Isolamento de Microrganismos
-
Upload
jefferson-alain -
Category
Documents
-
view
20 -
download
4
Transcript of Isolamento de Microrganismos
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
SETOR DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Trabalho acadêmico apresentado à
disciplina Processos Fermentativos
Industriais da Universidade Federal
do Paraná.
CURITIBA
2008
1
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO................................................................................................ 2
1.1- MEIOS DE CULTURA.............................................................................. 5
2- DIVERSIDADE MICROBIANA........................................................................ 7
3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO........................................................... 13
3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS........................................... 13
3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO............................. 14
3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO........................... 16
3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE................................ 17
4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO......................................................... 17
5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO..................................................... 18
6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS........................................................... 21
7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS.................................................. 21
8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS................................................................. 23
9- CULTURAS PURAS DE ALGAS.................................................................... 23
10- OUTRAS TÉCNICAS.................................................................................... 23
11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 25
12- ANEXOS....................................................................................................... 27
2
1- INTRODUÇÃO
Isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o
organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia
através da observação da produção de determinado produto ou da morfologia da
colônia (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente
modificados, ainda é possível encontrar uma grande variedade de novos
microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser até comercialmente
interessantes. A primeira etapa para a utilização de um microrganismo de interesse
industrial muitas vezes é a etapa de isolamento de uma colônia.
Normalmente, as colônias de microrganismos se originam somente de uma
célula ou esporo de microrganismo. Essas colônias apresentam características
morfológicas diferentes, as quais permitem a distinção entre os microrganismos,
como mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualização das colônias
independentes no meio sólido, é necessário a distribuição uniforme das bactérias
sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006)
Figura 1- Morfologia de colônias bacterianas
Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.
Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o
microrganismo de interesse está presente de forma homogênea é denominada
cultura axênica. Um cultivo desse tipo dá oportunidade de investigação de
3
características fisiológicas e genéticas sem a interferência de outros microrganismos
e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de
meio ambiente. No entanto alguns fatores podem ser alterados justamente por esse
motivo, pois no meio ambiente ocorre uma interação entre diversas espécies e
nutrientes, podendo, por exemplo, modificar o formato, a textura e a coloração de
colônias (OGUNSEITAN, 2005).
O isolamento, assim como todo o processo que irá se desenvolver
futuramente, deve ser o mais econômico possível, levando-se em consideração a
produtividade que será obtida pelo microrganismo e os gastos necessários para
isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um
microrganismo são as suas características nutricionais, pois se almeja obter
microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos através da
formulação adequada do meio de isolamento; a temperatura ótima, pois organismos
com temperatura ótima de 40ºC para cima facilitam o isolamento e reduz os custos
de resfriamento do fermentador; ser compatível com o fermentador utilizado e com o
processo de cultivo desejado; e deve ser geneticamente estável, ou quando se
deseja a manipulação genética devem ser conhecidos os melhores mecanismos
(STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
Os microrganismos isolados podem ser obtidos a partir de ambientes naturais
ou a partir de bancos de cepas. Esses centros de cepas, como os mostrados na
Tabela 1, podem fornecer microrganismos de características já conhecidas, mas
nem sempre estão presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o
ambiente possui uma infinidade de variações. Os bancos de culturas têm como
função o armazenamento, a prevenção de eventuais mudanças nas suas
características, o ensino e a pesquisa sobre manutenção e caracterização de cepas
(ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988).
Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isolá-la da natureza, mas
também pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma
procura extensa no meio ambiente. Mas geralmente é necessário utilizar uma cepa
dos bancos como uma referência para comparação com novos microrganismos
descobertos através do isolamento da natureza (STANBURY, WHITAKER E HALL,
1995).
4
Tabela 1 – Principais centros de coleção de culturas
Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988.
O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o
microrganismo desejado, podendo variar desde solo até águas, ar, lodo, alimentos
ou órgãos. Características que um determinado organismo possui para se
5
desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de
isolamento.
Pressão seletiva é muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos
que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presença de
certos compostos ou no cultivo sob condições que são adversas a outros
microrganismos que não são de interesse.
Quando não é possível fazer uso da pressão seletiva, utilizam-se
características detectáveis como morfologia (tipo e forma da colônia) ou produção de
compostos característicos de determinada espécie (como, por exemplo, a produção
de antibióticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
1.1- MEIOS DE CULTURA
Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de
cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material
nutriente preparado em laboratório cuja utilização é importante para o crescimento,
transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes
emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos
nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado
(PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).
Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos
(quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em
que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam
de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são
denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios
quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em
laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006).
Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que
tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de
carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio
complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na
forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados
normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios
complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um
6
microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não
pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).
No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial
denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é
capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura
(TORTORA et al., 2006).
Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de
microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth.
Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a
fortificá-lo, temos então um meio enriquecido.
Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado
organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de
meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta
(inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados
somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY
e KLEIN, 2002).
Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível
distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no
ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu
redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul
de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos
não.
Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no
isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão
em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é
que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento
deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e
em que ocasiões eles devem ser utilizados.
7
Tabela 2- Meios de Cultura
Tipo Finalidade
Quimicamente
definido
Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e análises
microbiológicas.
Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotróficos.
Redutor Crescimento de anaeróbios obrigatórios.
Seletivo Impedir o crescimento de microrganismos não desejados;
favorecer o crescimento do organismo de interesse.
Diferencial Diferenciar colônias do organismo de interesse dos outros
microrganismos.
Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a característica importante de
aumentar o número de bactérias de interesse tornando-a
detectável.
Fonte: TORTORA et al., 2006.
2- DIVERSIDADE MICROBIANA
O termo diversidade, no contexto biológico, define a multiplicidade de formas
presente em um sistema, sendo que muitas vezes essas diferentes formas só ficam
aparentes através da utilização de ferramentas especializadas de observação.
Essas ferramentas podem ir desde a visualização através de microscópio ou até
uma análise em nível molecular.
No entanto, mesmo com toda a tecnologia disponível, não é possível obter
uma informação completa sobre todos os microrganismos presentes em uma
amostra de ambiente, devido à inadequação de certos microrganismos às técnicas
de recuperação, isolamento e cultivo utilizadas atualmente. Esses microrganismos
não cultiváveis ainda são metabolicamente ativos e são chamados de “viáveis, mas
não cultiváveis” (VBNC – viable but non-culturable) ou de somnicélulas ou
“dormentes não-esporuladas”. Portanto, muitos microrganismos presentes na
natureza ainda não formaram colônias viáveis sob condições laboratoriais e somente
10% (ou menos) é passível de ser cultivado em laboratório. A figura 2 esquematiza
os microrganismos possíveis de serem cultivados (ativos, danificados e dormentes)
e aqueles não-cultiváveis (VBNC, inativas, e mortas) (OGUNSEITAN, 2005).
8
Figura 2- Estados fisiológicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo
Fonte: OGUNSEITAN, 2005.
Para os organismos cultiváveis, ainda pode haver uma diferença na sua
atividade na natureza e sob condições laboratoriais. Por exemplo, as cianobactérias
Trichodesminium são capazes de formar colônias em laboratório, mas na natureza
são encontradas somente na forma individualizada.
A maioria das tentativas de isolamento tenta proporcionar uma condição
balanceada de nutrientes como fonte de carbono, condições ótimas de temperatura,
pH, pressão de oxigênio e umidade. Algumas espécies requerem também fatores de
crescimento, sendo que alguns deles podem estar sendo produzidos por outras
espécies que convivem junto no meio ambiente. A simulação de um ambiente
natural é um bom começo para o isolamento e cultivo desses microrganismos.
(OGUNSEITAN, 2005)
Devido à grande diversidade de microrganismos presentes no meio ambiente,
é possível encontrar numa amostra ambiental características nutricionais variadas,
as quais definem o tipo de meio de isolamento a ser utilizado. Pode-se fazer uma
distinção com relação às fontes de energia, fontes de carbono e os oligoelementos.
9
A figura 3 mostra as diferentes combinações dessas características e a classificação
dos microrganismos com relação a elas.
Figura 3- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas
Fonte: OGUNSEITAN, 2005.
Meios de cultivo seletivo ou condições seletivas de incubação podem ser
usados para estreitar a variedade de espécies em uma comunidade microbiana. O
uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior
crescimento de determinadas espécies em detrimento de outras. Por exemplo,
Beijerinck isolou espécies de Rhizobium de nódulos de raízes através do
enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando
enriquecimento também conseguiram descobrir espécies capazes de metabolizar
moléculas xenobióticas e antropogênicas de poluentes. A técnica de enriquecimento
também pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding
(OGUNSEITAN, 2005).
As interações entre microrganismos no ambiente podem ser muito
importantes, e, quando não se deseja utilizar somente um microrganismo isolado,
pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populações mistas ou
culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinação de duas
10
ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois é feito em
condições assépticas. Culturas de comunidades microbianas já incluem interações
entre fatores bióticos e abióticos, podem ocorrer variações da composição das
espécies microbianas devido a essas condições. Elas são mantidas em
microcosmos que são estruturados para incubar amostras naturais em laboratório,
sendo importantes na investigação de como mudanças ambientais tem reflexo na
diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005)
Há uma grande diversidade de populações microbianas, sendo que em cada
ambiente será encontrado um nicho diferente. Pequenas distâncias como milímetros
no solo podem ter uma condição de oxigênio, luz e nutrientes diferente que propicia
o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de
microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse
número não é certo, pois não é possível isolar em uma placa para contagem todos
os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006).
Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo típico de jardim em várias
profundidades.
Profundidade (cm) Bactérias Actinomicetos* Fungos Algas**
3-8 9.750.000 2.080.000 119.000 25.000
20-25 2.179.000 245.000 50.000 5.000
35-40 570.000 49.000 14.000 500
65-75 11.000 5.000 6.000 100
135-145 1.400 - 3.000 -
* Bactérias filamentosas
** Algas encontradas em grandes profundidades não são ativas metabolicamente, mas foram
introduzidas por drenagem ou movimentos mecânicos.
Fonte: TORTORA et al., 2006.
Além dos solos, também podem ser isolados microrganismos do ambiente
aéreo, aquático. No ambiente aquático, as populações microbianas são afetadas
principalmente pela disponibilidade de oxigênio, nutrientes e luminosidade. Para
algas fotossintéticas a luz é a fonte de energia principal e, portanto, elas se
localizam próximas à superfície. Esses organismos são importantes para o ambiente
porque também são fontes de alimento para bactérias, protozoários, peixes e outras
11
formas de vida aquática. Como o oxigênio não se difunde bem na água, perto do
fundo de um lago estarão microrganismos anaeróbicos. A Figura 4 mostra um lago
em três zonas de características diferentes e os microrganismos mais prováveis de
serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006).
Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos típicos de cada zona
Fonte: TORTORA et al., 2006.
Podemos ver também a variação dos tipos de microrganismos encontrados
de acordo com cada porção de um ambiente através da coluna de Winogradsky
(Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de diâmetro
onde há a deposição de um terço do volume com sedimento de rio ou lago e a
complementação com água do mesmo ambiente. É então feito o cultivo por dois a
três meses e, após esse período é possível isolar microrganismos devido ao
gradiente químico. Será possível encontrar microrganismos representantes de cada
uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005)
12
Figura 5- Separação de microrganismo de acordo com o gradiente químico
Fonte: OGUNSEITAN, 2005.
Devido à grande quantidade de microrganismos presentes em um meio
natural altamente competitivo, eles tentam explorar todas as vantagens fisiológicas e
metabólicas possíveis para ter um desenvolvimento melhor em relação aos outros
microrganismos competidores. Eles devem utilizar os nutrientes comuns mais
rapidamente, utilizar nutrientes que outros não consigam metabolizar e ainda se
possível produzir metabólitos que inibem o crescimento de concorrentes. Por
exemplo, bactérias lácticas são capazes de tornar um nicho inóspito para
organismos competidores através da produção de ácido lático que irá acidificar o
meio e inibir alguns outros organismos (TORTORA et al., 2006).
Microrganismos que se desenvolvem em ambientes que apresentam
condições extremas de temperatura, salinidade, acidez ou alcalinidade são
chamados de extremófilos. Seu isolamento tem sido muito importante atualmente
devido à possibilidade de cultivá-los sem que haja contaminações ou o uso de suas
13
enzimas em condições que desativam outras que não são de interesse, como no
caso da Taq polimerase utilizada no processo de PCR. (OGUNSEITAN, 2005)
3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO
Esse método é usado para o isolamento de certos produtores de enzimas,
usando meios seletivos contendo o substrato que podem ser degradados pelas
enzimas produzidas pelos microrganismos desejados.
Os estudos iniciais feitos pelo bacteriologista alemão Robert Koch foram
muito importantes para a obtenção de culturas puras. Antigamente, as tentativas de
isolamento eram feitas somente através de meios líquidos, sendo assim muito difícil
isolar microrganismos como bactérias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de cultivo
sólido em superfície de batata. Por volta do mesmo tempo, um associado de Koch,
Frederick Loeffler, desenvolveu o extrato de carne peptonado para o cultivo de
bactérias patogênicas, e Koch tentou solidificar esse meio (PRESCOTT, HARLEY e
KLEIN, 2002). Ele conseguiu através da mistura do meio com gelatina em um
suporte sólido que permitia a sua solidificação, mas tinha a desvantagem de se
liquefazer à temperatura superiores a 28ºC e ser degradada por várias espécies
microbianas que possuem gelatinase (LECLERC et al., 1983).
Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar ágar como agente
solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japonês dono de uma
hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado após uma noite fria
(PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Outro agente solidificante é o ácido silícico,
o qual é quimicamente definido. Ele é importante na preparação de meios que
devem ser rigorosamente definidos (LECLERC et al., 1983).
3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS
Esse método também é chamado de esgotamento de alça. Através de uma
alça de platina, de um fio de platina ou até mesmo um swab, coleta-se uma pequena
parcela do meio de inóculo e o espalha sobre uma placa de Petri com ágar fazendo
movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem
várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua
(DROVAL, LIMA e HABU, 2001). A forma descontínua seria feita como mostrado na
14
figura 6, onde são feitas estrias na porção 1 da placa e em seguida flamba-se a alça;
após, faz-se uma retirada de bactérias da região 1 e espalha-se sobre a região 2;
flamba-se mais uma vez e espalha-se bactérias da região 2 na 3. As colônias
presentes na região 3 estarão mais isoladas (TORTORA et al., 2006).
Fazendo de forma contínua, haveria primeiramente a coleta de uma pequena
quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das bordas da
placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias até a outra
borda da placa (DROVAL, LIMA, HABU, 2001). LECLERC e colaboradores (1983)
descrevem a semeadura por estrias feita em duplicata em uma mesma placa,
percorrendo a alça ou fio de platina somente até o centro da placa, e do lado oposto
fazendo o mesmo procedimento. As colônias isoladas estarão mais ao centro e,
através da repetição, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na
segunda amostra do inóculo, porém não presente na primeira.
Figura 6- Semeadura por estrias com alça de platina
Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.
3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO
Nessa técnica, que é mostrada na figura 7, um pequeno volume da solução
de microrganismos contendo de 30-300 células é transferido para o cento de uma
15
placa de ágar já solidificado com o auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida,
mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool e a flamba de modo a manter todo o
material estéril. Com o auxílio dessa alça, espalha-se aquele volume depositado por
toda a superfície do ágar. As colônias cresceram espalhadas por toda a superfície
do ágar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002)
Figura 7- Semeadura por espalhamento
Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.
O espalhamento pode ser feito também empregando outros materiais.
GREENE e colaboradores testaram a utilização do aparato mostrado na figura 8,
que consiste de um anel cilíndrico metálico com uma tira de material fibroso. Ao
botar em contato o material fibroso e a amostra de inóculo líquida, por exemplo, os
microrganismos irão se fixar na fibra e estão carimba-se meios de cultivo estéreis
sucessivamente, de modo a obter colônias cada vez mais isoladas e definidas.
Figura 8- Aparato para semeadura do meio
Fonte: GREENE, VERSLEY e KEENAN, 1962.
16
3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO
O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour
plate é muito utilizado para bactérias e fungos. A amostra original é diluída de forma
que quando é feita a placa consegue-se colônias bem separadas. Um pequeno
volume da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em
seguida, derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com
uma agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar.
Figura 9- Comparação entre o método de pour plate e de espalhamento
Fonte: TORTORA et al., 2006.
17
Esse método permite o crescimento de colônias na superfície e dentro do
ágar, pois algumas células foram misturadas no ágar durante a sua solidificação,
como pode ser verificado na Figura 9, onde há a comparação do crescimento após a
semeadura por pour plate e por espalhamento (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN,
2002).
A maioria dos fungos e bactérias não é morta pela breve exposição ao ágar
quente, mas microrganismos sensíveis ao calor certamente podem ser danificados
pelo ágar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colônias. Além disso,
quando se deseja identificar microrganismos através da morfologia da colônia, esse
método não é muito indicado, pois as colônias presentes dentro do ágar não
fornecerão dados corretos. (TORTORA et al., 2006)
3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE
Faz-se a utilização da agulha de platina e semea-se o material contido nela
picando um ágar sólido contido num tubo (Figura 10). Com isso haverá o
crescimento de microrganismos em anaeróbio-se no fundo e aerobiose perto da
superfície do ágar.
Figura 10- Semeadura em profundidade
Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001.
4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO
Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de
determinada população microbiana são geralmente líquidos. Após o crescimento
avantajado então ocorre o isolamento de determinadas células. Isso pode ser feito
18
como mostrado nas técnicas em estado sólido ou através de uma série de diluições
em meio líquido.
Fazendo uma diluição em novo meio estéril, como na figura 11, espera-se que
em certo momento se obterá culturas provenientes de somente uma única célula. É
dessa forma que é feita o isolamento e a contagem de células de Escherichia coli
em águas ou alimentos, por exemplo (LECLERC et al., 1983).
Figura 11- Série de diluição para isolamento de um microrganismo
Fonte: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.
5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO
Métodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de
um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele deverá produzir
um número muito maior de células do que em relação aos outros.
Cultivo em meio de enriquecimento é geralmente feito em Erlenmeyers. No
entanto, o crescimento de um determinado organismos oriundo de uma amostra
variada na forma de batelada pode resultar numa mudança das condições do meio,
e, portanto, ocorre uma variação nas pressões seletivas. Isso pode ser reajustado
inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo meio idêntico
ao inicial. Após um bom desenvolvimento do microrganismo desejado, semea -se
uma alíquota em meio sólido (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
A prevalência do microrganismo desejado com relação aos outros dependerá
da taxa máxima de crescimento dele com relação aos outros organismos capazes
de também crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente
com os substratos disponíveis poderá ter um número maior de células.
19
No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento é o
desejável, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato
limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contínuo, onde novo meio de cultivo é
adicionado de tempos em tempos e as pressões seletivas são restauradas
(STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
Em um cultivo contínuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluição e
da concentração do substrato limitante. Para definir isso, deve-se partir da equação
de Monod, mostrada na fórmula 1:
(1)
onde μ é a taxa de crescimento , s é a concentração do substrato residual, Ks é a
constante de utilização do substrato (que expressa a afinidade do microrganismo
para o consumo do substrato).
No estado estacionário, temos que μ é igual a taxa de diluição (D),
transformando a fórmula em:
(2)
onde é a concentração do substrato no reator, que será constante no estado
estacionário.
Como mostrado pela fórmula 2, se o substrato estiver abaixo do nível da taxa
de crescimento predita pela taxa de diluição, pode ocorrer que a taxa de crescimento
será menor que a taxa de diluição e as células serão eluídas do reator (wash out)
numa taxa maior do que a taxa de sua produção, resultando na diminuição na
concentração de biomassa desse microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL,
1995).
Como exemplo genérico de um processo de isolamento usando cultivo
contínuo temos a Figura 12, em que temos dois microrganismos em cultivo contínuo,
onde, se a taxa de diluição for menor do que a do ponto Y, o organismo B se
desenvolverá mais, mas quando a taxa de diluição é maior, temos o organismo A se
desenvolvendo preferencialmente. Portanto, o cultivo será limitado pelo substrato,
podendo ser obtidos microrganismos que não seriam detectados durante o cultivo
em batelada.
Os organismos obtidos através do cultivo em batelada ou em placas de Petri
podem muitas vezes não se adaptar ao cultivo contínuo, sendo mais vantajoso fazer
20
o isolamento diretamente através do cultivo contínuo para selecionar aqueles já
adaptados para essa condição quando deseja-se desenvolver um processo em
sistema contínuo.
Figura 1- Efeito da concentração do substrato na taxa de crescimento de dois
microrganismos.
Fonte: STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995.
Essa técnica é bastante utilizada na seleção de microrganismos para a
produção de biomassa, mas também já foi usada para o isolamento de bactérias
produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).
21
6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS
Ao fazer o isolamento das culturas, não só de bactérias, mas também de
outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com
instrumentos estéreis.
Bactérias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de
um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam ágar suplementado com
extratos na concentração de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de
infusões feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras,
troncos, detritos). Podem ser usados também alguns meios seletivos como ágar
sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey (DEMAIN and DAVIES, 1999).
7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS
Actinomicetos são bactérias filamentosas que fazem parte da maioria dos
substratos naturais. Não é difícil isolar actinomicetos de amostras que também
contém fungos devido às suas propriedades fisiológicas distintas. O uso de
antibióticos e antifúngicos também auxilia no isolamento, como mostra a tabela 4.
Tabela 4- Antibióticos usados e microrganismos alvo que são inibidos
Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.
Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias
para formarem colônias definidas quando incubadas à temperatura de 65-80ºC
(DEMAIN and DAVIES, 1999). O crescimento desses microrganismos também é
favorecido quando há no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 5:
22
Tabela 5- Substâncias que estimulam o desenvolvimento de actinomicetos em geral
e actinomicetos produtores de antibióticos
Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.
El-Nakeeb e Lechevalier compararam meios de cultivo no isolamento de
actinomicentos. Pela tabela 6 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos
variando a fonte de carbono e nitrogênio e o tipo de meio utilizado.
Tabela 6- Comparação de meio AGS com meio de chitin e efeito das fontes de
carbono e nitrogênio no meio*
Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.
23
8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS
Fungos podem ser isolados de diversos materiais. Devido à sua preferência
por substratos que também forneçam suporte para o seu crescimento, eles são
freqüentemente encontrados em matéria em decomposição, plantas, rochas e solo.
Em uma planta, por exemplo, dependendo do tecido que for coletado, pode-se
encontrar diferentes tipos de fungos.
Esses microrganismos também são bastante variados, e a mudança de
somente um dos constituintes de um meio de cultivo pode resultar no isolamento de
um fungo diferente. Para a seleção de um meio, deve-se considerar as condições
físicas do meio de origem e o tipo de fungo que se deseja. A luminosidade também é
um fator importante às vezes, pois alguns fungos necessitam de luz para frutificarem
(DEMAIN and DAVIES, 1999).
Macrofungos tem o isolamento facilitado, pois é possível isolá-los do ambiente
através da coleta de tecidos, esporos ou estruturas vegetativas.
9- CULTURAS PURAS DE ALGAS
Para isolar eficientemente algas, é necessário simular em parte o ambiente
onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade, luminosidade.
Métodos de diluição são bastante indicados nesse caso, uma vez que algas e
microalgas são normalmente encontradas em meio líquido. A filtragem de amostras
e posterior inoculação do filtro em novo meio estéril também é um método utilizado.
10- OUTRAS TÉCNICAS
O avanço da biologia molecular, da genética e da imunologia permitiu o
desenvolvimento de novos métodos de isolamento com o uso de detectores,
enzimas e receptores de determinados microrganismos. Abaixo estão listados
alguns exemplos:
A utilização de organismos testes com sensitividade elevada para
determinado antibiótico podem indicar onde estão os microrganismos
produtores.
24
A clonagem de genes codificantes para enzimas ou receptores usados na
detecção de microrganismos pode fazer com que eles estejam mais
acessíveis em grande escala para a realização dos testes.
O uso de genes repórteres, que codificam substâncias facilmente detectáveis
e que são fusionados com uma seqüência que produz a substância de
interesse.
Sondas moleculares para seqüências de genes particulares podem detectar
microrganismos capazes de produzir certos produtos.
O desenvolvimento de testes imunológicos como a captura por ELISA.
(STANBURY, WHITAKER e HALL, 1995)
Com relação a esse último, a técnica de imunocaptura pode ser utilizada no
isolamento de bactérias. SANTOS e REIS (artigo em anexo 1) utilizaram essa
metodologia para isolar Gluconacetobacter diazotropicus e de bactérias fixadoras de
nitrogênio proveniente do solo. Para o isolamento de G. diazotropicus fez-se uso de
anticorpos anti-Gluconacetobacter diazotropicus fixados em uma microplaca de
poliestireno de 96 poços, onde é colocada a amostra de solo. Após as etapas de
incubação e lavagem, a ligação da bactéria com o anticorpo foi quebrada com a
adição de KCl 0,1M. A desvantagem dessa técnica é que é necessário o
conhecimento prévio do microrganismo que se deseja isolar e deve-se fazer o
inóculo de suas células mortas em cobaias como coelhos para a produção de
anticorpos.
As técnicas de micromanipulação também podem ser utilizadas para o
isolamento, apesar de serem mais caras devido aos equipamentos. Com o uso de
objetivas de longa distância com uma grande magnificação, é possível coletar uma
única célula microbiana através de tubos microcapilares, que irão aspirar a bactéria
e depois depositá-la em uma outra superfície de ágar ou em um meio líquido (para
mais, ver artigo em anexo 2).
Existe também a possibilidade de utilizar a citometria de fluxo para separar
células de microrganismos. Essa técnica utiliza anticorpos marcados, sondas de
nucleotídeos marcadas fluorescentemente ou constituentes celulares que
naturalmente refratam a luz ou emitem fluorescência. A Tabela 1 presente no anexo
3, mostra propriedades de certos microrganismos que podem ser diferenciadas
através da citometria de fluxo, podendo-se então isolar essas células.
25
11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p.
DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prático de Microbiologia de
Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante.
CEFET/PR – Unidade de Medianeira, 2001.
EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic
actinomycetes. Appl. Microbiol., Vol. 11, p. 75-77, 1963.
FRÖHLICH, J.; KÖNIG, H. New techniques for isolation of single prokaryotic
cells. FEMS Microbiology Reviews, 24, p. 567-572, 2000.
GREENE, V. W.; VERSLEY, D.; KEENAN, K. M. New Method for Microbiological
Sampling of Surfaces. J. Bacteriol., Vol. 84, p.188-189, 1962.
KATSURAGI, T.; TANI, Y. Screening for Microorganisms with Specific
Characteristics by Flow Cytometry and single-Cell Sorting. Journal of bioscience
and Bioengineering, Vol. 89, No. 3, p. 217-222, 2000.
LECLERC, H.; IZARD, D.; HUSSON, M.-O.; WATTRE, P.; JAKUBCZAK, E.
Microbiologie Générale. Doin Éditeurs, Paris, 1983. 369 p.
OGUNSEITAN, O. Microbial Diversity – Form and Function in Prokaryotes.
Blackwell Publishing, Oxford, 2005, 292 p.
PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The
McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.
ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de Microbiologia –
Volume 1. Editora Manole Ltda., São Paulo, 1988, 186p.
26
SANTOS, C. C. R.; REIS, V. M. Desenvolvimento do Método de Imunocaptura de
Bactérias para Aplicação em Solo Argiloso. EMBRAPA, Comunicado Técnico 64,
ISSN 1517-8862, Março 2004, Seropédica, RJ.
STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation
Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357
p.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ª
reimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.
27
12- ANEXOS
ANEXO 1
DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE IMUNOCAPTURA DE BACTÉRIAS PARA
APLICAÇÃO EM SOLO ARGILOSO
CARLA CRISTIANE ROCHA DOS SANTOS e VERÔNICA MASSENA REIS
28
ANEXO 2
NEW TECHNIQUES FOR ISOLATION OF SINGLE PROKARYOTIC CELLS
JÜRGEN FRÖHLICH and HELMUT KÖNIG
29
ANEXO 3
SCREENING FOR MICRORGANISMS WITH SPECIFIC CHARACTERISTICS BY
FLOW CYTOMETRY AND SINGLE-CELL SORTING
TOHORU KATSURAGI and YOSHIKI TANI