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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro, Campus Rio de Janeiro. Investigação da participação da Galectina-3 no processo de apoptose de célula infectadas por Trypanosoma cruzi. MICHELLE DE OLIVEIRA CHAIN Rio de Janeiro Novembro, 2016.
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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
do Rio de Janeiro, Campus Rio de Janeiro.
Investigação da participação da Galectina-3
no processo de apoptose de célula infectadas
por Trypanosoma cruzi.
MICHELLE DE OLIVEIRA CHAIN
Rio de Janeiro
Novembro, 2016.
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MICHELLE DE OLIVEIRA CHAIN
Investigação da participação da Galectina-3
no processo de apoptose de célula infectadas
por Trypanosoma cruzi.
Dissertação de Mestrado, apresentado como
requisito parcial a obtenção do grau de
Mestre em Bioquímica e Biologia
Molecular pelo Programa Multicêntrico de
Bioquímica e Biologia Molecular do
Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro
Orientador: Professor Luiz Dione Barbosa de Melo
Co-Orientador: Professor Mario Alberto Cardoso da Silva Neto.
Rio de janeiro
Novembro, 2016.
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MICHELLE DE OLIVEIRA CHAIN
Investigação da participação da Galectina-3
no processo de apoptose de célula infectadas
por Trypanosoma cruzi.
Dissertação de Mestrado, apresentado como
requisito parcial a obtenção do grau de Mestre em
Bioquímica e Biologia Molecular pelo Programa
Multicêntrico de Bioquímica e Biologia Molecular
do Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro.
Aprovado pela Banca Examinadora em novembro de 2016.
Prof. PhD Luiz Dione Barbosa de Melo (IFRJ)
Profª. PhD Juliene Antonio Ramos (IFRJ)
Profª. PhD Narcisa Leal da Cunha e Silva (UFRJ)
Prof. PhD Norton Heise (UFRJ)
Profª. PhD Joanna Reis Santos de Oliveira (IFRJ)
Prof. PhD Paulo Redner (FIOCRUZ)
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“O que prevemos raramente ocorre; o
que menos esperamos geralmente
acontece.” (Benjamin Disraeli)
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço aos meus pais pois sem eles não estaria aqui, tanto servindo como
exemplos de pessoa de como quero ser como também por todo apoio e consolo em todos os
momentos. Afinal pode ser clichê, mas tenho os melhores pais do mundo, meu muito obrigado a
ambos. Ao meu namorado que desde o início aceitou bem que nem todo final de semana e feriado
significam não ter trabalho. Por todos os treinos de apresentação de “gelatina-3” que ele escutou
com toda paciência e ouvidos. Muito obrigado por estar comigo nessa caminhada, não teria
conseguido sem sua ajuda. Aos meus colegas de laboratório 104 pela paciência e sempre disposição em ajudar em
qualquer situação, mesmo em finais de semana, tornando o ambiente de trabalho sempre o mais
agradável possível, formando uma espécie de segunda família. Aceitando as brincadeiras e
conversas em todos os momentos fazendo ser demorada a sua saída do laboratório, agradeço a eles
desde os monitores por aguentar meus pedidos desesperados (Marinara, Alberto e Carol que
aguentou também) como também meus parceiros de equipe Igor (sábado e as células infectadas),
Cefas e João pelo suporte e amizade e também fora da equipe, mas sempre dando apoio e ajuda
como Victor e Juliana. As minhas amigas Vanessa e Maira que sempre que a situação apertava dávamos uma saída
para relaxar e ficar fofocando, mostrando que as coisas iam entrar nos eixos, agradeço os conselhos,
apesar de aparecer que não escuto, escuto sim e me ajudam a tomar minhas decisões, como também
as bananadas da Maira para me alegrar. A minha amiga Stephanie, afinal foram boas risadas, boas
histórias e boas lições que aprendemos ao longo do caminho.
Não poderia deixar de fora a Caroline e a Vitória que acolhi como alunas, mas que muito
além de alunas foram amigas. Agradeço a Vitória por todas as noites no laboratório contando
células e fazendo extratos e seu desespero toda vez que revelava um blotting como também a
Caroline e sua alegria de ver as células brilhando na imunofluorescência, agradeço bastante a
ajuda e companhia, tornaram a caminhada mais leve e agradável.
Ao meu orientador, Luiz Dione, pela paciência, dedicação, amizade e caronas, me fazendo
sempre aprender e crescer na minha carreira científica desde o início, puxando minha orelha e me
colocando nos eixos sempre que necessário, agradeço todos os ensinamentos e dedicação que me
deram força de seguir adiante.
Ao Marcelo Alex e Juliane Ramos pelo apoio e orientação durante toda esta minha caminhada.
Pelos conselhos e suporte desde na coordenação no caso do Marcelo, buscando sempre o nosso
melhor como também junto da Juliene ajudando também na organização.
A todas as pessoas que estiveram comigo nessa caminhada meu muito obrigada, outros
estando pertinho, outros nem tanto, mas a força e amizade me ajudaram bastante a seguir em
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frente e conseguir força para continuar a batalha que muitas vezes fraquejei, mas com certeza dei
o meu melhor. Posso ter esquecido alguns nomes, mas saiba que todos que me marcaram e me
ajudaram só tenho uma coisa a falar:
Muito obrigada
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RESUMO
O agente etiológico da doença de Chagas, o protozoário Trypanosoma cruzi, possui um
ciclo de vida heteroxênico, alternando entre hospedeiros invertebrados e vertebrados. O
sucesso do estágio intracelular no hospedeiro vertebrado depende de múltiplos
mecanismos de inibição da morte e pró-sobrevivência pelo tempo necessário para
diferenciação/proliferação do patógeno em um nicho seguro. Acreditamos que o parasito
atue subvertendo a morte celular que normalmente ocorreria com a célula hospedeira sob
essa condição de estresse patológico que é a infecção pelo parasito. Nesse sentido, a
apoptose que é a morte celular não seguida de autólise, pode ser regulada negativamente
em células infectadas desempenhando um papel chave na fisiopatologia da doença de
Chagas. A apoptose pode se dar pela via extrínseca através da ativação de “receptores de
morte celular” ou pela via intrínseca pela liberação de citocromo c da mitocôndria. Estudos
recentes relacionam a Galectina-3 com ambas vias d´apoptose, atribuindo a ela uma função
tanto pró- quanto anti-apoptótica. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo estudar
o papel da Galectina-3, no âmbito da subversão d´apoptose mediada pelo T. cruzi. Para
analisarmos as consequências da infecção pelo T. cruzi, foram utilizadas como modelo
de estudo células da linhagem HeLa selvagens ou transduzidas com vetores lentivirais
para RNAi que expressam shRNA Gal-3 ou shRNA scramble. Análises de sobrevivência
pelo método do MTT confirmaram uma menor viabilidade da linhagem depletada de
Galectina-3 em comparação com as demais linhagens, além disso, essa mesma redução foi
ainda mais proeminente quando as células foram infectadas pelo T. cruzi, sugerindo que
Galectina-3 está envolvida com as vias de sobrevivência mediadas pelo T. cruzi. Ademais,
análises da proliferação demonstraram que a presença do parasito promove estímulos
proliferativos às células, de modo dependente de Galectina-3. Uma outra abordagem
utilizando etoposídeo como agente indutor de morte revelou que T. cruzi é capaz de
amenizar e subverter o estímulo pró-morte nas linhagens com níveis endógenos de
Galectina-3, mas não na linhagem depletada de Galectina-3. Os níveis proteicos de
mediadores apoptóticos como Bcl-2, Bax, e PARP também foram avaliados ao longo do
tempo, na ausência de Galectina-3 há diminuição dos níveis totais de Bcl-2 e Bax durante
a infecção. Ademais, em todas as linhagens foi observada a presença de um pico de Bcl-2
e Bax no tempo de 4 horas pós-infecção, pico também observado no processamento
proteolítico de PARP, ainda que com perfil proteolítico diferente do observado no controle
positivo utilizando etoposideo. Buscando relacionar a ação anti-apoptótica de Galectina-3
com sua atuação em vias citoplasmáticas/nucleares, a análise de imunolocalização revelou
uma maior concentração de Galectina-3 no citoplasma durante as primeiras horas da
infecção com posterior translocação para o núcleo a partir de 8 horas, acreditamos que os
estoques de Galectina-3 citoplasmática possam se associar com Bcl-2 e Bax como
demonstrado na literatura inibindo a via intrínseca d´apoptose a curto prazo, enquanto que
os estoques nucleares poderiam estar sinalizando para vias pró-sobrevivência a médio
prazo na infecção. Em síntese, acreditamos que o parasito se apropria das vias de
sinalização da célula hospedeira a seu favor, regulando positivamente as funções de
Galectina-3 relacionadas com a sobrevivência e inibição d´apoptose, mantendo a célula
hospedeira viva pelo tempo suficiente à replicação dos amastigotas e diferenciação destes
em tripomastigotas. Palavras chaves: Galectina-3; Trypanosoma cruzi; apoptose.
ix
ABSTRACT
The etiologic agent of Chagas disease, the protozoan Trypanosoma cruzi, has a
heteroxenic life cycle, alternating between hosts invertebrates and vertebrates. Successful
intracellular stage in the vertebrate host depends on multiple mechanisms of inhibition of
death and pro-survival time required for the differentiation/proliferation of the pathogen
in a safe niche. We believe that parasite acts subverting the cell death that normally occur
in the host cell under this pathological stress condition which is the infection by the
parasite. Thereby, the apoptosis is the cell death not followed by autolysis, it can be
downregulated in infected cells playing a key role in the pathophysiology of Chagas
disease. Apoptosis can occur through the extrinsic pathway by activation of “cell death
receptors” or the intrinsic pathway by the release of cytochrome c from mitochondria.
Recent studies relate Galectin-3 to both pathways of apoptosis, assigning it a function of
both pro- and anti-apoptotic. Therefore, this study aimed to study the role of Galectin-3,
in the context of the subversion of apoptosis mediated by T. cruzi. To analyze the
consequences of T. cruzi infection, were used as a study model HeLa cells wild or lineages
transduced with lentiviral vectors for RNAi expressing shRNA Gal-3 or shRNA scramble.
Analysis of survival by the MTT assay confirmed a lower viability in lineage depleted of
Galectin-3 in comparison to the other strains, moreover, the same reduction was even more
prominent when the cells were infected with T. cruzi, which suggests that galectin-3 it is
involved with survival pathways mediated by T. cruzi. Furthermore, the proliferation
analysis demonstrated that the presence of the parasite promotes proliferative stimuli to
cells of galectin-3-dependent manner. Another approach using etoposide as an induction
agent of death revealed that T. cruzi can mitigate and subvert the pro-death stimuli in lines
with endogenous levels of Galectin-3 but not in strain depleted of Galectin-3. The protein
levels of apoptotic mediators such as Bcl-2, Bax, and PARP were also evaluated over time,
in the absence of galectin-3 there is a decrease in total levels of Bcl-2 and Bax during
infection. Furthermore, in all strains was observed the presence of a peak of Bcl-2 and Bax
in the post-infection time of 4 hours, peak also observed in the proteolytic processing of
PARP, although with a different proteolytic profile observed in the positive control using
etoposide. Trying to relate the anti-apoptotic action of Galectin-3 with his acting in
cytoplasmic/nuclear ways, the immunolocalization analysis revealed a higher
concentration of Galectin-3 in the cytoplasm during the first hours of infection with
subsequent translocation to the nucleus from 8 hours, we believe that Galectin-3
cytoplasmic stocks can associate with Bcl-2 and Bax as demonstrated in the literature
inhibiting the intrinsic apoptotic pathway in the short-term, whereas nuclear stocks could
be signaling for pro-survival pathways in the medium term on infection. In summary, we
believe that parasite appropriates of the signaling pathways of the host cell in its favor,
positively regulating the functions of galectin-3 related to survival and apoptosis
inhibition, keeping the host cell alive for sufficient time for replication of amastigotes and
differentiation of these in trypomastigotes. Keywords: Galectin-3; Trypanosoma cruzi; apoptosis.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Ciclo de vida simplificado do Trypanosoma cruzi.
FIGURA 2. Mapa epidemiológico da doença de Chagas entre os anos de 2002 e 2011.
FIGURA 3. Interação parasito-hospedeiro
FIGURA 4. Esquema da estrutura dos diferentes tipos de galectinas, sua divisão e interação
FIGURA 5. Locais de atuação das galectinas em diferentes cascatas de sinalização celular.
FIGURA 6. Estrutura esquemática da Galectina-3 e sua interação.
FIGURA 7. Estrutura da Galectina-3.
FIGURA 8. Representação didática simplificada da associação da Galectina-3 em suas
diversas funções
FIGURA 9. Esquema das vias extrínseca e intrínseca de morte celular.
FIGURA 10. Pró- e anti-apoptóticos membros da família de Bcl-2
FIGURA 11. Ilustração do domínio NWGR presente na estrutura primária da galectina-3.
FIGURA 12. Modelo de interação entre Bax e galectina-3
FIGURA 13. Uma visão geral das vias apoptóticas mamíferos e os pontos de regulação por
protozoários intracelulares como Leishmania e Trypanosoma.
FIGURA 14A. Confirmação do silenciamento de Galectina-3 por interferência de RNA.
Figura 14B. Ensaio de infecção pelo T. cruzi em células HeLa WT e HeLa shGal-3.
FIGURA 15. Padronização por citometria de fluxo para quantificação da morte celular induzida
por etoposídeo.
FIGURA 16. Investigação dos níveis de Bcl-2, Bax e Galectina-3 em reposta ao estímulo com
etoposídeo.
FIGURA 17. Níveis protéicos de PARP total e clivado durante tratamento com etoposídeo para
indução da morte celular.
FIGURA 18. Viabilidade celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3)
em condições normais de cultivo.
FIGURA 19. Viabilidade celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3)
no curso da infecção pelo T. cruzi.
FIGURA 20. Proliferação celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3)
em condições normais de cultivo e no curso da infecção pelo T. cruzi.
FIGURA 21. Análise de viabilidade celular sob um estímulo farmacológico de morte celular em
conjunto com infecção por T. cruzi.
FIGURA 22. Análise de viabilidade celular sob um estímulo farmacológico de morte celular em
conjunto com infecção por T. cruzi em tempos tardios.
FIGURA 23. Análise dos níveis proteicos de Bcl-2, Bax e Galectina-3 junto à infecção
FIGURA 24. Análise dos níveis proteicos de PARP junto à infecção.
FIGURA 25. Padronização da condição não tóxica de cicloheximida para utilização nos ensaios
de inibição da síntese proteica.
xi
FIGURA 26. Ensaio de mobilização celular de Galectina-3 durante a infecção por T. cruzi.
FIGURA 27. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 e Bax no decorrer do
tratamento com ciclohexamida.
FIGURA 28. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 e Bax no decorrer do
tratamento com ciclohexamida e etoposídeo.
FIGURA 29. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 no decorrer da infecção por
T. cruzi.
FIGURA 30. Imunofluorescência da sublocalização de Bax no decorrer no decorrer da infecção
por T. cruzi.
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LISTA DE SIGLAS & ABREVIATURAS
AGEs – Produtos Finais de Glicosilação Avançada - ‘Advanced Glycation End products’
AIF – Fator Indutor de Apoptose –‘Apoptosis Induction Factor’
APAF1 – Fator Ativador de Peptidase Apoptótica 1 –‘Apoptotic Peptidase Activating Factor1’
B1 receptor - Receptores de Bradicinina 1 – ‘Bradykinin Receptor 1’
Bad – Bcl-2 Associado ao Promotor de Morte -‘Bcl-2-associated death promoter’
Bak – Homólogo Antagonista∕Assassino de Bcl-2 - ‘Bcl-2 Homologous Antagonist/Killer’
Bax - Proteína X associada a Bcl-2 – ‘Bcl-2-Associated X Protein’
Bcl-2 – Célula B de Linfoma 2 - ‘B-cell lymphoma 2’
Bcl-xL- Células B de Linfoma Extra Grande - ‘B-cell lymphoma-extra large’
bFGF - Fator de Crescimento básico de Fibroblasto – ‘basic Fibroblast Growth Factor’
BH – Homologia a Bcl-2 – ‘Bcl-2 Homology’
Bid – Domínio de interação a BH3 Agonista de Morte - ‘BH3 interacting-domain death agonist’
Bim – Proteína Like-Bcl-2 11- ‘Bcl-2-like protein 11’
BIR – Repetições de IAP de Baculovirus - ‘Baculoviral IAP Repeats’
CARD – Domínio Ativador e de Recrutamento de Caspase - ‘Caspase Activation and Recruitment
Domain’
c-FLIP – Proteína celular inibitória FLICE - ‘Cellular FLICE Inhibitory Protein’
c-IAP1 – IAP celular 1 - ‘cellular-IAP-1’
c-IAP2 – IAP celular 2 - ‘cellular-IAP-2’
CK1- caseína quinase 1-α – ‘Casein kinase 1-α’
CRD – Domínio de Reconhecimento de Carboídratos – ‘Carboidrate Recognition Domain’
DAPI - 4',6-diamidino-2-fenilindole –‘4',6-diamidino-2-phenylindole’
DED – Domínio Efetor de Morte - ‘Dead Effector-Domain’
DIABLO – Proteína de Ligação Direta a IAP com Baixo PI- ‘Direct IAP-Binding protein with
Low PI’
DISC- Complexo de Sinalização Indutor de Morte - ‘Death-inducing signaling complex’
DNA – Ácido Desoxirribonucleico – ‘Deoxyribonucleic Acid’
DTT – 1,4 Ditiotreitol – ‘1,4 Dithiothreitol’
ECM – Matriz Extracelular – ‘Extracellular Matrix’
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético – ‘Ethylenediamine tetraacetic acid’
ERK – Cinase Regulada por Sinal Extracelular – ‘Extracellular signal-Regulated Kinase’
FADD – Faz Associado a Domínio de Morte – ‘Faz Associated Death Domain’
FAK – Cinase Focal de Adesão – ‘Focal Adhesion Kinase’
G418 – Geneticina – ‘Geneticin’
Gal-1 – Galectina-1 –‘Galectin 1’
Gal-3 – Galectina-3 – ‘Galectin 3’
GFP – Proteína Fluorescente Verde – ‘Green Fluorescent Protein’
GP85 – Glicoproteína 85 – ‘Glycoprotein 85’
GP90 – Gliproteína 90 – ‘Glycoprotein 90’
GP92 – Glicoproteína 92 – ‘Glycoprotein 92’
GPI – Glicosilfosfotodilinusitol – ‘Glycosylphosphatidylinositol’
GSK-3β - Cinase glicogênio sintetase 3 beta –‘Glycogen synthase kinase 3 beta’
HRP – Peroxidase de Rábano - ‘Horseradish Peroxidase’
IAP – Proteína Inibidora de Apoptose – ‘Inhibitors of Apoptosis Proteins’
IgG – Imunoglobulina G – ‘Imunoglobulin G’
IL-10 – Interleucina 10 – ‘Interleucin 10’
xiii
iNOS – Sintetase de Óxido Nítrico induzida – ‘inducible Nitric Oxide Synthase’
JAK – Cinase Janus - ‘Janus Kinase’
JNK – C-Jun NH2-terminal Cinase – ‘c-Jun NH2-terminal Kinase’
L. amazonenses – Leishmania amazonenses
L. Major – Leishmania major
LAMC1 – Laminina γ-1 - ‘Laminin γ-1’
LAMP1- Proteína Membranar Associada ao Lisossomo 1 – ‘Lysosomal-associated membrane
protein 1’
LAMP2 - Proteína Membranar Associada ao Lisossomo 2 – ‘Lysosomal-associated membrane
protein 2’
LIT – Infusão de fígado e triptose -‘liver infusion tryptose’
LPS – Lipopolissacarídeo – ‘Lipopolysaccharide’
MAPK – Proteína Cinase ativada por Mitógeno – ‘Mitogen-Activated Protein Kinase’
Mcl-1 – Proteína de diferenciação de células de Leucemia Mieloide -‘Myeloid Cell Leukemia
Differentiation Protein’
MMP-9 – Metalopeptidase de Matriz 9 – ‘Matrix metallopeptidase 9’
MTT – 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Brometo – ‘3-(4,5-Dimethylthiazol-2-
yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide’
NAD+ - Dinucleótido de nicotinamida e adenina - ‘Nicotinamide adenine dinucleotide’
NES- Sequência de Exportação Nuclear – ‘Nuclear Exportation Sequence’
NF-κB – Fator Nuclear κ B- ‘Factor Nuclear κ B’
NGF – Fator de Crescimento de Nervoso –‘Nerve Growth Factor’
NLS – Sequência de Localização Nuclear – ‘Nuclear Localization Sequence’
Noxa - Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1
PAMP – Padrões Moleculares Associados a Patógenos – ‘Pathogen-Associated Molecular
Patterns’
PARP – Polimerase Poli ADP Ribose - ‘Poly ADP Ribose Polymerase’
PBS – Tampão Fosfato-Salino – ‘Phosphate Buffered Saline’
PDNF – Fator Neutrofílico Semelhante Derivado de Parasito - ‘Parasite-Derived Mimic of
Neurotrophic Factor’
PI – Iodeto de Propídio – ‘Iodide Propidium’
PI3K – Fosfotodilinusitol-4,5-Bifosfato 3 Cinase – ‘Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-
kinase’
PIP3 – Fosfatofi l inusitol (3,4,5) -Trisfosfato- ‘Phosphatidylinositol (3,4,5)-
Trisphosphate’
PKB - Proteína Cinase B –‘Protein Kinase B’
PKC – Proteína Cinase C –‘Protein Kinase C’
PMN – Polimorficonuclear – ‘Polymorphonuclear’
PRR – Receptores de Reconhecimento Padrão – ‘Pattern Recognition Receptors’
PS – Fosfatodilserina – ‘Phosphatidylserine’
PUMA- p53 Upregulated Modulador de Apoptose - ‘p53 upregulated modulator of apoptosis’
PVDF - fluoreto de polivinilideno – ‘Polyvinylidene fluoride’
qPCR - Reação da cadeia em tempo real quantitativo em tempo real – ‘quantative Real Time
Polimerase Chain Reaction’
RNA - Ácido Rbonucleico - ‘Ribonucleic Acid’
RNAi – RNA interferência –‘RNA interference’
RNAm – RNA mensageiro – ‘RNA messenger’
RPMI – Meio 1640 do Instituto Roswell Park Memorial – ‘Roswell Park Memorial Institute 1640
Medium’
SDS –Sulfato Dodecil de Sódio - ‘Sodium Dodecyl Sulfate’
xiv
Sh – ‘Short Hairpin RNA’
Smac – Ativador de Caspase derivado Secundário de Mitocôndria – ‘Second Mitochondria-
derived Activator of Caspases’
STAT – Ativador Transcricional e Sinal Transdutor – ‘Sinal Transdutor and Ativador
Transcricional’
T. cruzi – Trypanosoma cruzi
T. gondii – Toxoplasma gondii
TBP – Proteína ligante de TATA - ‘TATA binding protein’
TBS – Tampão Tris-Salino- ‘Tris-buffered saline’
Tcf – Fator de célula T – ‘T cell factor’
TGF-β – Fator de crescimento Beta – ‘transforming growth factor beta’
Th1 – Linfócito T auxiliador 1 –‘T Helper 1’
Th2 – Linfócito T auxiliary 2 – ‘T Helper 2’
TK – Tirosina Cinase – ‘Tyrosine Kinases’
TLR – Receptor Toll-Like – ‘Toll-Like Receptor’
TLR2- Receptor Toll-Like – ‘Toll-Like Receptor 2’
TLR4 – Receptor Toll-Like 4 – ‘Toll-Like Receptor 4’
TNF-α – Fator tumoral necrótico- α – ‘Tumor Necrotic Factor- α’
TRAIL – Ligante Indutor de Apoptose relacionado a TNF –‘TNF-Related Apoptosis-Inducing
Ligand’
Tris – tris(hidroximetil)aminometano - ‘tris(hydroxymethyl)aminomethane’
TrkA – Receptor de Tropomiosina Cinase A – ‘Tropomyosin Receptor Kinase A’
TSA-1 – Tiorredoxina peroxidase 1 – ‘Thioredoxin Peroxidase 1’
VEGF – Fator de crescimento Vascular Endotelial - ‘Vascular Endothelial Growth Factor’
WT – Selvagem - ‘Wild Type’
XIAP – Proteína inibidora de apoptose ligada a X - ‘X-linked inhibitor of apoptosis protein’
xv
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Modulação d´apoptose durante a infecção por T.cruzi
xvii
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................................................................... 1
1.1 Doença de Chagas (Ciclo de Vida do Trypanosoma cruzi) ............................................................................................. 1
1.2 Doença de Chagas (Epidemiologia & Tratamento) ........................................................................................................... 2
1.3 Interação Parasito-Hospedeiro em Tripanosomatídeos ................................................................................................... 4
1.4 Galectinas (Classificação & Estrutura) ................................................................................................................................... 7
1.5 Galectinas (Funções Pleiotrópicas) ............................................................................................................................................ 9
1.6 Galectina-3 ........................................................................................................................................................................................ 11
1.7 Contribuição de Galectina-3 na Fisiopatologia da Doença de Chagas ..................................................................... 15
1.8 Apoptose................................................................................................................................................................................................ 16
1.9 Galectina-3 e Regulação sobre a Apoptose ........................................................................................................................... 20
1.10. Tripanosomatídeos & Subversão da Apoptose............................................................................................................... 23
2. OBJETIVO ........................................................................................................................................................................................... 28
2.1 Objetivos específicos ....................................................................................................................................................................... 28
3. METODOLOGIA ................................................................................................................................................................................... 29
3.1 Células utilizadas (Linhagens celulares e Protozoários) ................................................................................................ 29
3.2 Linhagens de parasitos utilizadas............................................................................................................................................. 29
3.3 Ensaios de infecção e produção de tripomastigotas .......................................................................................................... 30
3.4 Ensaio de viabilidade celular (MTT) ....................................................................................................................................... 31
3.5 Drogas utilizadas e condições ..................................................................................................................................................... 32
3.6 Obtenção dos extratos proteicos ............................................................................................................................................... 32
3.8 SDS e Western Blotting ................................................................................................................................................................. 33
3.9 Imunofluorescência indireta ....................................................................................................................................................... 34
4. RESULTADOS ........................................................................................................................................................................................ 36
4.1 Confirmação da redução dos níveis proteicos de Galectina-3 por interferência de RNA .............................. 36
4.2 Obtenção de formas tripomastigotas de cultura em células Vero pcDNA 3.1 para posteriores ensaios na
linhagem HeLa. ........................................................................................................................................................................................ 38
4.3 Padronização de uma condição farmacológica indutora de morte celular para correlacionar com a
apoptose nos ensaios funcionais pós-infecção. ........................................................................................................................... 38
4.4 Avaliação da alteração dos níveis proteicos de marcadores apoptóticos sob condição farmacológica
com etoposídeo. ......................................................................................................................................................................................... 41
4.5 Contribuição de Galectina-3 na sobrevivência e proliferação celular. ................................................................... 45
4.6 Envolvimento de Galectina-3 no fenótipo de subversão da morte celular promovida pelo Trypanosoma
cruzi. .............................................................................................................................................................................................................. 48
4.7 Análise dos níveis proteicos de marcadores apoptóticos durante à infecção. ...................................................... 52
4.8 Análise dos níveis proteicos de Gal-3 por fracionamento celular. ............................................................................ 56
4.9 Análise de sublocalização celular de Galectina-3 e Bax durante infecção por imunofluorescência. ......... 59
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................................................................................. 66
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................................................................................................... 75
ii
7. PERSPECTIVAS .................................................................................................................................................................................... 76
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................................................................... 77
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Chagas (Ciclo de Vida do Trypanosoma cruzi)
O agente etiológico da doença de Chagas, o Trypanosoma cruzi, foi identificado em
1909 pelo Dr. Carlos Chagas, também responsável pela identificação do mecanismo de
transmissão da doença e seu vetor (CHAGAS, 1909; CHAGAS 1911).
O parasito alterna seu ciclo de vida entre um hospedeiro vertebrado (mamíferos) e um
invertebrado (hemípteros triatomíneos) e, por isso, é classificado como heteroxênico. A forma
tripomastigota sanguícola, presente no hospedeiro vertebrado, é internalizada pelo triatomíneo
durante o repasto sanguíneo, se diferenciando na forma epimastigota, que é capaz de proliferar
no inseto. Ao chegar ao intestino posterior, a forma epimastigota se diferencia na forma
tripomastigota metacíclica, capaz de infectar o hospedeiro vertebrado, sendo liberado nas fezes
do hemíptero durante o repasto sanguíneo. As fezes contendo o parasito entram em contato com
a lesão causada pelo inseto, promovendo assim a contaminação do hospedeiro vertebrado. A
forma tripomastigota invade as células do hospedeiro vertebrado se diferenciando na forma
amastigota intracelular, que é capaz de proliferar e de se diferenciar na forma tripomastigota
sanguícola, levando a lise celular e infecção de novas células, ou dando início a um novo ciclo
evolutivo do parasito (Figura 1) (CHAGAS, 1909; CHAGAS, 1911).
A doença de Chagas possui a fase aguda, a qual há a replicação do parasito e o mesmo
é encontrado na corrente sanguínea, já na fase crônica, não há mais parasitos circulantes. A fase
aguda pode ser assintomática ou sintomática com febre, reações alérgicas, dor de cabeça, e
miocardite rara. A doença de Chagas pode progredir à fase crônica a qual 30% dos pacientes
apresentam cardiopatia chagásica e hepatoesplenomegalia. A cardiopatia chagásica se dá pela
hipertrofia e dilatação do coração que causa arritmia severa e progressiva disfunção sistólica
(BERMUDEZ et al., 2016).
2
FIGURA 1. Ciclo de vida simplificado do Trypanosoma cruzi, demonstrando todos os estágios
evolutivos do parasito, nos hospedeiros vertebrado e invertebrado Infográfico: Venício Ribeiro,
ICICT/Fiocruz.
1.2 Doença de Chagas (Epidemiologia & Tratamento)
Mesmo após 117 anos da descrição da doença pelo Dr. Chagas, ainda existem entre 8
milhões de pessoas infectadas pelo T. cruzi pelo mundo (Figura 2), havendo a morte de 66.2000
pessoas por ano (WHO) e em torno de 20 a 30% apresentando sintomas da doença. No Brasil há
um passivo de 5 milhões de pessoas infectadas com 6000 mortes por ano (MARTINS-MELO et
al, 2014). Quando comparamos com os anos 60, onde haviam cerca de 7 milhões de novos casos
por ano (MONCAYOU & SILVERA, 2009), observamos para os anos da última década uma
grande redução no número de novos casos por ano para cerca de 56.000 identificados em 2013
(KASTEN-MONGES et al, 2016). Essa redução se deveu principalmente a redução da
transmissão através do inseto vetor ou por transfusão sanguínea (MONCAYOU & SILVER,
2009).
Com relação ao tratamento da doença, as drogas utilizadas atualmente visam somente
à fase aguda da doença, sendo pouco eficientes na fase crônica e variando sua eficácia de acordo
com a cepa de T. cruzi (SCHOFIELD et al., 2006; MARTINS-MELO et al., 2014; LEE et al.,
2013; SCHMUÑIS, 2013).
3
Os fármacos nifurtimox e benzonidazol são as únicas drogas que comprovaram eficácia
no tratamento a infecção ao T. cruzi na fase aguda levando a redução da severidade dos sintomas
e da parasitemia, havendo cura nesta mesma fase em torno dos 80% dos casos, porém a
administração destas drogas não se mostrou eficaz na fase crônica.
O nifurtimox é um nitrofurano que inibe a síntese do ácido pirúvico e interrompe o
metabolismo do T. cruzi, tal ação leva a efeitos colaterais tais como: problemas gastrointestinais,
anorexia, perda de peso, náusea e vômito em 70% dos pacientes, além de efeitos neurotóxicos
com desorientação, irritabilidade e insônia. Já o benzonidazol é um derivado do nitroimidazol,
sendo considerada a primeira linha de tratamento, promovendo um efeito menos adverso no
tratamento quando comparado com o nifurtimox, além de maior eficácia no tratamento (BERN,
2015).
Ainda que alguns estudos mostrem evidências de desenvolvimento de mecanismos de
resistência do parasito, tanto em humanos como em animais, não observamos o desenvolvimento
de novas drogas (ALSFORD et al., 2010). Mesmo com o sequenciamento do genoma do parasito
e as diversas informações obtidas sobre suas vias de sinalização, as informações ainda são
escassas e potenciais alvos terapêuticos carecem de investigação (EL-SAYED et al., 2005).
FIGURA 2. Mapa epidemiológico da doença de Chagas entre os anos de 2002 e 2011. Em vermelho mostra
as regiões endêmicas de transmissão vetorial, em amarelo mostra as regiões endêmicas de transmissão
vetorial esporádica e em azul as áreas não endêmicas de transmissão via transfusão de sangue, doação de
órgãos e etc (Zhou & Liu, 2015).
4
1.3 Interação Parasito-Hospedeiro em Tripanosomatídeos
O passo inicial para o sucesso da infecção se dá pela interação com o hospedeiro através
de moléculas presentes na membrana do parasito denominadas PAMPs (Pathogen-Associated
Molecular Patterns) e moléculas presentes na superfície da célula hospedeira chamadas de
receptores de reconhecimento de padrões PRRs (Pattern Recognition Receptors) (Figura 3)
(HOU et al., 2014). O parasito possui em sua superfície moléculas que são envolvidas no início
da cascata de sinalização essencial para entrada do mesmo na célula hospedeira e posterior
sobrevivência (DUTRA et al., 2014).
Há uma variedade de interações já descritas de PRRs com T. cruzi podendo destacar a
participação de receptores pró-inflamatórios de resposta contra patógenos como receptores TGF-
β, TLRs (Toll-like receptors) e Trk (Tyrosine-Protein Kinase) como TrkA e TrkC (Figura 3)
(HALL & PEREIRA, 2000; MAGANTO-GARCIA et al., 2008; LEMAITRE et al., 1996;
WEINKAUF & PEREIRA-PERRIN, 2009).
Diversos grupos estudam como se dão esses mecanismos de interação de PRRs versus
PAMPs de T. cruzi, seja pela interação independente de carboidratos seja pela interação
dependente de carboidratos como ácido siálico, galactose e manose. É sabido que nem todos
os parasitos que aderem à célula hospedeira são bem-sucedidos no processo infeccioso, por
isso, etapas como a invasão, saída do vacúolo, diferenciação/replicação e ruptura da célula
hospedeira com a liberação dos parasitos são essenciais para entendimento da infecção (ALVES
et al., 2007). Os PAMPs organizam-se de forma distinta entre as cepas e formas evolutivas, os
mais conhecidos e estudados são as trans-sialidases e glicoproteínas do tipo mucina e GIPLs
(glycoinositolphospholipids), inseridos na membrana plasmática através de uma âncora de GPI
(Glycosylphosphatidylinositol) (FONSECA et al, 2016).
Os membros da superfamília gp85/trans-sialidases formam um grupo bastante
heterogêneo interagindo com diversos receptores presentes tanto na superfície da célula
hospedeira quanto com componentes da matriz extracelular (DE SOUZA et al., 2010). Todos os
membros desta família são proteínas que contém em comum um domínio sialidase com motivo
Asp-box e motivo peptídico VTVxNVxLYNRPLN responsável pela transferência do ácido
siálico de glicoconjugados do hospedeiro para terminais β-galactose de glicoproteínas do parasito
(TEIXEIRA et al., 2015), mascarando a ação do complemento e favorecendo a infecção
(FRASCH, 2000; GAZZINELLI & DENKERS, 2006)
5
Por sua vez, as âncoras GPI (Glycosylphosphatidylinositol) contém um cerne de
oligossacarídeos conservado ligado a um grupo hidrofóbico como ceramida ou glicerolipídio. Há
diversas variações estruturais das âncoras GPI que resultam na adição de resíduos de carboidratos
e de lipídios. As proteínas ligadas por GPI são sintetizadas com uma extremidade C-terminal que
é substituída por uma âncora GPI numa reação de transamidação que acontece pós-
traducionalmente (ROPERT et al., 2002).
FIGURA 3. Interação parasito-hospedeiro demonstrando os possíveis PAMPs (Pathogen-Associated
Molecular Patterns) presentes na membrana de T. cruzi e possíveis PRRs (Pattern Recognition
Receptors) presentes na membrana da célula hospedeira. Adaptado de DE SOUZA et al., 2010.
As mucinas ancoradas via GPI são as glicoproteínas mais encontradas na superfície do
parasito, elas apresentam um cerne proteico com diversas cadeias de carboidratos ligadas a
treoninas e serinas por ligações glicosídicas (NOIA et al., 1995). Por serem altamente ricas
em glicídios, têm facilitada a interação com receptores PRRs e∕ou lectinas tendo
assim uma importância crucial na interação parasito -hospedeiro e no mecanismo de
defesa contra os hospedeiros vertebrados e invertebrados ( BUSCAGLIA et al.,
2006).
Outro ponto envolve a interação do parasito com a matriz extracelular (ECM) por
componentes como: fibronectina, laminina, glicoproteínas heparan-sulfato e Galectina-3 (descrita
em maiores detalhes no item 1.7) (ALVES et al., 2007).
6
Após sinalização de reconhecimento/adesão ocorre o evento de invasão, o qual depende
de um aumento transiente nos níveis de Ca+2 intracelular (TARDIEUX et al., 1992), mobilização
do citoesqueleto de actina (YOSHIDA & CORTEZ, 2008) e ativação de PI3K
(PhosphatidylInositol 3-Kinase) no hospedeiro (WOOLSEY & BURLEIGH, 2004). Em fagócitos
profissionais como os macrófagos, a fagocitose é o mecanismo principal de invasão, e parasito
internalizado irá localizar-se no fagolisossomo. Por outro lado, em células fagocíticas não-
profissionais sem emissão de pseudópodos, a entrada ativa é o evento prevalente com o parasito
localizando-se no vacúolo parasitóforo (DUTRA et al, 2014; DE SOUZA et al., 2010; VIEIRA
et al., 2002).
Embora ocorram divergências na literatura, a internalização por endocitose tem dois
modelos propostos: lisossomal-dependente e lisossomal-indepedente (MOTT & BURLEIGH,
2008). O modelo lisossomal postula que o T. cruzi sinaliza para o aumento localizado e transitório
nos níveis de Ca+2, sinalizando para o recrutamento de lisossomos em direção à face
citoplasmática da região de adesão com parasito, onde a exocitose localizada dos lisossomos
fornece membrana para o vacúolo parasitóforo ácido (TARDIEUX et al., 1992; RODRIGUEZ et
al, 1996). O modelo lisossomal-independente baseia-se na internalização através de invaginações
de membrana que acumulam PIP3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate), o produto de PI3K
ativa (WILKOWSKY et al., 2001; 2002). Dependendo da cepa do parasita e do tipo celular há
uma preferência pelo modo de invasão, porém o mais comum e o que ocorre é via dependente
de cálcio (DUTRA et al, 2014).
Uma vez formado o vacúolo parasitóforo, a aquisição de marcadores lisossomais e o
aumento do perfil ácido são requeridos para iniciar o escape para o citoplasma da célula hospedeira
(TARDIEUX et al., 1992). Ao longo deste processo, o T. cruzi secreta proteínas como peroxidases
e superóxido dismutases que o protegem contra espécies reativas de oxigênio (ANDRADE &
ANDREWS, 2004), além de transialidase/neuraminidases que removem resíduos de ácido siálico
das glicoproteínas como LAMP1 e LAMP2 presentes na face luminal do vacúolo fragilizando a
membrana do vacúolo (SIBLEY, 2011). Outro produto secretado é o peptídeo TcTOX, um fator
com homologia ao fator 9 do complemento humano, promovendo pequenos poros na membrana e
levando à fragmentação do vacúolo (ANDREWS & WHITLOW, 1989; NARDY et al, 2016).
Depois do escape há diferenciação no citoplasma para forma amastigota, e após várias
rodadas de duplicação as amastigotas se diferenciam na forma tripomastigota sanguícola, que é
liberada na corrente sanguínea através da lise da célula hospedeira pelo movimento flagelar do
parasito (HALL et al., 1992).
7
Até o momento acredita-se que a participação das galectinas nesse processo tem
influência no contexto da migração do parasito na matriz e na interação com a membrana celular
(CARDENAS et al., 2010). Principalmente no processo de reconhecimento/invasão devido a
Galectina-3 reconhecer como PRRs, os oligossacarídeos específicos na membrana do T. cruzi,
promovendo o reconhecimento/opsonização do parasito.
1.4 Galectinas (Classificação & Estrutura)
As galectinas são encontradas em diversos organismos desde fungos, nematódeos,
insetos, até vertebrados (BAUM et al., 2014). As galectinas compõem uma família de proteínas
que têm a capacidade de se ligar a glicídios, tendo afinidade principalmente por moléculas
contendo β-galactosídeos (QUATTRONI et al., 2012). Entre os mamíferos a organização dos
genes e a estrutura primária da proteína galectina são bem conservadas tendo em comum um
domínio de reconhecimento de carboidratos denominado CRD (Carbohydrate Recognition
Domain) tendo a conformação de folhas beta-pregueada em torno de 130 aminoácidos
(GOODMAN et al., 2014).
Com base no domínio CRD as galectinas são divididas em três diferentes tipos: proto,
chimera e tandem-repeat. As galectinas do tipo proto se associam por ligação não-covalente
com caráter hidrofóbico formando homodímeros (Figura 4). O tipo chimera possui a porção
N-terminal (onde ocorre o reconhecimento) e C-terminal rica em prolina e glicina, sendo a única
que tem a capacidade de formar pentâmeros. As galectinas do tipo tandem-repeat se associam
por uma ligação peptídica funcional entre dois CRDs, formando heterodímeros (Figura 4)
(VASTA et al, 2012). Até hoje foram descobertos 15 isoformas, sendo as galectinas 1, 2, 5, 7,
10, 11, 13, 14 e 15 do tipo proto, a Galectina-3 sendo a única do tipo chimera, e as galectinas 4,
6, 8, 9 e 12 do tipo tandem-repeat (VASTA et al., 2012). Acredita-se que galectinas do tipo
tandem-repeat tenham surgido devido a duplicação no gene do domínio CRD na evolução dos
cordados, formando um gene de galectina com domínio bi-CRD, junto a mudanças de
localização de exóns e introns, levando posteriormente a diferenciações nos terminais COOH e
NH2, o que gerou os diversos genes de galectina (VASTA et al., 2012).
Apesar de compartilharem um domínio conversado, as galectinas possuem diferenças
significativas na sua forma de interação, seja pela especificidade ao resíduo de galactose, seja por
modificações pós-traducionais. As galectinas podem formar estruturas muito bem ordenadas de
glicoconjugados, com cada isoforma tem preferência de ligação a um carboidrato, e normalmente
8
apresentando ligações bivalentes ou multivalentes, como no caso da Galectina-3 que forma
pentâmeros (BOER et al., 2010).
FIGURA 4. Esquema da estrutura dos diferentes tipos de galectinas, sua divisão e interação. Adaptado
de BRAEUER et al., 2012).
Essas diferenças no glicídio de ligação levam a implicações nas suas atividades
biológicas, gerando uma diversidade de ação e também complicações em distúrbios patológicos
de interação proteína-glicídio (SINDREWICZ et al., 2016).
Embora esses resíduos de carboidratos estejam amplamente distribuídos entre diferentes
células e tecidos e sejam compartilhados por um grande número de glicoproteinas e glicolipidos,
os membros individuais da família de galectina podem selecionar com qual molécula interagir
em diferentes tipos celulares, o que sugere que mecanismos adicionais, incluindo co-interações
proteicas, conformação e/ ou orientação dos motivos glicanos podem também determinar as
preferências de ligação das galectinas (RABINOVICH & CONEJO-GARCIA, 2016).
As galectinas não possuem uma sequência sinal clássica de peptídeos exportados via
complexo de Golgi, sendo assim exportadas pela via secretória não clássica (OCHIENG et
al., 2004; BACIGALUPO et al., 2013). Estudos também indicam que Galectina-3 pode ser
secretada através de estruturas vesiculares concentradas no lado citoplasmático, externalizadas
após sinalização (HUGHES, 1999), ou secretadas através de microvesículas e exossomos
(THÉRY et al., 2001). Uma vez liberada na ECM, a Galectina-3 pode interagir com uma miríade
de parceiros moleculares com implicações em processos fisiológicos naturais e patológicos
9
como a cascata de invasão-metástase na progressão do câncer (OCHIENG et al., 2004;
NANGIA-MAKKER et al., 2007).
1.5 Galectinas (Funções Pleiotrópicas)
Essas proteínas possuem uma vasta distribuição celular-tecidual, podendo ser
encontradas no citoplasma, na membrana plasmática, núcleo e matriz extracelular, tendo
diversas funções como adesão celular, migração, resposta imune inata e adquirida, angiogênese,
tumorigênese, e apoptose, sendo que para cada galectina há particularidades de expressão
tecidual. (VIGUIER et al., 2014).
Vários estudos comprovaram que as galectinas participam da imunidade inata e
adaptativa (LAURENT-CEDENO et al., 2012). Galectinas podem influenciar vários processos
imunes incluindo: ativação de células imunes precursoras com maturação/diferenciação,
polarização, produção de citocinas e viabilidade celular (RABINOVICH &CONEJO-GARCIA,
2016).
No caso da imunidade adaptativa há ligação com a homeostasia celular, u m a v e z
q u e as interações mediadas pelas galectinas podem ativar a maturação das células B e sua
diferenciação (VASTA et al., 2012). Galectinas como galectina-1 também participam do
controle da maturação das células T, controlando a proliferação e apoptose dessas células, além
de controlarem a produção de citocinas pró- e anti-inflamatórias, e consequente polarização
Th1/Th2 do sistema imune (SILVA-MONTEIRO et al., 2007).
Durante a adesão celular, as galectinas podem inibir ou promover a adesão, dependendo
da galectina em questão, e das condições fisiológicas que em última instância irão determinar a
polarização celular e as interações com a ECM (FRIEDRICHS et al., 2007). A participação
destas proteínas na adesão célula-célula e célula-matriz advêm da capacidade de interação com
carboidratos e glicoproteínas, apesar disso pouco se sabe como ocorre a inibição da adesão
celular pela galectina, mas acredita-se que seja graças a impedimentos estereoquímicos que
ditam a repulsão das cargas das proteínas, impossibilitando a interação da galectina com as
moléculas de matriz (HADARI et al., 2000).
Outro papel importante das galectinas está associado com a angiogênese que é o
crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de capilares pré-existentes, para que isso ocorra
são necessários eventos como destruição da matriz no local, migração e proliferação de células
endoteliais, e formação do vaso e nova ECM (THIJSSEN et al., 2014). As galectinas 1, 3 e 8
10
ativam a liberação do VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (ETULAIN et al., 2014,
THIJSSEN et al., 2015).
Estudos demonstraram que Galectina-3 estimula a formação de novos capilares em
camundongos pela interação com glicanos e integrinas expressas na superfície de células
endoteliais, essa interação ativa FAK (Focal Adhesion Kinase) modulando a expressão de
fatores angiogênicos como VEGF e bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), ambos intervêm
na angiogênese (NEWLACZYL et al., 2011).
Há também o papel das galectinas relativo à ativação plaquetária, o qual inclui as
galectinas 1 e 8, que participam do processo inicial de ativação plaquetária e formação de
agregados de plaquetas-leucócitos (ROMANIUK et al., 2011).
No processo inflamatório temos participação das galectinas 1, 3 e 9 e dependendo do
contexto elas podem atuar de forma pró- ou anti-inflamatória. As galectinas secretadas no local
da inflamação interagem com glicoproteínas específicas e iniciam uma cascata de sinalização
que pode levar a diferentes respostas, por exemplo no caso da galectina-1 (Gal-1) pode atuar em
ambas funções, pró e anti-inflamatória, mas no caso de adição de Gal-1 extracelular atenua a
inflamação e autoimunidade em vários modelos com rato inclusive em doenças como artitrite e
diabetes (Figura 5) (SCHNAAR, 2016).
Um dos papéis mais estudados acerca das galectinas seria seu envolvimento na
tumorigênese, alterações na expressão gênica de galectinas estão relacionadas com
agressividade e capacidade metastática de tumores (TRONCOSO et al., 2012). Sua ligação com
o fenótipo metastático se dá pela capacidade de células tumorais se ligarem a componentes de
matriz possibilitando assim a invasão em diversos tecidos (BRAEUER et al., 2012). Outras
vezes, a agressividade é associada com a apoptose, uma vez que diversas galectinas se
mostraram participantes do processo apoptótico, tornando células mais res i s ten tes a morte
celular (Figura 5) (ST-PIERRE et al., 2012).
11
FIGURA 5. Locais de atuação das galectinas em diferentes cascatas de sinalização celular. A) Atuação
na transformação de células normais em células tumorais. B) Atuação no processo de resistência à
apoptose em tumores. C) Participação no controle do ciclo celular. Adaptado de BRAEUER et al., 2012.
1.6 Galectina-3
A Galectina-3 foi nomeada primeiramente como Mac-2, um antígeno de superfície
encontrado em macrófagos peritoneais murinos quando tratados com tioglicolato
(RADOSAVLJEVIC et al., 2012). É a única galectina do tipo chimera, sendo capaz de formar
pentâmeros, possuindo de 29-35kDa e tendo na porção C-terminal o domínio CRD com
atividade de lectina clássica (BOER et al., 2010). É capaz de se ligar com β-galactosídeos,
principalmente moléculas contendo β-1,6-N-acetilglucosamina (FORTUNA-COSTA et al.,
2014).
Galectina-3 possui 3 motivos estruturais, sendo um domínio com terminal-NH2, contendo
um resíduo de serina que é alvo de fosforilação, um segundo com motivo de sequência do
colágeno tipo alfa, e um terminal-COOH onde se encontra o domínio CRD (Figura 6) (ÇAY,
2012).
12
FIGURA 6. Estrutura esquemática da Galectina-3 e sua interação. A: Motivos estruturais encontrados
em Galectina-3 e seu parceiro molecular; B: Polimerização das galectinas com a formação de
pentâmeros. Adaptado de Fortuna-Costa et al., 2014.
Galectina-3 é encontrada em todos metazoa examinados, desde esponjas e fungos, até
invertebrados e vertebrados. Possui distribuição altamente difundida por todos os tecidos e
diferentes tipos celulares em mamíferos. Em humanos, a proteína é codificada pelo gene
LSGAL-3 localizado no cromossomo 14, composto por seis éxons e cinco íntrons, dando um
total de em torno 17kb (ZEINALI et al., 2015). Além de sua região promotora, o primeiro éxon
possui alto percentual de ilhas CpG, indicando um mecanismo epigenético de controle da
expressão (CARDOSO et al., 2016) (Figura 7).
Galectina-3 é a mais bem caracterizada da sua família, tendo distribuição ubíqua,
podendo ser encontrada em diversos tecidos (NEWLACLZY et al., 2011). Particularmente, a
Galectina-3 está envolvida com: proliferação, diferenciação celular, apoptose, adesão celular,
resposta inflamatória, e interação da célula hospedeira com os microorganismos (Figura 8)
(ALVES et al., 2010).
Galectina-3 tem presença ubíqua sendo encontrada no núcleo, citopasma, membrana
citoplasmática e na matriz extracelular. Como não apresenta sequência sinal para exportação
pela via clássica reticulo endoplasmática∕Complexo de Golgi, acredita-se que a exportação seja
por vesículas autofágicas ou exossomos, afinal Galectina-3 já foi encontrada em exossomos
de células dendríticas, células leucêmicas, e células tumorais de bexiga (RUVOLO, 2016).
13
FIGURA 7. Estrutura da Galectina-3. Representação esquemática dos nucleotídeos (genoma e cDNA)
e da estrutura da proteína primária e terciária. Adaptado de AHMED & ALSECK, 2015.
De acordo com o tipo celular e as condições ambientais experimentais a Galectina-
3 pode se encontrar somente no citoplasma como somente no núcleo ou então em ambos os
compartimentos tendo implicações no estresse e morte celular (HAUDEK et al., 2010).
Estudos demonstram que Galectina-3 localizada no núcleo pode ser fosforilada e a
forma presente no citoplasma pode ser tanto fosforilada quanto não fosforilada. A região N-
terminal contém um resíduo de serina 6 que pode ser fosforilado, possibilitando a translocação
núcleo-citoplasma (TAKENAKA et al., 2004).
O domínio CRD além da importância na ligação a carboidratos tem papel
fundamental na localização subcelular da Galectina-3, pois é no domínio CRD que estão
localizadas as sequências de localização nuclear (NLS) e sequência de exportação nuclear
(NES). A Galectina-3 monomérica é importada para o núcleo por difusão passiva, porém sua
forma multimérica é importada via mecanismo mediado por importinas do poro nuclear
(RUVOLO, 2016).
14
FIGURA 8. Representação didática simplificada da associação da Galectina-3 em suas diversas
funções Retirado de NEWLACLZY et al., 2011.
Como dito anteriormente Galectina-3 está também associada ao estudo de câncer porque
seu aumento está relacionado com a migração e invasividade de células em vários tipos de
tumores tais como: câncer de pulmão, mama, estômago, melanoma, sarcoma e leucemia mielóide
crônica. Galectina-3 media a interação célula-matriz a qual atua modulando a fixação e
desprendimento das células tumorais do sítio primário e migração e invasão das células
metastáticas através da ligação com componentes da ECM presentes n o s tecidos como:
laminina, fibronectina, elastina, colágeno IV, hensina e tensina-R e -C (FUNASAKA et al.,
2014). Outra associação de Galectina-3 com tumores sugere que Galectina-3 regule a proliferação
normal da célula e o aumento da expressão resulta na formação de células tumorais possibilitando
a metástase (CHIU et al., 2010).
Como dito anteriormente, galectinas e especialmente a Galectina-3 participam na
angiogênese, sendo essa etapa também importante no processo invasivo e metastático de
tumores, possibilitando a irrigação do tumor com excesso de oxigênio e nutrientes. Além do
enfoque de estudo em tumores, Galectina-3 também está interligada com problemas
cardiovasculares, tal como, infarto e aterosclerose. No caso do infarto agudo do miocárdio, a
Galectina-3 favoreceria o processo inflamatório e fibrocístico (MADRIGAL-MATUTE et al,
2014). No caso da fibrose causada pelo infarto agudo do miocárdio, Galectina-3 seria um dos
mediadores da aldosterona que conduz o recrutamento de macrófagos e inflamação local, tendo
grande importância na formação de fibrose no local de disfunção miocárdica (LIN et al., 2014).
Adicionalmente foi demonstrada associação de Galectina-3 no processo de fibrose de
diversos outros tecidos tais como fígado, coração e rins. Nesses trabalhos foi observada a co-
15
localização de Galectina-3 com macrófagos e fibroblastos, responsáveis pelo processo de fibrose,
sugerindo que Galectina-3 atue como um importante mediador de renovação de AGEs
(Advanced Glycation End products) e seu acúmulo estaria associado com avanço de idade e
estresse oxidativo (BOER et al., 2010). Sugere-se que Galectina-3 atue no processo fibrótico de
remodelamento da ECM através do aumento das proteínas de matriz via ativação de JAK/STAT
(Janus Kinase/Sinal Transdutor and Ativador Transcricional) e proteína PKC (Protein Kinase
C) (HARVEY et al., 2016).
Outro ponto importante de ressaltar é a participação da Galectina-3 no processo
inflamatório, uma vez que, estudos mostraram que a presença de Galectina-3 estava associada ao
aumento dos marcadores de inflamação, tais como: interleucina-6 e proteína C reativa (ELIAZ
et al., 2013).
1.7 Contribuição de Galectina-3 na Fisiopatologia da Doença de
Chagas
A Galectina-3 tem papel importante na interação com patógenos, principalmente no T.
cruzi, participando tanto do processo de interação e invasão quanto do processo de migração do
parasito na matriz extracelular. Moody e colaboradores (2000) demonstraram que a Galectina-3
reconhece através do seu domínio CRD β-galactosídeos presentes em glicoproteínas da superfície
do parasito, com pesos moleculares estimados de 45, 32 e 30 kDa.
Uma das glicoproteínas do parasito que interagem com Galectina-3 é a mucina de
superfície, Tc45, a qual é expressa somente em formas tripomastigotas, e é também liberada no
meio extracelular pelo parasito (TURNER et al., 2002).
Em células musculares lisas de artérias coronarianas mostrou-se que a Galectina-3
participa no processo de adesão, reconhecendo as diversas moléculas glicosídicas presentes na
superfície da membrana do parasito, correlacionando os altos níveis de Galectina-3 com aumento
da adesão/reconhecimanto dos parasitos às células (KLESHCHENKO et al., 2004). Em células
dendríticas infectadas pelo T. cruzi foi observado um aumento na expressão de Gal-3, provocando
também uma alteração no perfil de glicoconjugados de superfície (VRAY et al., 2004).
Como Galectina-3 é um componente ubiquitário de matriz extracelular (ECM), é predito
que a interação de Galectina-3 com glicoproteínas do parasito e o consequente aumento na
expressão de Galectina-3 facilitaria a infecção no processo inicial de adesão/migração à ECM e
reconhecimento da célula hospedeira nos tecidos infectados (CARDENAS et al., 2010; NDE et
al., 2012).
16
Um exemplo que corrobora essa função de Galectina-3 sobre a infecção diz respeito a
sua ligação com laminina γ-1 (LAMC1), a laminina mais abundante na ECM. Uma vez que a
glicoproteína Tc45 de tripomastigotas consegue se associar com Galectina-3, essa associação
serviria de ponte molecular para acesso do parasito à laminina γ-1 da ECM, recrutando um número
significativo de parasitos para a ECM, potencializando a infecção tecidual (MOODY et al., 2000;
KLESHCHENKO et al., 2004; NDE et al., 2012).
Além da atuação extracelular, há uma co-localização intracelular da Galectina-3 com
os vacúolos parasitóforos contendo T. cruzi, sendo Galectina-3 um importante marcador para
identificação do vacúolo parasitóforo, uma vez que, enquanto houver a co-localização há a
manutenção do vacúolo parasitóforo (REIGNAULT et al., 2014).
1.8 Apoptose
A homeostasia das células é mantida por diversos mecanismos incluindo processos
intracelulares e extracelulares. Existem diversos fatores que forçam as células a se adaptarem
como: hipertrofia, hiperplasia, atrofia e metaplasia podendo levar as células a se estabilizarem
ou não. Caso a célula não se estabilize devido a um estresse prolongado, ocorrem mudanças
irreversíveis à célula, levando a sua morte por dois modos distintos: apoptose ou necrose
(GKOGKOU et al., 2014).
A necrose leva a lise da membrana da célula e extravasamento das enzimas celulares
para a matriz, causando um processo inflamatório ao redor, além disso, a necrose é caracterizada
pela presença de corpos celulares anucleados, chamados de “células fantasmas” (CHAN et al.,
2015).
Ao contrário da necrose, a apoptose é um evento fisiológico normal, sendo um processo
ativo com sinalizações moleculares específicas, a qual não gera um processo inflamatório
secundário, devido ao não rompimento celular (GKOGKOU et al., 2014).
A apoptose foi definida como um mecanismo de controle de morte celular tendo um papel
antagônico à mitose no controle da população das células animais, assim, mantendo a
homeostasia dos tecidos (KERR et al., 1972).
Inicialmente a apoptose foi definida como “necrose redutora”, e duas fases desse
processo foram bem descritas: encolhimento da célula com a externalização de PS
(Phosphatidylserine) e alterações morfofuncionais nucleares e citoplasmáticas com formação dos
corpos apoptóticos (KERR et al., 1972; VOROBJEV & BARTENEVA, 2016). Essas principais
alterações morfológicas correspondem à condensação da cromatina com ativação de
17
endonucleases e fragmentação do DNA, além de uma morfologia típica onde prevalece a
preservação das organelas, desidratação da célula com encolhimento e “blebs” (WLODKOWIC
et al., 2011).
A cascata d´apoptose ocorre por etapas altamente reguladas que incluem ativação,
propagação e execução de diversos passos que são controladas por proteínas com atividade de
cinase e sublocalização celular específica (SINGH et al., 2016). Em síntese, a apoptose pode se
dar por duas vias clássicas: (1) a via extrínseca que está relacionada a receptores de morte celular
presentes na membrana plasmática e é ativada por ligantes extracelulares podendo ocorrer de
modo dependente ou independente das alterações mitocondriais, (2) e a via intrínseca que está
associada com a despolarização da membrana mitocôndria promovida por mediadores
intracelulares com posterior ativação de vias citoplasmáticas. Embora os sinais apoptóticos não
sejam sinérgicos, existem moléculas que podem participar de ambas cascatas, intrínseca e
extrínseca, convergindo a sinalização de morte (GREEN & LLAMBI, 2015; LIU et al., 2014).
A família de proteínas envolvida no processo de apoptose mais conhecida é das capases
de cisteíno-proteases que se encontram na forma inativa de pró-enzimas (zimogênio) (SAVLA
& MINKO, 2016). Em ambas as vias, intrínseca e extrínseca, há a participação da cascata de
caspases (LIU et al., 2004) que clivam ligação peptídicas em resíduo de ácido aspártico
(HASANBASIC et al., 2016). Até momento foram identificados 14 isoformas de caspases
atuantes em humanos, sendo classificadas conforme sua atuação na apoptose em: iniciadoras
(caspases-2, -8, -9, -10) e efetoras (caspases-3, -6 -7) (RYOO, 2016).
As caspases iniciadoras dimerizam-se através de uma região chamada de pró-domínio
constituído por domínios DED (Dead Effector-Domain) e CARD (Caspase Activation and
Recruitment Domain). Uma vez dimerizadas, elas sofrem processamento proteolítico com cada
monômero produzindo duas subunidades, uma maior e uma menor, formando um
heterotetrâmero ativo (HWANG & KIM, 2015). Uma vez ativas, as caspases iniciadoras clivam
as pró-caspases executoras, ativando-as, e iniciando assim a cascata proteolítica de diversos
substratos celulares, amplificando e disseminando o sinal de morte através da célula (ALBERT
et al., 2010).
Em ambas as vias, a integridade da membrana mitocondrial interna é comprometida
pela ligação da proteína Bax ativada na membrana externa da mitocôndria levando a liberação
de fatores apoptóticos, tais como citocromo c. Um ponto irreversível, que leva a um
comprometimento com a morte celular (WANG et al., 2014; VOROBJEV & BARTENEVA,
2016).
18
Assim que o citocromo c é liberado no citoplasma ele forma um complexo com APAF1
(Apoptotic Peptidase Activating Factor1). A seguir, há oligomerização e formação do
apoptossomo que ativa proteoliticamente a caspase-9 e por conseguinte a caspase-3. Outros
fatores que participam do evento são AIF (Apoptosis Induction Factor), Smac (Second
Mitochondria- derived Activator of Caspases), DIABLO (Direct IAP-Binding protein with Low
PI) e a serina protease Omi/HtrA2. Tais proteínas são oriundas da membrana interna da
mitocôndria e são liberadas no citoplasma se ligando as IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins).
As IAPs atuam como inibidoras seletivas das caspases, sequestrando-as e impedindo a ativação
proteolítica (Figura 9) (SANKARI et al., 2012).
FIGURA 9. Esquema das vias extrínseca e intrínseca de morte celular. A via de apoptose induzida por
receptores de morte resulta da ligação de FasL ao receptor Fas ou da ligação de TNF ao TNFR1 (A). O
recrutamento de TRADD e/ou FADD resulta em ativação de pró-caspase-8 e subsequente ativação de
caspase-3. A ativação da via mitocondrial de morte celular resulta em liberação de citocromo c e formação
do complexo apoptossomo formado por Apaf-1 e caspase-9 (B). Essas duas vias levam à ativação de
caspase efetoras como caspase-3. Adaptado de HUNTER et al., 2007.
19
A via extrínseca se inicia após a associação de ligantes, “sinais de morte”, aos receptores
de morte como Fas, TNFR-1 e TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) receptor 2,
depois há uma peculiar trimerização. A agregação dos domínios de morte induz a montagem de
mediadores intracelulares necessárias para a apoptose. Os receptores FAS e TNF R-1 recrutam a
proteína chamada FADD (Faz Associated Death Domain) que em associação com a caspase-8
formam o complexo de sinalização de indução de morte DISC (Death-inducing signaling
complex) (Figura 9).
Posteriormente, há a ativação da caspase-8 iniciadora, a qual cliva e ativa a caspase-3,
sendo esta, a caspase responsável pela clivagem das proteínas alvo para execução d´apoptose
(LU et al., 2007). Sendo assim, ambos os eventos, intrínseco e extrínseco, convergem na
ativação da caspase-3 (Figura 9) (LIU et al., 2004).
Um ponto da regulação da via intrínseca se dá pelas proteínas da família Bcl-2, composta
por 18 membros classificados com base na estrutura e identidade de sequências com atuação de
pró-sobrevivência ou pró-apoptose. Todos os membros da família apresentam domínio BH (Bcl-
2 Homology) nomeados de BH1-BH4, e divididos em dois grupos. Um grupo de proteínas com
atuação anti-apoptótica que apresenta 4 domínios BH além de um domínio transmembrana na
região C-terminal tendo como representantes Bcl-2, Bcl-xL, e Mcl-1 (LUNA-VARGAS &
CHIPUK, 2016). Um outro grupo antagônico com estímulo a apoptose conhecido como ‘BH3-
only proteins’ tem como representantes: Bax e Bak. Além disso, há um terceiro grupo que inclui
Bad, Bid, Bim, Puma, Noxa e BH3 (XIONG et al., 2014), que podem exercer função pró-
apoptótica por regulação tanto no nível transcricional (Puma e Noxa) quanto por fosforilação ou
por processamento proteolítico (Bad, Bim e Bid) (Figura 10) (STRASSER, 2005).
Na ausência de estímulos apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL formam heterodímeros com Bax e
Bak, mantendo assim a integridade da membrana mitocondrial. Particularmente, os membros anti-
apoptóticos da família se ligam a Bax e Bak sequestrando-os e impedindo os mesmos de induzirem
a permeabilização de membrana externa mitocondrial (KROEMER et al., 2007). Em caso de
estresse apoptótico, membros de Bax e/ou BH3 (BH3-only proteins) tem aumento de expressão,
levando ao aumento de proteínas pró-apoptóticas livres, não ligadas as proteínas pró-
sobrevivência, possibilitando assim alterar a permeabilidade da membrana mitocondrial,
promovendo a liberação de citocromo c (XIONG et al., 2014).
20
FIGURA 10. Pró- e anti-apoptóticos membros da família de Bcl-2. Adaptado de AL-KATIB et al,
2016).
Além do controle d´apoptose via família Bcl-2, há também contribuição dos membros
das IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins) que interagem e inibem a ação das caspases
(VASUDEVAN & RYOO, 2015). Estruturalmente todos os membros das IAPs possuem
aproximadamente 70 aminoácidos no domínio BIR (Baculoviral IAP Repeats), o qual é
essencial, mas não é o suficiente para atividade anti-apoptótica (GARG et al., 2016). Os três
membros mais bem caracterizados das IAPs são XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein),
c-IAP1 (cellular-IAP-1) e c-IAP2 (cellular-IAP-2), cada membro possui três domínios BIR que
são responsáveis por interações proteicas entre IAPs e outras proteínas como caspases (KOCAB
& DUCKETT, 2016).
1.9 Galectina-3 e Regulação sobre a Apoptose
A região C-terminal da Galectina-3 possui uma sequência de aminoácidos que é similar
ao domínio BH1 da família de proteínas Bcl-2 contendo o motivo NGWR, a qual é responsável
pela atividade anti-apoptótitca de Bcl-2 (Figura 11) (AKAHANI et al., 1997). A Galectina-3
pode participar tanto da via intrínseca quanto da via extrínseca d´apoptose (NANGIA-MAKKER
et al., 2007).
Vale ressaltar a importância da localização de Galectina-3 na regulação d´apoptose. A
função pró- ou anti-apoptótica se dá priomordialmente devido a sua sublocalização celular. Em
células de câncer de próstata um aumento de Galectina-3 no citoplasma tem função anti-
apoptótica (FUKUMORI et al., 2007). Outro fato importante é que Galectina-3 nuclear induz
um arresto do ciclo celular, resultando na inibição do processo apoptótico, tendo correlação
21
com regulação do ciclo celular através de ciclinas e inibidores de ciclina em células BT549 e
MCF10 (KIM et al., 1999).
FIGURA 11. Ilustração do domínio NWGR presente na estrutura primária da galectina-3.
Adaptado de FUKUMORI et al., 2007
A função anti-apoptótica da Galectina-3 está correlacionada em alguns modelos
celulares com translocação da Galectina-3 do núcleo para o citoplasma (HSU et al., 2006),
atuando de modo a impedir alterações do potencial de membrana mitocondrial (LIU et al., 2005).
Quando no citoplasma é sabido de seu caráter anti-apoptótico, pois no citoplasma
interage com proteínas da família de Bcl-2, impedindo a liberação de citocromo c. Essa regulação
sobre a polaridade da membrana mitocondrial suprimindo a liberação de citocromo c já foi
demonstrada em células tumorais de próstata e mama, e em cultura de linfoblastos de pacientes
com leucemia linfoblástica aguda (FUKUMORI et al., 2007). Em células de carcinoma de
tireoide foi demonstrado que o efeito anti-apoptótico ocorre pela interação direta com o pró-
apoptótico Bax, através do motivo NGWR, formando assim um heterodímero (HARAZONO et
al., 2014) (Figura 12). Além da interação com Bax no citoplasma, Galectina-3 também interage
com Bcl-2 por meio de ligação direta, inibindo o processo de apoptose, mimetizando a ação de
Bcl-2 e assim estimulando a ação anti-apoptótica de Bcl-2 (YANG et al., 1996). Ainda, em
diversos modelos tumorais, a Galectina-3 pode mediar a expressão de Bcl-2 e de outros membros
família, porém não se sabe qual mecanismo envolvido para esta regulação (RUVOLO, 2015).
A Galectina-3 também inibe indiretamente a apoptose por estimular vias de proliferação
que levam a sobrevivência celular tais como a via de Ras/Raf e via PI3K (Phosphoinositide 3-
Kinase Inhibitor) e AKT/PKB (Protein Kinase B), sendo que AKT funciona inibindo a apoptose
por bloquear a clivagem de Bid, a qual é essencial na liberação de citocromo c no citoplasma
(FUKUMORI et al., 2007). Outras proteínas MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) como
22
ERK1/2 (Extracellular Signal–Regulated Kinases) também sofrem um aumento da ativação
mediado por Galectina-3, ERK1/2 tem função de regularização da estabilização mitocondrial e
apoptose., uma vez que a ligação de Galectina-3 e Ras ativa toda sua via, incluindo mensageiros
secundários como ERK e AKT que culminam em sinalização a sobrevivência celular e inibição
d´apoptose (MENACHEM et al., 2015).
FIGURA 12. Modelo de interação entre Bax e Galectina-3 levando a inibição d´apoptose por impedir a
despolarização mitocondrial. Adaptado de HARAZONO et al., 2014.
Em modelos de câncer in vitro e in vivo a Galectina-3 representa um marcador
tumorigênico, o aumento da sua expressão favorece a atuação anti-apoptótica com consequências
indiretas sobre a proliferação (THIJSSEN et al., 2015). Como exemplo, em tumores de tireóide,
a Galectina-3 participa da via p53/HIPK2 com estímulos proliferativos, podendo representar
um importante marcador do tumor em questão (CHIU et al., 2010). Em linhagem de tumor
mamário Evsa-T a expressão em níveis elevados de Galectina-3 protege a célula de injúrias e
morte promovidas por TNF-α, reduzindo a produção de espécies reativas de oxigênio
(MATARESSE et al., 2000).
Por outro lado, a atuação pró-apoptótica da Galectina-3 se dá com diversos fatores tais
como: ligação com receptor Fas. Outra via de sinalização envolve a associação de Galectina-3
na ativação de MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), sendo que essa ligação pode ativar
3 vias que seriam via (i) ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) a qual é ativada por Ras-
Raf-MEK, (ii) p38, e (iii) JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase). Galectina-3 estabiliza Ras em seu
modo ativo e Ras uma vez ativo promove a translocação de Gal-3 para a membrana, promovendo
ainda mais a ativação de Ras, impulsionando a ativação de PI3-K (Phosphoinositide 3-Kinase),
assim através desse mecanismo regulam a proliferação e sobrevivência (CARDOSO et al., 2016).
23
Gao e colaboradores investigaram a participação de Gal-3 na transdução do sinal por ERK via
ativação de RAS e conseguiram demonstrar que Gal-3 exógena pode estimular positivamente
ERK1/2 junto a PKC. A via de p38 é muito pouco sabida assim como a de JNK, mas sabe-se que
Gal-3 extracelular induz a expressão de MMP-9 pela cascata de p38 MAPK em melanomas,
assim como se sabe que Gal-3 ativa elementos da cascata de JNK (CARDOSO et al., 2016).
Os níveis extracelulares de Galectina-3 também influenciam distintamente na apoptose,
e estes níveis são bem distintos entre diferentes tipos celulares. Altos níveis de Galectina-3
extracelular podem levar a indução do processo de apoptose a qual difere em diversos tipos
celulares. Essa indução de morte se dá pela ligação de Galectina-3 ao complexo CD29∕CD7 que
leva a despolarização mitocondrial o que induz a liberação de citocromo c e posterior ativação
de caspase-3 (NANGIA-MAKKER et al., 2007).
1.10. Tripanosomatídeos & Subversão da Apoptose
Em estado patológico, a apoptose em células infectadas é regulada, ou de um modo
autócrino ou por células imunes citotóxicas, e desempenha um papel chave na resolução de
infecções provocadas por patógenos intracelulares.
Em especial, os protozoários intracelulares como T. cruzi e Leishmania spp. são capazes
de regular múltiplos mecanismos de inibição da morte e pró-sobrevivência pelo tempo necessário
para diferenciação/proliferação em nicho seguro (DANIAL & KORSMEYER, 2004; CARMEM
& SINAI, 2007) (Figura 13).
Em suma, essa subversão das vias de morte provocadas por T. cruzi e Leishmania spp.
pode ocorrer através: (1) indução das vias de sobrevivência, (2) produção de fatores anti-
apoptóticos, (3) ou direta interação do parasito com moléculas mediadoras d´apoptose na célula
hospedeira (Figura 13). Entretanto, as vias moleculares que governam esses mecanismos
apoptóticos ainda carecem de investigação.
A ativação de proteínas da família NF-κB de fatores transcricionais também regula
positivamente a expressão de genes anti-apoptóticos incluindo Bcl-2, Bcl-xL,cIAPs, cFLIP,
interferindo tanto com a via extrínseca quanto intrínseca (PERKINS, 2007) (Figura 13).
A infecção intracelular por T. cruzi e Leishmania spp é normalmente acompanhada pela
produção de citocinas que podem induzir a apoptose nas células criando um ambiente hostil para
o parasito com altos níveis de FasL, TNF-α, IFN-γ, e outros, além do recrutamento de células
imunes de resposta TH1 (Gazzinelli & Denkers ,2006). Porém, essa resposta é ineficiente para
induzir apoptose em células infectadas, sugerindo uma forte pressão seletiva dos parasitos para
bloquear a apoptose.
24
FIGURA 13. Uma visão geral das vias apoptóticas mamíferos e os pontos de regulação por protozoários
intracelulares como Leishmania e Trypanosoma. Na via extrínseca, os ligantes no receptor de morte
desencadeiam a morte pelo processamento e ativação do iniciador de caspase-8, que, em seguida, ativa
diretamente o efector da caspase-3 (células tipo I) ou cliva a proteína Bid (células tipo II), criando conexão
entre as vias extrínseca e intrínseca. Na via intrínseca, diversos danos celulares resultam na ativação ou
regulação positiva de proteínas da família Bcl-2, que, em seguida, conduzem a despolarização da
membrana mitocondrial através da ativação Bax e Bak, ou através da inibição das proteínas anti-
apoptóticas Bcl-2. Despolarização da membrana mitocondrial resulta na libertação de citocromo c das
mitocôndrias e à montagem do apoptossomo que resulta na ativação de caspase-9. Protozoários
intracelulares podem interferir em vários níveis na cascata apoptótica modulando a sobrevivência celular.
Embora Leishmania sp. infectem primariamente macrófagos, outras células como
neutrófilos PMN (Polymorphonuclear Neutrophil Granulocytes) também são recrutados para o
sítio de inoculação em estágio inicial da infecção experimental (Mate & Olivier, 2002).
Leishmania pode provocar um atraso na morte celular programada dos neutrófilos em mais de 24
horas, beneficiando-se da proteção segura de um nicho intracelular (AGA et al., 2002). Esta
inibição em L. major envolve a inibição do processamento de pró-caspase-3 em caspase-3 ativa,
através da ativação por fosforilação de ERK1/2 (Signal Extracelular Kinase ½) (AGA et al.,
2002).
Outro trabalho demonstrou que a L. major inibe a apoptose por ambas as vias, intrínseca
e extrínseca pela regulação de Fas e Bid, diminuindo suas expressões, sendo que Fas é um
25
receptor de morte celular e Bid serve como intermediário entre a via intrínseca e extrínseca
(SARKAR et al., 2012). Sarkar e colaboradores (2013) também demonstraram que L. major
promove a ativação de pERK1/2, e esta via de algum modo promove aumento dos níveis das
proteínas antiapoptóticas Bfl-1 e Bcl-2, prevenindo a liberação do citocromo c da mitocôndria.
Outro trabalho constatou que a amastigota da L. mexicana induz a fosforilação de PI3K
e AKT, ambas, proteínas da via de sobrevivência celular, e diminui a expressão de p38 e JNK,
ambas, proteínas da via pró-apoptótica (VASQUÉZ-LÓPEZ et al, 2015).
Ruhland e colaboradores (2007) demonstraram em macrófagos Raw 264.7 infectados
com L. major que a via de PI3-K (Phosphatidylinosotol 3-Kinase)/PKB(Protein Kinase B) é
ativada na infecção, PKB (ou Akt) ativo é capaz de fosforilar e sequestrar a proteína pró-
apoptótica BAD, impedindo assim a liberação do citocromo c. Aparentemente, essa é uma via
ubíqua mediada por Leishmania, uma vez que outros autores também observaram a mesma
regulação em células dendríticas infectadas por L. mexicana (GUTIERREZ-KOBEH et al., 2013;
VALDES-REYES et al., 2009).
Os fosfoglicanos de superfície de Leishmania, a molécula majoritária na superfície de
promastigotas, também podem inibir a apoptose (MOORE & MATLASHEWSKI, 1994;
DONOVAN et al., 2009). No entanto, esse papel inibitório limita-se a fase inicial da infecção,
uma vez que após a diferenciação intracelular em amastigotas, já não observamos mais
fosfoglicanos na superfície do parasito (NADERER et al., 2004).
Além das vias de inibição de apoptose dados da literatura demonstram que
curiosamente, em células infectadas por Leishmania, a modulação das vias de sobrevivência não
envolve a atuação do dímero p65/p50 de NF-κB como um ativador transcricional clássico
(NEVES et al., 2010). Não obstante, nosso grupo demonstrou que L. amazonensis é capaz de
ativar o dímero p50/p50 de NF-κB, um clássico repressor transcricional (CALEGARI-SILVA et
al., 2009). Em macrófagos estimulados por LPS, a L. amazonensis promoveu a troca do clássico
dímero p65/p50 induzido por LPS pelo dímero repressor p50/p50, o qual modulou negativamente
a expressão de iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase), favorecendo o sucesso da infecção
(CALEGARI-SILVA et al., 2009). Possivelmente, a resposta inflamatória mediada por NF-κB
que resultaria da ativação de macrófagos e células dendríticas anularia os potenciais benefícios
pró- sobrevivência da ativação de NF-κB para os parasitos.
Por sua vez, o T. cruzi se utiliza principalmente da produção de fatores anti-apoptóticos,
indução das vias de sobrevivência, e modulação indireta de marcadores pró- anti-apoptóticos
(CARMEN & SINAI, 2007; SIBLEY, 2011). O primeiro fator anti-apoptótico descrito foi uma
trans-sialidase peculiar (CHUENKOVA & PEREIRA, 2000) que mimetiza o fator NGF (Nerve
26
Growth Factor), e foi denominado de PDNF (Parasite-Derived Mimic of Neurotrophic Factor)
(CHUENKOVA & PEREIRA, 2003). A atuação de PDNF ocorre pela ligação ao putativo
receptor de NGF, o receptor TrkA (Tropomyosin receptor kinase A) (CHUENKOVA &
PEREIRAPERRIN, 2004; 2005), promovendo a inibição d´apoptose em neurônios infectados
pela ativação da via de PI3-K/Akt, e redução da atividade de caspase-9 (CHUENKOVA et al.,
2001).
O segundo fator anti-apoptótico é uma molécula solúvel, a cruzipaína, capaz de proteger
células d´apoptose induzida pela privação de soro inibindo a ativação de caspase-3 (AOKI et al.,
2004). Células tratadas com cruzipaína têm a ativação de distintas vias de sobrevivência como
via de PI3K/Akt e a via das MAPKs como: JNK, p38 e ERK1/2 (AOKI MDEL et al., 2006).
Também em resposta à cruzipaína, a ativação por fosforilação de ERK1/2 mediada por MEK1
(MAPK/ERK kinase 1) aumenta os níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2, enquanto MEK1 e
PI3K ativas estão envolvidas na inativação do pró-apoptótico BAD (AOKI MDEL et al., 2006).
Ainda, os níveis de Bcl-xL e arginase também aumentam em células tratadas com cruzipaína
(AOKI et al., 2004) é sabido que a redução dos níveis de arginina catalisada pela arginase
contribui para inibir a apoptose (ESCH et al., 1998).
Em cardiomiócitos infectados, a inibição d´apoptose-induzida pela privação de soro ou
estímulo com TNF-α mostrou-se dependente de NF-κB (PETERSEN et al., 2006). Esse fenótipo
no coração pode ser importante para o estado de infecção persistente levando a cronicidade
cardiovascular da doença de Chagas.
Enquanto PDNF e cruzipaína atuam inibindo a apoptose respectivamente em neurônios
e cardiomiócitos pela via intrínseca, a infecção sistêmica poderia por outro lado promover uma
resposta imune capaz de ativar a apoptose pela via extrínseca (GAZZINELLI & DENKERS,
2006). Entretanto, o T. cruzi modula os primeiros passos da via extrínseca mediada por receptores
de morte como Fas e TNFR1 (NAKAJIMA-SHIMADA et al., 2000), inibindo a ativação destes
receptores através da proteína c-FLIP (cellular FLICE Inhibitory Protein) (HASHIMOTO et al.,
2005). A c-FLIP é uma ubíqua inibidora dos receptores de morte que atuaria impedindo o
recrutamento da mólecula adaptadora FADD para o receptor de morte e consequente montagem
do complexo de sinalização indutor de morte (DISC, Death-Inducing Signaling Complex) (vide
Figura 13) (SAFA, 2012). Em células infectadas, c-FLIP tem um acúmulo nos níveis proteicos,
o estímulo do receptor Fas em células infectadas induz um recrutamento de c-FLIP bloqueando
a formação do complexo DISC e a ativação pró-caspase-8, o que ocorreria normalmente após
interação de FasL com o receptor Fas (HASHIMOTO et al., 2005). Estas distintas comprovações
27
demonstram que há uma estratégia múltipla para inibir a apoptose após a ativação de diferentes
vias de transdução de sinal durante a infecção inicial pelo T. cruzi (Tabela 1).
TABELA 1. Modulação d´apoptose durante a infecção por T.cruzi. Adaptado de CARMEN & SINAI,
2007.
28
2. OBJETIVO
Investigar a contribuição de Galectina-3 sobre as vias de sinalização celular responsáveis
pela sobrevivência e subversão da morte celular programada (apoptose) em células humanas
infectadas por Trypanosoma cruzi, utilizando como modelo de estudo a linhagem HeLa de
adenocarcinoma humano com níveis endógenos de Galectina-3 ou depletados por interferência de
RNA.
2.1 Objetivos específicos
A) Estabelecer condições farmacológicas de morte utilizando como modelo celular a linhagem
HeLa de adenocarcinoma humano:
Análise da viabilidade celular por citometria de fluxo após tratamento com etoposídeo;
Investigação dos níveis proteicos de Galectina-3, PARP, Bcl-2, e Bax em reposta ao
tratamento com etoposídeo;
B) Determinar a participação de Galectina-3 sobre vias de sobrevivência e morte no decorrer da
infecção pelo T. cruzi:
Confirmar a redução nos níveis de Galectina-3 por interferência de RNA na linhagem HeLa;
Investigar a viabilidade e a proliferação celular em resposta à infecção pelo T. cruzi na
linhagem controle (HeLa wt, HeLa scramble) e linhagem depletada de Galectina-3 (HeLa shGal-
3);
Investigação dos níveis proteicos de Galectina-3, PARP, Bcl-2 e Bax em resposta à infecção
pelo T. cruzi na linhagem controle (HeLa wt, HeLa scramble) e linhagem depletada de Galectina-
3 (HeLa shGal-3);
C) Determinar a mobilização de Galectina-3 para subdomínios celulares no decorrer da infecção
pelo T. cruzi:
Avaliar por fracionamento celular os níveis citoplasmáticos/nucleares de Galectina-3;
Avaliar por imunofluorescência os níveis citoplasmáticos/nucleares de Galectina-3;
Correlacionar a localização de Bax com a translocação de Galectina-3.
D) Determinar se ausência de Galectina-3 em células tratadas com etoposídeo altera a viabilidade
de células infectadas
Investigar a viabilidade celular nas linhagens de HeLa pré-tratadas com etoposídeo e
infectadas com T. cruzi.
29
3. METODOLOGIA
3.1 Células utilizadas (Linhagens celulares e Protozoários)
Tripomastigotas de cultura foram produzidos utilizando a linhagem VERO pcDNA3.1,
uma linhagem de células epiteliais renais de macaco verde africano transfectada com plasmídeo
pcDNA3.1 para conferir resistência a droga G418.
Para o ensaio de infecção e extração de proteínas foi utilizada como modelo de estudo a
linhagem HeLa, uma linhagem humana de adenocarcinoma cervical, além de linhagens HeLa-
scramble com a expressão de um shRNA (short hairpin RNA) controle não relacionado e
HeLa shGal3 com expressão de um shRNA direcionado para RNAm de Galectina-3, tais
linhagens foram cedidas por Renato Carvalho (UFRJ, Faculdade de Farmácia). As construções
utilizadas para modificação genética em células HeLa foram obtidas previamente a esse trabalho
através do empacotamento viral em células HEK293-FT dos arcabouços dos vetores pLKO.1-
wild type e pLKO.1-shGAL3. O sobrenadante viral obtido de células HEK-293FT foi então
utilizado para transduzir as células HeLa seguido da s eleção com droga puromicina, cujo
gene de resistência é parte do arcabouço do vetor pLKO (CARVALHO et al., 2014).
As células infectadas e não infectadas: VERO pcDNA3.1, HeLa WT, HeLa-scramble e
HeLa-sh Gal3 foram mantidas em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium)
(Gibco Thermo Scientific) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma Aldrich Corp.)
e estreptomicina∕penicilina a 100μg∕mL. Para passagem das células foi utilizado 0,25%
tripsina∕PBS, após centrifugação a 1000g por 5 minutos em centrífuga clínica, as células foram
resuspendidas em meio de cultura e semeadas. No caso das células VERO pcDNA3.1 o meio
foi complementado com G418 (Sigma Aldrich Corp) na concentração de 300μg∕mL.
3.2 Linhagens de parasitos utilizadas
A cepa de Trypanosoma cruzi utilizada nos experimentos foi a cepa Dm28c com
expressão constitutiva de GFP (Green Fluorescent Protein).
A expressão constitutiva de GFP em Trypanosoma cruzi Dm28c foi previamente obtida
através da transfecção com o vetor pTEX-GFP (KELLY et al., 1992), mantendo a pressão
seletiva com droga G-418 (Sigma Aldrich Corp) para manutenção epissomal do vetor.
A forma epimastigota do parasito foi mantida em meio LIT (Liver Infusion Tryptose)
(4.0 g NaCl, 0.4 g KCl , 8.0 g Na2HPO4 , 5.0 g Triptona, 5.0 g Infusão de fígado (Liver Infusion
Broth) e 1 ml da Hemina dissolvida em 0.1 M de NaOH (10 mg/ml) estéril) complementado
30
com 10% soro fetal bovino (Sigma Aldrich Corp.), 0,025 mg∕mL de hemina 300 μg∕mL de
G418.
Para diferenciação in vitro de epimastigotas em formas tripomastigotas metacíclicos foi
utilizado o protocolo de metaciclogênese descrito por Contreras e colaboradores (1985). Para este
propósito, as formas epimastigotas foram mantidas em meio LIT suplementado em 15% de soro
fetal bovino (Sigma-Aldrich Corp.) e 100μg∕mL estreptomicina∕penicilina (Thermo Scientific)
por 5 dias. Após alcançar a fase estacionária, 109 parasitos foram centrifugados a 2000 rpm em
centrífuga clínica por 10 minutos e foram feitas lavagens ressuspendendo o pellet em meio TAU
(NaCl 190mM, KCl 17mM, MgCl2 2mM, CaCl2(2mM, Tampão fosfato pH 6,0 8mM, NaHCO3
0,6mM) e centrifugado a 2000 rpm em centrífuga clínica por 10 minutos. O mesmo processo de
lavagem foi realizado duas vezes. Após as lavagens foram contadas 109 epimastigotas com
auxílio do hemocitômetro e foram ressuspensas em 1 mL de meio TAU pH 6,0 em tubos falcon
de 15mL.E então foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente (25oC). Uma vez
incubadas as epimastigotas foram ressuspensas em meio TAU3AAG (Meio TAU acrescido de
Glicose 10mM, I-Prolina 10mM, Glutamato de sódio 50mM e Aspartato de sódio 2mM) pH 6,5
na proporção 5x106 por mL em garrafas de cultura e mantidos a temperatura de 27oC. As formas
epimastigotas aderem-se ao fundo do frasco e em torno de 5 a 6 dias os parasitos se diferenciam
para a forma tripomastigota e se soltam do frasco mantendo-se no sobrenadante da cultura.
3.3 Ensaios de infecção e produção de tripomastigotas
Após a metaciclogênese os tripomastigotas metacíclicos foram coletados e
centrifugados a 3400 rpm por 15 minutos em centrífuga clínica, ressuspendidos em RPMI
10% soro fetal bovino, streptomicina∕penicilina a 100μg∕mL e G418 300μg∕mL e semeados na
cultura de células VERO pcDNA3.1 e semeados sobre cultura semiconfluente de células
VERO pcDNA3.1 em torno de 106 células e em torno de 5x106 a 107 parasitos, tendo assim uma
proporção de 5 a 10 parasitos por célula, ou seja, uma m.o.i de 5 até 10.
Cerca de 48 após a adição dos parasitos, foi realizada a troca do meio e a cultura foi
acompanhada até o brotamento de formas tripomastigotas de cultura. Aproximadamente no
terceiro ou quarto dia pós-infecção, o sobrenadante contendo os parasitos foi coletado e para
separação das formas amastigotas e células mortas das formas tripomastigotas foi feita uma
centrifugação diferencial de 900 rpm em centrífuga clínica por 2 minutos em centrífuga clínica,
após centrifugar deixar no mínimo 5 minutos em repouso para caso haja centrifugado
tripomastigotas de cultura volte ao sobrenadante.
31
Após o repouso foi feita a coleta do sobrenadante e foi centrifugado a 3400 rpm por 15
minutos em centrífuga clínica formando um pellet com a forma tripomastigota, o precipitado
então obtido foi ressuspenso em meio RPMI e o número de parasitos foi estimado em
hemocitômetro.
As infecções das diferentes linhagens HeLa, destinadas aos ensaios funcionais e VERO
pc DNA 3.1, destinadas a produção de massa parasitária, foram realizadas na proporção de 5 a
10 parasitos por célula, ou seja, uma m.o.i de 5 até 10.
3.4 Ensaio de viabilidade celular (MTT)
Aproximadamente, 3000 células das diferentes linhagens de HeLa (HeLa WT, HeLa
scramble e HeLa shGal-3) foram plaqueados por poço numa placa de 96 poços. Para a análise de
viabilidade das células no decorrer da infecção, formas tripomastigotas de cultura foram
adicionadas às células após a prévia adesão destas por período de 3 horas com m.o.i 5 a 10. Em
ambos os casos, células infectadas e não infectadas ficaram incubadas em diferentes tempos (24,
48, 72 e 96 horas). Após o tempo de incubação os poços foram lavados com PBS e foi adicionado
100µL de MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-DiphenyltetrazoliumBromide)
Sigma-Aldrich Corp.) na concentração de 0,5mg∕mL por poço diluído em meio de cultura sem
soro. Uma vez adicionado o MTT foi feita a incubação da placa em estufa a 37oC no escuro entre
3 a 4 horas. Após a adição de MTT e incubação foi adicionado 100µL de solução SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate) 10% em HCl 0,01M com incubação a 37oC no escuro pernoite. Posteriormente
foi feita a leitura no leitor de ELISA Espectra Max 190 Molecular Devices no comprimento de
onda 495nm. Para o ensaio de viabilidade celular após tratamento com etoposídeo foram plaqueados
103 células de diferentes linhagens de HeLa (scramble e shGal-3) para o tempo de 2 e 4 horas e
para os tempos restantes foram plaqueados 5000 células em placas de 96 poços, após o
plaqueamento pernoite as células foram tratadas com diferentes concentrações de etoposídeo (10
e 50 µM) por 4 horas, após o tempo de tratamento as células foram trocadas de meio e infectadas
com MOI de 10. A incubação com o parasito foi relativa ao tempo de infecção (2, 4, 16, 24, 48 e
72 horas). Após o tempo de infecção as células foram lavadas com PBS e foi adicionado 100µL
de MTT na concentração de 0,5mg∕mL por poço diluído em meio de cultura sem soro. Uma vez
adicionado o MTT foi feita a incubação da placa em estufa a 37oC no escuro entre 3 a 4 horas.
Após a adição de MTT e incubação foi adicionado 100µL de solução SDS 10% em HCl 0,01M
com incubação a 37oC no escuro pernoite. Posteriormente foi feita a leitura no leitor de ELISA
Espectra Max 190 (Molecular Devices) no comprimento de onda 495nm.
32
3.5 Drogas utilizadas e condições
A droga etoposídeo foi usada para como um controle positivo de morte celular nos
experimentos, uma vez que etoposídeo que é um quimioterápico que induz quebra de dupla fita
de DNA, o que leva a morte celular. Para tal, foi feito uma análise de porcentagem de células
viáveis e não-viáveis por citometria de fluxo descrito no item 3.8, com diferentes concentrações
de droga (10, 25, 50, 100 e 200 µM) por 16 horas. Para testes posteriores, foi estabelecida a
concentração (200µM) por 16 horas para os ensaios de western blotting.
Para inibir a síntese protéica e relacionar mobilização subcelular exclusivamente com a
translocação núcleo-citoplasma da galectina-3, mas não a alterações decorrentes da tradução
citoplasmática, foi utilizada a droga cicloheximida (Sigma-Aldrich Corp.), a qual é uma droga
que inibe a ação dos ribossomos. Para averiguar qual seria a melhor concentração de
ciclohexamida e sua toxicidade celular foi feito um teste de viabilidade pelo método do MTT
em diferentes tempos (0, 2, 4, 8, 16 e 24 horas) utilizando diferentes concentrações (1, 5, 10 e
20 µg∕mL). Este ensaio serviu de base para estabelecer a concentração utilizada nos testes
posteriores de extração proteica diferencial e imunofluorescência em 10µg∕mL.
3.6 Obtenção dos extratos proteicos
Para obtenção do extrato proteico total das células, aproximadamente 5 x 105 células das
diferentes linhagens de HeLa (HeLa scramble e HeLa shGal-3) foram plaqueadas em garrafas
de 25 cm2 por 16 horas, e após foram infectadas com m.o.i. de 5-10 parasitos por célula em
diferentes tempos (0, 2, 4, 8, 16 e 24 horas). Após os tempos de incubação, as células foram
raspadas com auxílio de um raspador e centrifugadas. Após centrifugação a 800g por 1 minuto,
as células foram lavadas duas vezes em PBS, e então contadas emhemocitômetro, em seguida,
cerca de 105 células foram ressuspensas diretamente em 20µL de Laemmli buffer (187,5 mM
Tris pH 6,8; 6% SDS; 30% glicerol; 0,3 M DTT (1,4 Dithiothreitol); e 0,0015% bromofenol
blue) e incubadas por 8 minutos a 99oC em termociclador Veriti (Applied Biosystem). Após lise
celular e desnaturação proteica com Laemmli buffer e aquecimento, as amostras foram
resolvidas em eletroforese com gel de acrilamida-bisacrilamida no procedimento descrito no
item 3.7.
Para obtenção dos extratos proteicos fracionados, nuclear e citoplasmático, foram
realizados ensaios prévios com plaqueamentos de diferentes números de células para determinar
a quantidade com melhor rendimento dos extratos. Assim, cerca de 5 x 106 células da linhagem
HeLa WT foram plaqueadas em garrafas de 75 cm2 por 16 horas por 16 horas, e após esse tempo
foram infectadas com m.o.i. de 5-10 parasitos por célula em diferentes tempos (0, 2, 4, 8 e 16
33
horas) ou tratadas com etoposídeo como descrito no item 3.5 como controle positivo de morte
celular. Sendo que em todas as condições, as células foram tratadas com ciclohexamida
(10ug∕mL) durante o tempo de infecção ou tratamento com etoposídeo. Após os tempos de
incubação, as células foram raspadas com auxílio de um raspador. Após centrifugação a 800g
por 1 minuto, as células foram lavadas duas vezes em PBS, e centrifugadas novamente a 800g
por 1 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 70µL de
solução I Tris (Tris[hydroxymethyl]aminomethane) 20mM pH 7,4, Glicerol 10% v/v, EDTA
(Ethylenediamine Tetraacetic Acid) 1mM, KCl 10mM, β-mercaptoetanol 0,6 mM e NP40
0,2%) e incubadas por 5 minutos em banho de gelo, sendo posteriormente centrifugadas a 7000
G por 5 minutos. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -80oC, obtendo assim o extrato
citoplasmático. O precipitado então foi ressuspendido em solução II (Tris 20mM pH 7,4,
Glicerol 10% v/v, EDTA 1mM, KCl 10mM e β-mercaptoetanol 0,6 mM) e logo após foi
centrifugado a 7000G por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. O precipitado nuclear foi
então ressuspenso em 50µL de solução III (Tris 20mM pH 7,4, Glicerol 20% v/v, KCl
10mM, NaCl 400mM, EDTA 1mM, e β-mercaptoetanol 0,6mM) e incubado por 30 minutos em
banho de gelo. Em seguida, foi centrifugado a 16000g por 10 minutos e foi coletado o
sobrenadante e armazenado a -80oC, obtendo assim o extrato nuclear. Uma vez obtidos os
extratos, eles foram dosados pelo método de Bradford (Bradford, 1976).
3.8 SDS e Western Blotting
Após a obtenção dos extratos proteicos obtidos no tópico 3.5, a fração total foi utilizada
para confirmar o silenciamento de Galectina-3 na célula HeLa-sh Gal3.Além da confirmação do
silenciamento foi feito para análise dos níveis proteicos de Bax, Bcl-2, PARP e Galectina-3 O
SDS- PAGE foi realizado utilizando o gel de corrida com uma concentração de 10% de
acrilamida para o gel de separação e 4% de acrilamida para gel de empacotamento.
Para transferência semi-seca para membrana de nitrocelulose Hybond-C nas condições
elétricas recomendadas pelo fabricante, utilizou-se TransBlot (BioRad). Após a transferência a
membrana foi bloqueada em solução de TBS (Tris 200 mM, NaCl 1,37 M, pH 7,6)
complementado com 0,05% Tween-20 e 5% leite desnatado entre 1-4 horas. Especialmente, para
os ensaios com fração nuclear e citoplasmática o bloqueio foi feito em solução de TBS0,05
% Tween-20 e 5% de albumina bovina Fração V (Sigma Aldrich Corp.) entre 1-4 horas.
Após bloqueio foram realizadas as incubações com anticorpos primários, em ambos
extratos, o anticorpo IgG de camundongo anti-Galectina-3 (hibridoma) foi utilizado na diluição
de 1:50 em solução de TBS 0,005% tween 0,5% leite desnatado e incubado por 16 horas a 4oC.
34
O anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado a HRP (Santa Cruz Biotech,
#sc2005) foi utilizado na diluição 1:2000 em solução de TBS 0,005% Tween-20 0,5% leite
desnatado por 1-2 horas a temperatura ambiente. Para os extratos totais além da utilização do
anticorpo anti-galectina-3, foi visto também para Bax com a incubação do o anticorpo IgG de
coelho anti-Bax (Santa Cruz Biotech. #sc493) foi utilizado na diluição de 1:30 em solução de
TBS 0,005% tween 0,5% leite desnatado e incubado por 16 horas a 4oC, para análise de Bcl-2 o
extrato total foi utilizado anticorpo IgG de camundongo anti-Bcl-2 (Santa Cruz
Biotech.#sc7382) foi utilizado na diluição de 1:500 em solução de TBS 0,005% tween 0,5% leite
desnatado e incubado por 16 horas a 4oC, já para análise de PARP foi utilizado anticorpo IgG
de coelho anti-PARP (Abcam) foi utilizado na diluição de 1:500 em solução de TBS 0,005%
tween 2,0% leite desnatado e incubado por 16 horas a 4oC.
No western blot com frações nucleares e citoplasmáticas, os seguintes anticorpos
primários foram utilizados em incubações de 16-18 horas a 4oC: (1) IgG de camundongo anti-
actina (Santa Cruz Biotech) como controle da fração citoplasmática na diluição de 1:5000 em
solução de TBS 1% Tween-20 0,5% BSA, (2) IgG de coelho anti-TBP (Santa Cruz Biotech)
como controle da fração nuclear na diluição de 1:1000 em solução de TBS 1% Tween-20
0,5% leite desnatado, (3) e IgG de camundongo anti-Galectina-3 (hibridoma) na diluição de 1:50
em solução de TBS 1% Tween-20 0,5% leite desnatado.
Os anticorpos secundários foram utilizados em incubações de 1-2 horas a temperatura
ambiente: (1) anti-IgG de camundongo conjugado a HRP (Santa Cruz Biotech. #sc2005) na
diluição 1:2000 em solução de TBS 1% Tween-20 0,5% leite desnatado, (2) anti-IgG de
coelho conjugado a HRP (Sigma Aldrich Corp.) na diluição 1:2000 em solução de TBS 1%
Tween-20 0,5% leite desnatado.
Em todos os ensaios de western blot, sempre após as incubações com os anticorpos,
primário e secundário, foram realizadas três lavagens de 10 minutos cada com solução TBS
0,1% Tween-20. Para quantificação da quimioluminescência da atividade da peroxidase
conjugada aos anticorpos secundários, as membranas foram escaneadas pelo equipamento C-
Digit (LI-COR Bioscience) em exposições curtas e longas e as imagens digitalizadas. A análise
densitométrica foi realizada com auxílio do programa ScionImage.
3.9 Imunofluorescência indireta
Células HeLa WT foram semeadas em placas de 24 poços já com a prévia adição de
lamínulas circulares 18nm estéreis tratadas previamente com éter:etanol (1:1). Foram
semeadas 5 x 104
células por poço e mantidas por 16-18 horas para total adesão. A infecção foi
35
realizada em diferentes tempos (0, 2, 4, 8 e 16 horas) seguindo o protocolo descrito no item 3.3
Para o controle positivo as células da linhagem HeLa WT foram tratadas com etoposídeo por 16
horas com 50µM além da ciclohexamida. Após o tempo de infecção, as células foram lavadas 3
vezes com PBS 1X e fixadas em solução de paraformaldeído 4% e sacarose 3% preparada em
PBS 1X e incubado por no mínimo 30 minutos. A seguir, as lamínulas foram incubadas por
30 minutos em solução cloreto de amônia 150mM preparado em PBS 1x, permeabilizando as
células por 5 minutos em PBS 1X complementado com 0,5% Triton X-100. A etapa de bloqueio
foi realizada com PBS 1x complementado com 3% BSA por 60 minutos, após o bloqueio f o i
r e a l i z a d a a incubação da lamínula invertida sobre parafilm M com 30μL da solução PBS
1x complementado com 3% BSA contendo anticorpo primário IgG de camundongo anti-
Galectina-3 (hibridoma), ou anticorpo primário IgG de coelho anti-Bax (Santa Cruz Biotech.
#sc493), ou ambos anticorpos, na diluição de 1:50 por 16-18 horas a 4oC. Após a incubação com
anticorpo primário, as lamínulas foram lavadas três vezes com PBS 1x complementado com
3% BSA por 5 minutos seguido da incubação com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de
camundongo conjugado a Alexa Fluor®546 (Thermo Scientific, #A11015) ou anti-IgG de
coelho conjugado a FITC (Sigma-Aldrich Corp.), ou ambos na diluição de 1:200 por 1-2 horas
no escuro. A seguir, as lamínulas foram incubadas com DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)
1000nM por 5 minutos e lavadas cinco vezes com PBS 1x. As lamínulas foram montadas
invertidas em lâminas em 20μL de N-propilgalato 0,1M preparado em glicerol:PBS (9:1). Após
prontas e seladas com esmalte, as lâminas foram guardadas a -20ºC até a observação em
microscópio de epifluorescência Nikon DX.r
36
4. RESULTADOS
4.1 Confirmação da redução dos níveis proteicos de Galectina-3
por interferência de RNA
As diferentes linhagens de HeLa foram obtidas através do processo de transdução,
primeiramente foram os vetores pLKO foram transfectados em células Hek 293FT para
produção das partículas virais contendo o material em questão. Após 3 dias houve o brotamente
das partículas virais e então recolheu-se o sobrenadante contendo as partículas virais que foi
adicionado no meio de HeLa WT, e deixado em contato por 2 dias seguido da seleção com a
droga puromicina 0,5μg∕mL. Após o fim da seleção, obtivemos células HeLa resistentes à droga,
ou seja, com o genoma lentiviral integrado ao genoma para expressão de shRNA para RNAi ou
shRNA inespecífico no caso da HeLa scramble, ou shRNA para Galectina-3 no caso da HeLa
shGal-3.
De posse das linhagens foi realizada uma investigação dos níveis proteicos de Galectina-
3 por western blotting (HeLa WT, scramble, shGal-3). E x t r a t o proteico total foi fracionado
em SDS-PAGE e após transferência do gel à membrana de PVDF (Polyvinylidene Fluoride), a
membrana foi revelada utilizando anticorpo anti-Galectina-3 e para o controle de carregamento
utilizou-se anticorpo anti-β-actina.
Como esperado, não foram observadas alterações nos níveis proteicos de Galectina-3
na linhagem HeLa scramble em comparação com HeLa WT, após transdução com vetor
pLKO.1 que expressa um shRNA não relacionado. Como esperado, para a linhagem HeLa
shGal-3 transduzida com vetor pLKO.1-shGal3 foi observada uma significativa redução nos níveis
de Galectina-3 (FIGURA 14A). Vale destacar que a seleção clonal para obtenção de populações
homogêneas de células transduzidas com pLKO.1-shGal3 não mostrou significativa redução nos
níveis de Galectina-3, desse modo, boa parte dos experimentos funcionais foi realizado com a
linhagem HeLa shGal-3 não selecionada clonalmente (dados não mostrados).
37
FIGURA 14A. Confirmação do silenciamento de Galectina-3 por interferência de RNA. Aproximadamente 45 µg de extrato proteico foi fracionado por SDS-PAGE. Após transferência a 2 Volts/cm2 por 45 minutos, a membrana foi processada com TBS-T como descrito no tópico 3.8 utilizando as concentrações de 1:50 para anti-Galectina-3, e 1:5000 para anti-β-actina. Seguido da revelação com anticorpo secundário nas diluições 1:2000. A banda predita para β-Actina é de 42 kDa e banda predita para Galectina-3 é de 31 kDa. A imagem selecionada corresponde ao trecho correspondente a esses pesos utilizando como parâmetro o padrão de peso molecular PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific).
38
4.2 Obtenção de formas tripomastigotas de cultura em células
Vero pcDNA 3.1 para posteriores ensaios na linhagem HeLa.
Como os ensaios basearam-se na utilização de tripomastigotas de cultura produzidos
previamente em linhagem Vero pcDNA3.1 foi necessário avaliar se esses parasitos permaneciam com
o potencial infectivo nas linhagens HeLa.
Uma infecção preliminar foi realizada com as células semeadas em placas de 24 poços, após
3 horas para que se aderissem, foram adicionados tripomastigota de cultura da cepa Dm28c GFP em
uma m.o.i de 1:10. Podemos observar que 24 e 48 horas após- infecção, ambas as linhagens, HeLa
wild type e scramble, já apresentavam ninhos de amastigotas (dados não mostrados). Porém nas
células silenciadas, HeLa shGal-3, não havia a formação de ninho de amastigotas em 24 horas,
somente a partir de 48 horas (FIGURA 14B). Após passadas 48 horas de infecção, todas as linhagens
já apresentavam ninhos de amastigotas (FIGURA 14B) Estes dados de infecção corroboram com os
resultados prévios de monografia do grupo (Chain, 2014), que porventura ocorre um atraso da invasão
do parasito na linhagem HeLa shGal-3 pela perda de interação do parasito com a Galectina-3 da célula
hospedeira. Uma análise mais aprofundada ainda é necessária para avaliarmos se é a ausência de
Galectina-3 extracelular e/ou Galectina-3 intracelular que acarreta no atraso do processo de invasão.
Pretendemos reavaliar a infecção nas linhagens Hela (wild type, scramble e shGal-3) na presença de
pectina cítrica como ligante de Galectina-3 para inibirmos a forma secretada e membranar de
Galectina-3 no processo de invasão.
Figura 14B. Ensaio de infecção pelo T. cruzi em células HeLa Scramble e HeLa shGal-3. Células da
linhagem HeLa Scramble e HeLa shGal-3 foram semeadas em placas de 24 poços na proporção de 3 x 104
células por poço e após 3 horas de adesão foram infectadas com 3 x 105 tripomastigotas de cultura e após
diferentes tempos de infecção (24 e 48 horas). As setas indicam os ninhos de amastiogtas.As imagens
foram capturadas com objetiva de 40x utilizando o programa Q-capture Pro 7 no microscópio Olympus
CKX41.
39
4.3 Padronização de uma condição farmacológica indutora de
morte celular para correlacionar com a apoptose nos ensaios
funcionais pós-infecção.
Com o intuito de estabelecer um controle positivo de morte celular que servisse de
referência em nossas análises nas linhagens infectadas pelo T. cruzi, as células da linhagem HeLa
WT foram incubadas com etoposídeo que é um quimioterápico que induz morte celular por quebra
de dupla fita de DNA.
Para determinarmos uma concentração molar ideal, as células da linhagem HeLa WT
foram incubadas com diferentes concentrações por 16 horas seguido da análise fenotípica por
citometria de fluxo utilizando como traçador iodeto de propídeo (PI) que é um agente intercalante
na dupla fita de DNA em condições avançadas de morte celular. Por ser um marcador tardio
de morte, quando a célula já apresenta aumento de sua permeabilidade da membrana
plasmática, o PI pode ser usado para determinar a porcentagem de células mortas. As
concentrações utilizadas foram de 10, 25, 50, 100 e 200µM de etoposídeo. Uma vez tratadas, as
células foram analisadas no citômetro de fluxo no canal FL-3 para leitura da fluorescência do PI.
Obtivemos as seguintes médias percentuais: sem tratamento e sem PI 0,1%; sem tratamento
77,04% (controle negativo); 10µM 45.6%, 25µM 48.5%, 50µM 53.6%, 100µM 51.7%, e 200µM
61.3% (FIGURA 15).
Como esperado, a marcação foi dose dependente, quanto maior concentração da droga,
maior marcação por PI, ou seja, maior indicativo de que as células estão em processo de morte
celular. Estes dados foram inconclusivos devido à alta marcação de células no controle negativo,
tornando inválida a utilização do PI em nosso modelo de estudo. De posse desse resultado, a
análise com outros traçadores se mostrou necessária para obtenção da melhor quantificação da
morte.
40
FIGURA 15. Padronização por citometria de fluxo para quantificação da morte celular induzida
por etoposídeo. Citometria de fluxo das células HeLa tratadas por 16 horas com diferentes concentrações
de etoposídeo (10, 25, 50, 100 e 200 µM). Como controle negativo foram utilizadas células sem nenhum
tratamento. As células foram marcadas com iodeto de propídeo (PI) e lidas no canal FL-3 tendo a
seguinte marcação, sendo n=3.
41
4.4 Avaliação da alteração dos níveis proteicos de marcadores
apoptóticos sob condição farmacológica com etoposídeo.
Com o propósito de investigar alterações nos níveis de proteínas pró- e anti-apoptóticas
no curso da infecção pelo T. cruzi foi avaliada a utilização do etoposídeo como controle positivo
de morte celular, um fármaco que sabidamente altera os níveis proteicos de marcadores como
Bax, Bcl-2 e PARP.
As proteínas Bax e Bcl-2 são membros da família de Bcl-2 que participa do controle
da via intrínseca d´apoptose. Já PARP é uma proteína que participa no reparo a quebra de dupla
fita de DNA sendo clivado no processo final de morte por apoptose. Por sua vez, Galectina-3
além de ser nossa proteína alvo do estudo, também pode participar do processo de apoptose,
podendo ter um efeito anti- ou pró-apoptótico, sendo assim, foi relevante analisarmos se
etoposídeo seria aplicável como um controle positivo em nossos ensaios para promoção de
alterações nos níveis endógenos de Galectina-3, Bax, Bcl-2, e PARP.
Células HeLa WT foram tratadas com etoposídeo em diferentes concentrações (10, 25,
50, 100 e 200µM) durante 16 horas. Após tratamento, o extrato proteico total foi analisado por
western blotting para quantificar proteínas relacionadas ao processo de apoptose tais como: Bax,
Bcl-2 e PARP, além da própria Galectina-3.
Primeiramente, analisamos os níveis de Bcl-2 que é uma proteína anti-apoptótica
protótipo da família de Bcl-2. Quando comparado com o controle não tratado, os níveis de Bcl-
2 se mantiveram estáveis, havendo apenas um ligeiro decréscimo conforme aumento da
concentração da droga, mostrando uma tendência de decréscimo dose-dependente, algo esperado,
pois como a indução de morte por etoposídeo é dose-dependente, quanto maior
comprometimento de sinalização de morte, menor a expressão da proteína anti-morte, no caso
Bcl-2 (Figura 16 A).
Em seguida foram analisados os níveis de Bax, a qual é uma proteína pró-apoptótica
da família de Bcl-2 que contribui pela despolarização da membrana mitocondrial. Foi observado
um acúmulo crescente nos níveis protéicos de Bax nas concentrações de 10µM até 50µM de
etoposídeo, quando comparado ao controle. O que demonstra que após 16 horas de incubação
com etoposídeo há possivelmente uma maior sinalização de morte via Bax. Por outro lado, em
concentrações maiores de etoposídeo, 100µM e 200µM, observamos um perfil decrescente nos
níveis de Bax, podendo estar correlacionado com a cinética de acúmulo de Bax, a qual deve
apresentar um pico anterior ao tempo de 16 horas, e, consequentemente, sinalizar para a via de
morte de modo mais precoce do que o observado nas concentrações menores (FIGURA 16 B).
42
Além do estudo com as proteínas da família de Bcl-2 foi realizado um ensaio preliminar
para analisarmos variações nos níveis totais da proteína Galectina-3. Entretanto, no tempo de 16
horas após a adição de etoposídeo não observamos uma tendência crescente e/ou decrescente de
Galectina-3 que pudesse ser correlacionada com as diferentes concentrações de etoposídeo, e
assim, explicar sua atuação como regulador anti-apoptótico ou pró-apoptótico (FIGURA 16 C).
Embora o etoposídeo não tenha sido capaz de induzir alterações nos níveis de Galectina-3 em
resposta a morte celular, os ensaios posteriores de infecção com T. cruzi utilizaram o etoposídeo
como controle positivo para morte celular.
Outro marcador pró-apoptótico analisado no curso da infecção pelo T. cruzi foi PARP, o
que tornou necessária uma prévia padronização com etoposídeo para estabelecê-lo como um
controle positivo da ativação de PARP. Sob estímulos de morte PARP sofre processamento
proteolítico sendo clivado por diversas proteínas relacionadas a morte celular, inclusive caspase-3
que é uma enzima efetora no processo de apoptose, gerando fragmentos proteicos de 24KDa
(CHAITANYA et al., 2010).
Tratamento da linhagem HeLa WT com etoposídeo provocou um aumento dose
dependente de PARP clivado com redução dos estoques totais de PARP não clivado, o que era
esperado, uma vez que maior concentração da droga induz dano de DNA, com maior indução de
morte celular e assim maior quantidade de PARP clivado (FIGURA 17). Vale ressaltar que o
fragmento gerado de PARP apresentou majoritariamente um peso molecular de 24kDa, não
havendo aparecimento de fragmento de peso intermediário como observamos no controle não
tratado, o que sugere que o processo de morte celular induzido por etoposídeo se dá
majoritariamente pela ação de caspase-3. Na maior concentração de etoposídeo com 200µM houve
maior nível de PARP clivado junto ao menor nível de PARP íntegro e este resultado foi decisivo
para a escolha desta concentração como controle positivo para processamento de PARP (FIGURA
17).
43
FIGURA 16. Investigação dos níveis de Bcl-2, Bax e Galectina-3 em reposta ao estímulo com
etoposídeo. Células HeLa wild type foram tratadas com etoposídeo em diferentes concentrações (0, 10,
25, 50, 100 e 200µM) por 16 horas. Sendo analisadas por SDS-PAGE seguido de western blot
utilizando anticorpos IgG anti-Bcl-2 de camundongo (A), IgG anti-Bax de coelho (B), IgG anti-
Galectina-3 de camundongo (C), e como controle de massa IgG anti-β-actina de camundongo, sendo
n=1. Densitometria foram realizadas com auxílio do Programa Scion Image para normalização dos níveis
protéicos usando β-Actina como controle endógeno.
44
FIGURA 17. Níveis protéicos de PARP total e clivado durante tratamento com etoposídeo para indução da morte celular. Células HeLa WT foram incubadas com etoposídeo em diferentes concentrações (0, 10, 25, 50, 100 e 200µM) por 16 horas. O western blot foi realizado utilizando as concentrações de 1:500 para anti-PARP, e 1:5000 para anti-β-actina como controle de massa. A banda predita para PARP íntegro é de 113 kDa e banda predita para produto clivado majoritário é de 24 kDa. A imagem selecionada corresponde ao trecho correspondente a esses pesos utilizando como parâmetro o padrão de peso molecular PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific), sendo n=1.
45
4.5 Contribuição de Galectina-3 na sobrevivência e proliferação
celular.
Para analisarmos a participação de Galectina-3 sobre a sobrevivência e proliferação em
condições normais de cultivo e no decorrer da infecção pelo T. cruzi foram realizados ensaios de
viabilidade celular pelo método colorimétrico do MTT.
Células das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble, shGal-3) foram semeadas
em placas de 96 e analisadas pelo método MTT nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas. Em
condições normais de cultivo sem a infecção não foram observadas diferenças significativas na
viabilidade celular entre as linhagens WT e scramble (FIGURA 18), o que demonstra que o
processo de transdução lentiviral por si não alterou a viabilidade celular. Por outro lado, a
linhagem HeLa shGal-3 silenciada mostrou uma menor viabilidade, na ausência de Galectina-3
há um decréscimo significativo de viabilidade em torno de 40%-60% dependendo do tempo em
cultivo (FIGURA 18).
Em adição, foi avaliada também a viabilidade das linhagens em diferentes tempos da
infecção pelo T. cruzi. Considerando a linhagem HeLa WT não infectada como a condição
100% viável, foi observada uma menor viabilidade das linhagens infectadas quando
comparadas com as linhagens não infectadas (FIGURA 18 e 19). A comparação entre as
linhagens infectadas Hela WT e HeLa scramble não revelou diferenças significativas,
novamente demonstrando que reduzida viabilidade é decorrente exclusivamente do estresse da
infecção e não do processo de transdução lentiviral (FIGURA 19).
Por outro lado, a linhagem HeLa shGal-3 apresentou uma menor viabilidade,
demonstrando mais uma vez a importância da Galectina-3 na sobrevida das células infectadas
pelo T. cruzi. Em resumo, estes dados demonstram um papel essencial de Galectina-3 tanto
para a viabilidade celular em condições normais de cultivo quanto para um fenótipo de
resistência à morte no decorrer da infecção pelo parasito, uma vez que sem a Galectina-3 a
sobrevida das células infectadas se mantém bastante reduzida quando comparada a linhagem
HeLa WT (FIGURA 19).
Além da análise do percentual de viabilidade celular foi avaliado também a proliferação
das linhagens em condições normais de cultivo e quando infectadas pelo T. cruzi. Em condições
normais, na ausência de Galectina-3 as células silenciadas proliferaram menos do que as demais
linhagens, WT e scramble, e comparando ambas linhagens não foram observadas alterações
significativas, mostrando assim a importância da proteína Galectina-3 na proliferação (FIGURA
20).
46
FIGURA 18. Viabilidade celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3) em
condições normais de cultivo. Células foram semeadas em meio RPMI com 10% de SFB e em diferentes
tempos de plaqueamento (24, 48, 72 e 96 horas) foram analisadas pelo método colorimétrico do MTT.
Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi realizada considerando como percentual de
100% de viabilidade a linhagem HeLa wild type não infectada em seus respectivos tempos, sendo n = 3.
Análise estatística por two-way-ANOVA com correção pelo método Bonferroni foi realizada no Programa
GraphPad Prism 10.0. As condições estatisticamente significantes (*) apresentaram um valor de p<0,0001.
Figura 19. Viabilidade celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3) no curso
da infecção pelo T. cruzi. Células foram semeadas em meio RPMI com 10% de SFB e infectadas com T.
cruzi como m.o.i de 1:10, e em diferentes tempos de plaqueamento (24, 48, 72 e 96 horas) foram analisadas
pelo método colorimétrico do MTT. Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi
realizada considerando como percentual de 100% de viabilidade a linhagem HeLa wild type não infectada
em seus respectivos tempos, sendo n = 3. Análise estatística por two-way-ANOVA com correção pelo
método Bonferroni foi realizada no Programa GraphPad Prism 10.0. As condições estatisticamente
significantes (*) apresentaram um valor de p<0,0001.
.
47
Figura 20. Proliferação celular das diferentes linhagens de HeLa (WT, scramble e sh Gal-3) em
condições normais de cultivo (A) e no curso da infecção pelo T. cruzi (B). Células foram semeadas em
meio RPMI com 10% de SFB e infectadas ou não com T. cruzi como m.o.i de 1:10, e em diferentes tempos
de plaqueamento (24, 48, 72 e 96 horas) foram analisadas pelo método colorimétrico do MTT.
Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi realizada considerando como percentual
inicial de 100% a linhagem HeLa wild type não infectada no tempo de 24 horas, sendo n = 3. Análise
estatística por two-way-ANOVA com correção pelo método Bonferroni foi realizada no Programa
GraphPad Prism 10.0. As condições estatisticamente significantes (*) apresentaram um valor de p<0,0001.
48
4.6 Envolvimento de Galectina-3 no fenótipo de subversão da
morte celular promovida pelo Trypanosoma cruzi.
Sabidamente, parasitos como T. cruzi manipulam as vias de sobrevivência e morte celular
para potencializar a infecção pelo tempo necessário para produção de novos parasitos. Para avaliar
essa possibilidade, as células das linhagens HeLa scramble e shGal-3 foram pré-incubadas com
etoposídeo nas concentrações de 10 e 50µM, sendo em seguida infectadas com T. cruzi. Essa
lógica experimental foi utilizada para avaliarmos se a infecção pelo parasito seria capaz de
aumentar a viabilidade celular, e até mesmo reverter vias de morte celular disparadas em resposta
a fármacos como etoposídeo.
Após a pré-incubação com etoposídeo por 4 horas, os parasitos foram adicionados e a
viabilidade das células foi avaliada pelo método do MTT nos tempos precoces de 2, 4, 16, 24
horas e tempos tardios de 48 e 72 horas pós-infeção.
Nas duas diferentes linhagens, HeLa scramble e HeLa shGal3, quando comparamos as
células tratadas com etoposídeo/infectadas com as células somente tratadas com etoposídeo
podem ser vistos aumentos na viabilidade ao longo do tempo (FIGURA 21). Estes dados mostram
que apesar da indução de morte pela droga, ou seja, indução da cascata de apoptose, o parasito de
alguma forma sinaliza revertendo tal cascata de sinalização, promovendo o aumento da viabilidade
necessário para o sucesso da infecção.
Especificamente, para a linhagem HeLa scramble, a infecção com T. cruzi provocou um
aumento da viabilidade celular a partir de 4 horas, já para a linhagem HeLa shGal3 tal efeito foi
tardio e só foi observado a partir de 16 horas (FIGURA 21). Com tal informação podemos sugerir
que sim, o parasito interfere na indução farmacológica de morte celular e que tal inibição é
dependente de Galectina-3, pois em sua ausência há um retardo deste efeito.
Mais ainda, como a presença do parasito elevou o percentual de células viáveis para
acima de 100% nos tempos de 4, 16 e 24 horas com HeLa scramble e 16 e 24 horas com HeLa
shGal3, podemos sugerir que T. cruzi está sinalizando positivamente para as vias de proliferação
celular, e não somente inibindo a morte celular mediada por etoposídeo (FIGURA 21).
Além da análise nos tempos precoces, também foi avaliada a viabilidade celular nos
tempos tardios de 48 e 72 horas, momento onde a infecção está avançada com a formação dos
ninhos de amastigotas e diferenciação destes em tripomastigotas de cultura com posterior lise das
células infectadas. A análise de viabilidade pelo método de MTT neste estágio avançado da
infecção pelo parasito é denotada por uma redução significativa da absorbância, não em função
49
de uma redução na viabilidade das células infectadas e não infectadas já pré-existentes, mas em
função da redução no número total de células infectadas que sofrem lise.
Nesses tempos mais tardios, a linhagem HeLa shGal-3 se mostrou mais sensível ao
tratamento com a droga do que a linhagem HeLa scramble, ou seja, menos resistente ao processo
de morte celular, demonstrando a importância de Galectina-3 no processo de sobrevivência
(FIGURA 22). Mesmo na ausência de Galectina-3 nos tempos tardios, o processo de infecção foi
capaz de auxiliar na sinalização pró-sobrevivência aumentando a viabilidade e inibindo a morte
celular induzida pelo etoposídeo, este fenótipo pode ser possivelmente devido a presença dos
tripomastigotas de cultura em novo round de infecção, ativando vias de sinalização pró-
sobrevivência diferentes e independentes das vias de sinalização pró-sobrevivência mediadas por
Galectina-3 (FIGURA 22).
50
Figura 21. Análise de viabilidade celular sob um estímulo farmacológico de morte celular em
conjunto com infecção por T. cruzi. Foram utilizadas a linhagem HeLa scramble (A) e HeLa shGal-3 (B)
que foram semeadas em meio RPMI com 10% de SFB em placa de 96 poços e incubadas com
concentrações de 10 e 50µM de etoposídeo durante 4 horas, sendo infectadas ou não com T. cruzi com uma
m.o.i de 1:10. Após adição dos parasitos, foi realizado ensaio colorimétrico pelo método do MTT nos
tempos de 2, 4, 16 e 24 horas. Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi realizada
considerando como percentual de 100% de células viáveis a linhagem HeLa scramble sem etoposídeo e
não infectada (-eto -T. cruzi), sendo n = 3. Análise estatística por two-way-ANOVA com correção com
correção por Turkey foi realizada no Programa GraphPad Prism 10.0. As condições estatisticamente
significantes (*) apresentaram um valor de p<0,0001.
51
Figura 22. Análise de viabilidade celular sob um estímulo farmacológico de morte celular em
conjunto com infecção por T. cruzi. Foram utilizadas a linhagem HeLa scramble (A) e HeLa sh Gal-3
(B) que foram semeadas em meio RPMI com 10% de SFB em placa de 96 poços e incubadas com
concentrações de 10 e 50µM de etoposídeo durante 4 horas, sendo infectadas ou não com T. cruzi com uma
m.o.i de 1:10. Após adição dos parasitos, foi realizado ensaio colorimétrico pelo método do MTT nos
tempos de 48 e 72 horas. Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi realizada
considerando como percentual de 100% de células viáveis a linhagem HeLa scramble sem etoposídeo e
não infectada (-eto -T. cruzi), sendo n = 3. Análise estatística por two-way-ANOVA com correção com
correção por Turkey foi realizada no Programa GraphPad Prism 10.0. As condições estatisticamente
significantes (*) apresentaram um valor de p<0,0001.
52
4.7 Análise dos níveis proteicos de marcadores apoptóticos
durante à infecção.
De posse dos níveis proteicos de Bcl-2, Bax, e PARP em resposta ao tratamento com
etoposídeo (tópico 4.4), e selecionada a concentração de 200µM de etoposídeo por 16 horas para
ser utilizada como controle positivo de morte, foi realizada a avaliação das mesmas proteínas ao
longo da infecção com T. cruzi nos tempos de 2, 4, 8, 16 e 24 horas.
Primeiramente analisamos os níveis totais do anti-apoptótico Bcl-2 nas linhagens HeLa
shGal-3 e HeLa scramble infectadas. De modo geral, os níveis de Bcl-2 nas células silenciadas
encontravam-se reduzidos ao longo do tempo em comparação às células controle, sugerindo a
existência de uma via de sinalização mediada por Galectina-3 que regule a expressão do gene
Bcl-2 para conferir resistência a morte celular e indiretamente otimizar a infecção na célula
hospedeira (FIGURA 23A).
Particularmente, a infecção com T. cruzi elevou os níveis de Bcl-2, para HeLa scramble
houve um pico da proteína no tempo de 4 horas pós-infecção e posterior redução dos níveis
proteicos, e o mesmo ocorreu na linhagem HeLa shGal-3 (FIGURA 23A).
Os níveis proteicos reduzidos de Bcl-2 observados na linhagem shGal-3 juntamente
presença de pico proteico em 4 horas de infecção sugerem que tanto Galectina-3 quanto parasito
modulam Bcl-2. No entanto, não sabemos se essa regulação se dá somente a nível de expressão
sobre gene Bcl-2 ou também por alguma regulação pós-transcricional que provoca o acúmulo da
proteína Bcl-2 em 4 horas.
A seguir, analisamos os níveis proteicos do pró-apoptótico Bax durante a infecção,
assim como observado com Bcl-2 os níveis proteicos de Bax na linhagem HeLa shGal-3
mostraram uma tênue tendência de redução, quando comparados com a linhagem HeLa scramble.
Vale ressaltar para ambas as linhagens um pico proteico em 4 horas pós-infecção com redução
para níveis basais em 8 horas pós-infecção, enquanto que nos tempos avançados de infecção de
16 e 24 horas ocorre um novo aumento da proteína.
Essa cinética de mudança nos níveis de Bax pode estar diretamente relacionada com os
principais momentos de estresse da célula hospedeira ao longo da infecção, quando parasito
escapa do vacúolo parasitóforo para o citoplasma por volta de 4 horas e posteriormente em 16 e
24 horas quando os parasitos formam ninhos de amastigotas proliferantes (FIGURA 23B).
A análise dos níveis proteicos de Galectina-3 nas linhagens HeLa shGal-3 e HeLa
scramble no decorrer da infecção refletiu os trabalhos anteriores de Vray e colaboradores (2004)
e Kleshchenko e colaboradores (2004) que demonstraram um aumento da expressão de Galectina-
53
3 em resposta à infecção. Desse modo, na linhagem HeLa scramble foram observados aumentos
de Galectina-3 nos tempos de 2 horas até 16 horas pós-infecção. Como esperado, os níveis de
Galectina-3 na célula silenciada HeLa shGal-3 já se encontravam diminuídos, e regulações à nível
transcricional não foram capazes de elevar os níveis de Galectina-3, possivelmente porque o RNAi
continuamente eliminou os transcritos à nível pós-transcricional, limitando as alterações na
expressão gênica de Galectina-3 (FIGURA 23C).
Por fim, outra proteína verificada foi PARP cujo perfil de clivagem havia sido
previamente analisado no tratamento com etoposídeo. Como esperado, no controle positivo com
etoposídeo foi observado um maior processamento proteolítico de PARP clivado tanto em HeLa
scramble quanto em HeLa shGal-3.
No decorrer da infecção com T. cruzi observamos um maior processamento na célula
silenciada HeLa shGal-3 quando comparada com a linhagem HeLa scramble, com um pico de
processamento no tempo de 4 horas, onde observamos além do fragmento de 24kD outros
diversos fragmentos intermediários de PARP, os quais reduzem progressivamente nos tempos de
8 e 16 horas. A presença destes fragmentos intermediários em menor escala em HeLa scramble
infectada e maior escala em HeLa shGal-3 sugere que a infecção por T. cruzi pode estar ativando
outras proteases, e não somente a caspase-3 que processa PARP gerando preferencialmente
produto de 24 kDa. Mais ainda, na ausência de Galectina-3 essa via de processamento de PARP
independente de caspases torna-se mais evidente, sugerindo que de algum modo Galectina-3
exerça uma atividade anti-apoptótica inibindo a ativação de caspase-3 no curso da infecção
(FIGURA 24).
54
Figura 23. Análise dos níveis proteicos de Bcl-2, Bax e Galectina-3 junto à infecção. Extrato proteico
total das linhagens HeLa shGal-3 e HeLa scramble em diferentes tempos (2, 4, 8, 16 e 24 horas) de
infecção com T. cruzi, além da célula controle (CT) não infectada e do controle positivo (CT+) com
tratamento com etoposídeo por 16 horas foram obtidos pela lise direta em Laemmli buffer 3x a 95oC por
10 minutos, utilizando 105 células por raia no SDS-PAGE. Como controle positivo foram utilizadas
células tratadas com 200µM de etoposídeo por 16 horas.A) Análise por western blotting foi realizada com
IgG de camundongo anti-Bcl-2 e como controle de massa IgG de camundongo anti-β-Actina, sendo n=1
B) Análise por western blotting foi realizada com IgG de camundongo anti-Bax e como controle de
massa IgG de camundongo anti-β-Actina, sendo n=1 C) Análise por western blotting foi realizada com
IgG de camundongo anti-Galectina-3 e como controle de massa IgG de camundongo anti-β-Actina, sendo
n=1.
55
Figura 24. Análise dos níveis proteicos de Bax junto à infecção. Extrato proteico total das linhagens
HeLa shGal-3 e HeLa scramble em diferentes tempos (2, 4, 8, 16 e 24 horas) de infecção com T. cruzi,
além da célula controle (CT) não infectada e do controle positivo (CT+) com tratamento com etoposídeo
por 16 horas, foram obtidos pela lise direta em Laemmli buffer 3x a 95oC por 10 minutos, utilizando 105
células por raia no SDS-PAGE. Como controle positivo foram utilizadas células tratadas com 200µM de
etoposídeo por 16 horas. Análise por western blotting foi realizada com IgG de coelho anti-PARP e como
controle de massa IgG de camundongo anti-β-Actina, sendo n=1
56
4.8 Análise dos níveis proteicos de Gal-3 por fracionamento
celular.
Como os dados da literatura demonstram que a atuação anti-apoptótica de Galectina-3
se dá pela translocação núcleo-citoplasma, ou seja, sua saída do núcleo para o citoplasma,
principalmente para a região perinuclear, foi necessário determinarmos se essa translocação de
Galectina-3 também ocorre durante a infecção com T. cruzi.
Antes das análises por western blotting das frações citoplasmáticas e nucleares e
anáslises de imunofluorescência para sublocalização celular de Galectina-3 foi necessário
padronizar uma condição de inibição da tradução proteica na linhagem HeLa WT. Este
procedimento teve como objetivo evitar que quaisquer inferências nas variações de Galectina-3
na fração proteica citoplasmática não fossem devido a aumento/diminuição da tradução, mas sim
decorrentes de uma mobilização dos estoques núcleo-citoplasma no decorrer da infecção. Para
tal, utilizamos a droga cicloheximida para inibir a ação dos ribossomos (OBRIG et al., 1971), e
como o procedimento poderia ser tóxico para célula foi realizado o teste de viabilidade pelo
método de MTT em diferentes concentrações da cicloheximida e em diferentes tempos para
escolha das melhores condições.
Para determinar a concentração de ciclohexamida menos tóxica, células da linhagem
HeLa WT foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas com diferentes concentrações da
droga (1, 5, 10 e 20µg/mL) e em diferentes tempos (2, 4, 8, 16 e 24 horas), seguido do teste de
viabilidade pelo método do MTT. Considerando como controle negativo a célula não tratada com
a droga, não foram verificadas diferenças significativas na viabilidade celular entre as diferentes
concentrações de cicloheximida nos tempos de 2, 4, 8 e 16 horas. Porém, observamos uma
diminuição significativa da viabilidade celular em 24 horas, com a droga mostrando-se altamente
tóxica reduzindo a viabilidade das células em torno de 50%, por esse motivo, os experimentos
posteriores não excederam 16 horas de tratamento, e concentração escolhida da droga foi de
10µg/mL (FIGURA 25), certamente acima dos da concentração inibitória dos ribossomos
(OKSVOLD et al., 2012).
De posse das condições de incubação com cicloheximida para inibição da síntese
proteica, foram obtidos extratos proteicos citoplasmáticos e nucleares nos tempos de 8 e 16 horas
de infecção utilizando células da linhagem HeLa WT previamente tratadas com ciclohexamida
10µg/mL. Análises por western blotting demonstraram um aumento dos níveis percentuais de
Galectina-3 nuclear e a diminuição dos níveis percentuais de Galectina-3 citoplasmática ao longo
da infecção (FIGURA 26). O que demonstra que ao longo da infecção, há sim um deslocamento
57
da Galectina-3 citoplasma-núcleo, e sob condições basais de cultivo os níveis citoplasmáticos
altos poderiam estar envolvidos com uma maior resistência a morte celular e em estágios
posteriores da infecção, o acúmulo no núcleo reduziria o efeito anti-apoptótico de Galectina-3,
ou por outro lado modularia vias de proliferação igualmente importantes para sobrevida da célula
infectada.
Figura 25. Padronização da condição não tóxica de cicloheximida para utilização nos ensaios de
inibição da síntese proteica. Ensaio de viabilidade pelo método de MTT foi realizado com células da
linhagem HeLa wild type semeadas em poços da placa de 96, sendo incubadas com cicloheximida nas
concentrações de 1, 5, 10 e 20µg/mL nos tempos de 2, 4, 8, 16 e 24 horas. A seguir, foram processadas
para análise como descrito em métodos. Normalização dos valores de absorbância obtidos a 595nm foi
realizada considerando como percentual de 100% de células viáveis a linhagem HeLa wild type não tratada
nos respectivos tempos, sendo n = 3. Análise estatística one-way-ANOVA com correção Dunnet, as
condições estatisticamente significantes (*) apresentaram um valor * sendo p<0,0001 ** sendo p<0,001.
58
Figura 26. Ensaio de mobilização celular de Galectina-3 durante a infecção por T. cruzi. Extratos
proteicos correspondentes a fração citoplasmática e nuclear foram obtidos como descrito em métodos,
utilizando células da linhagem HeLa wild type infectadas nos tempos de 8 e 16 horas com T. cruzi,
coincubadas com ciclohexamida 10µg/mL, além da célula controle (CT) não infectada. Como controle
positivo foram utilizadas células tratadas com 200µM de etoposídeo por 16 horas. Análise por western
blotting foi realizada com anticorpo obtido de hibridoma anti-Galectina-3, uma IgG de camundongo anti-
α-tubulina como controle da fração citoplasmática, uma IgG de coelho anti-TBP como controle da fração
nuclear, e posterior análise de densitometria das bandas utilizando programa Scion Image, sendo n=2
59
4.9 Análise de sublocalização celular de Galectina-3 e Bax
durante infecção por imunofluorescência.
Para correlacionarmos com os dados da literatura que atribuem à resistência a morte
celular a uma mobilização citoplasmática de Galetina-3 e sua associação com proteínas da família
Bcl-2 como Bax e Bcl-2 (Akahani et al., 1997; Harazono et al., 2014; Selemetjev et al., 2015;),
realizamos análises por imunofluorescência para avaliar a possível mobilização de Galectina-3
na região citoplasmática nas primeiras horas da infeção por T. cruzi.
Como Harazono e colaboradores (2014) demonstraram uma interação proteica entre
Galectina-3 e Bax, buscou-se investigar também a colocalização de Galectina-3 com Bax ao
longo da infecção, avaliando se a morte da célula no decorrer da infecção tem a participação de
Bax com a formação de focos mitocondriais, característicos da via intrínseca de morte.
Primeiramente, células da linhagem HeLa WT tratadas com ciclohexamida foram
investigadas para comprovar que as mudanças de translocação núcleo-citoplasma e citoplasma-
núcleo de Galectina-3 ocorreriam apenas pelo processo de infecção por T. cruzi e não como uma
resposta ao tratamento com cicloheximida. Como esperado, não houve translocação nos tempos
de incubação de 2, 4, 8 e 16 horas com a droga, nem formação de focos mitocondriais de Bax
(FIGURA 27).
Para padronizarmos uma condição farmacológica de translocação pró-apoptótica de
Galectina-3 para o núcleo e formação de focos mitocondriais de Bax, células da linhagem HeLa
WT foram tratadas com concentrações de 50 e 100µM de etoposídeo nos tempos de 8 e 16 horas.
O que foi visto em todas concentrações e tempos foi a formação dos focos mitocondriais de Bax,
porém a translocação citoplasma-núcleo de Galectina-3 só foi observada na maior concentração
e no maior tempo, ou seja, no tratamento com 100µM de etoposídeo por 16 horas (FIGURA 28).
Para avaliar a translocação de Galectina-3 durante a infecção por T. cruzi, células da
linhagem HeLa WT foram mantidas com as formas tripomastigotas dos parasitos nos tempos de
2, 4, 8 e 16 horas, utilizando como controle positivo de translocação o tratamento com 100µM
de etoposídeo por 16 horas. Podemos observar em epifluorescência de sobreposição com
marcação nucelar com DAPI, uma translocação citoplasma-núcleo de Galectina-3 iniciando em
4 horas de infecção e atingindo um ápice no tempo de 16 horas de infecção (FIGURA 29).
Nesse ensaio não podemos creditar a translocação de Galectina-3 para o núcleo
exclusivamente ao efeito provocado pelos parasitos internalizados presentes no vacúolo
parasitóforo ou já presentes no citoplasma das células infectadas, uma vez que os parasitos
permaneceram sobre as células ao longo de todo o tempo, sem lavagem do meio. Desse modo,
60
esse estresse extracelular poderia sinergizar com o estresse intracelular para desencadear a
translocação núcleo-citoplasma de Galectina-3 (FIGURA 29).
Uma vez comprovada a translocação de Galectina-3 ao longo da infecção, era necessário
avaliar se junto a saída do citoplasma para o núcleo de Galectina-3 haveria mobilização dos
estoques de Bax para mitocôndrias com a formação de focos mitocondriais característicos da
morte pela via intrínseca. Ao longo da infecção em células da linhagem HeLa scramble, os focos
mitocondriais de Bax foram observados somente no tempo mais tardio de 16 horas (FIGURA
30). Correlacionando-o com a translocação citoplasma-núcleo de Galectina-3 que atinge um alto
percentual nesse mesmo tempo de 16 horas (FIGURA 29), podemos sugerir que Galectina-3 no
citoplasma estaria estabilizando estoques de Bax, impedindo-o de ligação à membrana
mitocondrial. Por outro lado, em estágio avançado da infecção, a mobilização de Bax para
mitocôndria como um estímulo de morte seria útil para o sucesso evolutivo do parasito, pois a
morte celular auxiliaria na liberação de formas tripomastigotas do parasito.
61
Figura 27. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 e Bax no decorrer do
tratamento com ciclohexamida. Células da linhagem HeLa scramble foram semeadas sobre
lamínulas em placas de 24 poços como descrito em métodos e incubadas com 10µg∕mL de
cicloheximida nos diferentes tempos 2, 4, 8 e 16 horas, além da célula controle (CT) não tratada.
Marcação para Galectina-3 foi realizada com anticorpo primário IgG anti-Gal-3 obtido de
hibridoma na diluição de 1:50 e anticorpo secundário anti-IgG-camundongo conjugado a
FITC na diluição de 1:150; marcação para Bax foi realizada com anticorpo primário IgG
anti-Bax de coelho na diluição de 1:25 e anticorpo secundário anti-IgG-coelho conjugado a
Alexa-546 na diluição de 1:200; marcação nuclear foi realizada com DAPI na concentração
de 1000nM. Imagens foram capturadas com objetiva 100x utilizando Programa CellSense, e
a sobreposição dos canais foi realizada pelo Programa ImageJ. Barras com 100µm.
62
Figura 28. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 e Bax no decorrer do
tratamento com ciclohexamida e etoposídeo. Células da linhagem HeLa scramble foram
semeadas sobre lamínulas em placas de 24 poços como descrito em métodos e incubadas com
10µg∕mL de cicloheximida, mais etoposídeo nas concentrações de 50 e 100µM nos tempos de 8 e 16
horas. Marcação para Galectina-3 foi realizada com anticorpo primário IgG anti-Gal-3 obtido
de hibridoma na diluição de 1:50 e anticorpo secundário anti-IgG-camundongo conjugado a
FITC na diluição de 1:150; marcação para Bax foi realizada com anticorpo primário IgG
anti-Bax de coelho na diluição de 1:20 e anticorpo secundário anti-IgG-coelho conjugado a
Alexa-546 na diluição de 1:200; marcação nuclear foi realizada com DAPI na concentração
de 1000nM. Imagens foram capturadas com objetiva 100x utilizando Programa CellSense, e
a sobreposição dos canais foi realizada pelo Programa ImageJ. Barras com 100µm.
63
64
Figura 29. Imunofluorescência da sublocalização de Galectina-3 no decorrer da infecção
por T. cruzi. Células da linhagem HeLa scramble foram semeadas sobre lamínulas em placas
de 24 poços como descrito em métodos, e incubadas com 10µg∕mL de cicloheximida juntamente
com formas tripomastigotas de T. cruzi utilizando m.o.i. de 1:10. Como controle positivo de
translocação para Galectina-3, as células foram incubadas com 100µM de etoposídeo por 16 horas.
Marcação para Galectina-3 foi realizada com anticorpo primário IgG anti-Gal-3 obtido de
hibridoma na diluição de 1:50 e anticorpo secundário anti-IgG-camundongo conjugado a
Alexa-546 na diluição de 1:200; marcação nuclear foi realizada com DAPI na concentração
de 1000nM. Imagens foram capturadas com objetiva 100x utilizando Programa CellSense, e
a sobreposição dos canais foi realizada pelo Programa ImageJ. Barras com 100µm.
65
Figura 30. Imunofluorescência da sublocalização de Bax no decorrer no decorrer da
infecção por T. cruzi. Células da linhagem HeLa scramble foram semeadas sobre lamínulas em
placas de 24 poços como descrito em métodos, e incubadas com 10µg∕mL de cicloheximida
juntamente com formas tripomastigotas de T. cruzi utilizando m.o.i. de 1:10 sendo fixadas nos
tempos de 2, 4, 8 e 16 horas de infecção. Como controle positivo para a formação de focos
mitocondrias, as células foram incubadas com 100µM de etoposídeo por 16 horas. Marcação para
Bax foi realizada com anticorpo primário IgG anti-Bax de coelho na diluição de 1:20 e
anticorpo secundário anti-IgG-coelho conjugado a Alexa-488 na diluição de 1:200;
marcação nuclear foi realizada com DAPI na concentração de 1000nM. Imagens foram
capturadas com objetiva 100x utilizando Programa CellSense, e a sobreposição dos canais
foi realizada pelo Programa ImageJ. Barras com 100µm.
66
5. DISCUSSÃO
Em outros modelos, Galectina-3 já demonstrou ter um papel importante de interação
com diversos patógenos como com patógenos como Neisseria meningitidis, Toxoplasma gondii,
e Trypanosoma cruzi. Com Neisseria meningitidis, uma bactéria patogênica que pode se associar
diretamente com Galectina-3 extracelular aumentando sua associação com macrófagos e
monócitos. É sabido que N. meningitidis tem LPS, um lipopolissacarídeo ligante para galectina-
3 com especificidade por diversos sacarídeos (QUATRONI et al., 2012). Outro patógeno com a
qual Galectina-3 interage é o Toxoplasma gondii e tal interação ocorre entre Galectina-3 e as
âncoras GPI presentes na membrana do parasito (DEBIERRE- GROCKIEGO et al.,2010).
Como comentado anteriormente para T. cruzi, a Galectina-3 extracelular presente na
ECM aumenta o potencial de interação do parasito com as células musculares lisas,
potencializando a infecção (KLESHCHENKO et al., 2004). Entretanto, poucos trabalhos têm
avançado na compreensão da participação de Galectina-3 intracelular para fisiopatologia da
doença, só mais recentemente foi demonstrada uma co-localização da Galectina-3 intracelular
com o vacúolo parasitóforo de T. cruzi (REIGNAULT et al., 2014).
Em condições normais de resposta à infecção, a célula hospedeira deveria entrar no
processo apoptótico para que não haja sucesso da infecção, porém, isso não acontece com o T.
cruzi, uma vez que, a infecção mantém-se e só ocorre a morte celular após a lise da célula e
liberação das formas tripomastigotas no sangue ou tecido, porém não ocorre só com o T. cruzi
como com outros parasitos.
Acreditamos que essa postergação do processo de morte tenha a participação de
Galectina-3. Diversos estudos utilizando células cancerosas demonstram que Galectina-3 tem um
papel importante no processo de resistência a apoptose em diversos tipos de tumores, mediante
saída da Galectina-3 nuclear para o citoplasma na região perinuclear (NANGIA-MAKKER
et al., 2007). Considerando a Galectina-3 como uma parceira de interação com PAMPs de T.
cruzi e mediadora do processo apoptótico, será que ela não participaria no processo de resistência
à apoptose de células no decorrer da infecção? Desse modo, nosso interesse foi correlacionar essa
possível ação dos estoques intracelulares anti-apoptóticos de Galectina-3 com a subversão
d´apoptose que ocorre durante a infecção por T. cruzi.
Para tal análise, utilizamos células de adenocarcinoma humano da linhagem HeLa
transduzidas com vetor para silenciamento de Galectina-3 por expressão constitutiva de um
shRNA, e como controle células transduzidas com vetor para expressão de shRNA não
relacionado, gerando as linhagens HeLa scramble e HeLa shGal-3, respectivamente. O sucesso
67
da interferência de RNA foi evidenciado pela análise de western blotting, onde confirmamos a
diminuição de expressão de galectina-3.
A escolha como modelo de estudo de uma linhagem epitelial como HeLa, baseia-se na
capacidade do parasito infectar também células não-fagocíticas profissionais tais como células
endoteliais, fibroblastos e mioblastos por um processo de internalização que se difere quando
comparado a células fagocíticas profissionais. Em células não fagocíticas profissionais o
processo de internalização se dá por endocitose pela sinalização por cálcio que recruta lisossomos
para o local, ocasionando na fusão das membranas do lisossomo e da membrana celular (HISSA
et al., 2012), formando assim o vacúolo parasitóforo. Utilizando como modelo celular de estudo
a linhagem HeLa podemos correlacionar nossas observações com o processo de invasão por
endocitose e subversão d´apoptose que ocorre in vivo com as células endoteliais, fibroblastos e
principalmente células musculares cardíacas, todos estes, tipos celulares que o parasito apresenta
alto tropismo.
Outro ponto diz respeito à utilização nos nossos ensaios de infecção exclusivamente de
formas tripomastigotas de cultura, e não formas sanguícolas de laboriosa obtenção. Mesmo não
sendo exemplarmente similares aos tripomastigotas sanguícolas característicos da fase patente de
parasitemia, os tripomastigotas de cultura são de fácil obtenção e mimetizam a forma sanguícola,
se aproximando em muito da situação in vivo observada na fase aguda da doença, onde células
não fagocíticas profissionais tal como a linhagem HeLa são infectadas pelo parasito via
endocitose.
Outra questão importante foi o cuidado na utilização apenas da forma tripomastigota de
cultura e não formas amastigotas de cultura, estudos anteriores já demonstraram que a forma
amastigota também possui capacidade infectiva e seu processo de internalização se diferencia da
forma tripomastigota de cultura (MORTARA, 1991), o que poderia modular vias de transdução
de sinal diferentes.
Como utilizamos para produção de massa parasitária um T. cruzi da cepa Dm28c com
manutenção epissomal de um vetor que expressa constitutivamente GFP mediante seleção com
droga geneticina (G418), a produção de massa parasitária, ou seja, de formas tripomastigotas de
cultura, deu-se em células da linhagem VERO também resistentes à geneticina (G418), a
linhagem Vero pcDNA3.1.
Em posse das diferentes linhagens de HeLa foi necessário um controle positivo de morte
para os testes de apoptose, para isso tratamos a célula HeLa com diferentes concentrações de
etoposídeo, que é um quimioterápico que induz morte celular por quebra de dupla fita pelo
bloqueio da ação da topoisomerase II, durante 16 horas de tratamento. Entretanto, nossa
68
marcação de permeabilidade celular com iodeto de propídeo (PI) foi infrutífera, uma vez que as
células não tratadas com etoposídeo já apresentaram alta marcação. Creditamos essa alta
marcação a um possível estresse condicionado ao crescimento exagerado das células, o que levou
a indução da morte dessas células e posterior marcação com PI. Pretendemos substituir essa
análise futuramente, realizando novamente com outros marcadores de morte celular,
especialmente apoptose como 7-AAD e Anexina V.
Além disso, avaliamos a utilização do etoposídeo também como um possível controle
positivo que alterasse os níveis proteicos de marcadores apoptóticos tais como Bax, Bcl-2 e
PARP. Como dito anteriormente Bax e Bcl-2 são proteínas da família de Bcl-2 que controlam a
via intrínseca d´apoptose, Bax tendo função pró-apoptótica levando a despolarização da
membrana mitocondrial, e Bcl-2 função anti-apoptótica promovendo a integridade da membrana
mitocondrial, e já PARP é clivado por diversas proteínas incluindo caspase 3, sendo PARP uma
importante proteína no mecanismo de reparo ao dano de DNA.
Durante o tratamento com etoposídeo vimos um pico de Bax na concentração de 50μM,
com posterior declínio da mesma. Já para Bcl-2 vimos uma tendência de decréscimo dose
dependente, o que pode justificar seria apesar de Bcl-2 estar diminuindo outras proteínas anti-
apoptóticas como Bcl-xL ou Mcl-1, não analisadas, poderiam estar aumentando conforme
aumento da droga, compensando assim a diminuição de Bcl-2, tendo assim a necessidade de
aferir o nível de tais proteínas para a confirmação.
Para análise de PARP, o tratamento com etoposídeo promoveu clivagem dose-
dependente de PARP, pois quanto maior o comprometimento com a morte, maior a quantidade
de PARP clivado. Destaca-se também o tamanho do fragmento de PARP clivado em torno de
24kDa, quando PARP é clivado por caspase-3 gera esse fragmento exato de 24kDa, apesar de
PARP ser clivado por outras cinases envolvidas em outros tipos de morte, apenas a capase-3 gera
esse fragmento, demonstrando que a morte induzida pelo tratamento com etoposídeo foi por
apoptose. De posse desse controle, poderíamos agora correlacionar o possível processamento de
PARP no decorrer da infecção com atividade de caspase-3.
Uma vez estabelecido o controle positivo de morte com etoposídeo, podemos avançar
para a análise da infecção com as linhagens HeLa contendo níveis endógenos ou depletados de
Galectina-3. Utilizando ensaio de MTT para determinarmos a viabilidade celular em células
infectadas e não infectadas durante os tempos de 24, 48, 72 e 96 horas, pudemos observar para as
células depletadas de Galectina-3 não infectadas uma redução significativa de em torno de 40%
da viabilidade celular, mostrando a importância desta lectina para a sobrevivência celular.
69
Além disso, quando infectadas pelo T. cruzi, todas as linhagens apresentaram uma
redução da viabilidade devido ao próprio estresse provocado pelo parasito no processo de
infecção. Porém, essa redução da viabilidade para a linhagem depletada de Galectina-3 foi ainda
maior e mais significativa, demonstrando que a Galectina-3 além de importante para
sobrevivência celular sob condições normais de cultivo, também tem um papel importante na
manunteção da sobrevivência da célula hospedeira no decorrer da infecção pelo T. cruzi.
Ademais, realizando a análise do ensaio de MTT utilizando o ponto de 24 horas da
linhagem controle (Figura 20) como condição normalizadora, podemos evidenciar mais
claramente a atuação positiva de Galectina-3 sobre a proliferação nos tempos 48, 72 e 96 horas.
Em síntese, a menor viabilidade celular na linhagem HeLa depletada de Gal-3 pode ser
fruto de desregulação sobre vias de sobrevivência/proliferação mediadas por Galectina-3. É
sabido que Galectina-3 promove a ativação de proteínas da via de sobrevivência JAK/STAT
(JEON et al, 2010), a Galectina-3 está relacionada com a fosforilação de STAT3, e uma vez
fosforilada, STAT3p promove um aumento da expressão de Bcl-2 desempenhando um efeito pró-
sobrevivência nas células (QIN et al., 2015). É sabido que Bcl-2 e o mediador anti-apoptótico c-
IAP2 também aumentam sua expressão na presença de STAT3 fosforilado, por meio da ligação
de STAT3 fosforilado aos motivos STAT na sequência promotora dos genes Bcl-2 e c-IAP2
(BHATTACHARYA et al., 2005).
Ambos os eventos podem estar sendo regulados em nosso modelo de estudo: a
fosforilação de STATs e a ativação de promotores de Bcl-2 e c-IAP2. Estudos com células
cancerosas demonstraram a importância de Galectina-3 na viabilidade celular devido sua
participação nas vias de pró-sobrevivência mediadas por PI3-K, além da regulação sobre a
apoptose inibindo a via intrínseca d´apoptose (HARAZONO et al., 2014), contribuindo assim
para o aumento da viabilidade e maior proliferação celular.
Uma vez demonstrada a participação de Galectina-3 no processo de sobrevivência celular
em nossos ensaios, buscamos avaliar quão importante seria uma ação sinérgica do parasito sobre
a sobrevivência da célula hospedeira em conjunto com atuação de Galectina-3. O parasito seria
capaz de modular as vias d´apoptose através de Galectina-3?
Considerando os dados prévios da literatura, o T. cruzi se utiliza principalmente da
indução das vias de sobrevivência e produção de fatores anti-apoptóticos para manipular a
apoptose (CARMEN & SINAI, 2007; SIBLEY, 2011). Ao entrar na célula o parasito pode iniciar
uma cascata de sinalização via receptores tirosina-cinases provocando aumento da viabilidade
celular e inibição do processo de morte celular, e, na ausência da ativação dessas cinases o
processo de infecção não é sucedido, levando a célula infectada à morte por apoptose (VIEIRA et
70
al., 1994; MALAQUIAS & OLIVEIRA, 1999). Além disso, fatores anti-apoptóticos como PDNF
revertem o estímulo apoptótico promovido pelo cultivo das células na ausência de soro,
conseguindo reverter esse quadro pela ativação de PI3K∕AKT que leva a sobrevivência celular
(CHUENKOVA et al., 2001). Outro exemplo, é a sinalização pelo parasito através da cruzipaina
para inibir a apoptose via aumento de Bcl-2 (AOKI et al., 2006).
Entretanto, em todos os casos já descritos, não se sabe se Galectina-3 faz parte das vias
de sinalização manipuladas pelo parasito para promoção dos fenótipos anti-apoptóticos.
Para ajudar na resposta a essa questão, realizamos um ensaio de indução prévia da morte
celular com etoposídeo, seguido da adição dos parasitos às células para avaliarmos se o parasito
seria capaz de subverter as vias apoptóticas nas diferentes linhagens de Hela. As análises dos
ensaios revelaram uma reversão da morte nas linhagens scramble e shGal-3 pré-tratadas com
etoposídeo, onde observamos índices de viabilidade similares ao controle não tratado e não
infectado, demonstrando a ação pró-sobrevivência do T. cruzi (Figura 21).
Vale ressaltar que os tempos de reversão da morte entre as linhagens scramble e shGal-
3 foram diferentes ao longo da infecção. A linhagem scramble já apresentou total reversão em 4
horas pós-infecção quando pré-incubadas na menor concentração de etoposídeo, enquanto que a
linhagem shGal-3 só foi apresentar uma total reversão da morte no tempo de 16 e 24 horas pós-
infecção. Tal fenótipo de atraso na reversão da morte pode ser devido a ausência de Galectina-3,
porém mais ensaios serão necessários para demonstrarmos quais são os reais mecanismos dessa
reversão, se é a ausência de Galectina-3 atuando como PRR na superfície celular e/ou sua ausência
intracelular atuando como mediador chave de vias de sobrevivência e morte celular.
Outro ponto que vale salientar nos ensaios de indução prévia da morte celular com
etoposídeo é o que ocorre nos tempos tardios de 48 e 72 horas pós-infecção (Figura 22). Há em
adição ao estresse inicial provocado pelo tratamento com etoposídeo, há também o estresse dos
ninhos de amastigotas e a decorrente lise das células com liberação de tripomastigotas no
sobrenadante da cultura, eventos que contribuem para a redução do número total de células e
consequente diminuição dos índices de viabilidade celular. Podemos constatar que em 72 horas
sem infecção, a linhagem shGal-3 pré-tratada com etoposídeo está quase que 100% inviável,
enquanto que a linhagem scramble não, mais um indício que Galectina-3 confere resistência a
morte celular mediada por etoposídeo. Por outro lado, em 72 horas pós-infecção, o parasito
consegue restaurar a viabilidade das células em ambas linhagens.
Como resultados da literatura já demonstraram que proteínas da família Bcl-2 são
reguladas ao longo da infecção pelo T. cruzi com aumento de Bcl-xL e Bcl-2 (CARMEN &
SINAI, 2007; AOKI et al., 2006), buscamos investigar também os níveis de proteínas como
71
próprio Bcl-2 e Bax durante a infecção das linhagens scramble e shGal-3. Podemos comprovar
que Bcl-2 apresenta níveis diminuídos na linhagem shGal-3 quando comparados com níveis de
Bcl-2 na linhagem scramble. Ademais, observamos um pico da proteína Bcl-2 no tempo de 4
horas pós-infecção em ambas as linhagens, mas mais proeminente na linhagem scramble,
sugerindo ser um ponto importante para a homeostase da célula infectada, o que nos leva a crer
que esse aumento depende de Galectina-3 e é importante para inibir a via intrínseca mitocondrial
ao redor de 4 horas pós-infecção, um momento de alto estresse para a célula infectada, onde se
inicia o escape dos parasitos do vacúolo parasitoforo para o citoplasma.
Junto a essa análise dos níveis proteicos foi realizada também a investigação dos níveis
de RNAm de Bax e Bcl-2 pelo grupo por qPCR (quantative Real Time Polimerase Chain
Reaction) (dados não mostrados) demonstrando também níveis baixos de RNAm de Bcl-2 em
células silenciadas, sugerindo que a regulação ocorra a nível transcricional pela diminuição da
expressão destes genes.
Por outro lado, como esperado os níveis de Galectina-3 na linhagem silenciada
permaneceram reduzidos, porém na linhagem scramble não apresentaram variação ao longo da
infecção. Essa observação utilizando a linhagem HeLa não era esperada, uma vez que já foi
observado um aumento nos níveis de Galectina-3 em células musculares lisas de artérias
coronarianas e células dendríticas infectadas pelo T. cruzi (KLESHCHENKO et al., 2004; VRAY
et al., 2004). Talvez isso se deva ao fato da linhagem HeLa de adenocarcinoma cervical já
apresentar altos níveis de expressão da Galectina-3 sob condições basais de cultivo.
A análise de PARP revelou um maior percentual de PARP clivado na linhagem
silenciada quando comparada com a linhagem scramble, especialmente no tempo de quatro horas
pós-infecção. PARP foi inicialmente identificada como uma protéina que atua no reparo por
excisão de base em resposta a estresses metabólicos, químicos ou danos no DNA. Após ligação
aos nicks no DNA, PARP ativa sintetiza poli(ADP-ribose) utilizando NAD+ (Nicotinamide
adenine dinucleotide) como doador, sendo esse o sinal para a maquinaria de reparo corrigir o
local.
Posteriormente, PARP foi associado com a resposta inflamatória, sendo capaz de atuar
como repressor transcricional da citocina anti-inflamatória IL-10 (REY et al., 2007), e como
mediador de fatores inflamatórios como MAPKs e NFkB emergindo como molécula-chave na
homeostase da interface parasito hospedeiro, como visto em infecções por patógenos como
Helicobacter pylori (LI et al., 2015; NOSSA et al., 2010). PARP-1, o principal membro da
família, pode se associar diretamente com NFκB e promover interações com outras proteínas,
72
assim como, com o DNA para promover expressão de citocinas pró-inflamatórias e do gene iNOS
(HUANG et al., 2008).
Desse modo, o balanço nos níveis de PARP ativo e inativo é essencial para essa
homeostase celular, uma alta atividade de PARP consome os estoques de NAD+ e leva a célula
a morte por necrose (SCOVASSI et al., 1999), enquanto que a inativação proteolítica por
cisteino-proteases como caspases, calpainas, catepsinas e serino-proteases como granzimas
inviabiliza o reparo por excisão de bases no DNA e provoca alterações na resposta imune humoral
(CHAITANYA et al., 2010).
O que observamos em nossas análises foi que na ausência de Galectina-3, essa
homeostase nos níveis de PARP é alterada com considerável processamento proteolítico por
diferentes fragmentos no tempo de 4 horas pós-infecção, mas de alguma maneira o parasito
consegue reverter esse quadro e diminuir a quantidade de PARP clivado em tempos avançados
para manutenção da infecção. Em parte, este processamento em 4 horas pós-infecção pode ser
devido a caspase-3 ativa, uma vez que observamos a banda de 24kDa característica da clivagem
de PARP nas subunidades de 89kDa e 24kDa (CHAITANYA et al., 2010), prevalente na
condição com etoposídeo. Por outro lado, bandas intermediárias foram observadas podendo
corresponder as bandas de 40kDa e 70kDa clivadas por calpaínas relacionadas com o processo
de necrose celular (CHAITANYA et al., 2010).
De todo modo, o parasito consegue reverter os diferentes tipos de morte, e na ausência
de Galectina-3 a célula hospedeira não só fica susceptível ao processo de apoptose, como de
morte celular em geral. Outro ponto que se destaca é a possibilidade de que próprias cisteino-
proteases do parasito poderem clivar PARP como: cruzipaina e uma calpaina-like TcCALP
expressa por formas tripomastigotas do parasito (GIESE et al., 2008).
Larrea e colaboradores (2012) demonstraram que o parasito necessita da atividade de
PARP da célula hospedeira para a proliferação/diferenciação intracelular (LARREA et al., 2012),
sendo importante uma análise mais detalhada de PARP ao longo da infecção, tanto para
compreensão da sua participação no processo de diferenciação do parasito quanto do processo de
resistência de morte celular.
Após a confirmação que a Galectina-3 está de alguma forma envolvida com um fenótipo
pró-sobrevivência mediando os níveis de proteínas anti- e pró-apoptóticos, nós buscamos
correlacionar a atuação anti-apoptótica de Galectina-3 com sua sublocalização celular utilizando
fracionamento e imunomarcação. Como dito anteriormente, a atuação anti-apoptótica de
Galectina-3 em resposta a estímulos de morte é dependente de sua localização celular no citosol,
cuja prevalência depende da fosforilação no resíduo de serina 6 de Galectina-3. Para que ocorra
73
a inibição d´apoptose, a Galectina-3 citosólica é translocada para a membrana mitocondrial onde
medeia o sequestro do pró-apoptótico Bax por Bcl-2 bloqueando a liberação do citocromo c e a
permeabilização de membrana externa mitocondrial (YU et al., 2002; MATARRESE et al., 2000;
YOSHII et al., 2002; TAKENAKA et al., 2004; NAKAHARA et al., 2005).
Para essa abordagem, padronizamos a utilização de cicloheximida com o intuito de inibir
a síntese proteica pelos ribossomos (OBRIG et al., 1971), assim, limitar as inferências
quantitativas sobre os níveis de Galectina-3 somente à translocação núcleo-citoplasma-núcleo.
Utilizando a concentração de 10µg/mL podemos predizer que qualquer alteração dos níveis
citoplasmáticos ou nucleares de Galectina-3 se deu exclusivamente da translocação núcleo-
citoplasma e não apenas pelo aumento dos níveis proteicos totais por tradução pelos ribossomos.
A análise por western blotting de frações nucleares e citoplasmáticas demonstrou que há uma
concentração da Galectina-3 no citoplasma em tempos iniciais de infecção e que tal loco pode
estar associado ao fenótipo anti-apoptótico, mas em tempos posteriores há uma mobilização para
o núcleo das células infectadas.
Na análise de imunofluorescência, também comprovamos uma translocação da
Galectina-3 do citoplasma para o núcleo, principalmente após o tempo de 8 horas de infecção,
acreditamos que os estoques de Galectina-3 citoplasmática possam se associar com Bcl-2 e Bax
como demonstrado na literatura inibindo a via intrínseca d´apoptose a curto prazo.
A imulocalização da proteína pró-apoptótica Bax demonstrou a formação de focos de
Bax somente a partir de 16 horas pós-infecção, a formação desses focos se dá pela concentração
de Bax na membrana mitocondrial para que haja a despolarização da mesma e início d´apoptose
pela via intrínseca.
Em função dos resultados prévios de Harazono e colaboradores (2014) que
demonstraram a formação de um heterodímero de Bax com Galectina-3 através do motivo
NGWR, esperávamos em nossos ensaios uma co-localização temporal de Bax e Galectina-3. E
embora a localização de Bax em focos mitocondriais a partir de 16 horas possa estar relacionada
com dissociação de Galectina-3 que transloca para o núcleo a partir de 8 horas pós-infecção
liberando Bax para translocação à mitocôndria, não podemos inferir essa dinâmica de interação.
Para melhor investigação de Bax com Galectina-3 será necessária uma análise confocal para
entendermos a sublocalização celular da Galectina-3, assim como uma análise quantitativa que
possa evidenciar acúmulo de Galectina-3 em algumas regiões em potencial.
Além da análise confocal haveria necessidade de investigação mais apurada com
metodologias para medir diferença do potencial de membrana mitocondrial, fração
exclusivamente mitocondrial e morfologia por microscopia eletrônica para melhor análise dos
74
níveis de Bax mitocondrial quando há a formação de focos, e se há alteração morfológica
mitocondrial ou de outras organelas durante o curso da infecção que mostrariam esse processo
de indução∕inibição de morte celular ao longo da infecção.
Uma das possibilidades funcionais de Galectina-3 nuclear pode ser explicada pela
atuação com β-catenina em resposta a ativação da via Wnt. A β-catenina ativa transloca para
núcleo e associa-se com Galectina-3, podendo formar ainda um complexo com fator
transcricional Tcf4 estimulando a transcrição de genes da via Wnt como: c-Myc, ciclina D1,
ciclooxigenase2 (FUNASAKA et al., 2014). Por outro lado, caseína quinase 1-α (CK1) e GSK-
3β (Glycogen synthase kinase 3 beta) podem fosforilar β-catenina direcionando sua degradação
pelo proteossomo, fosforilando também a Galectina-3 no resíduo de serina 6 diminuindo o seu
importe para o núcleo (FUNASAKA et al., 2014). Desse modo, uma baixa atividade de CK1 e
GSK-3β poderia estar relacionada com translocação nuclear de ambas, Gal-3 e β-catenina, com
consequente formação de complexos transcricionais. Nesse contexto, seria também interessante
investigar os níveis de CK1 e GSK-3β em nosso modelo após infecção pelo T. cruzi.
Para uma melhor investigação do processo de translocação núcleo-citoplasma
pretendemos produzir células superexpressando Galectina-3 e mutantes de Galectina-3 com
alterações no resíduo de serina 06, mimetizando a forma fosforilada e não-fosforilada. Essa
modifação pós-traducional no resíduo de serina 6 que medeia a translocação núcleo-citoplasma
é sabidamente importante em modelos tumorais cujas células perdem a regulação da proliferação.
De posse dessas linhagens pretendemos avaliar a importância da localização celular de Galectina-
3 no fenótipo de pró-sobrevivência observado durante a infecção pelo T. cruzi.
Em resumo, acreditamos que o parasito se apropria das vias de sinalização da célula
hospedeira a seu favor, regulando positivamente as funções de Galectina-3 relacionadas com a
sobrevivência e inibição d´apoptose, mantendo a célula hospedeira viva pelo tempo suficiente à
replicação dos amastigotas e diferenciação destes em tripomastigotas. Acreditamos que o parasito
atue subvertendo a morte celular que normalmente ocorreria com a célula hospedeira sob essa
condição de estresse patológico que é a infecção pelo parasito.
75
6. CONCLUSÕES
Foi demonstrado que a Galectina-3 está envolvida com vias de sobrevivência celular, uma
vez que células silenciadas para Galectina-3 apresentam reduzida viabilidade como observado
nos ensaios de MTT;
Na ausência de Galectina-3 as células demonstraram uma maior sensibilidade à morte quando
infectadas pelo T. cruzi, como observado nos ensaios de MTT;
Além da resistência a morte celular, a Galectina-3 está envolvida com vias de proliferação sob
condições normais de cultivo e sob os estímulos decorrentes da presença do T. cruzi;
O T. cruzi de algum modo utiliza a maquinaria da célula para um aumento da viabilidade
celular, com a inibição do processo de apoptose e aumento da sobrevivência da célula de modo
Galectina-3-dependente;
Nas células silenciadas para Galectina-3 observamos níveis diminuídos das proteinas Bax
e Bcl-2 quando comparados com os níveis da linhagem scramble no curso da infecção;
Durante a infecção há um processamento proteolítico de PARP em células silenciadas para
Galectina-3, demonstrando que PARP tem uma estabilidade Galectina-3-dependente;
A cinética da infecção revela um acúmulo de Bax, Bcl-2 e um processamento proteolítico
de PARP no tempo de 4 horas pós-infecção, talvez correlacionado com o estresse provocado
pelo escape do T. cruzi do vacúolo parasitoforo para o citoplasma.
Nas células silenciadas para Galectina-3 os acúmulos proteicos de Bax e Bcl-2 no tempo
de 4 horas pós-infecção são evidentes, porém menores que os acúmulos observados na
linhagem scramble, demonstrando que Galectina-3 atua na homeostase de proteínas da família
Bcl-2 no curso da infecção pelo T. cruzi;
A análise da sublocalização de Galectina-3 por fracionamento celular revela uma
concentração citoplasmática de Galectina-3 em condições normais de cultivo e nos tempos
iniciais da infecção, por outro lado, nos tempos posteriores se observa uma maior concentração
de Galectina-3 nuclear;
Há uma translocação da Galectina-3 do citoplasma para o núcleo, principalmente após o tempo
de 8 horas de infecção, sugerindo que os estoques de Galectina-3 citoplasmática possam se
associar com Bcl-2 e Bax inibindo a via intrínseca d´apoptose a curto prazo, enquanto que os
estoques nucleares poderiam estar sinalizando para vias pró-sobrevivência a médio prazo na
infecção.
76
7. PERSPECTIVAS
Obter linhagens HeLa transduzidas com vetores lentivirais superexpressando Galectina-3
selvagem e expressando formas mutantes de Galectina-3 mimetizando a proteína fosforilada ou
não fosforilada;
Utilizar essas linhagens expressando diferentes isoformas de Galectina-3 para avaliar a
viabilidade/proliferação e sublocalização celular da proteína ao longo da infecção pelo T. cruzi;
Utilizar outras marcações de viabilidade celular como 7-AAD para viabilidade e marcação
com Anexina V para exposição de fosfatidilserina no folheto extracelular da membrana, para
correlacionar com os fenótipos de apoptose;
Avaliar nas diferentes linhagens a atividade de caspases como caspase-3 por ensaio
colorimétrico e inibidores seletivos de caspases correlacionando essa atividade com o
processamento de PARP e maior sensibilidade à morte durante a infecção;
Realizar ensaios de imunofluorescência por microscopia confocal para melhor determinação
da sublocalização da Galectina-3 e Bax;
Realizar microscopia eletrônica para efetuar uma investigação das possíveis alterações
morfológicas da célula ao longo da infecção;
Realizar ensaios com traçadores fluorescentes para avaliar as alterações no potencial de
membrana mitocondrial nas diferentes linhagens durante a infecção;
Verificar os níveis de RNAm de Bax, Bcl-2, Bcl-xL, e demais membros da família Bcl-2
entre outras correlacionadas com a sobrevivência celular e apoptose durante a infecção;
Analisar a ativação de proteínas relacionadas com o processo de sobrevivência celular ao
longo da infecção como NF-κB, PI3K, p-ERK, entre outras;
Para a interação Bcl-Bax-Galectina-3 pretendemos realizar ensaios de coimunoprecipitação
para investigar a formação de complexos com Galectina-3 ao longo da infecção;
Analisar outras proteínas que possam atuar como anti-apoptóticas, como IAPs durante a
infecção, verificando tanto seu nível proteico quanto quantificando o RNAm por qPCR.
Corroborar os resultados observados na linhagem HeLa durante a infecção utilizando como
alternativa uma linhagem fagocítica profissional como THP-1 contendo as mesmas modificações
genéticas: silenciada por RNAi, superexpressando a forma selvagem e formas mutantes de
Galectina-3.
77
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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