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INTRODUÇÂO À QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS ISOLAMENTO DO EUGENOL A PARTIR DO CRAVO DA ÍNDIA

OBJETIVOS

� Demonstrar o isolamento de substâncias orgânicas de fontes naturais. � Demonstrar a extração de um óleo essencial por destilação com arraste a vapor. � Demonstrar experimentalmente o uso da extração contínua (Soxhlet) para isolamento de

óleos fixos. � Análise cromatográfica do óleo essencial de cravo.

LEITURA RECOMENDADA Extração de produtos naturais; óleos essenciais; destilação por arraste a vapor. INTRODUÇÃO Desde a pré-história a humanidade tem demonstrado interesse por substâncias orgânicas extraídas de fontes naturais. Muitas substâncias usadas como medicamentos, pigmentos, venenos e perfumes foram, durante muito tempo, apenas isoladas de plantas ou animais. Só com o desenvolvimento da síntese orgânica no final do século 19, a humanidade conseguiu libertar-se dessa limitação. Mesmo assim, ainda hoje continua o interesse do químico orgânico pela descoberta de novas substâncias de origem natural (vegetal ou animal), que representem um desafio à síntese total ou elucidação molecular, face suas intrincadas arquiteturas.

O químico de produtos naturais atua, de modo geral, em quatro linhas básicas de pesquisas, às vezes, em duas ou mais concomitantemente:

� estudo sistemático da composição química de espécies pertencentes a determinadas famílias � isolamento de fontes naturais de substâncias, com ação farmacologica ou fisiológica

potencial, que possam ajudar no combate a doenças e pragas agrícolas � elucidação estrutural de novas moléculas, com uso intenso de técnicas espectrométricas � síntese e/ou transformações químicas de moléculas com ação fisiológica. O Esquema 1 abaixo, apresenta uma tentativa de definição das atividades desenvolvidas pelos químicos de produtos naturais e bioquímicos.

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Substâncias Orgânicas Naturais - Química de Produtos Naturais

Químicos de Produtos Naturais Bioquímicos

Processos Metabólicos Secundários Processos Metabólicos Primários

Metabólitos Especializados Polímeros Naturais

Substâncias Orgânicas Micromoleculares

(Isolamento e Elucidação Estrutural)

Substâncias OrgânicasMacromoleculares:

ProteínasÁcidos NucléicosPolissacarídeos

Ligninas

Metabolismo Secundário (especializado)

Rota-Acetato-Malonato

Rota Chiquimato(Metabolismo de aminoácidos aromáticos)

Rota Mevalonato(isoprenóides)

PolicetídeosAlcalóidesLignóidesNeolignóides

Terpenóides

Triterpenóides

Esteróides

DerivadosPrenilados

FlavonóidesXantanóides

TerpenóidesAlcalóidesFlavanóidesXantanóidesAntraquinóidesLignóidesNeolignóidesCumarinóidesCarotenóidesPolicetideos

Glicosídeos e outrosderivados naturais

Esquema 1.

A química de produtos naturais possui uma estreita relação de interdisciplinaridade com outras áreas do conhecimento, tais como: botânica, zoologia, biologia molecular, farmacologia, medicina humana e veterinária, entomologia, ecologia, etc. (Esquema 2).

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S u b s t â n c i a s O r g â n i c a s N a t u r a i s ( M i c r o m o l e c u l a r e s )

B i o t e c n o l o g i a ( E n g e n h a r i a

G e n é t i c a )

S i s t e m á t i c a Q u í m i c a

E v o l u ç ã o Q u í m i c a

E c o l o g i a Q u í m i c a

A t i v i d a d e B i o l ó g i c a

I n s u m o ( m a t é r i a - p r i m a )

N o v o s M o d e l o s

p a r a S í n t e s e

F a r m c o l o g i a M e d i c i n a

A g r o q u í m i c a

S í n t e s e T o t a l

S í n t e s e P a r c i a l

D e r i v a d o s

P r e p a r a ç ã o d e

P r o d u t o s Ú t e i s

V a c i n a s P r o d u ç ã o

A n i m a l

A n t i c o r p o s E n e r g i a

F i x a ç ã o B i o l ó g i c a

d e N i t r o g ê n i o

C u l t u r a s d e

C é l u l a s

e T e c i d o s

d e

P l a n t a s

N o v a s R e a ç õ e s

N o v o s R e a g e n t e s

Esquema 2.

Até meados do século passado o químico se valia das reações clássicas, que exigiam quantidades maciças de amostras, para estabelecer as estruturas moleculares, por vezes bastante complexas, de substâncias isoladas de fontes naturais. Atualmente, as técnicas utilizadas na elucidação estrutural dependem, quase que exclusivamente, de métodos espectrométricos. Tais métodos, geralmente não destrutivos, requerem amostras muito pequenas, o que, associado às novas metodologias de isolamento e purificação, expandiu em muito a capacidade do químico em descobrir novas moléculas interessantes, que ocorrem em diminutas quantidades nos organismos vivos.

EXTRAÇÃO DE ÓLEOS (FIXOS E VOLÁTEIS) A PARTIR DE MATERIAL BIOLÓGICO

Há uma diversidade de metodologias para a extração de substâncias orgânicas a partir de fontes naturais. Dependendo da natureza do material a extrair algumas técnicas são mais recomendadas que outras. Por exemplo, geralmente usamos a destilação por arraste de vapor d'água na extração de essências ou óleos voláteis. Para óleos (e gorduras) não voláteis (óleos fixos) a extração contínua por meio de solvente orgânico em extrator Soxhlet é a metodologia mais conveniente. Independente da técnica a ser usada na extração, o processo comum para a obtenção de produtos naturais a partir de fontes naturais envolve a escolha da fonte (material biológico, geralmente vegetais), a secagem do material, a trituração, a extração e a purificação do produto extraído.

As essências ou óleos essenciais são substâncias odoríferas, bastante voláteis à temperatura ambiente, encontrados em várias partes das plantas. Os óleos essenciais são normalmente encontrados em bolsas secretoras presentes nas partes vitais dos vegetais, tais como flores, folhas, sementes, caule, raiz e frutos. A qualidade do óleo essencial é variável de um gênero a outro e/ou de uma espécie a outra, podendo-se encontrar vegetais que possuem essências quimicamente diferentes em várias de suas partes.

Praticamente todos os óleos voláteis são constituídos por misturas muito complexas, cuja composição química varia muito. Representantes de quase todas as funções orgânicas comuns podem fazer parte de suas composições. Basicamente podemos agrupa-los em duas grandes classes, com base em sua origem biossintética: a) - derivados dos terpenóides, formados via ácido mevalônico-acetato; e b) - compostos com anéis aromáticos, formados via ácido chiquímico-fenil propanóides. Alguns exemplos de substâncias comumente presentes em óleos essênciais são mostrados Figura 1.

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O

O

CHO

O

O CH3O

CHO

OHO

OH

Safrol(óleo de sassafrás)

Anetol(óleo de anis)

Cinamaldeído(óleo de canela)

Linalol(óleo de alfazema)

Limoneno(óleo de limão)

Carvona(óleo de hortelã)

Mentol(óleo de hortelã)

Cânfora(óleo de cânfora)

Eucaliptol(óleo de eucalipto)

α −Felandreno(óleo de eucalipto)

Citral(óleo de capim-limão)

Figura 1. Alguns componentes químicos de óleos essenciais conhecidos. Muitas plantas são usadas diretamente com fins medicinais ou aromatizantes. Porém, é mais conveniente, para fins de comercialização, isolar a própria substância volátil, responsável pela ação fisiológica [a vanilina (baunilha) e o óleo de cravo são exemplos]. O processo de extração de uma essência depende de uma série de fatores, tais como sua localização no vegetal, suas propriedades físico-químicas e finalidade a qual se destina. Os óleos essênciais são facilmente solúveis em álcool, clorofórmio, diclorometano, éter e outros solventes orgânicos, mas imiscíveis com água. Assim, é possível extrai-los diretamente com um solvente orgânico de baixo ponto de ebulição (por ex. pentano, e mais recentemente dióxido de carbono em estado super-crítico), ou pela técnica de destilação com arraste de vapor d'água, processo muito usado na indústria de perfumaria.

A extração com arraste de vapor é uma variante da destilação azeotrópica, que permite a separação de componentes voláteis imiscíveis, sem necessidade de temperaturas elevadas. Quando dois ou mais líquidos imiscíveis são aquecidos seus vapores se comportam como gases "ideais" e portanto, obedecem a lei de Raoult (veja Experimento 4). Se um dos líquidos é a água, a destilação se processa a uma temperatura inferior a 100ºC, por força da contribuição da pressão de vapor do(s) outro(s) líquido(s) (Figura 2, exemplificado com a mistura bromobenzeno-água).

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P

H2O bromobenzeno760mm

azeotropoH2O-bromobenzeno

Tº100º 156º95º

Figura 2. Curvas de destilação da mistura bromobenzeno-água.

A composição do destilado depende do pêso molecular dos componentes e de suas respectivas pressões de vapor à temperatura em que a mistura destila:

gA / gB = pºA x pmA / pºB x pmB

No caso da destilação da mistura bromobenzeno(A)-água(B), que se processa a 95ºC, temos: pºa pressão de vapor da água a 95ºC 640 mm pºb pressão de vapor do bromobenzeno a 95ºC 120 mm m b massa molecular da água 18 m a massa molecular do bromobezeno 157 ∴ g bromobenzeno / g água = 120 x 157 / 640 x 18 = 1,64 / 1

logo, cada 1grama de água destilada carrea 1,64 gramas de bromobenzeno. O processo é industrialmente muito atrativo devido ao baixo custo e pêso molecular da água.

Em escala de laboratório, a operação é facilmente realizada em um sistema para destilação simples, munido de um funil de adição por meio do qual a água evaporada é constantemente reposta (Figura 3).

Figura 3. Aparelhagem para destilação por arraste de vapor.

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Os óleos fixos são geralmente constituídos de componentes com alto peso molecular. Enquadram-se, na categoria, os lipídios de baixo ponto de fusão (azeite e outros óleos comestíveis). Quimicamente são classificados como ésteres de álcoois e ácidos graxos de cadeia longa (triglicerídeos ou triacilgliceróis, Figura 4). Gorduras e cêras pertencem à mesma categoria, mas possuem pontos de fusão mais elevados.

O

OO

O

OO R'

R''

R'''

Figura 4. Fórmula genérica de um triglicerídeo

A extração de óleo fixo (ou gorduras/cêras) de fonte natural sólida é mais convenientemene

executada em um extrator Soxhlet (Figura 5). O sólido (devidamente moído) é colocado em um cartucho poroso na câmara do extrator e o solvente de extração adicionado ao balão. O solvente vaporizado e condensado na câmara do extrator dissolve o óleo (ou gordura) da amostra. Ao atingir o nível do sifão, a solução retornará ao balão e o processo repetido um número de vezes (extração contínua).

Figura 5. Extrator Soxhlet.

Parte I – Extração de Óleos Fixos de Materiais Biológicos

Experimento Demonstrativo

Objetivo: Demonstrar experimentalmente o funcionamento de um extrator Soxhlet na extração de um óleo fixo de tecidos vegetais (castanha de caju, milho, noz moscada, etc.). Procedimento: (detalhamento a ser apresentado pelo instrutor). Discussão 1. Quais são os dois principais métodos para extrair grosseiramente um produto natural de materiais biológicos? 2. Aponte três analogias entre óleo fixo e óleo volátil.

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3. Às vezes um produto natural pode ser isolado macerando a fonte natural em água e extraindo a solução aquosa com um solvente diferente. Qual afirmação não é uma propriedade necessária de um solvente para extrair um produto natural desta solução aquosa?

(a) o solvente não deve reagir quimicamente com os componentes da mistura. (b) o solvente extrator deve ser imiscível com a solução original. (c) o coeficiente de distribuição, K, para o produto natural deve ser grande. (d) o solvente extrator deve ter um ponto de ebulição alto. (e) o solvente deve ser prontamente separável do soluto.

4. (Provão 2001) Lipídios podem ser recuperados de diversos materiais biológicos através da extração por solvente. Os tipos mais comuns de lipídios são gorduras e óleos derivados de ácidos carboxílicos de cadeias longas e do glicerol. A figura abaixo mostra um extrator do tipo Soxhlet onde pode ser efetuada a extração de lipídeos. O solvente a ser usado na extração, a região onde deve ser colocado o material biológico a ser extraído e o local de onde será recuperado o extrato de lipídios são, respectivamente:

Solvente Local onde deve ser colocado o material biológico

Local onde será recuperado o extrato de lipídeo

(a) água cartucho poroso balão (b) água balão cartucho poroso (c) clorofórmio cartucho poroso balão (d) clorofórmio balão cartucho poroso (e) glicerol balão cartucho poroso

Parte II. Isolamento do Eugenol a Partir do Cravo da Índia Objetivo: Isolamento de óleos essenciais de tecidos vegetais (especiarias) por destilação com arraste de vapor (eugenol). O cravo da Índia contém entre 14% a 20% p/p de óleo essencial, cujo principal constituinte é o eugenol. Em menores quantidades, estão presentes também o acetato de eugenila e o sesquiterpeno cariofileno (Figura 6).

CH3O

RO

R = H eugenolR = OAc acetato de eugenila cariofileno

Figura 6. Componentes do óleo essencial do cravo da Índia. Procedimento Nota: para simplificação o sistema mostrado na Figura 3 foi ligeiramente modificado. Montar um aparato para destilação simples, usando um balão de 250 mL. Colocar 5,0 g de botões de cravo da Índia (preferivelmente pulverizados) no balão de destilação, e adicionar 150 mL de água. Aquecer suavemente o balão em banho de areia e sob agitação magnética, até que sejam recolhidos cerca de 100 mL do destilado em um Erlenmeyer de 125 ml.. Transferir o destilado para um funil de separação e extrair com 2 x 10 mL de diclorometano. Desprezar a fase aquosa. Secar o extrato orgânico combinado com sulfato de sódio anidro. Decantar a solução orgânica para um béquer previamente tarado e evaporar o solvente em banho-maria (capela!). Pesar o óleo residual e calcular seu rendimento percentual em relação à quantidade original de cravo utilizada. Reservar uma alíquota para análises cromatográficas.

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Discussão 1. Em que categoria geral de produtos naturais se enquadram as essências? 2. Consulte nos catálogos (Index Merk, Handbooks, etc.) o ponto de ebulição do eugenol. 3. Baseado no peso original de cravo, calcular a porcentagem de recuperação do eugenol,

considerando que as impurezas presentes no extrato são insignificantes. 4. Comente sobre a eficiência da montagem alternativa utilizada no processo de extração do eugenol. 5. Por que a destilação por arraste de vapor é preferida à destilação simples quando se trata de óleos

essenciais? 6. Por que um sistema heterogêneo, como água e óleo essencial, destila a uma temperatura abaixo de 100oC? 7. Os constituintes de um óleo essencial particular podem ser separados por destilação fracionada a pressão reduzida, cristalização ou cromatografia. Supondo que, com óleo essencial de cravo, nenhum dos procedimentos acima citados poderia ser adotado para separar os seus componentes (eugenol e acetato de eugenila). Nesse caso, proponha um fluxograma e equações mostrando como o eugenol pode ser separado (quimicamente!!!) do seu derivado acetilado (ver Figura 6). 8. (Provão 2002) Em um laboratório efetuou-se a nitração do fenol, obtendo-se os isômeros o-nitrofenol (A) e p-nitrofenol (B). Os dois isômeros obtidos foram separados utilizando-se aparelhagem mostrada na Figura 3.

O mecanismo escolhido para efetuar a separação baseia-se na destilação (a) por arraste a vapor do componente A, pois A é mais volátil que B, por apresentar ligação hidrogênio intramolecular. (b) por arraste a vapor do componente B, pois B é menos solúvel que A, por apresentar menor momento de dipolo. (c) fracionada, onde o componente A é recolhido puro, pois apresenta menor ponto de ebulição que B. (d) fracionada, onde o componente B é recolhido puro, pois apresenta menor solubilidade em água.

Parte III – Análise Cromatográfica do Óleo Essencial de Cravo Objetivo: Examinar a constituição do óleo essencial de cravo por cromatografia em camada delgada. Procedimento 1. Aplica-se em pontos separados, através de tubos capilares, uma gotinha das soluções de eugenol

(padrão) e do óleo de cravo recém extraído em uma mesma placa de cromatografia, a 1 cm da borda inferior da placa e mantendo-se cerca de 1 cm de distância entre os pontos de aplicação.

2. Introduz-se a placa na cuba com o solvente de desenvolvimento indicado pelo instrutor. de modo que o nível do líquido fique abaixo dos pontos de aplicação. Espera-se o desenvolvimento do cromatograma mantendo-se a cuba fechada.

3. Quando à frente do solvente ficar a 1 cm (registre essa distância) da borda superior da placa, retira-se e deixa-se secar totalmente ao ar (10 a 15 minutos).

4. Antes da revelação com iodo, verifica-se o cromatograma na lâmpada UV. Marca-se o contorno das manchas das substâncias UV-ativas, cuidadosamente, com o auxílio de uma lapiseira.

5. Para revelação definitiva, insere-se a placa em um recipiente cilíndrico e seco de tamanho adequado contendo um pouco de iodo sólido e coberto com um vidro de relógio. Espera-se o surgimento de manchas na placa.

6. Registrar as distâncias percorridas pela frente do solvente e pelos componentes de cada amostra analisada (eugenol e do óleo de cravo recém extraído).

Discussão 1. Com base no experimento realizado, apresente um desenho do seu cromatograma (revelado sob

luz UV e vapor de iodo). 2. Determinar os Rf de todos os componentes das soluções analisadas.

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3. Supondo que você precisa emitir parecer técnico em relação ao extrato obtido. Você poderia inferir no seu parecer que inequivocamente o mesmo contêm eugenol? Você pode inferir que seu extrato também contém acetato de eugenila e cariofileno? Ou nenhum deles? Ou outros constituintes? Explique.

4. Com base nos Rf dos componentes de sua amostra e considerando aspectos estruturais dos constituintes do óleo do cravo, você poderia fazer uma correspondência entre as manchas observadas e os componentes do óleo do cravo?

5. Observe o aspecto da sua cromatoplaca quando revelada sob luz UV e no vapor de iodo. Diga quantos componentes foram detectados em cada caso. Considerando os aspectos estruturais dos constituintes do óleo do cravo, você avalia como coerente os resultados da comparação? Explique.

Disposição dos Resíduos e Insumos � Seguindo indicação do instrutor, alguns resíduos aquosos poderão ser descartados na pia com

água corrente. � Os demais resíduos, líquidos e/ou sólidos, deverão ser acondicionados em frascos apropriados

para posterior tratamento e reutilização.