ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS...
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i PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS SILVESTRES DE DISTINTOS BIOMAS DO ESTADO DE SÃO PAULO PARA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS CAMPINAS 2014
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i
PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS SILVESTRES DE
DISTINTOS BIOMAS DO ESTADO DE SÃO PAULO PARA PRODUÇÃO DE
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS
CAMPINAS
2014
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS SILVESTRES DE
DISTINTOS BIOMAS DO ESTADO DE SÃO PAULO PARA PRODUÇÃO DE
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de
Alimentos da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do
título de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo
Este exemplar corresponde à versão final da
dissertação defendida pela aluna Paula de Paula
Menezes Barbosa e orientada pela Prof.ª Dr.ª
Gabriela Alves Macedo.
__________________________________________
Assinatura da orientadora
CAMPINAS
2014
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de AlimentosClaudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Barbosa, Paula de Paula Menezes, 1989- B234i BarIsolamento e seleção de fungos filamentosos silvestres de distintos biomas do
Estado de São Paulo para produçao de compostos antimicrobianos / Paula dePaula Menezes Barbosa. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
BarOrientador: Gabriela Alves Macedo. BarDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Engenharia de Alimentos.
Bar1. Bioprospecção. 2. Compostos bioativos. 3. Antibióticos. I. Macedo, Gabriela
Alves. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia deAlimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Isolation and selection of filamentous fungi from distinct biomes ofState of São Paulo for antimicrobial compounds productionPalavras-chave em inglês:BioprospectionBioactive compoundsAntibioticsÁrea de concentração: Ciência de AlimentosTitulação: Mestra em Ciência de AlimentosBanca examinadora:Gabriela Alves Macedo [Orientador]Danielle Branta LopesMarta Cristina Teixeira DuarteData de defesa: 24-10-2014Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
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iv
v
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________
PROF.ª DR.ª GABRIELA ALVES MACEDO
ORIENTADORA
__________________________________________________________
DR.ª DANIELLE BRANTA LOPES
CNPEM
(MEMBRO TITULAR)
_________________________________________________________
PROF.ª DR.ª MARTA CRISTINA TEIXEIRA DUARTE
CPQBA/UNICAMP
(MEMBRO TITULAR)
_________________________________________________________
PROF.ª DR.ª HÉLIA HARUMI SATO
FEA/UNICAMP
(MEMBRO SUPLENTE)
_________________________________________________________
DR.ª DARLILA APARECIDA GALLINA
ITAL
(MEMBRO SUPLENTE)
vi
vii
RESUMO
Compostos bioativos são moléculas orgânicas derivadas de vegetais, animais ou micro-
organismos que estão relacionados a alguma atividade biológica e, a microbiota do solo,
representa uma importante fonte destas substâncias. O ponto crítico na descoberta de novas
moléculas bioativas a partir desta fonte é o isolamento de grupos de micro-organismos
pouco explorados e conhecidos, que são ao mesmo tempo bons produtores de metabólitos
secundários. Os fungos filamentosos são conhecidos como produtores de uma grande
variedade de metabólitos secundários, diante disso, o objetivo deste trabalho foi isolar e
selecionar linhagens de fungos filamentosos silvestres de duas regiões do Estado de São
Paulo (Biomas de Mata Atlântica e Cerrado), com o intuito de produzir compostos
antimicrobianos ativos contra os micro-organismos alvo escolhidos nesta pesquisa:
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis e
Candida albicans, responsáveis por grandes problemas nas áreas de alimentos e saúde. A
partir das amostras de solo coletadas na região de Mata Atlântica (Ilhabela) e na região de
transição dos biomas Mata Atlântica e Cerrado (Barão Geraldo, Campinas), 118 culturas de
fungos filamentosos foram isoladas. Dentre elas, 22 apresentaram elevado potencial
antimicrobiano contra pelo menos um dos micro-organismos alvo e foram estudadas quanto
ao seu efeito antimicrobiano. No caso do B. cereus, 4 extratos de fungos (IB36A, BG11A,
BG13D e BG13E) apresentaram efeito bactericida e bacteriolítico sobre este micro-
organismo alvo. Para a cepa de S. aureus, 6 fungos apresentaram efeito bactericida (IB6A,
IB36A, IB45B, IB49C, BG13D e BG13E) e 6 apresentaram efeito bacteriolítico (IB6A,
IB36A, IB45B, BG5A, BG13D e BG13E). Para E. coli e S. choleraesuis, apenas um fungo
possuiu efeito bactericida (IB6A e IB38E, respectivamente). Para C. albicans, todos os
extratos analisados apresentaram efeito fungistático. Em resumo, foram obtidas culturas de
fungos filamentosos com elevado potencial para produção de metabólitos com atividade
antimicrobiana, os quais poderão ser identificados e explorados futuramente.
Palavras chave: bioprospecção; compostos bioativos; antibióticos.
viii
ABSTRACT
Bioactive compounds are organic molecules from vegetables, animals or microorganisms
that are related to some biological activity and, soil microbiota, is an important source of
these substances. The isolation of unexplored and unknown microorganisms that are both
good producers of secondary metabolites, provides the potential for novel bioactive
molecules. Filamentous fungi are known as good producers of a great variety of secondary
metabolites, therefore, this work goal was to isolate and select filamentous fungi strains of
two regions of São Paulo State (Biomes of Cerrado and Atlantic Forest), capable to produce
antimicrobial compounds against the microorganisms: Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis and Candida albicans, responsible for
important problems in food and health areas. 118 filamentous fungi strains were isolated
from soil samples collected at Atlantic Forest region (Ilhabela) and transition region
between Atlantic Forest and Cerrado biomes (Barão Geraldo, Campinas). Among them, 22
strains showed high antimicrobial activity against at least one of the pathogenic
microorganisms target and their antimicrobial effect were studied. In the case of B. cereus,
4 fungi extracts (IB36A, BG11A, and BG13D BG13E) showed bactericidal and
bacteriolytic effect on this target microorganism. For the strain of S. aureus, 6 fungi
showed bactericidal effect (IB6A, IB36A, IB45B, IB49C, BG13D and BG13E) and 6 had
bacteriolytic effect (IB6A, IB36A, IB45B, BG5A, BG13D and BG13E). In the cases of E.
coli and S. choleraesuis, only one fungus possessed bactericidal effect (IB6A and IB38E,
respectively), and for C. albicans, all analyzed extracts showed fungistatic effect. In
conclusion, potentially filamentous fungi strains producers of antimicrobial activity
metabolites were obtained, which can be identified and future explored.
Keywords: bioprospection; bioactive compounds; antibiotics.
ix
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 3
1.1 Compostos bioativos naturais .......................................................................................... 3
1.1.1 Biomas Mata Atlântica e Cerrado e a obtenção de micro-organismos produtores de
compostos bioativos .............................................................................................................. 4
1.2 Compostos bioativos com atividade antimicrobiana ....................................................... 6
1.2.1 Métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos naturais .................... 9
1.2.2 Pesquisa de novos antimicrobianos naturais e sua importância ................................. 10
1.2.3 Estratégias na prevenção de desenvolvimento de micro-organismos resistentes ....... 13
1.3 Fungos filamentosos ...................................................................................................... 13
1.3.1 Características e importância ...................................................................................... 13
1.3.2 Metabólitos bioativos de fungos ................................................................................. 14
1.3.3 Cultivo e produção de compostos bioativos ............................................................... 16
1.3.4 Principais antibióticos produzidos por fungos filamentosos ...................................... 18
1.4 Importância dos micro-organismos em alimentos e saúde escolhidos para o presente
estudo ................................................................................................................................... 24
2 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 27
2.1 Meios de cultura ............................................................................................................ 27
2.2 Isolamento das culturas de fungos filamentosos ........................................................... 28
2.2.1 Coleta das amostras .................................................................................................... 28
2.2.2 Isolamento e conservação das culturas de fungos filamentosos ................................. 30
2.2.3 Estudo morfológico macroscópico das linhagens fúngicas estudadas ....................... 30
2.3.1 Culturas de fungos filamentosos estudadas ................................................................ 31
2.3.2 Cultivo e preparação do extrato .................................................................................. 32
2.3.3 Atividade antimicrobiana ........................................................................................... 33
2.4 Estudo da atividade antimicrobiana das culturas de fungos selecionadas ..................... 35
2.4.1 Preparação do extrato dos fungos com maior potencial antimicrobiano .................... 35
2.4.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) pela técnica de
microdiluição e monitoramento da atividade antimicrobiana ............................................. 36
x
2.4.3 Determinação da concentração mínima bactericida/fungicida (MBC/MFC) ............. 38
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 40
3.1 Isolamento das culturas de fungos filamentosos ........................................................... 40
3.2 Seleção de micro-organismos com maior potencial antimicrobiano ............................. 41
3.2.1 Atividade antimicrobiana contra B. cereus ................................................................ 42
3.2.2 Atividade antimicrobiana contra E. coli ATCC 11229 .............................................. 48
3.2.3 Atividade antimicrobiana contra S. aureus ATCC 6538 ............................................ 51
3.2.4 Atividade antimicrobiana contra S. choleraesuis ATCC14028.................................. 56
3.2.5 Atividade antimicrobiana contra C. albicans ATCC 10231 ...................................... 59
3.2.6 Discussão geral ........................................................................................................... 62
4 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 68
5 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................ 69
REREFÊNCIAS .................................................................................................................. 70
APÊNDICES ....................................................................................................................... 86
ANEXO A - ....................................................................................................................... 116
xi
Dedico este trabalho à minha família
Regina, Itamar e Laís por estarem sempre
presentes em minha vida sendo meu porto
seguro e aquilo de mais precioso que tenho.
xii
xiii
AGRADECIMENTOS
À Deus por me iluminar, fortalecer e por colocar pessoas tão especiais em meu
caminho.
À Professora Gabriela, pela disponibilidade de orientação, confiança depositada em
meu trabalho e principalmente pelos ensinamentos transmitidos.
Aos meus pais Itamar e Regina, pelo amor, ensinamentos, apoio em minhas
escolhas, valores transmitidos e conselhos que promovem meu crescimento pessoal diário.
À minha irmã Laís, pela fidelidade, amizade, companheirismo e puxões de orelha
quando necessário.
Ao Danilo, por dividir comigo durante esses anos de relacionamento amor,
momentos de felicidade, companheirismo e carinho.
Aos meus amigos Ana Paula, Bia, Bruninha, Bruno, Camilo, Cínthia, Elaine,
Fabiano, Fabíola, Giba, Giulia, Gustavo, Gyorgy, Isa, Jô, Júlia, Léo, Liege, Lívia, Krébs,
Ricardo, Taun, Val, Vivi e Zé pela ajuda com os experimentos e principalmente por
tornarem o Laboratório de Bioquímica um ambiente único e acolhedor.
Aos amigos Paulinha e Ruann em especial, que tanto colaboraram nos primeiros
passos desta pesquisa, pela paciência, prontidão em sempre ajudar e ensinamentos.
Às minhas queridas amigas Débora, Fernanda e Jessika que me socorrem, me fazem
rir, chorar e que eu agradeço a Deus por tê-las conhecido. Vocês são ótimas!
Aos meus amados amigos de Lavras Manu, Mayara, Douglas e Lud e os de
Sertãozinho PV e Marcela pelos ótimos momentos que temos quando estamos juntos!
Ás amigas que fiz no Apto 22C Marluce, Laís, Monyca e Paola pela convivência,
companheirismo e aprendizado.
Às minhas famílias Menezes e Barbosa, em especial Tia Elza, Tia Landa, Vó
Maricota, Vó Aparecida, Madi, Madrinha e Fernando (in memorian) por estarem sempre
comigo me ajudando de alguma forma.
Aos professores da FEA, especialmente à Prof.ª Dr.ª Marta Cristina Teixeira Duarte
e à Prof.ª Dr.ª Hélia Harumi Sato pela disponibilidade em ajudar.
xiv
A banca examinadora pela contribuição dada ao trabalho.
À todos os funcionários da FEA pelos auxílios prestados.
Ao CNPq pela bolsa de mestrado concedida.
xv
“Coloque Deus no início e Ele cuidará do fim”.
Autor desconhecido
“A persistência é o menor caminho do êxito”.
Charles Chaplin
xvi
xvii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Mapa dos principais biomas brasileiros..................................................................5
Figura 2. Microplaca de 96 compartimentos antes (a) e depois (b) da adição do reagente
cloreto de iodonitrotetrazólio (INT), em que na presença de atividade microbiana a solução
dentro do compartimento se torna vermelha.........................................................................10
Figura 3. Estrutura química dos antibióticos penicilina G (1), cefalosporina C (2),
griseofulvina (3), ácido fusídico (4), equinocandina B (5), sordarina (6), esclerotiorina (7) e
ácido kójico (8).....................................................................................................................23
Figura 4. Inventário Florestal da vegetação nativa do Estado de São Paulo.......................29
Figura 5. Modelo da disposição das amostras na microplaca de 96 poços nas análises de
MIC, em que as três primeiras linhas representam a triplicata de cada concentração de
extrato analisada, e os números de 1 a 10 representam as concentração de extrato
analisadas, da maior para a menor concentração (mg mL-1
): 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,63; 0,31;
0,16; 0,08 e 0,04....................................................................................................................38
Figura 6. Número de culturas de fungos obtidas para cada tipo de amostra coletada nas
regiões de Mata Atlântia e de transição entre Mata Atlântica e Cerrado..............................41
Figura 7. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de B. cereus.......................................................................................................43
Figura 8. Crescimento de B. cereus (% D.O.), na presença de diferentes concentrações (mg
mL-1
) de extrato dos fungos BG11A (A), IB36A (B), BG13D (C) e BG13E (D), durante 20
h de exposição.......................................................................................................................46
Figura 9. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de
crescimento de E. coli ATCC 11229.....................................................................................49
Figura 10. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de S. aureus ATCC 6538..................................................................................52
xviii
Figura 11. Crescimento de S. aureus ATCC 6538 (% D.O.), na presença de diferentes
concentrações (mg mL-1
) de extrato dos fungos BG13D (A), BG5A (B), IB6A (C), IB36A
(D), IB45B (E) e BG13E (F) durante 20 h de exposição......................................................55
Figura 12. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de
crescimento de S. choleraesuis ATCC14028........................................................................57
Figura 13. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de C. albicans...................................................................................................60
Figura 14. Cultura dos fungos BG13E (A) e BG13D (B), cujos extratos apresentaram
atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-positivas estudadas..............................64
Figura 15. Cultura dos fungos IB4C (A), IB6A (B), IB6B (C), IB36A (D), IB36C (E) e
IB45B (F), cujos extratos apresentaram atividade antimicrobiana de amplo espectro.........65
Figura 16. Cultura dos fungos BG 8C (A) (cujo extrato apresentou atividade contra as
bactérias Gram-negativas); BG5A (B) (apresentou atividade de amplo espectro); IB49C (C)
(apresentou atividade contra S. aureus ATCC 6538); BG4B, BG11A, BG14K e Aspergillus
sp. (1099) (D) (apresentaram atividade contra a cepa de B. cereus); IB14B, IB27B, IB38E e
IB40A (E) (apresentaram atividade contra S. choleraesuis ATCC 14028) e IB8A, BG10C,
RP478 (F) (apresentaram atividade contra C. albicans ATCC 10231)................................66
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Micro-organismos isolados nas regiões brasileiras de Cerrado e Mata Atlântica
produtores de compostos bioativos e moléculas de alto valor agregado................................7
Tabela 2. Vantagens do cultivo de fungos em superfície de ágar com relação à FS e
FES........................................................................................................................................18
Tabela 3. Características dos micro-organismos estudados para atividade
antimicrobiana.......................................................................................................................26
Tabela 4. Composição dos meios de cultura utilizados neste estudo...................................28
Tabela 5. Fungos filamentosos estudados, pertencentes à CMLB.......................................31
Tabela 6. Fungos filamentosos estudados, isolados da região de Mata Atlântica, do
município de Ilhabela e da região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado do distrito de
Barão Geraldo (Campinas)....................................................................................................32
Tabela 7. Condições de cultivo para o preparo do inóculo dos micro-organismos alvo deste
estudo....................................................................................................................................34
Tabela 8. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem e B. cereus.......44
Tabela 9. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC)
e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente ao B. cereus........................................45
Tabela 10. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de IB36A, BG11A, BG13D e BG13E
sobre a bactéria B. cereus......................................................................................................47
Tabela 11. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de E. coli ATCC
11229.....................................................................................................................................50
Tabela 12. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida
(MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à de E. coli ATCC 11229......51
xx
Tabela 13. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de S. aureus
ATCC6538............................................................................................................................52
Tabela 14. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida
(MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à linhagem de S. aureus ATCC
6538.......................................................................................................................................53
Tabela 15. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de BG13D, BG5A, IB6A, IB36A,
IB45B e BG13E sobre a bactéria S. aureus ATCC 6538......................................................56
Tabela 16. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de S.
choleraesuis ATCC14028.....................................................................................................57
Tabela 17. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida
(MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à S. choleraesuis ATCC
14028.....................................................................................................................................58
Tabela 18. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de C. albicans
ATCC10231..........................................................................................................................60
Tabela 19. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima fungicida (MFC)
e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à C. albicans ATCC 10231................61
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
BDA Potato Dextrose Agar
CMLB Coleção de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica da FEA-
UNICAMP
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquidas Químicas Biológicas e Agrícolas da
Unicamp
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DCA Departamento de Ciência de Alimentos
DNA Deoxyribonucleic Acid
DTA Departamento de Tecnologia de Alimentos
DTAs Doenças Transmitidas por Alimentos
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
FDA Food and Drug Administration
FEA Faculdade de Engenharia de Alimentos
FES Fermentação em Estado Sólido
FS Fermentação Submersa
HTS High Throughput Screening
INT Cloreto de Iodonitrotetrazólio
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MIC Concentração Mínima Inibitória
MBC Concentração Mínima Bactericida
xxii
MFC Concentração Mínima Fungicida
NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
OMS Organização Mundial da Saúde
pH Potential of Hydrogen
RDC Resolução de Diretoria Colegiada
RNA Ribonucleic Acid
SDA Secretaria de Defesa Agropecuária
UFC Unidades Formadoras de Colônia
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
YMA Yeast Malt Agar
YMB Yeast Malt Broth
1
INTRODUÇÃO
Compostos bioativos são moléculas derivadas de fontes vegetais, animais ou
microbianas que podem apresentar diferentes estruturas e atividades biológicas, possuindo um
amplo espectro de aplicação. Embora o conhecimento científico destas moléculas tenha
apenas se desenvolvido ao longo dos últimos 100 anos, a aplicação prática de produtos
naturais é conhecida desde as culturas antigas, as quais utilizavam extratos vegetais e queijos
mofados em tratamentos terapêuticos (ZERIKLY; CHALLIS, 2009). Atualmente, os produtos
naturais representam uma valiosa fonte na descoberta de novos medicamentos e, juntamente
com os seus derivados, contribuem com um terço dos medicamentos mais vendidos no
mercado (ZHOU; LI; CHEN, 2010).
Segundo Demain (1999), os compostos naturais bioativos mais conhecidos são os
antibióticos, que são definidos como metabólitos secundários produzidos por micro-
organismos que inibem o crescimento de outros micro-organismos. São amplamente
empregados na medicina humana e veterinária, na fitopatologia e na preservação de
alimentos. Sua descoberta foi, sem dúvida, um marco na melhoria e expectativa de vida no
planeta. (AWAD et al., 2013). No entanto, atualmente, seu consumo indiscriminado tem
gerado um problema eminente relacionado ao surgimento de micro-organismos resistentes aos
antimicrobianos existentes (KAVITHA et al., 2010). Diante disso, novos compostos são
objeto constante de busca.
A triagem de micro-organismos produtores de compostos antimicrobianos é uma
alternativa viável para o descobrimento de novos antibióticos. Dentre eles, os fungos e os
actinomicetos são os mais estudados (AWAD et al., 2013). Os fungos são metabolicamente
versáteis (ARCHER et al., 2008) e têm se mostrado importantes fontes de compostos
biologicamente ativos, derivados do seu metabolismo ou subprodutos deste (PELÁEZ, 2005).
A investigação por metabólitos fúngicos bioativos começou com o descobrimento da
penicilina, produzida pelo Penicillium notatum, por Alexander Fleming. Desde então, a
diversidade taxonômica de fungos é uma importante fonte a ser explorada na busca por novos
compostos naturais bioativos de alto valor agregado (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011).
2
Os biomas brasileiros Cerrado e Mata Atlântica são considerados uns dos ecossistemas
de maior biodiversidade. A bioprospecção em regiões pouco exploradas e de grande
diversidade biológica possibilita a coleta de variados gêneros fúngicos e, consequentemente,
diferentes metabólitos secundários, permitindo o descobrimento de novos compostos
bioativos e moléculas de grande interesse econômico.
Dentre as maiores causas de morte no mundo, a diarréia está em quinta posição e, na
maioria das vezes é causada pelo consumo de alimentos contaminados (OMS, 2013). No
Brasil, Salmonella sp. , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Escherichia coli, são os
agentes etiológicos associados aos maiores números de surtos de doenças transmitidas por
alimentos (BRASIL, 2013). O mau uso terapêutico dos antibióticos e o consumo de carnes e
alimentos com essas substâncias são os maiores contribuintes para o desenvolvimento de
bactérias resistentes (GORBACH, 2001). Sendo assim, se faz necessário o descobrimento de
novos compostos antimicrobianos eficientes, que possam ser aplicados na conservação de
alimentos e no tratamento de infecções. Outro grande problema enfrentado são as infecções
causadas por fungos, como a Candida albicans. O efeito tóxico e a falta de eficácia dos
antifúngicos sintéticos existentes fazem necessário o descobrimento de novos antifúngicos
naturais eficientes (JIANG; AN, 2000; SASIDHARAN et al., 2008).
Diante dos problemas expostos, o presente trabalho teve como objetivo selecionar
linhagens de fungos filamentosos, isolados das Regiões de Cerrado e Mata Atlântica do
Estado de São Paulo, com potencial para produção de compostos antimicrobianos. O trabalho
desenvolvido é parte do Programa de Pesquisas em Caracterização, Conservação,
Recuperação e Uso Sustentável da Biodiversidade do Estado de São Paulo (BIOTA-FAPESP)
e esteve vinculado ao projeto coordenado pela Prof. Drª. Gabriela Alves Macedo, sob
“Bioprospecção de fungos filamentosos e leveduras silvestres de distintos biomas do Estado
de São Paulo visando à produção de enzimas, vitaminas de interesse industrial e compostos
bioativos”.
3
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Compostos bioativos naturais
Segundo Biesalski e colaboradores (2009), os compostos bioativos podem ser
definidos como compostos essenciais ou não ao funcionamento do organismo (como por
exemplo, vitaminas e polifenóis), encontrados na natureza e que apresentam algum benefício
à saúde humana ou animal, podendo apresentar atividade antimicrobiana,
hipocolesterolêmica, imunossupressora, antitumoral, antioxidante e antiinflamatória
(BIESALSKI et al., 2009). São moléculas orgânicas derivadas de vegetais, animais ou micro-
organismos e representam o ponto crítico para o descobrimento de novos compostos
bioativos. Desta forma, a avaliação terapêutica de substâncias químicas de fontes naturais tem
sido estudada para diversos tipos de aplicações biológicas com o objetivo de isolar novos
compostos bioativos (SU et al., 2007).
Devido ao seu potencial de aplicação nas áreas de alimentos, fármacos, indústria
química e outros mercados, o interesse no desenvolvimento de bioprocessos para a sua
produção e extração a partir de fontes naturais aumentou muito nos últimos anos e têm sido
muito valorizada pela indústria. Muitos desses compostos bioativos são metabólitos
secundários de plantas, fungos, bactérias, protozoários, insetos e animais. A propriedade
bioativa dessas substâncias faz com que estas sejam isoladas e desempenhem um importante
papel como uma das principais fontes de novos fármacos (STIERLE; STIERLE, 2000).
No século XX, o uso de metabólitos secundários microbianos e de plantas
revolucionou a medicina. Estes foram responsáveis por dobrar a expectativa de vida, e
diminuir sofrimento e dor (DEMAIN, 2014). Sendo possível citar moléculas como a
Penicilina, o primeiro antibiótico, a Actinomicina D, utilizada no tratamento de tumores em
crianças e a Estreptomicina, o primeiro antibiótico ativo contra a bactéria da tuberculose
(DEMAIN, 2006). Estima-se que aproximadamente 50 % dos fármacos mais vendidos
atualmente são compostos naturais ou compostos relacionados a produtos naturais
(NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003; NEWMAN; CRAGG, 2007). Esta constatação
comprova a importância dessas substâncias como fontes significativas para a obtenção de
4
novos medicamentos, assim como, protótipos para síntese de novos fármacos (CARTER,
2011; CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013).
Os micro-organismos desempenham um papel fundamental na produção de compostos
bioativos, os quais são representados principalmente pelos metabólitos secundários
microbianos. Sua habilidade na produção desses componentes com diferentes estruturas
químicas está relacionada particularmente a alguns grupos de micro-organismos, como as
actinobactérias, as mixobactérias, espécies de Pseudomonas, as cianobactérias e os fungos
filamentosos. Além disso, diferentes espécies são capazes de produzir diferentes compostos
(CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013; DONADIO et al., 2002). Isso significa que o
estudo de uma grande diversidade genética de micro-organismos pertencentes aos grupos
anteriormente citados possibilita o isolamento de diferentes compostos bioativos de interesse
na indústria farmacêutica (humana e animal), alimentícia e agrícola.
1.1.1 Biomas Mata Atlântica e Cerrado e a obtenção de micro-organismos produtores de
compostos bioativos
A bioprospecção é uma atividade exploratória que visa identificar componentes do
patrimônio genético com potencial uso comercial, como organismos, genes, enzimas e
compostos, sendo uma maneira de se extrair valor econômico da biodiversidade. Na
bioprospecção de micro-organismos, a obtenção de uma grande variedade de metabólitos
secundários bioativos se deve principalmente ao estudo de uma grande diversidade genética
de culturas. Isso é possível através do isolamento de micro-organismos de diferentes áreas
geográficas em que a biodiversidade ainda é mantida (KNIGHT et al., 2003).
Devido à sua grande extensão e localização, o território brasileiro exibe uma grande
diversidade climática. Isso implica em uma variedade ecológica, que permite a diferenciação
de regiões em biomas ou zonas biogeográficas (Figura 1). A biodiversidade é resultante da
história evolucionária, e ela implica não somente na diversidade de espécies de plantas, como
também de animais e até mesmo de micro-organismos (ALHO, 2008). A presença de
diferentes biomas e nichos ecológicos no Brasil explica o fato dele abrigar mais de 20 % das
espécies existentes no planeta (SILVA; CASTRO-GAMBOA; BOLZANI, 2010).
5
Figura 1. Mapa dos principais biomas brasileiros.
O Estado de São Paulo é formado basicamente pelos Biomas Mata Atlântica e
Cerrado. Entretanto, segundo o Inventário Florestal do Estado de São Paulo de 2001, apenas
13,94 % do território paulista possui vegetação nativa (KRONKA et al., 2005), além de serem
ecossistemas que possuem uma das maiores biodiversidades do mundo, com um grande
número de espécies endêmicas e, devido a grande exploração dessas regiões, estão ameaçadas
de extinção. Diante da importância em preservar a biodiversidade da Terra, principalmente
em áreas ameaçadas de extinção, essas regiões foram identificadas e denominadas hotspots
mundiais. No Brasil duas regiões obtiveram esta classificação: a Mata Atlântica e o Cerrado
(MYERS et al., 2000).
Lançado em março de 1999, o programa BIOTA-FAPESP tem por objetivo
caracterizar, conservar, restaurar e promover o uso sustentável da biodiversidade do Estado de
São Paulo. Este tem desempenhado papel fundamental no mapeamento e na análise da
biodiversidade distribuída nos ambientes paulistas, incluindo a fauna, a flora e os micro-
organismos. Além disso, tem avaliado possibilidades de exploração sustentável desta
6
biodiversidade com potencial econômico e de subsidiar a formulação de políticas de
conservação dos remanescentes florestais (BIOTA FAPESP, 2014).
O solo é um ecossistema de grande diversidade microbiana e representa uma
importante fonte a ser explorada no isolamento de compostos biologicamente ativos
(DONADIO et al., 2002). A interação entre os micro-organismos e este habitat pode
influenciar no metabolismo microbiano (TAKAHASHI et al., 2008). O solo do Bioma Mata
Atlântica é rico em nutrientes e possui elevada atividade de água (CRUZ et al., 2013). Já o
Cerrado é caracterizado por clima seco com altas temperaturas, além de ser um solo pobre em
nutrientes, porém com uma grande biodiversidade de plantas, animais e micro-organismos
(GARCIA et al., 2007; MARQUES et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2005). Essa baixa
disponibilidade de nutrientes provavelmente cria um ambiente hostil aos micro-organismos
que nele vivem, fazendo com que estes desenvolvam um metabolismo diferenciado, sendo
possível a produção de novas moléculas com propriedades biológicas de interesse (LUCAS;
DE CASTRO; TAKAHASHI, 2007).
Visto a importância da diversidade genética de micro-organismos na bioprospecção de
compostos bioativos, o estudo de espécies isoladas em locais em que a diversidade biológica é
preservada, pode ser o ponto crítico na descoberta de novos compostos bioativos e moléculas
de interesse industrial. Alguns estudos realizados com micro-organismos isolados destas
regiões, confirmam o potencial destes como novas fontes de compostos bioativos (Tabela 1).
1.2 Compostos bioativos com atividade antimicrobiana
Segundo Demain (1999), os compostos bioativos naturais mais conhecidos são os
antimicrobianos e estes são definidos como produtos naturais orgânicos de baixa massa
molecular, sintetizados por micro-organimos e, quando em baixas concentrações, inibem o
crescimento de outros micro-organismos (DEMAIN, 2009; GUO et al., 2008). Podem ser
classificados segundo seus efeitos antimicrobianos, espectros de atividades e mecanismos de
ação. De acordo com o seu espectro de ação, os antimicrobianos são divididos em três
categorias: amplo espectro, espectro intermediário e espectro reduzido. São moléculas com
diferentes estruturas e mecanismos de ação. Atuam sobre o DNA, o RNA, na síntese de
7
Tabela 1. Micro-organismos isolados nas regiões brasileiras de Cerrado e Mata Atlântica
produtores de compostos bioativos e moléculas de alto valor agregado.
Micro-organismo Região do
isolamento
Composto isolado/
Bioatividade
Referência
Bactérias
Streptomyces sp. Cerrado (solo) Enzima – Protease (AZEREDO et al.,
2004)
Bacillus amyloliquefaciens Mata Atlântica
(solo)
Tipo de Bacteriocina
antibacteriana (LISBOA et al.,
2006)
Streptomyces sp. Mata Atlântica
(solo)
Extrato antibacteriano,
antifúngico, antiviral e
antitumoral
(SACRAMENTO et
al., 2004)
Streptoverticillium sp. Cerrado (solo) Metabólito com efeito anti-
inflamatório (CRUZ et al., 2013)
Fungos filamentosos
Neosartorya spinosa Cerrado (solo) Enzima – Xilanase (ALVES-PRADO et
al., 2010)
Periconea atropurpurea Cerrado (Xylopia
aromática)
Enzima – Esterase (LISBOA et al.,
2013)
Metabólitos com atividade
citotóxica (Periconicina B) e
antifúngica (TELES et al., 2006)
Nigrospora cf. oryzae
Cerrado
(Stryphnodendron
adstringens)
Extrato com atividade
antifúngica (CARVALHO et al.,
2012) Diaporthe cf. phaseolorum
Extrato com atividade
anticâncer
Penicillium sp. Cerrado (solo) Metabólito secundário
antibacteriano e antifúngico (PETIT et al., 2009)
Mycelia sterilia,
P. griseofulvum e
P. aurantiogriseum
Mata Atlântica
(Spermacoce
verticillata)
Metabólitos com atividade
antibacteriana (CONTI et al., 2012)
Penicillium
sclerotiorum
Cerrado (solo)
Metabólito secundário
antibacteriano (Esclerotiorina) (TAKAHASHI et
al., 2008) Penicillium simplicissimum
Metabólito secundário
antibacteriano (Ácido
penicílico)
Paecilomyces lilacinus Cerrado (solo)
Metabólitos secundários
inibidor da AChE
(Paecilomide) e
antimicrobiano.
(TELES;
ATALIBA;
TAKAHASHI,
2013; TELES;
TAKAHASHI,
2013)
Metarhizium spp.,
I. cateniannulata Cerrado (solo)
Metabólito tóxico ao vetor de
Chagas (Triatoma infestans) (ROCHA; LUZ,
2011)
8
proteínas, na função da membrana plasmática, no transporte de elétrons, na esporulação, na
germinação e muitos outros alvos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). São aplicados na
medicina humana e veterinária, na agricultura, na conservação de alimentos e na
suplementação de rações de aves e outros animais, como promotores de crescimento
(DEMAIN, 2000).
Os agentes antimicrobianos também podem ser classificados quanto ao efeito causado
por eles no crescimento dos micro-organismos. São chamados de bacteriostáticos ou
fungistáticos aqueles que inibem o crescimento e multiplicação do micro-organismo, sem que
haja morte das células. O mecanismo de ação dessas substâncias frequentemente ocorre
através da sua ligação aos ribossomos, inibindo a síntese protéica. No entanto, quando a
concentração do composto é reduzida, essa ligação se desfaz e os micro-organismos voltam a
se multiplicar. Os compostos bactericidas ou fungicidas, não apenas impedem o crescimento
microbiano, como também desencadeiam processos que levam as células microbianas à
morte, sendo irreversíveis (BROCK et al., 2004). Em geral, atuam em alvos como parede
celular, membrana plasmática ou DNA (BOOTHE, 2006).
Experimentalmente, a classificação do efeito de agentes antimicrobianos em
bacteriostáticos/fungistáticos ou bactericidas/fungicidas podem ser determinadas in vitro por
diferentes técnicas microbiológicas, dentre elas, o estudo da curva de morte microbiana e da
concentração mínima bactericida/fungicida (MBC/MFC). A padronização dos métodos é
importante para reprodutibilidade e o estudo clínico dos resultados. Desta forma, nas técnicas
de determinação do efeito bactericida e fungicida (para leveduras) é utilizado como inóculo
um número mínimo de micro-organismos de 5x105 UFC mL
-1, inoculados entre 30 e 37 ºC e
18 e 24 h (PANKEY; SABATH, 2004).
A MBC/MFC é definida como a concentração mínima do composto antimicrobiano
em que se observa uma redução microbiana de 99,9 %, ou de três unidades de log10, do
inóculo inicial (PANKEY; SABATH, 2004). A classificação do efeito antimicrobiano de um
composto é comumente fornecida através da relação existente entre a MBC ou MFC e a
concentração mínima do composto capaz de inibir o crescimento do micro-organismo
estudado (MIC). Quando a relação MBC:MIC, para as bactérias ou para os fungos, estiverem
entre 1:1 ou até 2:1, o composto antimicrobiano em estudo é considerado
bactericida/fungicida. Nos casos da relação ser maior que 2:1, o efeito antimicrobiano é
9
classificado como bacteriostático/fungistático (HAFIDH et al., 2011). A determinação in vitro
do efeito antimicrobiano em bacteriostático/fungistático e bactericida/fungicida fornece
informações importantes do potencial de um agente antimicrobiano em estudo, porém é
apenas um dos fatores necessários para prever a evolução clínica destes compostos.
1.2.1 Métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos naturais
Diferentes metodologias podem ser empregadas na avaliação da atividade
antimicrobiana de compostos naturais. Estas são divididas em dois grupos: métodos de
difusão em ágar e métodos de diluição em caldo.
Os métodos de difusão em ágar são qualitativos. Baseiam-se no cultivo do micro-
organismo alvo em um meio de cultura sólido e a substância a ser analisada é aplicada em
discos de papel dispostos sobre o meio de cultura ou depositada em orifícios feitos no ágar. A
difusão da substância no ágar produz uma zona ou halo de inibição quando o composto
estudado apresenta potencial antimicrobiano e a atividade antimicrobiana é quantificada pela
medida do raio das zonas de inibição (STRÖMSTEDT; FELTH; BOHLIN, 2014). As
vantagens dos métodos de difusão em ágar são baixo custo e simplicidade de execução.
Porém, estes métodos possuem limitações no estudo de um grande número de amostras e na
determinação da concentração mínima inibitória da amostra (VOLK, 2008).
Os métodos de diluição em caldo são quantitativos e podem ser realizados de duas
maneiras distintas, através da macro ou microdiluição. A macrodiluição envolve
procedimentos em tubos de ensaios, enquanto que a microdiluição utiliza placas de
microdiluição com múltiplos compartimentos (96 compartimentos em formato de U). Estes
métodos consistem em inocular a suspensão do micro-organismo alvo em um meio de cultivo
líquido contendo a substância a ser analisada. Após a incubação, o crescimento microbiano é
avaliado pela turbidez do meio de cultivo provocada pelo crescimento microbiano, sendo
mensurada através da leitura da densidade óptica (OSTROSKY et al., 2008). Muitos estudos
têm utilizado a adição de sais de tetrazólio como indicadores de crescimento bacteriano para
melhorar a detecção de atividade antimicrobiana (KLANCNIK et al., 2010). Os sais de
tetrazólio atuam como aceptores de elétrons e, na presença de atividade microbiana, são
10
reduzidos a produtos vermelhos de formazano (ELOFF, 1998). Nas situações de inibição do
crescimento microbiano, a solução dentro do compartimento da microplaca se manterá clara
após a adição do reagente. Como descrito, tal reação pode ser observada na Figura 2.
Figura 2. Microplaca de 96 compartimentos antes (a) e depois (b) da adição do reagente
cloreto de iodonitrotetrazólio (INT), em que na presença de atividade microbiana a solução
dentro do compartimento se torna vermelha.
A microdiluição tem sido amplamente utilizada na avaliação da atividade
antimicrobiana de diferentes compostos. Isso se deve as vantagens que esta metodologia
apresenta: (1) baixo custo quando comparada à macrodiluição, (2) boa reprodutibilidade, (3) é
mais sensível que os outros métodos citados, (4) requer uma pequena quantidade de amostra e
(5) permite o estudo de várias amostras de uma só vez (ELOFF, 1998). No estudo da
atividade antimicrobiana de um grande número de amostras é desejável que o método
empregado seja simples, rápido, de baixo custo e reprodutível (KLANCNIK et al., 2010).
Desta forma, uso da técnica de microdiluição na bioprospeção de compostos antimicrobianos
naturais é vantajosa.
1.2.2 Pesquisa de novos antimicrobianos naturais e sua importância
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), doenças infecciosas são aquelas
que podem ser transmitidas pelo contato direto entre pessoas, ou de forma indireta, causadas
por micro-organismos patogênicos através do contato com alimentos, objetos ou ambientes
contaminados. Com a descoberta do antibiótico, acreditou-se que ocorreria a erradicação das
11
doenças infecciosas (SPÍŽEK et al., 2010). Porém, dados recentes demonstram que, entre os
anos de 2000 e 2011, as doenças infecciosas continuam sendo uma das dez maiores causas de
morte no mundo (OMS, 2013). Isso se deve principalmente à seleção de micro-organismos
mais resistentes, devido ao consumo indiscriminado de antibióticos em tratamentos
terapêuticos, assim como, o consumo de carnes, leite, ovos e outros alimentos com essas
substâncias, utilizadas, na alimentação animal como promotores de crescimento e na
conservação de alimentos (NIKAIDO, 2009). O desenvolvimento de resistência pelos
patógenos, a toxicidade de alguns antibióticos, a existência de bactérias naturalmente
resistentes e o surgimento de novas doenças, fazem da busca por novos compostos
antimicrobianos, com diferentes modos de ação, uma pesquisa incessante (DEMAIN, 2006).
A importância científica dos metabólitos secundários com atividade antimicrobiana
apresentou expansão na década de 1940 com o impacto do descobrimento da penicilina à
saúde humana. A penicilina, descoberta acidentalmente por Fleming em 1928, é produzida
pelo fungo Penicillium notatum e a sua produção em larga escala marca o surgimento da
indústria farmacêutica, e consequentemente, o desenvolvimento de outros antibióticos. A
“era de ouro dos antibióticos” ocorreu entre os anos 1940 e 1980 e foi marcada pelo grande
número de antibióticos descobertos em um ritmo surpreendente. Penicilinas, cefalosporinas,
tetraciclinas, aminoglicosídeos, cloranfenicol e macrolídeos são as classes de antibióticos de
maior importância que surgiram durante essa fase. Entretanto, após o ano de 1980, o ritmo da
descoberta de novos antibióticos sofreu uma grande desaceleração, e a descoberta de novos
compostos no século XXI é ainda menor (DEMAIN, 2014). Isso é devido ao desestímulo de
companhias farmacêuticas no desenvolvimento de novos antibióticos, cujo processo: (1)
demanda longos estudos pré-clínicos e clínicos, (2) possui um tempo reduzido de venda antes
da expiração das patentes, permitindo que companhias de medicamentos genéricos forneçam
esses medicamentos e (3) são fármacos utilizados em um curto período, diferentemente
daqueles cujos pacientes fazem uso diário, como por exemplo, no controle de colesterol, asma
e humor (PEALÉZ, 2005; DEMAIN, 2014; WRIGHT, 2014).
Em geral, os antibióticos podem ser produtos naturais (isolados de plantas, animais ou
micro-organismos), compostos semi-sintéticos (sintetizados a partir de produtos naturais) ou
sintéticos (sintetizados quimicamente com base na estrutura química de antibióticos naturais).
Dentre esta classificação, alguns antibióticos podem ser citados como exemplos de
12
antibióticos naturais, como a penicilina, a cefalosporina, a estreptomicina, a eritromicina e a
vancomicina. No caso dos antibióticos semi-sintéticos, a clindamicina, a quinupristina, a
dalfopristina e a dalbavancina são representantes desta classe. E quanto aos antibióticos
sintéticos, podem ser citados os compostos isoniazida, trimetropim e metronidazol (DEMAIN,
2009; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010).
A exploração de novos antibióticos naturais é um desafio que demanda tempo e
elevados custos. A indústria farmacêutica tem em grande parte abandonado estes compostos
em favor do grande número de moléculas sintéticas já conhecidas e descritas na literatura
(WRIGHT, 2014). Porém, os antibióticos naturais possuem algumas características que fazem
a busca dessas moléculas necessária. São moléculas originais, com uma imensa diversidade
de estruturas químicas e atividades biológicas. A complexidade desses compostos permite que
possuam diferentes modos de ação inibitória sobre os micro-organismos alvos e os
antibióticos de origem microbiana possuem propriedades privilegiadas de penetração na
célula microbiana e afinidade por alvos bacterianos (WITTING; SÜSSMUTH, 2011;
WRIGHT, 2014). Além disso, atualmente os órgãos legisladores da produção de alimentos e
os consumidores demonstra uma progressiva afinidade pelo consumo de produtos naturais,
demonstrando a importância na busca por novos antibióticos naturais. Segundo a consultora
internacional IMS Health Intelligence Applied o mercado farmacêutico global espera ver até
2020 uma mudança contínua em direção aos fármacos naturais. O mercado brasileiro atingirá
87 bilhões de reais em vendas, refletindo assim a importância da descoberta de compostos
naturais com atividades biológicas (GATYAS; SAVAGE, 2010). As técnicas conhecidas
como High Throughput Screening (HTS) são popularmente empregadas na obtenção de novos
compostos biologicamente ativos. Estas permitem o estudo de um grande número de amostras
por vez e podem ser utilizadas no estudo de novos antibióticos naturais, reduzindo tempo e
custos da pesquisa e aumentando o número de compostos obtidos para testes pré-clínicos
(MISHRA et al., 2008).
Diante da importância e necessidade de novos antimicrobianos naturais, e devido à
falta de apoio governamental às indústrias farmacêuticas no desenvolvimento destes
compostos, restam aos institutos de pesquisas o estudo e seleção de novas fontes de
compostos antimicrobianos, assim como novos antimicrobianos naturais, seus modos de ação,
aplicação, segurança e purificação.
13
1.2.3 Estratégias na prevenção de desenvolvimento de micro-organismos resistentes
O mau uso terapêutico dos antibióticos e o uso destes compostos na alimentação
animal (como promotores de crescimento) são os maiores contribuintes para o
desenvolvimento de bactérias resistentes (GORBACH, 2001). A administração contínua de
certos antibióticos em pequenas concentrações à ração de animais proporciona aumento
significativo do ganho de peso e previne o desenvolvimento de doenças em animais. Porém, a
presença de resíduos dessas substâncias em produtos para alimentação humana tem gerado
riscos à saúde pública, tornando certos antibióticos ineficientes no combate a determinadas
bactérias (LATHERS, 2001). A União Européia proibiu o uso de antibióticos como
promotores de crescimento desde janeiro de 2006. O Brasil com o objetivo de se adequar às
regras estabelecidas pela União Européia (um dos maiores consumidores de carne brasileira) e
preocupado com as questões de saúde pública, lança o Plano Nacional de Controle de
Resíduos e Contaminantes em carnes (bovina, aves, suína e equina), leite, pescado, mel e
ovos. A qualidade destes produtos é regulamentada pela Instrução Normativa SDA nº 11, do
MAPA de 07 de maio de 2014, para o exercício no ano da publicação (BRASIL, 2014). Além
disso, com a finalidade de evitar o mau uso terapêutico dos antibióticos e restringir o consumo
indiscriminado dessas substâncias, a Anvisa determina como sendo obrigatório a apresentação
de prescrição médica de antibióticos na compra destas substâncias. A RDC nº 20/2011 prevê a
nova norma que regulamenta a venda de antibióticos no Brasil (BRASIL, 2011).
1.3 Fungos filamentosos
1.3.1 Características e importância
Durante muito tempo os fungos foram classificados no Reino vegetal. Características
como ausência de celulose na parede celular (exceto no caso de fungos aquáticos), ausência
de clorofila e incapacidade de armazenar amido como fonte de reserva diferenciam os fungos
das plantas (TRABULSI; TOLEDO; LEMOS, 2008). Por isso, a partir do ano de 1969, os
fungos foram classificados em um novo grupo, o Reino Fungi. Dentro do Reino Fungi existe
14
uma grande variedade ecológica, fisiológica e morfológica de organismos que podem ser
diferenciados em três grupos distintos, ou seja, leveduras, fungos filamentosos e cogumelos.
Algumas características são intrínsecas desses organismos. São organismos eucarióticos,
heterotróficos, com presença de quitina na parede celular e quase todos aeróbios. São capazes
de se desenvolver em condições hostis de crescimento como baixo pH, alta pressão osmótica,
baixo teor de umidade e metabolizar substratos complexos. A capacidade destes organismos
em produzir diferentes enzimas permite que o material orgânico seja degradado e os
nutrientes resultantes sejam absorvidos. Além disso, são capazes de se adaptar a diversas
condições de crescimento, o que permite que estes estejam amplamente distribuídos no
ambiente (AZEVEDO, 1997; ESPOSITO; AZEVEDO, 2004; TORTORA; FUNKE; CASE,
2005; MUELLER; SCHMIT, 2007).
A compreensão do metabolismo ou mecanismo de ação de alguns fungos permitiu o
uso destes seres vivos em muitos processos industriais, como nas áreas química, farmacêutica
e de alimentos, que são de grande importância na sociedade. Dentro deste contexto, os fungos
são utilizados em processos biotecnológicos para a obtenção de produtos como antibióticos,
enzimas, vitaminas, polissacarídeos e pigmentos (DEMAIN, 1999). A levedura
Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, é amplamente empregada em escala industrial para a
produção de pães e bebidas alcoólicas. O Aspergillus niger é explorado para a produção de
ácido cítrico e enzimas como: α-amilase, celulase, lipase e protease (BENNETT, 1998;
JIANG; AN, 2000; MEYER, 2008). Na indústria farmacêutica, muitos medicamentos foram
obtidos do metabolismo secundário de fungos.
1.3.2 Metabólitos bioativos de fungos
O metabolismo fúngico pode ser dividido em primário e secundário. O primeiro
corresponde às reações químicas que formam produtos essenciais para o crescimento,
desenvolvimento e reprodução desses organismos. Já o segundo, não é indispensável ao
crescimento e sobrevivência do organismo. Os metabólitos secundários são sintetizados a
partir de um ou mais produtos primários em várias rotas biossintéticas e muitos são
biologicamente ativos (DEMAIN; ADRIO, 2008). Em geral, são produtos orgânicos de baixa
15
massa molecular, específicos de cada espécie, com grande variedade estrutural (WILLIAMS
et al., 1989). Esses compostos podem ser derivados de aminoácidos, peptídeos não
ribossomais, policetídeos, ácidos graxos e híbridos de policetídeos-peptídeos (KEMPKEN;
ROHLFS, 2010; ROZE; CHANDA; LINZ, 2011).
Os fungos são conhecidos como produtores de uma grande variedade de metabólitos
secundários. A importância da síntese desses compostos ainda não está bem esclarecida,
porém, segundo Demain (1996), esses metabólitos podem exercer funções importantes nos
organismos que os produzem, como hormônios sexuais, armas competitivas contra bactérias,
fungos, amebas, insetos e plantas, agentes de simbiose e efetores de diferenciação.
Apresentam importante papel na indústria farmacêutica, alimentícia, agrícola e veterinária e
condições da cultura, período de incubação, pH do meio, nutrientes e temperatura afetam a
produção destes compostos (DEMAIN, 1996). Portanto, parâmetros como estes podem ser
otimizados com o objetivo de aumentar a produtividade desses compostos de interesse
industrial.
Segundo os autores Brakhage e Schroeckh (2011), estima-se que 23 000 produtos
microbianos bioativos já foram isolados. Desse total, 42 % desses compostos bioativos são
produzidos por linhagens do Reino Fungi (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011), sendo a
classe dos Ascomicetos a mais envolvida. Os gêneros Aspergillus e Penicillium são
responsáveis pela produção de aproximadamente 6 500 desses metabólitos
(SURYANARAYANAN et al., 2009; TAKAHASHI; LUCAS, 2008).
O isolamento de metabólitos fúngicos teve início há muitos anos e esta prática ainda
continua ativa (ARCHER; CONNERTON; MACKENZIE, 2008; SUN et al., 2011). A
prospecção de metabólitos fúngicos é vantajosa quando se compara às demais fontes, porém o
isolamento desses compostos a partir de plantas, algas, anfíbios e insetos podem causar sérios
danos ao ecossistema. No caso dos fungos, estes podem ser cultivados em larga escala em
fermentadores, ocupando um pequeno espaço e não oferecendo prejuízos à natureza. Outra
vantagem observada é que os fungos se adaptam facilmente à mudanças ambientais de
crescimento, permitindo que a cultura seja transportada da natureza para o laboratório
(DEMAIN; ADRIO, 2008). Além disso, com exceção dos insetos, os fungos são os mais
numerosos seres vivos existentes. Estima-se que existam aproximadamente 5,1 milhões de
espécies e que apenas 99 000 tenham sido reportadas na literatura, o que implica que 98 %
16
das espécies fúngicas existentes ainda podem ser descobertas e exploradas (BLACKWELL,
2011; MYOBATAKE et al., 2014). Além disso, estima-se que aproximadamente 10 % da
diversidade mundial de fungos ocorra no Brasil (LEWINSOHN; PRADO, 2005). Desta
forma, a biodiversidade e a habilidade dos fungos em produzir diversos metabólitos
secundários fazem desses micro-organismos importantes fontes a serem exploradas no
isolamento de novos compostos bioativos e moléculas de interesse econômico.
1.3.3 Cultivo e produção de compostos bioativos
Os fungos são micro-organismos metabolicamente versáteis e suas diferentes
condições de cultivo influenciam na biossíntese de metabólitos secundários. A literatura
demonstra que diferentes condições já foram exploradas na produção de compostos bioativos
por fungos filamentosos (ARCHER; CONNERTON; MACKENZIE, 2008).
A fermentação submersa (FS) é um processo fermentativo que ocorre em situações de
excesso de água e, de acordo com a literatura, é o mais empregado na indústria para produção
de metabólitos secundários por fungos filamentosos, principalmente por facilitar processos em
larga escala (GIBBS; SEVIOUR; SCHMID, 2000; LE KER et al., 2011). Porém, os fungos
filamentosos se desenvolveram, na maior parte da história evolucionária, em ambientes
terrestres, consequentemente, o cultivo destes micro-organismos em meio líquido pode
reduzir sua eficiência metabólica destes (HÖLKER; HÖFER; LENZ, 2004).
A fermentação em estado sólido (FES) é designada como um processo que utiliza
materiais sólidos como fonte de nutrientes, sendo que estes suportes físicos podem ser de
diferentes naturezas. A produção de metabólitos secundários por FES permite a obtenção de
um produto mais concentrado (ROBINSON; SINGH; NIGAM, 2001). Como exemplo, a
produção de antibióticos nesta condição de cultivo está associada com elevados rendimentos
em curto período de tempo de cultivo, quando comparada à FS (BIGELIS et al., 2006). A
grande produção agroindustrial do Brasil é responsável pela geração de grandes quantidades
de resíduos, os quais podem ser explorados para outras finalidades, como substratos da FES
para produção de compostos bioativos (NIGAM, 2009; LOPES et al., 2012). As vantagens do
17
uso destes resíduos são o baixo custo destas matrizes, a abundância com que são encontrados
e diminuição dos prejuízos ambientais (LOPES et al., 2012).
O cultivo em superfície de ágar é o método mais utilizado no isolamento, seleção,
cultivo e conservação de micro-organismos. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado o
potencial deste método de cultivo na produção de metabólitos bioativos (ADELIN et al.,
2011; CARVALHO et al., 2012; LE GOFF et al., 2013; LE KER et al., 2011). Alguns dos
benefícios são os maiores rendimentos e a obtenção de uma grande variedade de metabólitos
(Tabela 2). No estudo com o fungo endofítico Chaetomium globosum JN11454, por exemplo,
isolado da folha de uma planta medicinal egípcia, foi avaliada sua atividade biológica quando
cultivado em diferentes meios. Cinco meios foram analisados: aveia, arroz, caldo yeast malt
glicose, ágar batata dextrose (PDA) e meio Czapek. O extrato do fungo C. globosum cultivado
em PDA demonstrou ser o mais promissor na obtenção de compostos bioativos antioxidante,
anticâncer e antimicrobianos (SELIM et al., 2014). Outros trabalhos, utilizando este meio de
cultivo na produção de compostos bioativos também demonstraram bons resultados
(CARVALHO et al., 2012; LIN et al., 2010).
18
Tabela 2. Vantagens do cultivo de fungos em superfície de ágar com relação à FS e FES
(adaptada de ADELIN et al., 2011).
Parâmetros FS Cultivo em superfície de
ágar FES
Substrato
Substrato solúvel,
composição
controlada
Substrato solúvel, composição
controlada
Substrato insolúvel,
composição não
controlada
Esterilização Eficiente Eficiente Ineficiente
Consumo de água Elevado consumo Consumo limitado Consumo limitado
Aquecimento Fácil controle Fácil controle Baixa transferência
de calor
Oxigênio Elevado consumo Baixo consumo Baixo consumo
Produção em alta escala Fácil Não disponível Ineficiente
Inóculo Homogêneo e fácil Homogêneo e fácil Heterogêneo
Consumo de energia Alto Baixo Baixo
Rendimento da produção
de metabólitos bioativos Baixo Moderado Moderado
Concentração de
metabólitos bioativos Baixa Alta Alta
1.3.4 Principais antibióticos produzidos por fungos filamentosos
1.3.4.1 β-Lactâmicos
As moléculas deste grupo representam os antibióticos naturais de maior importância
na história da medicina, sendo os primeiros utilizados no tratamento terapêutico de infecções
19
bacterianas. Caracterizam-se por uma estrutura central, denominada núcleo, o anel β-
lactâmico. A origem do grupo β-lactâmico permite classificar essas moléculas em:
penicilinas, cefalosporinas, carbapens e compostos β-lactâmicos monocíclicos (TAHLAN;
JENSEN, 2013). O mecanismo de ação dessas moléculas é pela inibição das transpeptidases,
enzimas responsáveis pela síntese das ligações transversais entre cadeias de peptideoglicano.
A construção da parede celular pode ser comprometida, tornando a membrana celular frágil, e
pode ocorrer a lise (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
A penicilina G (Figura 3 (1)), isolada inicialmente a partir do fungo Penicillium
notatum, foi o primeiro antibiótico β-lactâmico introduzido no mercado no ano de 1940. Dez
anos mais tarde, outro antibiótico deste grupo foi isolado, a cefalosporina C (Figura 3 (2)),
produzida pelo fungo Cephalosporium acremonium. Atualmente, P. chrysogenum e
Acremonium chrysogenum são as espécies utilizadas para a produção destes antibióticos,
respectivamente. O maior problema enfrentado pelos β-lactâmicos neste momento é o
desenvolvimento de bactérias resistentes a estes compostos, devido à produção de enzimas
que hidrolisam esses antibióticos (β-lactamases) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011).
1.3.4.2 Griseofulvina
Um dos primeiros antifúngicos naturais, a griseofulvina (Figura 3 (3)), é pertencente
ao grupo dos policetídeos e é produzida pelo fungo P. griseofulvum. Possui efeito
fungiostático e é utilizada no tratamento de infecções da pele, cabelo e unhas causadas por
Epidermophyton floccosum e espécies de Microsporum e Trichophyton. O mecanismo de ação
deste antifúngico é através da ligação com tubulinas, proteínas que formam os microtubos,
interferindo na função destas estruturas e impedindo a mitose (ALY; DEBBAB; PROKSCH,
2011; CHADEGANIPOUR; NILIPOUR; HAVAEI, 2004; CORVIS et al., 2006).
Além do fungo P. griseofulvum, outras espécies já foram descritas como produtoras de
griseofulvina, P. patulum, P. urticae, P. nigricans, P. sclerotigenum e Aspergillus versicolor
são algumas delas. Os fungos produtores deste composto já foram isolados em diversos
ecossistemas. Como exemplo, a espécie P.waksmanii, isolada do ambiente marinho (PETIT et
20
al., 2004) e a cepa Xylaria sp. strain F0010, fungo endofítico isolado de Abies holophylla
(PARK et al., 2005).
1.3.4.3 Ácido Fusídico
O ácido fusídico (Figura 3 (4)), isolado da fermentação de Fusidium coccineum, é um
antibiótico de espectro reduzido, capaz de inibir bactérias Gram-positivas (COLLIGNON;
TURNIDGE, 1999; FALAGAS; GRAMMATIKOS; MICHALOPOULOS, 2008). É utilizado
no tratamento de infecções causadas por S. aureus e o seu mecanismo de ação é através da
inibição da síntese protéica (MUSMADE et al., 2013). É classificado quanto a sua estrutura
química como um antibacteriano esteróide (ANDERSON, 1980). Estudos in vitro
demonstraram esse composto sendo mais eficaz que outros antibióticos, no tratamento de
infecções causadas por S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (GUENTHNER;
WENZEL, 1984).
1.3.4.4 Equinocandinas
As equinocandinas representam a mais nova classe de drogas aprovadas, utilizadas no
tratamento de infecções fúngicas (BAUER; BRÖNSTRUP, 2014). A equinocandina B (Figura
3 (5)), produzida pelos fungos A. nidulans var. echinolatus, A. nidulans var. roseus e A.
rugulosus, foi o primeiro tipo de equinocandina natural isolada. O mecanismo de ação destes
compostos é através da inibição não competitiva da enzima β- l, 3-glucano-sintetase, a qual
impede a formação de β-glucanos, componente essencial da parede celular de alguns fungos,
resultando em instabilidade osmótica e lise celular. O modo de ação nas paredes celulares de
fungos torna esses antifúngicos pouco tóxicos às células humanas (KATHIRAVAN et al.,
2012). Em geral, a estrutura química dos compostos pertencentes a este grupo baseia-se em
hexapeptídeos cíclicos ligados a uma cadeia lateral alifática de diferentes comprimentos
(CHEN et al., 2013). As equinocandinas são fungicidas contra Candida sp., e fungistática
contra algumas espécies de Aspergillus e Pneumocystis carynii, não sendo ativas contra
Cryptococcus sp. (que possui α-glucanos em sua parede celular), Fusarium sp. e Rhizopus sp.
21
(EMRI et al., 2013). Outras equinocandinas naturais são conhecidas, entre elas a
Pneumocandina B0, produzida pelo fungo Glarea lozoyensisc, a qual juntamente com a
equinocandina B, deram origem a alguns antibióticos semi-sintéticos: Caspofungina, primeira
equinocandina semi-sintética aprovada, Anidulafungina e Micafungina (ALY; DEBBAD;
PROKSCH, 2011).
1.3.4.5 Sordarinas
As sordarinas (Figura 3 (6)) representam uma classe de compostos antifúngicos, os
quais inibem a síntese protéica de fungos (VICENTE et al., 2009). São glicosídeos
diterpênicos tetracíclicos, primeiramente isolados da fermentação por Sordaria araneosa,
efetivos contra cepas de C. albicans, C. tropicalis, C. kefir e Cryptococcus neoformans, e
algumas cepas de fungos filamentosos, como Aspergillus spp., Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis e Coccidioides immitis (MISIEK;
HOFFMEISTER, 2007).
1.3.4.6 Esclerotiorina
Os policetídeos representam uma classe de metabólitos secundários produzidos por
diversos organismos, inclusive pelos fungos. Apresentam uma das maiores diversidades
estruturais entre os produtos naturais, incluindo polifenóis, polienos e macrolídeos
(SIMPSON; COX, 2012). A maioria destes compostos está relacionada a alguma atividade
biológica, entre elas, atividade antibacteriana e antifúngica (PASTRE et al., 2007).
A esclerotiorina (Figura 3 (7)) é um policetídeo pertencente à classe das azafilonas e é
relatada na literatura por possuir várias propriedades biológicas (CHIDANANDA; SATTUR,
2007). É produzida por diferentes espécies de fungo, como por exemplo, pelas cepas de P.
frequentans e P. sclerotiorum. No estudo da esclerotiorina produzida por P. frequentans essa
molécula demonstrou boa atividade antibacteriana e potente inibição da aldose redutase,
enzima envolvida em sérias complicações do diabetes (CHIDANANDA; RAO; SATTUR,
2006). Com relação à espécie P. sclerotiorum, nos estudos de Lucas, Castro e Takahashi
22
(2007) e Takahashi et al. (2008) que mostram a atividade antimicrobiana de fungos isolados
do solo do Cerrado brasileiro, a espécie P. sclerotiorum apresentou uma das melhores
atividades, sendo capaz de inibir as cepas de E. coli, S. aureus, Salmonella typhimurium,
Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes e C. albicans. A bioatividade foi relacionada
a alguns metabólitos isolados, entre eles a esclerotiorina (LUCAS; CASTRO; TAKAHASHI,
2007; TAKAHASHI et al., 2008). Este composto possui efeito bacteriostático sobre bactérias
gram-positivas e gram-negativas e atividade antifúngica (BAO et al., 2010), o que sugere que
esta molécula possua amplo espectro de atividade.
1.3.4.7 Peptídeos com ação antibiótica
Os peptídeos-antibióticos são metabólitos secundários bioativos produzidos
exclusivamente por fungos filamentosos, sendo estes na maioria dos casos pertencentes aos
gêneros Trichoderma, Acremonium, Paecilomyces e Emericellopsis (DEGENKOLB et al.,
2003; MARIK, et al., 2013). Essas moléculas são definidas como peptídeos lineares, com
massa molecular entre 500 e 2 200 Da (entre 5 e 21 resíduos de aminoácidos), contendo
aminoácidos incomuns, como ácido α-aminobutírico e isovalina, devido a biossíntese destes
peptídeos ser não ribossomal (DEGENKOLB; KIRSCHBAUM; BRÜCKNER, 2007). O
interesse nestas moléculas é devido à necessidade de novos antibióticos e da capacidade delas
possuírem também outras atividades biológicas (CARROUX et al., 2013). Segundo estudos,
os peptídeos antibióticos são capazes de formar poros na bicamada lipídica das membranas,
podendo possuir atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral e antiparasitária
(DEGENKOLB et al., 2003; SHI et al., 2012).
23
Figura 3. Estrutura química dos antibióticos penicilina G (1), cefalosporina C (2),
griseofulvina (3), ácido fusídico (4), equinocandina B (5), sordarina (6), esclerotiorina (7) e
ácido kójico (8).
24
1.3.4.8 Ácido kójico
O ácido kójico (Figura 3 (8)) é um metabólito secundário produzido por fungos dos
gêneros Aspergillus, Penicillium e Trichoderma. (KIM et al., 2013; SALEH et al., 2011). Na
produção deste ácido orgânico, diferentes fontes de carbono podem ser utilizadas, como
glicose, sacarose, acetato, etanol, arabinose e xilose (BURDOCK; SONI; CARABIN, 2001).
Diferentes bioatividades já foram relacionadas ao ácido kójico, entre elas a atividade
antimicrobiana (AYTEMIR; OZÇELIK, 2010). Isso permite o uso deste composto como
conservante natural de alimentos, sendo efetivo contra cepas de S. aureus e E. coli (LIU et al.,
2013).
1.4 Importância dos micro-organismos em alimentos e saúde escolhidos para o presente
estudo
Dados atualizados disponibilizados pela Organização Mundial da Saúde (OMS),
apontam doenças infecciosas entre as dez maiores causas mundiais de morte na década
passada. Além disso, a diarréia, causada na maioria dos casos pelo consumo de alimentos
contaminados, é a quinta maior causa, levando 1,9 milhões de pessoas à morte no ano de 2011
(OMS, 2013).
Muitas técnicas de conservação de alimentos já são conhecidas e aplicadas. Apesar
disso, a contaminação e as doenças transmitidas por alimentos ainda são desafios a serem
solucionados. No ano de 2000, foi determinado pela OMS que a segurança dos alimentos é
um problema de saúde pública. A maioria dos casos de Doenças Transmitidas por Alimentos
(DTAs) estão associados aos mesmos sintomas gastrointestinais: náusea, vômito e diarréia.
Poucos casos necessitam de cuidados médicos, porém, quando isso acontece, os sintomas
envolvidos se confundem com os de outras doenças, dificultando o diagnóstico DTAs. Outros
sintomas podem estar relacionados a elas como artrite, desordens autoimmunes, encefalopatia,
meningite e septicemia (KASOWSKI; GACKSTETTER; SHARP, 2002). O que significa que
casos sérios podem ser desenvolvidos por essas doenças, principalmente no acometimento do
grupo de risco (crianças, idosos e imunocomprometidos). No Brasil, os agentes etiológicos
25
associados aos maiores números de casos de surtos de DTAs entre 2000 e 2012 foram:
Salmonella sp. (envolvida em 39,38 % dos casos), S. aureus (19,79 %), B. cereus (7,60 %) e
E. coli (12,37 %) (BRASIL, 2013). Desta forma, é necessário o descobrimento de compostos
antimicrobianos alternativos eficientes, com diferentes mecanismos de ação e que possam ser
aplicados como compostos alternativos na conservação de alimentos e no tratamento
terapêutico de infecções causadas por estes micro-organismos.
Outro grande problema enfrentado nos últimos anos são as infecções causadas por
fungos, como a C. albicans. Isso se deve ao aumento do número de pessoas
imunocomprometidas que adquirem essas infecções, o que inclui: indivíduos portadores da
síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e pacientes que recebem tratamentos
terapêuticos como agentes anti-neoplásicos, imunossupressores ou antibióticos de amplo
espectro. O efeito tóxico e a falta de eficácia dos antifúngicos existentes justificam o
descobrimento de novos antifúngicos naturais eficientes (JIANG; AN, 2000; SASIDHARAN
et al., 2008).
Historicamente, os fungos foram importantes fontes de compostos naturais
antimicrobianos. Sua grande biodiversidade permite o descobrimento de fungos nunca antes
estudados e metabólitos com atividades desconhecidas. Desta forma, o presente trabalho teve
como objetivo selecionar linhagens de fungos filamentosos silvestres, isolados das Regiões de
Cerrado e Mata Atlântica do Estado de São Paulo, com potencial para produção de compostos
antimicrobianos contra os micro-organismos alvo escolhidos nesta pesquisa: S. aureus, B.
cereus, E. coli, S. choleraesuis e C. albicans. A Tabela 3 apresenta algumas características
destes micro-organismos.
26
Tabela 3. Características dos micro-organismos estudados para atividade antimicrobiana.
Micro-organismo Características
morfológicas Doenças/ Infecção Referência
S. aureus Bactéria Gram-
positiva
Intoxicação alimentar,
Pneumonia, Bacteremia,
Impetigo, Foliculite e
Osteomielite
KLOOS;
BANNERMAN,
1995
B. cereus Bactéria Gram-
positiva
Gastroenterite e Infecções
pulmonares BOTTONE, 2010
E. coli Bactéria Gram-
negativa
Gastroenterite, Infecção
urinária, Meningite e
Septicemia
KONEMAN et
al., 2001
S. choleraesuis Bactéria Gram-
negativa
Gastroenterite, Bacteremia,
Infecções extra-intestinal em
outros órgãos
CHIU; SU; CHU,
2004
C. albicans Fungo
leveduriforme
Candidíase oral e vaginal,
Infecções hospitalares
ODDS, 1994;
TUOMANEN,
1996;
DENNING, 2003
27
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Meios de cultura
Os meios de cultura utilizados neste estudo foram preparados segundo as
recomendações do fabricante e esterilizados a 121 ºC por 15 min.
Meio de cultura BDA (Ágar batata dextrose): foi utilizado para o isolamento das
culturas de fungos filamentosos, bem como, para a manutenção, crescimento e obtenção dos
extratos, os quais foram analisados quanto ao seu potencial antimicrobiano.
Meio de cultura NA (Ágar Nutriente com 0,1 % de glicose) e NB (Caldo Nutriente
com 0,1 % de glicose): Foram utilizados para o crescimento, manutenção e preparo do
inóculo das bactérias patogênicas utilizadas como micro-organismos alvo neste estudo. O
meio de cultura NB possui a mesma composição do NA, exceto pela presença de ágar.
Meio de cultura YMA (Yeast Malt Ágar com 2 % de glicose) e YMB (Caldo Yeast
Malt com 2 % de glicose): foram utilizados para o crescimento, manutenção e preparo do
inóculo da levedura patogênica utilizada como um dos alvos neste estudo. O meio de cultura
YMB (Difco, Detroit, Estados Unidos) possui a mesma composição do YMA, exceto pela
presença de ágar.
A composição dos referidos meios estão apresentadas na Tabela 4.
28
Tabela 4. Composição dos meios de cultura utilizados neste estudo.
Meio de Cultura Composição ( 1000 mL de água destilada)
BDA (Difco, Detroit, Estados Unidos)
4 g de amido de infusão de batata
20 g de dextrose
15 g de ágar
NA (Difco, Detroit, Estados Unidos)
3 g de extrato de carne
5 g de peptona
15 g de ágar
1 g de dextrose
YMA (Difco, Detroit, Estados Unidos)
3 g de extrato de levedura
3 g de extrato de malte
5 g de peptona
30 g de dextrose
20 g de ágar
2.2 Isolamento das culturas de fungos filamentosos
2.2.1 Coleta das amostras
As amostras de solo para o isolamento dos micro-organismos foram coletadas nas
regiões de Mata Atlântica e Cerrado do Estado de São Paulo, em locais cuja biodiversidade
ainda é mantida e pouco explorada. As amostras da região de Mata Atlântica foram coletadas
no Parque Estadual da cidade de Ilhabela (23° 50' 40,8" S e 45° 19' 26,6" W) e as amostras da
região de transição entre Cerrado e Mata Atlântica, em Barão Geraldo (22° 49' 40,2" S e 47°
04' 48,5" W), distrito pertencente à Campinas (Figura 4). O projeto de pesquisa referente ao
programa Biota recebeu autorização do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) para acessar e remeter amostras de componentes do Patrimônio
Genético, com a finalidade de pesquisa científica. Essa autorização foi registrada sob número
010662/2013-8 (ANEXO A).
29
Com o auxílio de espátulas e sacos de polietileno estéreis, foram coletadas ao acaso
amostras de solo da superfície de até no máximo 5 cm de profundidade, assim como flores,
frutos e sementes encontrados na serrapilheira. Na região de Mata Atlântica do município de
Ilhabela foram coletadas 28 amostras e na região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado
de Barão Geraldo (distrito de Campinas) foram coletadas 15 amostras. Em seguida, as
amostras obtidas foram transportadas para o Laboratório de Bioquímica de Alimentos (FEA,
Unicamp), local em que todos os experimentos desta pesquisa foram desenvolvidos.
Figura 4. Inventário Florestal da vegetação nativa do Estado de São Paulo (SIFESP, 2009);
Floresta Ombrófila densa, Floresta Ombrófila mista, Floresta Estacional
Semidecidual, Savana, Formação Arbórea/ Arbustiva em Região de Várzea,
Formação Arbórea/ Arbustiva- Herbácea de Terrenos Marinhos Lodosos,
Formação Pioneira Arbustiva- Herbácea sobre sedimentos Marinhos Recentes,
Represa, Curso d’ água, Área Urbana, Unidade de Conservação,
Bacia hidrográfica; Ilhabela , Barão Geraldo (Regiões de coleta das amostras para o
isolamento dos micro-organismos).
30
2.2.2 Isolamento e conservação das culturas de fungos filamentosos
Para o isolamento dos micro-organismos foi realizada a diluição das amostras
coletadas. Retirou-se, de forma representativa, 1 g de cada amostra e esta foi diluída em 10
mL de água destilada esterilizada. Alçadas de cada amostra foram plaqueadas através da
técnica de semeadura em superfície (estrias simples), em meio de cultura BDA suplementado
com cloranfenicol (50 ppm) para suprimir o crescimento bacteriano. As placas de Petri foram
mantidas a 30 ºC em estufa Fanem (modelo 002, São Paulo, Brasil) por até 72 h. A cada 24 h,
foi observado o crescimento de culturas filamentosas puras, as quais foram transferidas para
tubos com BDA inclinado que, por sua vez, foram incubados a 30 ºC até o crescimento
favorável da cultura. A conservação das culturas de fungos filamentosos isoladas foi feita em
tubos com BDA inclinado a 4 °C. A renovação das culturas foi feita periodicamente para
manutenção dos micro-organismos.
As culturas isoladas foram nomeadas de acordo com o local da coleta, Ilhabela e Barão
Geraldo (recebendo os códigos IB e BG, respectivamente) e, além disso, o número da amostra
na qual foi feita o isolamento e letras sequenciais para sua distinção. Os micro-organismos
isolados foram incorporados à Coleção de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica
de Alimentos, FEA- UNICAMP (CMLB).
2.2.3 Estudo morfológico macroscópico das linhagens fúngicas estudadas
As culturas de fungos filamentosos isoladas foram estudadas quanto à morfologia das
colônias. Características como presença de filamentos, textura da colônia, cor e produção de
pigmentos difundidos no meio foram analisadas.
31
2.3 Seleção de micro-organismos potenciais para produção de compostos bioativos com
atividade antimicrobiana
2.3.1 Culturas de fungos filamentosos estudadas
As culturas de fungos filamentosos isoladas a partir das amostras coletadas em
Ilhabela e Barão Geraldo, juntamente com algumas culturas de fungos já pertencentes à
CMLB foram estudadas quanto ao seu potencial antimicrobiano. Ao todo, 169 culturas de
fungos filamentosos foram estudadas e são apresentadas nas Tabelas 5 e 6.
Tabela 5. Fungos filamentosos estudados, pertencentes à CMLB.
Classificação das culturas da CMLB
RP 3 RP 24 RP 148 RP 164 RP 225 RP 331 RP 396 RP 480
RP 9 RP 59 RP 153 RP 180 RP 255 RP 347 RP 406 RP 488
RP 13 RP 63 RP 156 RP 184 RP 261 RP 361 RP 462 RP 1215
RP 16 RP 88 RP 159 RP 208 RP 314 RP 366 RP 471 RP 1701
RP 20 RP 143 RP 162 RP 216 RP 318 RP 367 RP 478
Fungos identificados pertencentes à CMLB
Paecilomyces variotii Aspergillus sp. 1099 P. corylophilum
Rhizopus sp. Fusarium sp. Fusarium graminearum
Trichoderma harzianum A. niger Aspergillus sp.
Aspergillus sp. 1068 Acremonium strictum
32
Tabela 6. Fungos filamentosos estudados, isolados da região de Mata Atlântica, do município
de Ilhabela e da região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado do distrito de Barão
Geraldo (Campinas).
Classificação das culturas de Ilhabela
IB 3A IB 6D IB 14A IB 18A IB 27B IB 33C IB 36C IB 40A IB 44G
IB 4B IB 6E IB 14B IB 23A IB 31A IB 34A IB 37A IB 44A IB 45B
IB 4C IB 7A IB 14C IB 23B IB 31C IB 35A IB 38A IB 44B IB 49A
IB 6A IB 8A IB 16A IB 24A IB 32A IB 35B IB 38B IB 44C IB 49C
IB 6B IB 10B IB 17A IB 25A IB 33A IB 36A IB 38D IB 44D IB 50A
IB 6C IB 13A IB 17B IB 27A IB 33B IB 36B IB 38E IB 44E IB 50B
Classificação das culturas de Barão Geraldo
BG1A BG3C BG 5A BG 8B BG 9F BG 13C BG 14F BG 15C
BG 15D
BG 16A
BG16B
BG 16C
BG 16D
BG 16E
BG 16F
BG1B BG3D BG 5B BG 8C BG 10A BG 13D BG 14G
BG1C BG3E BG 5C BG 8D BG 10B BG 13E BG 14H
BG1D BG3F BG 5D BG 9A BG 10C BG 14A BG 14I
BG2A BG 4A BG 6A BG 9B BG 10D BG 14B BG 14J
BG2B BG 4B BG 7A BG 9C BG 11A BG 14C BG 14K
BG 3A BG 4C BG 7B BG 9D BG 13A BG 14D BG 15A
BG3B BG 4D BG 8A BG 9E BG13B BG 14E BG 15B
2.3.2 Cultivo e preparação do extrato
Para a obtenção dos extratos, as culturas de fungos filamentosos foram cultivadas em
superfície de ágar em tubos de BDA inclinado, a 30 °C em estufa Fanem por 120 h, seguindo
a metodologia descrita por Conti et al. (2012) e Le Ker et al. (2011). Em seguida, foi
adicionada água destilada esterilizada (1 a 2 mL) a cada tubo e com o auxílio de uma alça de
inoculação foi feita uma raspagem da superfície do ágar para dissolução dos esporos e
metabólitos. O extrato aquoso obtido foi filtrado e esterilizado com filtros Millipore estéreis,
com poros de 0,22 µm de diâmetro e armazenados em microtubos estéreis -20 °C.
33
2.3.3 Atividade antimicrobiana
2.3.3.1 Micro-organismos alvo
O potencial antimicrobiano dos fungos foi avaliado contra cepas patogênicas cedidas
pela Divisão de Microbiologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquidas Químicas, Biológicas
e Agrícolas (CPQBA) da Unicamp e também pelo Laboratório de Higiene e Legislação
(DTA, FEA, Unicamp). Os micro-organismos alvo utilizados nessa pesquisa foram: as
bactérias gram-positivas B. cereus e S. aureus ATCC 6538; as gram-negativas E. coli ATCC
11229 e S. choleraesuis ATCC 14028; e a levedura C. albicans ATCC 10231. As bactérias
foram cultivadas em tubos com NA inclinado e a levedura em tubos com YMA inclinado. A
manutenção destas culturas foi feita em tubos com ágar inclinado, a 4 °C.
2.3.3.2 Preparo do inóculo
Para os ensaios de atividade antimicrobiana, o inóculo dos micro-organismos
patogênicos foi preparado com o auxílio de uma alça de inoculação retirando-se uma alçada a
partir da cultura do micro-organismo cultivado em tubos com ágar inclinado, e esta foi
transferida para frascos do tipo Erlenmeyer de 250 mL com 75 mL do caldo apropriado. As
bactérias foram cultivadas em NB e a levedura em YMB. Os frascos foram incubados com
agitação de 150 rpm em uma incubadora com agitação orbital (modelo TE-421, Tecnal,
Brasil) na temperatura ideal de crescimento de cada micro-organismo (Tabela 7). A
concentração do inóculo dos micro-organismos alvo em teste foi padronizada pela leitura da
absorbância a 490 nm e 600 nm, para as bactérias e para a levedura, respectivamente, em
espectrofotômetro (modelo DU®640, Beckman CoulterTM
, Estados Unidos). O meio cultivo
foi utilizado como branco. As condições de cultivo utilizadas para cada micro-organismo
estão apresentadas na Tabela 7.
34
Tabela 7. Condições de cultivo para o preparo do inóculo dos micro-organismos alvo deste
estudo.
Micro-organismo Condições de
cultivo
Período de
crescimento
Abs¹ do
inóculo
B. cereus 37 ºC/ 150 rpm 4 h 0,6 – 0,7
E. coli ATCC 11229 37 ºC/ 150 rpm 4 h 0,6 – 0,7
S. aureus ATCC 6538 37 ºC/ 150 rpm 6 h 0,6 – 0,7
S. choleraesuis ATCC 14028 37 ºC/ 150 rpm 6 h 0,6 – 0,7
C. albicans ATCC 10231 30 ºC/ 150 rpm 8 h 0,1 – 0,2
¹Leitura da absorbância do inóculo, medida a 490 nm para bactérias, e a 600 nm para
levedura.
2.3.3.3 Ensaios de atividade antimicrobiana
Os ensaios de atividade antimicrobiana foram conduzidos pelo método de
microdiluição em microplacas estéreis de 96 compartimentos (modelo 3595, Corning® e
Costar®, EUA) e é baseado na metodologia proposta por Eloff (1998), com algumas
modificações. Foram estudadas duas concentrações do extrato aquoso obtido para cada
cultura de fungo (Item 2.3.2), 10 e 20 % do volume total de cada compartimento, o que
corresponde a 20 e 40 µL, para um volume final de 200 µL/compartimento. A estes extratos
foram adicionados 50 µL/compartimento do meio de cultivo apropriado (NB 0,1 % de
glicose, para bactérias e YMB 2 % de glicose, para a levedura) e 50 µL/compartimento do
inóculo do micro-organismo alvo. Os compartimentos foram completados com água destilada
esterilizada, para um volume final de 200 µL/compartimento.
Foi feito também, em todas as microplacas, o branco de cada extrato, o controle do
inóculo e o controle do meio de cultura. O branco foi realizado nas duas concentrações
estudadas, para que não houvesse influência da cor das amostras na leitura da absorbância, e
foram constituídos pelo extrato (20 e 40 µL) e o conteúdo completado com água destilada
esterilizada para um volume final de 200 µL. O controle do inóculo, ou controle negativo, foi
35
adotado como referência para verificar o potencial de inibição dos extratos estudados e foi
preparado da mesma forma realizada para as amostras, sendo constituído por 50 µL do caldo
apropriado (NB ou YMB), 50 µL do inóculo e 100 µL de água destilada estéril. O controle do
meio de cultura foi constituído por 200 µL do caldo apropriado e foi utilizado como controle
da esterilidade do meio. Todos experimentos foram realizados em duplicata.
Nos ensaios com as bactérias, as microplacas foram incubadas a 37 °C em estufa
Fanem por 20 h. Como indicador de crescimento microbiano, foi adicionado 20
µL/compartimento do reagente cloreto de iodonitrotetrazólio – INT (Identificação I8377,
Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA) dissolvido em água na concentração de 4 mg mL-1
(concentração recomendada pela Sigma-Aldrich), 30 minutos antes da leitura das placas. O
crescimento bacteriano foi quantificado por colorimetria, pela leitura da absorbância em um
leitor de microplacas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Alemanha), a 490 nm. No caso dos
ensaios com a levedura, as microplacas foram mantidas a 30 °C por 20 h e o crescimento
fúngico foi quantificado por densidade óptica pela leitura da absorbância das microplacas a
600 nm. O percentual de inibição do crescimento microbiano foi calculado pela seguinte
fórmula:
( ) ( ) ( )
( )
2.4 Estudo da atividade antimicrobiana das culturas de fungos selecionadas
2.4.1 Preparação do extrato dos fungos com maior potencial antimicrobiano
Os fungos filamentosos que apresentaram maior atividade antimicrobiana contra os
micro-organismos alvos estudados foram cultivados nas mesmas condições anteriormente
citadas (descrito no item 2.3.2), e a obtenção dos extratos também foi conduzida da mesma
forma. Os extratos obtidos foram congelados a -20 ºC e em seguida liofilizados em um
liofilizador de bancada (Liotop L101, Liobras Indústria Comércio e Serviço de Liofilizadores
Ltda, São Carlos, Brasil) durante 48 h. Os extratos liofilizados foram armazenados a -20 ºC
em frascos de polietileno fechados. Para a condução dos estudos posteriores, os extratos
36
liofilizados foram solubilizados em uma concentração conhecida de 80 mg mL-1
nos meios de
cultivo utilizados em cada experimento (NB 0,1 % de glicose para bactérias e YMB 2 % de
glicose para a levedura). Em seguida, as soluções de extrato preparadas foram filtradas e
esterilizadas com filtros Millipore estéreis com poros de 0,22 µm de diâmetro e armazenadas
em frascos de vidro estéreis sob congelamento a -20° C.
2.4.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) pela técnica de microdiluição e
monitoramento da atividade antimicrobiana
A MIC foi determinada para os fungos filamentosos que apresentaram maior potencial
antimicrobiano contra as linhagens de micro-organismos alvo deste estudo. O preparo do
inóculo dos micro-organismos patogênicos testadas foi preparado nas mesmas condições
descritas no item 2.3.3.2, padronizando a concentração do inóculo a ser utilizado pela leitura
da absorbância.
A MIC foi avaliada pelo método de microdiluição, baseado nas metodologias
propostas por Eloff e Zgoda e Porter com algumas modificações (ELOFF, 1998; ZGODA;
PORTER, 2001). Os experimentos foram realizados em triplicata e foram estudadas 10
concentrações de extrato. Em uma microplaca estéril de 96 compartimentos (modelo 3595,
Corning®
e Costar®
, EUA) foram depositados da primeira coluna até a décima coluna, 50 µL
do caldo apropriado para o experimento (NB 0,1 % de glicose para bactérias e YMB 2 % de
glicose para levedura). Nos três primeiros compartimentos, da primeira e segunda coluna,
foram depositados 50 µL do extrato (80 mg mL-1
). O conteúdo dos compartimentos da
segunda coluna foi homogeneizado com o auxílio de uma pipeta automática multicanal
(Pipetman Neo® Multichanel, Gilson, EUA) e 50 µL do conteúdo destes compartimentos
foram transferidos para os compartimentos da terceira coluna. Este procedimento foi repetido
até a décima coluna e os 50 µL finais foram desprezados. Desta forma, foram realizadas
diluições seriadas do extrato e as concentrações entre 20 e 0,04 mg mL-1
foram obtidas. Em
seguida, 50 µL de inóculo foram adicionados até a décima coluna, e o volume final dos
compartimentos completados com meio de cultivo para 200 µL. Para cada microplaca foi
realizado o controle do inóculo (sem o extrato), o controle dos extratos em todas as
37
concentrações estudadas (sem inóculo) e o controle do meio de cultivo. O controle do inóculo
foi preparado com 50 µL de inóculo e 150 µL de meio de cultivo, e o controle dos extratos foi
preparado da mesma maneira que as amostras, substituindo-se o inóculo e o meio de cultivo
por água destilada estéril (Figura 5). As microplacas foram incubadas por 20 h em um leitor
de placas FLUOstar OPTIMA, nas condições de temperatura para cada micro-organismo
analisado, 37 ºC e 30 ºC, para as bactérias e para a levedura, respectivamente. O crescimento
bacteriano e da levedura foi monitorado por medições da densidade óptica, com leituras da
absorbância a cada 30 min. Antes de cada leitura era feita a agitação da placa (150 rpm/60 s).
As leituras de absorbância foram feitas a 490 nm (bactérias) e 600 nm (leveduras)
(LEHTINEN et al., 2006). Com isso, foram geradas curvas de crescimento, com o objetivo de
se observar a atividade antimicrobiana dos extratos ao longo do tempo de crescimento dos
micro-organismos alvo.
Nos estudos em que os micro-organismos alvos eram bactérias foi adicionado, após o
período de incubação, 20 µL/compartimento do reagente INT (Sigma-Aldrich) dissolvido em
água (4 mg mL-1
) (ELOFF, 1998). A MIC foi definida como a concentração mínima de
extrato capaz de inibir o crescimento do micro-organismo e foi detectada visualmente como a
menor concentração de extrato em que não se observou mudança na coloração do meio de
amarelo (original) para vermelho.
A MIC dos extratos analisados contra a levedura C. albicans foi definida como a
concentração mínima de extrato ou de antibiótico capaz de inibir o crescimento deste micro-
organismo e foi determinada através da análise das curvas de crescimento, geradas pelo
monitoramento do crescimento do micro-organismo pela leitura da absorbância em um leitor
de placas.
Como controle positivo foi realizada também a determinação da MIC e o
monitoramento da atividade antimicrobiana dos antibióticos comerciais Cloranfenicol
(Identificação C1919, Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA) e Nistatina (Identificação N4014,
Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA). Para o preparo da solução do antibiótico Cloranfenicol, 50
mg do produto foram dissolvidos em condições assépticas em 1 mL de etanol. Em seguida,
essa solução foi diluída 50 vezes em água destilada esterilizada e uma concentração final de 1
mg mL-1
foi obtida. No preparo da solução de Nistatina, 11,2 mg do reagente foram
dissolvidos em condições assépticas em 1 mL de metanol e depois diluída 10 vezes em água
38
destilada esterilizadas. As soluções finais dos antibióticos foram armazenadas refrigeradas a 4
ºC até o seu uso. As mesmas condições de preparo das análises com os extrato foram
utilizadas para o Cloranfenicol e para Nistatina e concentrações entre 0,2 e 0,0001 mg mL-1
dos antibióticos comerciais foram estudadas.
Figura 5. Modelo da disposição das amostras na microplaca de 96 poços nas análises de MIC,
em que as três primeiras linhas representam a triplicata de cada concentração de extrato
analisada, e os números de 1 a 10 representam as concentração de extrato analisadas, da maior
para a menor concentração (mg mL-1
): 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,63; 0,31; 0,16; 0,08 e 0,04.
2.4.3 Determinação da concentração mínima bactericida/fungicida (MBC/MFC)
A MBC/MFC foi definida como a menor concentração de extrato capaz de reduzir
99,9 % ou 3 ciclos log10 dos micro-organismos presentes no inóculo inicial, sendo possível
classificar segundo Hafidh et al. (2011), o efeito dos extratos em bacteriostático/fungistático
ou bactericida/fungicida. O efeito dos extratos e dos antibióticos (controles positivos) na
Controle do
meio de
cultivo
Concentrações
de extrato/
antibiótico
comercial
Branco das
concentrações
de extrato/
antibiótico
comercial
Controle
do inóculo
39
redução microbiana foi observado através da contagem de micro-organismos (UFC mL-1
) por
plaqueamento de superfície.
Desta forma, para determinação da MBC/MFC, foi retirada assepticamente a partir da
microplaca preparada para determinação da MIC, uma alíquota de 100 µL dos
compartimentos de MIC, do compartimento subsequente, de maior concentração e dos
compartimentos do controle do inóculo (controle negativo), previamente homogeneizados.
Esses conteúdos foram transferidos a microtubos estéreis e, em seguida, foi realizado o
plaqueamento de superfície em triplicata destas amostras. Foram plaqueadas alíquotas de 10
µL das amostras, assim como as suas diluições seriadas (1:10, 1:100 e 1:1000) em água
peptonada 0,1 % (Peptona Bacteriológica LP0037, Oxoid, Basingstone, Inglaterra). No caso
das bactérias, o plaqueamento foi feito em NA (0,1 % de glicose) e da levedura em YMA (2
% de glicose). As placas foram incubadas por 24 h, a 37 ºC para as bactérias e 30 ºC para a
levedura.
A concentração do inóculo inicial, padronizada inicialmente apenas pela leitura da
absorbância, também foi determinada por plaqueamento de superfície (UFC mL-1
). Desta
forma, sabendo a concentração inicial do inóculo (UFC mL-1
), foi feita a comparação do
percentual de redução dos micro-organismos patogênicos, ocasionados pelos extratos e pelos
antibióticos comerciais. A contagem de micro-organismos no inóculo inicial foi conduzida
nas mesmas condições de plaqueamento de superfície anteriores.
40
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Isolamento das culturas de fungos filamentosos
A partir das amostras de solo e serrapilheira coletadas na região de Mata Atlântica
(Ilhabela) e na região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado (Barão Geraldo, Campinas)
foi realizado o isolamento das culturas de fungos filamentosos. Na região de Mata Atlântica
foram coletadas 28 amostras e destas 54 isolados foram obtidos (Apêndice 1). Já na região de
transição 15 amostras foram coletadas e 64 isolados foram obtidos (Apêncide 2). As culturas
isoladas foram nomeadas como descrito no item 2.3.2. A Figura 6 apresenta o número de
isolados por tipo de amostra coletada.
Foi possível observar que apesar do número de amostras coletadas na região de
transição ter sido menor que na região de Mata Atlântica, o número de fungos isolados foi
relativamente superior. Dentre as amostras coletadas na região de transição, 6 delas eram de
solo, enquanto na região de Mata Atlântica apenas 3 eram amostras de solo (Apêndice 1 e 2).
Segundo Knight e colaboradores (2003), o solo é o ecossistema que contém uma população
microbiana maior do que qualquer outro habitat. Isso implica que o maior número de fungos
isolados na região de transição pode ser devido ao maior número de amostras de solo
coletadas.
Takahashi e colaboradores (2008) isolaram 200 linhagens de fungos filamentosos a
partir de 15 amostras de solo do Cerrado brasileiro em um estudo de seleção fungos
filamentosos com atividade antibacteriana. Os autores isolaram um número
consideravelmente superior de culturas de fungos filamentosos quando comparado aos dados
deste trabalho. Isso ocorreu possivelmente devido ao fato de as amostras coletadas pelos
autores serem todas de solo, que como dito anteriormente, é o habitat em que um maior
número de populações microbianas são encontradas.
As 118 culturas de fungos filamentosos isoladas foram adicionadas a CMLB, as quais
poderão ser utilizadas em estudos futuros. E juntamente com outras culturas de fungos já
pertencentes à CMLB, ao todo 169 culturas de fungos filamentosos foram estudadas no
presente trabalho.
41
Figura 6. Número de culturas de fungos obtidas para cada tipo de amostra coletada nas
regiões de Mata Atlântia e de transição entre Mata Atlântica e Cerrado.
As colônias dos micro-organismos foram, então, analisadas quanto às suas
características morfológicas macroscópicas. Detalhes como cor da colônia, textura e
capacidade de liberar pigmentos no meio de cultivo foram analisadas e descritas nos
Apêndices 1, 2 e 3.
3.2 Seleção de micro-organismos com maior potencial antimicrobiano
Os extratos aquosos das culturas de fungos em estudo foram preparados e analisados
quantitativamente quanto ao seu potencial antimicrobiano contra os micro-organismos
potencialmente patogênicos B. cereus, S. aureus, E. coli, S. choleraesuis e C. albicans. Nos
ensaios de atividade antimicrobiana os micro-organismos alvo desta pesquisa foram
inoculados na presença e ausência dos extratos fúngicos. Desta forma, perante um controle de
crescimento do inóculo (ausência de extrato), considerado 100 % de crescimento, foi
calculado o percentual de inibição do crescimento dos micro-organismos patogênicos
ocasionado pela presença dos extratos em estudo.
6
31
10 7
0
37
6 8
4
9
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Solo Folhas Frutos Tronco Cogumelo
Fonte de isolamento
Região de MataAtlântica
Região de Transição
Nú
me
ro d
e c
ult
ura
s d
e f
un
gos
42
Os extratos fúngicos apresentaram distintos valores de inibição de crescimento dos
micro-organismos patogênicos (Apêndice 4, 5, 6 e 7). Desta forma, estes foram classificados
quanto ao seu potencial antimicrobiano em faixas de percentual de inibição (Figuras 7, 8, 9,
10 e 11). Os extratos que foram capazes de inibir mais que 81 % do crescimento dos micro-
organismos patogênicos foram classificados como extratos com elevado potencial
antimicrobiano e foram estudados quanto ao seu efeito.
3.2.1 Atividade antimicrobiana contra B. cereus
Considerando os resultados apresentados na Figura 7, pode-se observar o número de
culturas de fungos com atividade antimicrobiana para cada faixa de inibição (%). Os valores de
inibição de B. cereus variaram entre 0 e 89,05% de inibição. Nota-se que o maior número de
culturas de fungos foi capaz de inibir entre 21 e 40% o crescimento da linhagem de B. cereus.
Um menor número de fungos mostrou possuir elevado potencial antimicrobiano, sendo capaz
de inibir acima de 81% o crescimento de B. cereus.
Foram estudadas duas concentrações de extrato fúngico (10 e 20 % de um volume final
de 200 µL por compartimento), com o objetivo de observar a relação existente entre a
concentração de extrato e o percentual de inibição do micro-organismo alvo. Porém, não foi
detectada uma relação positiva entre o aumento da concentração de extrato e o aumento da
inibição desta linhagem de B. cereus, visto que o número de fungos nas faixas de inibição de
crescimento se manteve muito parecido para as duas concentrações.
Segundo as condições de cultivo e preparo do extrato, propostas neste trabalho, pode-se
concluir que aproximadamente 80 % das linhagens de fungos testadas apresentaram atividade
antimicrobiana contra a linhagem de B. cereus. Entretanto, apenas 4,1 % das culturas foram
capazes de inibir mais de 81 % do crescimento microbiano, e estas são exibidas na Tabela 8.
Observa-se que, dentre as sete culturas, cinco delas foram isoladas na região de transição entre
Cerrado e Mata Atlântica (Barão Geraldo), uma na região da Mata Atlântica (Ilhabela) e a outra
pertence à coleção de fungos identificados da CMLB. Isso sugere que, a região de transição foi
um ambiente favorável para o isolamento de micro-organismos com elevado potencial de
inibição desta linhagem de B. cereus.
43
Figura 7. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de B. cereus.
Segundo as condições de cultivo e preparo do extrato, propostas neste trabalho, pode-se
concluir que aproximadamente 80 % das linhagens dos fungos testados apresentaram alguma
atividade antimicrobiana contra a linhagem de B. cereus. Porém, apenas 4,1 % das culturas de
fungos apresentam significativa atividade antimicrobiana contra este micro-organismo. Na
tabela 9, é possível identificar os extratos das culturas de fungos que foram capazes de inibir
acima de 81 % do crescimento deste micro-organismo patogênico. Observa-se que, dentre essas
sete culturas, cinco delas foram isoladas na região de transição entre Cerrado e Mata Atlântica
(Barão Geraldo), uma na região da Mata Atlântica (Ilhabela) e uma pertencente à coleção de
fungos identificados da CMLB. Isso sugere que, a região de transição foi um ambiente
favorável para o isolamento de micro-organismos com elevado potencial de inibição desta
linhagem de B. cereus.
32 29
64
24
13 7
34 33
50
30
15
7
0
20
40
60
80
0 ≤ 20 21 – 40 41 – 60 61 – 80 81 - 100
Nú
me
ro c
ult
ura
s d
e f
un
gos
Inibição do crescimento (%)
10 % de extrato
20 % de extrato
44
Tabela 8. Fungos com maior atividade antimicrobiana
contra a linhagem de B. cereus.
Cultura de fungo Inibição do crescimento de
B. cereus (%)
IB 36A 81,49 ± 22,39
BG 4B 85,39 ± 0,36
BG 11A 87,82 ± 0,63
BG 13D 89,05 ± 1,42
BG 13E 87,37 ± 0,47
BG 14K 81,92 ± 2,02
Aspergillus sp. (1099) 85,51 ± 0,54
Como descrito nos itens 2.4.2 e 2.4.3 foi determinada a concentração mínima inibitória
e a concentração mínima bactericida/fungicida de todos os extratos frente aos micro-
organismos alvo que cada extrato foi capaz de inibir. Além disso, através do monitoramento
do crescimento dos micro-organismos patogênicos na presença dos extratos, foi analisada sua
atividade antimicrobiana ao longo do tempo.
A partir dos resultados da tabela 9, observa-se que os valores de MIC dos extratos
variaram entre 0,313 e 10 mg mL-1
e os valores de MBC entre 0,625 e 20 mg mL-1
, ambos
assemelhando-se aos resultados encontrados na literatura (CARVALHO et al., 2012; HUANG
et al., 2007). Os resultados sugerem que o extrato BG4B foi o que apresentou maior atividade
antimicrobiana, necessitando, assim, de uma menor concentração para inibir o crescimento de
B. cereus (0,313 mg mL-1
), diferentemente do que foi observado para BG13E, o qual obteve o
maior valor de MIC (10 mg mL-1
). A MIC encontrada para o antibiótico comercial está de
acordo com a literatura e com o que é recomendado pelo fabricante (GEHRKE et al., 2013).
Porém, a MIC dos extratos para B. cereus foi relativamente superior àquela encontrada para o
antibiótico comercial, o que pode ser justificado pelo fato de que o antibiótico em estudo é um
composto isolado e o extrato trata-se de uma solução bruta, possuindo muitos compostos que
podem interferir nos resultados de atividade.
45
Não foi possível determinar a MBC de todos os extratos estudados, visto que foi
realizado apenas o plaqueamento da concentração de MIC e 2MIC. Dentre os fungos
analisados para atividade antimicrobiana sobre B. cereus, quatro foram capazes de produzir
compostos com efeito bactericida. Os outros três extratos dos fungos apresentaram efeito
bacteriostático, porém foram eficazes mesmo em baixas concentrações (entre 0,313 e 0,625
mg mL-1
).
Alguns agentes bactericidas são também bacteriolíticos, os quais recebem essa
denominação por provocarem a morte microbiana através de lise celular e liberação do
conteúdo citoplasmático. Lehtinen e colaboradores (2006) investigaram a possibilidade de
determinar o efeito bacteriostático, bactericida e bacteriolítico de antibióticos através do
monitoramento do crescimento de uma cepa de E. coli sobre o efeito de antibióticos. Os
resultados obtidos demonstraram que o monitoramento através de leituras de densidade óptica
pode refletir o número de células, assim como o estado de bacteriostase e a ação bacteriolítica,
a qual é verificada pelo decaimento nos valores de absorbância (LEHTINEN et al., 2006).
Tabela 9. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e
efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente ao B. cereus.
Extrato fúngico ou
Antibiótico comercial
MIC
(mg mL-1)
MBC
(mg mL-1)
Ratio
MIC:MBC
Efeito
antimicrobiano
IB 36A 2,5 2,5 1:1 Bactericida
BG 4B 0,313 * > 2:1 Bacterióstático
BG 11A 5 10 2:1 Bactericida
BG 13D 0,625 0,625 1:1 Bactericida
BG 13E 10 20 2:1 Bactericida
BG 14K 0,625 * > 2:1 Bacteriostático
Aspergillus sp. (1099) 0,625 * > 2:1 Bacteriostático
Cloranfenicol 0,004 * > 2:1 Bacteriostático
*Não foi determinada a MBC.
46
Diante do exposto e analisando os resultados da Figura 8, observa-se que as amostras
que apresentaram efeito bactericida sobre a linhagem de B. cereus (BG11A, IB36A, BG13D e
BG13E) também demonstraram ação bacteriolítica sobre este micro-organismo, a qual pode
ser observada devido ao decaimento nos valores de absorbância ao longo do crescimento. Este
resultado pode sugerir que os compostos antimicrobianos presentes nestas amostras tenham
efeito bactericida por atuarem na parede celular provocando sua lise.
Figura 8. Crescimento de B. cereus (% D.O.), na presença de diferentes concentrações (mg
mL-1
) de extrato dos fungos BG11A (A), IB36A (B), BG13D (C) e BG13E (D), durante 20 h
de exposição.
Através do percentual de decaimento dos valores de absorbância, a Tabela 10 expõe a
atividade bacteriolítica de cada extrato nas suas concentrações de MIC e MBC em dois pontos
da curva de crescimento (4 e 20 h). Observa-se que os extratos BG13D e BG13E
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20
Controle 5 10
D.O
.(%
)
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20
Controle 2,5 5 10
D.O
.(%
)
B
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20
Controle 0,625 1,25 2,5
C
D.O
.(%
)
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20
Controle 20 10 5
D.O
.(%
)
A
D
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
47
demonstraram as maiores atividades bacteriolíticas, porém BG13D em uma concentração de
extrato relativamente menor que a de BG13E. Todavia, nota-se que a ação bacteriolítica
provocada por BG13E foi ativa logo nas primeiras horas de crescimento de B. cereus,
diferentemente do que foi observado para as outras amostras e demonstrando o potencial dos
compostos produzido por este fungo.
Tabela 10. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de IB36A, BG11A, BG13D e BG13E
sobre a bactéria B. cereus.
Tempo (h)
Extratos fúngicos (mg mL-1
)
IB36A BG11A BG13D BG13E
2,5
(MIC/MBC)
5
(MIC)
10
(MBC)
0,625
(MIC/MBC)
10
(MIC)
20
(MBC)
4 12,19±2,09 25,38±2,69 37,24±1,24 19,84±7,28 66,33±1,62 63,49±1,90
20 61,17±3,84 52,56±1,57 62,51±1,43 69,88±0,59 64,96±1,68 69,25±2,56
A literatura descreve alguns compostos produzidos por fungos filamentosos que
possuem efeito bacteriolítico, dentre eles os chamados peptídeos com ação de antibióticos
(peptaibols). Estes peptídeos são produzidos exclusivamente por fungos dos gêneros
Trichoderma, Acremonium, Paecilomyces e Emericellopsis. São capazes de formar poros na
bicamada lipídica das membranas e demonstram atividade antimicrobiana de amplo espectro
contra bactérias Gram-positivas (DEGENKOLB et al., 2003; SHI et al., 2012). Entre os
antimicrobianos produzidos por fungos com efeito bacteriostático a literatura expõe alguns
metabólitos, como o ácido fusídico e a esclerotiorina, os quais são produzidos pelos fungos F.
coccineum e Penicillium sp., respectivamente (COLLIGNON; TURNIDGE, 1999;
FALAGAS; GRAMMATIKOS; MICHALOPOULOS, 2008; BAO et al., 2010). Diante do
grande conteúdo de compostos fúngicos antimicrobianos descritos, a identificação das
espécies de fungos filamentosos deste estudo pode ser a etapa inicial na assimilação dos
compostos antimicrobianos envolvidos.
Em geral, a maioria das cepas de B. cereus são resistente à penicilinas e
cefalosporinas, como conseqüência da produção da enzima beta-lactamase.
48
Estes antibióticos têm em comum a estrutura de um anel beta-lactâmico e a enzima beta-
lactamase quebra este anel, desativando as propriedades destas moléculas (BOTTONE, 2010).
No caso de infecções associadas ao agente B. cereus, que requerem o tratamento com
antibiótico, a vancomicina, os aminoglicosídeos, os carbapenêmicos e fluoroquinolonas são os
compostos mais utilizados (LUNA et al., 2007).
O B. cereus é uma bactéria gram-positiva, aeróbia, formadora de esporo, comumente
encontrada no solo e relacionada à deterioração e intoxicação alimentar. É produtora de dois
tipos de toxinas, a emética e a diarréica, cujos sintomas causados por elas são vômito e
diarréia, respectivamente. Está relacionada a relevantes problemas devido à formação de
esporos termorresistentes e a sua capacidade em aderir a superfícies, ocasionando problemas
de contaminação em ambientes da produção de alimentos, de processos biotecnológicos e
clínicos (LOGAN, 2012). No Brasil, o B. cereus é um dos micro-organismos associados ao
maior número de DTAs (BRASIL, 2013). Além disso, já foram relatados casos de septicemia,
meningite e pneumonia relacionados com este micro-organismo em indivíduos
imunocomprometidos (SCHOENI; LEE WONG, 2005). Desta forma, é de grande importância
o descobrimento de compostos antimicrobianos eficientes e que possam ser aplicados como
compostos alternativos na conservação de alimentos e no tratamento terapêutico de infecções
causadas por este micro-organismo.
3.2.2 Atividade antimicrobiana contra E. coli ATCC 11229
A E. coli é uma bactéria gram-negativa, não formadora de esporos, pertencente à
família das Enterobacteriaceae e cujo habitat é o trato gastrointestinal dos animais (incluindo
o homem) (SILVA et al., 2003). Algumas cepas são patogênicas, podendo causar severas
doenças intestinais ao homem. A diarréia, muitas vezes associada à DTAs, é ainda hoje uma
das dez maiores causas de mortes no mundo (OMS, 2013). A E. coli é uma das principais
bactérias envolvidas em casos de DTAs (AKHTAR; SARKER; HOSSAIN, 2014), sendo
relevante o estudo de novas fontes naturais de compostos antimicrobianos contra este micro-
organismo.
49
Os percentuais de inibição dos extratos fúngicos para E. coli ATCC 11229 variaram
entre 0 e 89,25 %. Observou-se que grande parte dos extratos não apresentaram atividade
antimicrobiana contra este micro-organismo, sendo classificados na faixa de 0 inibição
(Figura 9). Um pequeno número de extratos apresentaram inibição entre 81 e 100 %. No
entanto, mais de 45 % das linhagens testadas apresentaram atividade antimicrobiana contra a
linhagem de E. coli estudada.
Diferente do caso de inibição de B. cereus, pode-se observar uma relação positiva
entre o aumento da concentração de extrato e o aumento da inibição desta linhagem de E. coli
nas faixas de inibição de 41 a 60, 61 a 80 e 81 a 100 %.
Figura 9. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de
crescimento de E. coli ATCC 11229.
Os extratos que apresentaram redução maior que 81 % no crescimento do micro-
organismo alvo, na menor concentração de extrato (10 %), foram considerados com elevado
potencial antimicrobiano e selecionados para os estudos subsequentes. Estes representam
2,4% das culturas de fungos estudadas. Dos quatro extratos ativos (Tabela 11), podemos
destacar a cultura isolada da região de transição entre Cerrado e Mata Atlântica (Barão
Geraldo) e três da região da Mata Atlântica (Ilhabela), o que sugere que esta foi um ambiente
52
40
30 25
18
4
48
27 26 31
26
11
0
20
40
60
80
0 ≤ 20 21 – 40 41 – 60 61 – 80 81 - 100
Nú
me
ro d
e c
ult
ura
de
fu
ngo
s
Inibição do crescimento
10 % de extrato
20 % de extrato
50
favorável para o isolamento de micro-organismos com elevado potencial de inibição para a E.
coli.
Tabela 11. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a
linhagem de E. coli ATCC 11229.
Cultura de fungo Inibição do crescimento de E.
coli ATCC 11229 (%)
IB 6A 86,35 ± 1,88
IB 6B 82,78 ± 3,28
IB 36C 82,95 ± 1,28
BG 8C 89,25 ± 0,43
Os valores de MIC dos extratos contra a linhagem de E. coli (Tabela 12), variaram
entre 0,625 e 2,5 mg mL-1
. O extrato IB36C demonstrou melhor atividade sobre a E. coli,
sendo eficaz em uma menor concentração de extrato. Apenas uma das linhagens de fungo
demonstrou ser capaz de sintetizar compostos antimicrobianos com efeito bactericida: a
cultura IB6A, cujos valores de MIC e MBC foram 2,5 e 5,0 mg mL-1
, respectivamente. No
caso do antibiótico comercial, a MIC está de acordo com o observado na literatura e pelo
fabricante, porém é bem inferior aos valores determinados para os extratos, como encontrado
para B. cereus (GEHRKE et al., 2013).
Os extratos estudados quanto à inibição do crescimento de E. coli não demonstraram
atividade bacteriolítica através das curvas de crescimento, sendo possível observar a
bacteriostase provocada pelos compostos presentes nas amostras quando comparadas ao
controle do inóculo (Apêndice 8). Algumas moléculas produzidas por fungos já são descritas
com atividade antimicrobiana contra cepas de E. coli, como a esclerotiorina e o ácido kójico
(LIU et al., 2013; LUCAS; DE CASTRO; TAKAHASHI, 2007). Os extratos brutos dos
fungos estudados demonstraram bons resultados na inibição de E. coli e a identificação das
moléculas envolvidas nesta ação para trabalhos futuros é de grande importância, visto que
poucos compostos naturais são capazes de inibir bactérias Gram-negativas como a E. coli
(VAARA, 1993).
51
Tabela 12. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e
efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à de E. coli ATCC 11229.
Extrato fúngico ou
Antibiótico
comercial
MIC
(mg mL-1)
MBC
(mg mL-1)
Ratio
MIC:MBC Efeito antimicrobiano
IB 6A 2,5 * > 2:1 Bacteriostático
IB 6B 2,5 5 2:1 Bactericida
IB 36C 0,625 * > 2:1 Bacteriostático
BG 8C 2,5 * > 2:1 Bacteriostático
Cloranfenicol 0,004 * > 2:1 Bacteriostático
*Não foi determinada a MBC.
3.2.3 Atividade antimicrobiana contra S. aureus ATCC 6538
A partir dos resultados da Figura 10, pode-se verificar que os extratos apresentaram
frente a S. aureus o mesmo efeito observado anteriormente, sendo que a minoria inibiu mais
que 81 % do crescimento microbiano. O aumento na concentração de extrato aumentou o
número de extratos ativos contra S. aureus (entre 61 e 100 % de inibição). Com uma
concentração de 10 % de extrato, sete culturas mostraram capacidade para inibir entre 81 e
100 % do crescimento. Já empregando 20 % de extrato, treze fungos apresentaram este
comportamento.
Na seleção dos extratos de fungos com maior potencial antimicrobiano, foi utilizado o
mesmo critério anterior, ou seja, os que apresentaram atividade antimicrobiana acima de 81 %
na menor concentração de extrato foram selecionados para os estudos posteriores. Mais de 65
% das culturas de fungos estudadas mostraram alguma redução no crescimento da linhagem
de S. aureus ATCC 6538. Poucos extratos apresentaram elevado potencial antimicrobiano
contra esta bactéria, o que representa apenas 4,1 % das culturas de fungos testadas (Tabela
13). Dentre essas, quatro culturas foram isoladas da região de Mata Atlântica e três da região
de transição entre Cerrado e Mata Atlântica.
52
Figura 10. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de S. aureus ATCC 6538.
Tabela 13. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a
linhagem de S. aureus ATCC6538.
Fungo Inibição do crescimento de
S. aureus ATCC 6538 (%)
IB 6A 90,70 ± 0,29
IB 36A 81,80 ± 2,16
IB 45B 90,33 ± 6,74
IB 49C 81,6 ± 0,49
BG 5A 87,21 ± 5,12
BG 13D 89,01 ± 3,12
BG 13E 93,54 ± 0,70
A partir dos resultados apresentados na Tabela 14, nota-se que os extratos fúngicos
avaliados frente a linhagem de S. aureus apresentaram valores de MIC entre 0,156 e 20 mg
mL-1
. O extrato obtido a partir do isolado IB36A demonstrou elevado potencial
58
36
23 20
25
7
38 33 33
18
34
13
0
20
40
60
80
0 ≤ 20 21 – 40 41 – 60 61 – 80 81 - 100
Nú
me
ro c
ult
ura
s d
e f
un
gos
Inibição do crescimento (%)
10 % de extrato
20 % de extrato
53
antimicrobiano, sendo eficaz em baixas concentrações, a qual foi o menor valor de MIC
obtido (0,156 mg mL-1
). Ao contrário deste, o isolado BG5A demonstrou menor potencial
antimicrobiano, sendo eficaz em uma concentração de extrato bem superior (20 mg mL-1
).
Para o antibiótico comercial (cloranfenicol) foram estudadas concentrações entre 0,2 e
0,0001 mg mL-1
. No entanto, não foi determinada a MIC do cloranfenicol sobre a linhagem de
S. aureus ATCC 6538. Segundo a literatura, esta cepa é sensível a este antibiótico e a MIC é
0,002 mg mL-1
(AIYEGORO; AFOLAYAN; OKOH, 2009), sugerindo que a cepa tenha se
tornado resistente a este antibiótico.
Tabela 14. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e
efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à linhagem de S. aureus ATCC 6538.
Extrato fúngico ou
Antibiótico
comercial
MIC
(mg mL-1)
MBC
(mg mL-1)
Ratio
MIC:MBC Efeito antimicrobiano
IB 6A 0,313 0,313 1:1 Bactericida
IB 36A 0,156 0,156 1:1 Bactericida
IB 45B 0,625 0,625 1:1 Bactericida
IB 49C 5 10 2:1 Bactericida
BG 5A 20 * > 2:1 Bacteriostático
BG 13D 0,625 1,25 2:1 Bactericida
BG 13E 10 10 1:1 Bactericida
Cloranfenicol * * * *
*Não foi determinada a MIC ou MBC.
Dos 7 extratos estudados contra este micro-organismo alvo, 6 apresentaram efeito
bactericida e 1 efeito bacteriostático. Além disso, alguns destes extratos também
demonstraram atividade bacteriolítica (Tabela 15 e Figura 11). No caso dos isolados IB45B,
BG13D e BG13E, estes apresentaram efeito bactericida e bacteriolítico sobre a cepa de S.
aureus e, de acordo com a metodologia proposta por Lehtinen e colaboradores (2006), estes
resultados podem sugerir que o mecanismo de ação dos agentes antimicrobianos presentes
54
nestas amostras seja na parede celular, provocando a sua lise. Exemplos de moléculas
produzidas por fungos filamentosos, que possam estar envolvidas neste caso são os β-
lactâmicos e os peptídeos-antibióticos (peptaibols) (anteriormente citados no item 3.3.1). Os
chamados β-lactâmicos incluem moléculas como a penicilina e a cefalosporina. Estas
moléculas são produzidas principalmente por fungos dos gêneros Penicillium,
Cephalosporium e Acremonium. Seu mecanismo de ação é pela inibição das transpeptidases,
enzimas responsáveis pela síntese das ligações entre cadeias de peptideoglicano, tornando a
membrana celular frágil, o que pode acarretar em sua lise (TORTORA; FUNKE; CASE,
2005).
Os extratos aquosos dos fungos IB36A, BG13D e BG13E demonstraram efeito
bactericida sobre as duas bactérias Gram-positivas patogênicas analisadas. O S. aureus está
associado a um grande número de doenças ao homem e aos animais. No homem, este micro-
organismo está relacionado a casos de intoxicação alimentar, pneumonia e até infecções
hospitalares (MARTINS et al., 2014). Já na medicina veterinária, a mastite de S. aureus é um
dos maiores problemas enfrentados (ATALLA et al., 2009). Associado a mecanismos de
resistência a antimicrobianos, a busca por novos compostos com atividade antimicrobiana
contra S. aureus que possam ser aplicados em alimentos e na medicina humana e veterinária é
de grande importância (COUTO et al., 2001).
55
Figura 11. Crescimento de S. aureus ATCC 6538 (% D.O.), na presença de diferentes
concentrações (mg mL-1
) de extrato dos fungos BG13D (A), BG5A (B), IB6A (C), IB36A
(D), IB45B (E) e BG13E (F) durante 20 h de exposição.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,625 1,25 2,5
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 20 10
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 2,5 1,25
0,63 0,31
C
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,313 0,625 0,156
D
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 2,5 1,25 0,63
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 20 10
D.O
.(%
)
A B
E F
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
56
Tabela 15. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de BG13D, BG5A, IB6A, IB36A, IB45B
e BG13E sobre a bactéria S. aureus ATCC 6538.
Extrato
(mg.mL-1
)
S. aureus Extrato
(mg.mL-1
)
S. aureus
4 h 20 h 4 h 20 h
IB6A BG5A
2,500 * 38,36 ± 0,86 20,000 * 61,02 ± 3,03
1,250 * 20,05 ± 0,61 10,000 * *
IB45B BG13E
1,250 12,13 ± 7,62 40,12 ± 1,15 20,000 15,13 ± 1,21 21,05 ± 7,01
0,625 * 42,11 ± 7,52 10,000 1,21 ± 8,06 19,87 ± 1,22
IB 36A BG13D
1,250 23,24 ± 3,22 51,20 ± 0,82 2,500 54,60 ± 0,41 38,17 ± 2,33
0,625 * 34,76 ± 1,41 1,250 48,83 ± 3,01 40,51 ± 3,10
0,313 * 9,95 ± 7,42 0,625 * 72,18 ± 2,77
* Não foi observada atividade bacteriolítica.
3.2.4 Atividade antimicrobiana contra S. choleraesuis ATCC14028
Observando a Figura 12, a seleção dos extratos fúngicos aquosos com potencial
antimicrobiano contra S. choleraesuis ATCC 14028 mostrou valores de inibição entre 0 e 100
%. Mais de 63 % das linhagens de fungo estudadas apresentaram atividade antimicrobiana
contra esta bactéria. Entretanto, uma grande quantidade de extratos (pelo menos 51,47 %) não
demonstraram atividade antimicrobiana ou inibiram apenas 20 % do crescimento da bactéria.
Não foi observado aumento na atividade dos extratos com o aumento da concentração de 10
para 20%.
57
Figura 12. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de
crescimento de S. choleraesuis ATCC14028.
Tabela 16. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de
S. choleraesuis ATCC14028.
Fungo Inibição do crescimento de
S. choleraesuis ATCC 14028 (%)
IB 4C 100,00 ± 11,48
IB 6B 100,00 ± 0,35
IB 8A 74,09 ± 1,23
IB 14B 95,83 ± 2,32
IB 27B 100,00 ± 7,07
IB 36A 94,20 ± 1,06
IB 36C 87,89 ± 2,28
IB 38E 81,15 ± 3,04
IB 40A 100,00 ± 0,81
IB 45B 84,18 ± 2,95
BG 5A 87,53 ± 8,09
BG 8C 81,04 ± 1,10
61
47
29
12 9 11
47
40
32
23
15 12
0
20
40
60
80
0 ≤ 20 21 – 40 41 – 60 61 – 80 81 - 100
Nú
me
ro c
ult
ura
s d
e f
un
gos
Inibição do crescimento (%)
10 % de extrato
20 % de extrato
58
Um total de 12 extratos apresentaram elevado potencial antimicrobiano contra a
linhagem S. choleraesuis ATCC 14028 (Tabela 16), o que representa 6,5 % das linhagens de
fungos testadas. Dentre essas, nove foram isoladas da região de Mata Atlântica (Ilhabela) e
três da região de transição entre Cerrado e Mata Atlântica (Barão Geraldo). Sugerindo
novamente a região de Mata Atlântica como um ambiente favorável para o isolamento de
micro-organismos com elevado potencial antimicrobiano contra a espécie de Salmonella.
Tabela 17. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e
efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à S. choleraesuis ATCC 14028.
Extrato fúngico ou
Antibiótico comercial
MIC
(mg mL-1)
MBC
(mg mL-1)
Ratio
MIC:MBC Efeito antimicrobiano
IB 4C 1,25 * > 2:1 Bacteriostático
IB 6B 1,25 * > 2:1 Bacteriostático
IB14B 20 * > 2:1 Bacteriostático
IB 27B 10 * > 2:1 Bacteriostático
IB 36A 1,25 * > 2:1 Bacteriostático
IB 36C 1,25 * > 2:1 Bacteriostático
IB 38E 2,5 5 2:1 Bactericida
IB 40A 5 * > 2:1 Bacteriostático
IB 45B 0,156 * > 2:1 Bacteriostático
BG 5A >20 * > 2:1 -
BG 8C 10 * > 2:1 Bacteriostático
Cloranfenicol 0,004 * > 2:1 Bacteriostático
*Não foi determinada a MBC, - não foi determinado o efeito antimicrobiano.
De acordo com a Tabela 17, 11 culturas de fungos filamentosos demonstraram elevada
atividade antimicrobiana sobre S. choleraesuis e foram estudados quanto a MIC e a MBC.
Desta forma, a partir dos resultados obtidos, verifica-se que os valores de MIC variaram entre
0,156 e 20 mg mL-1
, sendo que o extrato IB 45B e IB 14B apresentaram o menor e maior
59
valor de MIC, respectivamente. Não foi possível determinar a MIC para o extrato da cultura
BG 5A, necessitando de concentrações mais elevadas do mesmo. No caso do cloranfenicol, a
MIC está dentro do que é descrito na literatura, e como no caso dos outros micro-organismos,
é bem inferior aos valores encontrados para os extratos (GEHRKE et al., 2013).
Dentre as amostras estudadas sobre a linhagem de S. choleraesuis, com exceção de
IB38E, todas apresentaram efeito bacteriostático. Alguns antimicrobianos produzidos por
fungos já são descritos na literatura com efeito bacteriostático contra cepas de Salmonella sp.,
como a esclerotiorina (LUCAS; DE CASTRO; TAKAHASHI, 2007). Os extratos aquosos
brutos dos fungos IB4C, IB6B, IB36A, IB36C e IB45B demonstraram bons resultados de
inibição em baixas concentrações. A identificação das moléculas com atividade
antimicrobiana envolvidas nestes casos é de grande importância, sabendo que poucos
compostos naturais são capazes de inibir bactérias Gram-negativas (VAARA, 1993).
A Salmonella sp. é uma bactéria gram-negativa patogênica de grande problema para a
saúde pública nos países desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento (AKHTAR;
SARKER; HOSSAIN, 2014). No Brasil, representa o micro-organismo associado ao maior
número de casos de DTAs (BRASIL, 2013). Desta forma, estudos como este são relevantes na
busca de compostos antimicrobianos que possam ser aplicados na conservação de alimentos e
no tratamento terapêutico de infecções causadas por este micro-organismo.
3.2.5 Atividade antimicrobiana contra C. albicans ATCC 10231
Neste estudo ao menos 87 % dos extratos exibiram certa atividade antimicrobiana
contra C. albicans ATCC 10231, porém, a maior parte dos extratos não foi capaz de inibir
mais do que 20 % do seu crescimento. As atividades antimicrobianas variaram entre 0 e 100
%. Não foi constatada uma relação positiva entre o aumento da concentração de extrato e o
aumento da inibição do crescimento desta linhagem (Figura 13).
60
Figura 13. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do
crescimento de C. albicans.
Tabela 18. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a
linhagem de C. albicans ATCC10231.
Fungo Inibição do crescimento de
C. albicans ATCC 10231 (%)
IB 4C 92,80 ± 1,15
IB 6A 100,00 ± 0,13
IB 6B 94,84 ± 0,32
IB 8A 96,42 ± 0,70
IB 36A 95,79 ± 0,63
IB 36C 98,27 ± 1,77
IB 45B 91,70 ± 2,30
BG 10C 85,35 ± 5,52
RP 478 87,29 ± 0,94
Alguns extratos apresentaram elevado potencial antimicrobiano contra a levedura, o
que representa 5,3 % das culturas de fungos estudadas (Tabela 18). Dentre estas, sete foram
16
125
14
4 1 9
21
123
8 3 6 8
0
20
40
60
80
100
120
140
0 ≤ 20 21 – 40 41 – 60 61 – 80 81 - 100
Nú
me
ro c
ult
ura
s d
e f
un
gos
Inibição do crescimento (%)
10 % de extrato
20 % de extrato
61
isoladas da região de Mata Atlântica (Ilhabela), uma da região de transição entre Cerrado e
Mata Atlântica (Barão Geraldo) e outra da CMLB, o que evidencia novamente a região de
Mata Atlântica como um ambiente promissor no isolamento de micro-organismos com
elevado potencial antimicrobiano.
Tabela 19. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima fungicida (MFC) e
efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à C. albicans ATCC 10231.
Extrato fúngico ou
Antibiótico comercial
MIC
(mg mL-1)
MFC
(mg mL-1)
Ratio
MIC:MFC Efeito antimicrobiano
IB 4C 10 * >2:1 Fungistático
IB 6A 10 * >2:1 Fungistático
IB 6B 5 * >2:1 Fungistático
IB 8A > 20 * >2:1 -
IB 36A 20 * >2:1 Fungistático
IB 36C >20 * >2:1 -
IB 45B 10 * >2:1 Fungistático
BG 10C > 20 * >2:1 -
RP 478 5 * >2:1 Fungistático
Nistatina 0,004 * >2:1 Fungistático
*Não foi determinada a MFC, - não foi determinado o efeito antimicrobiano.
Segundo os resultados da Tabela 19, os valores de MIC variaram entre 5 e 20 mg mL-
1, dos quais IB6B e RP478 foram os extratos com maior potencial antimicrobiano e IB36A o
menor. No caso dos extratos de IB8A, IB36C e BG10C a MIC é superior a máxima
concentração avaliada, não sendo detectada. A MFC de todos os extratos estudados sobre a C.
albicans são superiores a máxima concentração plaqueada (2MIC). Diante disso e das
definições de Hafidh et al.(2011), os extratos foram classificados como fungistáticos, com
exceção de IB8A, IB36C e BG10C. A literatura relata alguns compostos produzidos por
62
fungo com efeito fungistático sobre linhagens de C. albicans, como moléculas pertencentes ao
grupo das sordarinas e a esclerotiorina (BAO et al., 2010; VICENTE et al., 2009).
A C. albicans é fungo leveduriforme que atinge aproximadamente 75% das mulheres
adultas. As infecções causadas por Candida sp. são geralmente tratadas com antifúngicos
sintéticos, sendo o Fluconazol o antifúngico mais utilizado. Perante as limitações dos
antifúngicos existentes, como elevada toxicidade, desenvolvimento de resistência aos
fármacos e alto custo, o desenvolvimento de antifúngicos naturais com elevada eficiência
terapêutica é requerido (LUCAS; DE CASTRO; TAKAHASHI, 2007; MARTIN, 1999;
RAJESHKUMAR; SUNDARARAMAN, 2012; (SHARANAPPA; VIDYASAGAR, 2013).
Diante disso, a busca por novos compostos antimicrobianos contra este micro-organismo é
essencial. Trabalhos como este representam o ponto inicial no descobrimento de novas
moléculas com atividade antifúngica contra C. albicans em trabalhos futuros.
3.2.6 Discussão geral
Em um estudo de Takahashi e colaboradores, ao menos 67 % dos extratos orgânicos
de fungos filamentosos isolados na região de Cerrado brasileiro demonstraram possuir
atividade antibacteriana (TAKAHASHI et al., 2008). No presente trabalho, resultados
similares foram constatados, visto que, com exceção da linhagem de E. coli, no mínimo 65%
dos fungos filamentosos estudados demonstraram certa atividade antimicrobiana contra pelo
menos um dos micro-organismos alvo. Diante disso, é possível pressupor que as linhagens de
fungos e as condições de cultivo e obtenção dos extratos estudados mostraram-se eficientes a
aquisição de compostos antimicrobianos, no entanto, é importante ressaltar que o estudo de
outros métodos de cultivo e extração podem ser estudados com o objetivo de aumentar o
potencial antimicrobiano destas linhagens.
Na pesquisa de Carvalho et al. (2012), 320 culturas endofíticas de fungos filamentosos
isoladas no Cerrado brasileiro foram estudadas quanto ao seu potencial antimicrobiano contra
linhagens de E. coli, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa e C. albicans. Os fungos foram
cultivados em placas com PDA e os metabólitos extraídos com etanol. A atividade
antimicrobiana desses extratos foi analisada pelo método da microdiluição e 5 % deles
63
demonstraram elevada atividade (70 a 100 % de inibição) contra pelo menos um dos micro-
organismos alvo (CARVALHO et al., 2012). No presente trabalho, dentre as 169 culturas de
fungos filamentosos estudadas, 13 % demonstraram elevado potencial antimicrobiano (81 à
100% de inibição) contra pelo menos uma das linhagens patogênicas avaliadas. Isso
comprova que os resultados obtidos foram mais promissores que os encontrados pelos
autores, além de uma vantagem adicional devido ao uso de extratos aquosos ao invés de
extração alcoólica, como a utilizada na pesquisa citada.
Dentre as 169 culturas estudadas, nota-se um menor número de linhagens (2,4 %)
capazes de inibir entre 81 e 100 % do crescimento da cepa de E. coli analisada. Segundo
Vaara (1993) o resultado encontrado pode ser explicado pela estimativa de que 90 % dos
antibióticos naturais são incapazes de inibir bactérias Gram-negativas, como a E. coli, por
exemplo. Já para a linhagem de S. choleraesuis, constatou-se o maior número de culturas
fúngicas com elevado potencial de inibição para esta bactéria (6,5 %). Além disso, também
foram verificados os maiores valores de redução, chegando até 100 % de inibição desta
bactéria. Esta ação foi conferida pelos extratos dos fungos IB4C, IB6B, IB27B e IB40A. O
mesmo valor de inibição foi obtido para C. albicans, com o emprego do extrato IB6B.
Das culturas de fungos filamentosos pertencentes à CMLB apenas duas, Aspergillus
sp. (1099) e RP478, mostraram-se promissoras para a inibição da linhagem de B. cereus e C.
albicans, respectivamente. Isso sugere que, dentro das condições testadas neste estudo, os
micro-organismos desta coleção foram pouco favoráveis na produção de compostos
antimicrobianos contra as cepas patogênicas estudadas.
Verifica-se também que alguns dos fungos com maior potencial antimicrobiano
inibiram mais de um dos micro-organismos alvo. Isso permite inferir que as atividades
antimicrobianas destes extratos estejam relacionadas a três tipos de ação: aqueles com
atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (B. cereus e S. aureus), aqueles
contra bactérias Gram-negativas (E. coli e S. choleraesuis) e aqueles extratos com amplo
espectro de inibição (inibição de gram-positivas, gram-negativas e fungos). Os extratos dos
fungos BG13D e BG13E, por exemplo, demonstraram ação antibacteriana contra as bactérias
gram-positivas deste estudo e podem possuir atividade antimicrobiana contra outras
pertencentes ao mesmo grupo. Já o extrato BG8C, por sua vez, demonstrou ação
antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e o potencial antibacteriano contra este grupo
64
de bactérias pode ser explorado com maior afinco. As amostras IB4C, IB6A, IB6B, IB36A,
IB36C, IB45B e BG5A apresentaram ação antimicrobiana de amplo espectro, o que permite
concluir que os compostos produzidos por essas linhagens de fungos têm ação contra
diferentes grupos microbianos. Desta forma, faz- se necessário um estudo mais aprofundado
para sua potencial aplicação tanto na indústria de alimentos e farmacêutica, quanto como
produtores de novos agentes antimicrobianos de amplo espectro.
Alguns autores referem-se ao solo em regiões de transição do Cerrado com pouca
disponibilidade de nutrientes, criando ambientes hostis e ao mesmo tempo, fazendo que os
organismos presentes neste local desenvolvam um metabolismo diferenciado sendo possível a
produção de novas moléculas com propriedades biológicas de interesse (LUCAS; DE
CASTRO; TAKAHASHI, 2007). Isso talvez explique o fato dos micro-organismos isolados
em Barão Geraldo possuírem alto potencial antimicrobiano. Além destas, as culturas de
fungos isoladas da região de Mata Atlântica também se mostraram muito promissoras para a
produção de compostos bioativos. Isso permite que, futuramente, após estudos mais
aprofundados, estes micro-organismos possam ser utilizados como novas fontes de compostos
antimicrobianos.
Figura 14. Cultura dos fungos BG13E (A) e BG13D (B), cujos extratos
apresentaram atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-positivas
estudadas.
65
Figura 15. Cultura dos fungos IB4C (A), IB6A (B), IB6B (C), IB36A (D), IB36C
(E) e IB45B (F), cujos extratos apresentaram atividade antimicrobiana de amplo
espectro.
66
Figura 16. Cultura dos fungos BG 8C (A) (cujo extrato apresentou atividade contra as
bactérias Gram-negativas); BG5A (B) (apresentou atividade de amplo espectro); IB49C (C)
(apresentou atividade contra S. aureus ATCC 6538); BG4B, BG11A, BG14K e Aspergillus
sp. (1099) (D) (apresentaram atividade contra a cepa de B. cereus); IB14B, IB27B, IB38E e
IB40A (E) (apresentaram atividade contra S. choleraesuis ATCC 14028) e IB8A, BG10C,
RP478 (F) (apresentaram atividade contra C. albicans ATCC 10231).
67
A identificação do gênero das linhagens de fungos que apresentaram maior atividade
antimicrobiana é necessária, uma vez não é possível diferenciar algumas linhagens muito
similares pela análise morfológica (Figuras 14, 15 e 16).
68
4 CONCLUSÕES
O presente trabalho permitiu o isolamento de 118 culturas de fungos filamentosos, as
quais foram adicionadas à CMLB e poderão ser utilizadas em estudos futuros.
Através da bioprospecção de fungos filamentosos, isolados de biomas do Estado de
São Paulo, foi possível isolar 22 culturas com elevado potencial antimicrobiano contra
pelo menos um dos micro-organismos alvo analisados.
Isolados da região de Mata Atlântica e da região de transição apresentaram maior
potencial antimicrobiano.
As linhagens dos fungos IB36A, BG11A, BG13D e BG13E produziram compostos
com efeitos bactericida e bacteriolítico sobre B. cereus.
Os extratos dos fungos IB6A, IB36A, IB45B, IB49C, BG13D e BG13E apresentaram
efeito bactericida sobre S. aureus ATCC 6538, sendo que os extratos das linhagens
IB6A, IB36A, IB45B, BG5A, BG13D e BG13E também apresentaram efeito
bacteriolítico.
Apenas os fungos IB6B e IB38E produziram compostos com efeito bactericida sobre
as linhagens de E. coli ATCC 11229 e S. choleraesuis ATCC14028, respectivamente.
Nenhum dos extratos fúngicos estudados produziram compostos efeito fungicida sobre
C. albicans ATCC 10231.
O trabalho realizado representa a etapa inicial na obtenção de novos compostos
antimicrobianos naturais e novas fontes destes compostos. Os resultados fornecem
informações importantes que podem ser utilizadas no desenvolvimento de novos
fármacos ou aditivos alimentares.
69
5 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Realizar a identificação dos fungos filamentosos que apresentaram maior potencial
antimicrobiano contra os micro-organismos alvo deste estudo;
Identificar as moléculas relacionadas à atividade antimicrobiana produzidas pelos
isolados de fungos filamentosos selecionados;
Avaliar o mecanismo de ação dessas moléculas;
Estudar outras condições de cultivo e diferentes extratos a partir dos isolados ativos e
a otimização da produção dos compostos;
Avaliar a toxicidade dos extratos e possibilidade de ensaios in vivo;
Avaliar o potencial das culturas de fungos selecionadas para produção de compostos
com outras atividades biológicas e outras moléculas de alto valor agregado.
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86
APÊNDICES
Apêndice 1. Culturas de fungos filamentosos isoladas na região de Mata Atlântica no
município de Ilhabela. Códigos das culturas, tipo de amostra do isolamento e
características das colônias dos fungos filamentosos isolados da região de Mata Atlântica.
Cultura Origem Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
IB 3A Folhas Verde escuro Aveludada Ausente
IB 4B Folhas Verde escuro Aveludada Ausente
IB 4C Folhas Verde escuro Aveludado Ausente
IB 6A Tronco Verde Aveludada Ausente
IB 6B Tronco Verde-amarelado Aveludada Ausente
IB 6C Tronco Branco Algodonosa Ausente
IB 6D Tronco Marrom claro Pulverulenta Marrom
IB 6E Tronco Violeta Aveludada Ausente
IB 7A Folhas Verde claro Aveludada Ausente
IB 8A Folhas Verde Aveludada Ausente
IB 10B Tronco Branco Algodonosa Ausente
IB 13A Fruto Marrom Pulverulenta Ausente
IB 14A Fruto Marrom Pulverulenta Ausente
IB 14B Fruto Branco Aveludada Ausente
IB 14C Fruto Branco Aveludada Ausente
IB 16A Folhas Marron claro Aveludada Marrom escuro
IB 17A Folhas Marrom Pulverulenta Ausente
IB 17B Folhas Verde Pulverulenta Ausente
IB 18A Folhas Branco Cremosa Ausente
IB 23A Solo Marrom claro Pulverulenta Marrom escuro
IB 23B Solo Marrom claro Pulverulenta Ausente
IB 24A Fruto Creme Aveludada Ausente
IB 25A Fruto Branco Algodonosa Ausente
IB 27A Solo Marrom Pulverulenta Marrom
IB 27B Solo Verde Algodonosa Ausente
IB 31A Solo Preto Pulverulenta Ausente
IB 31C Solo Marrom claro Pulverulenta Ausente
IB 32A Tronco Branco Algodonosa Ausente
IB 33A Folhas Verde Pulverulenta Ausente
IB 33B Folhas Marrom Pulverulenta Marrom
IB 33C Folhas Creme Pulverulenta Ausente
IB 35A Folhas Branco e verde Aveludada Ausente
*p.d.: pigmento difundido no meio
87
Apendice 1. Continuação.
Cultura Origem Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
IB 35B Folhas Marrom claro Aveludada Ausente
IB 36A Folhas Branco e verde Aveludada Ausente
IB 36B Folhas Verde escuro Aveludada Ausente
IB 36C Folhas Branco e verde Aveludada Ausente
IB 37A Folhas Verde claro Aveludada Ausente
IB 38A Fruto Branco Aveludada Ausente
IB 38B Fruto Marrom Pulverulenta Ausente
IB 38D Fruto Creme Aveludada Ausente
IB 38E Fruta Branco Aveludada Vermelho
IB 40A Folhas Branco e verde Aveludada Ausente
IB 44A Folhas Verde Pulverulenta Ausente
IB 44B Folhas Branco Aveludada Amarelo
IB 44C Folhas Branco e verde Aveludada Ausente
IB 44D Folhas Branco Aveludada Ausente
IB 44E Folhas Branco Aveludada Ausente
IB 44G Folhas Violeta Aveludada Ausente
IB 45B Folhas Verde Pulverulenta Ausente
IB 49A Folhas Marrom Pulverulenta Ausente
IB 49C Folhas Verde Pulverulenta Amarelo
IB 50A Folhas Marrom Algodonosa Ausente
IB 50B Folhas Verde Aveludada Ausente
*p.d.: pigmento difundido no meio
88
Apêndice 2. Códigos das culturas, tipo de amostra do isolamento e características das
colônias dos fungos filamentosos isolados da região de transição (entre Mata Atlântica e
Cerrado, no distrito de Barão Geraldo).
Cultura Origem Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
BG 1A Folhas Branco e marrom Aveludada Ausente
BG 1B Folhas Verde Aveludada Ausente
BG 1C Folhas Verde escuro Aveludada Ausente
BG 1D Folhas Marrom claro Aveludada Ausente
BG 2A Folhas Marrom Aveludada Ausente
BG2B Folhas Marrom Aveludada Ausente
BG 3A Solo Preta Pulverulenta Ausente
BG 3B Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 3C Solo Verde Aveludada Ausente
BG 3D Solo Branco Aveludada Ausente
BG 3E Solo Verde escuro Aveludada Amarelo
BG 3F Solo Branco Aveludada Ausente
BG 4A Solo Preta Pulverulenta Ausente
BG 4B Solo Branca Algodonosa Ausente
BG 4C Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 4D Solo Amarela Aveludada Marrom
BG 5A Tronco Verde Pulverulenta Ausente
BG 5B Tronco Marrom Aveludada Ausente
BG 5C Tronco Verde Aveludada Amarelo
BG 5D Tronco Verde escuro Aveludada Amarelo
BG 6A Fruto Branco Aveludada Ausente
BG 7A Fruto Marrom Aveludada Marrom
BG 7B Fruto Branco Aveludada Ausenre
BG 8A Fruto Amarelo Algodonosa Amarelo
BG 8B Fruto Branco Aveludada Ausente
BG 8C Fruto Rosa e Branco Aveludada Ausente
BG 8D Fruto Verde Aveludada Vermelho
BG 9A Solo Cinza Algodonosa Ausente
BG 9B Solo Verde escuro Aveludada Ausente
BG 9C Solo Branca Aveludada Ausente
BG 9D Solo Verde escuro Aveludada Ausente
BG 9E Solo Preta Pulverulenta Ausente
BG 9F Solo Verde Aveludada Ausente
*p.d.: pigmento difundido no meio
89
Apêndice 2. Continuação.
Cultura Origem Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
BG 10A Cogumelo Branco Aveludada Rosa
BG 10B Cogumelo Preto Pulverulenta Ausente
BG 10C Cogumelo Cinza Algodonosa Ausente
BG 10D Cogumelo Marrom Aveludada Ausente
BG 11A Fruto Marrom Pulverulenta Amarelo
BG 13A Cogumelo Cinza Algodonosa Ausente
BG13B Cogumelo Marrom Pulverulenta Amarelo
BG 13C Cogumelo Verde Aveludada Ausente
BG 13D Cogumelo Branco Algodonosa Rosa
BG 13E Cogumelo Branco e rosa Aveludada Ausente
BG 14A Solo Verde Aveludada Ausente
BG 14B Solo Branco Algodonosa Ausente
BG 14C Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 14D Solo Verde escuro Aveludada Ausente
BG 14E Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 14F Solo Branco Aveludada Ausente
BG 14G Solo Amarelo Aveludada Ausente
BG 14H Solo Marrom Aveludada Marrom
BG 14I Solo Branco Aveludada Ausente
BG 14J Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 14K Solo Violeta Algodonosa Ausente
BG 15A Solo Preta Aveludada Ausente
BG 15B Solo Verde escura Aveludada Amarelo
BG 15C Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 15D Solo Preta Pulverulenta Ausente
BG 16A Solo Preta Pulverulenta Ausente
BG16B Solo Verde escura Aveludada Ausente
BG 16C Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 16D Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 16E Solo Marrom Aveludada Ausente
BG 16F Solo Marrom Aveludada Ausente
*p.d.: pigmento difundido no meio
90
Apêndice 3. Códigos das culturas e características das colônias dos fungos filamentosos
pertencentes a CMLB.
Cultura Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
RP 3 Verde escura Aveludada Ausente
RP 9 Branca Algodonosa Ausente
RP 13 Branca Algodonosa Ausente
RP 16 Verde escura Aveludada Marrom
RP 20 Verde escura Aveludada Ausente
RP 24 Verde Aveludada Ausente
RP 59 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 63 Preta Pulverulenta Ausente
RP 88 Verde escura Aveludada Ausente
RP 143 Verde Aveludada Verde
RP 148 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 153 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 156 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 159 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 162 Marrom Aveludada Ausente
RP 164 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 180 Branca Algodonosa Ausente
RP 184 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 208 Verde clara Aveludada Ausente
RP 216 Verde escura Aveludada Ausente
RP 225 Verde Aveludada Ausente
RP 255 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 261 Verde escura Aveludada Ausente
RP 314 Verde escura Aveludada Ausente
RP 318 Verde escura Aveludada Ausente
RP 331 Verde Aveludada Ausente
RP 347 Marrom Pulverulenta Amarelo
RP 361 Verde escura Aveludada Ausente
RP 366 Marrom Aveludada Amarelo
RP 367 Verde Aveludada Ausente
RP 396 Verde escuro Aveludada Ausente
RP 406 Verde Aveludada Ausente
RP 462 Verde e Branca Aveludada Amarelo
*p.d.: pigmento difundido no meio.
91
Apêndice 3. Continuação.
Cultura Morfologia da Colônia
Cor Textura p.d.*
RP 478 Verde e Branca Aveludada Amarelo
RP 480 Verde Aveludada Ausente
RP 488 Verde Aveludada Verde
RP 1215 Rosa Aveludada Ausente
RP 1701 Verde Aveludada Ausente
P. variotii Marrom Pulverulento Amarelo
Rhizopus sp Cinza Algodonosa Ausente
Aspergillus sp 1068 Verde e branca Aveludada Ausente
Aspergillus sp 1099 Verde e branca Aveludada Ausente
Fusarium sp Lilás Aveludada Ausente
A. strictum Laranja Algodonosa Ausente
P.corylophilum Verde Aveludada Ausente
F. graminearum Verde e branca Aveludada Ausente
Aspergillus sp Preta Pulverulenta Ausente
T. harzianum Marron Aveludada Marron
*p.d.: pigmento difundido no meio.
92
Apêndice 4. Inibição do crescimento (%) dos micro-organismos indicadores frente à presença
dos extratos de fungo isolados na região de Mata Atântica (Ilhabela).
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli S. aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
IB 3A 10 11,95 11,02 0,00 60,45 0,00
20 0,00 0,00 14,28 60,20 9,19
IB 4B 10 20,65 8,25 0,00 0,00 5,93
20 0,38 0,00 0,00 0,00 1,95
IB 4C 10 42,87 65,07 73,09 100,00 92,80
20 11,39 91,41 64,98 100,00 95,25
IB 6A 10 64,39 86,35 90,70 65,47 100,00
20 39,17 87,76 78,12 97,09 94,57
IB 6B 10 58,39 82,78 78,00 100,00 94,84
20 31,73 87,04 93,61 100,00 87,69
IB 6C 10 38,42 23,83 5,67 0,00 0,00
20 0,00 27,90 0,00 0,00 0,00
IB 6D 10 0,00 42,61 66,48 0,00 8,69
20 15,89 55,45 75,40 0,00 8,96
IB 6E 10 36,30 11,90 41,12 15,31 0,00
20 33,54 12,77 8,56 51,21 0,00
IB 7A 10 0,00 22,61 13,25 46,50 0,00
20 0,00 68,99 38,76 58,28 2,26
IB 8A 10 4,94 78,15 79,22 74,09 96,42
20 20,03 90,95 81,91 19,47 96,24
IB 10B 10 0,00 6,54 0,00 0,00 9,19
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
IB 13A 10 0,00 30,54 0,00 0,00 0,16
20 0,00 57,98 0,00 0,00 11,30
93
Apêndice 4. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli S. aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
IB 14A 10 51,02 40,04 53,18 0,00 10,48
20 73,48 54,69 44,67 0,00 9,30
IB 14B 10 0,00 0,00 0,00 95,83 0,00
20 0,00 44,60 0,00 48,72 1,21
IB 14C 10 0,00 0,22 0,00 0,00 34,77
20 14,50 0,00 0,00 0,00 4,16
IB 16A 10 17,89 20,64 0,00 0,00 23,40
20 37,36 62,50 0,00 0,00 7,94
IB 17A 10 71,33 4,26 0,00 1,91 1,66
20 71,67 18,95 16,47 56,13 21,45
IB 17B 10 3,44 6,28 0,00 72,04 13,53
20 14,16 0,00 0,00 70,23 10,08
IB 18A 10 36,23 20,67 0,00 0,00 12,90
20 10,72 50,32 6,48 0,00 5,48
IB 23A 10 24,89 53,12 0,00 0,00 4,03
20 0,00 62,06 0,00 0,00 16,58
IB 23B 10 29,06 35,85 0,00 0,00 18,85
20 27,43 42,36 0,00 0,00 16,76
IB 24A 10 4,18 0,00 0,00 0,00 4,66
20 12,87 0,00 0,00 0,00 0,00
IB 25A 10 0,00 0,00 0,00 0,00 24,34
20 0,00 0,00 26,49 0,00 4,02
IB 27A 10 66,87 62,60 66,31 0,00 16,58
20 59,67 51,21 69,71 0,00 18,49
IB 27B 10 0,00 8,86 0,00 100,00 0,00
20 0,00 0,00 0,00 100,00 7,31
94
Apêndice 4. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli S. aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
IB 31A 10 0,00 48,64 48,36 31,00 16,37
20 0,00 57,36 55,53 0,00 0,00
IB 31C 10 0,00 50,73 0,00 0,00 15,39
20 0,00 50,81 39,08 0,00 4,89
IB 32A 10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
20 0,00 19,56 0,00 0,00 0,00
IB 33A 10 0,00 50,84 0,00 0,00 13,33
20 0,00 50,29 18,07 0,00 14,25
IB 33B 10 0,00 49,38 0,00 0,00 14,29
20 0,00 49,78 0,00 0,00 1,55
IB 33C 10 0,00 45,09 0,00 0,00 0,59
20 21,60 55,46 2,02 0,00 24,38
IB 34A 10 21,71 68,42 47,14 0,00 16,30
20 77,57 34,65 64,35 0,00 8,40
IB 35A 10 0,00 4,40 0,00 0,00 1,23
20 0,00 0,00 0,00 11,15 0,00
IB 35B 10 0,00 31,21 0,00 0,00 0,00
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
IB 36A 10 81,49 76,95 81,80 94,20 95,79
20 0,00 85,44 75,74 53,92 96,50
IB 36B 10 12,81 0,00 79,29 0,00 6,43
20 45,55 0,00 79,00 0,00 10,51
IB 36C 10 0,00 82,95 69,09 87,89 98,27
20 0,00 92,92 93,98 100,00 93,95
IB 37A 10 0,00 13,44 0,00 47,29 12,48
20 0,00 13,04 0,00 79,79 7,73
95
Apêndice 4. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli S. aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
IB 38A 10 0,00 6,65 0,00 0,00 2,94
20 0,00 2,28 0,00 0,00 9,66
IB 38B 10 0,00 6,90 0,00 0,00 4,55
20 0,00 0,00 0,00 0,00 1,55
IB 38D 10 25,27 62,39 35,69 53,85 13,65
20 0,00 68,46 39,54 71,05 2,80
IB 38E 10 0,00 0,33 64,95 81,15 7,69
20 60,14 10,77 65,27 90,72 15,53
IB 40A 10 31,14 69,98 71,02 100,00 37,40
20 41,64 89,92 86,25 90,43 86,56
IB 44A 10 31,14 10,26 53,09 0,00 8,67
20 0,00 1,12 80,29 13,26 9,79
IB 44B 10 6,16 18,76 0,00 2,68 8,61
20 0,00 50,75 0,00 10,29 11,03
IB 44C 10 0,00 9,04 0,00 0,00 11,34
20 0,00 4,82 25,01 83,81 0,13
IB 44D 10 0,00 55,11 0,00 10,39 2,68
20 0,00 24,02 0,00 6,94 1,49
IB 44E 10 1,52 2,32 0,00 7,00 3,08
20 17,66 24,70 0,00 0,00 15,77
IB 44G 10 1,83 16,08 0,00 13,64 7,03
20 25,04 12,40 0,00 0,00 9,58
IB 45B 10 62,02 0,00 90,33 84,18 91,70
20 33,33 81,88 84,21 100,00 94,95
IB 49A 10 25,80 19,59 56,81 6,66 24,60
20 45,59 8,72 65,11 0,00 16,21
96
Apêndice 4. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli S. aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
IB 49C 10 76,41 15,08 81,60 6,01 12,70
20 79,45 23,37 82,39 1,41 5,71
IB 50A 10 0,00 8,29 0,00 0,00 0,00
20 0,00 0,00 0,00 81,22 0,00
IB 50B 10 0,00 23,55 0,00 1,23 3,30
20 0,00 28,98 0,00 0,00 1,93
97
Apêndice 5. Inibição do crescimento (%) dos micro-organismos indicadores na presença dos
extratos dos fungos identificados pertencentes à CMLB.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus
E.
coli
S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
Penicillium sp. 10 0,00 16,69 0,00 0,00 4,57
20 0,00 24,73 0,00 6,98 1,27
Aspergillus sp.
1068
10 48,46 7,51 40,80 37,03 8,28
20 70,38 9,62 57,75 32,60 11,65
Rhizopus sp. 10 61,15 49,20 31,31 0,00 4,09
20 36,03 70,61 29,66 59,81 4,55
P. varioti 10 75,26 21,98 78,75 0,00 29,43
20 76,03 61,18 79,32 34,82 48,56
Aspergillus sp.
1099
10 85,51 0,00 47,38 24,34 12,54
20 84,74 0,00 49,15 30,24 6,60
Fuzarium sp. 10 19,10 0,00 19,67 0,00 15,24
20 37,44 0,00 1,33 0,00 13,06
A. strictum 10 36,54 41,00 25,87 25,66 10,82
20 28,08 71,17 27,26 65,92 17,19
P.corilofilum 10 29,10 0,00 48,32 17,19 6,07
20 32,69 0,00 58,82 2,49 5,31
F. graminarium 10 16,28 34,29 36,50 38,07 12,47
20 14,10 37,76 50,28 38,28 12,37
Aspergillus sp. 10 30,77 11,92 15,31 5,71 12,01
20 12,69 48,77 0,76 16,69 15,87
T. harzianum 10 45,13 0,00 12,97 31,53 6,40
20 62,82 21,40 15,43 32,03 6,43
98
Apêndice 5. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus
E.
coli
S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
A. niger 10 42,44 30,65 8,29 31,49 11,02
20 30,64 22,57 10,69 19,76 10,29
Geotrichum sp. 10 30,41 0,00 0,00 0,00 2,33
20 30,17 0,00 9,36 0,00 1,31
99
Apêndice 6. Inibição do crescimento (%) dos micro-organismos indicadores na presença dos
extratos dos fungos isolados na região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado (Barão
Geraldo, Campinas).
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 1A 10 7,89 0,00 0,00 0,00 11,18
20 0,00 0,00 8,33 32,48 7,82
BG 1B 10 19,60 45,95 24,07 42,61 7,62
20 6,35 60,45 30,99 67,71 4,50
BG 1C 10 30,15 8,57 0,00 21,97 8,29
20 28,09 33,34 36,42 13,80 8,80
BG 1D 10 6,09 6,23 0,00 29,51 12,78
20 8,66 23,69 23,09 60,48 5,82
BG 2A 10 22,30 0,00 7,10 36,73 10,95
20 22,94 8,91 20,86 52,74 5,90
BG 2B 10 16,38 0,00 0,00 18,09 11,73
20 0,00 0,00 15,31 11,16 7,58
BG 3A 10 0,00 28,20 0,00 25,86 1,56
20 13,81 38,33 0,00 27,48 1,41
BG 3B 10 0,00 2,30 50,37 35,86 5,47
20 54,59 8,28 55,74 57,95 3,28
BG 3C 10 36,19 0,00 5,56 9,47 7,11
20 52,79 7,33 29,51 22,92 4,61
100
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 3D 10 21,66 27,24 16,17 11,47 2,85
20 11,11 48,06 20,80 47,20 2,62
BG 3E 10 24,10 0,00 67,41 0,00 10,63
20 39,54 5,97 68,52 36,02 8,25
BG 3F 10 26,18 4,95 0,00 24,96 7,07
20 24,27 18,07 0,00 23,74 8,04
BG 4A 10 18,93 29,11 0,00 43,26 4,91
20 10,80 55,73 0,74 62,06 5,17
BG 4B 10 85,39 48,56 18,61 70,55 7,37
20 75,48 66,28 80,09 80,97 5,66
BG 4C 10 27,83 0,00 8,74 29,81 12,69
20 7,88 30,97 0,00 59,89 10,64
BG 4D 10 0,00 0,00 33,73 51,29 19,02
20 16,39 0,00 52,06 61,34 21,25
BG 5A 10 6,61 71,50 87,21 87,53 10,57
20 48,92 73,63 91,30 81,61 23,11
BG 5B 10 24,52 24,31 0,00 17,59 7,74
20 27,83 36,17 0,00 0,00 6,74
101
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 5C 10 45,49 25,73 73,37 44,82 10,98
20 71,03 29,97 77,70 64,25 13,84
BG 5D 10 30,62 0,00 56,50 3,36 14,89
20 31,39 0,00 64,21 0,00 11,50
BG 7A 10 72,30 45,05 76,18 16,27 13,81
20 82,59 53,97 82,31 7,95 15,44
BG 7B 10 33,16 72,31 0,00 62,23 4,32
20 30,50 82,52 0,00 83,11 5,40
BG 8A 10 20,09 0,00 0,00 31,16 2,33
20 13,24 0,00 0,00 36,00 3,06
BG 8B 10 20,91 24,25 2,93 21,46 4,91
20 15,21 30,46 27,93 36,20 8,77
BG 8C 10 40,88 89,25 53,79 81,04 14,54
20 71,43 89,47 74,10 80,63 14,20
BG 8D 10 23,00 8,34 39,82 28,87 6,84
20 31,13 11,82 35,55 33,37 4,30
BG 9A 10 26,02 0,00 0,00 0,00 13,62
20 33,45 0,00 0,00 0,00 10,54
102
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli
S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 9B 10 24,51 71,35 42,96 70,88 3,99
20 25,09 85,36 47,23 72,24 4,91
BG 9C 10 32,52 0,00 0,00 0,00 11,62
20 29,97 0,00 0,00 0,00 7,65
BG 9D 10 46,57 34,79 38,23 41,56 7,53
20 43,44 58,09 64,50 54,22 4,80
BG 9E 10 4,30 62,61 25,00 63,88 4,45
20 22,65 79,54 31,23 58,60 3,91
BG 9F 10 31,24 0,00 0,00 0,00 5,41
20 37,98 0,00 34,73 15,85 5,76
BG 10A 10 42,62 6,88 26,30 0,00 5,37
20 49,25 28,66 48,49 45,33 5,14
BG 10B 10 31,17 0,00 25,93 15,43 41,23
20 41,79 0,00 27,48 51,26 20,52
BG 10C 10 18,66 0,00 0,00 17,30 85,35
20 0,00 0,00 0,00 20,91 6,46
BG 10D 10 4,80 0,00 0,00 13,43 21,79
20 27,15 0,00 14,33 56,80 15,62
103
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli
S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 11A 10 87,82 57,15 79,95 42,43 16,70
20 86,48 61,24 83,60 63,34 8,81
BG 13A 10 25,36 4,09 21,35 34,60 19,45
20 19,33 1,44 17,09 10,63 32,47
BG 13B 10 76,87 25,27 60,89 18,04 22,59
20 81,56 41,77 75,20 31,02 40,71
BG 13C 10 17,88 0,00 0,00 18,46 24,30
20 6,82 0,00 12,68 32,76 16,98
BG 13D 10 89,05 0,00 89,01 38,21 15,07
20 86,59 0,00 92,82 48,81 15,70
BG 13E 10 87,37 0,00 93,54 8,12 22,11
20 89,39 0,00 94,15 11,28 16,30
BG 14A 10 37,54 74,21 10,47 63,98 21,71
20 40,67 76,07 25,10 80,99 12,00
BG 14B 10 37,65 5,67 11,79 0,00 16,78
20 27,15 0,00 1,85 0,00 18,69
BG 14C 10 60,73 53,44 35,29 0,32 5,80
20 67,10 71,89 26,79 20,53 6,06
104
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 14D 10 30,17 59,99 74,06 25,82 3,92
20 18,34 37,83 79,89 44,65 3,06
BG 14E 10 4,03 19,00 19,09 3,44 10,42
20 59,43 34,88 26,79 26,26 8,07
BG 14F 10 30,30 19,01 15,13 0,00 6,52
20 38,49 0,00 28,50 1,45 8,27
BG 14H 10 27,05 2,46 4,49 5,78 2,07
20 27,31 19,65 2,62 24,18 0,62
BG 14I 10 31,34 0,00 1,87 3,18 14,94
20 41,61 0,00 0,75 7,61 10,45
BG 14J 10 25,36 0,00 26,31 27,13 4,08
20 11,18 13,65 41,44 36,84 1,34
BG 14K 10 81,92 0,00 20,91 2,83 2,83
20 84,92 0,00 83,58 21,40 6,89
BG 15A 10 27,18 73,64 29,68 45,60 8,77
20 36,93 72,76 26,26 64,08 9,56
BG 15B 10 38,23 24,95 65,61 39,53 9,72
20 43,69 27,07 65,78 28,43 5,66
105
Apêndice 6. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
BG 15C 10 0,00 0,00 0,00 0,00 5,07
20 13,78 0,00 0,86 34,07 2,20
BG 15D 10 16,30 54,13 11,28 9,13 0,00
20 0,00 62,94 21,98 20,83 0,00
BG 16A 10 21,90 41,17 3,43 2,03 1,57
20 6,20 62,56 9,19 21,33 0,00
BG 16B 10 25,55 0,00 8,31 0,00 9,73
20 41,36 0,00 7,97 11,99 13,45
BG 16C 10 17,40 0,00 25,00 2,41 0,00
20 65,21 0,00 33,49 21,70 0,00
BG 16D 10 26,64 0,00 0,00 6,14 6,77
20 23,24 0,00 2,91 0,54 4,07
BG 16E 10 45,62 0,00 0,00 0,00 11,51
20 32,73 0,00 0,00 14,36 11,08
BG 16F 10 33,33 54,62 11,45 0,00 2,33
20 18,86 61,05 11,63 16,35 2,13
106
Apêndice 7. Inibição do crescimento (%) dos micro-organismos indicadores na presença dos
extratos dos fungos pertencentes à CMLB.
Fungo Concentração
de extrato (%)
Inibição do crescimento (%)
A. cereus E. coli S. aureus S.
choleraesuis
C.
albicans
RP 9 10 0,00 0,00 3,60 0,00 5,68
20 30,17 53,32 20,76 44,85 7,46
RP 16 10 30,29 0,00 16,98 0,00 2,85
20 17,15 11,02 1,16 0,00 0,00
RP 20 10 27,62 38,74 9,42 0,00 5,02
20 20,07 11,08 18,20 0,00 1,34
RP 24 10 65,10 29,64 23,79 16,93 0,43
20 58,02 69,72 46,20 48,44 0,00
RP 59 10 36,66 73,47 11,47 2,00 6,82
20 7,02 74,36 30,06 35,75 10,09
RP 63 10 13,19 74,70 9,75 31,85 0,00
20 51,40 77,81 41,05 63,36 0,00
RP 88 10 33,35 40,04 53,80 39,20 6,23
20 25,08 9,91 66,13 34,19 4,29
RP 143 10 21,61 54,19 35,91 0,11 8,45
20 16,65 59,96 25,29 13,25 3,57
RP 148 10 51,86 51,43 67,90 9,69 25,10
20 47,64 73,08 72,51 57,46 44,36
107
Apêndice 7. Continuação.
Fungo Concentração
de extrato (%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S. aureus S.
choleraesuis
C.
albicans
RP 156 10 44,63 51,82 70,90 36,97 60,19
20 27,78 64,60 72,62 9,24 75,88
RP 159 10 42,23 56,71 69,77 15,70 51,61
20 36,21 50,94 70,63 16,04 77,75
RP 162 10 45,09 66,17 70,15 26,61 28,67
20 62,24 73,37 72,35 51,45 61,70
RP 164 10 68,25 62,33 71,97 44,65 19,63
20 40,12 73,37 73,10 6,35 40,69
RP 180 10 24,02 0,00 26,47 0,00 6,72
20 32,90 0,00 28,51 3,34 11,70
RP 184 10 59,15 44,12 69,20 19,33 53,72
20 57,93 75,58 73,17 37,92 75,48
RP 208 10 42,32 0,00 4,44 7,17 7,28
20 44,39 2,96 8,57 0,00 3,23
RP 216 10 35,24 0,00 10,80 0,00 10,88
20 48,54 43,52 28,82 34,65 4,88
RP 225 10 27,20 27,90 16,57 21,90 10,78
20 40,73 53,52 19,40 16,99 7,15
108
Apêndice 7. Continuação.
Fungo Concentração
de extrato (%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S. aureus S.
choleraesuis
C.
albicans
RP 255 10 62,93 48,63 68,65 10,09 36,78
20 53,05 46,87 70,18 15,47 76,47
RP 261 10 36,71 5,24 2,80 4,95 11,87
20 44,02 12,02 14,99 25,53 6,92
RP 314 10 44,88 35,62 25,39 17,58 4,02
20 57,32 51,93 32,90 0,00 0,40
RP 318 10 41,71 9,40 59,46 5,07 9,99
20 48,17 0,00 63,21 23,89 6,82
RP 361 10 35,12 0,00 18,69 14,77 5,24
20 34,76 50,21 30,56 21,20 0,53
RP 366 10 48,05 20,82 52,65 0,00 3,53
20 52,07 58,28 65,06 0,00 5,44
RP 367 10 42,56 0,00 0,00 0,00 2,47
20 36,22 0,00 0,00 7,64 1,19
RP 396 10 40,18 0,00 44,20 0,00 9,30
20 38,14 0,00 60,20 13,67 40,97
RP 471 10 29,21 36,48 22,32 27,50 8,54
20 41,33 28,07 9,06 6,28 6,45
109
Apêndice 7. Continuação.
Fungo Concentração
de extrato (%)
Inibição do crescimento (%)
B. cereus E. coli S. aureus S.
choleraesuis
C.
albicans
RP 406 10 23,85 12,80 0,00 0,00 11,71
20 34,31 43,50 0,00 22,97 8,90
RP 331 10 30,10 0,00 3,13 25,00 12,44
20 26,15 5,74 21,75 13,20 11,71
RP 347 10 32,27 40,59 7,33 0,00 8,01
20 31,38 33,42 22,64 12,00 8,97
RP 478 10 51,53 68,79 42,98 65,42 87,29
20 71,56 76,58 22,64 63,04 63,60
RP 480 10 37,24 10,83 9,76 11,17 9,76
20 18,24 0,00 32,21 4,25 7,51
RP 488 10 29,59 28,12 40,05 0,00 5,89
20 40,18 28,59 47,00 0,00 6,06
RP 13 10 67,22 5,17 50,83 0,56 15,35
20 66,07 10,46 61,67 0,00 37,13
RP 153 10 54,85 52,74 64,41 14,39 66,81
20 50,00 71,02 68,05 4,85 77,96
RP 1215 10 35,08 13,43 0,00 0,00 3,44
20 40,56 37,11 14,16 0,00 2,78
110
Apêndice 7. Continuação.
Fungo
Concentração
de extrato
(%)
Inibição do crescimento (%)
B.
cereus E. coli
S.
aureus
S.
choleraesuis
C.
albicans
RP 1701 10 25,79 0,00 7,68 20,15 8,97
20 26,19 36,91 2,35 20,85 4,56
RP 3 10 23,74 0,00 0,00 9,28 3,34
20 0,70 0,00 0,00 9,64 1,51
RP 462 10 6,20 0,00 61,79 10,98 7,58
20 36,68 0,00 60,22 33,81 6,10
111
Apêndice 8. Crescimento de B. cereus (% D.O.), na presença de diferentes concentrações do
antibiótico Cloranfenicol (A) e dos extratos dos fungos BG14K(B), BG4B (C) e Aspergillus
sp. 1099 monitorado pela leitura da densidade óptica durante 20 h de exposição.
0
30
60
90
120
150
180
0 5 10 15 20
Controle 0,004 mg/mL0,008 mg/mL 0,016 mg/mL
D.O
.(%
)
0
30
60
90
120
150
180
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL1,25 mg/mL 2,5 mg/mL
B
D.O
.(%
)
0306090
120150180
0 5 10 15 20
Controle 0,313 mg/mL 0,625 mg/mL
D.O
.(%
)
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL 1,25 mg/mL
D.O
.(%
)
A
C D
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
112
Apêndice 9. Crescimento de E. coli (% D.O.), na presença de diferentes concentrações do
antibiótico Cloranfenicol (A) e dos extratos dos fungos IB6B (B), IB6A (C), IB36C (D) e
BG8C (E) monitorado pela leitura da densidade óptica durante 20 h de exposição.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,004 mg/mL0,008 mg/mL 0,016 mg/mL
A
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 2,5 mg/mL5 mg/mL 10 mg/mL
B
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 1,25 mg/mL2,5 mg/mL 5 mg/mL
C
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 0,313 mg/mL0,625 mg/mL 1,25 mg/mL
D D
.O.(
%)
0
100
200
300
400
500
0 5 10 15 20
Controle 2,5 mg/mL5 mg/mL 1,25 mg/mL
E
D.O
.(%
)
Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
113
Apêndice 10. Crescimento de S. aureus (% D.O.), na presença de diferentes concentrações do
antibiótico Cloranfenicol (A) e do extrato dos fungo IB49C (B) monitorado pela leitura da
densidade óptica durante 20 h de exposição.
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL0,3125 mg/mL 0,156 mg/mL
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 20 mg/mL
10 mg/mL 5 mg/mL
B
D.O
.(%
)
A
Tempo (h) Tempo (h)
114
Apêndice 11. Crescimento de S. choleraesuis (% D.O.), na presença de diferentes
concentrações do antibiótico Cloranfenicol (A) e do extrato dos fungo IB38E (B), IB40A(C),
IB45B (D), BG8C (E) e BG5A (F)monitorado pela leitura da densidade óptica durante 20 h
de exposição.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,004 mg/mL0,008 mg/mL 0,016 mg/mL
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 2,5 mg/mL
5 mg/mL 10 mg/mL
B
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 5 mg/mL10 mg/mL 20 mg/mL
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,313 mg/mL0,625 mg/mL 1,25 mg/mL
D
D.O
.(%
)
050
100150200250300350
0 5 10 15 20
Controle 20 mg/mL10 mg/mL 5mg/mL
D.O
.(%
)
050
100150200250300350
0 5 10 15 20
Controle 20 mg/mL 10 mg/mL
F
D.O
.(%
)
A
C
E
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
115
Apêndice 12. Crescimento de S. choleraesuis (% D.O.), na presença de diferentes
concentrações dos extratos dos fungos IB4C (G), IB6B (H), IB14B(I), IB27B(J), IB36A (K) e
IB36C (L) monitorado pela leitura da densidade óptica durante 20 h de exposição.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL1,25 mg/mL 2,5 mg/mL
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL1,25 mg/mL 2,5 mg/mL
H
D.O
.(%
)
050
100150200250300350
0 5 10 15 20
Controle 20 mg/mL 10 mg/mL
D.O
.(%
)
050
100150200250300350400450
0 5 10 15 20
Controle 20 mg/mL10 mg/mL 5 mg/mL
J
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL1,25 mg/mL 2,5 mg/mL
D.O
.(%
)
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20
Controle 0,625 mg/mL1,25 mg/mL 2,5 mg/mL
L
D.O
.(%
)
G
I
K
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
Tempo (h) Tempo (h)
116
ANEXO A - Autorização de acesso e de remessa de amostras de componente do Patrimônio
Genético nº 010662/2013-8
