INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA …bdtd.inpa.gov.br/bitstream/tede/1534/2/Tese_ Jorge...

i

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E

BIOLOGIA EVOLUTIVA

Efeito da poluição do igarapé do Quarenta sobre a expressão gênica e da contaminação

por cobre sobre o comportamento e o desenvolvimento larvário, dos anuros Rhinella

granulosa e Scinax ruber

Jorge Felipe Oliveira Franco de Sá

Manaus, Amazonas

Janeiro, 2015

ii

JORGE FELIPE OLIVEIRA FRANCO DE SÁ

Efeito da poluição do igarapé do Quarenta sobre a expressão gênica e da contaminação

por cobre sobre o comportamento e o desenvolvimento larvário, dos anuros Rhinella

granulosa e Scinax ruber

Orientador: Adalberto Luis Val, Dr.

Tese apresentada ao Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

Doutor em Genética, Conservação e

Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas

Janeiro, 2015

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

S111 Franco de Sá, Jorge Felipe Oliveira

Efeito da poluição do igarapé do Quarenta sobre a expressão

gênica e da contaminação por cobre sobre o comportamento e o

desenvolvimento larvário, dos anuros Rhinella granulosa e Scinax

ruber / Jorge Felipe Oliveira Franco de Sá. --- Manaus: [s.n.], 2015.

91 p. : il. color.

Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2015.

Orientadores: Adalberto Luis Val.

Área de concentração : Genética.

1. Anfíbios. 2. Expressão gênica. I. Título.

CDD 597.8

Sinopse:

O descarte sem controle de poluentes nos corpos d’água tem

causado o declínio das populações de anfíbios no mundo todo. Neste

trabalho utilizamos análises ecotoxicológicas e de expressão gênica para

compreender os danos causados pelos poluentes dos igarapés de Manaus

em duas espécies de anuros, facilmente encontradas em ambientes

urbanos, Scinax ruber e Rhinella granulosa.

Palavras-chave: Anfíbios, CL50-96h, cobre, BLM, Expressão gênica.

iv

Dedico essa tese aos meus pais Jorge

Franco de Sá e Mônica O. Franco de Sá, a

minha irmã Rafaela O. Franco de Sá e a

minha noiva Fernanda Lima de Oliveira.

v

Agradecimento Institucional

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônica (INPA), pelo apoio institucional;

Agradeço ao programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva, do INPA;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

(Processo 573976/2008-2) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas

(FAPEAM) (processo 3159/2008) pelo financiamento do projeto através INCT ADAPTA;

A FAPEAM pela concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho;

Ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) por toda a estrutura

física e suporte;

Ao Laboratório Temático de Águas do INPA, pelo apoio nas análises químicas.

vi

Agradecimentos

Ao meu orientador, Dr. Adalberto Luis Val, pelos ensinamentos, sugestões e críticas

que ajudaram em meu crescimento profissional.

A Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val, pelo apoio ao longo do trabalho.

A minha futura esposa, Fernanda Lima de Oliveira, pelo apoio que tem me dado desde

o mestrado, e por todos os sábados e domingos que ficou comigo no laboratório me ajudando

na revisão dos experimentos.

Aos meus pais Jorge Franco de Sá e Mônica O. Franco de Sá que tem me apoiado na

carreira científica desde criança, quando assistia TV cultura e Discovery Channel e

conversávamos sobre vida extraterrestre e sobre as novas descobertas da ciência.

A Dra. Eliana Feldberg, não apenas como coordenadora do programa de pós-

graduação, mas como uma amiga que tem me ajudado nos últimos 10 anos, nunca me

deixando desistir ou desanimar.

Aos meus amigos Daniel Fagundes e Renato Lemgruber pela ajuda na bancada e no

sequenciamento das amostras no SOLID.

Ao Dr. Rafael Duarte pela ajuda com as análises físico-químicas e ecotoxiológicas.

A Dra. Andrea Ghelfi pela ajuda com as análises de bioinformática.

A Maria de Nazaré Paula da Silva, Claudia Oliveira e Raimunda Brandão, pela

amizade, conselhos e pelo apoio.

Aos meus colegas de sala, Daiani Kochhann, Ramon Baptista, Marcos Prado e Helen

Sadauskas, que sempre me ajudaram quando precisei.

A todos os amigos do LEEM pela contribuição nesse trabalho. Durante esses quatro

anos tantos chegaram, e tantos saíram que seria impossível enumerar todos que merecem

meus agradecimentos.

vii

Resumo

Nos últimos anos foram registrados extinções e declínios de populações de anuros,

relacionados à poluição do ambiente, às mudanças no uso da terra e ao surgimento de

doenças. A cidade de Manaus é cortada por uma série de igarapés com características de água

preta; porém, nas últimas décadas, eles têm sido utilizados pela população e pelas indústrias

como um sistema de esgoto, alterando desse modo a composição química anteriormente

encontrada. Nosso objetivo foi avaliar a influência da poluição do igarapé do Quarenta no

comportamento e no desenvolvimento larvário de duas espécies de anuros, Rhinella

granulosa e Scinax ruber. Avaliamos os efeitos dos poluentes encontrados nesses igarapés

desde o estágio de ovo até o estágio adulto. Nas fases larvais observamos, em experimentos

laboratoriais, os efeitos de um único poluente encontrado em muitos igarapés da cidade

(Cobre) e sua ação de forma aguda (teste de CL50) e crônica no comportamento e

desenvolvimento larval. Para os adultos de Scinax ruber utilizamos a expressão gênica em

hepatócitos como ferramenta de análise fisiológica, de modo a compreender os efeitos

negativos da longa exposição aos poluentes encontrados nas margens de um igarapé

contaminado da cidade (Igarapé do Quarenta). A CL50 -96h dos girinos de Rhinella granulosa,

dos girinos de Scinax ruber e dos ovos de Scinax ruber em águas pretas da Amazônia

contaminadas com cobre foram 23,48±1,8; 36,37±5,1 e 50,02±3,6 µg/L, respectivamente. O

modelo do ligante biótico (BLM) foi usado para prever os valores de CL50 para essas duas

espécies e pode ser considerado uma ferramenta promissora para essas espécies tropicais e

para essas condições de água. Os estadios 19-21 de Gosner (relacionados ao aparecimento das

brânquias externas) são os mais vulneráveis e o estágio de ovo é o mais resistente em relação

à poluição por cobre. A concentração subletal de 30 µg/L de cobre (82,5% da CL50-96h) não

teve efeito sobre o comprimento, duração do período larvário, taxa de crescimento e massa

viii

corporal nos girinos de Scinax ruber, mesmo quando expostos por longos períodos de tempo.

A exposição prolongada aos contaminantes encontrados nas margens do igarapé do Quarenta

induziram, no fígado dos machos adultos de Scinax ruber, um aumento na expressão dos

genes envolvidos nos processos de oxirredução e um aumento de 197,7 vezes na expressão do

gene ERGIC3, de 54,7 vezes na expressão do gene IGF1R, e de 60,7 vezes na expressão do

gene PDCD6IP em relação ao controle. Esses genes estão relacionados ao crescimento,

viabilidade, migração, formação de colônias e capacidade de invasão das células tumorais.

Também foi observado um aumento de 54,7 vezes na expressão do gene FANCM no

tratamento em relação ao controle. Esse gene codifica a proteína FANCM, uma proteína

essencial no sistema de reparo de danos no DNA. Os poluentes encontrados nos igarapés do

Quarenta podem provocar sérios danos a saúde dos animais que habitam essas áreas, levando-

os à morte precoce e desse modo reduzindo o tamanho das populações locais. Nem mesmo os

animais que conseguem sobreviver até a fase adulta estão livres dos desafios e danos

biológicos causados por seus ambientes.

PALAVRAS-CHAVE: Anfíbios, CL50-96h, cobre, BLM, expressão gênica.

ix

Abstract

Populations of anurans have declined and extinctions have been recorded over the last

years, most of them related to environmental pollution, changes of land use and emerging

diseases. Streams with black water characteristics cross the city of Manaus; however, in

recent decades, the population and industries have used them as a sewer system, thereby

altering their original chemical composition. The main goal of this study was to evaluate the

effect of the pollution occurring in these streams on the anuran of the Amazon, Rhinella

granulosa and Scinax ruber. We evaluated the effects of pollutants found in these streams on

the evolution of egg to adult stage. We analyzed, under laboratory conditions, the effects of

copper, a pollutant found in many streams, on larvae behavior and development of these

species, using acute (LC50 test) and chronic tests. For Scinax ruber adults we used the gene

expression of the hepatocytes as a tool for physiological analysis, in order to understand the

negative effects of a long exposure to pollutants found on the banks of a contaminated city

stream (Igarapé do Quarenta). LC50 at 96 h of Rhinella granulosa Gosner 25, Scinax ruber

Gosner 25 and Scinax ruber eggs in black water of the Amazon contaminated with copper

were 23.48±1.8, 36.37±5.1 and 50.02±3.6 µg/L, respectively. The Biotic Ligand Model

(BLM) was used to predict the LC50 values that, based on the results, can be considered a

promising tool for these tropical species and water conditions. The Gosner stage 19-21

(related to the appearance of external gills) is the most vulnerable stage and the egg stage is

the most resistant, in relation to copper pollution. The sublethal concentration of 30 µg/L of

copper (82.5% of LC50 – 96h) had no effect on length, duration of the larvae period, growth

rate and body weight of Scinax ruber tadpoles, even when they were exposed for long period

of time. Long lasting exposure to contaminants found on the banks of the Igarapé do Quarenta

induced, in the liver of Scinax ruber adult males, an increase in the expression of genes

x

involved in oxidation-reduction processes and an increase of 197.7 times in the expression of

ERGIC3 gene, 54.7 times the IGF1R gene, and 60.7 times the PDCD6IP in relation to

control. These genes are related to growth, viability, migration, colony formation and

invasiveness of tumor cells. There was also an increase of 54.7 times in the expression of

FANCM gene relative to control. This gene codifies the FANCM protein, involved in DNA

damage repair system. The pollutants found in the city creeks can cause serious damage

animals health that inhabit these areas, leading them to an early death and thereby reducing

the size of local populations. Even the animals that survived to adulthood have to deal with

constraints and biological damage caused by their environment.

KEYWORDS: Amphibian, LC50-96h, copper, BLM, gene expression.

xi

Sumário

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 1

1.1. O ambiente urbano – desafios biológicos ............................................................................... 1

1.2. Bacia do Educandos ................................................................................................................. 3

1.3. Os anuros: sensibilidade aos desafios ambientais .................................................................. 4

1.4. Expressão gênica ..................................................................................................................... 5

1.5. Espécies teste .......................................................................................................................... 7

1.5.1. Scinax ruber ..................................................................................................................... 8

1.5.2. Rhinella granulosa ................................................................................................................. 9

2. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................... 11

2.1. Objetivos específicos .................................................................................................................. 11

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................................... 12

3.1. Capítulo 1 ................................................................................................................................... 13

Toxicidade do cobre em Scinax ruber e Rhinella granulosa (Amphibia: Anura): Potencial do Modelo

do Ligante Biótico para predizer a toxicidade em igarapés urbanos. Aceito para publicação no

periódico Acta Amazonica em: 15/05/2014 (ID AA-2014-0038) (artigo original em anexo). ........... 13

3.1.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 13

3.1.2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 15

3.1.3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 19

3.1.4. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 23

3.2. Capítulo 2 ................................................................................................................................... 27

Efeito crônico do cobre sobre o comportamento e desenvolvimento larvário de girinos de Scinax

ruber .................................................................................................................................................. 27

3.2.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 27


3.2.3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 35

3.2.4. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 38

3.3. Capítulo 3 ................................................................................................................................... 42

Identificação dos genes expressos no fígado de machos adultos de Scinax ruber (Anura Hylidae),

expostos à água do igarapé do Quarenta ......................................................................................... 42

3.3.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 42


3.3.3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 54

3.3.4. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 61

xii

4. CONCLUSÕES GERAIS .................................................................................................................... 68

5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 69

6. ANEXOS ......................................................................................................................................... 85

6.1. Artigo Aceito para publicação no periódico Acta Amazonica em: 15/05/2014 ......................... 85

xiii

Lista de figuras

Figura 1. Poluição no Igarapé do Quarenta, Manaus, Amazonas. ........................................................ 2

Figura 2. Girino no estadio 25 de Gosner (A) e adulto de Scinax ruber (B).......................................... 8

Figura 3. Desova (A) e adulto de Rhinella granulosa (B). .................................................................. 9

Capitulo 1

Figura 1.1. Classificação dos estadios de desenvolvimento dos ovos e larvas, segundo Gosner 1960.

............................................................................................................................................................... 17

Figura 1.2. Taxas de sobrevivência dos girinos em diferentes concentrações de cobre (15-94 µg/L)

diluído na água do igarapé do Barro Branco (média ± erro padrão da média). (A) 24 horas, (B) 48

horas, (C) 72 horas e (D) 96 horas de exposição. * P<0,05. ................................................................. 20

Figura 1.3. CL50 predita pelo BLM versus a CL50 observada para () ovos de Scinax ruber , ()

girinos de Rhinella granulosa e () girinos de Scinax ruber. A linha diagonal sólida corresponde a

relação de 1:1 entre o modelo e os dados. ............................................................................................. 21

Capitulo 2

Figura 2.1. Sistema de troca contínua de água e recipientes com fundo telado, utilizados durante a

exposição crônica dos girinos de Scinax ruber ao cobre. ...................................................................... 32

Figura 2.2. Girino de Scinax ruber no estadio 42 de Gosner com barra de escala de 1 cm e numeração

representando a desova e o indivíduo. Método utilizado para medir o comprimento final e inicial dos

girinos. ................................................................................................................................................... 32

Figura 2.3. Relação da identidade da desova com o comprimento final (A), duração do período

larvário (B), taxa de crescimento (C), massa corporal (D) e comprimento inicial (E). ........................ 37

Capitulo 3

Figura 3.1. Área de coleta das amostras de água. 1- Igarapé do Quarenta. 2 a 5 – Poças próximas às

áreas onde os adultos de Scinax ruber foram coletados. Fonte: Google Maps. .................................... 45

Figura 3.2. Preparo das bibliotecas de RNA-Seq (SOLID). Fonte: protocolo Whole Transcriptome

Library Preparation: Low Input for SOLiD™ ...................................................................................... 49

Figura 3.3. Representação dos 10 principais termos do GO que resultaram dos genes com aumento da

expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria Processo Biológico, no tratamento

em relação ao controle........................................................................................................................... 58

Figura 3.4. Representação dos os 10 principais termos do GO que resultaram dos genes com aumento

da expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria Função Molecular, no

tratamento em relação ao controle. ....................................................................................................... 59

Figura 3.5. Representação dos 10 principais termos do GO que resultaram dos genes com aumento da

expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria Componente Celular, no

tratamento em relação ao controle. ....................................................................................................... 60

Figura 3.6. Modelo simplificado da regulação do ERGIC3 por miR-490-3p em células do

hepatocarcinoma humano (HCC). miR-490-3p regula positivamente a expressão de ERGIC3 e

xiv

estimula a proliferação celular; ERGIC3 promove o EMT, resultando na migração e invasão. Fonte:

Zhang et al. (2012) com modificações. ................................................................................................ 63

xv

Lista de tabelas

Capitulo 1

Tabela 1.1. Características físico-químicas e CL50 predita para o Igarapé do Bolívia (cidade de

Manaus, área urbana) e para o igarapé do Barro Branco (área natural). ............................................... 22

Capitulo 2

Tabela 2.1. Composição físico-química da água nos experimentos. Valores expressos como média ±

desvio padrão da média. ........................................................................................................................ 35

Capitulo 3

Tabela 3.1. Características fisico-químicas da água nos pontos de coleta. 1- Igarapé do Quarenta. 2 a

5 – Poças próximas às áreas onde os adultos de Scinax ruber foram coletados.................................... 56

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. O ambiente urbano – desafios biológicos

Durante a implantação da Zona Franca de Manaus ocorreu um rápido crescimento da

cidade, que não foi acompanhado de políticas públicas de controle ambiental. Áreas

anteriormente florestadas foram transformadas em bairros para acomodar a população e sem

um sistema de tratamento e coleta de esgoto adequado, os igarapés acabaram sendo usados

como esgoto a céu aberto (Velloso 2002).

Até 2004, apenas 11,6% da população de Manaus possuía coleta de esgoto, sendo que

apenas 2,9% da população possuía algum tipo de tratamento de esgoto. Manaus, Belém e Rio

Branco possuem os piores índices de tratamento de esgoto de todo o Brasil (Instituto

Socioambiental 2007). Em igarapés poluídos de Manaus são encontrados altos níveis de

nitrogênio na forma amoniacal, formados pela decomposição da matéria orgânica proveniente

de esgotos e excreção direta de animais e do homem (Figura 1) (Velloso 2002).

Nos igarapés que cortam a cidade são observados os efeitos decorrentes da poluição

por esgoto doméstico e industrial, como o aumento do pH da água, diminuição do oxigênio

dissolvido e altos teores de metais de transição (Zn, Co, Cu, Fe, Ni, Mn, Cr e Pb, entre outros)

( Melo et al. 2005; Santana e Barroncas 2007; Franco de Sá et al. 2012).

2

Figura 1. Poluição no Igarapé do Quarenta, Manaus, Amazonas.

3

1.2. Bacia do Educandos

A área urbana de Manaus abrange quatro bacias hidrográficas, todas contidas na

grande bacia do rio Negro. Duas bacias encontram-se integralmente dentro da cidade, a do

igarapé de São Raimundo e a do igarapé do Educandos e duas parcialmente inseridas na

malha urbana, a do igarapé do Tarumã-Açu e do Puraquequara (Velloso 2002).

A bacia do igarapé do Educandos é integrada pelo Igarapé do Quarenta, que é o

principal tributário da bacia e sua nascente está localizada no bairro Armando Mendes, na

zona leste da cidade, percorre áreas ocupadas como o Distrito Industrial da SUFRAMA e o

bairro do Japiim e recebe tanto esgoto doméstico quanto industrial; pelo Igarapé da

Cachoeirinha, que abrange os bairros Cachoeirinha, Petrópolis, Raiz e São Francisco,

atravessando vales que estão sujeitos a inundações, principalmente nos meses de janeiro a

junho; e pelo igarapé do Mestre Chico, localizado próximo à área central de Manaus, que

abrange parte do bairro da Cachoeirinha e cruza vias importantes de acesso ao centro da

cidade até desaguar no igarapé do Educandos, também estando sujeito a inundações (Velloso

2002).

No igarapé do Quarenta foram observados vários indicadores de poluição das águas

como o aumento do pH, alta condutividade, baixos teores de oxigênio dissolvido, altas

concentrações de cátions e ânions e altas concentrações de metais (Cu, Cr, Zn e Ni). Somente

na sua nascente esses valores estão em níveis considerados normais (Silva et al. 1999; Melo et

al. 2005). No Igarapé do Educandos foram encontrados metais (Fe, Ni, Mn, Cr, Pb e Cu) em

níveis acima dos recomendados pelo CONAMA e altos níveis de amônia total, decorrentes da

decomposição da matéria orgânica presente nas águas (Franco de Sá et al. 2012).

Mesmo com altos níveis de poluentes, algumas espécies, tanto vegetais quanto

animais, ainda conseguem sobreviver nessa bacia. O PROSAMIM (Programa Social e

4

Ambiental dos Igarapés de Manaus) encontrou 12 espécies de peixes ao longo da bacia do

Educandos, porém, em igarapés mais poluídos como o do Quarenta, foram encontradas

apenas espécies de peixes resistentes a ambientes poluídos como o tamoatá (Hoplosternum

littorale), a traíra (Hoplias malabaricus) e o acará-açu (Astronotus sp). Nesse igarapé também

foram encontradas espécies de peixes com altos teores de metais e com deformidades nas

nadadeiras (Prosamim 2004). Das 70 espécies de serpentes encontradas na região de Manaus,

apenas 27 foram encontradas na bacia (Prosamim 2004). Das 75 espécies de anfíbios da

região de Manaus, 32 foram registradas no igarapé do Quarenta, porém, a maioria das

espécies de anfíbios foi encontrada na área do campus da UFAM, uma área mais preservada

que o restante da bacia (Prosamim 2004).

1.3. Os anuros: sensibilidade aos desafios ambientais

Os anuros são especialmente suscetíveis aos poluentes encontrados nas áreas com

influência antrópica (metais potencialmente tóxicos, amônia, nitrato etc.), pois são

dependentes de condições ambientais específicas e, por possuírem pele permeável (Sparling et

al. 2000), há acúmulo nos seus tecidos de contaminantes químicos dissolvidos na água

(Degarady e Halbrook 2006).

No mundo existem 7259 espécies descritas de anfíbios anuros (Frost 2014); porém,

um terço das espécies de anfíbios do mundo estão ameaçadas de extinção (Amphibiaweb

2014). Consequentemente, há crescente interesse no estudo desses animais (La Marca et al.

2005). Entre as principais causas dessa ameaça estão a poluição de corpos d’água, a radiação

UV e as doenças (Amphibiaweb 2014).

Em relação aos igarapés que cortam a cidade de Manaus, já foram observados os

efeitos da poluição em girinos e ovos de Osteocephalus taurinus (Hylidae). Ao serem

expostos às águas contaminadas do igarapé do Educandos, esses animais apresentaram

5

aumento na taxa de mortalidade, aumento no tamanho corporal na metamorfose e o

aparecimento de edemas abdominais nos girinos, possivelmente causados pela presença de

nitrato na água (Franco de Sá et al. 2012).

Larvas de anfíbios anuros expostas a altos níveis de contaminantes como, por

exemplo, metais de transição, pesticidas, herbicidas e fertilizantes presentes na água, podem

apresentar malformações, diminuição do desempenho natatório (Burkhart et al. 1998;

Hopkins et al. 2000), diminuição no tamanho corporal na metamorfose, redução na taxa de

eclosão dos ovos (Karasov et al. 2005), aumento nas taxas metabólicas (Rowe et al. 1998) e

maior susceptibilidade à predação (Broomhall 2002), às doenças e às infecções (Johnson et al.

2002). Mudanças no pH da água podem diminuir a taxa de sobrevivência, o tamanho e o

tempo até a metamorfose de algumas espécies de anfíbios (Andrén et al. 1988; Warner et al.

1991; Rowe et al. 1992; Kutka 1994), afetando diretamente os parâmetros demográficos das

populações de anuros.

A intensificação da produção agrícola e industrial pode provocar o aumento de metais

potencialmente tóxicos e de outros poluentes nas águas e isso afeta as populações de anfíbios.

Esses efeitos podem ser letais ou induzir efeitos subletais como o retardo do crescimento e do

desenvolvimento e alterações comportamentais (Blausten et al. 2003). Rowe et al. (1998)

observaram que larvas de Rana catesbeiana expostas a áreas contaminadas com grande

quantidade de metais (Al, As, Ba, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Se e Zn) apresentavam

deformações na região oral e diminuição na sua taxa de sobrevivência em relação às larvas de

áreas não contaminadas.

1.4. Expressão gênica

Alguns trabalhos têm mostrado um aumento nas taxas metabólicas de larvas de

anuros expostas a áreas poluídas (Rowe et al. 1998; Ward et al. 2006). Rowe et al. (1998)

6

verificaram um aumento na taxa metabólica de girinos de Rana catesbeiana expostos a uma

região poluída com metais potencialmente tóxicos em comparação com áreas não poluídas.

Uma taxa metabólica maior pode indicar um custo fisiológico maior em animais expostos a

áreas poluídas pela formação de proteínas de estresse, eliminação das toxinas do corpo ou

pelo sistema de reparo celular (Rowe et al. 1998). Se novos metabólitos (proteínas,

hormônios, enzimas) estão sendo produzidos em animais expostos a poluentes, ou se está

ocorrendo uma maior produção de determinados metabólitos, isso pode ser verificado por

meio da expressão gênica, que pode ser estudada a partir dos RNAm que estão sendo

transcritos no momento da exposição.

Uma forma de se estudar os genes que estão sendo expressos nos tecidos de um

organismo seria por meio da construção de bibliotecas de cDNA, que são coleções de

fragmentos de cDNA (DNA complementar a um RNAm), representando as sequências

expressas em um determinado tecido ou órgão, sob influência de uma determinada condição

do ambiente, num determinado momento. Ao contrário de uma biblioteca genômica, que

contém em princípio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de

cDNA contém os genes expressos no tempo e local específicos. As moléculas de RNAm

(altamente instáveis) são convertidas a cDNA para a sua clonagem e armazenamento (Malone

et al. 2006).

Girinos de Xenopus laevis (Amphibia, Anura) expostos de forma crônica a uma

concentração do pesticida atrazine apresentaram alteração na expressão de 44 genes em

machos e de 77 genes em fêmeas, que na maioria das vezes estavam relacionados ao

crescimento e metabolismo, proteólise, formação do complexo fibrinogênio e na regulação do

sistema imunológico (Langerveld et al. 2009). Em Xenopus laevis (Amphibia, Anura)

também foram observadas diferenças na expressão proteica em girinos expostos durante um

7

período de 2 a 5 dias a duas concentrações de bifenilas policloradas (PCBs), um composto

utilizado para uma série de fins industriais, como em isolantes elétricos e papéis carbono

(Gillardin et al. 2009).

Os metais de transição ao entrarem em contato com organismos vivos, estimulam a

expressão das metalotioneínas, que são proteínas pequenas, ricas em cisteína, que possuem

um papel importante em manter a homeostase intracelular do metal e na desintoxicação dos

metais de transição (Hamer 1986; Adams et al. 2002). Em anfíbios já foram realizados

estudos para entender melhor os mecanismos envolvidos na expressão dos genes relacionados

às metalotioneínas em girinos e adultos de Xenopus laevis (Amphibia, Anura) (Muller et al.

1993; Durliat et al. 1999) e Pleurodeles waltl (amphibia, Urodela) (Munaji et al. 2002).

1.5. Espécies teste

No presente trabalho utilizamos duas espécies de anuros encontradas facilmente na

região de Manaus (Scinax ruber e Rhinella granulosa). Essas espécies foram escolhidas por

serem muito comuns em áreas antropizadas e por possuírem desova composta de número

relativamente grande de ovos, já que os experimentos em laboratório necessitaram de grande

número de indivíduos.

8

1.5.1. Scinax ruber

Scinax ruber é uma espécie comum em áreas abertas, bordas e clareiras (Figura 2). É

uma espécie arborícola e noturna. Sua reprodução ocorre durante todo o ano, mas com maior

intensidade durante a estação chuvosa (novembro a maio) (Rodriguez e Duellman 1994; Lima

et al. 2006).

A desova é composta por aproximadamente 600 ovos, que ficam aderidos à vegetação

ou à margem de poças temporárias, onde os girinos se desenvolvem até completar a

metamorfose (Lima et al. 2006). A eclosão dos ovos ocorre entre 48 e 55 horas após terem

sido postos e os girinos podem alcançar até 25 mm de comprimento (Rodriguez e Duellman

1994). Exemplares dessa espécie podem ser encontrados na bacia Amazônica (Brasil, Peru,

Equador e Colômbia) e, também, na Guiana, Suriname e Guiana Francesa, leste do Panamá e

Trinidad e Tobago (Lima et al. 2006).

Figura 2. Girino no estadio 25 de Gosner (A) e adulto de Scinax ruber (B).

9

1.5.2. Rhinella granulosa

A espécie Rhinella granulosa ocorre principalmente em áreas impactadas, desde o

limite sul da Amazônia até o sul do Texas nos EUA (Figura 3). É terrestre e noturna (Lima et

al. 2006). Exemplares dessa espécie ocorrem em baixa densidade nas áreas florestadas,

porém, ocorrem em alta densidade populacional em clareiras e margens de rios que recebem

luz solar direta. A reprodução ocorre principalmente durante a estação chuvosa. A desova, de

aproximadamente 900 ovos, é depositada na superfície d’água como um cordão gelatinoso

(Figura 3A) (Lima et al. 2006). Os indivíduos de Rhinella granulosa alimentam-se de uma

grande variedade de insetos, principalmente de formiga, mas também de Coleopteras,

Ortopteras, Hemipteras e larvas de Lepidópteras (Santana e Juncá 2007).

Figura 3. Desova (A) e adulto de Rhinella granulosa (B).

Os resultados aqui apresentados representam a primeira tentativa de entender a

toxicidade do cobre para anuros amazônicos. Nossos resultados destacam as primeiras

evidências de que a exposição prolongada dos anfíbios aos poluentes da cidade de Manaus

pode estar causando danos em nível celular, incluindo a formação de tumores. Também

10

destacamos a primeira evidência de que modelo ligante biótico pode ser considerado uma

ferramenta promissora para a predição da toxicidade do cobre para efeitos de regulação nas

águas de igarapés urbanos na Amazônia.

11

2. OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência da poluição do igarapé do Quarenta na expressão gênica e

do cobre no comportamento e no desenvolvimento larvário de Rhinella granulosa e Scinax

ruber.

2.1. Objetivos específicos

1) Estimar a concentração letal média (CL50) de cobre para girinos e ovos de Rhinella

granulosa e Scinax ruber.

2) Verificar a eficácia do Modelo do Ligante Biótico (BLM) como ferramenta para

análise da toxicidade do cobre usando girinos e ovos de Scinax ruber e Rhinella granulosa em

igarapés amazônicos.

3) Estimar os efeitos crônicos da contaminação por cobre em girinos de Scinax ruber e

Rhinella granulosa, medindo as seguintes variáveis:

(a) Sobrevivência do estágio 25 de Gosner até a metamorfose;

(b) Tempo decorrido entre a data de desova e a data de metamorfose;

(c) Taxa de crescimento do estágio 25 de Gosner até a metamorfose;

(d) Tamanho na metamorfose;

(e) Massa corporal

4) Identificar quais genes estão sendo expressos no fígado de machos adultos de

Scinax ruber expostos à poluição do Igarapé do Quarenta em comparação às áreas não

contaminadas.

12

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Capítulo 1 - Toxicidade do cobre em Scinax ruber e Rhinella granulosa

(Amphibia: Anura): Potencial do Modelo do Ligante Biótico para predizer a toxicidade em

igarapés urbanos. Publicado no periódico Acta Amazonica, doi: 10.1590/4392201400383.

3.2. Capítulo 2 - Efeito crônico do cobre sobre o comportamento e desenvolvimento

larvário de girinos de Scinax ruber.

3.3. Capítulo 3 – Identificação dos genes expressos no fígado de machos adultos de

Scinax ruber (Anura Hylidae), expostos as águas contaminadas do igarapé do Quarenta.

13

3.1. Capítulo 1

Toxicidade do cobre em Scinax ruber e Rhinella granulosa (Amphibia: Anura):

Potencial do Modelo do Ligante Biótico para predizer a toxicidade em igarapés urbanos.

Publicado no periódico Acta Amazonica, doi: 10.1590/4392201400383.

3.1.1. INTRODUÇÃO

O Brasil possui a maior diversidade de anfíbios do mundo, com um total de 956

espécies, das quais 650 são endêmicas, tornando o Brasil o primeiro em endemismo. Entre as

três ordens de anfíbios, os anuros são considerados os mais ameaçados (Amphibiaweb 2014).

Desde 1990 foram registrados declínios e extinções de populações de anuros, que estavam

relacionados com a poluição do ambiente, a mudanças no uso da terra e ao surgimento de

doenças (Blaustein e Wake 1990; Daszak et al. 1999; Houlahan et al. 2000). A cidade de

Manaus é recortada por uma série de igarapés, com predominância de águas pretas (Velloso

2002). Durante os períodos de chuva, esses igarapés transbordam formando poças nas suas

margens, que eventualmente são utilizados pelos anuros para a deposição dos ovos. As

margens desses igarapés possuem uma cobertura vegetal que mantém temperatura e umidade

relativa do ar ideais para a reprodução e o desenvolvimento dos anuros nas áreas urbanas de

Manaus.

A água preta da Amazônia possui característica físico-química muito específica, bem

diferente da água branca. Geralmente a água preta é encontrada no Rio Negro, e possui pH

baixo, baixa condutividade e baixas concentrações de cátions (Silva et al. 1999; Horbe e

Oliveira 2008). No entanto, em áreas urbanas sob intensa pressão antrópica, estas

características são alteradas, ocorrendo aumento do pH, alta turbidez, redução das

14

concentrações de oxigênio dissolvido, aumento das concentrações de cálcio, magnésio, sódio,

potássio, sulfato e bicarbonato, e altas concentrações de metais de transição (Silva et al. 1999;

Melo et al. 2005; Nascimento e Silva 2010).

A qualidade da água é um ponto central para o modelo ligante biótico (BLM), que foi

desenvolvido para prever toxicidade de metais com base na química da água (Paquin et al.

2002). As características das águas da Amazônia, tanto naturais como as de ambientes

modificados, representam condições interessantes para testar este modelo, tal como tem sido

relatado para peixes da Amazônia (Duarte et al. 2009). Até o momento não existem relatos de

testes com anfíbios. Os anuros são particularmente suscetíveis aos efeitos dos metais

potencialmente tóxicos, pois possuem pele permeável, o que facilita sua absorção. Os girinos

expostos a altas concentrações de metais podem apresentar malformações, redução no

desempenho natatório, diminuição na taxa de sobrevivência, aumento no tempo até a

metamorfose e alterações no crescimento (Lefcort 1998; Rowe et al. 1998; Chen et al. 2007;

Garcia-Munõz et al. 2009; Lance et al. 2012).

O objetivo principal do presente estudo foi determinar a sensibilidade de duas espécies

de anuros, Scinax ruber e Rhinella granulosa ao cobre. Estas espécies são encontradas

facilmente as margens dos igarapés que cortam a cidade de Manaus. Muitos desses igarapés

apresentam alta concentração de cobre, muitas vezes mais elevados do que os níveis definidos

pelo Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA) (> 9 µg/L) (Silva et al. 1999;

Santana e Barroncas 2007).

15

3.1.2. MATERIAL E MÉTODOS

3.1.2.1. Animais estudados

Três desovas de Scinax ruber e três de Rhinella granulosa foram coletadas na Reserva

Florestal Adolpho Ducke, próximo ao igarapé do Barro Branco, Manaus, AM, Brasil

(02o55'03''S; 59

o53'59''W). Os ovos foram retirados diretamente de poças temporárias e

transportados para o laboratório, onde foram mantidos em caixas individuais contendo água

do igarapé do Barro Branco em temperatura ambiente e aeração constante. Os girinos foram

alimentados uma vez por dia com ração comercial de peixes. A alimentação foi suspensa 48

horas antes do início dos experimentos a fim de reduzir as ligações dos íons cobre a matéria

orgânica dos alimentos e das fezes.

3.1.2.2. Contaminante

Cloreto de cobre (II) foi diluído em diferentes concentrações com água do igarapé

Barro Branco. A água foi coletada durante o período chuvoso na Reserva Florestal Adolpho

Ducke, Manaus, Amazonas, Brasil e as suas características principais foram: [Na+], 0,182

mg/L; [K+], 0,09 mg/L; [Ca

2+], 0,01 mg/L; [Mg

2+], 0,029 mg/L; [Cl

-] 0,15 mg/L; [SO4

2-], 1

mg/L; [COD] 6,94 mg/L; [Cu], 1,5 µg/L; alcalinidade 2,8 mg CaCO3/L; pH 5,5. Estas

características físico-químicas da água do Barro Branco são semelhantes aos dos igarapés de

água preta que cortam a cidade de Manaus. Para melhor calibrar o BLM, e a CL50, também

foram feitos experimentos usando a água do poço do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia). Esta água é caracterizada por [Na+], 0,72 mg/L; [K

+], 0,42 mg/L; [Ca

2+], 0,1

mg/L; [Mg2+

], 0,026 mg/L; [Cl-], 1,32 mg/L; [SO4

2-], 0,01 mg/L; [DOC] 1,84 mg/L; [Cu] 4

µg/L; alcalinidade 3,75 mg de CaCO3/L; pH 6,2.

16

3.1.2.3. Efeito agudo de contaminação (Teste de CL50).

A CL50 é um teste padronizado que determina a concentração de uma substância ou

de uma combinação de substâncias que causa 50% de mortalidade em um grupo de

organismos, o que permite inferir a susceptibilidade das espécies em análise, Scinax ruber e

Rhinella granulosa. Quatro testes de CL50 foram realizados, dois para girinos de Scinax ruber

(Estadio 25 de Gosner, 21 dias) na água do igarapé e na água de poço, um com ovos de Scinax

ruber e um com girinos Rhinella granulosa (estadio 25 de Gosner, 21 dias) na água do

igarapé, de acordo com a licença da Comissão de Ética no Uso de Animais do INPA

(061/2012). Os teores de cobre foram definidos de acordo com o protocolo de Sprague

(1990), ou seja, as concentrações das exposições foram aumentadas usando uma razão de 1,3.

O período total de exposição dos girinos e dos ovos ao cloreto de cobre foi de 96 horas. Três

réplicas foram definidas para cada uma das oito concentrações analisadas. Cada réplica

consistiu em um recipiente de plástico de 500 mL, com 400 mL de água com aeração

constante, contendo 10 girinos ou ovos. O mesmo número de réplicas sem cloreto de cobre foi

usada como controle. Três diferentes desovas foram utilizadas. Para os testes com girinos de

Scinax ruber em água de poço foram utilizadas cinco réplicas. A sobrevivência e o estágio de

desenvolvimento das larvas (de acordo com a tabela de Gosner, 1960) (Figura 1.1) foram

registradas em 24, 48, 72 e 96 horas. As larvas e ovos sem movimentos foram considerados

mortos quando apresentavam colorações acinzentadas, o que contrastava com os vivos.

17

Figura 1.1. Classificação dos estádios de desenvolvimento dos ovos e larvas, segundo

Gosner 1960.

3.1.2.4. Análise Química

No início de cada experimento foi coletada uma amostra de água para análise das

concentrações de Ca2+

, Mg2+

, Na+, K

+, Cl

-, alcalinidade e carbono orgânico dissolvido (COD).

O pH, a temperatura e os níveis de cobre dissolvido foram medidos diariamente. Quando

necessário, as concentrações de cobre dissolvido foram corrigidas para o valor nominal. Os

níveis de Ca2+

, Mg2+

, Na+ e K

+ foram determinados por espectrofotometria de absorção

atômica (AAnalyst 800, Perkin-Elmer, Singapura), as concentrações de Cl-

foram

determinadas pelo método colorimétrico descrito por Zall et al. (1956), usando uma

espectrofotômetro de placa (Spectra-Max Plus 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA,

USA). Todas as determinações foram realizadas em triplicata para cada amostra de água.

A concentração de COD das amostras foi determinada em um analisador de carbono

total (Apollo 9000, Teledyne Tekmar, Ohio, USA) usando o método de combustão

18

combinado com detecção por infravermelho, como previamente descrito pela norma

ISO/FDIS 8245 (1998). Em resumo, as amostras foram pré-filtradas em membrana de 0,45

m para remover material particulado antes da injeção e o COD foi medido em triplicatas. As

concentrações de SO42-

, S2-

e ácido húmico (AH) foram calculadas a partir de determinações

anteriores para igarapés naturais no interior da cidade de Manaus (Ertel et al. 1986; Silva et

al. 1999; Nascimento e Silva 2010).

3.1.2.5. Os cálculos e a análise estatística

A CL50-96h e seus respectivos intervalos de confiança de 95% foram calculados

usando o método Spearman-Karber (Hamilton et al. 1977). Foram utilizadas, para esse

cálculo, as médias das concentrações de cobre, medidos em triplicata.

Os valores medidos de Ca2+

, Mg2+,

Na+, K

+, Cl

-, alcalinidade, pH, COD, e temperatura

e os valores de SO42-

, S2-

da literatura foram utilizados como parâmetros de entrada para

todas as séries experimentais. O conteúdo de ácido húmico foi fixado em 40% a fim de

corresponder ao teor de ácidos húmicos do Rio Negro (Ertel et al. 1986). O BLM (versão

2.2.3 para Windows, Hydroqual, Mahwah, NJ, EUA) foi usado para prever a CL50-96h do Cu

em girinos de Scinax ruber e Rhinella granulosa, usando o modelo de Daphinia magna, e

de ovos de Scinax ruber, usando modelo da truta arco-íris. Cada réplica de cada experimento

foi introduzida no programa individualmente.

Os parâmetros físico-químicos do igarapé do Bolívia (Nascimento e Silva 2010), que

está localizado ao lado da Reserva Florestal Adolpho Ducke, foram utilizados como modelo

para os parâmetros de entrada. Como os autores não mediram as concentrações de COD, S e

AH, foi inserida uma série de valores para verificar sua influência sobre o modelo. Para S,

19

consideramos o mesmo valor encontrado para igarapés naturais, pois mesmo aumentando este

valor em 150 vezes, não observamos alterações na CL50 prevista pelo programa. Para o AH e

o COD, inserimos quatro valores diferentes, a partir das concentrações encontradas em

igarapés naturais, com aumento gradativo usando uma razão de 2. Como esses igarapés têm

altas concentrações de matéria orgânica provenientes dos esgotos domésticos, esperamos um

aumento nas concentrações de COD e AH (Tabela 1.1).

3.1.3. RESULTADOS

Os ovos apresentaram uma maior resistência ao cobre que os girinos, principalmente

nas primeiras 24 horas, quando a CL50 dos ovos foi de 73,93 µg/L (66,95 - 82,14) diminuindo

para 51,34 µg/L (45,58- 57,82) após 48 horas. Ao fim de 24 horas de exposição ao cobre os

ovos já haviam eclodido e as larvas já mostravam movimentos musculares (estadio 18-19 de

Gosner); em 48 horas evoluíram para larvas com brânquias e movimentos natatórios (estadio

21 de Gosner), exceto aqueles expostos a 56 µg/L, que permaneceram no estadio 19 de

Gosner. Em 72 horas todas as larvas vivas alcançaram o estadio 25 de Gosner.

Os girinos expostos à água do igarapé da Reserva Ducke apresentaram queda na taxa

de sobrevivência em baixas concentrações de cobre mesmo em um período de tempo

relativamente curto. Em apenas 24 horas nenhum girino de Rhinella granulosa conseguiu

sobreviver quando expostos a 33 µg de Cu/L. Em contrapartida, quase três vezes mais cobre

(94 µg de Cu/L) foi necessário para causar mortalidade total de ovos e girinos de Scinax

ruber. Não houve mortalidade significativa de qualquer espécie quando os girinos foram

expostos a concentrações abaixo de 20 µg de Cu/L (Figura 1.2).

20

Figura 1.2. Taxas de sobrevivência dos girinos em diferentes concentrações de cobre

(15-94 µg/L) diluído na água do igarapé do Barro Branco (média ± desvio padrão da média).

(A) 24 horas, (B) 48 horas, (C) 72 horas e (D) 96 horas de exposição. * P<0,05.

A CL50-96h foi de 36,37 µg/L (31,45 - 42.07) para girinos e de 50,02 µg/L (44,46 -

56.15) para ovos de Scinax ruber e de 23,48 µg/L (21,28 - 25,91) para girinos de Rhinella

granulosa expostos ao cobre dissolvido na água do igarapé da Reserva Ducke. Para os girinos

de Scinax ruber expostos ao cobre dissolvido na água do INPA, a CL50-96h foi de 15,9 µg/L

(13,4 - 19, 12).

A CL50-96h predita pelo BLM foi de 25,7 µg/L para girinos e de 90,9 µg/L para os

ovos de Scinax ruber e de 23,4 µg/L para girinos de Rhinella granulosa expostos ao cobre

dissolvido na água do igarapé da Reserva Ducke. Para girinos de Scinax ruber expostos ao

cobre dissolvido na água do INPA, a CL50-96h predita foi de 19,15 µg/L. Os valores da CL50-

21

96h preditos pelo programa estão na mesma faixa dos valores observados, indicando que o

BLM é uma ferramenta confiável para estimar a toxicidade do cobre até mesmo em igarapés

contaminados (Figura 1.3).

Figura 1.3. CL50 predita pelo BLM versus a CL50 observada para () ovos de Scinax

ruber , () girinos de Rhinella granulosa e () girinos de Scinax ruber. A linha diagonal

sólida corresponde a relação de 1:1 entre o modelo e os dados.

As condições físicas e químicas dos igarapés da cidade, contaminados por esgotos

domésticos, afetam a biodisponibilidade do cobre e, desse modo, ocorre uma redução da

toxicidade para os girinos, em comparação aos animais expostos à água pura do igarapé do

Barro Branco na Reserva Ducke ou a água do poço do INPA (tabela 1.1).

22

Tabela 1.1. Características físico-químicas e CL50 predita para o Igarapé do Bolívia (cidade

de Manaus, área urbana) e para o igarapé do Barro Branco (área natural).

Natural Contaminado

Temperatura oC 28 28

pH 5,5 6,5

CL50 (µg/L) 30,25 101,2–1498,8

COD (mg C/L) 6,94 6,9 – 55,3

AH (mg/L) 40,00 20 – 80

Ca2+

(mg/L) 0,01 2,22

Mg2+

(mg/L) 0,029 52,4

Na+ (mg/L) 0,182 11,55

K+ (mg/L) 0,09 2,54

SO42-

(mg/L) 1,00 5,67

Cl- (mg/L) 0,15 7,65

Alcalinidade (mg/L

CaCO3

2,8 4,04

S2-

(mg/L) 0,01 0,01

23

3.1.4. DISCUSSÃO

Depois de 48 horas de exposição ao cobre, foi observado uma queda brusca na

viabilidade dos ovos, em contraste com o declínio gradual na sobrevivência dos girinos. A

gelatina que recobre os ovos pode tê-los protegido da contaminação nas primeiras 24 horas de

exposição. No entanto, ao alcançarem os estadios 19, 20 e 21 de Gosner, entre 24 e 48 horas,

marcados pelo aparecimento dos filamentos branquiais externos e pelo início da atividade

cardiovascular (Gosner 1960), pode ter ocorrido um aumento da absorção do cobre e,

consequentemente, reduzido a sobrevivência das larvas (Figura 1.2). Lance et al. (2012)

observaram uma correlação entre densidade dos ovos e a toxicidade do cobre, ou seja, quanto

maior a densidade dos ovos, menor toxicidade do cobre. Eles sugeriram que o cobre se liga a

gelatina do ovo, diminuindo a biodisponibilidade do cobre na água e, assim, reduzindo sua

toxicidade. Este parece ser o caso no presente estudo também.

Franco de Sá et al. (2012) também observaram uma maior resistência dos ovos de

Osteocephalus taurinus em comparação com os girinos (primeiras 13 horas) expostos de

forma aguda à água de um igarapé contaminado na cidade de Manaus, que contém altos teores

de Fe, Mn, Ni, Cr e Pb. Como no presente trabalho, Franco de Sá et al. (2012) não

verificaram diminuições significativas na viabilidade dos ovos antes da eclosão, mas

observaram uma alta taxa de mortalidade logo após a eclosão, relacionada ao aparecimento

das brânquias externas.

Nascimento et al. (2012) realizaram um experimento similar com Osteocephalus

taurinus em dois outros igarapés de Manaus, Igarapé do Quarenta e do Mindu, e ao contrário

de Franco de Sá et al. (2012) não observaram nenhum efeito da água contaminada na

sobrevivência dos ovos e larvas durante o período de 96 horas. A diferença entre os dois

estudos pode estar relacionada com a composição química dos igarapés, o que afeta a

24

biodisponibilidade dos metais, exigindo-se assim uma análise detalhada dos locais

contaminados.

A CL50-96h foi maior para Scinax ruber do que para Rhinella granulosa,

possivelmente devido a uma maior resistência dos girinos de Scinax ruber ao cobre, a

diferenças no tamanho e na massa corporal dos girinos das duas espécies e a pequenas

variações nas características físico-químicas, das águas utilizadas nos experimentos. As águas

foram coletadas no mesmo igarapé, mas em dias diferentes para cada experimento.

Em curto prazo (48h) a exposição ao cobre causou um atraso no desenvolvimento

larvário. Um atraso no desenvolvimento dos girinos pode ter uma influência extremamente

negativa para a população. Quanto mais tempo permanecerem na poça, maiores são as

chances de serem predados e da poça secar.

Em igarapés contaminados, observamos uma redução na toxicidade do cobre, com a

CL50 predita variando entre 101,2 a 1.498 µg/L, dependendo das concentrações do COD e AH

(Tabela 1.1). As condições físico-químicas específicas dos igarapés poluídos, incluindo o

aumento COD, afetam a biorreatividade e a biodisponibilidade dos metais e podem torná-los

biologicamente indisponível para o animal, reduzindo sua toxicidade. A toxicidade dos metais

ocorre devido à ligação do metal ao ligante biótico, e a brânquia é o principal ligante. O pH

tem uma influência significativa na especiação dos metais, ou seja, o aumento do pH, como

observado nos igarapés poluídos, facilita a formação do complexo metal-COD, reduzindo

assim a ligação do metal no ligante biótico. As substâncias húmicas formam complexos

altamente estáveis com alto peso molecular e, portanto, reduzem a captação dos metais pelas

membranas biológicas (Paquin et al. 2002).

A biodisponibilidade dos metais nos igarapés naturais da Amazônia depende de

múltiplas e complexas interações físicas e químicas, tais como pH variando de muito ácido

25

para condição aproximadamente neutra, de muito baixo para níveis relativamente altos de

íons, de baixo a altos níveis de COD, e do aumento de poluentes orgânicos e inorgânicos,

como ocorre em igarapés urbanos. Essas condições determinam a toxicidade dos metais, e

assim podem causar danos em extensões diferentes para as populações de anuros que habitam

as margens dos corpos d'água.

Experimentos realizados em diferentes tipos de águas da Amazônia, incluindo branca,

preta e uma mistura de águas branca e preta, têm sugerido que o BLM é uma ferramenta

adequada para prever a toxicidade do cobre (Bevilacqua 2009) para peixes nesses tipos de

águas naturais. Bianchini et al. (2004) também demonstraram que o BLM é uma ferramenta

promissora para estimar sensibilidade de copépodes ao cobre nas águas subtropicais. O

presente estudo evidencia que o modelo ligante biótico também pode ser considerado uma

ferramenta promissora para predizer a sensibilidade dos anuros amazônicos ao cobre.

Os anfíbios estão diariamente expostos a um grande número de desafios urbanos no

interior das cidades ou perto delas. A expansão das cidades em direção às florestas provoca

desmatamento, que tem efeito direto sobre a maioria das espécies de anuros, levando ao

desaparecimento das suas populações. Entre as causas do declínio das populações de anfíbios

está o aumento das concentrações de metais na água e no solo, incluindo o cobre. Os anfíbios,

tanto as larvas quanto os adultos, possuem pele permeável, tornando-os mais vulneráveis ao

cobre dissolvido nas águas e no solo. No entanto, existem algumas espécies que podem

sobreviver a estas mudanças, como é o caso de Scinax ruber e Rhinella granulosa, espécies-

alvo do presente estudo, que têm uma preferência por áreas abertas e não necessitam de

cobertura vegetal para desovar (Lima et al. 2006).

Cerca de 70% dos anfíbios possuem ciclo de vida com larvas ou ovos aquáticos

(Sparling et al. 2000). A maioria dessas espécies não usam diretamente os igarapés, eles

26

usam as poças formadas nas margens pelas chuvas ou pelo transbordamento dos cursos

d’água. As poças passam por constantes mudanças ambientais, pois recebem continuamente

as águas poluídas dos igarapés, sofrem alterações físico-químicas causadas pela

decomposição bacteriana da matéria orgânica e passam por extremas mudanças de

temperatura, aumentando ou diminuindo os efeitos dos poluentes. Apesar disso, com o BLM

foi possível estimar a sensibilidade desses organismos ao cobre.

Em conclusão, a toxicidade do cobre depende da composição físico-química da água e

do estágio larval dos girinos. Os estádios 19, 20 e 21 de Gosner (relacionados ao

aparecimento das brânquias externas) são os mais vulneráveis e a fase de ovo é a mais

resistente. No caso de uma contaminação por cobre, os igarapés naturais devem

receber atenção especial, dado que a CL50 observada foi menor nesses ambientes. Os

resultados aqui apresentados representam a primeira tentativa de entender toxicidade do

cobre em anuros amazônicos. Nossos resultados destacam as primeiras evidências de que o

modelo ligante biótico pode ser considerado uma ferramenta promissora para a predição da

toxicidade do cobre para efeitos de regulação nas águas de igarapés urbanos na Amazônia.

27

3.2. Capítulo 2

Efeito crônico do cobre sobre o comportamento e desenvolvimento larvário de

girinos de Scinax ruber

3.2.1. INTRODUÇÃO

Atualmente, acredita-se que um terço das espécies de anfíbios do mundo estão

ameaçadas de alguma forma. Dentro da classe Amphibia há três ordens: Anura (923 espécies

brasileiras), Caudata (5 espécies brasileiras) e Gymnophiona (31 espécies brasileiras)

(Amphibiaweb 2014). Entre essas ordens a mais ameaçada é a Anura. De acordo com os

dados da IUCN, existem 503 espécies de anfíbios no Brasil classificados como pouco

preocupantes, 25 como ameaçadas, 16 como vulneráveis, 9 como criticamente em perigo, 7

em perigo e 1 como extinta. Este fato tem impulsionado estudos científicos para compreender

as causas e consequências dos declínios das populações de anfíbios no Brasil e no mundo.

A cidade de Manaus é recortada por um grande numero de igarapés, e em suas

margens encontramos varias espécies de anuros, entre elas está a Scinax ruber, uma espécie

de área aberta que utiliza as poças formadas nas margens para desovar. Durante a implantação

da Zona Franca de Manaus ocorreu um rápido crescimento da cidade, causando problemas

ambientais graves e impactando muitos corpos d'água. Áreas de florestas foram transformadas

para acomodar a grande população de trabalhadores migrantes. Sem um sistema adequado de

recolhimento e tratamento de resíduos, grande quantidade de esgoto acabou em muitos

igarapés sendo que os igarapés que atravessam a área industrial recebem, também, poluentes

orgânicos e inorgânicos, como o cobre (Velloso 2002).

28

Altas concentrações de cobre são encontradas em muitos igarapés no interior da cidade

(Silva et al. 1999; Santana e Barroncas 2007). Durante a estação chuvosa, período em que

ocorre o pico de reprodução da maioria das espécies de anuros, pode ocorrer um aumento nas

concentrações dos metais, atribuídos à entrada de efluentes industriais, esgotos domésticos e

também ao arraste pelas águas das chuvas dos resíduos sólidos e substâncias que se

encontram na superfície do solo nas margens dos igarapés (Silva et al. 1999).

O cobre é um metal essencial para o desenvolvimento e funcionamento dos

organismos, participa de vários processos fisiológicos, sendo cofator essencial para muitas

metaloproteínas; porém, quando encontrado em excesso, pode provocar uma série de danos ao

organismo, podendo levar o animal a morte.

Estudos ecotoxicológicos têm sido realizados em todo o mundo para compreender os

efeitos de poluentes em diferentes grupos de animais aquáticos, principalmente em peixes. O

cobre tem recebido certo destaque nestes estudos por ser muito utilizado como pesticida

agrícola. Ao contaminar o solo e os corpos d'água, o cobre é absorvido pelas brânquias e pele

ou ingerido através do alimento (Garcia-Munoz et al. 2009). Estudos ecotoxicológicos

utilizando anuros ainda são escassos, principalmente em regiões tropicais.

O cobre, mesmo em concentrações relativamente baixas, pode diminuir, em curto

prazo, as taxas de sobrevivência de ovos e girinos e, em longo prazo, pode aumentar as

chances dos girinos serem predados, pois interfere na sua capacidade de detectar a presença

de predadores (García-Muñoz et al. 2009). A intoxicação por cobre também aumenta o tempo

para a metamorfose, aumentando assim as possibilidades da poça secar antes que as larvas se

adaptem ao ambiente terrestre (Lance et al. 2012). Também pode reduzir o peso e o

comprimento final dos girinos, aumentando as chances deles serem predados ou estimular o

aparecimento de malformações, como barbatana dorsal ondulada, cauda flexionada, eixo do

29

corpo curvado, formação de edema e pigmentação reduzida no saco vitelínico e induzir danos

no DNA e apoptose celular (Xia et al. 2012). Todos esses fatores podem, em longo prazo,

reduzir as populações locais de anuros. A sinergia do cobre com outros fatores estressantes,

como a radiação UV (Baud e Beck 2005), tem um efeito aditivo, afetando negativamente a

sobrevivência de girinos.

O efeito no desenvolvimento larvário causado por longas exposições a poluentes

presentes nos igarapés de Manaus já foi testado por Franco de Sá et al. (2012) e por

Nascimento et al. (2012) utilizando girinos de Osteocephalus taurinos expostos às águas dos

igarapés do Educandos, do Mindu e do Quarenta, contaminados por concentrações de metais

de transição acima das naturais. Foi observado um efeito desses poluentes no tempo até a

metamorfose e no comprimento dos girinos; porém, o efeito de um único poluente

isoladamente, como o caso do cobre, ainda não havia sido testado.

Existe uma associação negativa entre a poluição por metais potencialmente tóxicos no

solo e na água e a riqueza de espécies de anuros. Os metais provenientes da poluição

industrial e de pesticidas agrícolas podem alterar a estrutura das comunidades globais de

anfíbios (Ficken e Byrne 2013).

O objetivo principal do presente estudo foi determinar os efeitos de um único poluente

de forma isolada, no caso o cobre, no desenvolvimento dos girinos de Scinax ruber, quando

expostos de forma crônica a uma concentração subletal, nas águas de um igarapé de água

preta.

30


3.2.2.1. Animais estudados

Três desovas de Scinax ruber foram coletadas na Reserva Florestal Adolpho Ducke,

próximo ao igarapé do Barro Branco, Manaus, AM, Brasil (02o55'03''S; 59

o53'59''W). Os

ovos foram retirados diretamente de poças temporárias e transportados para o laboratório,

onde foram mantidos em caixas individuais contendo água do igarapé do Barro Branco em

temperatura ambiente e aeração constante. Os girinos foram alimentados uma vez por dia com

ração comercial de peixes. Os experimentos tiveram início quando os girinos alcançaram o

estadio 25 de Gosner, com 21 dias de vida.

3.2.2.2. Contaminante

Como contaminante foi utilizado 30 µg/L (±2,51) de cobre diluído na água do igarapé

do Barro Branco. Essa concentração foi escolhida por ser a concentração mais alta do

experimento de CL50-96h onde não ocorreu mortalidade (Capítulo 1). A água foi coletada

durante o período chuvoso na Reserva Florestal Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas, Brasil e

as suas características principais foram: [Na+], 0,182 mg/L; [K

+], 0,09 mg/L; [Ca

2+], 0,01

mg/L; [Mg2+

], 0,029 mg/L; [Cl-] 0,15 mg/L; [SO4

2-], 1 mg/L; [DOC] 6,94 mg/L; [Cu], 1,5

µg/L; alcalinidade 2,8 mg CaCO3/L; pH 5,5. Estas características físico-químicas da água do

Barro Branco são semelhantes às dos igarapés de água preta que cortam a cidade de Manaus.

31

3.2.2.3. Efeito crônico da contaminação

Foi utilizada uma única concentração de 30 µg/L de cobre, equivalente a

82,5% da CL50-96h (Capítulo 1). Para o tratamento utilizamos 30 réplicas (10 para cada

desova), cada réplica com um indivíduo mantido em recipiente plástico de 300L com fundo

telado. Os recipientes foram colocados em grupos de 10 em tanques contendo 4L de água.

Como o fundo dos recipientes era telado, a água podia circular livremente entre eles e como

as fezes se acumulavam abaixo da tela, os girinos não entravam em contato direto com elas. O

mesmo número de réplicas foi utilizado como controle, contendo apenas água do igarapé

(Figura 2.1). A aeração foi mantida constante e os girinos foram alimentados a cada dois dias

com ração de peixe.

A troca da água foi feita de modo contínuo, sem a necessidade de manipular os

animais. Semanalmente medimos as concentrações de cobre e os valores de pH, que se

mantiveram constantes durante todo o experimento. A cada duas semanas foram feitas novas

coletas de água no igarapé do Barro Branco para alimentar o sistema. A cada coleta uma

amostra foi separada para medir os parâmetros físico-químicos. Não observamos grandes

variações em relação aos parâmetros físico-químicos durante os experimentos.

À medida que os girinos alcançavam o estadio 42 de Gosner, eles foram pesados e

fotografados com uma barra de escala e medidos utilizando o programa image J (Figura 2.2).

Antes de serem pesados, os girinos foram secados com o uso de toalhas de papel para evitar

que o excesso de água influenciasse as medidas.

32

Figura 2.1. Sistema de troca contínua de água e recipientes com fundo telado,

utilizados durante a exposição crônica dos girinos de Scinax ruber ao cobre.

Figura 2.2. Girino de Scinax ruber no estadio 42 de Gosner com barra de escala de 1

cm e numeração representando a desova e o indivíduo. Método utilizado para medir o

comprimento final e inicial dos girinos.

33

Para avaliar as respostas dos girinos ao cobre foram considerados os seguintes

parâmetros de desenvolvimento larvário:

1) Sobrevivência – número de indivíduos que sobreviveram em cada tratamento;

2) Comprimento na metamorfose – comprimento total, do focinho até o final da

cauda;

3) Duração do período larvário – número de dias desde a desova até a

metamorfose;

4) Taxa de crescimento – diferença entre o comprimento total inicial e o

comprimento total final, dividido pelo número de dias decorridos entre o início do

experimento e a data de metamorfose;

5) Massa corporal – Massa corporal dos girinos na metamorfose.

Diversos estudos (Kutka 1994; Monteiro 2004; Karasov et al. 2005, Franco de Sá et

al. 2012) indicam que esses são os principais parâmentros a serem medidos para se estudar o

efeito de contaminantes sobre o desenvolvimento de ovos e larvas de anuros.

Para avaliar as respostas dos girinos ao cobre, durante os primeiros 20 dias de

experimento, também observamos possíveis variações nos seguintes parâmetros

comportamentais:

1) Localização no aquário (Respostas = (a) confinado no fundo; (b) do meio para

cima da coluna d água; (c) na superfície da água).

2) Modo de natação (Respostas = (a) estacionário; (b) nadando de lado (c)

serpenteando; (d) frequentemente afundando e subindo).

34

3) Alimentação (Respostas = (a) resposta lenta a alimentação; (b) não responde).

4) Excitabilidade (Respostas = (a) hiperatividade; (b) letargia; (c) sem resposta).

Para testar o grau excitabilidade utilizamos um pequeno pincel para estimular uma reação no

girino.

Os dados da duração do período larvário, comprimento na metamorfose e taxa de

crescimento foram comparados entre o tratamento e o controle utilizando o teste t. A

identidade da desova foi comparada com os diferentes parâmetros medidos por meio da

análise de variância (ANOVA).

3.2.2.4. Análise Química

No início de cada experimento foi colhida uma amostra para análise das

concentrações de Ca2+

, Mg2+

, Na+, K

+, Cl

-, alcalinidade e carbono orgânico dissolvido (COD).

O pH, a temperatura e os níveis de cobre dissolvido foram medidos semanalmente. Quando

necessário, as concentrações de cobre dissolvido foram corrigidas para o valor nominal. Os

teores de Ca2+

, Mg2+

, Na+ e K

+ foram determinados por espectrofotometria de absorção

atômica (AAnalyst 800, Perkin-Elmer, Singapura), as concentrações de Cl-

foram

determinados pelo método colorimétrico descrito por Zall et al. (1956), usando um

espectrofotômetro de placa (Spectra-Max Plus 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA,

USA). Todas as determinações foram realizadas em triplicatas para cada amostra de água.A

concentração de COD das amostras foi determinada em um analisador de carbono total

(Apollo 9000, Teledyne Tekmar, Ohio, USA) usando o método de combustão combinado

com detecção por infravermelho, como previamente descrito pela norma ISO/FDIS 8245

(1998). Em resumo, as amostras foram pré-filtradas em membrana de 0,45 m para remover

material particulado antes da injeção e o COD foi medido em triplicatas.

35

3.2.3. RESULTADOS

Os parâmetros físico-químicos da água se mantiveram estáveis durante todo o período

experimental, conforme observados na tabela 2.1.

Tabela 2.1. Composição físico-química da água nos experimentos. Valores expressos

como média ± desvio padrão da média.

Temperatura oC 28

pH 5 ± 0,43

Cu (µg/L) 30 ± 2,52

COD (mg C/L) 6 ± 1,47

Ca2+

(mg/L) 0,1 ± 0,02

Mg2+

(mg/L) 0,03 ± 0,01

Na+ (mg/L) 0,19 ± 0,02

K+ (mg/L) 0,11 ± 0,02

Cl- (mg/L) 0,38 ± 0,23

Alcalinidade (mg/L) 2,97 ± 0,33

O cobre não provocou nenhum efeito no comportamento dos girinos, pelo menos em

relação aos parâmetros testados. Todos os girinos tanto do controle quanto do tratamento

reagiram com hiperatividade ao estímulo, sendo o modo de natação estacionário. Os girinos se

mantiveram continuamente no fundo do recipiente e não responderam a alimentação

imediatamente. Não observamos relação entre a presença do cobre e a mortalidade dos

36

girinos. A mortalidade foi de 13% no controle e de 13% no tratamento, sendo que todos

estavam no estádio 41 de Gosner quando morreram.

Também não houve diferença significativa entre o controle e o tratamento em relação

ao comprimento na metamorfose (p= 0,122), à duração do período larvário (p= 0,093), à taxa

de crescimento (p= 0,077) e à massa corporal (p= 0,39). Em média, o comprimento na

metamorfose foi de 33,08±2,76 mm no controle e de 34,24 ±2,24 mm no tratamento, a

duração do período larvário foi de 108,35 ± 28,1 dias no controle e de 95,58 ± 25,56dias no

tratamento, a taxa de crescimento foi de 0,22 ± 0,07 mm/dia no controle e de 0,25 ± 0,08

mm/dia no tratamento e a massa corporal foi de 111,44 ± 17,2 mg no controle e de 117,9 ±

25,51 mg no tratamento.

A identidade da desova teve efeito significativo em relação ao comprimento na

metamorfose (F(2,45) = 5,22; p < 0,0001), a duração do período larvário (F(2,49) = 12,77; p <

0,0001), a taxa de crescimento (F(2,45) = 50,55; p < 0,0001), a massa na metamorfose (F(2,32) =

4,46; p = 0,019) e ao comprimento inicial (F(2,45) = 17,8, p < 0,0001) (Figura 2.3).

37

Figura 2.3. Relação da identidade da desova (desovas A, B e C) com o comprimento

final (A), duração do período larvário (B), taxa de crescimento (C), massa corporal (D) e

comprimento inicial (E) (média ± desvio padrão da média).

38

3.2.4. DISCUSSÃO

Não observamos nenhum efeito negativo quando os girinos de Scinax ruber foram

expostos a uma concentração subletal de 30 µg/L de cobre diluído nas águas de um igarapé de

água preta. Acreditamos que isso se deve ao rápido crescimento dos girinos, animais maiores

e em estágios mais avançados de desenvolvimento possuem uma maior resistência ao cobre

(Aronzon et al. 2011; García-Muñoz et al. 2010; Chen et al. 2007). Desse modo, os girinos

que conseguiram sobreviver aos primeiros dias de experimento não tiveram problemas para

sobreviver até o final do período experimental. No início do experimento os girinos possuíam

em média 12 ± 2 mm de comprimento, triplicando de comprimento em 101,96 ± 27,4 dias

com um comprimento final de 34 ± 3 mm, uma taxa de crescimento de 0,24 mm por dia.

Aronzon et al. (2011) observaram um aumento gradual na resistência de girinos de

Rhinella arenarum expostos ao cobre, à medida que se aproximavam da metamorfose e Chen

et al. (2007) observaram uma maior resistência dos girinos de Rana pipens aos efeitos

teratogênicos do cobre em estágios mais avançados de desenvolvimento (25-42 de Gosner),

em comparação com os girinos de estágios mais atrasados (19-25 de Gosner).

Como no presente estudo, Chen et al. (2007) não observaram nenhum efeito

significativo em relação ao tempo até a metamorfose, velocidade de natação e tempo de

reabsorção da cauda em girinos de Rana pipens expostos de forma crônica a concentrações

subletais de cobre (5-25 µg/L). Os efeitos negativos só foram observados na concentração

mais alta (100µg/L de cobre), onde também ocorreu uma redução significativa na

sobrevivência dos girinos (Chen et al. 2007).

Xia et al. (2012) observaram uma relação entre o aumento da concentração de cobre e

o aparecimento de malformações nos girinos de Bufo gargarizans, porem isso só foi

observado nas concentrações onde ocorreu mortalidade. O aparecimento dos efeitos negativos

39

no desenvolvimento dos girinos aparentemente está relacionado também à redução na

sobrevivência, sendo assim concentrações subletais de cobre não apresentam efeitos visíveis

nos girinos expostos, pelo menos em relação aos parâmetros testados.

Utilizamos nos experimentos três desovas diferentes pertencentes à mesma população

(Reserva Florestal Adolpho Ducke) e, mesmo assim, observamos variações intrapopulacionais

significativas. O efeito da identidade da desova em relação à sobrevivência, duração do

período larvário e massa corporal na metamorfose também foi observado por Lance et al.

(2012) ao expor girinos de Lithobates sphenocephalus pertencentes a diferentes desovas a

concentrações crescentes de cobre (10-150 µg/L). Lance et al. (2013) observaram variações

inter e intrapopulacionais significativas em relação à sobrevivência das larvas de Anaxyrus

terrestris expostas de forma crônica ao cobre.

Em estudos de ecotoxicologia de anfíbios é comum a mistura de ovos provenientes de

várias desovas ou utilizar uma única desova nos experimentos. Embora essa abordagem seja

eficiente, ela pode subestimar ou superestimar os efeitos dos contaminantes, devido às

variações inter e intrapopulacionais na tolerância ao poluente. Medidas ecotoxicológicas, tais

como a CL50, seriam claramente diferentes dependendo da escolha da população em estudo. A

origem das populações utilizadas nos ensaios ecotoxicológicos de anfíbios é um ponto

importante a ser considerado; tão importante quanto o estágio da larva e a espécie em estudo

(Lance et al. 2013). Os resultados aqui apresentados reforçam a importância da utilização de

diferentes desovas nos estudos ecotoxicológicos.

Dependendo das populações expostas ao contaminante, a resposta poderá ser

diferente, visto que existem características hereditárias que podem aumentar ou diminuir a

resistência desses animais aos poluentes. As populações que habitam e que se reproduzem nas

margens dos igarapés da cidade já passaram por um processo de seleção, onde somente os

40

mais resistentes aos poluentes conseguiram sobreviver. O presente estudo simulou o primeiro

contato dos girinos ao contaminante, visto que os animais utilizados são provenientes de uma

área livre desse poluente (Reserva Florestal Adolpho Ducke).

Estudando três espécies de anuros de diferentes regiões e zonas climáticas do planeta,

Araújo et al. (2014) observaram que girinos (estadio 25 de Gosner) de Leptodactylus letrans

(América do Sul), Lithobates catesbeianus (América do norte) e Pelophylax perezi (Europa)

eram capazes de detectar e evitar concentrações subletais de cobre, afastando-se das áreas

contaminadas. A sensibilidade dessa resposta foi similar nas três espécies.

A migração das áreas poluídas só é possível para girinos que habitam corpos grandes

de água onde o cobre se distribui de forma heterogênea e para animais que são expostos a

concentrações subletais, pois altos níveis de cobre interferem na capacidade de natação dos

girinos, impedindo a fuga (Araújo et al. 2014). Tal comportamento provavelmente não ocorre

com girinos de Scinax ruber encontrados na natureza, já que essa espécie desova em pequenas

poças, o que impede a fuga do ambiente. Porém, podemos supor que os adultos possam

apresentar a mesma habilidade de detecção dos contaminantes, evitando áreas poluídas para

desovar. Mais estudos devem ser realizados para confirmar essas hipóteses, já que mesmo

com altas concentrações de poluentes, encontramos, nas margens do igarapé do Quarenta,

diferentes espécies de anuros, incluindo girinos nas poças contaminadas (Comunicação

pessoal).

Em conclusão, a concentração subletal de 30 µg/L de cobre (82,5% da CL50-96h) não

teve efeito sobre o comprimento, duração do período larvário, taxa de crescimento e massa

corporal nos girinos selvagens de Scinax ruber, expostos de forma crônica a partir do estádio

25 de Gosner. A identidade da desova foi significativa em relação a todos os parâmetros

41

testados, mostrando uma variação intrapopulacional que deve ser considerada em estudos

ecotoxicológicos, evitando super ou subestimar os efeitos do contaminante.

42

3.3. Capítulo 3

Identificação dos genes expressos no fígado de machos adultos de Scinax ruber

(Anura Hylidae), encontrados nas margens do igarapé do Quarenta.

3.3.1. INTRODUÇÃO

O Igarapé do Quarenta nasce no bairro Armando Mendes, na zona leste da cidade de

Manaus e percorre áreas ocupadas, como o Distrito Industrial e os bairros do Coroado e

Japiim. Recebe tanto esgoto doméstico quanto industrial (Velloso 2002). Nesse igarapé foram

observados vários indicadores de poluição das águas como o aumento do pH, alta

condutividade, baixos teores de oxigênio dissolvido, altas concentrações de cátions e ânions e

altas concentrações de metais (Cu, Cr, Zn e Ni). Somente na sua nascente esses valores estão

em níveis considerados normais (Silva et al. 1999; Melo et al. 2005).

Mesmo com altos níveis de poluentes, algumas espécies de anfíbios ainda conseguem

sobreviver em suas margens. O PROSAMIM (Programa Social e Ambiental dos Igarapés de

Manaus) registrou 32 espécies de anfíbios vivendo as margens da sub-bacia do Quarenta,

porém, a maioria foi encontrada na área do campus da UFAM (Universidade Federal do

Amazonas), mais preservada do que o restante da bacia (Prosamim 2004).

Anfíbios expostos por longo prazo a rios contaminados podem apresentar mudanças

na contagem de glóbulos brancos (WBC) e alterações nos parâmetros hematológicos

refletindo as respostas dos organismos aos fatores ambientais. Estas variações refletem as

reações fisiológicas à presença de substâncias tóxicas no ambiente (Romanova e Egorikhina

2006; Zhelev et al. 2012; Zhelev et al. 2013).

43

Uma grande variedade de biomarcadores estão sendo testados com sucesso em anuros

a fim de se observar as reações destes animais aos ambientes contaminados, entre eles

podemos destacar algumas enzimas que tem sua concentração aumentada quando os animais

são expostos a poluentes, a GST, a P450, entre outras. Kostaropoulos et al. (2005)

observaram um aumento da concentração da GST e da P450-MO no fígado de Rana

ridibunda exposto a altas concentrações de cádmio e cromo. Essas enzimas estão relacionadas

a processos de biotransformação. Os biomarcadores enzimáticos são ferramentas úteis para

avaliar a susceptibilidade dos anuros a diferentes desafios ambientais, sendo, portanto, um

uma ferramenta importante para a conservação das espécies selvagens (Falfushinska et al.

2008).

A análise da expressão gênica é uma ferramenta muito eficiente para a detecção das

respostas fisiológicas dos organismos às alterações do ambiente, através dela podemos

identificar quais genes estão sendo sub ou superexpressos e supor quais enzimas são

expressas em determinada situação. Relacionando os genes expressos com o ambiente onde os

animais foram encontrados, podemos compreender quais estratégias os organismos utilizam

para sobreviver em diferentes ambientes. Essa abordagem tem sido utilizada para estudar as

respostas fisiológicas de peixes amazônicos aos poluentes (Lemgruber et al. 2013), para a

detecção de biomarcadores em mamíferos como resposta às citotoxinas que podem vir a

causar tumores malignos (Bianconi et al. 2012; Zhang et al. 2012; Yu et al. 2013) e para

estudar as respostas de parasitas à presença de drogas (Kessler 2010).

Utilizando RT-PCR (PCR em tempo real) para a análise da expressão gênica, Bogi et

al. (2003) observaram um aumento na expressão do gene Vg (vitelogenina) no fígado de

juvenis de Xenopus laevis expostos, a partir dos primeiros estágios larvais, a diferentes

concentrações de esgoto diluído em água de rio. Foi observada uma proporção

44

significativamente maior de fêmeas quando as larvas foram expostas ao contaminante.

Substâncias chamadas de “disruptores endócrinos” encontrados nos efluentes são capazes de

interferir com o sistema hormonal, causando assim efeitos adversos na fisiologia dos

organismos, aumentando a proporção de fêmeas em relação aos machos (Bogi et al. 2003). Os

autores utilizaram o Vg como biomarcador para detecção da exposição a estrogênio.

Langerveld et al. (2009) utilizaram as técnicas de microarray e qRT-PCR para definir as

mudanças de expressão de genes em girinos de Xenopus laevis expostos de forma crônica ao

pesticida atrazine e desse modo compreender as mudanças fisiológicas que ocorrem na

presença desse contaminante.

No presente estudo analisamos a expressão dos genes no fígado de machos adultos de

Scinax ruber encontrados nas margens do igarapé do Quarenta, com o intuito de compreender

os mecanismos utilizados por esses organismos para sobreviver nesse ambiente e encontrar os

possíveis riscos para o desenvolvimento futuro de suas populações.


3.3.2.1. Análise físico-química das amostras de água do igarapé do Quarenta

As amostras de água foram coletadas na superfície do igarapé do Quarenta, e em

quatro poças próximas às áreas onde os animais foram coletados, no Bairro do Japiim, em

Manaus (Figura 3.1). As amostras foram armazenadas em frascos e acidificadas com ácido

nítrico.

A concentração de oxigênio dissolvido, a temperatura e o pH foram aferidos em

campo com aparelhos portáteis.Foram analisadas as concentrações de NO2-, NO3

-, NH4

+ e PO4

por espectrofotometria adaptado ao sistema de FIA (“Flow Injection Analysis” - análises por

45

injeção de fluxo) em colaboração com o Laboratório Temático de Águas do Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia (INPA). A concentração de COD das amostras foi determinada

em um analisador de carbono total (Apollo 9000, Teledyne Tekmar, Ohio, USA) usando o

método de combustão combinado com detecção por infravermelho e a concentração de cobre

foi determinada por espectrofotometria de absorção atômica (AAnalyst 800, Perkin-Elmer,

Singapura).

Figura 3.1. Área de coleta das amostras de água. 1- Igarapé do Quarenta. 2 a 5 –

Poças próximas às áreas onde os adultos de Scinax ruber foram coletados. Fonte: Google

Maps.

46

3.3.2.2. Coleta dos espécimes

Foram utilizados, no total, doze animais coletados entre os dias 10/01/2011 e

18/2/2011, medindo entre 3,4 e 3,6 cm (seis machos adultos de Scinax ruber coletados nas

margens do igarapé do Quarenta, no bairro no Japiim em Manaus e seis machos adultos

coletados na Reserva Florestal Adolpho Ducke, uma área comprovadamente livre de

poluentes, que foi usada como controle.

Os animais foram imediatamente anestesiados com gelo (técnica comumente utilizada

em ranários comerciais) e sacrificados por secção medular. Em seguida, o fígado foi retirado,

utilizando para isso tesoura cirúrgica, e guardado em microtubo criogênico, congelado em

nitrogênio líquido e armazenado até o momento da extração do RNA total. O projeto foi

aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do INPA (061/2012).

3.3.2.3. Extração de RNA

O RNA total foi extraído de maneira individual das 12 amostras de fígado, utilizando

o protocolo TRIzol® reagent (InvitrogenTM

, Cat. No 15596-018). O processo pode ser dividido

em três etapas: na primeira foi realizada a lise celular, a dissociação das nucleoproteínas,

inativação das RNases e retirada dos debris celulares; na segunda etapa foi feita a limpeza da

solução com a retirada dos solventes orgânicos e separação da fase aquosa e, por último, a

precipitação em álcool e ressuspensão do RNA total em 20µL de água livre de nucleases.

47

3.3.2.4. Avaliação quantitativa e qualitativa do RNA

Para a quantificação do RNA extraído foi utilizado espectrofotômetro NanoDrop®

(Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA) conforme orientações no manual do fabricante

(NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 user manual, 2009). Por meio desse

equipamento foram determinadas a concentração de RNA total e a pureza das amostras,

análises estas baseadas nos valores de absorbância da luz nos comprimentos de onda de 260 e

280nm. A razão entre os valores das absorbâncias em 260nm e 280nm foi utilizada para

verificar o grau de contaminação nas amostras de RNA extraídas, sendo que valores próximos

de 2,0 indicam alto grau de pureza e valores abaixo de 1,8, contaminação por proteínas ou

outras substância que absorvem fortemente próximo do ou no comprimento de onda de

280nm.

A integridade do RNA extraído foi verificada por meio de eletroforese a 4 V/cm em

gel de agarose 1,0% (p/v). Para isso foi aplicado no gel aproximadamente 1000 ng de cada

amostra, adicionada de 1,0µL do front de corrida (400µL de glicerol, 600µL tampão tris-

acetato-EDTA, azul de bromofenol e 1µL de GelRed). Ao final, o gel foi visualizado em

sistema de fotodocumentação digital L.PIX (Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil). Na

análise quantitativa das amostras de RNA total extraído do fígado de Scinax ruber, foram

obtidos em média 1437,28 ± 541,64 ng/µL (média ± desvio da média), com grau de pureza de

1,97 ± 0,03 (média ± desvio da média).

48

3.3.2.5. Pools de RNA total

Antes do início do protocolo que prepara as amostras para análise em série da

expressão gênica foram formados dois pools de RNA total, um para as amostras de fígado dos

animais coletados no igarapé do Quarenta e outro para os coletados na Reserva Ducke. Essa

estratégia garantiu uma quantidade adequada de RNA total para as atividades subsequentes,

além de reduzir o número de bibliotecas construídas para o sequenciamento.

3.3.2.6. Preparo das bibliotecas usando o método de RNA-Seq

O método conhecido como RNA-Seq baseia-se no isolamento de RNA celular (total

ou poli(A)+), conversão do mesmo em uma biblioteca de fragmentos de cDNA ligados a

adaptadores em ambas as extremidades e sequenciamento de cada uma das moléculas usando

uma das técnicas de sequenciamento em larga escala. Os reads resultantes são alinhados a um

genoma referência, resultando em um mapa transcricional em escala genômica que contém

informação tanto da estrutura física dos transcritos quanto do nível de expressão para cada

gene.

O preparo das amostras foi realizado segundo o protocolo Whole Transcriptome

Library Preparation: Low Input for SOLiD™ (Figura 3.2).

49

Figura 3.2. Preparo das bibliotecas de RNA-Seq (SOLID). Fonte: protocolo Whole

Transcriptome Library Preparation: Low Input for SOLiD™.

A partir de 5-25 ng de mRNA poli-A, obtido através da purificação das amostras de

RNA com kit Poly(A) PuristTM

(Applied Biosystems), procedeu-se a fragmentação por RNase

III, utilizando-se 1 μL de RNase III e 1 μL de tampão em um volume final de 10 μL. A reação

foi incubada em um termociclador a 37°C por 3 minutos e interrompida pela adição de 90 μL

de água sem nuclease. O RNA foi purificado através do produto RiboMinus Concentration

Module (Invitrogen).

50

Com o RNA fragmentado, foi feita a hibridização e ligação dos adaptadores em ambas

as extremidades dos fragmentos de RNA usando componentes do kit SOLiDTM

Total RNA-

Seq. Para tal, foram utilizados 2 μL de solução contendo adaptadores, 3 μL de solução de

hibridização e 3 μL de RNA fragmentado. O material foi colocado em um termociclador, a

65°C por 10 minutos e a 16°C por 5 minutos; concomitantemente, foram adicionados 10 μL

de tampão de ligação 2X e 2 μL da mistura da enzima ligase e deixado incubar a 16°C por 16

horas.

Após a ligação dos adaptadores, foi realizada a transcrição reversa, com o

componentes do kit SOLiDTM

Total RNA-Seq. Aos 20 μL da reação de ligação, adicionou-se

11 μL de água sem nuclease, 4 μL de tampão RT 10X, 2 μL de dNTP Mix, e 2 μL de

SOLIDTM

RT Primer, vortexou-se brevemente e incubou-se em um termociclador a 42°C por

30 minutos.

Após o término da reação de transcrição reversa, foi feita a purificação e a seleção por

tamanho do cDNA com o kit Agencourt® AMPure

® XP, onde os fragmentos foram

capturados utilizando beads, lavados e eluídos. Para melhorar a eficiência da purificação esse

processo foi repetido duas vezes, de acordo com as instruções do fabricante.

A amplificação foi realizada em um termociclador através de 18 ciclos de 95°C por 30

segundos, 62°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, sucedidos por incubação a 72°C

por 7 minutos. Finalmente, o material amplificado foi purificado com o kit PureLinkTM PCR

Micro (Invitrogen) e sua concentração final foi analisada com o equipamento NanoDrop.

51

3.3.2.7. Preparo das beads para sequenciamento por PCR de emulsão

As PCRs em emulsão (ePCR) foram realizadas segundo protocolo SOLiD™ 4 System

Template Bead Preparation Guide, mais especificamente para ePCR em mini-escala. A fase

oleosa foi preparada através da mistura de 1,8 mL de estabilizador de emulsão 1, 400 μL de

estabilizador de emulsão 2 e 37,8 mL de óleo de emulsão para um volume final de 40 ml. Na

fase aquosa da emulsão foram combinadas quantidades iguais das amostras de cDNA

amplificado contendo SOLiD™ System Barcodes, para uma concentração final de 0,5 e 1 pM

de DNA molde, os reagentes para ePCR (14 mM dNTP mix, 25 mM Cloreto de Magnésio, 40

nM de ePCR primer 1, 3 μM de ePCR primer 2, 0,54U/μL de AmpliTaq Gold DNA

Polimerase e água livre de nuclease para volume final de 2720 μL) e beads revestidas com

oligo P1 (P1 DNA Bead) para amplificação nos microrreatores. As fases foram emulsificadas

por 5 minutos usando o sistema ULTRA-TURRAX® Tube Drive da IKA®, de forma a gerar

microgotículas de fase aquosa no interior da emulsão, onde ocorre a amplificação clonal do

DNA em torno da P1 DNA Bead durante a ePCR. A emulsão é otimizada para gerar

microrreatores monoclonais (somente uma bead e uma molécula de DNA molde), os quais

podem gerar beads úteis para o sequenciamento. 100 μL da emulsão foram transferidos para

cada um dos poços de uma placa de PCR, onde se seguiu a ePCR: incubação inicial à 95°C

por 5 minutos, 40 ciclos de 93°C por 15 segundos, 62°C por 30 segundos e 72°C por 75

segundos e incubação final a 72°C por 7 minutos. Durante a ePCR, cerca de 30 mil cópias

clonais do DNA molde são geradas em cada P1 DNA Bead, com o adaptador P1 ligado a

bead.

Após a ePCR, os microrreatores na emulsão foram quebrados com 2-butanol e as

beads foram lavadas para eliminar o óleo e emulsificadores. O volume total da emulsão foi

passado para um sistema SOLiD™ Emulsion Collection Tray onde foram adicionados 10 ml

52

de 2-Butanol. Após homogeneização da solução, a mistura foi transferida para um tubo de 50

mL, com 6 mL 2-Butanol e centrifugada a 2200g por 5 minutos. A fase superior foi

descartada e o pellet contendo as beads foi recuperado com 600 µL de 1X Bead Wash Buffer,

passado para tubo de 1,5 ml LoBind e lavado novamente com 1X Bead Wash Buffer e 1X

TEX Buffer.

O enriquecimento das beads foi requerido para isolar as template beads (monoclonais

e policlonais) das beads não amplificadas (não clonais). No enriquecimento foram utilizadas

beads de poliestireno com sequências adaptadoras P2 de fita simples, complementares a

região P2 do adaptador A nas template beads.

O complexo formado pelas template beads mais as beads de poliestireno foi separado

das demais beads por centrifugação em glicerol 60%, isolando na fase superior as beads de

poliestireno não ligadas; na fase intermediária, o complexo formado pelas template beads e as

beads de enriquecimento; e na fase inferior as beads não amplificadas. Este complexo foi

então extraído da solução e desnaturado para a dissociação das template beads das beads de

poliestireno. Ao final, foi retirada uma alíquota de cada amostra para leitura da absorbância

no comprimento de onda de 600nm, de modo a determinar o número de template beads totais

a serem aplicadas em cada poço da lâmina de sequenciamento.

Depois da quantificação, foi realizada uma modificação 3’ terminal para neutralizar a

região P2 das template beads destinadas ao sequenciamento. A reação ocorreu com a adição

de 2’-desoxiuridina 5’-trifosfato (dUTP) pela ação da enzima terminal transferase. Para

validar a qualidade das template beads, determinar a concentração ideal para o

sequenciamento (0,5 e/ou 1,0 pM) e quantificar a eficiência do enriquecimento, foi realizada

uma corrida prévia denominada Workflow Analysis (WFA).

53

Ao final da WFA todas as amostras foram validadas. Com base neste resultado, foram

depositadas em uma nova lâmina, destinada ao sequenciamento. Todos os procedimentos de

utilização do sequenciador SOLiD™ 4 foram realizados conforme o guia “Intrument

Operation Guide”

3.3.2.8. Análise dos dados

As análises de bioinformática foram realizadas em colaboração com o laboratório de

bioinformática da UFAM em Coari. As reads inicialmente foram “trimadas” para eliminar

resíduos de adaptadores. Foram utilizados os programas Bowtie, Thophat e Cufflinks para o

alinhamento e a montagem dos genes utilizando o genoma do Xenopus laevis como

referência. As anotações dos genes foram feitas utilizando o programa BLAST. Os dados de

contagens de reads foram normalizados e analisados para expressão diferencial usando

programa R Versão 3.0.1, considerando o nível de significância de 0,05. Além disso, foi

usado o valor de alteração absoluta Log2FC (fold-change) de 1,5 vezes como critério

biológico para seleção de genes diferencialmente expressos. Os valores do Log2FC foram

utilizados para medir o nível de expressão entre controle e tratamento, sendo que valores

negativos de Log2FC referem-se a genes subexpressos e valores positivos de Log2FC referem-

se a gene sobre-expressos.

Após as análises iniciais de bioinformática, os genes foram categorizados utilizando o

programa Gene Ontology (AmiGO, versão 1.8). O GO (www.geneontology.org) utiliza uma

nomenclatura sistemática e padronizada para a anotação de genes em vários organismos. O

GO é dividido em três categorias que refletem aspectos conservados da biologia: processos

biológicos, componentes celulares e funções moleculares. Estes vocabulários contêm uma

54

estrutura hierárquica de termos (subcategorias) designados para descrever o que o produto de

um dado gene faz e onde está localizado na célula.

Para análise dos termos de ontologia gênica (gene Ontology, GO) foram considerados

válidos apenas os genes com p ≤ 0,05 e Log2FC ≥ 1,5 (para genes com a expressão aumentada

em relação ao controle) e Log2FC ≤ -1,5 (para genes com a expressão reduzida em relação ao

controle).

3.3.3. RESULTADOS

3.3.3.1. Caracterização do ambiente

A nascente do Igarapé do Quarenta ainda apresenta características naturais para águas

pretas, como pH baixo, entre 3,2 e 5,6, oxigênio dissolvido de 7,28 mg/L, concentrações de

magnésio e de cálcio em torno de zero, concentrações de sódio em torno de 0,3 mg/L, de

potássio abaixo de 8,4 mg/L e alcalinidade menor que 3,05 mg/L (Melo et al. 2005)

Podemos observar na tabela 3.1 que, nos pontos de coleta, os valores de pH estão

acima dos encontrados em sua nascente, também podemos observar uma redução nas

concentrações de oxigênio dissolvido no igarapé e em todas as poças. A concentração de

cobre está acima da recomendada pela resolução no. 357 do CONAMA que é de 9 µg/L, com

exceção a poça numero 5.

3.3.3.2. Análise da expressão gênica

Após o alinhamento e a montagem dos genes utilizando o genoma do Xenopus laevis

como referência, obtivemos 5.067 genes (3.129 genes com aumento de expressão no

55

tratamento em relação ao controle e 1.938 genes com redução da expressão no tratamento em

relação ao controle).

Para análise dos termos de ontologia gênicas (Gene Ontology, GO) foram

considerados válidos apenas os genes com p ≤ 0,05, e Log2FC ≥ 1,5 (para genes com a

expressão aumentada em relação ao controle) e Log2FC ≤ -1,5 (para genes com a expressão

reduzida em relação ao controle), totalizando 135 genes (84 com expressão aumentada e 51

com expressão reduzida no tratamento em relação ao controle).

56

Tabela 3.1. Características fisico-químicas da água nos pontos de coleta. 1- Igarapé

do Quarenta. 2 a 5 – Poças próximas às áreas onde os adultos de Scinax ruber foram

coletados. Valores expressos como média ± desvio padrão da média.

1 2 3 4 5

Ph 7,11±0,41 6,38±0,23 6,73±0,31 6,5±0,37 7,03±0,28

Oxigênio

(mg/L)

1,02±0,09 0,72±0,03 1,65±0,07 1,25±0,1 1,57±0,06

Temperatura

(oC)

27,5±0,35 28,3±0,29 27,3±0,42 27,2±0,27 27,2±33

Fosfato

(mg/L)

0,115±0,02 1,510±0,04 0,350±0,02 0,412±0,03 0,051

Amônia

(mg/L)

0,225±0,01 0,558±0,03 0,466±0,01 0,756±0,02 0,207±0,01

Nitrato

(mg/L)

0,570±0,03 0,010 0,140±0,015 0,013 0,031

Nitrito

(mg/L)

0,44±0,04 < 0,03 0,16±0,012 <0,03 <0,03

COD (mg/L) 11,5±0,12 18,2±0,62 9,22±0,27 9,49±0,12 12,19±0,03

Cobre (µg/L) 12,56±0,9 35,14±0,54 13,09±0,32 15,27±0,20 4,95±0,63

Cada um desses genes foi analisado separadamente para encontrar uma relação do

aumento ou diminuição de sua expressão com os desafios ambientais encontrados no igarapé

do Quarenta. Observamos um aumento de 197,7 vezes na expressão do gene ERGIC3 (p=

0,0006; Log2FC = 7,6), de 54,7 vezes na expressão do gene IGF1R (p= 0,035; Log2FC = 5,8),

de 60,7 vezes na expressão do gene PDCD6IP e de 54,7 vezes na expressão do gene FANCM

(p =0,034; Log2FC =5,8) no fígado de machos adultos de Scinax ruber encontrados no igarapé

57

do Quarenta em relação aos encontrados na reserva Florestal Adolfo Ducke, uma área

comprovadamente livre de contaminantes. Esses genes estão relacionados com formação de

tumores cancerígenos e com o sistema de reparo celular.

Em relação aos termos do Gene Ontology observamos um aumento na expressão dos

genes relacionados a processos de oxidorredução e processos metabólicos (Figura 3.3A) e de

genes relacionados à membrana célula (Figura 3.5A), e uma redução na expressão de genes

relacionados à regulação da transcrição (Figura 3.3B), à ligação no DNA (Figura 3.4B) e de

genes relacionados ao núcleo (Figura 3.5B).

58

Figura 3.3. Representação dos 10 principais termos do GO que resultaram dos genes

com aumento da expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria Processo

Biológico, no tratamento em relação ao controle.

Processos de oxidorredução;

10% Desenvolvimento

do organismo multicelular; 8%

Processos metabólicos ; 8%

Tradução; 5%

Fosforilação de proteínas; 5%

Proteólise; 5% Importação de

proteínas para o núcleo,

acoplamento; 3%

Modificação do RNAr; 3%

Processo metabólico dos

carboidratos; 3%

Transferência de elétrons; 3%

Outros ; 50%

A

Regulação da trancrição, DNA-templated; 35%

Transporte; 6%

Crescimento; 3%

Transporte de eletrons; 3%

Tradução de sinal; 3%

Organização do citoesqueleto; 3%

Processo de modificação da proteína celula; 3%

Posforilação de proteínas; 3%

Desfosforilação de proteínas; 3%

Proteólise; 3%

Outros; 32%

B

59

Figura 3.4. Representação dos os 10 principais termos do GO que resultaram dos

genes com aumento da expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria

Função Molecular, no tratamento em relação ao controle.

Ligação ao ATP; 4%

Ligação ao nucleotideo; 4%

Ligação ao ácido nucleico; 4% Ligação ao

DNA; 4%

Atividade transdutor de

sinal; 2%

Ligação ao ínos ferro; 2%

Ligação a proteína; 2%

Ligação ao íon zinco;

2%

Atividade da ATPase;

2%

Atividade nucleosídeo-

triphosphatase ; 2%

Outros; 83%

A

Ligação ao DNA; 14%

Atividade do factor de transcrição de

ligação a sequência especifica de DNA ;

11%

Ligação ao ácido nucleico; 5%

Ligação a actina; 5%

Ligação ao ion zinco; 5% Atividade de

Oxidoredutase, atuando no NADPH; 5%

Atividade catalitica; 3%

Ligação a proteína; 3% Ligação ao ATP; 3%

Atividade reguladora da

miosina fosfatase; 3%

Outros; 45%

B

60

Figura 3.5. Representação dos 10 principais termos do GO que resultaram dos genes

com aumento da expressão (A) e com diminuição da expressão (B), para a categoria

Componente Celular, no tratamento em relação ao controle.

Membrana; 23%

Núcleo; 20%

Citoplasma; 10% Intracelular; 7%

Componente intregral da

membrana; 7%

Região extracelular; 3%

Poro nuclear; 3%

Complexo proteina G heterotrimérica;

3%

Ribossomo ; 3%

Citoesqueleto; 3%

Outros; 17%

A

Núcleo; 36%

Membrana; 6% Cromatina; 3%

Região extracelular;

3%

Intracelular; 3%

Citoplasma; 3%

Componente integral da

membrana; 3%

Complexo de proteina Kinase dependente de

calcio e calmodulina; 3%

Complexo proteína serina/treonina

fosofatase dependente de magnésio; 3%

protein serine/threonine

phosphatase complex; 3%

Outros; 8%

B

61

3.3.4. DISCUSSÃO

O aumento do pH e a redução do oxigênio dissolvido foram observados na amostra

coletada no igarapé e em todas as amostras de água coletadas nas poças, esse efeito está

relacionado à decomposição da matéria orgânica presente nos esgotos domésticos. A amostra

de água número 5 possui o menor valor de cobre, o que seria esperado, já que por sua

distância da margem ela não sofre influência do igarapé (Tabela 3.1); porém, possui baixas

concentrações de oxigênio dissolvido e pH mais alto do que os encontrados em igarapés não

contaminados, provavelmente, pela contaminação do solo onde essa poça se formou. Silva et

al. (1999) encontraram grandes concentrações de Cd, Co, Cu, Cr e Ni nos sedimentos do

igarapé do Quarenta, proveniente dos efluentes do Distrito Industrial.

Além dos contaminantes medidos no presente trabalho, uma série de outros poluentes

podem estar presentes nesse igarapé, como, por exemplo, pesticidas, remédios eliminados

diretamente nas redes de esgotos e substâncias químicas descartadas pelas indústrias. Esses e

outros compostos podem afetar de forma negativa os anuros que vivem nas margens dos

igarapés.

Os compostos químicos podem ser absorvidos pela pele e boca dos anfíbios, atingindo

a circulação sanguínea e se distribuindo pelo organismo. Após a absorção, são

biotransformados, processo por meio do qual novos compostos químicos de características

distintas do composto inicial são formados. Esses compostos secundários são mais

hidrossolúveis, facilitando a sua excreção e diminuindo sua toxicidade (Nascimento 2008).

As reações de biotransformação são catalisadas por um diversificado número de

enzimas, das quais a citocromo P450 é a mais importante. É uma superfamília de sistemas

enzimáticos, encontrada principalmente no fígado, ligada às membranas no retículo

endoplasmático liso. A citocromo P450 é uma hemoproteína que se liga tanto a xenobióticos

62

como ao oxigênio molecular e catalisa a transferência de um átomo de oxigênio ao substrato

enquanto o outro é reduzido (processo de oxido redução) (Nascimento 2008). Essas reações

explicam o aumento da expressão de genes relacionados a processos de oxidorredução e a

processos metabólicos (Figura 3.3A) e, também, o aumento da expressão dos genes

relacionados à membrana plasmática (Figura 3.5A). Resultados similares formam obtidos por

(Lemgruber et al. 2013), ao estudar peixes expostos a diferentes concentrações de

benzo(a)pireno e fenantreno. A citocromo P450 também tem papel importante na bioativação e

na inativação de substâncias cancerígenas, podendo aumentar as chances de o indivíduo

desenvolver tumores malignos (Rodriguez-Antona e Ingelman-Sundberg 2006).

No presente estudo também observamos um aumento na expressão dos genes

ERGIC3, IGF1R e PDCD6IP, no fígado dos anuros coletados nas margens do Igarapé do

Quarenta. O aumento da expressão desses genes parece estar ligado a processos que

estimulam o crescimento e a viabilidade das células tumorais. Esses efeitos têm sido relatados

em diferentes variedades de tumores cancerígenos em mamíferos, incluindo

hepatocarcinomas, câncer de pulmão e mama (Bianconi et al. 2012; Zhang et al. 2012; Yu et

al. 2013)

O ERGIC3 codifica a ERGIC3 (proteína do compartimento intermediário entre

retículo endoplasmático-Golgi 3), proteína integral da membrana que circula entre o retículo

endoplasmático e o Golgi (Otte e Barlowe 2002; Breuza et al. 2004)

Wu et al. (2013) observaram um aumento na expressão da proteína ERGIC3 em

células cancerígenas de pulmão em humanos, em comparação com células normais

adjacentes. ERGIC3 foi positiva em 89 % dos tumores testados. O aumento da expressão de

ERGIC3 promoveu a proliferação e a migração celular, eventos essenciais durante a

carcinogênese e invasão cancerosa.

63

Zhang et al. (2012) observaram que o aumento da expressão de ERGIC3 estimulou a

viabilidade celular, formação de colônia, migração e habilidade de invasão das células do

hapatocarcinoma humano, comparado com células normais adjacentes. O mecanismo por trás

desse processo pode ser observado na Figura 3.6, onde o aumento da expressão do MicroRNA

(miRNA) miR-490-3p estimulou o crescimento das células do hepatocacionoma, por meio do

aumento da expressão do ERGIC3. ERGIC3 e miR-490-3p também contribuíram para a

invasão celular através da indução da transição epitélio-mesenquimal (EMT) (Zhang et al.

2012).

Figura 3.6. Modelo simplificado da regulação do ERGIC3 por miR-490-3p em células

do hepatocarcinoma humano (HCC). miR-490-3p regula positivamente a expressão de

ERGIC3 e estimula a proliferação celular; ERGIC3 promove o EMT, resultando na migração

e invasão. Fonte: Zhang et al. (2012) com modificações.

64

Utilizando a técnica de hibridização genômica comparativa (CGH), extensivamente

utilizada para a identificação das alterações genéticas associadas ao câncer e que permite a

análise de alterações do número de cópias de DNA de todo o genoma, Brim et al. (2014)

concluíram que em células tumorais do câncer colorretal em humanos ocorreu uma

amplificação do numero de cópias de ERGIC3 refletindo em um número maior de proteínas

expressas.

O IGF1R codifica a IGF1R (receptor do fator de crescimento insulina-simile 1), uma

proteína transmembranar do receptor de tirosina-quinase, pertencente à família HER

(Mitsudomi e Yatabe 2010). O aumento da expressão do gene IGF1R parece estar

relacionado com o aumento da sobrevivência das células tumorais. Os níveis plasmáticos

elevados de IGF1R têm sido associados com o aumento do risco de câncer (Kiely et al. 2002;

Bianconi et al. 2012). Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a IGF1R tem

sido desenvolvidos para tratamento de câncer em humanos. Ao se ligar a IGF1R o anticorpo

inibe as funções de proliferação e sobrevivência em células cancerígenas, confirmando assim

o importante papel que esta proteína tem no desenvolvimento dos tumores (Maloney et al.

2003; Gong et al. 2009).

O gene PDCD6IP (Proteína de interação da morte celular programada 6) está

envolvido numa variedade de eventos biológicos que incluem a morfogênese, manutenção da

homeostase do tecido e eliminação de células nocivas (Sun e Peng 2009). Disfunções nessas

vias conduzem a vários tipos de cânceres. O produto do gene PDCD6IP liga-se ao produto do

gene PDCD6, uma proteína necessária para a apoptose celular, de um modo dependente de

cálcio, impedindo que ocorra a morte celular (Missotten et al. 1999). O produto desse gene se

liga a proteínas que regulam a forma da membrana celular, durante a endocitose e resulta em

vascularização citoplasmática que pode ser, em parte, responsável pela proteção contra a

65

morte celular (Chatellard-Causse et al. 2002). Em humanos, o aumento da expressão do gene

PDCD6IP esta relacionado com o aumento na probabilidade de se desenvolver

hepatocarcinomas. Essa relação foi observado por Yu et al. (2013) por meio do estudo dos

polimorfismos da região promotora em células tumorais. Em resumo, o gene PDCD6IP

quando superexpresso tem um efeito protetor nas células cancerígenas, evitando que estas

entrem em apoptose e sejam destruídas, aumentando assim as chances de propagação do

tumor.

O aumento da expressão de um determinado gene pode estar relacionado com o

aumento do número de cópias do gene dentro do genoma (Brim et al. 2014) ou com mutações

na sua região promotora (Yu et al. 2013). Mutações em diferentes regiões do genoma podem

provocar um aumento, diminuição, ativação ou desativação da expressão de um gene,

podendo levar a célula a se dividir de forma descontrolada, gerando um tumor maligno. Tais

genes quando ativados são chamados de oncogenes. As células cancerígenas vão substituindo

as normais, sendo que os tecidos invadidos vão perdendo a função, já que são menos

especializadas (Risch e Plass 2008).

Também observamos um aumento significativo na expressão do gene FANCM em

anuros encontrados nas margens do igarapé do Quarenta em relação ao controle. Esse gene

codifica a proteína FANCM (Anemina de Falconi, grupo de complementação M), uma

proteína essencial para a via de estresse replicativo (Schwab et al. 2010).

A manutenção da integridade da forquilha de replicação é de vital importância para a

divisão celular em face do estresse genotóxico causado por agentes endógenos e exógenos,

que podem conduzir a forquilha a um colapso. Lesões no DNA ou em regiões do genoma

podem bloquear ou dificultar a replicação do DNA. Em resposta à estagnação da forquilha de

replicação, a célula ativa a via de resposta ao estresse replicativo, que age para proteger a

66

forquilha do colapso, promovendo a reparação ou o desvio do bloqueio e facilitando a

retomada da síntese de DNA (Collis e Boulton 2010). Isso não só garante a replicação precisa

do DNA, mas também impede a instabilidade genômica, um fator causal reconhecido no

desenvolvimento de tumores. Em humanos, distúrbios genéticos que interferem no

funcionamento dessa via estão relacionados a uma elevada predisposição ao câncer (Deans e

West 2009; Vinciguerra e D’ Andrea 2009)

Uma série de trabalhos relatam a possível utilização do genes ERGIC3, IGF1R e

PDCD6IP como bioindicadores de tumores em mamíferos (Bianconi et al. 2012; Zhang et al.

2012; Yu et al. 2013); porém, em anfíbios não encontramos nenhum trabalho envolvendo

esses genes. A raridade do câncer espontâneo em anfíbios, e a dificuldade de induzir câncer

nestes animais, sugerem que eles possuam um sistema eficaz de resistência ao câncer. Por

esse motivo tem crescido, no meio científico, o interesse por estudos oncológicos nesse grupo

(Ruben et al. 2013). A compreensão dos mecanismos de resistência dos anfíbios ao câncer

pode ajudar no desenvolvimento de novos tratamentos.

Diferenças nos mecanismos de apoptose e de reparo celular podem explicar a maior

resistência dos anfíbios ao câncer. O período de reparo do DNA, mais lento em anfíbios, em

comparação com os mamíferos, pode permitir uma reparação mais precisa da cadeia de DNA

e um tempo maior para que ocorram eventos apoptóticos, que, no caso dos anfíbios, ocorre de

forma mais precoce que nos humanos, chamada de apoptose direta. Esses mecanismos

evoluíram nos anfíbios como forma de auxiliar no processo de metamorfose durante o

desenvolvimento da larva em juvenil (Ruben et al. 2013).

O aumento de 54,7 vezes na expressão do gene FANCM, no fígado de anuros expostos

a um igarapé contaminado em comparação aos coletados em ambiente não contaminado, pode

estar relacionado à reparação eficaz de danos no DNA, causados por agentes exógenos ou por

67

erros durante a replicação do DNA, servindo de proteção contra a formação de células

mutantes que venham a se transformar em tumores malignos.

O aumento da expressão desses genes não significa necessariamente que os anuros

coletados no igarapé contaminado desenvolveram ou irão desenvolver tumores cancerígenos,

para isso, estudos envolvendo análises histológicas devem ser realizados. O que podemos

concluir é que o aumento da expressão dos genes ERGIC3, IGF1R e PDCD6IP tornam esses

anuros mais suscetíveis a desenvolver tumores malignos e que esse efeito pode estar sendo

provocado por agentes genotóxicos externos ou por poluentes que provoquem danos à cadeia

de DNA. O aumento da expressão do gene FANCM, e de genes relacionados a processos de

oxidorredução, demonstram uma provável ativação de sistemas de defesa celular contra

agentes externos.

68

4. CONCLUSÕES GERAIS

a) Os estadios 19, 20 e 21 de Gosner (relacionados ao aparecimento das brânquias

externas) são os mais vulneráveis ao cobre e a fase de ovo é a mais resistente.

b) A CL50 -96h dos girinos de Rhinella granulosa, dos girinos de Scinax ruber e dos

ovos de Scinax ruber em águas pretas da Amazônia, contaminadas com cobre, foram 23,48;

36,37 e 50,02 µg Cu L-1

, respectivamente.

c) No caso de contaminação por cobre, os igarapés naturais devem receber atenção

especial, dado que a CL50 observada foi menor nesses ambientes.

d) A concentração subletal de 30 µg/L de cobre (82,5% da CL50-96h) não teve efeito

sobre o comprimento, duração do período larvário, taxa de crescimento e massa corporal nos

girinos de Scinax ruber, expostos de forma crônica a partir do estádio 25 de Gosner.

e) A identidade da desova foi significativa em relação a todos os parâmetros testados,

mostrando uma variação intrapopulacional que deve ser considerada em estudos

ecotoxicológicos, evitando super ou subestimar os efeitos do contaminante.

f) A exposição prolongada aos contaminantes encontrados nas margens do igarapé do

Quarenta induziram, no fígado dos machos adultos de Scinax ruber, um aumento na expressão

dos genes envolvidos nos processos de oxidorredução e um aumento de 197,7 vezes na

expressão do gene ERGIC3, de 54,7 vezes na expressão do gene IGF1R, e de 60,7 vezes na

expressão do gene PDCD6IP em relação ao controle. Esses genes estão relacionados ao

crescimento, viabilidade, migração, formação de colônias e na capacidade de invasão das

células tumorais. Também foi observado um aumento de 54,7 vezes na expressão do gene

FANCM no tratamento em relação ao controle, esse gene codifica a proteína FANCM, uma

proteína essencial no sistema de reparo de danos no DNA.

69

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6. ANEXO

6.1. Artigo publicado no periódico Acta Amazonica, doi: 10.1590/4392201400383.

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