ISO 6579 TC

Padrão Internacional ISO 6579

4ª. Edição (15/07/2002)

Microbiologia de Alimentos para consumo humano e

de animais – Método Horizontal para detecção de

Salmonella spp.

Número de referência: ISO 6579:2002 (E)

2

Conteúdo

Prefácio................................................................................................................3

Introdução............................................................................................................4

1 Escopo..............................................................................................................5

2 Referências Normativas....................................................................................5

3 Termos e Definições.........................................................................................6

4 Princípios..........................................................................................................6

4.1 Geral .............................................................................................................6

4.2 Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo ........................................7

4.3 Enriquecimento em meio líquido seletivo .....................................................7

4.4 Plaqueamento e identificação .......................................................................7

4.5 Confirmação da identidade ...........................................................................7

5 Meios de cultura, reagentes e soros ...............................................................8

5.1 Geral .............................................................................................................8

5.2 Meios de cultura e reagentes ........................................................................8

5.3 Soros .............................................................................................................9

6 Equipamentos e vidraria ..................................................................................9

7 Amostragem .....................................................................................................10

8 Preparação das amostras de teste ..................................................................10

9 Procedimento (Veja diagrama no Anexo A) .....................................................11

9.1 Parte do teste e suspensão inicial ................................................................11

9.2 Pré-enriquecimento não seletivo ..................................................................12

9.3 Enriquecimento seletivo.................................................................................12

9.4 Plaqueamento e identificação........................................................................12

9.5 Confirmação...................................................................................................13

10 Expressão de resultados.................................................................................19

11 Reporte do teste..............................................................................................19

12 Garantia da Qualidade.....................................................................................19

Anexo A (normativa) Diagrama de Procedimento ................................................20

Anexo B (normativa) Composição e preparação de meios de cultura e reagentes... ...............................................................................................................................21

Anexo C (informativo) Resultados de ensaios interlaboratoriais ..........................34

Bibliografia ............................................................................................................39

3

Prefácio

ISO (a Organização Internacional para Padronização) é uma federação mundial

de órgãos nacionais de padronização (organismos membros da ISO). O

trabalho de elaboração das Normas Internacionais é geralmente realizado

através de comitês técnicos da ISO. Cada organismo membro interessado em

um assunto para o qual um comitê técnico foi estabelecido tem o direito de ser

representado no comitê. Organizações internacionais, governamentais e não-

governamentais, em ligação com a ISO, também tomam parte do trabalho. A

ISO colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (CEI -

IEC) em todos os assuntos de normalização eletrotécnica.

Normas Internacionais são elaboradas de acordo com as regras estabelecidas

nas diretivas ISO / IEC, Parte 3.

A principal tarefa de comitês técnicos é preparar Padrões Internacionais. Os

projetos de Padrões Internacionais aprovados pelos comités técnicos são

distribuídos aos organismos membros para votação. A publicação como

Padrão Internacional exige aprovação de pelo menos 75% dos organismos

membros com direito a voto.

Atenção para a possibilidade de que alguns dos elementos do presente Padrão

Internacional pode ser objeto de direitos de patente. A ISO não deve ser

considerada responsável pela identificação de quaisquer direitos de patente.

A ISO 6579 foi preparada pelo Comitê Técnico ISO/TC 34, Produtos

Alimentícios, Subcomitê SC 9, Microbiologia.

Esta quarta edição cancela e substitui a terceira edição (ISO 6579: 1993), que

foi tecnicamente revisada.

Os anexos A e B formam a parte normativa deste Padrão Internacional. O

anexo C é somente para informação.

4

Introdução

Por causa da grande variedade de alimentos para consumo humano e animal,

este método horizontal pode não ser apropriado em cada detalhe para

determinados produtos. Neste caso, métodos diferentes, que sejam específicos

para estes produtos, podem ser utilizados se absolutamente necessário por

questões técnicas justificadas. No entanto, toda atenção deve ser dada para

aplicar este método horizontal, tanto quanto possível.

Quando esta Norma Internacional estiver próximo de ser revisada, serão

levadas em consideração todas as informações então disponíveis,

considerando a extensão em que este método horizontal tem sido seguido e as

razões para desvios deste método em caso de produtos distintos.

A harmonização dos métodos de ensaios não pode ser imediata, e para certos

grupos de produtos, Padrões Internacionais e/ou padrões nacionais podem já

existir e não estar de acordo com este método horizontal. Espera-se que

quando tais normas sejam revisadas elas serão modificadas para estarem em

conformidade com este Padrão Internacional e que, eventualmente, somente

partidas restantes deste método horizontal sejam necessárias para estabelecer

o método.

5

Microbiologia de Alimentos para consumo humano e de animais –

Método Horizontal para detecção de Salmonella spp.

AVISO - A fim de preservar a saúde do pessoal de laboratório, é essencial que

os testes para a detecção de Salmonella, em especial Salmonella Typhi e

Salmonella Paratyphi, só sejam realizados em laboratórios equipados

corretamente, sob o controle de um microbiologista qualificado, e que um

grande cuidado seja tomado na eliminação de todos os materiais incubados.

1 Escopo

Este Padrão Internacional especifica um método horizontal para a detecção de

Salmonella, incluindo Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi.

Sujeito às limitações discutidas na Introdução, esta Norma é aplicável a:

- produtos destinados ao consumo humano e à alimentação de animais

- amostras ambientais na área de produção de alimentos e manipulação de

alimentos

AVISO – O método pode não recuperar todas as cepas de Salmonella Typhi e

Paratyphi.

2 Referências Normativas

Os seguintes documentos normativos contêm disposições que, ao serem

citadas neste texto, constituem prescrições para este Padrão Internacional.

Para referências datadas, as emendas subseqüentes ou revisões de qualquer

uma destas publicações não se aplicam. No entanto, as partes em acordos

baseados no presente Padrão Internacional são encorajadas a investigar a

possibilidade de aplicarem as edições mais recentes dos documentos

normativos indicados abaixo. Para referências não datadas, a última edição do

documento normativo referido se aplica. Os membros da ISO e IEC mantém

registos de Padrões Internacionais atualmente válidos.

ISO 6887-1, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal -

Preparação de amostras de teste, suspensão inicial e diluições decimais para

análise microbiológica - Parte 1: Regras gerais para a elaboração da

suspensão inicial e das diluições decimais.

6

ISO 7218:1996, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal –

Regras Gerais para análises microbiológicas.

ISO 8261, Leite e produtos lácteos – Guia geral para a preparação de amostras

de teste, suspensões iniciais e diluições decimais para análise microbiológica

3 Termos e Definições

Para as propostas deste Padrão Internacional, os seguintes termos e

definições se aplicam.

3.1

Salmonella

microorganismos que formam colônias típicas ou menos típicas em meios

sólidos seletivos e que exibem as características bioquímicas e sorológicas

descritas quando os testes são realizados em conformidade com o presente

Padrão Internacional.

3.2

Detecção de Salmonella

determinação da presença ou ausência de Salmonella (3.1), em uma massa ou

volume particular do produto, quando testes são realizados em conformidade

com este Padrão Internacional.

4 Princípios

4.1 Gerais

A detecção de Salmonella necessita de quatro estágios sucessivos (veja

também Anexo A).

NOTA – A Salmonella pode estar presente em pequenos números de colônias

e são frequentemente acompanhadas por números consideravelmente maiores

de outros micro organismos da família Enterobacteriaceae ou outras famílias.

Além disso, o pré-enriquecimento é necessário para permitir a detecção de

baixos números de Salmonella ou células injuriadas de Salmonella.

7

4.2 Pré-enriquecimento em meio líquido não seletivo

A amostra teste é inoculada a temperatura ambiente em água peptonada

tamponada e, então, incubada a 37°C ± 1 °C por 18h ± 2h.

Para certos alimentos, o uso de outros procedimentos de pré-enriquecimentos

é necessário. Veja 9.1.2.

Para grandes quantidades, a água peptonada tamponada deve ser aquecida a

37 °C ± 1 °C antes da inoculação com a amostra teste.

4.3 Enriquecimento em meio líquido seletivo

O meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS) e caldo Muller-Kauddmann

tetrationato/novobiocina (caldo MKTTn) são inoculados com a cultura obtida em

4.2.

O caldo RVS é incubado a 41,5°C ± 1 °C por 24h ± 3h e o caldo MKTTn a 37

°C ± 1 °C por 24 h ± 3 h.

4.4 Plaqueamento e identificação

Para as culturas obtidas em 4.3, dois meios sólidos seletivos são inoculados:

- Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Ágar XLD)

- Algum outro meio sólido seletivo complementar ao Agar XLD e especialmente

apropriado para o isolamento de cepas de Salmonella lactose-positivo e

Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi; o laboratório pode escolher qual

meio usar.

O Agar XLD é incubado a 37 °C ± 1 °C e avaliado após 24 h ± 3 h. O secundo

Agar seletivo é incubado de acordo com as recomendações do fabricante.

NOTA – Para informação, o Agar Verde Brilhante (AVB), Agar Bismuto Sulfito,

etc., podem ser usados como o segundo meio de plaqueamento.

4.5 Confirmação de identidade

Colônias de Salmonella presuntivas são subcultivadas, então plaqueadas como

descrito em 4.4, e sua identidade é confirmada por meio de testes bioquímicos

e sorológicos apropriados.

8

5 Meios de cultura, reagentes e soro

5.1 Geral

Para práticas laboratoriais atuais, veja ISO 7218.

5.2 Meios de cultura e reagentes

NOTA - Por causa do grande número de meios de cultura e reagentes, é

considerado preferível, por clareza, dar suas composições e preparações no

Anexo B.

5.2.1 Meios de pré-enriquecimento não seletivo: água peptonada

tamponada

Veja B.1.

5.2.2 Primeiro meio de enriquecimento seletivo: meio Rappaport-

Vassiliadis com soja (caldo RVS).

Veja B.2.

5.2.3 Secundo meio de enriquecimento seletivo: caldo Muller-Kauffman

tetrationato novobiocina (caldo MKTTn)

Veja B.3.

5.2.4 Meio sólido seletivo de plaqueamento

5.2.4.1 Primeiro meio: Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Agar XLD)

Veja B.4.

5.2.4.2 Segundo meio

A escolha do segundo meio apropriado é deixada ao critério do laboratório de

teste. As instruções do fabricante devem ser precisamente seguidas

considerando seu preparo para uso.

5.2.5 Agar nutriente

Veja B.5.

5.2.6 Agar Açúcar /ferro triplo (Agar TSI)

Veja B.6

5.2.7 Agar Uréia (Christensen)

Veja B.7.

9

5.2.8 Meio Descarboxilação L-Lisina

Veja B.8

5.2.9 Reagente para detecção de β-galactosidase (ou preparados de

discos de papel utilizados conforme as instruções do fabricante.

Veja B.9

5.2.10 Reagentes para reação Voges-Proskauer (VP)

Veja B.10

5.2.11Reagentes para reação Indol

Veja B.11

5.2.12 Agar nutriente semi-sólido

Veja B.12

5.2.13 Solução salina fisiológica

Veja B.13

5.3 Soros

Vários tipos de soros aglutinantes contendo anticorpos para um ou vários

Antígenos-O estão disponíveis comercialmente; isto é, anti-soros contendo um

ou mais grupos "O" (chamado soro monovalente ou polivalente anti-O), soro

anti-Vi e anti-soros contendo anticorpos para um ou vários fatores H (chamado

soro monovalente ou polivalente anti-H).

Cada tentativa deve ser feita para garantir que os anti-soros utilizados são

adequados para fornecer para a detecção de todos os sorotipos de Salmonella.

Assistência para este objetivo pode ser obtido utilizando apenas os anti-soros

preparados por um fornecedor reconhecido como competente (por exemplo,

por uma agência governamental apropriada).

6 Equipamentos e Vidrarias

Aparelho descartável é uma alternativa aceitável para vidrarias reutilizáveis, se

ele tem as especificações adequadas. Equipamentos usuais de laboratório de

microbiologia (ver ISO 7218) e, em particular, o seguinte

10

6.1 Equipamento para esterilização a seco (estufa) ou esterilização úmida

(autoclave)

Veja ISO 7218.

6.2 Cabine de secagem ou estufa, ventilado por convecção, capaz de operar

entre 37 °C e 55 °C.

6.3 Incubadora, capaz de operar a 37 °C ± 1 °C

6.4 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 41,5°C ± 1°C, ou

incubadora, capaz de operar a 41,5 °C ± 1 °C

6.5 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 44°C a 47°C

6.6 Banho de água (Banho Maria), capaz de operar a 37°C ± 1 °C

É recomendado usar um banho de água (6.4, 6.5 e 6.6) contendo um agente

antibacteriano por causa da baixa dose infecciosa de Salmonella.

6.7 Alças estéreis, de aproximadamente 3 mm de diâmetro ou 10 µl ou

pipetas estéreis.

6.8 pHmetro tendo uma precisão de calibração de ± 0,1 unidade de pH de

20°C a 25 °C

6.9 Tubos de ensaio ou frascos de capacidade apropriada

Garrafas ou frascos com roscas metálicas não tóxicas ou de plástico podem

ser utilizados

6.10 Pipetas graduadas ou pipetas automáticas de capacidade nominal de

10mL e 1mL graduados respectivamente em divisões de 0,5mL e 0,1mL.

6.11 Placas de Petri, de tamanho pequeno (diâmetro de 90mm a 100mm) e/ou

tamanho maior (140mm).

7 Amostragem

É importante que o laboratório receba uma amostra que é verdadeiramente

representativa e não tenha sido danificada ou alterada durante o transporte ou

armazenamento.

A amostragem não é parte do método especificado neste Padrão Internacional.

Veja o Padrão Internacional específico que lida com o produto em questão. Se

não há um Padrão Internacional específico, é recomendado que as partes

interessadas cheguem a um acordo sobre este assunto.

11

8 Preparação da amostra de teste

Preparar a amostra de teste de acordo com o Padrão Internacional específico

que lida com o produto em questão. Se não houver Padrão Internacional

específico, é recomendável que as partes envolvidas cheguem a um acordo

sobre este assunto.

9 Procedimento (Veja diagrama Anexo A)

9.1 Parte do teste e suspensão inicial

9.1.1 Geral

Veja ISO 6887-1 e o Padrão Internacional específico que lida com o produto

em causa. Ver ISO 8261 para o leite e produtos lácteos.

Para a preparação da suspensão inicial, no caso geral, usar como como

diluente o meio de pré-enriquecimento especificado em 5.2.1(água peptonada

tamponada) e item 4.2.

Se a massa especificada da porção de teste é diferente de 25 g, utilizar a

quantidade necessária de meio de pré-enriquecimento para produzir uma

diluição 1/10.

Para reduzir o volume de trabalho de análise quando uma porção maior que

25g de um lote específico de alimento tem que ser analisado e quando existem

evidências de que a composição (junção das porções de teste) não afeta o

resultado para aquele particular alimento, as porções do teste podem ser

compostas. Por exemplo, se 10 partes do teste de 25 g estão para ser

analisados, combinar as 10 unidades para formar uma porção de teste

composta de 250 g e adicionar 2,25L de caldo de pré-enriquecimento.

Alternativamente, a porção de 0,1mL (em 10mL de caldo RVS) e 1 mL (em 10

mL de caldo MKTTn) do caldo de pré-enriquecimento a partir das 10 porções

de testes separados (ver 9.3.1) pode ser composta para o enriquecimento em

100 mL de meio de enriquecimento seletivo.

9.1.2 Preparações específicas da suspensão inicial para certos alimentos

NOTA - As seguintes preparações específicas dizem respeito apenas ao caso

de Salmonella. Preparações específicas aplicáveis para a determinação de

quaisquer microorganismos são descritas nas normas ISO 6887-2, ISO 6887-3,

6887-4 ISO e ISO 8261.

12

9.1.2.1 Cacau e produtos que contenham cacau (i.e., mais que 20%)

Adicionar à água peptonada tamponada (5.2.1), de preferência 50 g/L de

caseína (evitar o uso de caseína ácida), ou 100 g/L de leite em pó desnatado

estéril e adicionar, após cerca de 2 h de incubação, 0,018 g/L de Verde

Brilhante se o alimento é susceptível de ser altamente contaminada com

microbiota Gram-positivo.

9.1.2.2 Alimentos ácidos e acidificantes

Assegurar que o pH não cai para baixo de 4,5 durante o pré-enriquecimento.

NOTA - O pH dos alimentos ácidos e acidificantes é mais estável se a água

peptonada tamponada em concentração dupla é usada.

9.2 Pré-enriquecimento não seletivo

Incubar a suspensão inicial (9.1) a 37°C ± 1 °C por 18 h ± 2 h.

9.3 Enriquecimento seletivo

9.3.1 Transferir 0,1mL da cultura obtida em 9.2 para o tudo contendo 10mL de

caldo RVS (5.2.2). Transferir 1mL da cultura obtida em 9.2 ao tubo contendo

10mL de caldo MKTTn (5.2.3).

9.3.2 Incubar o caldo RVS inoculado (9.3.1) a 41,5°C ± 1°C por 24h ± 3h e o

caldo MKTTn inoculado a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h. Cuidado deve ser dado

para que o máximo da temperatura de incubação (42,5°C) não seja excedido.

9.4 Plaqueamento e identificação

9.4.1 Após incubação durante 24h ± 3h, usar a cultura obtida no caldo RVS

(9.3.2), inocular por meio de uma alça (6.7) na superfície de uma placa de Petri

de maior tamanho (6.11) contendo o primeiro meio de plaqueamento seletivo

(Agar XLD,veja 5.2.4.1), de modo que colônias bem isoladas serão obtidas.

Na ausência de grandes placas, utilizar duas pequenas placas, um após a

outra, usando a mesma alça.

Proceder da mesma forma com o segundo meio seletivo de plaqueamento

(5.2.4.2), utilizando uma alça estéril e placas de Petri como descrito acima.

9.4.2 Após incubação por 24h ± 3h, usar a cultura obtida no caldo MKTTn

(9.3.2), repetir o procedimento descrito em 9.4.1 com os dois meios seletivos

de plaqueamento.

13

9.4.3 Inverta as placas (9.4.1 e 9.4.2) para que o fundo fique no alto e colocá-

los então na incubadora (6.3) regulada a 37°C para o primeiro meio de plaqueamento (5.2.4.1). As instruções do fabricante devem ser seguidas para o segundo meio de plaqueamento (5.2.4.2).

9.4.4 Após incubação por 24h ± 3h, analisar as placas (9.4.3) para a presença

de colônias típicas de Salmonella e colônias atípicas que podem ser

Salmonella (veja nota). Marcar a sua posição sobre o fundo da placa.

As colônias típicas de Salmonella cultivadas em ágar XLD tem um centro negro

e uma zona ligeiramente transparente de cor avermelhada devido à mudança

de cor do indicador.

NOTA – Variantes de Salmonella H2S negativo (por exemplo, S. Paratyphi A)

cultivadas em Agar XLD são cor de rosa com um centro rosa escuro.

Salmonella Lactose-positivo cultivadas em Agar XLD são de cor amarela, com

ou sem o escurecimento.

Incubar o segundo meio sólido seletivo à temperatura apropriada e analisar

após o tempo apropriado para verificar a presença de colónias que, por suas

características, são consideradas presuntivas para Salmonella.

9.5 Confirmação

9.5.1 Geral

Se demonstrado que são confiáveis, kits de identificação comercialmente

disponíveis podem ser usados para a análise bioquímica de Salmonella. A

utilização de kits de identificação diz respeito à confirmação bioquímica de

colônias. Estes kits devem ser usado seguindo as instruções do fabricante.

NOTA - O reconhecimento de colônias de Salmonella é uma questão de

experiência, e sua aparência pode variar um pouco, não só de sorotipo a

sorotipo, mas também de lote a lote do meio de cultura seletivo utilizado.

9.5.2 Seleção de colônias para confirmação

Para confirmação, tirar de cada placa (duas placas pequenas ou uma placa

grande) de cada meio seletivo (veja 9.4), pelo menos uma colônia considerada

típica ou suspeita e mais quatro colônias se a primeira é negativa. É

recomendado que pelo menos cinco colônias sejam identificadas no caso de

estudos epidemiológicos. Se sobre uma placa existirem menos de cinco

colônias típicas ou suspeitas, isolar para confirmação todas as colônias típicas

ou suspeitas.

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Estriar as colônias selecionadas sobre a superfície de placas pré-secas com

ágar nutriente (5.2.5), de maneira que permitirá que colônias bem isoladas se

desenvolvam. Incubar as placas inoculadas (9.4.3) a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h.

Usar culturas puras para confirmação bioquímica e sorológica.

9.5.3 Confirmação bioquímica

9.5.3.1 Geral

Por meio de uma alça de inoculação, inocular os meios especificados em

9.5.3.2 a 9.5.3.7 com cada uma das culturas obtidas a partir das colônias

selecionadas em 9.5.2.

9.5.3.2 Agar TSI (5.2.6)

Estriar a superfície inclinada do Agar e perfurar o fundo. Incubar a 37°C ± 1°C

por 24h ± 3h.

Interpretar as alterações no meio como se seguem.

a) Fundo (base)

- Amarelo Glicose positivo (glucose utilizada)

- Vermelho ou inalterado Glicose negativo (glicose não utilizada)

- Negro Formação de sulfeto de hidrogênio

- Bolhas ou rachaduras Formação de gás da glicose

b) Superfície inclinada

- Amarelo Lactose e/ou sacarose positivo

(Lactose e/ou sacarose utilizada)

- Vermelho ou inalterado Lactose e sacarose não utilizada (Nem

lactose nem sacarose utilizadas).

Culturas típicas de Salmonella apresentam superfície inclinada alcalina

(vermelho) e ácida (amarelo) no fundo com formação de gás (bolhas) e (cerca

de 90% dos casos) a formação de sulfeto de hidrogénio (escurecimento do

ágar) (9.5.3.8).

Quando uma Salmonella lactose-positivo é isolada (veja 4.4), a inclinação em

TSI é amarela. Assim, a confirmação preliminar de culturas de Salmonella não

deve ser baseada nos resultados do teste de Agar TSI somente (ver 9.5.3).

9.5.3.3 Agar Uréia (5.2.7)

Estriar a superfície inclinada do Agar. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h e

analisar em intervalos regulares.

Se a reação for positiva, a quebra da uréia libera amônia, que muda a cor do

vermelho de fenol para rosa-pink e mais tarde para cor de cereja profunda. A

reação é frequentemente aparente após 2h para 4h.

15

9.5.3.4 Meio de descarboxilação de L-Lisina (5.2.8)

Inocular logo abaixo da superfície do meio líquido. Incubar a 37°C ± 1°C por

24h ± 3h.

A turbidez e uma cor púrpura, após incubação, indica uma reação positiva. A

cor amarela indica uma reação negativa.

9.5.3.5 Detecção de β-galactosidase (5.2.9)

Suspender uma alça cheia de colônias suspeitas em um tubo contendo 0,25

mL de solução salina (5.2.13).

Adicione 1 gota de tolueno e agitar o tubo. Colocar o tubo num banho de água

(6.6) a 37°C e deixar durante vários minutos (aproximadamente 5 min).

Adicionar 0,25 mL do reagente para a detecção de β-galactosidase e misturar.

Substituir o tubo em banho de água regulado a 37°C e deixar por 24h ± 3h,

examinando o tubo em intervalos regulares.

A cor amarela indica uma reação positiva. A reação é frequentemente aparente

após 20 min.

Se discos de papel preparados (5.2.9) são utilizados, seguir as instruções do

fabricante.

9.5.3.6 Meio para reação de Voges-Proskauer (VP) (5.2.10)

Suspender uma alça cheia de colônias suspeitas num tubo estéril contendo 3

mL do meio VP.

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24h ± 3h.

Após a incubação, adicionar duas gotas da solução de creatina, três gotas da

solução alcóolica de 1-naftol e, em seguida, duas gotas de solução de

hidróxido de potássio; agitar após a adição de cada reagente.

A formação de uma cor rosa a cor vermelho brilhante dentro de 15 minutos

indica uma reação positiva.

9.5.3.7 Meio para reação Indol (5.2.11)

Inocular um tubo contendo 5 mL do meio de triptona/triptofano com a colônia

suspeita. Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h. Após a incubação, adicionar 1 mL

do reagente de Kovacs.

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A formação de um anel vermelho indica uma reação positiva. Um anel amarelo-

marrom indica uma reação negativa.

9.5.3.8 Interpretação de testes bioquímicos

Salmonella geralmente apresenta as reações mostradas na Tabela 1.

9.5.4 Confirmação sorológica e sorotipagem

9.5.4.1 Geral

A detecção da presença de antígenos O, Vi e H de Salmonella é testada por

aglutinação com o soro adequado, a partir de colônias puras (9.5.2) e após

cepas auto-aglutináveis terem sido eliminadas. Utilizar o anti-soro de acordo

com as instruções do fabricante se for diferente da descrição a seguir.

9.5.4.2 Eliminação de cepas auto-aglutináveis

Colocar uma gota da solução salina (5.2.13) cuidadosamente numa lâmina de

vidro limpa. Dispersar na gota, por meio de uma alça (6.7), parte da colónia a

ser testada, de forma a obter uma suspensão homogénea e turva.

NOTA - É possível também dispersar parte da colónia a ser testada em uma

gota de água, e em seguida, misturar a solução com uma gota de solução

salina (5.2.13).

Balançar a lâmina suavemente por 30 a 60s. Observar o resultado contra um

fundo escuro, de preferência com o auxílio de um lupa.

Se as bactérias estiverem agregadas em unidades mais ou menos distintas, a

cepa é considerada como auto-aglutinável e não deve ser submetida aos

seguintes testes como a detecção dos antígenos não é possível.

17

Tabela 1. Interpretação de testes bioquímicos

Testea (9.5.3.2 a

9.5.3.7)

Cepa Salmonella

S. Typhi S. Paratyphi

A S. Paratyphi

B S. Paratyphi

C Outras cepas

Reação %b Reação %

b Reação %

c Reação %

c Reação %

b

TSI ácido de glicose

+ 100 + 100 + + + 100

TSI gás de glicose

-d 0 + 100 + + + 92

TSI ácido de lactose

- 2 - 100 - - - 1

TSI ácido de sacarose

- 0 - 0 - - - 1

TSI sulfeto de hidrogênio produzido

+ 97 - 10 + + + 92

Hidrólise de uréia

- 0 - 0 - - - 1

Descarboxilação de Lisina

+ 98 - 0 + + + 95

Reação β-galactosidase

- 0 - 0 - - - 2e

Reação Voges-Proskauer

- 0 - 0 - - - 0

Produção de Indol

- 0 - 0 - - - 1

a Referência [5]

b Esses percentuais indicam que nem todos os isolados do sorotipo Salmonella

mostram as reações marcadas como + ou -. Estas percentagens podem variar

entre e dentro dos sorotipos advindos de sorotipos de intoxicação alimentar a

partir de diferentes locais.

c Os percentuais não são conhecidos na literatura disponível

d Salmonella Typhi é anaerogênica

e A Salmonella enterica subespécie arizonae dá uma reação lactose positivo ou

negativo, mas é sempre β-galactosidase positivo. Para o estudo destas cepas

isto pode ser útil para realizar testes complementares.

9.5.4.3 Análise de antígenos O

Usando uma colônia pura não-autoaglutinante, proceder de acordo com

9.5.4.2, utilizando uma gota do soro anti-O (5.3) ao invés da solução salina

(5.2.13).

Se aglutinação ocorrer, a reação é considerada positiva.

Utilizar os soros poli e monovalentes um após o outro.

18

9.5.4.4 Análise de antígenos Vi

Proceder de acordo com 9.5.4.2, mas utilizando uma gota de soro anti-Vi (5.3)

ao invés da solução salina.


9.5.4.5 Análise de antígenos H

Inocular o ágar nutriente semi-sólido (5.2.12) com uma colônia não auto-

aglutinável. Incubar o meio a 37°C ± 1°C por 24h ± 3h.

Utilize esta cultura para análise de antígenos H, procedendo de acordo com

9.5.4.2, mas usando uma gota de soro anti-H (5.3) ao invés da solução salina.


9.5.5 Interpretação das reações bioquímicas e sorológicas

Tabela 2 dá a interpretação de testes confirmatórios (9.5.3 e 9.5.4) realizados

sobre as colônias utilizadas (9.5.2).

Tabela 2. Interpretação de testes confirmatórios

Reações bioquímicas

Auto-aglutinação Reações sorológicas

Interpretação

Típicas Não Antígeno O, H ou Vi positivo

Cepas consideradas como Salmonella

Típicas Não Todas reações negativas

Podem ser Salmonella

Típicas Sim Não testado (veja 9.5.4.2)

Reações não típicas Não/Sim Antígeno O, H ou Vi positivo

Reações não típicas Não/Sim Todas reações negativas

Não consideradas como Salmonella

9.5.6 Confirmação definitiva

As cepas que são considerados como Salmonella, ou que podem ser

Salmonella (veja Tabela 2), devem ser enviadas para um

reconhecido centro de referência para Salmonella tipificação definitiva.

19

Esta processo deve ser acompanhado de todas as informações possíveis

sobre a cepa (s) e se trata-se de um surto ou alimento.

10. Expressão dos resultados

Em conformidade com os resultados da interpretação, indicar a presença ou

ausência de Salmonella na porção de teste de x g ou x mL do produto (veja

ISO 7218).

Veja o anexo C para a precisão dos dados obtidos de ensaios

interlaboratoriais.

11. Reporte dos resultados

O reporte dos testes deve especificar:

- o método de amostragem utilizado, se conhecido;

- qualquer desvio no meio de enriquecimento ou nas condições de incubação

utilizadas

- todas as condições operacionais não especificadas neste Padrão

Internacional, ou considerado como opcional, juntamente com os detalhes de

quaisquer incidentes que possam ter influenciado os resultados

- os resultados obtidos

O relatório deverá indicar também se um resultado positivo foi obtido usando

um meio de plaqueamento (5.2.4) não especificado neste Padrão Internacional.

12. Garantia da Qualidade

Para verificar a capacidade do laboratório para detectar Salmonella com os

métodos e os meios descritos no presente Padrão Internacional, introduzir

amostras de referência dentro de frascos-controle contendo meio de pré-

enriquecimento (veja 5.2.1). Proceder com os frascos-controle como para as

culturas de teste.

20

Anexo A

(Normativa)

Diagrama de procedimento

21

Anexo B

(Normativa)

Composição e preparação dos meios de cultura e reagentes

B.1 Água peptonada tamponada

B.1.1 Composição

Digestão enzimática de caseína 10,0g

Cloreto de sódio 5,0g

Fosfato de hidrogênio dissódio Dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9,0g

Fosfato dihidrogênio de potássio (KH2PO4) 1,5g

Água 1.000mL

B.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 7,0 ±

0,2 a 25°C.

Dispensar o meio em frascos (6.9) de capacidade adequada para se obter as

porções necessárias para o teste.

Esterilizar por 15 minutos em autoclave (6.1) a 121° C.

B.2 Meio Rappaport-Vassiliadis com soja (caldo RVS)

B.2.1 Solução A

B.2.1.1 Composição

Digestão enzimática de soja 5,0g

Cloreto de sódio 8,0g

Fosfato dihidrogênio de potássio (KH2PO4) 1,4g

Fosfato de hidrogênio dipotássio (K2HPO4) 0,2g

Água 1.000mL

22

B.2.1.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, aquecer a 70 °C, se necessário.

A solução deve ser preparada no dia da preparação do meio RVS completo.

B.2.2 Solução B


Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2.6H2O) 400g

Água 1.000mL


Dissolve-se o cloreto de magnésio em água.

Como este sal é muito higroscópico, é aconselhável dissolver todo o conteúdo

de MgCl2.6H2O a partir de um recipiente recém-aberto, de acordo com a

fórmula. Por exemplo, 250g de MgCl2.6H2O é adicionado a 625 mL de água,

dando uma solução de volume total de 788mL e uma concentração em massa

de cerca de 31,7g por 100mL de MgCl2.6H2O.

A solução pode ser mantida num frasco de vidro escuro bem fechado com

tampa à temperatura ambiente durante pelo menos 2 anos.

B.2.3 Solução C


Oxalato verde de malaquita 0,4g

Água 100mL


Dissolver o oxalato verde de malaquita em água.

A solução deve ser mantida em frasco de vidro escuro à temperatura ambiente

por pelo menos 8 meses.

B.2.4 Meio completo

23


Solução A (B.2.1) 1.000mL

Solução B (B.2.2) 100mL

Solução C (B.2.3) 10mL


Adicionar a 1.000 mL de solução A, 100 mL de solução B e 10mL de solução

C.


0,2.

Antes da utilização, dispensar em tubos de ensaio (6.9) em quantidades de 10

mL.

Esterilizar por 15 min na autoclave (6.1) a 115°C.

Armazene o meio preparado a 3°C ± 2°C. Use o meio no dia de sua

preparação.

NOTA - A composição final do meio é: digestão enzimática de soja, 4,5 g /L;

cloreto de sódio, 7,2 g /L; fosfato dihidrogênio de potássio (KH2PO4 + K2HPO4),

1,44 g /L; cloreto de magnésio anidro (MgCl2), 13,4 g / l ou cloreto de magnésio

hexahidratado (MgCl2. 6H2O), 28,6 g /L; oxalato verde de malaquita, 0036

verde.

B.3 Caldo Muller-Kauffmann tetrationato/novobiocina (MKTTn) [7]

B.3.1 Meio Base


Extrato de carne 4,3g

Digestão enzimática de caseína 8,6g

Cloreto de sódio (NaCl) 2,6g

Carbonato de cálcio (CaCO3) 38,7g

Tiosulfato de sódio pentahidratado (Na2S2O3.5H2O) 47,8g

Bile bovina para uso bacteriológico 4,78g

Verde brilhante 9,6mg

Água 1000mL

24


Dissolver os componentes básicos desidratados ou o meio desidratado

completo na água em ebulição por 5 min.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que esteja em 8,2 ± 0,2 a 25°C.

Misture bem o meio.

O meio base pode ser armazenado por 4 semanas a 3°C ± 2°C

B.3.2 Solução de iodeto-iodo


Iodo 20g

Iodeto de potássio (KI) 25g

Água 100mL


Dissolver completamente o iodeto de potássio em 10 mL de água, então

adicionar o iodo e diluir até 100 mL com água estéril. Não aqueça.

Armazenar a solução preparada no escuro em temperatura ambiente num

recipiente hermeticamente fechado.

B.3.3 Solução de Novobiocina


Sal de novobiocina de sódio 0,04g

Água 5mL


Dissolver o sal de novobiocina de sódio em água e esterilizar por filtração.

Armazenar por até 4 semanas a 3°C ± 2°C.

B.3.4 Meio completo

25


Meio Base (B.3.1) 1.000mL

Solução Iodeto-Iodo (B.3.2) 20mL

Solução Novobiocina (B.3.3) 5mL


Adicionar assepticamente 5 mL da solução de novobiocina (B.3.3) para

1.000mL de meio base (B.3.1). Misture, em seguida adicione 20 mL da solução

de iodeto- iodo (B.3.2). Misture bem.

Dispensar o meio assepticamente em frascos estéreis (6.9) de capacidade

adequada para obter as porções necessárias para o teste.

O meio completo deve ser usado no dia de sua preparação.

B.4 Agar Xilose Lisina Desoxicolato (Agar XLD) [7]

B.4.1 Meio base


Extrato de levedura em pó 3,0g


Xilose 3,75g

Lactose 7,5g

Sacarose 7,5g

Hidrocloreto de L-Lisina 5,0g

Tiosulfato de sódio 6,8g

Citrato amônico de Ferro III 0,8g

Vermelho de fenol 0,08g

Desoxicolato de sódio 1,0g

Ágar 9g a 18g1)

Água 1.000mL

1) Dependendo da força de geleificação do Agar

26


Dissolver os componentes de base desidratados ou a base completa

desidratada em água em aquecimento, com frequente agitação, até que o meio

comece a ferver. Evitar o sobreaquecimento.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 7,4 ± 0,2

a 25°C.

Verter a base nos tubos ou frascos (6.9) de capacidade apropriada.

Aquecer com agitação frequente até que o meio ferva e o ágar se dissolva.

Não sobreaquecer.

B.4.2 Preparação das placas de Agar

Transferir imediatamente para um banho de água (6.5) de 44°C a 47°C, agitar

e verter em placas. Deixa-se solidificar.

Imediatamente antes da utilização, secar as placas de Agar cuidadosamente

(de preferência com as tampas para fora e a superfície de agar para baixo)

na estufa (6.2) entre 37°C e 55°C até que a superfície do agar esteja seca.

Armazenar as placas invertidas até 5 dias a 3°C ± 2°C.

B.5 Agar nutriente

B.5.1 Composição

Extrato de carne 3,0g

Peptona 5,0g

Agar 9g a 18g 1)

Água 1.000mL


B.5.2 Preparação

Dissolver os componentes ou o meio completo desidratado em água, com

aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que após a esterilização, esteja 7,0 ± 0,2 a

25°C.

27

Transferir o meio de cultura para os tubos ou frascos (6.9) de capacidade apropriada.

Esterilizar por 15 minutos em autoclave (6.1) a 121°C.

B.5.3 Preparação de placas de Agar nutriente

Transferir cerca de 15mL do meio fundido para pequenas placas de Petri

estéreis (6.11) e proceder conforme B.4.2

B.6 Agar açúcar/ferro triplo (Agar TSI)

B.6.1 Composição

Extrato de carne 3g

Extrato de levedura 3g

Peptona 20g

Cloreto de sódio (NaCl) 5g

Lactose 10g

Sacarose 10g

Glicose 1g

Citrato de Ferro III 0,3g

Tiosulfato de sódio 0,3g


Ágar 9g a 18g1)

Água 1.000mL


B.6.2 Agar uréia (Christensen)

B.7.1 Meio base

28


Peptona 1g

Glicose 1g


Fosfato dihidrogênio de potássio (KH2PO4) 2g


Ágar 9g a 18g1)

Água 1.000mL



Dissolver os componentes ou a base completa desidratada em água, com

aquecimento, se necessário.

Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja em 6,8 ± 0,2 a

25°C.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a 121°C.

B.7.2 Solução de uréia


Uréia 400g

Água 1.000mL


Dissolver a uréia em água. Esterilizar por filtração e checar a esterilidade.

Veja a ISO 7218:1996, 7.3.2.

B.7.3 Meio completo


Base (B.7.1) 950mL

Solução de uréia (B.7.2) 50mL

29


Adicionar, sob condições assépticas, a solução de ureia à base, previamente

fundidos e então manter a 44°C a 47°C.

Dispensar o meio completo em tubos estéreis (6.9) em quantidades de 10 mL.

Deixe-o numa posição inclinada.

B.8 Meio Descarboxilação L-Lisina

B.8.1 Composição

Monohidrocloreto de L-Lisina 5g

Extrato de levedura 3g

Glicose 1g

Vermelho de bromocresol 0,015g

Água 1.000mL

B.8.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário.


0,2 a 25°C.

Transferir o meio em quantidades de 2mL a 5mL para limitar as culturas nos

tubos (6.9) com tampas de rosca.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a 121°C.

B.9 Reagente de β-galactosidase

B.9.1 Solução tampão


Fosfato dihidrogênio de sódio (NaH2PO4) 6,9g

Hidróxido de sódio, solução 10mol/L 3mL

Água para um volume final de 50mL

30


Dissolver o fosfato dihidrogênio de sódio em aproximadamente 45mL de água

em um frasco volumétrico.

Ajustar o pH a 7,0 ± 0,2 at 25°C com solução de hidróxido de sódio.

Adicionar água para um volume final de 50mL.

B.9.2 Solução ONPG


o-Nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG) 0,08g

Água 15mL


Dissolver o ONPG em água a aproximadamente 50°C.

Resfriar a solução.

B.9.3 Reagente completo


Solução tampão (B.9.1) 5mL

Solução ONPG (B.9.2) 15mL


Adicionar a solução tampão à solução ONPG.

B.10 Reagentes para reação de Voges-Proskauer (VP)

B.10.1 Meio VP


Peptona 7g

Glicose 5g

Fosfato de hidrogênio dipotássio (K2HPO4) 5g

Água 1.000mL

31


Dissolver os componentes em água, por aquecimento, se necessário. Ajustar o pH, se necessário, de modo que, após a esterilização, esteja 6,9 ± 0,2

a 25°C.

Transferir o meio para tubos (6.9), em quantidades de 3 mL.

Esterilizar por 15 min em autoclave (6.1) a em 121°C.

B.10.2 Solução de creatina (N-amidinosarcosina)


Monohidrato de creatina 0,5g

Água 100mL


Dissolver o monohidrato de creatina em água.

B.10.3 1-Naftol, solução etanólica


1-Naftol 6g

Etanol, 96% (fração de volume) 100mL


Dissolver o 1-Naftol em etanol.

B.10.4 Solução de hidróxido de potássio


Hidróxido de potássio 40g

Água 100mL


Dissolver o hidróxido de potássio em água.

B.11 Reagentes para reação Indol

32

B.11.1 Meio triptona/triptofano


Triptona 10g


DL-triptofano 1g

Água 1.000mL


Dissolver os componentes em água em ebulição.


a 25°C.

Dispensar 5mL do meio em cada um dos vários tubos (6.9).


B.11.2 Reagente de Kovacs


4-Dimetilaminobenzaldeído 5g

Ácido clorídrico, D=1,18g/mL a 1,19 g/mL 25mL

2-Metilbutan-2-ol 75mL


Misturar os componentes

B.12 Agar nutriente semi-sólido

B.12.1 Composição

Extrato de carne 3g

Peptona 5g

Agar 4g a 9g 1)

Água 1.000mL


33

B.12.2 Preparação

Dissolver os componentes em água, com aquecimento se necessário .


a 25°C.

Transferir o meio para frascos (6.9) de capacidade apropriada.


B.12.3 Preparação de placas de Agar

Verter em placas de Petri pequenas e estéreis (6.11) cerca de 15mL de meio

preparado recentemente. Não permitir que as placas de Agar sequem.

B.13 Solução salina fisiológica

B.13.1 Composição


Água 1.000mL

B.13.2 Preparação

Dissolver o Cloreto de sódio em água.


a 25°C.

Dispensar quantidades de solução em frascos ou tubos (6.9) de modo que eles

irão conter entre 90mL e 100mL após a esterilização.


34

Anexo C

(Informativo)

Resultados de testes interlaboratoriais

Um teste de colaboração internacional foi organizado em 2000 pela AFSSA-

Ploufragan na Europa e Sistemas BioControl nos EUA, no quadro do projeto

europeu SMT CT 96 2098 [6]. Esse teste envolveu 11 laboratórios em 9 países

da Europa e 10 laboratórios nos EUA, e foi realizado em requeijão fresco, ovo

desidratado, carne crua de aves e em um material de referência. As amostras

de alimentos foram testadas cada uma em dois níveis diferentes de

contaminação, além de um controlo negativo.

Os valores das características de desempenho derivados deste teste

colaborativo são mostrados por tipo de amostra nas Tabelas C.1 a C.4. Os

dados obtidos por alguns laboratórios foram excluídos dos cálculos apenas

com base em razões técnicas claramente identificadas (desvios do protocolo).

35

Tabela C.1 – Resultados dos dados de análise obtidos de amostras de

requeijão fresco

Requeijão fresco

(branco)

Requeijão fresco

(baixo nível de contaminação)

Requeijão fresco

(alto nível de contaminação)

Número de laboratórios que

tiveram resultados retornardos

23 23 23

Número de amostras por

laboratório 5 5 5

Número de laboratórios excluídos

2 2 2

Número de laboratórios retidos após

exclusão

21 21 21

Número de amostras aceitas

105 105 105

Precisão (especificidade),

% 100 - -

Precisão (sensibilidade), %

- 74,3 83,8

Conformidade, % 100 83,8 95,2

Concordância, % 100 60,5 71,7

36


ovo desidratado

Ovo desidratado

(branco)

Ovo desidratado

(baixo nível de contaminação)

Ovo desidratado

(alto nível de contaminação)



26 26 26


laboratório 5 5 5


5 5 5


exclusão

21 21 21


105 105 104


% 100 - -


- 98,1 99

Conformidade, % 100 96,2 98,1

Concordância, % 100 96,2 98,1

37


carne crua de aves

Carne crua de aves (branco)

Carne crua de aves (baixo nível de contaminação)

Carne crua de aves (alto nível

de contaminação)



25 25 25


laboratório 5 5 5


5 5 5


exclusão

20 20 20


100 99 100


% 100 - -


- 98 100

Conformidade, % 100 96,9 100

Concordância, % 100 96 100

38


referência

Material de referência (cápsulas contendo cerca de 5UFC de S.

Typhimurium

Número de laboratórios que tiveram resultados retornardos

26

Número de amostras por laboratório 5

Número de laboratórios excluídos 1

Número de laboratórios retidos após exclusão

25

Número de amostras aceitas 125

Precisão (especificidade), % -

Precisão (sensibilidade), % 94,4

Conformidade, % 88,8

Concordância, % 89,1

39

Bibliografia

[1] ISO 6887-2, Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal –

Preparação de amostras de testes, suspensão inicial e diluições decimais para

análise microbiológica – Parte 2: Regras específicas para o preparo de carnes

e produtos derivados



análise microbiológica – Parte 3: Regras específicas para o preparo de peixes

e produtos derivados



análise microbiológica – Parte 4: Regras específicas para o preparo de outros

produtos que não sejam leite e produtos derivados, carnes e produtos

derivados e peixe e produtos derivados

[4] ISO/TR 11133-1, Microbiologia de alimentos para consumo humano e

animal – Guia de preparação e produção de meio de cultura – Parte 1: Guia

geral sobre garantia da qualidade para a preparação de meio de cultura no

laboratório

[5] Ewing, W. H. And Ball, M. M. As reações bioquímicas do gênero Salmonella.

Centro Nacional para Controle e Prevenção de Doenças. Atlanta, Georgia,

EUA, 1996.

[6] Feldsine, P. et al. Recuperação de Salmonella em alimentos selecionados

pelo procedimento ISO 6579 de cultura de Salmonella e pelo Método de

análise Oficial Internacional AOAC: Estudo colaborativo. J. AOAC Int. 2001.

[7] Meio de cultura para microbiologia de alimentos. Em: Progresso em

microbiologia industrial. Vol. 34. (Eds. Corry, J. E. L., Curtis, G. D. W. e Baird,

R. M. Elsevier, Amsterdam, 1995.

ISO 6579 TC

Documents

Transcript of ISO 6579 TC