Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia INPA Programa de … · 2016-09-13 · Amazonas –...

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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA

Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva -

GCBEv

Composição, abundância, diversidade e mapeamento cromossômico de DNA

repetitivo em ciclídeos neotropicais utilizando dados de sequenciamento de

nova geração

Edika Sabrina Girão Mitozo Tavares

MANAUS – AM

2016

ii

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA

Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva -

GCBEv

Composição, abundância, diversidade e mapeamento cromossômico de DNA

repetitivo em ciclídeos neotropicais utilizando dados de sequenciamento de

nova geração

Edika Sabrina Girão Mitozo Tavares

Projeto apresentado ao Instituto

Nacional de Pesquisas na Amazônia

como parte dos requisitos para obtenção

do título de Mestre em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva.

Orientador: Carlos Henrique Schneider, Dr.

Coorientador: Cesar Martins, Dr.

Fontes Financiadoras: FAPEAM/ CNPq/ Fapesp

MANAUS – AM

2016

iii

T231c Tavares, Edika Sabrina Girão Mitozo

Composição, abundância, diversidade e mapeamento cromossômico de

DNA repetitivo em ciclídeos neotropicais utilizando dados de

sequenciamento de nova geração / Edika Sabrina Girão Mitozo Tavares. ---

Manaus : [s.n.], 2016.

xvii, 90f. : il., color.

Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2016.

Orientador: Carlos Henrique Schneider.

Coorientador: Cesar Martins .

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

1. Mapeamento cromossômico. 2. Ciclídeos Neotropicais. 3. Peixes –

água doce.

I Título

CDD

639.309

Sinopse:

Análise da composição da fração repetitiva genômica de quatro

espécies de ciclídeos neotropicais amazônicos a partir de dados de

sequenciamento de nova geração e mapeamento cromossômico

comparativo de elementos transponíveis (L2, R4/Dong, RTE e Tc1) entre

as espécies com suporte de sequências nucleotídicas. As análises

evidenciaram ampla diversidade de elementos repetitivos na composição

genômica em ciclídeos neotropicais e diferentes padrões de organização

cromossômica de elementos transponíveis.

Palavras-chave: composição genômica, DNA repetitivo e

transponível, FISH

FICHA CATALOGRÁFICA

iv

Dedico essa dissertação aos meus pais

Edil e Cássia, ao meu amor Paulo e à

todos que acreditaram, confiaram e

participaram dessa conquista.

v

“Para achar a solução? Continue a nadar”

Dory, Procurando o Nemo

vi

A realização deste projeto foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva, do INPA.

Ao Laboratório de Citogenômica da UFAM, Departamento de Genética, onde

a maior parte deste trabalho foi desenvolvida, com financiamento proporcionado pela

Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM FIXAM 017/2014).

Aos laboratórios Genômica Integrativa da Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho” – Botucatu/SP, onde análises do Repeat Explorer foram

realizadas e ao Laboratório de Tecnologias de DNA da Universidade Federal do

Amazonas – Manaus/AM, onde as clonagens dos DNAs transponíveis foram

desenvolvidas.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pela concessão

da bolsa de estudo (Projeto 007/2014) durante a realização deste trabalho.

vii

Agradecimentos

Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou indiretamente,

possibilitaram a realização deste trabalho.

Aos meus amados pais Edil Tavares e Cássia Mitozo, que sempre com muito

amor e carinho, me deram o suporte necessário para o meu desenvolvimento, me

ensinando a fazer sempre o meu melhor e que, para mim, são fontes de inspiração e

admiração. À minha mãe, que com seu amor e ternura, sempre tolerou a pior parte

de mim e mesmo assim continuava sendo sempre gentil e bondosa. Ao meu pai, que

nunca limitou minhas decisões e sempre me apoiou cegamente em todas elas. Aos

meus irmãos que com orgulho falam de mim. Amo todos vocês, minha família.

Ao meu grande amor Paulo Rodrigues, sem o qual muitas vezes teria

desistido. Agradeço por sempre acreditar no meu potencial e por inúmeras vezes me

convencer que eu conseguiria. Por ser um cara fantástico, o qual me motiva

cotidianamente e me lembra do valor que tenho, mesmo quando esqueço. Por ser

alguém que incansavelmente me instiga a ser grande, especialmente na minha

profissão e que ensinou, com seu próprio exemplo, que não há limites quando se

tem um sonho e o quer de verdade. Agradeço também por ser sempre tão amoroso

e carinhoso comigo, mesmo nos dias difíceis, por sempre me fazer rir como suas

brincadeiras inusitadas, me poupando de cair na rotina e por sempre fazer eu me

sentir especial. Amo você.

Ao meu excelentíssimo orientador, Doutor Carlos Schneider, que antes de

tudo foi um impulsionador da minha carreira acadêmica e a quem sempre serei grata

por ter acreditado em mim. Carlão, mano, você é um orientador extraordinário e eu

não poderia ter feito melhor escolha ao decidir trabalhar com você, ou o contrário

hahahaha, fato que é um grande privilégio para mim. Você é muito mais que um

orientador, é um pai acadêmico que de forma muita sábia sabe conduzir pelo

caminho certo e sempre me instiga a pensar mais. É alguém: em quem se pode

confiar, com quem se tem prazer em trabalhar, que estimula e dá ânimo, que

convence de forma gentil e respeitosa e prova que existem pessoas brilhantes no

meio cientifico. Quero muito ser como você um dia!

À Doutora Maria Claudia, que mesmo não sendo oficialmente ligada a mim,

emocionalmente assumiu esse posto, me recebendo de braços abertos, sempre me

viii

dando suporte, sendo provedora e fornecendo ajuda quando precisei. Você é

fantástica e jamais esquecerei toda ajuda que me deu, sem olhar pra trás e sem

nem me conhecer tão bem. O mundo precisa de mais Marias-Cláudias para ser um

lugar melhor.

Ao Dr. Cesar Martins, que abriu as portas de seu laboratório e concordou em

ser meu co-orientador, participando desse trabalho da melhor forma possível.

À Érica Ramos, que forneceu grandes contribuições nesse trabalho.

Aos meus amigos do LACA, sem os quais eu não teria conseguido: Nathy, a

quem devo um agradecimento especial por ter toda a paciência e zelo de me ensinar

tudo o que eu precisava saber de bancada e fora dela, e que sempre se apresenta

prestativa e disposta a ajudar, dando sempre o melhor de si; ao Léo, cujas

conversas são sempre agradáveis, instigantes e carregadas de ensinamentos

valiosos e que muitas vezes mudaram minha forma de pensar e acrescentaram

conhecimento que carregarei sempre comigo; Francy (minha patroa), que com seu

jeito divertido e espontâneo, faz todo dia ser mais legal; Francy (minha patroa), que

com seu jeito divertido e espontâneo, faz todo dia ser mais legal (a repetição não foi

um erro!); Sabrina (minha querida xará), com a qual vivi experiências exclusivas e a

quem tenho muito respeito e admiração; Érika, que com seu jeito todo meigo e gentil

me ajudou nessa conquista; Marcos, com quem sempre pude contar, mesmo em

cima da hora; Phamela, que conquistou seu espaço e nos alegra com sua presença,

especialmente nas tardes de conversa; Vanessa Pinheiro, que com seu jeito

carinhoso sempre busca estar de boa com tudo e com todos. Agradeço a todos

vocês.

Ao doutorando Edson, que nos auxiliou com as clonagens e o fez com muito

zelo.

Às minhas queridas amiga Israela e Paola, sem as quais eu não teria nem me

graduado, nem feito a seleção do mestrado, nem conseguido várias outras

conquistas. Meninas eu estaria bem perdida sem vocês. Agradeço por fazerem parte

disso ao ouvirem minhas queixas e alegrias, me auxiliarem nas minhas indagações

e estarem sempre comigo em todas as circunstâncias. Vocês são demais!

ix

Resumo

Os ciclídeos apresentam diferentes adaptações morfológicas, ecológicas e

comportamentais, promovendo sua adaptação em diversos ambientes ao longo da

evolução. Essa diversidade é refletida na composição citogenômica do grupo, que

apresenta disparidade na fórmula cariotípica e número diploide entre espécies

próximas filogeneticamente. As diferenças na composição e estrutura cariotípica

dessas espécies estão diretamente relacionadas à fração repetitiva do genoma, pois

correspondem à maior parte, e favorecem eventos de rearranjo cromossômico, que

podem ser observados pela técnica de hibridização fluorescente in situ. O

mapeamento físico cromossômico de ciclídeos neotropicais amazônicos limita-se a

elementos pontuais que são os principais alvos de estudos citogenéticos, como os

retroelementos não-LTR da família Rex e DNAs ribossomais. Contudo, outros

participantes da porção repetitiva do genoma ainda não foram mapeados até o

presente estudo. Além disso, estudos em ciclídeos africanos, grupo filogenético

irmão dos neotropicais, indicam que a composição genômica repetitiva dessas

espécies é muito mais abrangente. Graças à recente disponibilidade do

sequenciamento genômico de machos e fêmeas das espécies amazônicas Cichla

vazzoleri, Astronotus ocellatus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus, o

presente estudo identificou, a partir de uma pequena fração do genoma total destas

espécies, outras classes de elementos repetitivos a fim de mapeá-los nos

cromossomos. Os elementos repetitivos identificados foram repetições simples e

DNA satélites, além de diferentes classes de retrotransposons não-LTRs do tipo

LINE, retrotransposons LTRs do tipo ERV e transposons do tipo Tc1. Além disso, foi

possível identificar a estimativa da proporção genômica e relacionar a abundância

do número de cópias de cada elemento com a filogenia do grupo hospedeiro,

fornecendo dados preliminares sobre a participação de transponíveis na evolução. A

partir dessa abordagem inicial, foram selecionados os elementos transponíveis mais

abundantes para serem utilizados como sondas no mapeamento físico

cromossômico: retrotransposons não-LTRs lines L2, RTE e Dong.R4 e o transposon

Tc1. As marcações foram conspícuas e dispersas e não se restringiram às regiões

de heterocromatina. Algumas peculiaridades foram observadas, como a do

retroelemento L2 em Astronotus ocellatus, cujas marcações foram majoritariamente

x

conspícuas nas regiões centroméricas e terminais, com exceção do par

cromossômico 10 que apresentou fortes marcações dispersas ao longo de todo o

segmento cromossômico. Uma investigação adicional foi realizada a fim de

identificar possíveis variações dos elementos utilizados como sondas, pela técnica

de clonagem in vivo. De maneira geral, as sequências são relativamente

conservadas, apresentando alto grau de identidade entre si. Dados genômicos dos

elementos transponíveis combinado ao mapeamento cromossômico e análise

comparativa de suas sequências nucleotídicas fornecem dados preliminares sobre a

participação na composição, organização e evolução citogenômica de ciclídeos

neotropicais amazônicos.

xi

Abstract

Cichlids have different morphological, ecological and behavioral adaptations,

promoting their adaptation in different environments throughout evolution. This

diversity is reflected in the composition of cytogenomics group, which shows disparity

in karyotype formula and diploid number of phylogenetically related species. The

differences in composition and structure variations of these species are directly

related to the repetitive fraction of the genome, since they correspond to most of the

genome, and promotes chromosomal rearrangement events that can be observed by

fluorescent in situ hybridization technique. Chromosome physical mapping of

neotropical amazonian cichlid limited to specific elements that are the main targets of

cytogenetic studies, such as non-LTR retrotransposons Rex and ribosomal DNA

family. However, other participants in the repetitive portion of the genome have not

yet been mapped until this present study. In addition, studies in African cichlids,

brother phylogenetic group of neotropical, indicate that repetitive genomic

composition of these species is much broader. Thanks to the recent availability of

genomic sequencing of males and females of Amazonian species Cichla vazzoleri,

Astronotus ocellatus, Pterophyllum scalare and Symphysodon discus, this study has

identified, from a small fraction of the total genome of these species, other classes of

repetitive elements in order to map them on chromosomes. The repetitive elements

were identified as simple repeat and satellites DNA, and different classes of non-

LTR retrotransposons LINE-like, LTR retrotransposons ERV-like and transposons

Tc1-like. Moreover, it was possible to identify the proportion of each element in

genomic sample used and relate the abundance of the number of copies of each

element with the phylogeny of the host group, providing preliminary data on the

participation of transposable throughout evolution. From this initial approach, the

transposable elements more abundant were selected for use as probes in

chromosomal physical mapping: retrotransposons non-LTR lines L2, RTE and

Dong.R4 and transposons Tc1. The markings were conspicuous and widespread and

not restricted to regions of heterochromatin. Some peculiarities were observed, such

as retroelement L2 in Astronotus ocellatus, whose markings were mostly

conspicuous in the centromeric and terminal regions, with the exception of

chromosome pair 10 which showed strong marks scattered throughout the

chromosome segment. Further investigation was conducted to identify possible

xii

variations of elements used as probes, the technique of in vivo cloning. In general,

the sequences are relatively conserved, showing high degree of identity each other.

Genomic data of transposable elements combined with its chromosomal mapping

and their comparative nucleotide sequences provide preliminary data on the

participation in the composition, organization and cytogenomics evolution of

neotropical Amazonian cichlids.

xiii

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................. 18

1.1 Ciclídeos como modelo de estudos comparativos ........................................ 18

1.2 DNA repetitivo e Elementos transponíveis .................................................... 21

1.3 Sequenciamento de nova geração no estudo de elementos transponíveis .. 25

1.4 Mapeamento físico cromossômico ................................................................ 26

1.5 Justificativa ................................................................................................... 27

1.6. Objetivo Geral .............................................................................................. 27

1.6.1 Objetivos Específicos ........................................................................ 27

2. Material e Métodos ................................................................................................ 28

2.1 Coleta das amostras ..................................................................................... 28

2.2 Extração de ADN e Sequenciamento de Nova Geração............................... 28

2.3 Preparação cromossômica ........................................................................... 30

2.4 Identificação de elementos transponíveis ..................................................... 30

2.5 Primers e amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) ............ 31

2.6 Clonagem ...................................................................................................... 33

2.7 Hibridização fluorescente in situ (FISH – Fluorescence in situ hybridization)34

2.7.1 Tratamento das lâminas .................................................................... 34

2.7.2 Fixação .............................................................................................. 34

2.7.3 Pré-hibridização ................................................................................. 35

2.7.4 Solução de hibridização ..................................................................... 35

2.7.5 Hibridização ....................................................................................... 35

2.7.6 Lavagens ........................................................................................... 35

2.7.7 Detecção ........................................................................................... 35

2.7.8 Montagem das lâminas ...................................................................... 36

2.8 Processamento microscópico ....................................................................... 36

3. Resultados e Discussão ........................................................................................ 36

3.1 Artigo 1: Composição e Representatividade de Elementos Repetitivos no

Genoma de Ciclídeos Neotropicais ..................................................................... 37

3.1.1 Introdução .......................................................................................... 37

3.1.2 Material e Métodos ............................................................................ 40

3.1.2.1 Extração de DNA e Sequenciamento de Nova Geração .......... 40

xiv

3.1.2.2 Identificação de elementos transponíveis ................................ 41

3.1.3 Resultados ......................................................................................... 42

3.1.3.1 Diferença de 500 reads entre as espécies ............................... 45

3.1.3.2 Diferença de 500 reads entre os sexos da mesma espécie ..... 48

3.1.3.3 Altamente representativo em uma das espécies ...................... 48

3.1.4 Discussão .......................................................................................... 49

3.1.4.1 Diferença na composição genômica entre as espécies ........... 50

3.1.4.1.1 Retrotransposons não LTR ................................................ 50

3.1.4.1.2 Transposons ...................................................................... 52

3.1.4.2 Diferença na composicão genômica entre os sexos da mesma

espécie ................................................................................................. 52

3.1.4.2.1 Transposons e Retrotransposons não LTR ....................... 53

3.1.4.2.2 Repetições simples............................................................ 54

3.1.4.3 Altamente Representativo em uma das Espécies .................... 54

3.1.4.3.1 Retrotransposons não LTR ................................................ 54

3.1.4.3.2 Retrotransposos LTR ......................................................... 54

3.2 Artigo 2: Composição, Diversidade e Mapeamento Cromossômico de

Elementos Transponíveis no Genoma de Ciclídeos Neotropicais ...................... 56

3.2.1 Introdução .......................................................................................... 56

3.2.2 Material e Métodos ............................................................................ 58

3.2.2.1 Preparação cromossômica ....................................................... 58

3.2.2.2 Extração de DNA e amplificação por reação em cadeia da

polimerase (PCR) ................................................................................. 59

3.2.2.3 Clonagem, sequenciamento e análise das sequências ........... 59

3.2.2.4 Hibridização fluorescente in situ (FISH – Fluorescence in situ

hybridization) ........................................................................................ 60

3.2.2.5 Processamento microscópico .................................................. 60

3.2.3 Resultados ......................................................................................... 60

3.2.3.1 Clonagem ................................................................................. 60

3.2.3.2 FISH ......................................................................................... 62

3.2.4 Discussão .......................................................................................... 68

3.2.4.1 Diversidade de ETs no genoma de ciclídeos amazônicos ....... 68

xv

3.2.4.2 Distribuição de elementos transponíveis no genoma de

ciclídeos amazônicos ........................................................................... 72

4. Conclusões Gerais .......................................................................................... 77

5. Referências Bibliográficas ............................................................................... 78

xvi

Lista de figuras

Introdução

Figura 1: Gêneros de ciclídeos amazônicos evidenciando variações morfológicas. 18

Figura 2: Árvore filogenética de máxima parcimônia com identificação a partir de

família, seguido por subfamília, tribo, subtribo e gênero (Smith et al., 2008). ........... 20

Figura 3: Adaptado de Klug et al., 2013. Organização dos elementos repetitivos por

tipo e unidade de repetição. ...................................................................................... 22

Figura 4: Adaptado de Kapitonov e Jurka, 2008. Classificação universal dos

elementos transponíveis. .......................................................................................... 23

Artigo 1

Figura 1: Clusters organizados por critério de escolha ............................................. 44

Figura 2: Elementos repetitivos e superfamílias de transponíveis identificados e suas

proporções em uma amostragem genômica de ciclídeos neotropicais amazônicos. 44

Artigo 2

Figura 1 Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Mariner/Tc1.

Os cromossomos foram contra corados com DAPI. Barra 10 um. ............................ 64

Figura 2 Cariótipos das espécies modelo hibridizadas com sonda de Line/R4/Dong.


Figura 3 Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Line/L2. Os

cromossomos foram contra corados com DAPI. Barra 10 um................................... 65

Figura 4: Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Line/RTE.


xvii

Lista de tabelas

Introdução

Tabela 1: Lista de primers sintetizados para o isolamento dos elementos repetitivos.

.................................................................................................................................. 32

Artigo 1

Tabela 1: Dados do sequenciamento genômico total e da amostragem utilizada na

investigação da fração repetitiva de quatro espécies de ciclídeos neotropicais

amazônicos. (CV) Cichla vazolleri, (AO) Astronotus ocellatus, (PS) Pterophyllum

scalare, (SD) Symphysodon discus, (F) fêmeas e (M) machos................................. 43

Tabela 2: Clusters que apresentam diferença de pelo menos 500 reads entre

espécies. ................................................................................................................... 45

Tabela 3: Número de reads por elemento e por espécie. (CV) Cichla vazolleri, (AO)

Astronotus ocellatus, (PS) Pterophyllum scalare, (SD) Symphysodon discus, (F)

fêmeas e (M) machos. ............................................................................................... 46

Tabela 4: Espécies que apresentaram diferença no número de cópias de elementos

transponíveis e outros repetitivos entre sexos. ......................................................... 48

Tabela 5: Clusters compostos predominantemente por reads de uma das espécies.

.................................................................................................................................. 49

Artigo 2

Tabela 1: Lista de primers utilizados. ........................................................................ 59

18

1. Introdução

1.1 Ciclídeos como modelo de estudos comparativos

Os ciclídeos são a maior família de peixes acantomorfos e o maior clado de

euteleósteos dulcícolas e pertencem a família Cichlidae (Smith et al., 2008). Sua

distribuição abrange a África, América do Sul e Central, Ilha das Antilhas,

Madagascar, Índia e Sri Lanka (Smith et al., 2008). Os ciclídeos englobam uma

ampla gama de espécies de peixes, sendo o número de espécies neotropicais

superior a 350 somente na América do Sul (Smith et al., 2008).

Os ciclídeos apresentam morfologia bem variada, tanto na forma corpórea

quanto na coloração e, por isso, são massivamente usados como peixes

ornamentais na aquariofilia, principalmente os gêneros Pterophyllum e

Symphysodon (Figura 1). A maioria desses peixes habitam ambientes lênticos de

rios e córregos, alimentam-se de plânctons, invertebrados e matéria vegetal, embora

alguns gêneros como Cichla e Astronotus, se alimentem também de outros peixes,

apresentam dimorfismo sexual e cuidado parental. Já foram registrados em

praticamente todas as bacias hidrográficas da América do Sul, mas raramente

ocorrem em altitudes superiores a 500 m e ocorrem preferencialmente até 200 m de

altitude (Kullander 2003).

Nesse contexto, é fácil notar que os ciclídeos são um importante grupo de

estudos evolutivos devido à sua expressiva radiação adaptativa ao longo da

evolução, à diversidade de habitats que povoam e às suas adaptações morfológicas

e comportamentais (Kocher, 2004; Fan et al., 2012; Schneider et al., 2013a).

Figura 1: Gêneros de ciclídeos amazônicos evidenciando variações morfológicas.

Symphysodon sp. Pterophyllum sp. Astronotus sp. Cichla sp.

19

Os ciclídeos amazônicos destacam-se como fonte protéica, para fins

ornamentais e pesca de subsistência e esportiva. O tucunaré (gênero Cichla)

movimenta um forte mercado econômico relacionado à prática de pesca desportiva,

o qual atrai praticantes devido ao seu comportamento agressivo (Figura 1). Este tipo

de pesca tem aumentado no decorrer dos anos, principalmente na região que

abrange o médio rio Negro e seus afluentes (Freitas e Rivas, 2006). No que diz

respeito à alimentação, os peixes são a base alimentar em regiões ribeirinhas e nos

grandes centros amazônicos, sendo espécies de ciclídeos amplamente consumidas

o acará-açu (Astronotus spp.) e o tucunaré (Cichla spp.), onde dados pesqueiros

chegam a registrar um desembarque de mais de 5.000 toneladas por ano da última

espécie (Figura 1) (Cabral Júnior e Almeida, 2006).

A bacia do rio Negro, principalmente na região média do seu curso, ocorre a

exploração de peixes ornamentais, e os ciclídeos correspondem a grande parte dos

animais exportados para mercados da Ásia e Europa (Anjos et al., 2007). Duas

espécies se destacam, são elas o acará-bandeira (Pterophyllum spp.), com mais de

6.000 exemplares exportados legalmente em 2007 e o acará-disco (Symphysodon

spp.), com mais de 42.000 exportações na mesma época (Anjos et al., 2007).

A família Cichlidae é dividida em 4 subfamílias, Etroplinae, Ptychochrominae

Pseudocrenilabrinae e Cichlinae sendo que as duas últimas correspondem aos

ciclídeos africanos e neotropicais, respectivamente (Sparks e Smith, 2004; Smith et

al., 2008). A partir de análises moleculares combinadas às características

morfológicas, esses dois clados são considerados monofiléticos e irmãos (Figura 2).

Vale ressaltar que os ciclídeos neotropicais apresentam um nível significativamente

maior de variabilidade genética do que seu grupo irmão africano. Essa hipótese é

defendida pelo fato destes peixes apresentarem taxas aceleradas de evolução

molecular em relação à outra subfamília (Smith et al., 2008).

Na árvore filogenética mais recente proposta por Smith et al. (2008), os

gêneros amazônicos Cichla e Astronotus são considerados basais e Pterophyllum e

Symphysodon gêneros derivados na subfamília Cichlinae (Figura 2). Essa proposta

filogenética corrobora as descrições citogenéticas propostas para a subfamília. O

número diploide mais frequente para espécies de Cichlinae é 2n=48 cromossomos,

número considerado ancestral para esta subfamília e também para a ordem

Perciformes (Brum, 1995; Feldberg et al., 2003). Porém, de acordo com Feldberg et

20

al., (2003), três tendências de evolução cromossômica são evidenciadas nos

ciclídeos neotropicais: (i) manutenção do 2n=48 cromossomos considerado basal,

(ii) diminuição do 2n ou (iii) aumento do número diploide. Em contrapartida, dados

recentes tem demonstrado que estes caminhos evolutivos ocorrem

independentemente entre os gêneros (Schneider et al., 2013a).

Figura 2: Árvore filogenética de máxima parcimônia com identificação a partir de

família, seguido por subfamília, tribo, subtribo e gênero (Smith et al., 2008).

21

As espécies Cichla vazzoleri, Astronotus ocellatus e Pterophyllum scalare

apresentam 2n=48 cromossomos, entretanto existem diferenças em sua fórmula

cariotípica. Cichla vazzoleri possui apenas cromossomos subtelo-acrocêntricos,

enquanto A. ocellatus e P. scalare possuem cariótipo com 16 cromossomos meta-

submetacêntricos + 32 subtelo-acrocêntricos (Schneider et al., 2013a). Por outro

lado os acarás-disco do gênero Symphysodon (S. aequifasciatus, S. discus e S.

haraldi) apresentaram número diploide igual a 2n=60 cromossomos, com a maioria

dos cromossomos meta-submetacêntricos, confirmando sua posição derivada

proposta pela filogenia vigente (Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009a; Schneider

et al., 2013b; Smith et al., 2008) (Figura 1).

As diferenças na composição e estrutura cariotípica dessas espécies estão

diretamente relacionadas a eventos de rearranjos cromossômicos, já reportados em

ciclídeos (Gross et al., 2010; Poletto et al., 2010) que podem estar relacionados à

porção repetitiva do genoma por serem alvo de quebra cromossômica,

principalmente aos elementos transponíveis.

1.2 DNA repetitivo e Elementos transponíveis

A porção codificante do DNA de eucariotos correspondente a uma parte muito

pequena em relação ao genoma total, cerca de 1,5-2% do genoma humano (Martins,

2007). Desta forma, a maior parte do genoma é composta por regiões intergênicas e

repetitivas, as quais por muito tempo foram consideradas dispensáveis ao DNA,

sendo chamadas de “DNA lixo” (Charlesworth et al., 1994; Martins, 2007).

Uma das possíveis razões para haver uma quantidade tão elevada de porção

repetitiva no genoma seriam eventos de duplicação, inserção e amplificação

oriundas de recombinação desigual de cromossomos homólogos (Martins, 2007). A

região repetitiva do genoma pode ser classificada de acordo com o número de

unidades de repetição, o comprimento dessas unidades e a frequência que ocorrem

(Wicker et al., 2007). Eles podem ser altamente repetitivos, representados por DNA

satélite ou moderadamente repetitivos com repetições in tandem, como genes de

cópias múltiplas, mini e microssatélites, ou dispersos, que são os elementos

transponíveis (Figura 3) (Charlesworth et al., 1994; Phillips e Reed, 1996; Martins,

2007). Os elementos transponíveis (ETs), também chamados de “jumping genes”, se

distinguem dos outros elementos repetitivos pela habilidade de replicar-se no

22

genoma independente do ciclo celular, além serem capazes de migrar para outras

regiões diferentes da origem, apresentarem sequências nucleotídicas codificadoras

e não ocorrer em amplas repetições (in tandem) (McClintock, 1950; Charlesworth et

al., 1994; Feschotte et al., 2008).

Inicialmente esses elementos eram considerados parasitas do DNA que se

tornaram não funcionais ao longo do tempo. Entretanto, uma pequena parcela pode

apresentar papéis funcionais no genoma (Zeigler, 2014). Diversos trabalhos têm

demonstrado que essa parte não codificante do DNA desenvolve um papel

fundamental na manutenção celular e estão envolvidos em mecanismos de

regulação determinantes na expressão gênica, podendo resultar em mudanças

fenotípicas, além de estarem envolvidos em processos de especiação e atuando na

evolução do genoma do hospedeiro (Kazazian, 2004; Martins, 2007; Vitte et al.,

2014; Zeigler, 2014). Em certas situações, os ETs podem se inserir em éxons,

Figura 3: Adaptado de Klug et al., 2013. Organização dos elementos repetitivos

por tipo e unidade de repetição.

23

resultando em doenças ou em mutações, podendo diminuir o fitness do hospedeiro

(Charlesworth et al., 1994). Porém, a instabilidade que eles causam no genoma é o

que muitas vezes confere uma rápida adaptação às mudanças ambientais, sendo de

significativa importância na evolução genômica (Almeida e Carareto, 2005; Gross et

al., 2009b; Zeigler, 2014).

A ocorrência desses elementos no genoma não é aleatória, pois eles estão

sujeitos aos mecanismos evolutivos de seleção que podem fixar ou eliminar esses

elementos de regiões genômicas específicas (Kazazian, 2004; Grewal e Jia, 2007).

Outra característica importante destes elementos é a possibilidade de migrar

também para o genoma de outros hospedeiros caracterizando transferência

horizontal (Charlesworth et al., 1994; Silva e Kidwel, 2000), já sugerida para

ciclídeos neotropicais (Schneider et al., 2013b).

ETs são classificados com base na sua estrutura e em seu mecanismo de

transposição em duas classes principais: transposons e retrotransposons (Figura 4).

A principal diferença entre eles é o tipo de intermediário da transposição. Enquanto

nos retrotransposons existe o RNA como intermediário, os transposons transpõem

diretamente de DNA para DNA (Van Sluys et al., 2001; Tafalla et al., 2006; Wicker et

al., 2007).

Figura 4: Adaptado de Kapitonov e Jurka, 2008. Classificação universal dos

elementos transponíveis.

24

De maneira geral, os transposons mobilizam-se no genoma pelo mecanismo

“corta-e-cola”, no qual transposases e ligases promovem a excisão do ET de uma

região e inserem-no em outra (Wicker et al., 2007; Kapitonov e Jurka, 2008). Fazem

parte dos transposons as superfamílias Mariner/Tc1, hAT, MuDR, EnSpm/CACTA,

PiggyBac, P, Merlin, Harbinger, Transib, Novosib, Kolobok, ISL2EU, Helitron,

Polinton, Mirage, Rehavkus e Chapaev (Figura 4) (Kapitonov e Jurka, 2008).

Os transposons são divididos em duas subclasses e ambas apresentam

genes codificantes para a transposase. A subclasse 1, que é a maior em número de

superfamílias, contém também repetições terminais invertidas (TIRs). Já a subclasse

2 transpõem-se sem a quebra das duas hélices do DNA e somente uma das fitas é

clivada e inserida em outra região do genoma e engloba as superfamílias Helitron e

Polinton (Maverick) e Crypton (Wicker et al., 2007).

Os retrotransposons mobilizam-se no genoma gerando uma cópia de si

mesmos e inserindo-a em outra região gerando um intermediário de RNA, com a

participação de transcriptase reversa. Esse mecanismo é conhecido como “copia-e-

cola”, onde o número de cópias desse retroelemento sempre aumenta no genoma

(Kapitonov e Jurka, 2008). São classificados nas classes LTR (long terminal

repeats), da qual fazem parte as superfamílias Copia, Gypsy, BEL, DIRS e retrovírus

endógenos e a classe não-LTR composta pelas superfamílias CRE, NeSL, R4, R2,

L1, RTE, Jockey, CR1, Rex1, I, RandI (Dualen), Tx1, SINEs e Penelope (Figura 4)

(Kapitonov e Jurka, 2008).

Elementos LTR são estruturalmente similares. Além das longas regiões

terminais, normalmente eles contêm open read frame (ORF) para GAGs (codificam

proteínas do capsídeo), proteinase aspártica (AP), transcriptase reversa (RT),

RNase H (RH) e integrase DDE (INT). São separados em clados distintos por

diferenças na filogenia da transcriptase reversa e pela presença de ENV (codificam

proteínas envelope), no caso de ERVs. Os DIRS apresentam uma estrutura muito

similar a essa, salvo pela ausência de INT e presença de tirosina recombinase (TR)

(Wicker et al., 2007).

A maior parte dos não-LTRs é composta pela ordem LINE que apresenta

constituição bem diferenciada entre as superfamílias, salvo pela transcriptase

reversa e nuclease que estão presente em todas elas (Wicker et al., 2007).

25

Independente da classe, os ETs são abundantes no genoma e amplamente

diversificados, e com o advento de novas tecnologias de sequenciamento genômico,

novas descrições só tendem a aumentar (Wicker et al., 2007).

1.3 Sequenciamento de nova geração no estudo de elementos transponíveis

Com o advento de tecnologias de sequenciamento de nova geração (next

generation sequencing - NGS), os dados gerados com essas ferramentas possuem

dimensões astronômicas, com o melhor custo-benefício (Wicker et al., 2007; Novak

et al., 2010). Entretanto, a abundância e diversificação dos ETs no genoma, pode

representar um grande problema no sequenciamento genômico total, devido aos

procedimentos necessários para executá-lo (Wicker et al., 2007). Para o

sequenciamento, é necessário fragmentar o DNA em regiões menores que depois

serão organizadas em sequência, a partir da sobreposição dos fragmentos - reads -

(Lapidus, 2009). O grande problema encontra-se nas regiões repetitivas, pois essa

fragmentação produz segmentos que podem conter mais de uma combinação e,

muitas vezes, essas combinações possuem muitas possibilidades formando grandes

agrupamentos - clusters – (Novak et al., 2010).

Apesar de a abundância de ETs no genoma representar um problema de

anotação e identificação em NGS, trabalhos recentes têm apresentado ferramentas

desenvolvidas para análises de ETs a partir de dados massivos obtidos por NGS e

vem apresentando resultados satisfatórios. Uma delas é o Repeat Explorer (Novak

et al., 2010) que constrói gráficos baseados em agrupamento e caracterização de

elementos repetitivos em dados de NGS. Esta análise é baseada na comparação all-

to-all dos reads a fim de identificar similaridades entre eles e construir clusters pela

sobreposição (overlaps) dos reads representando diferentes elementos repetitivos.

O tamanho dos clusters (número de reads dentro dos clusters) é usado para

quantificar famílias distintas de elementos transponíveis (Novak et al., 2010).

Essa ferramenta apresenta-se satisfatória na caracterização de ETs de dados

de NGS de estudos em plantas e apresenta-se promissora para outros grupos de

organismos. Seus resultados proporcionam informações necessárias para inferência

da evolução das famílias de elementos transponíveis, descoberta e caracterização

de novos elementos e ajuda na montagem de sequências consenso (Novak et al.,

2010).

26

A identificação massiva dos ETs presentes no genoma proporciona matéria

prima para o mapeamento físico cromossômico, possibilitando assim a identificação

de rearranjos cromossômicos, embasando estudos evolutivos e permitindo melhor

interpretações do panorama genômico de diferentes espécies.

1.4 Mapeamento físico cromossômico

A citogenética molecular é utilizada para mapeamento físico de sequências de

DNA específicas no cromossomo, consistindo basicamente no pareamento de

determinado segmento de DNA ou RNA com uma sequência de nucleotídeos

complementar situado na célula alvo (Guerra, 2004).

Na citogenética de ciclídeos neotropicais a hibridização fluorescente in situ

(FISH) revela-se importante, pois tem permitido novas interpretações da diversidade

cariotípica e sobre a organização genômica de segmentos cromossômicos tanto de

DNAs ribossomais e sequências teloméricas, quanto de elementos transponíveis

(Vicari et al., 2006; Gross et al., 2009b; Mazzuchelli e Martins, 2009; Teixeira et al.,

2009; Gross et al., 2010; Poletto et al., 2010; Valente et al., 2011; Schneider et al.,

2013a; Schneider et al., 2013b).

Diferentes classes de ETs foram mapeadas no genoma dos ciclídeos

neotropicais, tais como transposon Tc1 que foi mapeado em Cichla kelberi

evidenciando blocos conspícuos em regiões centroméricas e marcações dispersas

nos cromossomos (Teixeira et al., 2009). Três novas classes de retroelementos

foram descritas: RCk que apresenta marcações dispersas nos cromossomos de C.

kelberi; AoRex3 e AoLINE que são agrupados na heterocromatina centromérica de

todos os cromossomos de Astronotus ocellatus (Mazzuchelli e Martins, 2009).

A maioria dos estudos focam no mapeamento dos retroelementos Rex (Rex 1,

3 e 6) e os resultados têm mostrado um padrão de distribuição compartimentalizado

na heterocromatina pericentromérica, entretanto sinais dispersos e agrupados em

regiões eucromáticas também foram observados (Gross et al., 2009b; Mazzuchelli e

Martins, 2009; Teixeira et al., 2009; Valente et al., 2011, Schneider et al., 2013b).

Desta forma, faz-se necessário identificar outras classes classe de elementos

transponíveis, a fim de conhecer sua sequência e utilizá-las como sondas para o

mapeamento físico cromossômico, dando suporte para identificação de rearranjos

cromossômicos, compreensão da organização cariotípica e interpretações sobre a

27

participação de elementos transponíveis na dinâmica evolutiva dos ciclídeos

neotropicais amazônicos.

1.5 Justificativa

Ciclídeos têm importante relevância ecológica, uma vez que correspondem à

família mais rica em número de espécies de peixes de água doce e exibem

expressiva radiação adaptativa distribuída em quase todos os continentes. Também

exercem impacto social e econômico, na pesca esportiva, aquariofilia e economia

regional de muitas comunidades ribeirinhas no Amazonas, além de serem descritos

como um excelente grupo para estudos evolutivos. Algumas espécies de ciclídeos

africanos já tiveram seu genoma sequenciado (Cichlid Genome Consortium Program

em http://cichlid.umd.edu/cichlidlabs/kocherlab/bouillabase.html), bem como algumas

espécies sul americanas, abrindo novos horizontes para integração entre

sequências nucleotídicas e mapeamento físico cromossômico, uma vez que os

dados sobre esta ainda são incipientes.

Considerando que a grande parte do mapeamento físico cromossômico de

ETs é focada em retroelementos não-LTRs da família Rex, a identificação e o

mapeamento físico de outras classes de ETs em ciclídeos neotropicais permitirá

uma melhor compreensão da organização genômica bem como o entendimento da

dinâmica dos retroelementos na evolução cromossômica deste grupo de peixes.

1.6. Objetivo Geral

Comparar elementos repetitivos das espécies Cichla vazzoleri, Astronotus

ocellatus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus a fim de compreender sua

organização genômica e sua evolução cariotípica, bem como inferir a dinâmica

desses elementos.

1.6.1 Objetivos Específicos

- Isolar e caracterizar comparativamente os elementos repetitivos das quatro

espécies de ciclídeos neotropicais;

- Identificar e mapear elementos transponíveis destas espécies, utilizando as

sequências repetitivas isoladas;

http://cichlid.umd.edu/cichlidlabs/kocherlab/bouillabase.html

28

- Analisar comparativamente as sequências nucleotídicas dos elementos

transponíveis entre as espécies modelo.

2. Material e Métodos

2.1 Coleta das amostras

Quatro espécies de ciclídeos neotropicais da Amazônia Central foram

analisados, sendo elas basais Cichla vazzoleri (3 machos e 3 fêmeas) e Astronotus

ocellatus (3 machos e 5 fêmeas), e derivadas Pterophyllum scalare (3 machos e 3

fêmeas) e Symphysodon discus (2 machos e 2 fêmeas). Amostras de tecido foram

retiradas para realização do sequenciamento genômico e para preparações

cromossômicas. As espécies foram coletas com autorização do ICMBio (ICMBio

SISBIO 22984-1/2011).

Exemplares de Cichla vazzoleri foram coletados nos meses de março e abril

de 2011 no lago da Usina Hidroelétrica de Balbina (Presidente Figueiredo-AM),

bacia do rio Uatumã̃ afluente do rio Amazonas (3°09’57”S, 59°54’44”W).

Espécimes de Symphysodon discus foram coletados em igarapés próximos a

Barcelos AM (bacia do rio Negro) no período de abril de 2010 a março de 2011

(0°52'2.29"S, 62°48'35.61"W).

Os indivíduos de Astronotus ocellatus foram coletados no mês de abril de

2010 e os indivíduos de Pterophyllum scalare foram coletados no mês de fevereiro

de 2010. Ambas as espécies, A. ocellatus e P. scalare, foram coletadas no lago

Catalão, região de confluência entre os rios Negro e Solimões (3°09'45,53''S e

59°55'05,6''W).

Dados citogenéticos clássicos tais como número diploide, localização de

heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo já foram previamente descrita

(Schneider et al., 2013b).

2.2 Extração de ADN e Sequenciamento de Nova Geração

Os dados utilizados nesse trabalho foram fornecidos pela parceria

estabelecida com o Laboratório Genômica Integrativa do Instituto de Biociências de

Botucatu, São Paulo, o qual realizou o sequenciamento genômico total das quatro

29

espécies investigadas e onde estão sendo montados e anotados os genomas das

mesmas.

Os espécimes foram sacrificados pela imersão em água gelada e tecidos

muscular e hepático foram recolhidos para extração de DNA genômico, tanto para o

sequenciamento genômico quanto para as preparações cromossômicas. O DNA

total foi extraído usando fenol-clorofórmio (Sambrook et al., 1989) e quantificado

pelo espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Reações de sequenciamento foram realizadas para 2 indivíduos (macho e

fêmea) de cada espécie (A. ocellatus, C. vazzoleri, P. scalare e S. discus). As

amostra de DNA de cada espécie foram fragmentadas em tamanhos com cerca de

500 pb usando um ultrasonicador S220 (Covaris Inc., Woburn, MA, USA). As

bibliotecas genômicas foram construídas pelo Sequencing Facility da Universidade

de Maryland, USA (http://www.ibbr.umd.edu/facilities) utilizando o kit TruSeq DNA

Sample Preparation (Illumina Inc., San Diego, California, USA). Os sequenciamentos

genômicos foram realizados utilizando a plataforma HiSeq 1000 Illumina, sendo dois

lanes por espécie em uma abordagem paired-end de acordo com as recomendações

do fabricante e geraram 8 conjuntos de reads genômicos.

O output foi composto por reads paired-end com tamanho médio aproximado

de 500 pares de base (pb) e a cobertura de cada genoma foi de ~32 a 40 vezes o

genoma de cada sexo e espécie. Todas as sequências foram submetidas à

avaliação de qualidade e de presença de adaptadores utilizando o software

FASTQC (website:http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) a partir

dos valores de Phred quality score obtidos para cada base nucleotídica durante o

sequenciamento. Foram eliminados reads que não apresentassem 90% de seus

nucleotídeos com qualidade igual ou superior a 30 (Phred quality score). O número

de reads obtido foi: 267.797.946 para fêmea de A. ocellatus; 226.726.662 para

macho de A. ocellatus; 231.369.922 para fêmea de C. vazolleri; 227.201.454 para

macho de C. vazolleri; 248.087.060 para fêmea de P. scalare; 240.672.242 para

macho de P. scalare; 216.066.104 para fêmea de S. discus; e 251.236.834 para

macho de S. discus. O genoma completo de cada espécie estará disponível no

banco de dados público SaciBase (www.lgi.edu.br/sacibase).

http://www.ibbr.umd.edu/facilities

http://www.lgi.edu.br/sacibase

30

2.3 Preparação cromossômica

Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais usando o

protocolo de Bertollo et al.,. (1978) que consiste em injetar intraperitonealmente

colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso do animal. Após

40 minutos, os espécimes foram sacrificados pela imersão em água gelada e a

porção anterior do rim foi removida e transferida para uma solução hipotônica de

KCL 0,075 M (6-8 mL). O tecido foi divulsionado com o auxílio de uma seringa de

vidro. Em seguida, o sobrenadante (suspensão celular) foi retirado com o auxílio de

uma pipeta Pasteur, colocado em tubo de centrífuga e incubado em estufa a 37 °C

por 30 minutos. A suspensão foi pré-fixada com 6 gotas de metanol:ácido acético

(3:1) e ressuspendida com cuidado. Após 5 minutos, foi adicionado 8ml de fixador

Carnoy e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi descartado e 6

mL de fixador Carnoy foi adicionado. O material foi novamente ressuspendido e

centrifugado por 10 minutos a 900 rpm, repetindo essa lavagem por mais duas

vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5 mL de

fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. A suspensão

celular foi então estocada em tubo “eppendorf” e mantida em freezer -20°C. Para a

preparação das lâminas as mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente

imersas em água destilada a 50 ºC, em banho-maria. Após cinco minutos, as

lâminas foram retiradas da água de forma a manter uma película de água sobre a

sua superfície, na qual foi gotejada a suspensão celular em diferentes regiões. As

lâminas secaram diretamente ao ar.

2.4 Identificação de elementos transponíveis

Após as filtragens iniciais e o preparo das bibliotecas para a análise de

clusterização, cerca de 700.000 reads (correspondente a 0,1x de cobertura do

genoma completo, cujo tamanho estimado é de 1Gb) de cada sexo e espécie foram

selecionados para identificar a composição da fração repetitiva dos genomas destas

espécies. Os reads desta amostragem de sequências de cópias repetitivas foram

filtrados, agrupados em clusters e identificados e caracterizados utilizando a

ferramenta Repeat Explorer - website http://www.repeatexplorer.org/ - (Novak et al.,

2013). Neste pipeline os reads de elementos repetitivos são agrupados por

identidade em uma comparação all-to-all formando clusters. Para que um read seja

31

incorporado ao cluster, ele precisa ter 55% de cobertura e 90% de identidade em

relação a outro read. Desta forma, cada clusters representa um grupo de sequências

mais similares entre si do que em relação às sequências de outro cluster. Os

clusters foram anotados utilizando o algoritmo Repeat Masker em conjunto com o

banco de dados Repbase Update (Jurka et al., 2005). A caracterização de cada

cluster contém informações específicas e revela a identidade do elemento

transponível de acordo com o Repbase Update e o número de hits, número de reads

total e discriminado por sexo e espécie, além de gráficos, domínios de proteínas e

outras informações. Os elementos foram identificados ao nível de superfamília

(Kapitonov e Jurka, 2008), portanto a ocorrência de mais de um cluster identificado

como o mesmo elemento, não significa que eles sejam iguais em níveis mais

específicos. A análise estatística é feita pela ferramenta SeqGrapheR, que distingue

tipos básicos de repetições e investiga a variabilidade de sequências dentro das

famílias de elementos repetitivos (Novak et al., 2010).

Com o intuito de estudar elementos repetitivos de dinâmicas diferentes entre

as espécies e entre os indivíduos de sexos diferentes, foram selecionados para as

próximas etapas os clusters com diferenças nos números de reads de cada espécie

(utilizados na montagem do mesmo elemento). Os clusters selecionados deveriam

apresentar diferença de no mínimo 500 reads: i) entre as espécies; ii) entre os sexos

da mesma espécie; iii) os altamente representativos em uma única espécie.

2.5 Primers e amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)

Após a identificação e caracterização dos elementos repetitivos,

oligonucleotídeos iniciadores (primers) foram sintetizados a partir das sequências

consenso de cada cluster no programa Geneious ® 8.0.5 (Biomatters Limited -

http://www.geneious.com/), uma ferramenta que permite organizar, analisar e

manipular as sequências do output do Repeat Explorer, além de permitir

alinhamentos múltiplos e aos pares, inferência de árvores filogenéticas, assembly

dos contigs, desenho de primers para mapeamento genético das sequências de

interesse (Kearse et al., 2012). A lista dos primers desenhados que amplificam os

elementos repetitivos de cada cluster podem ser observados na Tabela 1.

32

Tabela 1: Lista de primers sintetizados para o isolamento dos elementos repetitivos.

ID ELEMENTO PRIMER FORWARD SEQUÊNCIA PRIMER REVERSE SEQUÊNCIA

07 LINE DONG R4 CL07R4-F WGGAATCTGCTGGAGCCAYT CL07R4-R ACTCTCAGTGGCAGGGGAAR

08 DNA.TcMar.Tc1 CL08Tc1-F CAATAAGTCAAGGACAACAC CL08Tc1-R CAAACCATCATGGCCCTGTGT

09 Satélite CL09Sat-F AGTCAGCCATCTTGGCGTGA CL09Sat-R TTGTGGTTCATGCTRTAGGG

10 LINE L2 CL10L2-F GCTTTTCAGCATCACTCCTG CL10L2-R ATGCAGATGATACCCAGGCT

11 LINE RTE CL11RTE-F ATGATGGYDGTYCTGTTGGC CL11RTE-R GTAGGACATGCCCKGGAACA

13 LINE L2 CL13L2-F TCGTGCTTGGAACTATAAGG CL13L2-R GCTTGTYTCAACAGAGGATG

16 LINE RTE CL16RTE-F CAGCAGCCTCAAACAATGGA CL16RTE-R CGGACCGMATCCCCGGCTAT

21 LINE L2 CL21L2-F AGGAAACATGATGTGGATGC CL21L2-R TAAAGTGAAAGGAACAGAGC

22 LINE L2 CL22L2-F CTTAGTTACAGCACTTTCAG CL22L2-R STGCCTTACAGAAACCTGGT

23 DNA.TcMar.Tc1 CL23Tc1-F CAAGTCCTGCACAGTGGTCA CL23Tc1-R TCATGGCTAAATTGGACCAG

24 Satélite CL24Sat-F CAACATCATCTAGAGAAGTG CL24Sat-R TGCTGCTGTGTATAATGCCT

28 DNA.TcMar.Tc1 CL28Tc1-F TGTGAACAGCAGTCTTCAGC CL28Tc1-R GTTTGAAGCCTGAAATGTGGC

33 LINE RTE CL33RTE-F TGCTGACTTCAACTGAGGCT CL33RTE-R GTAGACTGGWTGRGCAAACT

35 LINE Rex.Babar CL35Rex.Babar-F ATTTGGTTCACCCTGTGGCT CL35Rex.Babar-R TCAGAAGAAGTYGAAGAAGA

38 LINE Penelope CL38Penelope-F GGGAGAATAAGAATGACAAG CL38Penelope-R GATGGTTGTTCACAGTGGAC

41 LTR ERV1 CL41ERV1-F TCTGAGAAGATGTGTCCAGT CL41ERV1R TAAGAATCATCTGGCTTCTG

48 Satélite CL48Sat-F CCTTACCCTCCCATTAAGCC CL48Sat-R CATACCCCAAACCCTACAGG

63 LINE Penelope CL63Penelope-F AATGTTTGGCGGTCCTGCGT CL63Penelope-R CTCACAAGCAGGACTCCAGA

66 LINE Rex.Babar CL66Rex.Babar-F ACAATGTTACTAACTACTGG CL66Rex.Babar-R GGGTAAAGGTGACACTTGG

33

O software Geneious 8.0.5 ® (Biomatters Limited - http://www.geneious.com/)

permite ainda a busca por sequências similares públicas em banco de dados

genômicos online, como NCBI BLAST (Kearse et al., 2012). Desta forma, é possível

realizar comparações dos elementos transponíveis das espécies modelo com o

genoma de outros peixes.

A amplificação dos elementos repetitivos pela reação em cadeia da

polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) foi realizada utilizando os primers

desenhados a partir das sequências consenso dos elementos repetitivos. A reação

de PCR foi realizada para o volume final de 25 µL, contendo DNA genômico (200

ng), tampão 1x com 1,5 mM de magnésio, Taq DNA polimerase (5 U/µL), dNTPs (1

mM), primers (5 mM) e água Milli-Q. As condições dos ciclos para todos os

elementos incluíram os seguintes passos: 95°C por 5 min; 34 ciclos de 95°C por 1

min, 55°C por 40 seg e 72°C por 2 min; e a extensão final a 72°C por 5 min. Os

produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose à 1%,

quantificados pelo espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific,

Wilmington, DE, USA) e usados na clonagem e como sonda na técnica de FISH.

De todos os 19 elementos transponíveis isolados por PCR, selecionamos as

quatro superfamílias mais abundantes no genoma para as etapas seguintes de

clonagem e mapeamento cromossômico, que foram: os elementos transponíveis

Mariner/Tc1 (ID08), Line/L2 (ID22), Line/R4/Dong (ID07) e Line/RTE (ID11).

2.6 Clonagem

A fim de investigar possíveis variações nas sequências amplificadas por estes

quatro primers, realizamos a clonagem, onde cada vetor só incorpora um produto de

PCR por vez que posteriormente é sequenciado e comparado aos outros fragmentos

do mesmo primer. Os produtos de PCR dos elementos transponíveis Mariner/Tc1

(ID 08), Line/L2 (ID 22), Line/R4/Dong (ID 07) e Line/RTE (ID 11) foram inseridos no

plasmídeo pGEM-T Easy (Promega). Os produtos de ligação foram inseridos em

células competentes de Escherichia coli linhagem DH5 por eletro e

quimiocompetência. Clones carregando o inserto de interesse foram sequenciados

pelo Sequenciador de DNA ABI 3130 XL (Perkin-Elmer) para confirmar a

amplificação da região de interesse e os resultados das sequências foram

submetidos no banco de dados Repbase Update. Cada clone foi identificado na

34

busca contra o banco de dados Repbase Update no Genetic Information Researche

Institute (GIRI) (http://www.girinst.org/repbase/) utilizando o software CENSOR

(Jurka et al., 2005). As sequências nucleotídicas foram alinhadas usando o

programa ClustalW implementado pelo programa Geneious ® 8.0.5 (Biomatters

Limited).

2.7 Hibridização fluorescente in situ (FISH – Fluorescence in situ hybridization)

Os produtos de PCR dos elementos transponíveis Mariner/Tc1 (ID08), Line/L2

(ID22), Line/R4/Dong (ID07) e Line/RTE (ID11) foram utilizados como sondas para o

mapeamento cromossômico por hibridização fluorescente in situ (FISH) homólogas e

heterólogas, de acordo com o protocolo de Pinkel et al,. (1986). Os produtos de PCR

desses elementos transponíveis foram marcados com digoxigenin-11-dUTP (mix

Dig-Nick Translation; Roche) por nick translation de acordo com as recomendações

do fabricante e a anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usada para a detecção do

sinal das sondas.

2.7.1 Tratamento das lâminas

As lâminas contendo preparações cromossômicas foram lavadas em tampão

PBS 1x por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram desidratadas em

uma série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada. Em

seguida, tratadas com 90 μL de RNase 10 μg/mL (5 μL de RNase 10 mg/mL e 975

μL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As lâminas foram lavadas três

vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, foram lavadas em PBS 1x

durante 5 minutos.

2.7.2 Fixação

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM MgCl2

durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por

5 minutos. Após, as lâminas foram desidratadas em uma série alcoólica gelada

(70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada.

35

2.7.3 Pré-hibridização

As lâminas foram desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5

minutos e novamente desidratadas em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5

minutos cada.

2.7.4 Solução de hibridização

Em um tubo eppendorf foram adicionados 4 μL de sonda, 20 μL de

formamida, 8 μL de sulfato de dextrano 50% e 4 μL de 20xSSC. A sonda foi

desnaturada a 99 °C por 10 minutos e transferida imediatamente ao gelo.

2.7.5 Hibridização

Foram colocados 40 μL de solução de hibridização sobre uma lamínula e a

lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material

voltado para baixo em câmara úmida (H2O destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas.

2.7.6 Lavagens

As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida foram lavadas duas

vezes em formamida 15% a 42°C durante 10 minutos cada. Em seguida, lavadas

novamente em solução Tween 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente.

2.7.7 Detecção

As lâminas foram incubadas em tampão NFDM (Non Fat Dry Milk) por 15

minutos. Em seguida, lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos a

temperatura ambiente. Foram colocadas sobre cada lâmina 20 µL de anti

digoxigenina-rodamina e 100 µL de solução contendo tampão NFDM e

estreptavidina (2 μL de estreptavidina estoque em 998 μL de NFDM). Em seguida,

cobertas com lamínula e deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água

destilada. Posteriormente as lamínulas foram removidas e as lâminas lavadas três

vezes em solução Tween 5% por 2 minutos a temperatura ambiente cada. As

lâminas foram desidratadas em uma série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min

cada, secando ao final.

36

2.7.8 Montagem das lâminas

Foi adicionado a cada lâmina solução de DAPI diluído em antifade

VectaShield Vector (20 μL de antifade e 1 μL de DAPI).

2.8 Processamento microscópico

Quatro lâminas e no mínimo 20 metáfases foram analisadas por espécie para

cada ET. Cromossomos foram analisados em objetiva de 100x usando o

microscópio de epifluorescência Leica DM 2000 e as imagens foram capturadas com

uma câmera digital (Olympus DP 71) usando o software Leica LAS 4.0. Metáfases

mitóticas foram processadas pelo programa Adobe Photoshop CS6. Os cariótipos

foram organizados pela ordem decrescente de tamanho dos cromossomos (Levan et

al.,. 1964).

3. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos com a análise genômica e cromossômica comparativa

de ciclídeos amazônicos e a discussão destes dados estão apresentados na forma

de dois artigos científicos, mencionado a seguir:

Artigo 1 – Composição e Representatividade de Elementos Repetitivos no

Genoma de Ciclídeos Neotropicais.

Artigo 2 – Composição, Diversidade e Mapeamento Cromossômico de

Elementos Transponíveis no Genoma de Ciclídeos Neotropicais.

37

3.1 Artigo 1: Composição e Representatividade de Elementos Repetitivos no

Genoma de Ciclídeos Neotropicais

Edika Sabrina Girão Mitozo Tavares, Érica Ramos, Maria Claudia Gross, Cesar Martins,

Carlos Henrique Schneider

3.1.1 Introdução

A porção codificante do genoma de eucariotos corresponde a uma pequena

parte em relação às regiões intergênicas e repetitivas. As regiões repetitivas do

genoma podem ser classificadas de acordo com o número de unidades de repetição

e o comprimento dessas unidades. Os dois maiores grupos de sequências

repetitivas em eucariotos são repetições in tandem e dispersas (Charlesworth et al.,

1994). Repetições in tandem são sequências curtas de DNA não codificantes que se

repetem uma após outra por várias vezes e incluem os DNAs satélites (altamente

repetitivas), mini e microssatélites, DNAs ribossomais e repetições simples

(moderadamente repetitivas) (Charlesworth et al., 1994; Martins, 2007; Padeken et

al., 2015).

As sequências repetitivas dispersas correspondem aos elementos

transponíveis, que se distinguem das outras repetições pela habilidade de se mover

no genoma, independente do ciclo celular (McClintock, 1950; Charlesworth et al.,

1994; Feschotte, 2008; Kazazian et al., 2004). Essa mobilidade pode conferir

vantagens evolutivas ou ser deletéria ao hospedeiro (Kazazian et al., 2004; Kidwell e

Lisch, 2000). Os elementos transponíveis tem o potencial de conduzir a evolução do

genoma onde estão inseridos e influenciam diretamente o tamanho e estrutura do

genoma (Kazazian, 2004; Imai et al., 2007; Metcalfe et al., 2012), conferindo

estabilidade à molécula de DNA (Chalopin et al., 2015), participando dos

mecanismos de regulação gênica (Feschotte, 2008; Indjeian et al., 2016),

determinação sexual (Faber-Hammond et al., 2015), diversidade, organização e

evolução genômica (Kazazian, 2004; Warren et al., 2015) e cariotípica (Schneider et

al., 2013b).

Os elementos transponíveis são classificados quanto à sua estrutura,

tamanho e mecanismo de transposição (Kapitonov e Jurka, 2008; Wicker et al.,

2007). Todos os elementos transponíveis descritos para eucariotos estão unificados

em um banco de dados exclusivo de sequências repetitivas, o Repbase Update

38

(Jurka et al., 2005; Bao et al., 2015). Nele, os ETs são organizados em dois tipos: 1)

Transposons, cuja transposição é realizada pela excisão desse elemento do genoma

e inserção do mesmo em outra região, permanecendo assim com o mesmo número

de cópias, 2) Retrotransposons, no qual uma transcriptase reversa converte uma

cópia de RNA do retrotransposon em cDNA e a insere em outra porção do genoma,

aumentando o número de cópias desse elemento (Bao et al., 2015; Finnegan, 1989;

Kazazian, 2004; Kapitonov e Jurka, 2008; Markova e Mason-Gamer, 2015; Warren

et al., 2015).

Os transposons são divididos em três subclasses, de acordo com seu

mecanismos de transposição e similaridade estrutural: i) Cut-and-paste, na qual

ambas as fitas de DNA são clivadas e constituem a ordem mais abundante dentre os

transposons, os TIRs (Kapitonov e Jurka, 2008). Nela estão inseridas as

superfamílias Mariner/Tc1, hAT, MuDR, EnSpm/CACTA, PiggyBac, P, Merlin,

Harbinger, Transib, Novosib, Kolobok, ISL2EU e os descritos somente no Repbase

Update Mirage, Rehavkus e Chapaev (Kapitonov e Jurka, 2008); ii) Rolling-circle que

inclui os Helitrons e iii) Self-synthesizing que inclui os Polintons/Maverick (Bao et al.,

2015; Kapitonov e Jurka, 2008).

Os retrotransposon são divididos em duas subclasses, são elas: i) LTR (long

terminal repeat) composta pelas superfamílias Copia, Gypsy, BEL, DIRS e retrovírus

endógenos (ERV1, ERV2, ERV3) e ii) não-LTR composta pelas ordens LINE (long

interspersed nuclear elements), SINEs (short interspersed nuclear elements) e

Penelope. A ordem LINE é a mais variável dentre os retrotransponíveis e inclui as

superfamílias CRE, NeSL, R4, R2, L1, RTE, Jockey, CR1, Rex1, I, RandI (Dualen) e

Tx1 (Kapitonov e Jurka, 2008).

Os ETs podem mobilizar-se produzindo sua própria maquinaria de

transposição (considerados autônomos) ou utilizando a maquinaria de elementos

autônomos ou do hospedeiro (Capy, 1998; Friedli e Trono, 2015). A transposição

pode ocorrer tanto entre cromossomos homólogos e não-homólogos, quanto entre

indivíduos e, até mesmo, entre espécies (Capy et al., 1994; Schaack et al., 2010).

Todos os tipos de ETs são amplamente difundidos nos vertebrados (Warren

et al., 2015). Em uma comparação geral, os peixes teleósteos são os que

apresentam a maior diversidade de ETs entre os vertebrados (Chalopin et al., 2015).

Dentre as espécies desse grupo, destacam-se os ciclídeos que caracterizam um

39

grupo de enorme diversidade morfológica, ecológica e comportamental, que os torna

extremamente atraentes para o estudo de questões biológicas, particularmente

aquelas relacionadas à evolução genômica (Lowe-McConnell, 1991; López-

Fernández et al., 2005; Turner, 2007).

A família Cichlidae é dividida em 4 subfamílias: Etroplinae, Ptychochrominae,

Pseudocrenilabrinae e Cichlinae, sendo que as duas últimas correspondem aos

ciclídeos africanos e neotropicais, respectivamente (Sparks e Smith, 2004; Smith et

al., 2008). A partir de análises moleculares combinadas às características

morfológicas, ciclídeos africanos e neotropicais foram considerados clados

monofiléticos e irmãos (Smith et al., 2008). Embora os ciclídeos africanos sejam alvo

de muitos estudos em função da sua ampla gama de espécies, vale ressaltar que os

ciclídeos neotropicais apresentam taxas aceleradas de evolução molecular que

condizem com eventos de radiação adaptativa e contemplam mais de 350 espécies

somente na América do Sul (López-Fernández et al., 2010; Smith et al., 2008;

Turner, 2007). Desta forma, eles representam um grupo de estudo muito

interessante do ponto de vista evolutivo, sendo necessárias investigações a cerca de

sua composição genômica associadas às adaptações do grupo.

Estudos relacionados à composição genômica de ciclídeos neotropicais

caracterizam elementos transponíveis específicos, como Rex1, Rex3, Rex6 e Tc1

(Schneider et al., 2013b; Teixeira et al., 2009) e sítios ribossomais (Gross et al.,

2009b; Schneider et al., 2013a). A abordagem mais abrangente foi a identificação

geral da composição genômica da porção repetitiva em Cichla vazolleri e

Symphysodon discus obtida pela cinética de reassociação do DNA. Foram

identificados satélites, microssatélites, mais de 4 superfamílias de retrotransposons

e representante das superfamílias de transposons (Schneider et al., 2013a).

Entretanto, técnicas atuais permitem a identificação mais precisa e a detecção

da representatividade e uma diversidade muito maior de elementos que constituem

esses genomas. Novas tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (Next

Generation Sequence - NGS) geram dados em larga escala em um período de

tempo reduzido à baixo custo (Novak et al., 2010; Wicker et al., 2007). Contudo, a

abundância de sequências repetitivas ainda é um dos grandes desafios que

dificultam a anotação correta e completa desses genomas (Treangen e Salzberg,

2012; Wicker et al., 2007). Nesse sentido, ferramentas como o Repeat Explorer

40

(Novak et al., 2013), voltadas especificamente para os componentes repetitivos do

genoma, fornecem informações necessárias como a identificação, caracterização,

quantificação, representatividade e proporção de elementos repetitivos no genoma,

possíveis domínios proteicos, descrição de novos elementos, layout do grau de

similaridade entre as sequências (Novak et al., 2010).

Tendo em vista os processos evolutivos aos quais estão sujeitas as espécies

de ciclídeos neotropicais e a importância de ETs na evolução e na dinâmica dos

genomas de eucariotos, o presente estudo identificou e caracterizou os elementos

da fração repetitiva do genoma de quatro espécies de ciclídeos neotropicais

utilizando dados de Sequenciamento de Nova Geração.

3.1.2 Material e Métodos




fêmeas) e Symphysodon discus (2 machos e 2 fêmeas). As espécies foram coletas

com autorização do ICMBio (ICMBio SISBIO 22984-1/2011).

Exemplares de Cichla vazzoleri foram coletados nos meses de março e abril

de 2011 no lago da Usina Hidroelétrica de Balbina (Presidente Figueiredo-AM),

bacia do rio Uatumã̃ afluente do rio Amazonas (3°09’57”S, 59°54’44”W).

Espécimes de Symphysodon discus foram coletados em igarapés próximos a

Barcelos AM (bacia do rio Negro) no período de abril de 2010 a março de 2011

(0°52'2.29"S, 62°48'35.61"W).

Os indivíduos de Astronotus ocellatus foram coletados no mês de abril de

2010 e os indivíduos de Pterophyllum scalare foram coletados no mês de fevereiro

de 2010. Ambas as espécies, A. ocellatus e P. scalare, foram coletadas no lago

Catalão, região de confluência entre os rios Negro e Solimões (3°09'45,53''S e

59°55'05,6''W).

3.1.2.1 Extração de DNA e Sequenciamento de Nova Geração

Os espécimes foram sacrificados pela imersão em água gelada e tecidos

muscular e hepático foram recolhidos para extração de DNA genômico a ser

utilizado no sequenciamento genômico. O DNA total foi extraído usando fenol-

41

clorofórmio (Sambrook et al., 1989) e quantificado pelo espectrofotometro NanoDrop

2000 (Thermo Scientific).

Reações de sequenciamento foram realizadas para 2 indivíduos (macho e

fêmea) de cada espécie (A. ocellatus, C. vazzoleri, P. scalare e S. discus). As

amostras de DNA de uma fêmea e um macho de cada espécie foram fragmentadas

em tamanhos com cerca de 500 pb usando um ultrasonicador S220 (Covaris Inc.,

Woburn, MA, USA). As bibliotecas genômicas foram construídas pelo Sequencing

Facility da Universidade de Maryland, USA (http://www.ibbr.umd.edu/facilities)

utilizando o TruSeq DNA sample preparation kit ver.2 rev. C (Illumina Inc., San

Diego, California, USA). Os sequenciamentos genômicos foram realizados utilizando

a plataforma HiSeq 1000 Illumina, sendo dois lanes por espécie em uma abordagem

paired-end de acordo com as recomendações do fabricante e geraram 8 conjuntos

de reads genômicos.

O output foi composto por reads paired-end com tamanho médio aproximado

de 500 pares de base (pb) e a cobertura de cada genoma foi de ~32 a 40 vezes o

genoma de cada sexo e espécie. Todas as sequências foram submetidas à

avaliação de qualidade e de presença de adaptadores utilizando o software

FASTQC (website:http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) a partir

dos valores de Phred quality score obtidos para cada base nucleotídica durante o

sequenciamento. Foram eliminados reads que não apresentassem 90% de seus

nucleotídeos com qualidade igual ou superior a 30 (Phred quality score).

3.1.2.2 Identificação de elementos transponíveis

Após as filtragens iniciais e o preparo das bibliotecas para a análise de

clusterização, cerca de 700.000 reads (correspondente a 0,1x de cobertura do

genoma completo, cujo tamanho estimado é de 1Gb) de cada sexo e espécie foram

selecionados para identificar a composição da fração repetitiva dos genomas destas

espécies. Os reads desta amostragem de sequências de cópias repetitivas foram

filtrados, agrupados em clusters e identificados e caracterizados utilizando a

ferramenta Repeat Explorer - website http://www.repeatexplorer.org/ - (Novak et al.,

2013). Neste pipeline os reads de elementos repetitivos são agrupados por

identidade em uma comparação all-to-all formando clusters. Para que um read seja

incorporado ao cluster, ele precisa ter 55% de cobertura e 90% de identidade em

42

relação a outro read. Desta forma, cada clusters representa um grupo de sequências

mais similares entre si do que em relação às sequências de outro cluster. Os

clusters foram anotados utilizando o algoritmo Repeat Masker em conjunto com o

banco de dados Repbase Update (Jurka et al., 2005). A caracterização de cada

cluster contém informações específicas e revela a identidade do elemento

transponível de acordo com o Repbase Update e o número de hits, número de reads

total e discriminado por sexo e espécie, além de gráficos, domínios de proteínas e

outras informações. Os elementos foram identificados ao nível de superfamília

(Kapitonov e Jurka, 2008), portanto a ocorrência de mais de um cluster identificado

como o mesmo elemento, não significa que eles sejam iguais em níveis mais

específicos. A análise estatística é feita pela ferramenta SeqGrapheR, que distingue

tipos básicos de repetições e investiga a variabilidade de sequências dentro das

famílias de elementos repetitivos (Novak et al., 2010).

Com o intuito de estudar elementos repetitivos de dinâmicas diferentes entre

as espécies e entre os indivíduos de sexos diferentes, foram selecionados para as

próximas etapas os clusters com diferenças nos números de reads de cada espécie

(utilizados na montagem do mesmo elemento). Os clusters selecionados deveriam

apresentar diferença de no mínimo 500 reads: i) entre as espécies; ii) entre os sexos

da mesma espécie; iii) os altamente representativos em uma única espécie.

3.1.3 Resultados

O número de reads totais gerados pelo Sequenciamento de Nova Geração, a

cobertura dos genomas, o número de reads total utilizados como amostragem para

identificação de elementos transponíveis e de o número dos que foram agrupados

em clusters ou não podem ser observados na Tabela 1. A quantidade de reads

agrupados em clusters variou de 51,3% a 63% dessa amostragem. Nem todas as

sequências foram consideradas na composição dos clusters ou por se tratarem de

sequências de cópia única ou por serem sequências repetitivas que não

apresentaram similaridade com outras sequências e, portanto, não foram agrupados

em nenhum cluster e variaram de 37% a 48,7% (Tabela 1).

43

Tabela 1: Dados do sequenciamento genômico total e da amostragem utilizada na

investigação da fração repetitiva de quatro espécies de ciclídeos neotropicais

amazônicos. (CV) Cichla vazolleri, (AO) Astronotus ocellatus, (PS) Pterophyllum

scalare, (SD) Symphysodon discus, (F) fêmeas e (M) machos.

Ao total, 30 clusters dos 69 gerados foram utilizados nas etapas

subsequentes. Os selecionados pelo critério 1 foram os clusters 06, 07, 08, 10, 11,

15, 16, 21, 22, 23, 27, 28, 33, 35, 38; pelo critério 2 foram 02, 05, 06, 08, 11, 51, 63;

e pelo critério 3 foram 01, 02, 03, 05, 09, 13, 24, 41, 44, 48, 54, 61, 63, 66 (Figura 1).

Alguns clusters atendem a dois critérios, como exemplo dos clusters 02, 05, 06, 08,

11, 63. Os elementos repetitivos identificados foram: as superfamílias DONG.R4, L2,

RTE, PENELOPE e REX.BABAR da ordem LINE da classe dos retrotransposons

não-LTR, superfamília ERV1, da classe dos retrotransposons LTRs, superfamília

Tc1 da classe dos transposons, repetições simples e DNA satélites (Figura 2).

Grupo

N° total de

reads obtidos

no SNG

Cobertura

do

genoma

Amostragem

utilizada

(reads)

Reads agrupados

em clusters Singlets

CV - F 231.369.922 ~34x 700.000 359.229 (51.3%) 340.771 (48.7%)

CV - M 227.201.454 ~34x 700.000 372.638 (53.2%) 327.362 (46.8%)

AO - F 267.797.946 ~40x 700.000 378.617 (54.1%) 321.383 (45.9%)

AO - M 226.726.662 ~34x 700.000 392.116 (56%) 307.884 (44%)

PS - F 248.087.060 ~37x 700.000 397.237 (56.7%) 302.763 (43.3%)

PS - M 240.672.242 ~36x 700.000 427.087 (61%) 272.913 (39%)

SD - F 216.066.104 ~32x 700.000 433.776 (62%) 266.224 (38%)

SD - M 251.236.834 ~37x 700.000 441.146 (63%) 258.854 (37%)

Total 1.909.158.224 5.600.000 3.201.846 2.405.154

44

Figura 2: Elementos repetitivos e superfamílias de transponíveis identificados e suas

proporções em uma amostragem genômica de ciclídeos neotropicais amazônicos.

REPETIÇÃO SIMPLES

34%

LINE.L2 23%

SATÉLITE 15%

DNA.TcMar.Tc1 9%

LINE.RTE 8%

LINE.DONG.R4 5%

LINE.PENELOPE 2%

LINE.REX.BABAR 3%

LTR.ERV1 1%

02,

05,

63

06,

08,

11

Critério 1:

07, 10, 15, 16,

21, 22, 23, 27,

28, 33, 35, 38

Critério 2:

51

Critério 3:

01, 03, 09, 13,

24, 41, 44, 48,

54, 61, 66

Figura 1: Clusters organizados por critério de escolha

45

3.1.3.1 Diferença de 500 reads entre as espécies

Todos os clusters que apresentaram diferença de no mínimo 500 reads entre

as espécies podem ser observados na Tabela 2. Esta tabela apresenta o número de

identificação do cluster, o nome do elemento repetitivo identificado, estimativa da

proporção genômica e o número de hits, que corresponde ao número de

equivalência contra o banco de dados da busca. De maneira geral, os clusters

apresentam altos valores de hits, indicando regiões conservadas e bem definidas em

outras espécies do Repbase Update.

Tabela 2: Clusters que apresentam diferença de pelo menos 500 reads entre

espécies.

RETROTRANSPOSONS NÃO-LTRS

Identificação do cluster Superfamília identificada

Estimativa da proporção genômica

n° de hits

7 R4.Dong 0,6 82,30% 6 L2 0,67 31,00%

10 L2 0,51 80,80% 15 L2 0,44 85,40% 21 L2 0,3 43,50% 22 L2 0,29 28,00% 27 L2 0,28 42,90% 11 RTE 0,48 72,40% 16 RTE 0,37 87,40% 33 RTE 0,24 84,80% 38 Penelope 0,19 43,11% 35 Rex babar 0,23 5,61%

TRANSPOSONS

Identificação do cluster Superfamília identificada


n° de hits

8 Tc1 0,58 94,10% 23 Tc1 0,29 90,90% 28 Tc1 0,28 92,30%

Os clusters identificados como R4.Dong, Penelope e L2 apresentaram alto

número de cópias nas espécies basais e reduzido nas derivadas, ou seja, estes

elementos estão diminuindo em número de cópias ao longo da derivação das

espécies (Tabela 3b). Já o elemento Rex babar, identificado em apenas um cluster,

foi o oposto, apresentou maior número de cópias nas espécies derivadas em relação

às basais (Tabela 3a). O elemento RTE, não apresentou um padrão de aumento ou

46

diminuição em número de cópias em relação à filogenia dos ciclídeos amazônicos

(Tabela 3c).

O elemento DNA.TcMar.Tc1 foi identificado nos clusters 08, 23 e 28. Nos

clusters 08 e 23 a abundância do elemento não acompanha a filogenia do grupo

(Tabela 3b), enquanto que no cluster 28, embora apresente um padrão similar aos

outros dois, apresenta um gradiente do número de cópias que aumentou ao longo

da derivação das espécies (Tabela 3a).

Tabela 3: Número de reads por elemento e por espécie. (CV) Cichla vazolleri, (AO)

Astronotus ocellatus, (PS) Pterophyllum scalare, (SD) Symphysodon discus, (F)

fêmeas e (M) machos.

a) Elementos que aumentaram em número de cópias ao longo da derivação

das espécies.

Tc1 - Cluster 28

Rex babar - Cluster 35

Espécie e sexo

N° de reads Abundância

interspecífica

Espécie e sexo


interspecífica

CV - F 819 (0,11%) 11,07%

CV - F 281 (0,04%) 4,26%

CV - M 926 (0,13%)

CV - M 266 (0.03%) AO - F 1.145 (0,16%)

14,30%

AO - F 580 (0,08%) 8,69%

AO - M 1.109 (0,15%)

AO - M 534 (0,07%) PS - F 2.397 (0,34%)

30,84%

PS - F 1.421 (0,20%) 21,09%

PS - M 2.464 (0,35%)

PS - M 1.282 (0,18%) SD - F 3.440 (0,49%)

43,77%

SD - F 4.462 (0,63%) 65,94%

SD - M 3.457 (0,49%)

SD - M 3.990 ,57%)

Basal

Derivada

-

+

47

Tabela 3 (continuação)

b) Elementos que diminuíram em número de cópias ao longo da derivação das espécies.

R4.Dong - Cluster 07

Penelope - Cluster 38

L2 - Clusters 10, 15, 21, 22, 27

Espécie e sexo


interspecífica

Espécie e sexo


interspecífica

Espécie e sexo


interspecífica

CV - F 8.195 (1,17%) 48,18%

CV - F 2.329 (0,33%)

43,11%

CV - F 2.039 (0,29%) a 3.863 (0,55%) 26,38 a 46,92%

CV - M 8.009 (1,14%)

CV - M 2.327 (0,33%)

CV - M 2.149 (0,30%) a 3.890 (0,55%) AO - F 4.347 (0,62%)

26,34%

AO - F 1.528 (0,21%) 28,10%

AO - F 1.986 (0,28%) a 4.144 (0,59%)

23,51 a 51,65% AO - M 4.511 (0,64%)

AO - M 1.507 (0,21%)

AO - M 1.899 (0,27%) a 4.055 (0,57%)

PS - F 1.980 (0,28%) 12,44%

PS - F 836 (0,11%)

15,03%

PS - F 1.027 (0,14%) a 4.060 (0,58%) 12,40 a 21,53%

PS - M 2.204 (0,31%)

PS - M 788 (0,11%)

PS - M 1.028 (0,14%) a 4.031 (0,57%) SD - F 2.170 (0,31%)

13,03%

SD - F 781 (0,11%) 13,75%

SD - F 595 (0,08%) a 3.540 (0,50%) 7,41 a 17,58%

SD - M 2.212 (0,31%)

SD - M 704 (0,10%)

SD - M 633 (0,09%) a 3.068 (0,43%)

c) Elementos cujo número de cópias foi arbitrário e não acompanharam a filogenia das espécies.

RTE - Cluster 11, 16, 33

Tc1 - Cluster 08 e 23

Espécie e sexo


interspecífica

Espécie e sexo


interspecífica

CV - F 5,794 (0,82%) a 4.958 (0,708%) 41,36 a 44,85%

CV - F 18 (0,002%) e 1.049 (0,15%)

0,22 e 6,52% CV - M 5.361 (0,76%) a 4.420 (0,63%)

CV - M 19 (0,002%) e 1.066 (0,15%)

AO - F 1.376 (0,19%) a 2.263 (0,32%) 21,88 a 22,02%

AO - F 5.669 (0,81%) e 2.706 (0,38%)

33,06 e 33,45% AO - M 1.553 (0,22%) a 2.342 (0,33%)

AO - M 5.045 (0,72%) e 2.814 (0,40%)

PS - F 521 (0,07%) a 1.305 (0,186%) 8,79 a 11,03%

PS - F 2.513 (0,35%) e 1.599 (0,22%)

15,85 e 20% PS - M 656 (0,09%) a 1.670 (0,23%)

PS - M 2.626 (0,37%) e 1.701 (0,24%)

SD - F 2.352 (0,33%) a 3.156 (0,45%) 23,9 a 25,67%

SD - F 7,294 (1,04%) e 3.802 (0,54%)

44,55 e 46,32% SD - M 2.645 (0,37%) a 3.768 (0.53%)

SD - M 7.142 ,02%) e 3.841 (0,54%)

Basal

Derivada

+

-

Basal

Derivada

48

3.1.3.2 Diferença de 500 reads entre os sexos da mesma espécie

As espécies que apresentaram diferença no número de reads entre os sexos

foram: i) Astronotus ocellatus nos clusters 08 (Tc1) e 06 (L2), sendo 5.669 e 5.906

reads no genoma de fêmeas e, 5.049 e 6.591 no de machos, respectivamente; e ii)

Symphysodon discus nos clusters 06 (L2 – 3.540 reads de fêmeas e 3.068 reads de

macho), 51 (L2 - 2.894 reads de fêmeas e 2.324 reads de machos), 63 (Penelope -

3.019 reads de fêmeas e 2.483 reads de machos), 11 (RTE - 3.156 reads de fêmeas

e 3.768 reads de machos) e nos clusters 02 e 05, ambos repetições simples com

17.014 reads de fêmeas e 22.476 reads de machos no primeiro e 50.588 reads de

fêmeas e 37.768 reads de machos no segundo (Tabela 4).

Tabela 4: Espécies que apresentaram diferença no número de cópias de elementos

transponíveis e outros repetitivos entre sexos.

Espécie e cluster Sequências repetitivas e

superfamílias identificadas Sexo com maior

n° de reads

Astronotus ocellatus

Cluster 08 Tc1 fêmea Cluster 06 L2 macho

Symphysodon discus

Cluster 06 L2 fêmea Cluster 51 L2 fêmea Cluster 63 Penelope fêmea Cluster 11 RTE macho Cluster 05 Repetição simples macho Cluster 02 Repetição simples fêmea

3.1.3.3 Altamente representativo em uma das espécies

Alguns clusters foram compostos quase exclusivamente por reads de uma

única espécie. Um cluster de LTR.EV1 foi composto majoritariamente por reads de

C. vazzoleri, um de Penelope por reads de S. discus e clusters de L2 e Rex babar

por reads de A. ocellatus. Além destes, diferentes clusters identificados como

repetições simples e DNA satélite foram compostos por reads de uma das quatro

espécies (Tabela 5).

49

Tabela 5: Clusters compostos predominantemente por reads de uma das espécies.

Espécie e Cluster

Sequências repetitivas e superfamílias identificadas

Composição do cluster

com reads da espécie


n° de hits

Cichla vazzoleri

Cluster 41 LTR.ERV1 99,99% 0,17 4,33% Cluster 44 Repetição simples 99,95% 0,16 0,01% Cluster 09 DNA satélite 94,65% 0,56 6,22% Cluster 24 DNA satélite 74,35% 0,29 57,9%

Astronotus ocellatus

Cluster 13 L2 99,99% 0,46 0,07% Cluster 66 Rex babar 75,99% 0,10 17,2% Cluster 54 Repetição simples 99,39% 0,14 0,5%

Pterophyllum scalare

Cluster 01 Repetição simples 99,98% 1,89 0,09% Cluster 61 DNA satélite 70,02% 0,12 3,97%

Symphysodon discus

Cluster 63 Penelope 90,21% 0,11 3,52% Cluster 02 Repetição simples 99,97% 1,58 78,1% Cluster 05 Repetição simples 99,97% 0,70 0,14% Cluster 03 DNA satélite 99,98% 0,93 0,04% Cluster 48 DNA satélite 82,37% 0,15 16,3

3.1.4 Discussão

Estudos anteriores sobre a composição da fração repetitiva do DNA de

ciclídeos neotropicais mostraram a presença de satélites em similaridade com SATB

e ONSAT; microssatélites; retrotransposons LINE, MAUI, elementos REX,

EXPANDER, SINE; transposons similares a Mariner, Tc1 e Helitron; retrovírus

ERV3; sequências gênicas similares aos genes Hox, Opsina, GnRH1, proteína-

fosfatase, gene vasa, DNAr 18S, Copia 8, histona-desacetilase, Anoctamina,

proteína zinc-finger, pseudogenes e famílias gênicas, tais como as ribossomais 5 e

18S (Gross et al., 2009b; Gross et al., 2010; Poletto et al., 2010; Schneider et al.,

2013a; Teixeira et al., 2009; Cioffi et al., 2010; Valente et al., 2011).

Contudo, a técnica utilizada para obtenção desta biblioteca enriquecida por

sequências moderadas e altamente repetitivas foi baseada na cinética de

reassociação do DNA (Zwick et al., 1997; Ferreira e Martins, 2008). Nesta técnica,

as sequências as bibliotecas devem ser clonadas e o produto sequenciado, podendo

ocorrer uma sub-amostragem da real composição da fração repetitiva na etapa de

50

clonagem. Os resultados do presente estudo não apresentam este tipo de viés

técnico, uma vez que os dados utilizados foram gerados diretamente pela

amostragem de dados do sequenciamento de nova geração (SNG), sendo uma

abordagem mais robusta.

Nas quatro espécies de ciclídeos analisadas foram encontrados LINEs

pertencentes a 5 superfamílias: L2, RTE, Penelope, Rex.babar e Dong.R4. Com

relação aos transposons, somente um foi identificado, o Tc1. Ainda, foram

identificados Retrotransposons LTR do tipo ERV1, DNA satélites e outras repetições

simples.

Todos os elementos identificados no genoma de ciclídeos neotropicais foram

encontrados em ciclídeos africanos. Entretanto, uma gama mais diversificada foi

evidenciada nos ciclídeos africanos, tais como: SINEs, L1, Rex1, Crack, Daphne,

Nimb, Hero, Gypsy, Pao, Copia, DIRs, hAT, Harbinger, piggyBac, dada, Polinton,

Helitron (Brawand et al., 2014). Provavelmente isto está relacionado à dois possíveis

viés deste trabalho: o de i) sub-amostragem, que, embora utilize diretamente dados

do SNG, analisou apenas uma pequena fração do genoma total das espécies,

refletindo uma resultado inicial da porção repetitiva; e o de ii) sub-agrupamento, pois

os elementos repetitivos ou superfamílias de transponíveis identificados nos clusters

são abrangentes e correspondem ao maior número de sequências envolvidas na

formação daquele cluster. Para minimizar esse viés, seria necessário fazer

reagrupamentos subsequentes (reclustering), a fim de favorecer identificações mais

específicas dos mesmos. Desta forma, é possível que a diversidade de ETs em

ciclídeos neotropicais seja tão vasta quanto a encontrada em seu grupo irmão

africano em uma abordagem mais abrangente e refinada com identificações mais

específicas (Smith et al., 2008; Warren et al., 2015).

3.1.4.1 Diferença na composição genômica entre as espécies

3.1.4.1.1 Retrotransposons não LTR

O elemento LINE foi o ET mais representativo encontrado no genoma de

ciclídeos neotropicais, correspondendo a mais de 40% dos ETs encontrados. Isso

confronta os principais relatos na literatura, pois os ETs mais abundantemente

distribuídos nos genomas de peixes teleósteos são os transposons (Chalopin et al.,

2015). Em ciclídeos africanos, os LINEs são apenas o segundo elemento mais

51

abundante. O primeiro é o transposon Tc1 que correspondem a mais de 60% do

genoma (Brawand et al., 2014).

Nos ciclídeos neotropicais, os elementos DONG.R4 (cluster 07), L2 (clusters

06, 10, 15, 21, 22 e 27) e PENELOPE (cluster 38) apresentaram maior

representatividade nas espécies basais do que nas derivadas. LINE.REX.BABAR foi

o único que apresentou menor representatividade nas espécies basais do que nas

derivadas, possivelmente indicando um acúmulo deste elemento ao longo da

evolução destas espécies.

Quando retrotransposons estão ativos no genoma, o número de cópias tende

a aumentar ao longo da derivação das espécies hospedeiras em virtude do

mecanismo de retrotransposição que apresentam, como observado no elemento

LINE.REX.BABAR. Ainda, eventos de duplicação ou crossing over desigual podem

ter ocorrido, contribuindo com o aumentando de cópias deste ET. Se esse elemento

não interfere na dinâmica celular ou acaba favorecendo o hospedeiro, ele é mantido

no genoma e pode apresentar alto grau de polimorfismo.

No entanto, se os elementos adquirem função, se tornam ativos, ou alocam-

se próximos a gene, eles ficam sob um processo restritivo, que é o que

provavelmente acontece com DONG.R4, L2 e PENELOPE. Isso significa que eles

estão sob alta pressão seletiva, pois qualquer mudança mais acentuada em suas

sequências, pode interferir significativamente na expressão de genes adjacentes

(Feschotte, 2008; Kidwell e Lisch, 2000; Warren et al., 2015). Para isso, ocorre o

processo de seleção purificadora, que elimina esses elementos do genoma do

hospedeiro a fim de prevenir maiores danos, tais como sugerido para plantas

(Hollister et al., 2011), invertebrados como para Drosophila (Casola et al., 2007), e

mamíferos (Lowe et al., 2007; Kamal et al., 2006).

LINE.PENELOPE, LINE 1 e 2, Rex1/BABAR aparentemente estão presente

em todos os vertebrados, mas apresentam distribuição desigual entre eles, enquanto

que DONG.R4 e Rex6 estão em quase todos os peixes Actinopterygii e ausentes

Sarcopterygii, com exceção de celacanto (Chalopin et al., 2015). O movimento e o

acúmulo de ETs exercem grande influência na trajetória evolutiva do hospedeiro e

parece evidente que TEs são ferramentas regulatórias do genoma, com papel

importante no direcionamento da expressão gênica (Brookfield, 2005; Slotkin e

Martienssen, 2007).

52

3.1.4.1.2 Transposons

Os elementos Tc-Mariner e hAT são superfamílias mais representativas de

transposons e estão presentes em todos os eucariotos de forma heterogênea

(Brunet et al., 1994; Wallau et al., 2014). O elemento Tc1 foi o segundo elemento

transponível mais representativo no genoma de ciclídeos neotropicais,

correspondendo a 9% dos ETs encontrados e o transposon mais abundante. Sua

representatividade foi oscilante em ciclídeos neotropicais, sendo maior em A.

ocellatus e S. discus e menor em C. vazolleri e P. scalare. A ocorrência descontínua

e não concatenada com a filogenia dos ciclídeos pode ser resultado de i)

polimorfismo ancestral ii) diferentes taxas de evolução dos ETs, incluindo perdas

estocásticas de cópias de ETs e iii) eventos de transferência horizontal ao longo da

evolução da espécie hospedeira.

Inconsistências entre a filogenia de transposons e espécies hospedeiras já

foram relatadas em estudos evolutivos (Arkhipova e Meselson, 2000; Capy et al.,

1994; Lohe et al., 1995; Yamada et al., 2015), sendo também explicadas por essas

hipóteses, tais como em plantas para o transposon Pong do tipo Harbinger (Markova

e Mason-Gamer, 2015), em Drosophila melanogaster (Dias e Carareto, 2012), entre

crustáceos e insetos (Dupeyron et al., 2014), entre mamíferos e insetos (Oliveira et

al., 2012), em Cichla kelberi (Teixeira et al., 2009), entre peixes teleósteos e

lampreias, os quais apresentam comportamento parasita-hospedeiro (Kuraku et al.,

2012). Existem evidências de elementos transponíveis procarióticos em eucariotos

(Gilbert e Cordaux, 2013). Esses eventos já foram sugeridos para outros ETs como

os elementos da família Rex em espécies ciclídeos neotropicais filogeneticamente

distantes (Schneider et al., 2013b).

3.1.4.2 Diferença na composicão genômica entre os sexos da mesma

espécie

A variabilidade em abundância e diversidade de ETs entre os organismos é

fortemente influenciada pelo seu modo de reprodução (Wright e Finnegan, 2001).

Linhagens assexuadas, mesmo as derivadas de linhagens sexuadas, tendem a

apresentar baixas ou nulas probabilidades de propagação e reduzida abundância de

ETs no genoma (Wright e Finnegan, 2001; Arkhipova e Meselson, 2000).

53

Além do modo de reprodução, diferenças na composição genômica entre os

sexos da mesma espécie também estão relacionados à determinação sexual,

especialmente pela composição diferenciada dos cromossomos sexuais

(Charlesworth, 2012). ETs geralmente estão ativos em células germinativas e

promovem rearranjos cromossômicos em diferentes populações, conduzindo ao

isolamento reprodutivo e especiação (Volff, 2005). A mobilidade de ET em

salmonídeos, por exemplo, está associada às regiões de determinação sexual em

machos (Faber-Hammond et al., 2015). Em mamíferos, a presença do elemento

LINE L1 leva à condensação de um dos cromossomos X de fêmeas (Bailey et al.,

2000), que resulta na compensação de dosagem hormonal nas fêmeas, uma vez

que possuem o dobro da informação genética em relação aos machos. Ainda em

mamíferos, uma família de retrogenes presentes no cromossomo Y está envolvida

na fertilidade masculina e é expressa exclusivamente nos testículos (Volff, 2005).

3.1.4.2.1 Transposons e Retrotransposons não LTR

A espécie Astronotus ocellatus foi a única espécie que apresentou diferença

no número de reads entre machos e fêmeas para o transposon Tc1.Mariner, sendo

maior em fêmeas do que em machos. Por outro lado, a maior representatividade do

retrotransposons não-LTR LINE.L2 para essa espécie foi em machos. A espécie

Symphysodon discus apresentou diferença no número de reads dos elementos L2,

Penelope e RTE entre sexos, sendo L2 e Penelope superior em fêmeas e RTE em

machos.

Em salmonídeos, o elemento Tc1 e os retroelementos não LTR são

candidatos responsáveis pela determinação sexual (Yano et al., 2012). Pois

sequências deste transposon, bem como domínios de endo e exonucleases e

transcriptase reversa típicos do LINE-1 foram encontradas entre éxons de genes de

determinação sexual (Faber-Hammond et al,. 2015). As transposases responsáveis

pela transposição do Tc1 estão mobilizando, além do ET situado nas regiões

flanqueadoras, grandes porções das regiões de determinação sexual. Transposons

e elementos do tipo Rex foram detectados duplicando regiões de regulação de

genes de determinação sexual em medaka, Oryzias latipes (Herpin et al., 2010).

Pode ser que haja uma relação como essa em Astronotus ocellatus, portanto, é

importante que uma investigação acerca da constituição do transposon Tc1.Mariner

54

seja realizada a fim de detectar a presença ou ausência de sequências de

transposases inseridas em genes de determinação de sexo nesta espécie.

3.1.4.2.2 Repetições simples

Diferenças no número de repetições simples entre machos e fêmeas foram

observadas somente em Symphysodon discus. Vários podem ser os motivos que

justifiquem essa característica e um deles pode estar atrelado à determinação

sexual ou aos mecanismos de proteção das regiões de determinação sexual.

Repetições simples tendem a se acumular em regiões de recombinação desigual de

cromossomos sexuais e isso, de certa forma, previne que regiões codificadoras de

produto funcional sejam perdidas ou alteradas (Charlesworth, 2012).

3.1.4.3 Altamente Representativo em uma das Espécies

O genoma de peixes teleósteos é constituído em grande parte por elementos

transponíveis, enquanto que o genoma de mamíferos e aves não, sugerindo que a

evolução de cada linhagem é conduzida por mecanismos evolutivos diferentes

(Chalopin et al., 2015; Warren et al., 2015).

3.1.4.3.1 Retrotransposons não LTR

O elemento LINE.L2 foi altamente representativo em Astronotus ocellatus,

apresentando um único read em Cichla vazolleri. O elemento L1, semelhante ao L2,

apresenta-se ativo no genoma de mamíferos, podendo mobilizar-se e promover

doenças (Kazazian, 2004)

O elemento LINE.Rex.Babar também foi altamente representativo em A.

ocellatus, embora as outras espécies tenham apresentado cópias desse elemento

em menor proporção, diferente do ocorrido para o LINE.L2. Elementos do tipo Rex3

e AoLINE semelhante ao CR1 (Mazzuchelli e Martins, 2009) já foram identificados

em Astronotus ocellatus previamente.

3.1.4.3.2 Retrotransposos LTR

O elemento LTR.ERV1 foi altamente representativo em Cichla vazolleri. Esse

elemento é o mais ativo em ciclídeos africanos e corresponde a metade dos LTRs

no genoma (Brawand et al., 2014). Embora ele seja altamente representativo em C.

55

vazolleri, provavelmente esse elemento surgiu em um ancestral comum e foi

eliminado nas outras espécies. Isso porque sua representatividade nas outras

espécies foi baixa.

Além do ERV1, Cichla vazolleri também apresentou repetição simples e

satélite espécie-específicos; LINE.L2, LINE.REX.BABAR e repetições simples foram

específicas de Astronotus ocellatus; Pterophyllum scalare apresentou uma única

repetição simples espécie-específico; Em contraste a Symphysodon discus que

apresentou LINE.PENELOPE, LINE.L2, repetições simples e satélites.

Desta forma, nossos dados indicam que os genomas de ciclídeos neotropicais

são constituídos por repetições em tandem e diferentes superfamílias de elementos

transponíveis que se distribuem de forma desigual entre os genomas e fornecem

suporte para melhor compreensão da composição e organização genômica.

56

3.2 Artigo 2: Composição, Diversidade e Mapeamento Cromossômico de

Elementos Transponíveis no Genoma de Ciclídeos Neotropicais

Edika Sabrina Girão Mitozo Tavares, Natália Dayane Moura Carvalho, Edson Junior do Carmo,

Marcos Andrei de Almeida Barbosa, Maria Claudia Gross, Cesar Martins, Carlos Henrique Schneider

3.2.1 Introdução

O genoma dos vertebrados é composto majoritariamente por sequências

repetitivas. Elementos transponíveis (ETs) são sequências repetitivas de DNA

capazes de mobilizar-se dentro e entre os genomas (Fedoroff, 2012; Kapitonov e

Jurka, 2008; Warren et al., 2015; Wicker et al., 2007). Vários trabalhos evidenciam a

participação direta desses ETs na estabilidade, tamanho e estrutura do genoma

(Bennetzen e Wang, 2014; Imai et al., 2007), mudanças fenotípicas (Lisch, 2013;

Piacentini et al., 2014), diversidade e evolução genômica (Schneider et al., 2013b;

Bourque, 2009), determinação sexual (Faber-Hammond et al., 2015) e processos de

especiação (Bonchev e Parisod, 2013). Ainda, a transposição promove diversidade e

aumento no número de cópias, mudanças de posição de importantes sequências de

DNA e consequente alteração da expressão gênica (Indjeian et al., 2016; Kazazian,

2004; Rebello et al., 2012). Dessa forma, é clara a participação de elementos

transponíveis nos processos evolutivos que conduzem a evolução do hospedeiro

(Kazazian, 2004; Schneider et al., 2013b; Bourque, 2009; Kidwell e Lisch, 2000;

Warren et al., 2015).

A transposição de um ET não é aleatória e está sujeita aos mecanismos de

defesa do genoma onde estão inseridos, como RNAs de interferência (RNAi),

atividades epigenéticas, repressão transcricional e pós-transcricional (Bourc’his &

Bestor, 2004; Obbard et al., 2009; Kidwell e Lisch, 2001; Lippman et al., 2004;

Cowley & Oakey, 2013). A fim de evitar sua eliminação, os ETs também

desenvolveram estratégias que viabilizam sua permanência no genoma, como a

tendência a se acumular em regiões de heterocromatina (Kidwell e Lisch, 2000;

Kidwell e Lisch, 2001; Lippman et al., 2014). Alguns desses mecanismos se

tornaram tão específicos que coevoluiram e contribuem com benefícios ao

hospedeiro, como o silenciamento mediado por RNA que fornecem um complexo

regulatório adicional aos genes do próprio hospedeiro (Jordan e Miller, 2008). Além

disso, os ETs são considerados fontes de biodiversidade em vertebrados e a

57

instabilidade que eles causam no genoma é o que muitas vezes confere uma rápida

adaptação às mudanças ambientais (Böhne et al., 2008; Schrader et al., 2014, Volff,

2005).

Os peixes teleósteos são detentores da mais alta diversidade de

superfamílias, conteúdo e atividade de ETs entre os vertebrados (Böhne et al., 2011;

Duvernell et al., 2004; Kojima e Jurka, 2011; Ravi e Venkatesh, 2008; Volff et al.,

2003; Volff, 2005). Takifugu rubripes e Tetraodon nigroviridis, por exemplo,

apresentam baixo número de cópias de ETs, mas uma vasta diversidade de

retrotransposons, superando com vantagem as encontradas em mamíferos (Volff et

al., 2003). O mesmo cenário se repete para o elemento Line 1, que em mamíferos

apresenta grande número de cópias de uma única linhagem, enquanto que em

teleósteos existem várias linhagens antigas desse elemento mas restrito número de

cópias (Duvernell et al., 2004).

Dentre os teleósteos, destacam-se os ciclídeos que são um importante grupo

de estudo devido à sua ampla radiação adaptativa, evidenciada pela expressiva

diversidade morfológica, comportamental e ecológica (Kocher, 2004; Fan et al.,

2012; Schneider et al., 2013b). Diferentes superfamílias de elementos transponíveis

já foram identificadas no genoma de ciclídeos neotropicais, tais como Tc1 da

superfamília Mariner e retrotransposons não-LTR L2, RTE e R4 (Tavares et al.,

2016). A manutenção desses elementos nas espécies Cichla vazzoleri, Astronotus

ocellatus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus pode ocorrer por diferentes

mecanismos evolutivos, uma vez que ocorrem de maneira heterogênea, com

diferentes números de cópias entre as espécies (Tavares et al., 2016).

No que tange a mapeamento cromossômico, várias sequências repetitivas já

foram mapeadas no genoma de ciclídeos neotropicais, sendo elas do tipo satélites e

microssatélites, Rex1, Rex3, Rex6 e Tc1 (Gross et al., 2009b; Mazzuchelli e Martins,

2009; Schneider et al., 2013b; Schneider et al., 2015; Teixeira, 2009; Valente et al.,

2011). Ainda que os diferentes ETs tenham sido mapeados nos genomas de

ciclídeos neotropicais, um enfoque comparativo, incluindo espécies basais e

derivadas, está restrito apenas aos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 (Schneider et

al., 2013b). Diante disso a identificação e mapeamento de outros ETs são

fundamentais no entendimento da dinâmica evolutiva destes ETs, bem como o seu

papel na evolução genômica dos ciclídeos neotropicais.

58

Recentemente genomas de diferentes espécies de ciclídeos neotropicais

foram totalmente sequenciados (Ramos, 2016; Tavares et al., 2016), abrindo assim

a possibilidade de integração entre Next Generation Sequence e mapeamento e

identificação de ETs. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo caracterizar

molecularmente e mapear fisicamente diferentes ETs presentes no genoma de

ciclídeos neotropicais, incluindo espécies basais (Cichla vazzoleri e Astronotus

ocellatus) e derivadas (Pterophyllum scalare e Symphysodon discus), gerando assim

dados sobre o papel destes ETs na evolução dos ciclídeos neotropicais.

3.2.2 Material e Métodos




fêmeas) e Symphysodon discus (2 machos e 2 fêmeas). As espécies foram coletas

com autorização do ICMBio (ICMBio SISBIO 22984-1/2011). Dados citogenéticos

clássicos tais como número diploide, localização de heterocromatina e regiões

organizadoras de nucléolo já foram previamente descrita (Schneider et al., 2013a).

3.2.2.1 Preparação cromossômica

Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais usando o

protocolo de Bertollo et al., (1978) que consiste em injetar intraperitonealmente

colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso do animal. Após

40 minutos, os espécimes foram sacrificados pela imersão em água gelada e a

porção anterior do rim foi removida e transferida para uma solução hipotônica de

KCL 0,075 M (6-8 mL). O tecido foi divulsionado com o auxílio de uma seringa de

vidro. Em seguida, o sobrenadante (suspensão celular) foi retirado com o auxílio de

uma pipeta Pasteur, colocado em tubo de centrífuga e incubado em estufa a 37 °C

por 30 minutos. A suspensão foi pré-fixada com 6 gotas de metanol:ácido acético

(3:1) e ressuspendida com cuidado. Após 5 minutos, foi adicionado 8ml de fixador

Carnoy e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi descartado e 6

mL de fixador Carnoy foi adicionado. O material foi novamente ressuspendido e

centrifugado por 10 minutos a 900 rpm, repetindo essa lavagem por mais duas

vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5 mL de

59

fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. A suspensão

celular foi então estocada em tubo “eppendorf” e mantida em freezer -20°C.

3.2.2.2 Extração de DNA e amplificação por reação em cadeia da

polimerase (PCR)

DNA total foi extraído dos tecidos muscular e hepático usando fenol-

clorofórmio (Sambrook et al., 1989) e quantificado pelo espectrofotometro NanoDrop

2000 (Thermo Scientific). A amplificação dos ETs pela reação em cadeia da

polímerase (PCR) foi realizada utilizando os primers da tabela 1 (Tavares, 2016). A

reação de PCR foi realizada para o volume final de 25 µL, contendo DNA genômico

(200 ng), tampão 1x com 1,5 mM de magnésio, Taq DNA polimerase (5 U/µL),

dNTPs (1 mM), primers (5 mM) e água Milli-Q. As condições dos ciclos para todos

os elementos incluíram os seguintes passos: 95°C por 5 min; 34 ciclos de 95°C por 1

min, 55°C por 40 seg e 72°C por 2 min; e a extensão final a 72°C por 5 min. Os

produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose à 1%,

quantificados pelo espectrofotometro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) e usados

na clonagem e como sonda na técnica de FISH.

Tabela 1: Lista de primers utilizados.

Nome do primer

Primer forward Nome do

primer Primer reverse

Transponível amplificado

C07R4-F WGGAATCTGCTGGAGCCAYT C07R4-R ACTCTCAGTGGCAGGGGAAR Line/R4/Dong

C11RTE-F TAGGAGCTGCCTGACACAGT C11RTE-R CAAACCATCATGGCCCTGTGT Line/RTE

C22L2-F CTTAGTTACAGCACTTTCAG C22L2-R STGCCTTACAGAAACCTGGT Line/L2

C08Tc1-F ATGATGGYDGTYCTGTTGGC C08Tc1-R GTAGGACATGCCCGGGAACA Mariner/Tc1

3.2.2.3 Clonagem, sequenciamento e análise das sequências

Os produtos de PCR dos elementos transponíveis Mariner/Tc1, Line/L2,

Line/R4/Dong e Line/RTE foram inseridos no plasmídeo pGEM-T Easy (Promega).

Os produtos de ligação foram inseridos em células competentes de Escherichia coli

por eletro e quimiocompetência. Clones carregando o inserto de interesse foram

sequenciados pelo Sequenciador de DNA ABI 3130 XL (Perkin-Elmer) e os

resultados das sequências foram submetidos no banco de dados Repbase Update.

Cada clone foi identificado utilizandos na busca contra o banco de dados Repbase

60

Update no Genetic Information Researche Institute (GIRI)

(http://www.girinst.org/repbase/) utilizando o software CENSOR (Jurka et al., 2005).

As sequências nucleotídicas foram alinhadas usando o programa ClustalW

implementado pelo programa Geneious ® 8.0.5 (Biomatters Limited).

3.2.2.4 Hibridização fluorescente in situ (FISH – Fluorescence in situ

hybridization)

Os produtos de PCR de todos os ET foram marcados com digoxigenin-11-

dUTP (mix Dig-Nick Translation; Roche) por nick translation de acordo com as

recomendações do fabricante e a anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para

a detecção do sinal das sondas. Hibridizações fluorescentes in situ homólogas e

heterólogas foram tratadas com 77% de extringência (2,5 ng/µL de DNA, 50%

formamida deionizada, 10% sulfato dextrano e 2x SSC a 37°C por 18 horas) (Pinkel

et al., 1986). Os cromossomos foram contra-corados com DAPI (2 mg/ml) em um

meio de montagem com Vectashield (Vetor). Quatro lâminas e no mínimo 20

metáfases foram analisadas por espécie para cada ET.

3.2.2.5 Processamento microscópico

Quatro lâminas e no mínimo 20 metáfases foram analisadas por espécie para

cada ET. Cromossomos foram analisados em objetiva de 100x usando o

microscópio de epifluorescência Leica DM 2000 e as imagens foram capturadas

usando o software Leica LAS 4.0. Metáfases mitóticas foram processadas pelo

programa Adobe Photoshop CS6. Os cariótipos foram organizados pela ordem

decrescente de tamanho dos cromossomos (Levan et al., 1964).

3.2.3 Resultados

3.2.3.1 Clonagem

Foram sequenciados 14 clones do Transposon Mariner/Tc1. Foram obtidas 2

sequências de Astronotus ocellatus, 9 de Pterophyllum scalare e 3 de Symphysodon

discus. Todas as sequências foram identificadas como TC1_RP e apresentaram de

85 a 100% de identidade quando comparadas ao banco de dados Repbase Update

(Tabela 2).

61

Foram sequenciados 34 clones de Line/R4/Dong. Foram obtidas 12

sequências de Cichla vazzoleri, 7 de Astronotus ocellatus, 9 de Pterophyllum scalare

e 6 de Symphysodon discus. Todas as sequências foram identificadas como

DONG_FR2, salvo 7 sequências identificadas como Rex6 (2 de A. ocellatus, 3 de P.

scalare e 2 de S. discus) e 3 como Dong-1_AFC (2 sequências de P. scalare e 1 de

S. discus). As sequências apresentaram de 71 a 93% de identidade quando

comparadas ao banco de dados Repbase Update (Tabela 2).

Foram sequenciados 27 clones de Line/L2. Foram obtidas 9 sequências de

Cichla vazzoleri, 5 de Astronotus ocellatus, 1 de Pterophyllum scalare e 12 de

Symphysodon discus. No total, 19 sequências foram identificadas como MAUI (9 de

Cichla vazzoleri, 5 de A. ocellatus, 1 de P. scalare e 4 de S. discus), as outras 8

sequências de S. discus foram identificadas como L2-5_OL. As sequências

apresentaram de 70 a 82% de identidade quando comparadas ao banco de dados

Repbase Update (Tabela 2).

Foram sequenciados 13 clones de Line/RTE. Foram obtidas 4 de Astronotus

ocellatus, 5 de Pterophyllum scalare e 4 de Symphysodon discus. Não foram obtidos

clones de Cichla vazzoleri. No total, 10 sequências foram identificadas como

Expander (3 de A. ocellatus, 3 de P. scalare e 4 de S. discus), 2 sequências de A.

ocellatus foram identificadas como Rex3 e RTE-1_OL cada e 1 sequência de P.

scalare como Rex3. As sequências apresentaram de 72 a 87% de identidade

quando comparadas ao banco de dados Repbase Update (Tabela 2).

Tabela 2: Número e identificação das sequências isoladas na clonagem

Elemento transponível

Total de clones

Número de clones em cada

identificação Identificação

Identidade com o banco dados

Tc1 14 14 Tc1_RP 85 a 100%

Dong 34 24 DONG_FR2

71 a 93% 7 Rex 6

3 DONG-1_AFC

L2 27 19 MAUI 70 a 82%

8 L2-5_OL

RTE 13 10 Expander

72 a 87% 2 Rex 3

1 RTE-1_OL

62

3.2.3.2 FISH

Os mapeamentos dos ETs evidenciaram localizações dispersas e/ou

conspícuas no genoma das quatro espécies de ciclídeos. As marcações ocorreram

ao longo de todo o segmento cromossômico e não se restringiram às regiões de

heterocromatina, embora em algumas situações elas ocorram preferencialmente nas

regiões centroméricas, pericentroméricas ou terminais.

A hibridização da sonda Mariner/Tc1 apresentou marcações dispersas e

conspícuas. As marcações dispersas ocorreram em todos os cromossomos, com

exceção dos pares: 14, 19 e 21 de Cichla vazolleri e 18 e 24 de Pterophyllum

scalare. Symphysodon discus apresentou marcações dispersas somente nos pares

3, 5, 6, 9, 10, 11, 16, 18, 19 e 22 e não apresentou blocos conspícuos. As

marcações conspícuas foram menos recorrentes que as dispersas e observadas

somente nos pares: 4 de C. vazzoleri tanto na região centromérica quanto na região

terminal e um sinal intenso no par 6; nos pares 2, 3, 6, 8, 10 e 15 as marcações

ocorrem nas regiões centroméricas e terminais em A. ocellatus, já nos pares 5, 7 e

17 ocorrem fora dessas regiões; nos pares 3, 4, 5, 9 e 11 nas regiões, centromérica,

pericentromérica e terminais de P. scalare, enquanto que os pares 14, 16 e 17 as

marcações conspícuas ocorrem fora dessas regiões. S. discus apresentou fracas

marcações conspícuas nos pares 6, 10, 11 e 18.

A sonda Line/R4/Dong apresentou marcações dispersas em C. vazzoleri

(pares 1, 2, 4, 8, 9, 11, 14 e 17), em todos os pares P. scalare e em S. discus (nos

pares 2, 7-13, 16-18, 24-30). As marcações dispersas apresentam-se bem reduzidas

e fracas nas espécies P. scalare e S. discus. Em A. ocellatus, os pares 5, 8, 10, 12,

14, 16, 21 e 22 apresentaram tanto marcações dispersas quanto conspícuas. Já os

pares 2, 3, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 23 e 24 apresentaram somente

marcações conspícuas, mas que não se restringiram às regiões heterocromáticas.

Em S. discus, alguns pares apresentaram marcações conspícuas, tais como o par

12 e o 27. Os outros não apresentaram marcações.

A sonda Line/L2 apresentou marcações dispersas em todos os cromossomos

de C. vazolleri, P. scalare e S. discus e nos pares 8-10 e 23 de A. ocellatus. Em S.

discus, as marcações dispersas dos cromossomos subtelo/acrocêntricos

apresentam um sinal forte e ocorrem ao longo de todo o segmento cromossômico.

As marcações conspícuas foram variantes entre as espécies e não restringiram-se

63

às regiões de heterocromatina. Enquanto que C. vazolleri apresenta marcações sutis

nos pares 1, 2, 5, 6, 9, 10, 11, 14, 17 e 22, S. discus evidencia marcações

conspícuas bem definidas nos pares 1-6, 10, 13-17, 19-21, 24 e 25. O par 1, por

exemplo, apresentou muitas marcações conspícuas, um diferencial em relação aos

outros pares dessa espécie e em relação às outras espécies. As principais

marcações de Line/L2 em A. ocellatus são conspícuas e ocorrem preferencialmente

nos centrômeros e regiões terminais. Os pares que exibiram esse perfil foram 1-5, 7,

11-22 e 24. Em contrapartida, o par número 6 não exibiu qualquer marcação. P.

scalare também apresentou blocos conspícuos evidenciados nos pares 2, 5, 6, 7,

11, 13 e 18.

A sonda Line/RTE apresentou marcações dispersas em todos os

cromossomos de C. vazolleri, nos pares 9, 12-14, 22-24 de A. ocellatus, nos pares

13, 17-24 de P. scalare e nos pares 8, 13, 14, 16-19, 24, 26, 29 e 30 de S. discus.

As marcações dispersas em C. vazzoleri foram sutis e nenhum dos cromossomos

apresentou blocos conspícuos. Para essa sonda, todos os cromossomos que

apresentaram marcações conspícuas também apresentaram marcações dispersas.

São eles: os pares 1-8, 10, 11, 15, 17-21 de A. ocellatus e em todos os pares de S.

discus e P. scalare, exceto os pares 12, 14, 16 desse último.

64

Figura 1 Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Mariner/Tc1. Os cromossomos foram contra corados com

DAPI. Barra 10 um.

65

Figura 2 Cariótipos das espécies modelo hibridizadas com sonda de Line/R4/Dong. Os cromossomos foram contra corados com

DAPI. Barra 10 um.

66

Figura 3 Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Line/L2. Os cromossomos foram contra corados com

DAPI. Barra 10 um.

67

Figura 4: Cariótipos das espécies estudadas hibridizadas com sonda de Line/RTE. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. Barra 10 um.

68

3.2.4 Discussão

Elementos transponíveis constituem uma fração importante no genoma dos

ciclídeos (Tavares et al., 2016). Pelo menos 4 superfamílias – Line/L2,

Line/R4/Dong, Line/RTE e Mariner/Tc1 - foram identificadas nesse trabalho, uma

diversidade relativamente alta comparada a outros grupos de vertebrados (Chalopin

et al., 2015). Todas as 4 superfamílias são amplamente difundidas entre os peixes

teleósteos (Terai et al., 1998; Volff et al., 2001; Volff et al., 1999; Zupunski et al.,

2001; Radice et al., 1994), enquanto que estão ausentes em outros vertebrados e

provavelmente foram perdidas ao longo da evolução (Böhen et al., 2011; Volff et al.,

2003; Chalopin et al., 2014; Kojima e Jurka, 2011).

3.2.4.1 Diversidade de ETs no genoma de ciclídeos amazônicos

A dinâmica evolutiva dos ETs é claramente distinta entre os organismos

(Ferreira et al., 2011; Chalopin et al., 2015) e isso pode ser exemplificado pela

diversidade das sequências dos ETs. O elemento Mariner/Tc1 foi o único cujas

sequências apresentaram alta similaridade com apenas uma linhagem de ET do

Repbase Update, o TC1_RP. O elemento TC1_RP é um transposon mariner do tipo

Tc1 isolado de Rana pipiens (Miskey et al., 2003). Embora as sequências de

Mariner/Tc1 estejam representadas por uma única linhagem, a variação das

sequências entre as espécies foi de 35%, já considerado uma divergência par-a-par

alta, típica de atividade transponível antiga (Blass et al., 2012).

Quando representantes de uma família de ET estão presentes em espécies

hospedeiras próximas ou distantes filogeneticamente, contendo pequenas regiões

com altos níveis de identidade, considera-se que: ou são elementos transponíveis

muito antigos que acumularam mutações ao longo do tempo antes da separação

das espécies (Capy, 1994), ou são elementos oriundos de transferência horizontal

(Capy, 1994), hipóteses como estas já foram suportadas para peixes teleósteos e os

vertebrados de forma geral (Radice et al., 1994).

O elemento Mariner/Tc1 já havia sido identificado e mapeado em ciclídeos

neotropicais (Teixeira et al., 2009). Ele teria originado MITEs (miniature inverted

repeat transposable elements) no genoma desses peixes e possivelmente sofre

transferência horizontal ao longo da evolução de Cichla kelberi. Estes eventos

possivelmente ocorreram entre esta espécie e Pleuronichthys cornutus e Eptatretus

69

burgeri (Ahn et al., 2013). A alta similaridade do elemento Mariner/Tc1 com as

linhagens isoladas de Rana pipiens somado às evidências de transferência

horizontal em peixes reforça a ideia de que esse elemento pode ter sofrido

transferência horizontal em outros grupos de vertebrados adicionalmete (Miskey et

al., 2003; Kidwell, 1993; Kuraku et al., 2012; Schaack et al., 2010). Desta forma,

Mariner/Tc1 teria uma participação especial, atuando ativamente a dinâmica

evolutiva dos genomas dos vertebrados (Kuraku et al., 2012).

Diferente do Mariner/Tc1, os elementos Line/RTE, Line/L2 e Line/R4/Dong

tiveram suas sequências identificadas em mais de uma família de elemento

transponível pelo Repbase Update. Embora sejam distintos, esses tipos (linhagens)

estão agrupados na mesma superfamília na classificação dos ETs, correspondem ao

elemento esperado e possuem sequências semelhantes entre si. O elemento

Line/R4/Dong apresentou similaridade com três linhagens do banco de dados do

Repbase, mas todas elas pertencem a superfamília Line/R4/Dong e diferem em 30%

entre as espécies. A maioria das sequências apresentou similaridade com a

linhagem DONG_FR2 isolada de Takifugu rubripes da ordem tetraodontiformes

(Smit, 2002), 7 de 32 apresentaram similaridade com a linhagem Rex6-1_OL isolado

de Oryzias latipes da ordem beloniformes (Kojima e Jurka, 2014) e apenas 3

sequências apresentaram similaridade com a linhagem Dong-1_AFC de ciclídeo

africano (Brawand et al., 2014). O elemento DONG_FR2 é considerado um ancestral

de DONG_FR (Smit, 2002), que, quando comparado ao elemento Rex6, revela ser o

mesmo elemento (Volff et al., 2001).

As sequências de C. vazzoleri apresentaram similaridade somente com a

linhagem DONG_FR2. Possivelmente, o controle deste ETs no genoma de C.

vazzoleri é mais rigoroso, pois além de apresentar alta similaridade com apenas

uma linhagem de ET considerada ancestral, as sequências são altamente

conservadas dentro dessa espécie, com menos de 17% de variação, sendo ela uma

espécie basal. Uma possível explicação para baixa variabilidade deste elemento no

genoma de C. vazzoleri, seria que provavelmente este esteja associado a genes e

relacionado aos seus mecanismos de regulação (Rebello et al., 2012), como

verificado em Oryzias latipes, onde o elemento Rex6_Ola, muito similar ao

DONG_FR2, que está truncado ao gene para guanilil-ciclase ou ainda está ativo no

genoma (Volff et al., 2001).

70

Em relação às outras três espécies, a variação entre as sequências dentro de

cada espécie foi superior a 40%, evidenciando um dinamismo menos controlado. A

alta variação entre as sequências dentro de uma espécie e entre as espécies e a

identificação com diferentes linhagens pode ser explicado por algumas hipóteses: i)

esse elemento não apresenta atividade de transposição recente (Capy, 1994) nas

espécies derivadas deste trabalho, contrário ao sugerido para Rex1, Rex3 e Rex6

(Volff et al., 2001; Schneider et al., 2013b); ii) as sequências podem estar alocadas

em regiões de baixa pressão seletiva facilitando essa diversificação, como já foi

sugerido para ciclídeos (Valente et al., 2011); iii) as forças de seleção atuam de

formas diferentes entre as famílias de ETs, como a diferença resultante do sucesso

de transposição e as taxas de eliminação resultando na taxa de evolução distinta em

cada espécie hospedeira (Böhne et al., 2008; Capy, 1994); iv) transferência

horizontal em uma linhagem específica (Böhne et al., 2008; Capy, 1994; Kuraku et

al., 2012); e v) surgimento de novos elementos em clados filogenéticos específicos

(Böhne et al., 2008), como é o caso do elemento Zisupton, presente somente em

peixes teleósteos entre todos os vertebrados (Böhne et al., 2012).

Os teleósteos apresentam a mais alta diversidade de superfamílias de ETs

entre os vertebrados sendo que os mais amplamente encontrados no genoma são

os retrotransposons Line/L2, juntamente com hAT e Tc-mariner (Chalopin et al.,

2015). As sequências de Line/L2 apresentam-se altamente conservadas,

apresentando similaridade com apenas duas linhagens que são intimamente

relacionadas: MAUI e L2-5_OL. MAUI é um retrotransposon não-LTR, superfamília

CR1 e família Line/L2 (Poulter et al., 1999). Inicialmente isolado em Takifugu

rubripes, representa o clado mais abundante nessa espécie (Poulter et al., 1999),

assim como em Gasterosteus aculeatus (Blass et al., 2012). Enquanto o elemento

L2-5_OL também faz parte da família Line/L2 e foi isolado primeiramente do genoma

de Oryzias latipes (Kojima e Jurka, 2014).

Todos os clones do elemento Line/L2 sequenciados das espécies C.

vazzoleri, A. ocellatus e P. scalare foram similares ao retroelemento MAUI, com

menos de 16% de variação entre as espécies. Sequências que apresentam baixa

variação entre si, sendo muito similares ou idênticas, indicam fortemente atividade

recente da família de ET e ainda podem estar ativos no genoma (Blass et al., 2012),

como na espécie Anolis carolinensis (Novick et al., 2009) e Gasterosteus aculeatus

71

(Blass et al., 2012) ou já estiveram, como sugerido para celacanto (Chalopin et al.,

2014) e ciclídeos (Schneider et al., 2013b). Ainda, existem evidências que Line/L2

atua como potencializador do gene GDF6 em peixes de água doce, fornecendo um

provável mecanismo de regulação para modelagem da estrutura óssea (Indjeian et

al., 2016).

S. discus foi o único que apresentou similaridade com duas linhagens de

Line/L2, ou seja, suas sequências foram mais divergentes dentro da espécie que

nas demais. Essa ocorrência pode ser resultado de sua complexa evolução

genômica (Gross et al., 2009b; Gross et al., 2010) associada aos elementos Rex1 e

Rex3 que apresentam sequências mais variantes em S. discus do que em espécies

basais (Schneider et al., 2013b). A filogenia do elemento Rex1 é tão diferente entre

S. discus e outras espécies de ciclídeos neotropicais (Cichla vazzoleri, Astronotus

ocellatus, Pterophylum scalare, Geophagus proximus) que a distância genética entre

eles é elevada (aproximadamente 36%) e, por isso, são separados em dois clados

filogenéticos distintos, sendo que S. discus apresenta-se mais próximo de ciclídeos

africanos do que de ciclídeos neotropicais (Schneider et al., 2013b).

As sequências de Line/RTE apresentaram similaridade com 3 linhagens do

Repbase Update. A maioria das sequências foram similares à linhagem Expander,

que trata-se de um retrotransposon não-LTR pertencente a superfamília Line/RTE

isolado inicialmente em Takifugu rubripes (Kapitonov & Jurka 1999). A linhagem

Expander inclui uma open reading frame (ORF) codificadora de endonuclease e

transcriptase reversa, possivelmente inativa por apresentar várias repetições

tetranucleotídicas dispostas em tandem na extremidade 3’ UTR, característico de

elementos Line/RTE (Kapitonov e Jurka, 1999). Apenas uma sequência de A.

ocellatus foi similar à linhagem RTE-1_OL também pertence à superfamília RTE, foi

isolado primeiramente de Fugu rubripes e 81% similar ao Expander (Kojima e Jurka,

2014). O elemento Expander é o segundo mais abundante no genoma de

Gasterosteus aculeatus e apresenta recente atividade retrotransponível nessa

espécie, devido ao alto nível de similaridade entre os elementos (Blass et al., 2012).

Duas sequências de A. ocellatus e uma de P. scalare foram identificadas

como Rex3, descrito originalmente em Xiphophorus maculatus (Volff et al., 1999). O

elemento Rex3 foi o primeiro Line/RTE descrito nas linhagens de peixes e está

amplamente distribuído entre os teleósteos (Volff et al., 1999). Fujimura et al., (2011)

72

sugerem que Expander e Rex3 tratam-se do mesmo ET. Contudo, quando as

sequências consenso de ambos são alinhadas no presente estudo, elas diferem em

20%, demonstrando que embora sejam muito similares, não são idênticas e portanto

não correspondem ao mesmo elemento. Rex3 apresenta evidências de atividade

retrotransponível recente, sucesso na inserção nos genomas de peixes e várias

cópias estão associadas às regiões codificadoras, o que pode conferir à este ET um

importante papel na evolução genômica (Volff et al., 1999), ou cariotípica dos peixes

teleósteos, ainda que não estejam mais ativos no genoma de ciclídeos tropicais

(Schneider et al., 2013b).

3.2.4.2 Distribuição de elementos transponíveis no genoma de ciclídeos

amazônicos

A ocorrência dos ETs no genoma pode estar associada tanto à

heterocromatina quanto à eucromatina, embora haja uma tendência preferencial

pelas regiões de heterocromatina centroméricas e telomérica, onde existe a

predominância de elementos repetitivos e replicação tardia (Ferreira et al., 2011;

Lippman et al., 2004; Schneider et al., 2013b; Teixeira et al., 2009). Na realidade,

uma das teorias é que o silenciamento da heterocromatina teria como objetivo

evolutivo original o controle dos ETs (Grewal e Jia, 2007). Ainda, presença desses

elementos no genoma já confere estabilidade à molécula (Kazazian, 2004), tais

como os telômeros de Drosophila melanogaster, os quais são alvos de transposição

de retrotransposons e isto seria fundamental para manutenção desta porção

cromossômica, superior às cópias repetitivas geradas pela telomerase (Grewal e Jia,

2007).

A locação prefencial de ETs na heterocromatina pode ocorrer por três

motivos: i) são regiões de baixa pressão seletiva (Valente et al., 2011; Teixeira et al.,

2009), ii) exercem função regulatória ou estrutural no genoma trazendo vantagens

ao hospedeiro (Schneider et al., 2013b; Valente et al., 2011; Kazazian, 2004; Volff et

al., 1999) e iii) são mantidos no genoma hospedeiro por neutralismo (Chalopin et al.,

2015; Schneider et al., 2013b; Kazazian, 2004; Volff et al., 1999). Cada elemento

teve um padrão de distribuição particular. Os padrões variaram tanto quando o

mesmo elemento é comparado entre as espécies, quanto quando são comparados

os diferentes elementos dentro da mesma espécie. Essa grande variação entre as

73

espécie pode ser resultado de um longo processo de divergência entre as

sequências a ponto de elas não serem mais detectadas na hibridização, como já foi

sugerido para Line2 em Oreochromis niloticus e Batrachocottus baikalensis (Oliveira

et al., 1999; Volff et al., 2011). Ainda, é possível que os cariótipos que tenham

marcações fracas ou que aparentemente não apresentem marcação, possuam na

verdade, baixo número de cópias do ET no genoma ou que estes esteja dispersos,

não sendo detectado pela técnica de FISH, como sugerido para o elemento Line/L2

em Oreochromis niloticus (Oliveira et al., 1999), ou foram perdidos em processos de

erosão molecular, já reportado para peixes, répteis e mamíferos (Lovsin et al., 2001;

Schneider et al., 2013b).

Os mapeamentos físicos das diferentes classes de ETs apresentaram

marcações compartimentalizadas coincidentes com as áreas de heterocromatina

constitutiva e dispersas ou conspícuas ao longo do segmento cromossômico

coincidentes com as áreas de eucromatina descritas previamente (Schneider et al.,

2013a). Os que se apresentaram dispersos estão na porção heterocromática do

genoma alternativa às posições centroméricas, pericentroméricas e teloméricas.

Sendo assim, eles não estão na eucromatina necessariamente, só não estão

localizados nas regiões heterocromáticas mais evidentes. Além disso, genes ativos

em blocos heterocromáticos já foram descritos em Drosophila melanogaster

(Yasuhara et al., 2005), em Arabidopsis thaliana (Copenhaver et al., 1999), no

genoma de arroz (Nagaki et al., 2004), tomate (Wang et al., 2006) e em humanos

(Mudge e Jackson, 2005). Por outro lado, alguns trabalhos relatam a presença de

ETs em regiões de eucromatina e ainda inferem que esses elementos podem estar

envolvidos na regulação gênica, como é o caso os elementos Rex1 e Rex3 cujo

mapeamento pela técnica de hibridização fluorescente in situ indicou que a

compartimentalização desses elementos não está restrita somente à

heterocromatina no genoma de Cichla kelberi (Teixeira et al., 2009).

O elemento transponível Mariner/Tc1 foi mais frequentemente localizado em

marcações dispersas ao longo dos cromossomos. Os blocos conspícuos mais

evidentes são nas espécies Astronotus ocellatus e Pterophyllum scalare, entretanto

as marcações dispersas são as mais numerosas. A espécie Cichla vazzoleri

apresentou algumas marcações dispersas enquanto Symphysodon discus quase

não apresentou marcação. O mapeamento cromossômico do Mariner/Tc1 ainda é

74

limitado a poucas espécies de vertebrados, tais como Gymnotus paraguensis (da

Silva et al., 2011) e Cichla kelberi (Teixeira et al., 2009). Em C. kelberi, Mariner/Tc1

apresentou mais marcações compartimentalizadas na heterocromatina

centroméricas (Teixeira et al., 2009). Isso evidencia que a organização genômica do

elemento Mariner/Tc1 é dinâmica e variável entre as espécies de ciclídeos

amazônicos. Já existem registros de transferência horizontal para esse elemento em

outras espécies de ciclídeos (Teixeira et al., 2009), entre peixes teleósteos e

lampréias (Kuraku et al., 2012).

O elemento Line/R4/Dong apresentou muitas marcações dispersas nas

espécies C. vazzoleri e P. scalare e quase nenhuma em S. discus. As marcações de

Astronotus ocellatus foram diferenciais, pois também apresentaram muitos blocos

conspícuos distribuídos ao longo do cromossomo. Este é o primeiro mapeamento

cromossômico do elemento transponível do tipo Line/R4/Dong. As sequências

utilizadas como sonda para Line/R4/Dong foram identificadas em três linhagens:

Dong_FR2, Dong-1_AFC e Rex6. O elemento Rex6 é um membro da família R4 e é

similar às outras linhagens encontradas (Volff et al., 2001). Portanto, de todos os

elementos já mapeados cromossomicamente em vertebrados, Rex6 é o mais similar

ao esperado, ainda que seus dados sejam incipientes. O elemento Rex6 foi

mapeado pela primeira vez em Cichla kelberi onde apresentou marcações

clusterizadas tanto nos centrômeros quanto ao longo dos cromossomos (Teixeira et

al., 2009). Já nas espécies Cichla vazzoleri, Astronotus ocellatus, Geophagus

proximus, Pterophyllum scalare e Symphysodon discus o elemento Rex6 está

organizado em blocos conspícuos localizados principalmente nas regiões

centroméricas e terminais (Schneider et al., 2013b). Essa diferença na composição e

localização indica que esses elementos evoluíram de forma independente e/ou sua

mobilidade no genoma traz vantagens ao hospedeiro, como já sugerido para Rex6

em ciclídeos neotropicais (Schneider et al., 2013b).

O elemento Line/L2 apresenta-se disperso e bem compartimentalizado nos

centrômeros na espécie basal A. ocellatus, enquanto que em S. discus apresenta

muitas marcações clusterizadas ao longo de todo o segmento cromossômico. Além

disso, apresenta também muitas pequenas marcações dispersas, principalmente

nos cromossomos subtelo/acrocêntricos. C. vazzoleri e P. scalare apresentaram

poucas marcações dispersas. Pode ser que esse elemento tenha aumentado em

75

número de cópias nos cromossomos de espécies derivadas (S. discus), enquanto

que nas espécies basais (A. ocellatus) esse elemento tende a estar restrito à

heterocromatina como forma de controle de expressão, como já foi sugerido para os

elementos Rex1 e Rex3 nas espécies C. vazzoleri e S. discus (Schneider et al.,

2013b). Uma alta concentração do Line/L2 está presente no par um de S. discus e

em outros pares cromossômicos. O elemento Line/L2 foi mapeado em Oreochromis

niloticus que exibiu pequenos blocos conspícuos dispersos ao longo dos

cromossomos e evidentes marcações teloméricas na maioria dos cromossomos

(Oliveira et al., 1999). Assim como os resultados para S. discus, o par cromossômico

1 de O. niloticus apresentou uma alta concentração de marcações que, somado à

uma possível associação desse elemento com repetições teloméricas, seria a

confirmação de que o cromossomo 1 originou-se da fusão de três pequenos

cromossomos (Oliveira et al., 1999).

Assim como o elemento Line/R4/Dong, o elemento Line/RTE foi identificado

como três linhagens: Rex3, Expander e RTE1_OL, mas desses três somente o

elemento Rex3 foi mapeado cromossomicamente em ciclídeos até a presente data

(Schneider et al., 2013b; Teixeira et al., 2009; Valente et al., 2010). O elemento

Line/RTE apresentou apenas marcações dispersas na espécie basal C. vazzoleri,

enquanto as demais espécies exibiram tanto marcações dispersas quanto

marcações conspícuas agrupadas preferencialmente nos centrômeros. O padrão de

blocos conspícuos presente nos nossos resultados foi observado em outras

espécies de ciclídeos neotropicais e africanos (Gross et al., 2009b; Schneider et al.,

2013b; Valente et al., 2011), em loricarídeos (Ferreira et al., 2010) e em peixes

antárticos (Ozouf-Costaz et al., 2004). Ainda, a localização e distribuição de Rex1 e

Rex3 coincidiram em Cichla kelberi, estando relacionadas à evolução do grupo

(Teixeira et al., 2009). O mesmo foi observado em outros ciclídeos neotropicais, com

a diferença que as localizações de Rex 1, 3 e 6 correspondiam à ITS (interstitial

telomeric sites), evidenciando rearranjos cromossômicos, e aos sítios ribossomais

5S e 18S (Schneider et al., 2013b).

A expansiva radiação adaptativa dos ciclídeos pode estar relacionada à

divergência genômica promovida pelas diferentes atividades e evolução dos ETs,

como já sugerido para os vertebrados de forma geral (Kidwell e Lisch, 1997; Warren

et al., 2015). Sabe-se, por exemplo, que o dinamismo cariotípico de peixes

76

neotropicais está intimamente relacionado à ocorrência de ETs (Schneider et al.,

2013a). Os peixes teleósteos apresentam várias famílias de ETs ativos no genoma e

isso tem forte relação com as diversas especiações do grupo (Volff, 2005). ETs

inseridos próximos às regiões 5’ e 3’ UTR de genes aumentam significativamente a

expressão gênica em todos os tecidos de diferentes ciclídeos africanos, salvo no

cérebro e músculo esquelético no segundo caso (Brawand et al., 2014).

Portanto, diante da diversidade molecular e a distribuição cromossômica

diferenciada de elementos transponíveis no genoma de ciclídeos neotropicais fica

evidente que as forças evolutivas às quais estão sujeitos agem de formas distintas

para cada um deles. Não há um padrão exclusivo de organização cromossômica dos

ETs no genoma dos ciclídeos amazônicos. Isso porque a dinâmica evolutiva dos

elementos transponíveis é independente da evolução genômica do hospedeiro e da

evolução de outros ETs e, portanto, cada um participa de forma singular na evolução

do genoma hospedeiro.

77

4. Conclusões Gerais

Os genomas das espécies de ciclídeos amazônicos são compostos por

diferentes superfamílias de elementos transponíveis e outros elementos repetitivos,

que se organizam no genoma de diferentes formas.

Os elementos transponíveis identificados, ainda não haviam sido reportados

para ciclídeos neotropicais amazônicos e compreendem as superfamílias Line/L2,

Line/RTE, Line/R4/Dong, Line/Penelope, Line/Rex.babar, Mariner/Tc1, ERV1, e

repetições em tandem do tipo simples e satélites.

O elemento transponível mais representativo em todos os genomas foi o

Line/L2, mas os genomas são compostos em sua maioria por repetições simples.

A ocorrência e representatividade de cada elemento ocorrem de forma

heterogênea entre as espécies, resultando em diferentes organizações genômicas.

Possivelmente, cada elemento esteve ou ainda está sujeito a diferentes tipos de

mecanismos evolutivos que modelam o genoma das espécies de forma

independente entre elas.

A distribuição cromossômica dos elementos transponíveis divergente reforça

a hipótese de que o mesmo elemento, está sujeito a modelagens evolutivas distintas

entre as espécies, podendo ser utilizado na detecção de rearranjos cromossômicos

e contribuir com estudos evolutivos. Maiores proporções dessa perspectiva são

observadas quando diferentes elementos são comparados entre si.

A diversidade molecular dos ETs apresentou certo padrão de similaridade

entre as sequências para cada espécie, sugerindo que esses elementos podem ser

resultado de atividade transponível recente, sem tempo suficiente para terem

acumulado mutações e que ainda podem estar em atividade no genoma das

espécies hospedeiras, abrindo a possibilidade para estudos posteriores.

78

5. Referências Bibliográficas

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