Interação de Alquilfosfolipídios de atividade anti-neoplásica

com membranas modelos.

Resumo

Tem sido demonstrado recentemente na literatura que a interação de alquilfosfolipidios (ALPs)

com membranas pode levar à morte celular, e o mecanismo de ação difere de quimioterápicos

clássicos que atuam em DNA. Tem sido proposto que os domínios lipídicos podem estar

relacionados como porta de entrada dos ALPs favorecendo a internalização celular para posterior

inibição da síntese de fosfatidilcolina em diferentes níveis. Para entendermos melhor o

mecanismo de ação do alquilfosfolipídio 10-(octiloxi) decil-2-(trimetilamonia) etil fosfato

(ODPC), realizamos um primeiro trabalho focalizando a ação de ODPC em membranas modelo

constituídas por vesículas unilamelares gigantes, GUVs, compostas por DOPC:SM:Col na razão

molar 1:1:1 que apresentam coexistência de fases liquido ordenada Lo – liquido desordenada Ld

(conhecida como rafts lipidicos). Observações de microscopia de fluorescência e de contraste de

fase evidenciaram que ODPC promove a destestabilização da separação de fases favorecendo a

mistura homogênea de lipideos (trabalho recentemente publicado na BBActa: Biomembrane,

2013 doi: 10.1016/j.bbamem.2013.01.017). Entretanto, tal reorganização é termodinâmicamente

instável, provavelmente porque a composição lipídica estudada está próxima da fronteira de

coexistência de fase homogênea Lo e coexistência Lo-Ld. Visando melhor compreender o

mecanismo de ação dos APLs em função do parâmetro termodinâmico temperatura, da

composição lipídica e das propriedades biofísicas das membranas lipídicas como fluidez, no

presente projeto pretendemos investigar como as moléculas de ODPC alteram o diagrama de

fases ternário DOPC:SM:Chol, a temperatura ambiente e a 37°C, por microscopia óptica (MO)

de contraste de fase e fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Enquanto MO

é capaz de detectar dominios lipídicos maiores que 1 m, EPR é sensível a diferentes graus de

empacotamento da membrana evidenciando, assim, a formação de dominios na escala

nanométrica, associados a mudanças na fluidez da membrana. Neste caso, serão estudadas

vesículas unilamelares grandes (LUVs) com a mesma composição lipídica das GUVs, em ambas

temperaturas. Os resultados também serão complementados com a ação de outro ALP,

perifosine, o qual foi demonstrado ter um efeito citotóxico maior que o de ODPC.

Introdução

Alquilfosfolipídios (ALP) são moléculas estruturalmente relacionadas com um fosfolípido

de ocorrência natural, 2-lisofosfatidilcolina (lisolecitina, LPC), e apresentam efeitos promissores

citotóxicos em diferentes linhas de células neoplásicas. A ação de ALPs é preferencialmente via

a membrana celular [1]. Há um interesse crescente na sua atividade biológica, porque eles

induzem a apoptose em células tumorais e podem servir para complementar as quimioterapias

anticancerígenas já existentes [2]. Entre os ALPs mais conhecidos estão a edelfosina [3], a

miltefosina [4], e a perifosina [5].

Tem sido mostrado que os ALPs se acumulam em membranas celulares, resistem à lipase

celular, interferem com a base de lipídios de transdução de sinal bem como com a biossíntese de

fosfolipídios [6], o que leva à apoptose, inibe a neovascularização, evita a invasão e induz a

diferenciação das células tumorais [7]. Edelfosina pode exercer o seu efeito pró-apoptótico

através da ativação de Fas/CD95 [8] enquanto que a perifosina pode induzir a interrupção do

ciclo celular e levar à apoptose de linhas celulares de carcinoma humano através do bloqueio da

fosforilação de AKT [9]. Também tem sido proposto que edelfosina afeta a composição proteíca

de lipídios com domínios de leveduras [10] e células leucêmicas [8,11], em que a quantidade de

colesterol desempenha um papel importante. De maneira interessante, foi proposto que os

domínios lipídicos podem estar relacionados como porta de entrada dos ALPs favorecendo a

internalização celular para posterior inibição da síntese de fosfatidilcolina em diferentes graus, e

induzir apoptose em linfomas e células leucemicas [12,13].

É bem conhecido que os domínios lipídicos são enriquecidos em colesterol, esfingolipídios

e proteínas que participam em diversos processos celulares, tais como a transdução de sinal e de

tráfico lipídico [14]. Os domínios lipídicos apresentam uma coexistência de fases no plano da

membrana liquido-ordenada (Lo) e liquido-desordenada (Ld) da ordem de centenas de

nanômetros em células vivas [15]. Eles também podem ser observados como domínios

microscópicos em sistemas de membranas isoladas [16,17]. Certamente, moléculas que afetam a

separação de fases lipídica podem ter efeitos importantes nas respostas fisiológicas.

O alquilfosfolipídio 10-(octiloxi) decil-2-(trimetilamônio) etil fosfato, ODPC,

originalmente sintetizado por Agresta e col. [18], mostrou efeitos citotóxicos em algumas linhas

de células cancerígenas comparável com os outros ALPs, mas com menor atividade hemolítica e

citotoxicidade. Em particular, os grupos do prof. Pietro Ciancaglini (FFCLRP-USP) e do prof.

Lewis Joel Greene (FMRP-USP) observaram que ODPC (10 – 50 µM) induz a apoptose e inibe a

proliferação de células leucemicas, poupando as células hematopoiéticas e epiteliais normais

[19]. Além disso, uma perda precoce de Lat2, um adaptador protéico associado com os domínios

lipídicos na sua forma palmitoilada, se dá na fração das células leucêmicas que é rica em

domínios lipídicos dentro de 3 horas após o tratamento com 25 µM de ODPC [20].

Entretanto, o papel dos domínios lipídicos não é claro e bem compreendido. A fim de

melhor compreendermos o mecanismo de ação da molécula de ODPC via coexistência de fases

Ld-Lo, realizamos um primeiro estudo utilizando membranas modelo constituídas por vesículas

unilamelares gigantes, GUVs, aonde investigamos como a membrana lipídica responde à adição

de ODPC na solução externa às membranas. Verificamos que o principal efeito da molécula de

ODPC, em concentrações inferiores a CMC (200 M [19]), é promover o rompimento da

membrana ao longo de uma hora de observação em sistemas binários compostos de um lipídio

insaturado, DOPC, e colesterol (Col) ou DOPC e esfingomielina (SM), em menor ou maior grau,

dependendo da composição da membrana. Os resultados mostram que membranas compostas de

SM ficam mais protegidas que as formadas com colesterol. Por outro lado, ODPC não afeta a

integridade da membrana para GUVs compostas por uma mistura homogênea de

DOPC:Col:SM (1:1:1), mas é de fato capaz de perturbar os domínios lipídicos favorecendo, em

poucos minutos de contato, uma reorganização dos lipídios levando a um mistura homogênea.

Entretanto, após cerca de 20 minutos de interação da molécula de ODPC com a bicamada

lipídica os domínios voltam a aparecer sobre a superfície da membrana, seguido de um

rompimento da mesma com total destruição da membranam (Figura 1).

Figura 1 – a) imagem da vesícula composta de DOPC:SM:Chol (1:1:1) sem adição de ODPC, mostrando que há

domínios da membrana. b) 3 minutos após adição de 100 µM de ODPC, vesícula já sem separação de fase, Lo-Ld.

c) 30 minutos de interação a membrana volta a ter separação de fase, Lo-Ld. d) vesícula desestabiliza e estoura.

Além do mais, esse surpreendente efeito foi comparado com o promovido pela perifosina

na coexistência de fase Ld-Lo cujos resultados mostraram que a interação da perifosina com a

membrana é mais forte, pois é observada uma sutil reorganização dos lipídios entre 17 e

20 minutos de incubação da perifosina, seguido por uma diminuição da membrana e logo uma

ruptura. Isto é, não houve tempo suficiente para que tivesse uma reorganização dos lipídios para

haver uma separação de fase Ld-Lo como ocorreu com a molécula de ODPC. Esse trabalho foi

recentemente publicado na Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes (janeiro de 2013)

[21].

Notamos, entretanto, que a composição lipídica estudada está no limite do domínio de

coexistência de fases, como podemos observar no diagrama de fases da Figura 2 [22], à

temperatura ambiente no qual os experimentos foram realizados. Provavelmente, a inserção de

ODPC na membrana altera os limites de fases das misturas de DOPC, SM e Col, diminuindo a

temperatura de transição de fases [22]; os lipídios segregam subsequentemente para domínios

lipídicos, refletindo que a fase homogênea deve ser termodinamicamente instável. Assim, a fase

ternária pseudo-homogênea de ser muito próxima do limite de uma fase líquida para coexistência

de transição de fases liquida. A redistribuição de lipídios na membrana conduz à ruptura das

GUVs.

Portanto, a fase inicial de ruptura dos domínios lipídicos por duas moléculas, ODPC e

perifosina, e talvez outros ALPs, através da promoção da mistura de lipídios, pode ser

correlacionados com a sua toxicidade sobre as células neoplásicas, desde sua seletiva

(des)associação de proteínas essenciais dentro dos microdomínios lipídicos devem ser levados

em conta na membrana plasmática.

Esses efeitos de ruptura de membranas com domínios também tem sido recentemente

reportado para os derivados de colesterol [23] e da vitamina E [24]. Neste último caso,

Muddana e col. [24] mostraram por simulação de dinâmica molecular que vitamina E atua como

“linactante” particionando preferencialmente nos limites do domínio e diminuindo a tendência

para a formação de domínio. Por outro lado, Carrer e col. [23] mediu o coeficiente de difusão de

alguns derivados do colesterol por espectroscopia de correlação de fluorescência e demonstrou

que esses análogos de colesterol contribuem para um aumento dos coeficientes de difusão

favorecendo uma mistura de lipídios dentro da membrana.

Além disso, os experimentos realizados com monocamada lipídica de SM:Col contendo

domínios lipídicos semelhantes demonstraram que a edelfosina tem um efeito de fluidificação do

Figura 2 – Diagrama de fases de uma mistura ternária de lipídios, DOPC:PSM:Col. A região em que é observada

a transição da miscibilidade é identificada pelos círculos negros e a superfície colorida corresponde ao ajuste

extrapolado dos valores medidos da Tmix. Os círculos abertos indicam que somente uma fase líquida está presente

abaixo de 10°C. E os quadrados cinzas indicam que núcleos de domínios sólidos se formam a partir de uma fase

líquida uniforme quando a temperatura é abaixada. (extraído de Veatch e col. [22])

sistema misto [25]. Com base nessas constatações, pode-se pensar que a ODPC pode ter um

efeito similar sobre as bicamadas lipídicas, de tal forma que a molécula de ODPC pode promover

alterações na fluidez da membrana, como foi anteriormente revelado por DSC para a interação

de ODPC com membranas de DPPC [19].

Portanto, é de extrema importância a continuidade dos estudos de ALPS em membranas

modelo, visando compreender o mecanismo de ação destas moléculas em função de parâmetros

termodinâmicos e propriedades biofísicas das membranas lipídicas como fluidez. Neste contexto,

pretendemos no presente projeto investigar como as moléculas ODPC e perifosine agem em

membranas explorando outras composições lipídicas do diagrama de fases (Figura 2), a

temperatura ambiente e a 37°C, por video-microscopia de contraste de fase e fluorescência.

Além disso, em paralelo, investigaremos como os ALPs afetam o empacotamento de bicamadas

lipídicas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR). Neste caso, serão estudadas vesículas

unilamelares grandes (LUVs) com a mesma composição lipídica das GUVs, para inferirmos se e

como os ALPs alteram a fluidez da membrana.

No caso de membranas contendo domínios lipídicos, a técnica de EPR pode complementar

as informações obtidas por MO sobre a ação dos ALPs na membrana, uma vez que a técnica é

sensível a variações de fluidez e empacotamento [26]. Trabalhos de F. Goni e D. Marsh mostram

que é possível analisar diferentes espectros de EPR em função de composição lipidica e

formação de domínios da ordem de 1 a 2 nm [26,27,28].

Objetivos:

Geral:

Investigar a ação de ALPs, em particular ODPC e perifosine, em membranas modelo de

diferentes composições lipídicas, visando entender como a presença de fases Ld-Lo (domínios

lipídicos), ou o dominio de fases ordenadas, influencia no mecanismo de ação destas moléculas.

Especifico:

Explorar o diagrama de fases (Fig. 2) variando temperatura e composição das

GUVs utilizando a técnica de microscopia ótica (MO) de contraste de fase e

fluorescência.

Investigar a localização dos ALPs em GUVs cuja composição lipídica formam

regiões de coexistência de fases Lo-Ld, por MO, buscando observar se os ALPs se

localizam nas fases Lo ou Ld, são homogêneamente distribuídos, ou se localizam

nas fronteiras de separação de fases atuando nos defeitos hidrofóbicos.

Investigar a variação no grau de empacotamento das bicamadas lipídicas, utilizando

a técnica de ressonância paramagnética eletrônica, EPR.

Comparar, e complementar, os resultados obtidos com GUVs por MO com os de

LUVs por EPR.

Materiais e Métodos

Materiais

Serão utilizados os fosfolipídios 1.2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC),

esfingomielina de cérebro (SM), colesterol (Col) e a sonda fluorescente Rodamina-DOPE [1,2-

dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina-N-(lissamine rodamina B sulfonil)] todos obtidos da

Avanti Polar Lipids. Glicose, sacarose e os marcadores de spin: metil éstaer ácido esteárico 5-

doxil (5-MESL), metil éster ácido esteárico 12-doxil (12-MESL) e metil éster ácido esteárico 16-

doxil (16-MESL) adquiridos da Sigma-Aldrich. 1-palmitoil-2-estearoil-(5-doxil)-sn-glicero-3-

fosfocolina (5-PCSL), 1-palmitoil-2-estearoil-(12-doxil)-sn-glicero-3-fosfocolina (12-PCSL) e 1-

palmitoil-2-estearoil-(16-doxil)-sn-glicero-3-fosfocolina (16-PCSL) adquiridos pela Avanti Polar

Lipids.

As moléculas ODPC e perifosina serão sintetizadas e fornecidas pelo grupo do Prof. Dr.

Greene.

Equipamentos

Na preparação das vesículas gigantes serão utilizados um gerador de função Minipa MFG-

4201A, um multímetro digital DT-830B e um osmômetro Gonotec Osmomat 030.

Para a obtenção das imagens das vesículas gigantes vamos usar o microscópio invertido

(Zeiss, Axio Observer D1, Germany) equipado com as objetivas Plan Neo-Fluar 63x Ph2

(NA 0.75) e A-plan 10x Ph1 (NA 0.25) e uma com câmera AxioCam MRm acoplada. Além de

filtros com excitação em 538-563 nm e emissão em 570-5640 nm (Zeiss filter set 43 HE) e uma

lâmpada de mercúrio HXP-R 120W que serão usados para observar as vesículas marcadas com

Rodamina-DOPE.

Métodos

Preparação da membrana modelo

Vesículas Unilamelares Gigantes – GUVs

A formação de vesículas é realizada pelo método de eletroformação [29]. Para o

crescimento das vesículas, ~20 L da solução de lipídio será espalhada sobre duas lâminas de

vidro recobertas por uma liga de óxido de índio (III) e óxido de estanho (IV) formando uma

superfície condutora (ITO). Um espaçador de teflon de 2 mm de espessura é colocado entre as

duas lâminas que são presas com duas presilhas formando uma câmara semifechada. A câmara é

preenchida por uma solução de sacarose 0,2 molL-1

. Então o gerador de função é conectado em

cada uma das lâminas e uma tensão de 2 V é aplicada com uma frequência de 10 Hz em corrente

alternada por 2 horas (Figura 3).

Figura 3 – Aparato para preparação das vesículas gigantes pelo método de eletroformação. Neste esquema são

mostradas as lâminas cobertas com ITO com o filme de lipídio formado em sua superfície e o espaçador de teflon

formando uma câmara, que é preenchida com a solução de sacarose 0,2 molL-1

. Também é mostrado o gerador de

função utilizado para aplicar uma tensão de 2 V e 10 Hz.

Depois desse período de espera tem-se uma solução contendo vesículas gigantes com

sacarose dentro e fora da vesícula. Essa solução é então diluída cerca de 10 vezes numa solução

de glicose de mesma concentração (0,2 molL-1

), compondo assim, uma solução de vesículas cujo

interior possui sacarose e na parte exterior existe glicose. Essa diferença nas soluções interna e

externa permite que haja um contraste, pois o índice de refração da sacarose é diferente do da

glicose, possibilitando a observação no microscópio óptico, além de fazer com que as vesículas

decantem na lamínula uma vez que a sacarose possui um maior peso molecular, facilitando a

observação. Vale ressaltar aqui que as soluções de glicose e sacarose possuem rigorosamente a

mesma osmolaridade para evitar problemas de tensão na membrana.

Vesículas Multilamelares – MLV.

Os fosfolipídios usados no preparo das vesículas serão dissolvidos em solvente orgânico,

normalmente o clorofórmio. Dessa solução, filmes lipídicos serão obtidos em tubos de ensaio

através da evaporação do clorofórmio sob fluxo de N2 e, em seguida deixados sob vácuo por pelo

menos 2 horas para que todo resíduo orgânico seja removido. A próxima etapa é suspender os

filmes em solução aquosa levando a obtenção de vesículas multilamelares (MLV). Pode ser que

seja necessário colocar em banho de ultrassom por 5 minutos para que todo o filme solte da

parede do tubo de ensaio. Para que as membranas se tornem Unilamelares e de tamanho

definido, com certa dispersão, a solução deve ser extrusada. Para isso, a solução é colocada em

uma seringa e forçada a atravessar uma membrana de policarbonato que tem a função de filtro

com diâmetro de poro de 100 nm. Após 30 ciclos, obtém-se uma solução de LUVs, vesículas

unilamelares grandes.

Para a incorporação dos marcadores de spin, volumes apropriados das soluções

clorofórmicas destes serão misturados às soluções orgânicas dos lipídios durante a preparação do

filme.

Ressonância Paramagnética Eletrônica

Para investigar com mais detalhes o efeito das moléculas de alquilfosfolipidios na fluidez

da membrana iremos utilizar a técnica de ressonância paramagnética eletrônica (EPR), em

colaboração com a Profa Dr

a Shirley Schreier (IQUSP). Para isso usaremos um espectrômetro da

Bruker EMX-200 SRC operando em 9 GHz.

A análise do espectro de EPR do marcador de spin fornece informações de caráter

estrutural e dinâmico da região onde se encontra o marcador (30). Uma das características

principais dos espectros de EPR é que, em muitos casos, a posição das linhas no campo

magnético (fator g) e os valores de desdobramento hiperfino (A) dependem da direção do campo

magnético em relação aos eixos moleculares (anisotropia, [30]). A dependência dos espectros da

orientação em relação ao campo magnético é de grande utilidade no estudo de membranas,

permitindo o cálculo do parâmetro de ordem, S, que é uma medida da amplitude de movimento

do eixo longo molecular de lipídios em uma bicamada ou outras membranas modelo (31). Um

aumento em S implica em maior espessura da bicamada e diminuição na flexibilidade da cadeia

acil (isto é, aumento da ordem) devido à redução da isomerização trans-gauche. O parâmetro de

ordem é calculado utilizando a seguinte equação:

2/

//

YYXXZZ AAA

AAS

onde Azz, Axx e Ayy são os valores dos componentes principais do tensor de desdobramento

hiperfino, os quais são obtidos para o marcador de spin introduzido como impureza sustitucional

em um monocristal diamagnético e podem ser encontrados em tabelas [32] e //A e A são os

valores de extremos externos e internos, respectivamente, os quais pode ser obtidos para

marcadores com movimento axial limitado (por exemplo, marcadores incorporados em

bicamadas) (Fig. 4, extraído de Schreier e col. [33]).

A distribuição da nuvem eletrônica ao redor do núcleo de nitrogênio é alterada pela

polaridade do meio em que se encontra o radical nitróxido, a qual afeta os tensores g

e A

. São

duas as configurações eletrônicas possíveis para o grupo nitróxido, conforme se vê abaixo (34).

Em geral, quando o marcador de spin encontra-se em solventes polares, como a água, o

elétron desemparelhado está mais densamente localizado sobre o átomo de nitrogênio

(configuração 2), consequentemente o espectro de EPR apresentará um desdobramento hiperfino

maior. Assim, as medidas do desdobramento hiperfino isotrópico, ao (e do valor médio do

tensor-g, go) são sensíveis à polaridade do ambiente. Em sistemas isotrópicos nos quais o

marcador tomba rapidamente na escala de tempo do EPR a distância medida entre os picos é o

próprio ao. No caso de sistemas que apresentam simetria axial (por exemplo, marcador

Figura 4 – Espectro de EPR do marcador de spin 5-SASL incorporado em vesículas multilamemar de

fosfolipídio (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina). Mostra como é medido os valores //A e A para o

cálculo do parâmetro de ordem, S [33].

incorporado em bicamadas) o desdobramento hiperfino é obitido indiretamente pelos valores de

A// e A.

)2(3

1//0 AAaeff

No caso de composições lipídicas que apresentam separação de fases Lo-Ld, trabalho

recente do grupo do Prof. D. Marsh do Instituto Max-Planch de Biofísica Química em Göttingen,

Alemanha, mostra que é possível observar 3 componnetes espectrais. Uma das componentes é

bem imobilizada com separação hiperfina exterior de 2 mT, isto é, , o que é

atribuido à fase Lβ (fase gel), o que caracteriza um regime de movimento rápido, que surge a

partir das fases Ld e Lo. A componente Lβ é identificada na região de campo baixo como um

“ombro” ou um alargamento da linha de campo baixo. Na região de campo alto, a componente

Lβ aparece como um aumento da amplitude de campo na posição correspondente à linha

hiperfina, . Normalmente, as componentes Ld e Lo não são totalmente resolvidos, mas

podem ser identificadas pelas formas das linhas nas regiões de baixo e de alto campo que surgem

a partir da sobreposião de diferentes frações desses dois componentes do fluido [26].

Neste projeto, pretendemos seguir a metodologia de análise reportada na literatura (ref), e

investigar mais em detalhes as mudanças das propriedades biofísicas que ocorrem na membrana

pela ação de ALPs.

Este projeto será desenvolvido em colaboração com os grupos do Prof. Dr. Pietro

Ciancaglini e Lewis J. Greene que desenvolvem estudos in vivo; e Profa. Dra.Shirley Schreier

para medidas de EPR.

Cronograma: Plano de Trabalho

Atividades Bimestres

1 2 3 4 5 6

Explorar o diagrama de fase

variando composição das GUVs

e investigar a interação com a

molécula de ODPC utilizando a

técnica de microscopia ótica.

x x x

Explorar o diagrama de fase

variando composição das GUVs

e investigar a interação com a

Perifosina utilizando a técnica de

microscopia ótica.

x x x x

Variar temperatura das GUVs e

investigar a ação das moléculas

de ODPC e perifosina nas

membranas

x x x x x

Estudo das propriedades

conforrmacionais da molécula de

ODPC utilizando a técnica

espectroscópica, EPR.

x x x x

Estudo das propriedades

conforrmacionais da molécula de

perifosina utilizando a técnica

espectroscópica, EPR.

x x x x

Redação de artigos x x x x

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