Introdução Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa endémica...
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Introdução Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa endémica dos Açores com grande importância ao nível da estrutura e funcionamento de várias comunidades vegetais endémicas dos Açores (Dias, 1996; Dias et al. 2004; Elias, 2001; Elias & Dias, 2004). Os objectivos deste trabalho são os seguintes: - Determinar a variabilidade genética intra e inter-populacional em populações naturais e de viveiro; - Estimar o grau de diferenciação genética das populações; - Avaliar as consequências ao nível taxonómico; - Avaliar as consequências ao nível da conservação. Variabilidade genética de populações naturais e em viveiro de Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) Luís Silva 1 , Rui Elias 2 , Eduardo Dias 2 , Mónica Moura 1 , Samuel Menard 1 e Sandra Couto 1 1 Departamento de Biologia, CIRN, Universidade dos Açores, Apartado 1422, PT 9501-855 Ponta Delgada, Portugal; Telefone: 296650463; fax: 296 650 100; e-mail: lsilva @notes. uac .pt ; 2 Departamento de Ciências Agrárias, CITA, Universidade dos Açores, Largo da Igreja, 9701-851 Terra-chã, Portugal. Telefone: 295402200; Fax: 295402205; e-mail: elias @ angra . uac .pt Material e Métodos Amostragem - As amostras incluem, sempre que possível, 10 indivíduos de cada população (5 plantas femininas e 5 masculinas). Foram amostradas 6 populações na Ilha Terceira e 2 na Ilha do Pico. Sempre que possível, evitou-se a amostragem de plantas vizinhas. Extracção de DNA - O DNA foi extraído a partir dos raminhos terminais, mantidos no frigorífico até ao início do processo de extracção. O material excedentário foi conservado a –80ºC. Todo o material foi processado recorrendo ao kit de extracção DNeasy Plant Mini kit (Qiagen). Verificação da qualidade e quantidade do DNA extraído - As amostras de DNA, mantidas em tampão TE e no congelador a –20ºC, foram analisadas num gel de agarose a 1,2 % de modo a aferir da presença e da quantidade de DNA extraído. Amplificação - Por reacção foram utilizados 10 µmol/L (1µL) do respectivo primer, cerca de 35 ng de DNA purificado (1µL) e um tubo de 0,2 ml com “puReTaq Ready-To- Go PCR bead” (Amersham Biosciences), para um volume final de 25 µl. A reacção de amplificação foi realizada num amplificador T-Gradient (Whatman Biometra) com o seguinte programa: i) desnaturação 3 min a 94ºC; ii) 45 ciclos de amplificação (94ºC, 1 min; 36ºC, 1 min; 72ºC, 2 min); iii) extensão final de 4 min a 72ºC. Análise dos fragmentos amplificados - Os fragmentos de DNA resultantes da amplificação foram separados num gel de agarose a 1,4% (tampão TBE), corados com brometo de etídio e visualizados com o sistema Gel Doc 2000. Foi utilizado como referência um marcador molecular de 50–2000 ou de 50–10000 pares de bases (Sigma- Aldrich). Análise estatística - As bandas polimórficas foram registadas como presentes (1) ou ausentes (0). Para evitar enviesamentos as bandas com uma frequência inferior a 3/N (N é a dimensão da amostra) foram excluídas da análise (Lynch & Milligan, 1994). A diversidade fenotípica (com base nas bandas) foi estimada por população, por ilha e globalmente, utilizando o índice de Shannon (Morgan-Richards & Wolff, 1999). A variação genética dentro das populações, dentro das ilhas, entre populações e entre ilhas foi estimada utilizando uma Análise de Variância Molecular (AMOVA) com a aplicação Arlequin ver. 2.000 (Schneider et al., 2000). A diferenciação genética das populações foi estimada, com base nas distâncias Euclideanas entre indivíduos, as quais foram utilizadas no cálculo dos valores de F ST (Schneider et al., 2000). Foi construída uma árvore (Neighbor-Joining tree) com base na matriz de distâncias (Nei & Li, 1979), recorrendo à aplicação RAPDistance 1.06 (Armstrong et al., 1994). Bibliografia •Adams, R. P., A. . Schwarzbach and R. N. Pandey (2003). The concordance of terpenoid, ISSR and RAPD markers, and ITS sequence data sets among genotypes: na example from Juniperus. Biochemical Systematics and Ecology, 31: 375-387. •Armstrong, J., Gibbs, A., Peakall, R. and G. Weiller (1994). The RAPDistance Package. Australian National University, Canberra, Australia. •Dias E. 1996. Vegetação natural dos Açores. Ecologia e sintaxonomia das florestas naturais. Tese de Doutoramento. Universidade dos Açores. Angra do Heroísmo, Azores. •Dias E., Elias R. B. & Nunes V. (2004). Vegetation mapping and nature conservation: a case study in Terceira Island (Azores). Biodiversity and Conservation 13: 1519-1539. •Elias R. B. (2001). Sucessão primária em domas traquíticos. Tese de Mestrado em Ecologia Insular e Evolução. Universidade dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias. Angra do Heroísmo, Azores. •Elias R. B. & Dias E. (2004). Primary succession on lava domes on Terceira (Azores). Journal of Vegetation Science 15: 331-338. •Lynch, M., and B. Milligan (1994). Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3: 91-99. •Morgan-Richards, M. and K. Wolff (1999). Genetic structure and differentiation of Plantago major reveals a pair of sympatric sister species. Molecular Ecology, 8: 1027-1036. •Nei, M. and W.-H. Li, (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76: 5269-5273. •Schneider, S., D. Roessli, and L. Excoffier (2000). Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis . Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Conclusões A variabilidade genética intrapopulacional é relativamente elevada. A distância genética, considerável, encontrada entre amostras das ilhas Terceira e do Pico, indica que se deverá proceder com cautela no que respeita à utilização das plantas originárias do Pico em outras ilhas dos Açores. Deve ainda considerar-se o facto da população de viveiro apresentar a diversidade genética mais reduzida. Dada a distância genética encontrada entre populações de diferentes ilhas, nesta fase do estudo aconselha-se que o material vegetal de uma ilha não seja utilizado para plantio noutra ilha. Uma tal prática acarretaria, muito provavelmente, uma progressiva homogeneização ao nível genético das populações de J. brevifolia das diferentes ilhas. No que respeita à variabilidade genética de J. brevifolia na ilha Terceira, esta é uma realidade, pelo que, os dados referentes aquela Ilha serão alvo de uma análise mais detalhada, de modo a confirmar a estrutura genética agora detectada. Resultados Dos 30 primers inicialmente testados, foram aplicados 5 primers RAPD e 5 primers ISSR. Utilizaram-se 8 amostras (72 indivíduos) o que resultou na análise de um total de 140 bandas polimórficas. Tabela 2. A diversidade genética, estimada através do índice de Shannon, foi relativamente elevada no interior das populações (67%), com alguma variabilidade entre ilhas e entre populações. Fst T01 T02 T03 T04 T05 T06 P01 P02 T01 0,000 * * * * * * * T02 0,262 0,000 * * * * * * T03 0,240 0,268 0,000 * * * * * T04 0,262 0,168 0,283 0,000 * * * * T05 0,269 0,191 0,195 0,195 0,000 * * * T06 0,282 0,215 0,284 0,154 0,151 0,000 * * P01 0,387 0,403 0,368 0,425 0,342 0,437 0,000 * P02 0,407 0,407 0,368 0,442 0,359 0,431 0,236 0,000 Fonte de V ariação G rausde liberdade Som a de quadrados Variância Percentagem de variação Entre grupos 1 226,9 5,6 20,6 Entre populações dentro dosgrupos 6 366,0 5,0 18,5 D entro das populações 64 1054,0 16,5 60,8 Total 71 1648,9 27,1 F ST 0,39 p < 0.001 Figura 2. Estrutura genética de 8 populações de Juniperus brevifolia das ilhas Terceira e Pico. Dendrograma baseado na distância genética de Nei. Existe uma estrutura genética algo complexa ao nível da Ilha Terceira. Observa-se um certo agrupamento das populações de Mistérios Negros e Cão Morto, por um lado, e das populações de Sanguinhal, Mistérios e Serra de Santa Bárbara, por outro, ficando a população das Quatro Ribeiras algo isolada, e aparentemente mais próxima das populações do Pico. Tabela 3. Análise da variância molecular - foram definidos dois grupos (6 populações da ilha Terceira e 2 populações da Ilha do Pico). Confirma-se que a percentagem de variabilidade genética dentro das populações (61%) é o factor responsável pela maior parte da variância encontrada. Tabela 4. Distância genética entre as amostras analisadas. Todas as distâncias são significativas (* p<0,05). Foram encontradas distâncias genéticas consideráveis entre as populações amostradas, especialmente entre populações de ilhas diferentes. Figura 1 – Géis obtidos utilizando primers do tipo RAPD e ISSR. TMN TCM TS TC TS TM TQR TQR PM PV Local Abreviatura Código Indivíduos M istériosNegros TM N T01 1-10 Serra de Santa Bárbara TC T02 11-20 Cão M orto TCM T03 23-30 Sanguinhal TS T04 31-40 Q uatro Ribeiras TQR T05 41-48 M istérios TM T06 54-60 Viveiros PV P01 1-10 M anhanha PM P02 11-20 Tabela 1. Populações amostradas nas ilhas Terceira (6) e Pico (2). Agradecimentos: Ao Engº. Jorge Belerique pelo apoio prestado. Financiado pela Direcção Regional dos Recursos Florestais - Açores Helder Fraga Helder Fraga
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IntroduçãoJuniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa endémica dos Açores com grande importância ao nível da estrutura e funcionamento de várias comunidades vegetais endémicas dos Açores (Dias, 1996; Dias et al. 2004; Elias, 2001; Elias & Dias, 2004). Os objectivos deste trabalho são os seguintes:- Determinar a variabilidade genética intra e inter-populacional em populações naturais e de viveiro;- Estimar o grau de diferenciação genética das populações;- Avaliar as consequências ao nível taxonómico;- Avaliar as consequências ao nível da conservação.
Variabilidade genética de populações naturais e em viveiro de Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae)
Luís Silva1, Rui Elias2, Eduardo Dias2, Mónica Moura1, Samuel Menard1 e Sandra Couto1
1Departamento de Biologia, CIRN, Universidade dos Açores, Apartado 1422, PT 9501-855 Ponta Delgada, Portugal; Telefone: 296650463; fax: 296 650 100; e-mail: [email protected]; 2Departamento de Ciências Agrárias, CITA, Universidade dos Açores, Largo da Igreja, 9701-851 Terra-chã, Portugal. Telefone: 295402200; Fax: 295402205; e-mail: [email protected]
Material e MétodosAmostragem - As amostras incluem, sempre que possível, 10 indivíduos de cada população (5 plantas femininas e 5 masculinas). Foram amostradas 6 populações na Ilha Terceira e 2 na Ilha do Pico. Sempre que possível, evitou-se a amostragem de plantas vizinhas.
Extracção de DNA - O DNA foi extraído a partir dos raminhos terminais, mantidos no frigorífico até ao início do processo de extracção. O material excedentário foi conservado a –80ºC. Todo o material foi processado recorrendo ao kit de extracção DNeasy Plant Mini kit (Qiagen).
Verificação da qualidade e quantidade do DNA extraído - As amostras de DNA, mantidas em tampão TE e no congelador a –20ºC, foram analisadas num gel de agarose a 1,2 % de modo a aferir da presença e da quantidade de DNA extraído. Amplificação - Por reacção foram utilizados 10 µmol/L (1µL) do respectivo primer, cerca de 35 ng de DNA purificado (1µL) e um tubo de 0,2 ml com “puReTaq Ready-To-Go PCR bead” (Amersham Biosciences), para um volume final de 25 µl. A reacção de amplificação foi realizada num amplificador T-Gradient (Whatman Biometra) com o seguinte programa: i) desnaturação 3 min a 94ºC; ii) 45 ciclos de amplificação (94ºC, 1 min; 36ºC, 1 min; 72ºC, 2 min); iii) extensão final de 4 min a 72ºC. Análise dos fragmentos amplificados - Os fragmentos de DNA resultantes da amplificação foram separados num gel de agarose a 1,4% (tampão TBE), corados com brometo de etídio e visualizados com o sistema Gel Doc 2000. Foi utilizado como referência um marcador molecular de 50–2000 ou de 50–10000 pares de bases (Sigma-Aldrich). Análise estatística - As bandas polimórficas foram registadas como presentes (1) ou ausentes (0). Para evitar enviesamentos as bandas com uma frequência inferior a 3/N (N é a dimensão da amostra) foram excluídas da análise (Lynch & Milligan, 1994). A diversidade fenotípica (com base nas bandas) foi estimada por população, por ilha e globalmente, utilizando o índice de Shannon (Morgan-Richards & Wolff, 1999). A variação genética dentro das populações, dentro das ilhas, entre populações e entre ilhas foi estimada utilizando uma Análise de Variância Molecular (AMOVA) com a aplicação Arlequin ver. 2.000 (Schneider et al., 2000). A diferenciação genética das populações foi estimada, com base nas distâncias Euclideanas entre indivíduos, as quais foram utilizadas no cálculo dos valores de FST (Schneider et al., 2000). Foi
construída uma árvore (Neighbor-Joining tree) com base na matriz de distâncias (Nei & Li, 1979), recorrendo à aplicação RAPDistance 1.06 (Armstrong et al., 1994).
Bibliografia•Adams, R. P., A. . Schwarzbach and R. N. Pandey (2003). The concordance of terpenoid, ISSR and RAPD markers, and ITS sequence data sets among genotypes: na example from Juniperus. Biochemical Systematics and Ecology, 31: 375-387.•Armstrong, J., Gibbs, A., Peakall, R. and G. Weiller (1994). The RAPDistance Package. Australian National University, Canberra, Australia.•Dias E. 1996. Vegetação natural dos Açores. Ecologia e sintaxonomia das florestas naturais. Tese de Doutoramento. Universidade dos Açores. Angra do Heroísmo, Azores.•Dias E., Elias R. B. & Nunes V. (2004). Vegetation mapping and nature conservation: a case study in Terceira Island (Azores). Biodiversity and Conservation 13: 1519-1539.•Elias R. B. (2001). Sucessão primária em domas traquíticos. Tese de Mestrado em Ecologia Insular e Evolução. Universidade dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias. Angra do Heroísmo, Azores. •Elias R. B. & Dias E. (2004). Primary succession on lava domes on Terceira (Azores). Journal of Vegetation Science 15: 331-338.•Lynch, M., and B. Milligan (1994). Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3: 91-99.•Morgan-Richards, M. and K. Wolff (1999). Genetic structure and differentiation of Plantago major reveals a pair of sympatric sister species. Molecular Ecology, 8: 1027-1036.•Nei, M. and W.-H. Li, (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76: 5269-5273.•Schneider, S., D. Roessli, and L. Excoffier (2000). Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland.
ConclusõesA variabilidade genética intrapopulacional é relativamente elevada.A distância genética, considerável, encontrada entre amostras das ilhas Terceira e do Pico, indica que se deverá proceder com cautela no que respeita à utilização das plantas originárias do Pico em outras ilhas dos Açores. Deve ainda considerar-se o facto da população de viveiro apresentar a diversidade genética mais reduzida. Dada a distância genética encontrada entre populações de diferentes ilhas, nesta fase do estudo aconselha-se que o material vegetal de uma ilha não seja utilizado para plantio noutra ilha. Uma tal prática acarretaria, muito provavelmente, uma progressiva homogeneização ao nível genético das populações de J. brevifolia das diferentes ilhas.No que respeita à variabilidade genética de J. brevifolia na ilha Terceira, esta é uma realidade, pelo que, os dados referentes aquela Ilha serão alvo de uma análise mais detalhada, de modo a confirmar a estrutura genética agora detectada.
ResultadosDos 30 primers inicialmente testados,
foram aplicados 5 primers RAPD e 5
primers ISSR. Utilizaram-se 8 amostras
(72 indivíduos) o que resultou na análise
de um total de 140 bandas polimórficas.
Tabela 2. A diversidade genética, estimada através do índice de Shannon, foi relativamente elevada no interior das populações (67%), com alguma variabilidade entre ilhas e entre populações.
Fst T01 T02 T03 T04 T05 T06 P01 P02T01 0,000 * * * * * * *T02 0,262 0,000 * * * * * *T03 0,240 0,268 0,000 * * * * *T04 0,262 0,168 0,283 0,000 * * * *T05 0,269 0,191 0,195 0,195 0,000 * * *T06 0,282 0,215 0,284 0,154 0,151 0,000 * *P01 0,387 0,403 0,368 0,425 0,342 0,437 0,000 *P02 0,407 0,407 0,368 0,442 0,359 0,431 0,236 0,000
Fonte de VariaçãoGraus de liberdade
Soma de quadrados Variância
Percentagem de variação
Entre grupos 1 226,9 5,6 20,6
Entre populações dentro dos grupos
6 366,0 5,0 18,5
Dentro das populações
64 1054,0 16,5 60,8
Total 71 1648,9 27,1
FST 0,39 p < 0.001
Figura 2. Estrutura genética de 8 populações de Juniperus brevifolia das ilhas Terceira e Pico. Dendrograma baseado na distância genética de Nei. Existe uma estrutura genética algo complexa ao nível da Ilha Terceira. Observa-se um certo agrupamento das populações de Mistérios Negros e Cão Morto, por um lado, e das populações de Sanguinhal, Mistérios e Serra de Santa Bárbara, por outro, ficando a população das Quatro Ribeiras algo isolada, e aparentemente mais próxima das populações do Pico.
Tabela 3. Análise da variância molecular - foram definidos dois grupos (6 populações da ilha Terceira e 2 populações da Ilha do Pico). Confirma-se que a percentagem de variabilidade genética dentro das populações (61%) é o factor responsável pela maior parte da variância encontrada.
Tabela 4. Distância genética
entre as amostras
analisadas. Todas as
distâncias são significativas
(* p<0,05). Foram
encontradas distâncias
genéticas consideráveis
entre as populações
amostradas, especialmente
entre populações de ilhas
diferentes.
Figura 1 – Géis obtidos utilizando primers do tipo RAPD e ISSR.
TMN
TCM
TS
TC
TS
TM
TQR
TQR
PM
PV
Local Abreviatura Código IndivíduosMistérios Negros TMN T01 1-10Serra de Santa Bárbara TC T02 11-20Cão Morto TCM T03 23-30Sanguinhal TS T04 31-40Quatro Ribeiras TQR T05 41-48Mistérios TM T06 54-60Viveiros PV P01 1-10Manhanha PM P02 11-20
Tabela 1. Populações amostradas nas ilhas Terceira (6) e Pico (2).
Agradecimentos: Ao Engº. Jorge Belerique pelo apoio prestado.
Financiado pela Direcção Regional dos Recursos Florestais - Açores
Helder FragaHelder Fraga
