INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular …

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular

Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados

por micobacteacuterias

Tamiris Lameira Bittencourt

Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes

RIO DE JANEIRO

2017

i






Dissertaccedilatildeo apresentada ao Instituto

Oswaldo Cruz como parte dos requisitos

para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em

Biologia Celular e Molecular


RIO DE JANEIRO

2017

ii

Elaborada pelo Sistema de Geraccedilatildeo Automaacutetica de Ficha Catalograacutefica da Biblioteca de ManguinhosICICT com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Bittencourt Tamiris Lameira

Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por

micobacteacuterias Tamiris Lameira Bittencourt Rio de Janeiro 2017

XV 81 f

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Instituto Oswaldo Cruz Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e

Molecular 2017

Orientador Milton Ozoacuterio Moraes

Bibliografia f 66-81

1 Autofagia 2 Mycobacterium leprae 3 Interferon tipo I I Tiacutetulo

iii







EXAMINADORES

Prof Dra Maria Cristina Vidal Pessolani ndash PRESIDENTE (IOCFIOCRUZ)

Prof Dr Luzia Maria de Oliveira Pinto (IOCFIOCRUZ)

Prof Dra Luciana Silva Rodrigues (LIPUERJ)

SUPLENTES

Prof Dr Flavio Alves Lara ndash REVISOR (IOCFIOCRUZ)

Prof Dr Leonardo Holanda Travassos Correcirca (IBCCFUFRJ)

Rio de Janeiro 06 de novembro de 2017

iv

ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo

e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada

por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo

v

Agradecimentos

Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas

Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os

momentos te amo

Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim

Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade

Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha

formaccedilatildeo amo vocecircs

Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma

positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar

Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido

desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter

contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada

Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria

como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo

injusta

As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a

gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo

teria permanecido de peacute

A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela

confianccedila

Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha

segunda famiacutelia

Ao apoio financeiro do CNPq

vi



micobacteacuterias

RESUMO


Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o

Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos

microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo

sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da

sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I

favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por

ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da

via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve

polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que

nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta

microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium

smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel

pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da

viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi

bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula

hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de

genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de

LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de

soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes

associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos

a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes

relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes

para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade

intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem

mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo

de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos

diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na

infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado

diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na

modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo

fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada

pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I

vii


Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected

with mycobacteria

ABSTRACT


Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and

Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage

mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion

system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling

leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs

bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the

type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a

cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is

parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy

susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce

the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-

pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating

positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular

replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside

the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of

the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was

shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to

negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy

induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with

IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the

PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as

well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to

serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the

macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the

presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in

M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the

bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot

in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no

difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in

the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine

balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility

mediated by the activation of type I IFN

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

3-MA - 3-metiladenina

AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo

Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem

pode ser chamada de Proteiacutena cinase B

AMP - Monofosfato de adenosina

AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP

APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia

AU - Unidades arbitraacuterias

BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente

BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo

BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin

Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2

BECN1- Beclina-1

BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa

BSA - Albumina seacuterica bovina

BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide

CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo

cDNA - DNA complementar

CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa

CFU - Unidades formadoras decolocircnias

cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo

cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo

CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C

CO2 - Dioacutexido de carbono

CR - Receptores de complemento

CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo

CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1

DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol

DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de

ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas

DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo

ix

DTT - Ditiotreitol

EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico

ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico

ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2

ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico

ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa

ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6

FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc

FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK

g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional

GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase

GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina

IB - Iacutendice baciloscoacutepico

IFN - Interferon

IL - Interleucina

IRF - Fator regulador de IFN

IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade

kDa - Quilodaacutelton

LAM - Lipoarabinomanana

LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo

LAP - Fagocitose associada agrave LC3

LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3

LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade

LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3

LL - Forma lepromatosa

LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ

M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios

M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios

MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria

MB - Multibacilares

M leprae - Mycobacterium leprae

MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo

Ms - Mycobacterium smegmatis

Mtb - Mycobacterium tuberculosis

x

mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos

mTORC - Complexo mTOR

MΦs - Macroacutefagos

NI - Natildeo infectado

NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1

NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium

binding and coiled-coildomainrdquo

NF-κB - Fator nuclear κB

NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo

OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo

OPTN - Optineurina

oxLDL - LDL oxidadas

PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida

PB - Paucibacilares

PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena

PBS - Salina tampatildeo fosfato

PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase

PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1

PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase

PI3KC - Complexo PI3K de classe III

PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato

PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12

PQT - Poliquimioterapia

Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR

RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide

RNAm - RNA mensageiro

RP - Rapamicina

RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo

RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park

RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1

RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR

SFB - Soro fetal bovino

SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62

SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo

xi

SNC - Soro normal de cabra

SQSTM1p62 - Sequestosoma 1

SR - Receptores ldquoscavengerrdquo

STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo

TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo

TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK

Th - Ceacutelula T auxiliar

THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana

TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo

TNF - Fator de necrose tumoral

TT - Forma tuberculoacuteide

U - Unidade internacional

UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo

UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina

UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo

UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo

ULk - Famiacutelia similar a Unc-51

VDR - Receptor de vitamina D

VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de

2015 2

Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da

Hanseniacutease 4

Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M

leprae 7

Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na

hanseniacutease 10

Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por

uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12

Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do

hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e

autofagia 15

Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18

Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20

Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21

Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia

dependente de galectina-8 e ubiquitina 23

Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com

Ms41

Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42

Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos

THP1 43

Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e

OASL diminuiacuteda 44

Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos

THP145

Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46

Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes

tempos 47

Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados

com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49

xiii

Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo

de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51

Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos

THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53

Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54

Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55

Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia

de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56

Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M

leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse

mecanismo 57

Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M

smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64

xiv

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 1

11 Hanseniacutease 1

111 Epidemiologia 1

112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2

113 Mycobacterium leprae 6

114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8

115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11

116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13

12 Autofagia 17

121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17

122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22

123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros

patoacutegenos intracelulares 23

13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28

21 Objetivo geral 28

22 Objetivos especiacuteficos 28

3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29

31 Cultivo de micobacteacuterias 29

311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29

312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30

313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30

32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31

33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31

34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31

341 Extraccedilatildeo de RNA 32

342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32

343 Tratamento do RNA com DNAse 33

344 Extraccedilatildeo do DNA 33

35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34

351 Siacutentese de cDNA 34

352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34

xv

353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35

354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36

36 Imunofluorescecircncia 36

37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37

38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37

39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38

310 Anaacutelises estatiacutesticas 39

4 RESULTADOS 40

41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em

macroacutefagos THP-1 40

42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42

43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43

44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44

45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo

Mycobacterium leprae 46

46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo

I47

48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia

ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51

49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para

aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52

410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos

THP-1 independente da retirada de SFB 54

5 DISCUSSAtildeO 57

6 CONCLUSOtildeES 65

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia

A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium

leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos

(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes

da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo

tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo

via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar

incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por

isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que

contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do

tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que

penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de

controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo

social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave

porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais

pobres (Minuzzo 2008)

De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial

registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil

em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos

10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de

2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil

habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da

Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil

habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)

2

Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015

As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP

2016 acesso em 02 de Julho de 2017

Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil

e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia

baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para

reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761

casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente

americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados

(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de

novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)

112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo

A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou

seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de

sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo

importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos

nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo

do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com

posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como

3

articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de

ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas

vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem

lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)

O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando

disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos

suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico

soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o

antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-

PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a

baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o

desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados

na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e

sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras

cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do

M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso

diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o

elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006

Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)

A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos

bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas

identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas

intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se

enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de

hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como

uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas

cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)

No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia

ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo

bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos

caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do

poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular

vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas

ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)

4

Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline

borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de

acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores

(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de

definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos

de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados

De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e

BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como

multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com

uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido

oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela

presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)

Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo

tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas

epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma

resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline

apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo

com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que

satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a

reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso

Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de

Lockwood amp Saunderson 2012

5

A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de

inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados

estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em

todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer

espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute

considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)

As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que

ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters

1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do

tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e

LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das

lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios

reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas

de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)

O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como

dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de

novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da

poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos

mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da

reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR

justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel

dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)

O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute

diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem

maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como

eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos

Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com

noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)

Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o

observado na reaccedilatildeo reversa

O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O

tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma

combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo

supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com

6

duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma


supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de

clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma

dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)

Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto

pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou

pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides

113 O Mycobacterium leprae

O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o

qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos

oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um

bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de

largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional

pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo

de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in

vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al

2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da

pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)

Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero

Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos

complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-

negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos

ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan

e Nikaido 1995)

Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute

constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra

em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela

parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das

demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas

intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)

7

lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede

celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da

ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo

ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)

Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua

parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de

anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente

aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)

O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande

expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease

Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam

proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et

al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de

um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o

crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de

geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)

Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica

do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada

covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como

lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees

terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado

monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol

(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al

2006

8

Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos

(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus

novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma

disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos

medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo

os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados

(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a

multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T

representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos

grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)

114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro

Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por

projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de

complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et

al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a

interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular

micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do

tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo

de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de

CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse

receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com

pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)

Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa

interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees

moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso

et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar

respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi

demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes

hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem

disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula

como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro

9

simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira

(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e

ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a

eliminaccedilatildeo de patoacutegenos

Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela

ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute

responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente

ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e

3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu

et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de

CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et

al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β

eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da

ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)

O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos

pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente

confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)

estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo

derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo

(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o

fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi

associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de

mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de

NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o

processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)

Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico

caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas

multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com

atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees

de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo

fenotiacutepica no controle da doenccedila

Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar

altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-

1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13

10

aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2

associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis

consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas

ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da

imunidade celular

Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na

hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D

onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa

125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos

antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo

com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163

resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas

(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae

Fonte adaptado de Montoya et al 2009

Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um

papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos

lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da

resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute

modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o

aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-

metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al

2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno

aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de

LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela

11

captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na

ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de

colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae

uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente

descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae

em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc

infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)

115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo

Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem

mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula

hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de

interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um

nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e

colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o

citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes

micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos

genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana

citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M

tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al

2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se

fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar

para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel

et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato

verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico

Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela

atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente

em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M

marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel

fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao

disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute

discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos

infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em

12

actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-

6 (Gao et al 2006)

Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam

compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M

tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no

ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)

O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de

secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon

et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M

smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos

casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas

por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por

diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas

como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M

tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo

da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode

ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a

direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem

que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo

(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)

O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez

que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa

moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade

comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et

al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de

M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este

processo (Lerena e Colombo 2011)

13

Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por

uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo

patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado

micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando

a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007

116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares

A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus

efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na

contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo

viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)

Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de

IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em

resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram

infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas

na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral

Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear

as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras

podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo

IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et

al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute

para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--

) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via

eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra

14

infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--

satildeo altamente sensiacuteveis a

infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al

2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira

dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma

da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3

levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos

nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--

) satildeo extremamente resistentes agrave

infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)

A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como

TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA

(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador

chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado

que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA

micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP

(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo

de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda

nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem

leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)

15

Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do


autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA

micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um

potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula

hospedeira Modificado de Watson et al 2015

Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que

codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)

tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto

esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--

IFNAR1--

(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O

controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e

aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com

cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre

niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et

al 2007)

Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na

eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a

participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua

relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos

16

intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O

IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo

relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica

converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada

na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A

vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade

antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)

Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde

um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular

que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em

pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide

exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse

estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por

IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e

tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas

Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de

M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de

matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia

mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para

autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e

ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores

pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et

al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)

Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo

caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene

induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease

(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste

trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em

ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de

DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1

frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da

infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto

ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a

ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo

17

a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia

(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino

entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela

sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos

12 Autofagia

121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia

O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)

surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico

conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla

membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no

compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima

2009 Yang amp Klionsky 2010)

A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares

dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo

abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias

principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de

carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada

por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia

(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma

estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o

lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por

enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes

citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da

membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por

chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal

especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp

Mizushima 2014)

18

Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de

isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o

autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o

lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os

componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado

de Cheung 2009

A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e

maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente

descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp

Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que

regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de

mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e

um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o

complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo

serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da

autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-

Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda

sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute

inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica

resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)

A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica

eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria

19

(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a

proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um

complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo

momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser

degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes

No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por

sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-

Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No

segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem

a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de

cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao

lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-

Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do

citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de

isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do

autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)

Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos

citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento

ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave

membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo

dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os

componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp

Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e

pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo

autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L

(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece

associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a

fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana

do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)

20

Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt

regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt

tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo

mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em

resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e

fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase

de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial

para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do

autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram

beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento

do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o

segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013

A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de

mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al

2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que

refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de

autofagia

No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo

ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado

por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3

(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras

moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o

21

recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a

fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26

TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos

fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li

et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)

Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A

imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria

para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de

LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo

fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014

Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma

diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros

(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como

situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos

accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares

fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da

ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al

2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode

ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a

favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de

organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)

22

122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva

Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo

especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente

no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva

quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com

dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg

Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo

aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos

para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia

ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo

endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos

respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de

microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de

receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a

eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem

como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de

degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados

receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)

O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-

oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas

ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores

NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1

Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de

ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina

reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui

afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta

sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)

interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)

(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)

23

Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente

de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos

de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8

cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia

seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52

p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo

LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas

ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al

2014

Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para

interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor

possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi

demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face

citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao

motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana

(Thurston et al 2012)


patoacutegenos intracelulares

A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os

patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua

fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do

autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo

24

o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No

caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave

maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de

autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)

Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes

patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)

Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa

imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios

patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia

atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina

(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)

Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por

micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou

que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de

mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do

domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a

resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia

dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a

UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave

ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma

vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et

al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem

participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e

L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a

carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e

mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem

mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com

tuberculose pulmonar

De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos

genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora

de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do

hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo

citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir

autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata

25

eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012

Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no

processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et

al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M

tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a

qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING

levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira

(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)

A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-

II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al

2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1

governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com

Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa

antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M

tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)

Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o

que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp

Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos

contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta

no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)

Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em

lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a

persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno

do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo

aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de

Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo

da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos

corpuacutesculos lipiacutedicos

Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta

carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um

mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT

ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade

de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et

26

al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas

nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e

adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de

citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do

fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de

moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009

Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)

27

13 Justificativa

Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter

mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas

ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo

STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura

de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene

mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a

sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de

Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a

segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por

ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o

clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos

geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a

imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com

o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)

Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de

autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda

satildeo desconhecidos

Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I

reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos

infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o

envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias

de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico

28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral

Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo

de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias

22 Objetivos especiacuteficos

Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos

macroacutefagos infectados com M smegmatis

Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo

por M smegmatis

Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1

infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees

Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de

autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae

29

3 MATERIAL E MEacuteTODOS

31 Cultivo de micobacteacuterias

311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis

O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de

Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson

andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de

ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto

de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de

cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a

500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado

para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =

2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano

o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC

para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as

aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000

rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos

A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram

adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de

seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a

lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de

fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado

soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado

azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente

lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em

microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A

cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos

corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da

cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e

McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o

meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes

da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por

contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente

30

312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae

Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas

suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto

Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da

infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a

inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de

Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas

foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os

bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e

McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life

Technologies EUA) (Trombone et al 2014)

313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH

Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits

para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com

pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do

fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram

centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi

descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A

Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi

incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi

bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a

neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-

1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o

sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio

RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram

ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640

Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10

vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson

NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M

31

leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5

10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC

32 Cultura de ceacutelulas THP-1

Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo

(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura

(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio

RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM

penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da

Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel

Lab OR EUA)

Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de

Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul

Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de

acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo

em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram

lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os

antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-

Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae

33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia

A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos

THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences

NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009

Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro

fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC

(Klinkenberg et al 2012)

Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor

farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de

autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia

34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos

32

341 Extraccedilatildeo de RNA

Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram

cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas

culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol

(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes

raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em

seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os

mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso

os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o

RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de

isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no

miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para

posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de

GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e

entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados

e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000

x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos

secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL

de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)

342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA

O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-

1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de

agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)

A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois

comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto

A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram

consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram

valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do

RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)

dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de

RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram

33

utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul

de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e

aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco

por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo

MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta

(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi

considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e

18S) sem rastros

343 Tratamento do RNA com DNAse

Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi

submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade

(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo

com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de

RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido

por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01

volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave

temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante

esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a

10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente

transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item

anterior (412)

344 Extraccedilatildeo do DNA

A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA

para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi

adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio

A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na

configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram

incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura

ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL

contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e

34

armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL

de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e

entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes

foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por

centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os

sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15

min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola

35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica

351 Siacutentese de cDNA

O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados

em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript

VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente

500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix

da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC

durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para

transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a

incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C

352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)

Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR

utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do

fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL

de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada

oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada

amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a

ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne

Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10

minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a

desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da

fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma

nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto

35

correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias

alvo

Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5

MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via

autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de

referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista

completa de genes alvos estaacute disponibilizada em

httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC

por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10

segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do

primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System

(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A

curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1

min

353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis

Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em

tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas

modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas

com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito

em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os

genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela

detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez

et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em

volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01

μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C

por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1

min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg

Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos

infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis

e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10

suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado

atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)

36

354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real

A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT

(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os

valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT

do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi

escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de

ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT

(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica

relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT

Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o

meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT

referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo

experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi

selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de

expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT

36 Imunofluorescecircncia

Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas

celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning

EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos

ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com

PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min

a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-

100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB

10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as

ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3

(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as

ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo

realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente

fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124

Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo

de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em

37

temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as

lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)

e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados

consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo

primaacuterio

As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1

equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e

as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens

foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa

AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por

campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al

2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ

versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi

normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises

cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao

menos 10 campos randocircmicos

37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas

Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados

e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o

kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd

Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10

kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd

Gen cataacutelogo 887106-22) e para o

TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd

Gen cataacutelogo 887346-88) onde

os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)

(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada

condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina

calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53

38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT

A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado

para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as

ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h

seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e

38

5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan

resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume

igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida

atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a

um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos

em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle

39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting

Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na

presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em

tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH

68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de

azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min

As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE

Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida

composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em

tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das

proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan

Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25

mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-

Rad)

Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black

(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da

transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas

por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20

005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA

4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK

(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta

incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min

e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de

coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em

TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST

por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo

39

A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato

quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo

Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi

colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida

revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)

Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por

5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com

TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para

GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2

de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para

pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de

camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup

Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000

Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o

programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo

entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e

expressos em unidades arbitraacuterias

310 Anaacutelises estatiacutesticas

A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon

(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)

utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores

foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram

apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo

40

4 RESULTADOS


macroacutefagos THP-1

Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos

microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos

mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell

2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)

uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos

THP1

Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica

puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada

como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori

2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme

em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas

(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos

com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico

foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A

quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse

modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo

de autofagossomos durante a infecccedilatildeo

41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

LC

3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la

Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)

Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos

infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24

horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise

quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu

a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os

resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes

42

42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis

Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute

relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da

micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da

micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal

os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e

infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias

intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total

de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram

que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias

intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento

significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura

42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no

controle da viabilidade intracelular de Ms

MS

MS +

3M

A

00

05

10

15

20

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)

Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade

intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)

obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado

representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica

foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)

43

43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos

Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no

nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel

crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes

importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados

sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn

044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288

versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms

179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por

Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa

a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1

ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

1

2

3

4

5NI

MS

Exp

ressatildeo r

ela

tiva


THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M

smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de

qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia

bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-

ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio

padratildeo de 3 experimentos independentes

44

44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis

Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I

modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente

relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M

tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A

induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido

por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com

Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi

analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula

negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do

gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo

com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco

indutor da via de IFN tipo I

IF

NOASL

00

05

10

15

MS

NI

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL

diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos

genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas

Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes

45

Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por

Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do

RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao

IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso

macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou

ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante

durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo

mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na

persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura

442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias

mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms

Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute

suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria

00

05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)

Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1

Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ

recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes

24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes

e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo

muacuteltipla de Dunn ( plt005)

46


Mycobacterium leprae

Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae

induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os

mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo

decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a

autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados

sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070

plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em

relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn

014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus

NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na

expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram

um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia

em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro

ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As

ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51

bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada

47

para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados

representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes

46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I

Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de

autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia

pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar

se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso

dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar

significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura

461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes

tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa

MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB

Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

()

Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos

Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino

(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam

a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi

calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni

Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da

resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M

tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular

48

negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ

durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae

Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma

reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae

confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem

disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae

durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ

recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes

resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada

pela via do IFN tipo I

A B

Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o

M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-

PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de

IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia

utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo

infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da

expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo

NI

ML +

SFB

ML +

SFB

+ IN

F

ML -

SFB

ML -

SFB

+ IF

N

00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la

49

menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam

um experimento Barra de escala 10 μm

47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo

tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae

O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a

ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de

genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto

macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou

ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos

apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na

induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-

SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas

ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do

baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia

Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos

transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na

presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de

OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no

tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado

ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo

do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos

infectados pelo M leprae

50

A B

C D

Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de

macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)

de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M

leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no

tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos

independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo

teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)

0

5

10

15

20

ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

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atildeo r

ela

tiva

0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

- SFB

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o r

ela

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0

5

10

15

OASL mRNA

IFN

M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

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0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51


ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae

Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo

durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo

aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O

grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-

inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al

2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=

1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=

9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em

macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a

citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=

9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo

na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a

infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada

(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)

52

A B

C

Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-

1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF

e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou

ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3

experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis

seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)


aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae

Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute

essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no

modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene

0

1000

2000

3000

4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

mL

)

53

PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo

na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas

com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)

mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB

Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de

autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou

ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de

PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a

induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)

A B

Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores

normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro

fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante

24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M

leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados

representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada

por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)

Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas

condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa

a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de

parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para

aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto

PARK2 mRNA

0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54

nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade

do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB

Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da

viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada

pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB

seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4

experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA

Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)

410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em

macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB

Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz

de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes

autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase

parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com

M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western

blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees

observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB

comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa

proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos

diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com

M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo

0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

55

qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos

diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)

A B

Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia

de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram

diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o

SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo

de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O

resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado

Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de

induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo

(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso

macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido

ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a

MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila

de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito

eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo

Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de

subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN

NI

ML +

SFB

ML -

SFB

00

05

10

15

pP

AR

KIN

AG

AP

DH

(un

idad

e a

rbit

raacuteri

a )

56

Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M

leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da



seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico

101

501

0

2

4

6

8

10+ SFB

+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

57

5 DISCUSSAtildeO

Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo

bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia

bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem

como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp

Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho

buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na

regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias

Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de

macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no

nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo

do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como

xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a

inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da

contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW

2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis

semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)

Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na

infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo

proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da

colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al

2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B

hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)

Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por

Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B

LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em

alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o

aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida

com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados

gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms

funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1

O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente

possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas

58

hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias

induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma

dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo

STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de

promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)

Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias

natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu

em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz

de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir

que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos

o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a

autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero

de bacteacuterias

Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M

avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de

cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1

(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute

capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas

hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos

mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de

permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et

al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de

infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN

tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e

BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo

(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem

como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas

diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ

Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via

autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar

o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e

mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a

via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de

modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)

59

Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo

estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de

natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente

aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de

expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros

integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de

todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene

neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute

necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-

PE (fosfatidiletanolamina)

As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas

espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de

infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de

mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na

ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a

bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de

infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-

STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso

grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via

STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501

(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5

bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das

bacteacuterias fagocitadas

Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular

conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode

ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e

tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo

propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M

leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os

mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo

I

Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece

conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados

do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a

60

formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em

adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da

autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis

(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados

A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis

requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o

mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de

IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson

et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece

influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda

elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o

tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2

ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa

modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo

desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo

negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento

significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com

M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ


durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada

de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al

2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-

inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α

Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de

autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar

aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por

Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia

em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis

leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de

autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ

teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros

estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por

um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies

reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)

61

De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em

macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados

para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de

IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)

Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem

sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos

intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a

participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia

bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo

autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e

colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea

(BMDMs) de animais Smurf--

com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo

derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo

eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)

Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em

diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo

reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da

susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser

induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de

neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante

ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando

retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a

droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser

induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos

apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um

regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de

nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2

fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode

ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das

proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos

perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo

independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos

adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de

mTOR

62

Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na

presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos

transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a

autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo

embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina

Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo

mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito

utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo

similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012

Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia

induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da

micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do

inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em

consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem

como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de

infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio

para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por

ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade

autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo

pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees

artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese

decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de

101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na

viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por

privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em

quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando

a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este

efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo

No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na

atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M

leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila

na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento

do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de

ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta

63

significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o

niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo

Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na

viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia

induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms

prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que

o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ

recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem

um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M

leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e

susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da

via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para

estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease

51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere

na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a

sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento

exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua

persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado

especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular

o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)

favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de

infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos

mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com

implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou

estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease

64


smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do

macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da

ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-

ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave

via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma

demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo

de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular

positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3


65

6 CONCLUSOtildeES

A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos

macroacutefagos

M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que

pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica

M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na

multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente

regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta

No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento

com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene

que codifica para a ubiquitina-ligase parkina

O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a

sobrevivecircncia do M leprae

A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por

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Cytosolic Sensor cGAS Detects Mycobacterium tuberculosis DNA to Induce

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69

Zullo AJ Lee S Mycobacterial induction of autophagy varies by species and occurs

independently of mammalian target of rapamycin inhibition J Biol Chem 2012

Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome

AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)

AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1

APOL1 Apolipoprotein L 1

ATF4 Activating transcription factor 4

ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)

ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)

ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)


ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)

ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)




ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)

ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)




BARKOR BARKOR (KIAA0831)

BAX BCL2-associated X protein

BCL2 B-cell CLLlymphoma 2

BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1

BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1

BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3

DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3

DRAM Damage-regulated autophagy modulator

EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1

EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2

EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1

EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1

FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa

FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1

FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2


GABARAP GABA( A) receptor-associated protein

GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1

GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2

GBL G protein beta subunit-like

GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor

GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3

GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)


GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)

81

HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha

HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5

LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1



LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1


MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha

MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta

MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2

MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma

MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)

PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3

PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4

PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)

RAPTOR Raptor

RASD1 RAS dexamethasone-induced 1

RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1

RGS19 Regulator of G-protein signaling 19

RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor

SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)

SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)



SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)

SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)

SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)

SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)

SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1


SNX30 Sorting nexin family member 30

SQSTM1 Sequestosome 1

TP53 Tumor protein p53


TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)

ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)




UVRAG UV radiation resistance associated gene

WDR45L WDR45-like

WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1

WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2

Actb Actin beta

B2m Beta-2-microglobulin

Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

Gusb Glucuronidase beta

Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1

Ppia Peptidylprolyl isomerase A

Rpl13a Ribosomal protein L 13a

82

i






Dissertaccedilatildeo apresentada ao Instituto

Oswaldo Cruz como parte dos requisitos

para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em

Biologia Celular e Molecular


RIO DE JANEIRO

2017

ii





XV 81 f


Molecular 2017




iii







EXAMINADORES




SUPLENTES




iv




v

Agradecimentos



momentos te amo












injusta





confianccedila




vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

LC

3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la








42















MS

MS +

3M

A

00

05

10

15

20

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

1

2

3

4

5NI

MS

Exp

ressatildeo r

ela

tiva








44














IF

NOASL

00

05

10

15

MS

NI

Exp

ressatildeo r

ela

tiva





45














00

05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)







46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

ad

e c

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lar

()









48











A B








NI

ML +

SFB

ML +

SFB

+ IN

F

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SFB

ML -

SFB

+ IF

N

00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la

49























50

A B

C D








0

5

10

15

20

ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

Exp

ress

atildeo r

ela

tiva

0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

5

10

15

OASL mRNA

IFN

M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

- SFB

Expre

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o r

ela

tiva

0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

C












0

1000

2000

3000

4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

mL

)

53










A B













PARK2 mRNA

0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

55



A B

















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ML +

SFB

ML -

SFB

00

05

10

15

pP

AR

KIN

AG

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DH

(un

idad

e a

rbit

raacuteri

a )

56






101

501

0

2

4

6

8

10+ SFB

+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

ii





XV 81 f


Molecular 2017




iii







EXAMINADORES




SUPLENTES




iv




v

Agradecimentos



momentos te amo












injusta





confianccedila




vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

LC

3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la








42















MS

MS +

3M

A

00

05

10

15

20

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

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0

1

2

3

4

5NI

MS

Exp

ressatildeo r

ela

tiva








44














IF

NOASL

00

05

10

15

MS

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Exp

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ela

tiva





45














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05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

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UF

C

(aum

ento

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tivo

)







46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

ad

e c

elu

lar

()









48











A B








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ML +

SFB

ML +

SFB

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F

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SFB

ML -

SFB

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N

00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

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49























50

A B

C D








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5

10

15

20

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IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

Exp

ress

atildeo r

ela

tiva

0

2

4

6

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IFN

M leprae

-

- +

+- - +

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+ SFB

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ela

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0

5

10

15

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M leprae

-

-

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++

+ SFB

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Expre

ssatilde

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ela

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0

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8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

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Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

C












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1000

2000

3000

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IFN

M leprae

+ SFB

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+

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IL-1

(

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0

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M leprae

+ SFB

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0

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M leprae

+ SFB

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53










A B













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0

1

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M leprae

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SFB

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0

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57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

iii







EXAMINADORES




SUPLENTES




iv




v

Agradecimentos



momentos te amo












injusta





confianccedila




vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











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16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

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43












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45














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20

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ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

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ML

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47












MTT

6h 24h

48h

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A B

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57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

iv




v

Agradecimentos



momentos te amo












injusta





confianccedila




vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

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44














IF

NOASL

00

05

10

15

MS

NI

Exp

ressatildeo r

ela

tiva





45














00

05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)







46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

ad

e c

elu

lar

()









48











A B








NI

ML +

SFB

ML +

SFB

+ IN

F

ML -

SFB

ML -

SFB

+ IF

N

00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la

49























50

A B

C D








0

5

10

15

20

ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

Exp

ress

atildeo r

ela

tiva

0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

5

10

15

OASL mRNA

IFN

M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

C












0

1000

2000

3000

4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

mL

)

53










A B













PARK2 mRNA

0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

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eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

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55



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SFB

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SFB

00

05

10

15

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AR

KIN

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DH

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e a

rbit

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56






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0

2

4

6

8

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+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

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eM

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16S

RN

A

16S

DN

A

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han

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57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

v

Agradecimentos



momentos te amo












injusta





confianccedila




vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

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0

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2

3

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LC

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un

tifo

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la








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MS

MS +

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15

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UF

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)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

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MS

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ressatildeo r

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NOASL

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45














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05

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15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

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(aum

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46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

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ML

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ressatildeo r

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47












MTT

6h 24h

48h

72h

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50

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150Controle

Sem SFB


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bilid

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48











A B








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ML +

SFB

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C3 p

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49























50

A B

C D








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5

10

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ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

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+

+

+

+ SFB

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ela

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0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

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+ SFB

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ela

tiva

0

5

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15

OASL mRNA

IFN

M leprae

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Expre

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0

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LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

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ressatildeo r

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51

















52

A B

C












0

1000

2000

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4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

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-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

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)

0

100

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300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

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+ +

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+ +

+ +

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pg

mL

)

0

50

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IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

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- +

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IL-1

0 (

pg

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)

53










A B













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0

1

2

3

4

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IFN

M leprae

-

-

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+

+ +

+ +

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+ SFB

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Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

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ela

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54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

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iab

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eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

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han

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KIN

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2

4

6

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+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

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A

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57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

vi



micobacteacuterias

RESUMO


































vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

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A3M

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LC

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ATG

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47












MTT

6h 24h

48h

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Sem SFB


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A B








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SFB

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49























50

A B

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M leprae

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0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

5

10

15

OASL mRNA

IFN

M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

C












0

1000

2000

3000

4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

mL

)

53










A B













PARK2 mRNA

0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

55



A B

















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ML +

SFB

ML -

SFB

00

05

10

15

pP

AR

KIN

AG

AP

DH

(un

idad

e a

rbit

raacuteri

a )

56






101

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0

2

4

6

8

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+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

vii



with mycobacteria

ABSTRACT


































viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

LC

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un

tifo

rmec

eacutelu

la








42















MS

MS +

3M

A

00

05

10

15

20

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C

(aum

ento

rela

tivo

)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

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0

1

2

3

4

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MS

Exp

ressatildeo r

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tiva








44














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00

05

10

15

MS

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Exp

ressatildeo r

ela

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45














00

05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)







46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

ad

e c

elu

lar

()









48











A B








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ML +

SFB

ML +

SFB

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F

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SFB

ML -

SFB

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00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

rmec

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la

49























50

A B

C D








0

5

10

15

20

ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

Exp

ress

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ela

tiva

0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

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o r

ela

tiva

0

5

10

15

OASL mRNA

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M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

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Expre

ssatilde

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ela

tiva

0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

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1000

2000

3000

4000

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IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

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53










A B













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0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

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eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

55



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SFB

00

05

10

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AR

KIN

AG

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DH

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e a

rbit

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a )

56






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0

2

4

6

8

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+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

le

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57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

viii















BECN1- Beclina-1



















ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

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un

tifo

rmec

eacutelu

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05

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(aum

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)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

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LIN1

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LAM

P2

0

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MS

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IF

NOASL

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45














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05

10

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20

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M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

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46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

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6NI

ML

Exp

ressatildeo r

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tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

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48











A B








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SFB

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A B

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M leprae

-

-

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+

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+

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+

+

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+ SFB

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0

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M leprae

-

- +

+- - +

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0

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M leprae

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-

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0

2

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-

- +

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51

















52

A B

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1000

2000

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IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

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-

-

+

+

+

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Plt 006

IL-1

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0

100

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IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

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0

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IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

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- +

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+ + +

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pg

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53










A B













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0

1

2

3

4

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M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

55



A B

















NI

ML +

SFB

ML -

SFB

00

05

10

15

pP

AR

KIN

AG

AP

DH

(un

idad

e a

rbit

raacuteri

a )

56






101

501

0

2

4

6

8

10+ SFB

+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

ix

DTT - Ditiotreitol













IFN - Interferon

IL - Interleucina















MB - Multibacilares





x











OPTN - Optineurina



PB - Paucibacilares













RP - Rapamicina








xi




















xii

LISTA DE FIGURAS


2015 2


Hanseniacutease 4


leprae 7


hanseniacutease 10





autofagia 15







Ms41



THP1 43




THP145



tempos 47



xiii











mecanismo 57



xiv

SUMAacuteRIO



111 Epidemiologia 1






12 Autofagia 17





13 Justificativa 27

2 OBJETIVO 28


















xv








4 RESULTADOS 40









I47







5 DISCUSSAtildeO 57



1


11 Hanseniacutease

111 Epidemiologia
























2




















3



































4























5



































6

























e Nikaido 1995)







7
























2006

8

































9



































10





imunidade celular




















11

































12


6 (Gao et al 2006)


























13
























14





















15











IFNAR1--






al 2007)





16



































17





12 Autofagia






















Mizushima 2014)

18






de Cheung 2009

















19






























20

















autofagia






21






















22






























23









2014














24



































25


































26








27

13 Justificativa























28

2 OBJETIVO

21 Objetivo geral







por M smegmatis





29

































30






























31










Lab OR EUA)




















32
































33








18S) sem rastros













anterior (412)










34































35


alvo













min



















36
































37





primaacuterio






























38




















Rad)













39
























40

4 RESULTADOS








THP1












41

A

B

NI

MS

MS +

3M

A3M

A

0

1

2

3

4

5

LC

3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la








42















MS

MS +

3M

A

00

05

10

15

20

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)






43












ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

1

2

3

4

5NI

MS

Exp

ressatildeo r

ela

tiva








44














IF

NOASL

00

05

10

15

MS

NI

Exp

ressatildeo r

ela

tiva





45














00

05

10

15

20

IFN

M smegmatis

- - ++

+ SFB

- SFB

+ + + +

UF

C

(aum

ento

rela

tivo

)







46
















ATG

5

MAP1L

C3B

BEC

LIN1

PARK2

LAM

P2

0

2

4

6NI

ML

Exp

ressatildeo r

ela

tiva




47












MTT

6h 24h

48h

72h

0

50

100

150Controle

Sem SFB


Via

bilid

ad

e c

elu

lar

()









48











A B








NI

ML +

SFB

ML +

SFB

+ IN

F

ML -

SFB

ML -

SFB

+ IF

N

00

05

10

15L

C3 p

un

tifo

rmec

eacutelu

la

49























50

A B

C D








0

5

10

15

20

ATG5 mRNA

IFN

M leprae

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+ SFB

- SFB

Exp

ress

atildeo r

ela

tiva

0

2

4

6

MAP1LC3B mRNA

IFN

M leprae

-

- +

+- - +

+ + +

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

5

10

15

OASL mRNA

IFN

M leprae

-

-

- -

+

+

+

+

++

+ SFB

- SFB

Expre

ssatilde

o r

ela

tiva

0

2

4

6

8

LAMP2 mRNA

IFN

M leprae

-

- +

- -+ +

+ + +

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

51

















52

A B

C












0

1000

2000

3000

4000

5000

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+

+

+

-

+ +

+

Plt 006

IL-1

(

pg

mL

)

0

100

200

300

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

-

-

+ +

-

+ +

+ +

TN

F (

pg

mL

)

0

50

100

150

200

IFN

M leprae

+ SFB

- SFB

-

- +

- +

+ + +

- +

IL-1

0 (

pg

mL

)

53










A B













PARK2 mRNA

0

1

2

3

4

5

IFN

M leprae

-

-

-

+

+ +

+ +

-

+

+ SFB

- SFB

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

PARK2 mRNA

Contr

ole

Sem

SFB

Rap

amic

ina

0

2

4

6

8

Exp

ressatildeo r

ela

tiva

54






















0

2

4

6

8

-IFN -+ +

+ SFB

- SFBV

iab

ilid

ad

eM

le

pra

e

16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

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55



A B

















NI

ML +

SFB

ML -

SFB

00

05

10

15

pP

AR

KIN

AG

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DH

(un

idad

e a

rbit

raacuteri

a )

56






101

501

0

2

4

6

8

10+ SFB

+ SFB + IFN

- SFB

- SFB + IFN

Via

bilid

ad

eM

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pra

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16S

RN

A

16S

DN

A

(Fo

ld c

han

ge)

57

5 DISCUSSAtildeO

































58













de bacteacuterias






















59































I




60



































61



































mTOR

62



































63



























64











65

6 CONCLUSOtildeES


macroacutefagos












M leprae

66



2012 Mar 1310(1)7







Lett 2004 Sep 15238(2)429ndash37


















Signal 2012 Mar 65(214)9










2015 Jun86(2)142ndash55


19956429-63

67















368(7)651-62


Oct8(10)1045-7



Int 1988 dez 13(2) 42-6











Med 2009 Aug 3206(8)1709-16






Dec 28287(53)44184-91

68










Biol 2012 Jun44(6)942-54






1121(1)59-72





50 335-339






(12)652-8










70

69









Chem 2007 Dec 28282(52)37298-302











2012 Aug14(8)1287-98








1513(16)1745-54




20135(5)471-9







2012189794

70


2008 jul-set 44(3) 27-30






803







91




Sep39(3)693-702












Apr10(4)549ndash51


Cell 201040(2)280-93



May9(5)525-32




71












2011 Jan 20469(7330)323ndash35






Mar 24311(5768)1770ndash3













5287(41)34149-56









72




Jun 29129(7)1261-74



2013 Sep 26501(7468)512ndash6







Jun 1178(11)7190-8










2011 Oct 5(10) e1354







2010 Mar87(3)371ndash84










73


15191(4)1732-43









Feb 12427(6975)636ndash40


11147(4)728-41


200933571-84


Dec3(6)542ndash5








Med 2014 Aug 206(250)250ra114






12107(2)832ndash7



248105-37




2011 mar12(3)222ndash30

74















Out 1461(7264)654ndash8










31



Oct 1599(21)13861-6













75




Feb11(2)181ndash90



22204(1)25ndash31








Exp Med 2010 Feb 15207(2)327-37












2011









discussion S73-4




76






381












2913(3)255ndash63



Pathog 2017 Jan 13(1) e1006103




















77





2004 Aug 27279(35)36268-76













15214(2)311-20


Atheneu 2005 p 417-421





















78






1017(6)799ndash810




1017(6)811ndash9



17150(4)803ndash15






WHOCSDLEP864 1987 30-35



1108(9)3168-75



2220(53)7779-86


Sep12(9)814-22






2S431-5






79


69



Apr 13287(16)12668-78

80

8 ANEXO

Siacutembolo Nome






















BCL2L1 BCL2-like 1

BECLIN1 Beclin1

BECN1L1 Becn1L1






















81
















RAPTOR Raptor

























WDR45L WDR45-like



Actb Actin beta








82

INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular …

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