os ratos

resultados:

6,67±2,04 µm 6,16±2,39 µm respectivamente, e maiores quando comparadas com os grupos inoculado e controle (2,48±1,36 µm e 3,83±2,19 µm). Conclusão: As lesões

meses de idade, inoculados por E.coli, são modelos biológicos adequados para estudos

Palavras-chave:

1 INTRODUçãO

Na clínica médica, em algumas circunstâncias, há necessidade de intervenções cirúrgicas em abdômen infectado, como em trauma abdominal,

-gridade de uma víscera permitindo a passagem de microorganismo do lúmen, sendo a cicatrização destas cirurgias afetadas pela presença de bacté-rias1,2. A resposta sistêmica a sepse caracteriza-se

por aumento da temperatura, aumento dos bati-mentos cardíacos, aumento da taxa respiratória, leucocitose com 10% de células imaturas, hipoten-são e anormalidade na perfusão dos órgãos. Este quadro pode levar a múltipla falência dos órgãos, em que o paciente não recupera a homeostase sem intervenção terapêutica intensiva3.

Os estudos experimentais da patogênese e evolução da sepse foram baseados em pesquisas realizadas com modelo animal que mimetiza al-guns aspectos da doença humana4,5,6,7. Em muitos

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desses trabalhos foi utilizado o mais numeroso e conhecido dos microorganismos aeróbios faculta-

Escherichia coli (E. coli), por apresentar impor--

gicas normais do intestino do hospedeiro, porém tornando-se patógeno oportunista quando fora de seu habitat natural4,8,9.

-fagos, mastócitos, células endoteliais e células natural killer, tem sua síntese estimulada por agentes infecciosos, incluindo as bactérias e seus lipopolissacárides, exotoxinas bacterianas, protozoários, fungos e partículas virais. Trata--se de um pirogênio endógeno com claras ações

partir da medula óssea; induz a marginação de

incluindo a desgranulação e produção de radicais superóxidos; promove a diferenciação de células precursoras mielóides em monócitos e macrófa-gos; induz a ativação dos macrófagos. Além de modular a função imune é um potente efetor de funções metabólicas nos tecidos somáticos: au-menta o transporte de glicose na membrana plas-

de lactato; aumenta a degradação de proteínas na musculatura esquelética estriada; em contraste a essa função catabólica anteriormente descrita, o

-tos, aumentando a expressão de proteinas de fase aguda e estimulando a captação de amino ácidos, estimula a liberação direta de triglicérides a partir dos adipócitos e estimula a lipogênese hepática, promovendo a diminuição do tecido gorduroso corporal e a hipertrigliceridemia vistos em diver-sos estados catabólicos. Outra ação importante

cicatricial e no remodelamento das feridas; produz aumento da permeabilidade vascular; estimula

outro lado, sua secreção exagerada ou crônica pode estar associada a duas situações clínicas par-ticulares e graves, a primeira associada a doenças malignas e síndromes paraneoplásicas e a segunda

ao colapso cardiovascular associado à infecção severa e endotoxemia: caquexia e choque10,11.

2 OBjETIvO

Desenvolvimento de um modelo biológico para acesso cirúrgico em abdômen infectado, em ratos isogênicos F344, com 10-11 meses de idade, submetidos à peritonite por E.coli e anastomose de cólon ascendente, avaliando as alterações clínicas e histopatológicas na área perianastomótica, fíga-

nestes órgãos.

3 MATERIAL E MÉTODOS

Animais

Foram utilizados 32 ratos isogênicos F344 com 10-11 meses de idade, 16 machos e 16 fêmeas, convencionais, oriundos do Biotério Central da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/Instituto de

durante todo o período experimental em ambiente convencional, recebendo água e ração (Nuvital

ad libitum. Todos os procedimentos descritos para manipulação dos animais estão de acordo com as normas éticas indi-cadas internacionalmente12 e foram aprovados pela

Bactéria

Foi utilizada a bactéria Escherichia coli, cepa ATCC 11775, H7:01:K1, adquirida do Instituto Adolfo Lutz, cultivada em Ágar cérebro-coração

preparo da solução as bactérias foram coletadas na fase exponencial de crescimento e diluídas em

-


Nagamassa Yamaguchi; Sueli Blanes Damy; Márcia M. Reis; Sergio Murilo M. Borges; Maria de Lourdes Higuchi; junko Takano Osaka; josé Otoch Pinhata

absorbância em comprimento de onda de 540 nm, comparando-se com a Escala de Mac Farlands13 para obtenção da unidade formadora de colônia

formadoras de colônias foi realizado pela semea-

horas de incubação a 37ºC.6

UFC/ml, por via intraperitoneal, correspondendo a 1 DL50, baseada em estudos anteriores14.

Desenho experimental

Foram formados 4 grupos de machos e 4 grupos de fêmeas: G1 inoculado com uma suspensão de E.coli; G2 submetido a anastomose de cólon as-cendente; G3 inoculado com a suspensão de E.coli e submetido à anastomose de cólon ascendente 24 horas após a infecção; G4 controle. Decorridas 48 horas da infecção e 24 da cirurgia os ratos foram eutanasiados e a alça anastomosada, o fígado, o rim e o baço foram submetidos à análise histo-

imuno-histoquímica.

Dieta pré e pós-operatória

Os ratos de todos os grupos receberam 48 horas antes da data prevista para a cirurgia e durante o pós-operatório, uma dieta líquida composta de: 10% de albumina, 10% de sacarose, dissolvidos em

ad libitum em bebedouros.

Inoculação da suspensão bacteriana

Os animais foram imobilizados por apreensão digital dorsal, cervical e lombar. Após antissepsia da parede abdominal ventral, com gaze embebida em álcool iodado a 2%, foram submetidos à pun-ção percutânea com agulha hipodérmica.

Anestesia e finalização humanitária

-

--

gado o triplo da dose da mesma associação de anestésico15.

Procedimento Cirúrgico

Após a anestesia, foi feita uma tricotomia, assepsia com iodo-povidine, incisão mediana xifóide-pubiana, os ratos foram submetidos a láparo-enterectomia, com secção de fragmento do cólon ascendente e posterior anastomose, utilizando-se: sutura contínua extra-mucosa, su-tura separada extra-mucosa, total e dois planos,

4.0. No pós-operatório os ratos foram mantidos em ambiente aquecido, aproximadamente 35ºC nas primeiras horas, em gaiolas individuais. Não foram submetidos a antibioticoterapia e analgesia, para evitar interferência na resposta, uma vez

Coleta de materiais

submetidos à necropsia, coletando-se fragmentos do cólon anastamosado, fígado, baço e rim di-reito, mantidos em solução tamponada de formol a 10%.

Processamento histológico

As amostras foram submetidas às técnicas histológicas tradicionais, cortadas a 5 µm por um

secções foram colocadas em lâminas silanizadas

pura, resultando em maior aderência do corte. A seguir foram coradas pela técnica de hematoxilina--eosina.

Detecção de TNF- por imuno-histoquímica

-



centrações decrescentes de etanol até água. A peroxidase endógena foi bloqueada em peróxido de hidrogênio a 3%, em duas incubações de 10 minutos a temperatura ambiente. O antígeno foi

-pão Tris-EDTA com Tween, pH 9,0. A biotina, a avidina e as proteínas, foram bloqueadas por 20 minutos cada, a temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas por 40 minutos, a 37ºC, com o anticorpo primário biotinilado, policlonal, anti-rat-

de imunoperoxidase, as lâminas foram cobertas por 1 minuto com a solução contendo 40 mg de

com hematoxilina de Harris.

Análise histológica

A análise foi realizada em microscópio ótico

na alça anastomosada, rim e fígado, corados por hematoxilina-eosina: edema, congestão vascular,

hemorragia focal e esteatose. No baço foi analisa--

los e tumefação de células reticulares. Os cortes histológicos tratados por imuno-

Análise estatística

Todos os resultados obtidos na análise das secções das amostras dos quatro grupos foram comparados pelo programa Sigma Stat para Win-dows, versão 1,0 (Sigma Chemical, Co, St Louis,

4 RESULTADOS

No período de observação os ratos inocu-lados com E.coli apresentaram, 6 horas após a infecção, pelos eriçados, encurvamento da região dorsal, diminuição de atividade motora; os que foram submetidos a anastomose, sem infecção, apresentavam-se com os pelos lisos, a postura e atividades motoras próprias da espécie. Foram registrados 3 óbitos: uma fêmea de G1 e uma de G3; um macho de G2.

Os aspectos microscópicos da secção do baço, rim, fígado e alças anastomosadas foram: esple-nite aguda com maior aumento de tamanho dos

as alterações apresentavam-se maiores tanto no fígado, com tumefação dos hepatócitos (degene-

tabela 1: Grupos de ratos isogênicos F344, com 10-11 meses de idade, submetidos a peritonite e anastomose de cólon ascendente.

grupo tratamento Machos(n)

Fêmeas(n)

Mortos(n)

G1 E.coli 4G2 Anastomose de cólon ascendente 4 4G3 E.coli e submetidos a anastomose 4 4G4 Controle 3 4

E.coli contendo 1-8 x 106 UFC/ml.



proximais e distais, focos de necrose celular e nas alças anastomosadas com presença abundante de

-sa; em algumas regiões necrose da parede com

correspondeu a leitura de m=3535 ± 2347 µm/

da alça anastomosada e ausente nos demais órgãos -

na Tabela 2. Os grupos submetidos a anastomose e inoculados com E.coli e submetidos a anastomose

apresentaram médias próximas de expressão do antígeno, em ambos os grupos maiores que os grupos inoculado e controle.

5 DISCUSSãO

O presente estudo apresentou um modelo de peritonite, representado pelos ratos isogênicos F344 infectados por E.coli, intraperitonealmente, com idade entre 10-11 meses, mimetizando um ser

Figura 1:

Figura 2:hepatócitos apresentando degeneração hidrópica (seta estreira) e focos de necrose celular (seta

Figura 3: Em G3, nas alças anastomosadas presença

necrose da parede com destruição da mucosa caracterizando desarranjo da arquitetura glandular



humano adulto com abdômen agudo necessitando uma intervenção cirúrgica.

As análises histopatológicas dos órgãos apon-taram para lesões mais graves do fígado, rins e baço no grupo inoculado por E.coli e submetido a anastomose do cólon ascendente. Estes resultados estão de acordo com estudo prévio16 em que foi

fígado, e intestino de ratos F344 inoculados com a mesma cepa de bactéria.

--

tomótico, resultado semelhante ao observado em ratos Wistar, submetidos a isquemia do cólon por ligadura dos vasos mesentéricos, com expressão

17

citocinas local e sua distribuição regional parecem ser de fundamental importância. Acredita-se que a elevação sistêmica de citocinas, observada logo

como um sinal de alarme para o resto do orga-nismo, desencadeando uma cascata de processos

a importância em termos de prognóstico, pois após

antagonistas começam a controlar a resposta pró-

como se os mecanismos antagonistas exercessem a

agudas em processos localizados18.A evidência apresentada no presente estudo

perianastomótica, tanto do grupo anastamosado sem infecção como o infectado, sugere que essa citocina poderia funcionar como um marcador em estudos de tratamentos terapêuticos, como

ativada no processo cicatricial de anastomose de cólon na presença de sepse por ligação cecal e pun-ção, tendo como um dos parâmetros para análise

-tar19. Outro estudo, sobre o papel da talidomina na cicatrização de anastomose de cólon, em ratos, apontou uma baixa formação de aderências20,

TNF da talidomida, na qual indiretamente inibiu a formação de aderências.

Nos resultados aqui discutidos, por se tratar de observação pós operatória de 24 horas, não foram observadas aderências abdominais, no entanto, em pesquisa realizada com modelo semelhante e período pós observatório de 7 dias foi constatada a formação de aderências intraabdominais21.

Um outro fator importante do presente estudo foi a utilização de alimentação líquida contendo albu-mina e sacarose, para evitar-se uma hipoglicemia

tabela 2:

grupos de ratos F344.

grupo(n)

Fração de área com antígeno

m±dpµm

p

I 2,48±1,36II 6,67±2,04 II=III p=0,786III 6,16±2,39

3,83±2,19

E.coli contendo 1-8 x 106 UFC/ml.

Figura 4:



ABST

RACT

e hipoproteinemia em decorrência de prolongado

dos ratos ou na gravidade da resposta, uma vez que 22 relataram o efeito da

desnutrição protéica na parede intestinal do rato, através da medida da força de ruptura e dosagem de colágeno tecidual do íleo e cólon distal, observaram que a força de ruptura destes segmentos intestinais foi menor nos animais desnutridos; a perda da re-sistência mecânica foi maior no segmento do cólon distal, provavelmente pela menor concentração do colágeno tecidual nesta região do intestino.

6 CONCLUSãO

As lesões associadas à infecção aguda obser-vadas em cólon ascendente anastomosado, fígado, rim e baço, as quais foram acompanhadas pela

-matórias da área perianastomótica, sugerem que ratos isogênicos F344, com 10-11 meses de idade, inoculados por E.coli, são modelos biológicos adequados para estudos de acesso cirúrgico em abdômen com ou sem infecção.

INBRED RATS F344: BIOLOGICAL MODEL FOR ACCESS IN ABDOMEN INFECTED

objective: Development of a biological model for surgical approach to abdominal infec-tion in inbred rats F344, between10 to 11 months of age, subject to Escherichia coli (E.coli

Materials and Methods: We formed groups of four male and four female: G1 inoculated with a suspension containing 8.1 x 106 E. coli, G2 under-went anastomosis of the ascending colon; G3 inoculated with the suspension of E. coli and subjected to the anastomosis of the ascending colon 24 hours after infection, G4

results: In the quan-

and control groups (2.48 ± 1.36 µm and 3.83 ± 2.19 µm). Conclusion: The lesions as-

E. coli, are biological models suitable for studies on surgical approach to

Keywords:



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REFERÊNCIAS

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