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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E
SUBTROPICAL
EFEITO DO INDUTOR DE RESISTÊNCIA ACIBENZOLAR-S-METÍLICO
SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE BACTÉRIA ‘Candidatus Liberibacter
asiaticus’ EM PLANTAS CITRÍCAS.
DHIEGO LEANDRO DUVARESCH
Orientador: Fernando A. de Azevedo
Co-orientador: Nelson A. Wulff
Dissertação submetida como requisito
paraobtenção do grau de Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área de
Concentração em Fitossanidade
Campinas, SP
Abril 2016
ii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... iv
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... vi
RESUMO ....................................................................................................................... vii
ABSTRACT .................................................................................................................. viii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 3
2.1 Huanglongbing ........................................................................................................... 3
2.1.1 Etiologia do HLB .................................................................................................... 4
2.1.2 Danos do HLB sobre plantas cítricas ...................................................................... 6
2.1.3 Transmissão do agente associado ao HLB .............................................................. 7
2.1.4 Manejo do HLB ....................................................................................................... 8
2.2 Indução de resistência ................................................................................................. 9
2.3 Indutores de resistência ............................................................................................ 10
2.3.1 Acibenzolar-S-metílico (ASM) ............................................................................. 10
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 12
3.1 Condições experimentais .......................................................................................... 12
3.2 Infecção artificial via enxertia .................................................................................. 13
3.3 Infecção via inoculação de psilídeos adultos infectivos ........................................... 14
3.4 Tratamentos Indutores .............................................................................................. 15
3.5 Avaliações ................................................................................................................ 17
3.6 Análise qualitativa através de qPCR ........................................................................ 18
3.6.1 Extração de DNA das folhas ................................................................................. 18
3.6.2 Extração de DNA de Diaphorina citri .................................................................. 19
3.6.3 Detecção de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ através de qPCR ................................... 19
3.7 Análises estatísticas .................................................................................................. 20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 20
4.1 Experimento 1 – Infecção via enxertia ..................................................................... 20
4.1.1 Desenvolvimento de plantas .................................................................................. 20
4.1.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ ........................................................... 23
4.1.3 Evolução de sintomas associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’........ 28
4.2 Experimento II – Inoculação via psilídeos infectivos .............................................. 33
4.2.1 Desenvolvimento de plantas .................................................................................. 33
4.2.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ ........................................................... 34
4.2.3 Evolução de sintomas de HLB associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L.
asiaticus’ ......................................................................................................................... 39
4.3 Comparação entre os métodos de infecção............................................................... 42
4.4 Considerações ........................................................................................................... 43
iii
5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 45
6 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 46
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Descrição dos tratamentos, doses e intervalos de aplicação do indutor de
resistência para os experimentos I e II............................................................................ 16
Tabela 2 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o diâmetro do
caule de plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores
representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ............................... 21
Tabela 3 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de
plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores representam
a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ................................................... 23
Tabela 4 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a da presença de
‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através de enxertia. Total de plantas
positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 500 dias
após o início das aplicações do indutor. Holambra, SP. ................................................. 25
Tabela 5 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento
de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’
através de enxertia. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total),
manganês, zinco+manganês e magnésio por tratamento aos 270 dias após o início das
aplicações. Holambra, SP. .............................................................................................. 31
Tabela 6 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento
de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’
através de enxertia. Total de plantas com mosqueado, nevuras amareladas e super
desenvolvidas, queda significativa de folhas e sem sintomas por tratamento aos 270 dias
após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................................. 32
Tabela 7 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o diâmetro do
caule de plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos.
Valores representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. .................. 33
Tabela 8 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de
plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Valores
representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP. ............................... 34
Tabela 9 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a presença de
‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens inoculadas através de psilídeos infectivos. Total de
plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e
440 dias após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................... 35
Tabela 10 Porcentagem de mortalidade de psilídeos adultos e resultado em qPCR
para ‘Ca. L. asiaticus’ (amostragem de insetos provinientes de duas repetições por
tratamento) após o período de inoculação em campo, aos 5, 60, 120, 180 e 240 dias após
início das aplicações. Holambra, SP. .............................................................................. 36
Tabela 11 Dados de temperatura (°C) para os meses de inoculação de psilídeos:
valores médios mensais, obtidos através do banco de dados do local do experimento.
Holambra, SP. ................................................................................................................. 38
Tabela 12 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento
de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’
através de psilídeos infectivos. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e
total), manganês, zinco+manganês e magnésio por tratamento aos 270 dias após o início
das aplicações. Holambra, SP. ........................................................................................ 40
v
Tabela 13 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento
de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’
através de psilídeos infectivos. Total de plantas com mosqueado, nervuras amareladas e
super desenvolvidas, queda significativa de folhas e sem sintomas por tratamento aos
270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP. .................................................... 41
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Corte longitudinal ilustrando sintoma do HLB em fruto: filetes alaranjados
na columela, partindo da região de inserção com o pedúnculo. ....................................... 7
Figura 2 Ovos (A), ninfas (B) e adultos (C) de Diaphorina citri (Fonte: USDA). .......... 8
Figura 3 Área experimental, Holambra-SP. ................................................................... 13
Figura 4 Descrição de estádios fenológicos de vegetação em citros (Fonte:
Stoller®).... ..................................................................................................................... 15
Figura 5 Sintomas associados ao HLB observados durante a condução dos
experimentos. (A) mosqueado, (B) nervura amarelada e espessa, (C) deficiência de
zinco leve, (D) deficiência de zinco média, (E) deficiência de zinco severa, (F)
deficiência de manganês, (G) deficiência de magnésio e (H) sem sintomas. ................. 18
Figura 6 Estrutura química do BTH (A) e ASM (B) (Fonte: Sigma Aldrich® e
Syngenta®). .................................................................................................................... 27
Figura 7 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número de
plantas Las+ acumuladas na população do experimento com infecção via enxertia e via
psilídeos aos 60, 120, 180, 270, 360 e 440/500 dias após início das aplicações
(Holambra, SP). .............................................................................................................. 42
Figura 8 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número de
plantas Las+ acumuladas nas testemunhas (Las- e Las+) do experimento com infecção
via enxertia e via psilídeos ao longo do tempo, onde (NS) representa diferença não
significativa e (*) significativa. Holambra, SP. .............................................................. 43
vii
Efeito do indutor de resistência acibenzolar-S-metílico sobre o desenvolvimento de
bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas.
RESUMO
O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de suco de laranja. No entanto, o
aumento de pragas e doenças tem colocado em risco sua hegemonia. O huanglongbing
(HLB), causado predominantemente pela bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ -
Las, é a doença mais destrutiva no Brasil. O manejo do HLB é realizado através do plantio
de mudas sadias, controle do inseto vetor, o psilídeo Diaphorina citri e da erradicação de
plantas sintomáticas. Entretanto, essas ações não estão impedindo o avanço da doença.
Novos métodos de controle são demandados. Um trabalho realizado recentemente,
evidenciou que o indutor de resistência acibenzolar-S-metílico (ASM) diminuiu o número
de plantas infectadas por ‘Ca. L. asiaticu’s em condições experimentais controladas.
Portanto, o presente estudo teve como objetivo quantificar o efeito de aplicações foliares
sequenciais de ASM na presença de ‘Ca. L. asiaticus’ através da PCR em tempo real
(qPCR) em plantas de um ano de idade recém enxertadas com borbulhas contendo ‘Ca.
L. asiaticus’ e em plantas inoculadas com psilídeos infectivos, mantidos em condições de
campo. No experimento via enxertia, aos 270 dias após o início dos tratamentos houve
diferença significativa para os tratamentos com 50 mg i.a. planta-1 (intervalo de 30 dias)
e 100 mg i.a. planta-1 (intervalo de 45 dias), atingindo 79 e 60 % de eficiência em
manifestação da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ por qPCR, respectivamente, quando
comparados à testemunha positiva. A transmissão de Las via psilídeos apresentou baixa
eficiência, não permitindo discorrer sobre o efeito de ASM na população do patógeno
quando transmitido pelo vetor. Os resultados trazem nova confirmação do efeito do ASM
em plantas cítricas jovens infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia,
adicionando informações para plantas mantidas em condições em campo. Considerando-
se o avanço da doença no cenário atual da citricultura brasileira e a importância sócio-
econômica da cultura, é evidente a importância e a necessidade do aprofundamento do
tema indução de resistência, bem como de outras tecnologias que possam agregar ao
manejo do HLB em citros.
Palavras-chave: indução de resistência, Bion, huanglongbing, Diaphorina citri.
viii
Effect of the resistance inducer acibenzolar-S-methyl on the development of
‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus.
ABSTRACT
Brazil is the major producer and exporter of orange juice in the world. However, the
increase of pests and diseases have been threatening its hegemony. Huanglongbing (HLB)
in citrus, mainly associated to the bacteria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ - Las, is
the most destructive disease in Brazil. Its management is based on use of healthy
seedlings, vector control (psyllid Diaphorina citri) and erradication of symptomatic
plants. These actions are not enough to stop the HLB spread, demanding new alternatives
of control. It was observed that the resistance inducer acibenzolar-S-methyl (ASM)
reduced the number of infected plants by ‘Ca. L. asiaticus’ in controlled experimental
conditions (AGNELLI, 2011). The present study had the objective to quantify the effect
of foliar applications of ASM against ‘Ca. L. asiaticus’ through real time PCR (qPCR) in
young citrus plants, grafted with tissue contaminated with ‘Ca. L. asiaticus’ or inoculated
with psyllid carrying ‘Ca. L. asiaticus’. The grafting trial showed a significant difference
at 270 days after beginning of applications in the treatments 50 mg a.i. plant-1 (30 days
interval) and 100 mg a.i. plant-1 (45 days interval), reaching 79 e 60 % of effiency over
the manifestation of presence of ‘Ca. L. asiaticus’ respectively, when compared to the
infected untreated check. The efficiency in transmission through psyllids was very low,
not allowing to conclude about the ASM effects on Las by using this methodologyof
transmission. The grafting results bring confirmation of the effect of ASM in young citrus
plants, adding information to field conditions. Considering the development of HLB in
the current Brazilian scenario and the social-economic relevance of citrus business,
becomes evident the need of more studies to better understand the resistance induction
against HLB in order to validate its use by growers, as well for other technologies that
could contribute to the disease complex management.
Key-words: resistance inducer, Bion, huanglongbing, Diaphorina citri.
1
1 INTRODUÇÃO
O setor agroindustrial citrícola brasileiro apresenta números que impressionam.
Em nenhum outro produto de exportação do agronegócio o país tem expressividade
semelhante. De cada cinco copos de suco de laranja consumidos no mundo, três são
produzidos nas fábricas brasileiras. O país detém atualmente mais da metade da produção
mundial de suco de laranja, sendo 98% destinados à exportação. Os Estados da Flórida
(EUA) e São Paulo (Brasil) detêm mais de 80% da produção mundial de suco (NEVES
et al., 2010).
A área de pomares de citros no principal cinturão citrícola brasileiro totaliza
482.591 hectares e está distribuída em municípios no estado de São Paulo, Triângulo
Mineiro e Sudoeste de Minas Gerais. Em 2015, foram quase 175 milhões de árvores
produzindo na região, e na Flórida, seu principal concorrente, em torno de 53 milhões
(FUNDECITRUS, 2015a; USDA, 2015).
O aumento de pragas e doenças tem colocado em risco a hegemonia do Brasil
nos últimos anos. Dentre os principais entraves fitossanitários, o huanglongbing (HLB) é
a mais destrutiva doença da citricultura devido à severidade dos sintomas, rapidez com
que se dissemina entre plantas cítricas e entre pomares, e também pela falta de resistência
genética no gênero Citrus.
O HLB não provoca a morte biológica das plantas, mas, com o passar dos anos,
elas se tornam debilitadas e improdutivas. Pomares adultos podem ficar inviáveis
economicamente dentro de sete a dez anos após o aparecimento da primeira planta
sintomática se medidas de controle não forem adotadas (GOTTWALD et al., 2007). A
partir do ramo infectado, a bactéria coloniza a planta afetando o fluxo e a distribuição de
fotossintatos no floema. Plantas jovens infectadas não produzem de forma viável
(FUNDECITRUS, 2008).
Plantas afetadas exibem folhas mosqueadas (clorose assimétrica) e folhas com
sintomas similares aos provocados por deficiências minerais, particularmente de zinco,
manganês e ferro. Ocorre também a deformação dos frutos, abortamento de sementes,
queda de folhas e frutos e morte de brotações (GRAÇA, 1991). No Brasil, o HLB está
associado a duas espécies de bactérias bastonete Gram negativas denominadas
‘Candidatus (Ca) Liberibacter (L.) asiaticus’ e ‘Ca. L. americanus’ e a um fitoplasma do
grupo IX (Teixeira et al., 2009). Ambas as liberibactérias são transmitidas por enxertia
de ramos infectados (Lin, 1963; LOPES & FRARE, 2008) e pelo vetor Diaphorina citri
(Hemiptera: Psyllidae) (CAPOOR et al., 1967; GASPAROTO et al., 2010).
2
Não há métodos de controle curativo para o HLB que possam ser usados nos
pomares, de modo que prevenir a infecção das plantas é fundamental no controle da
doença. Para o manejo é preconizada a utilização de mudas sadias, inspeção de pomares
acompanhada de erradicação das plantas infectadas, eliminação de hospedeiros e controle
rigoroso do vetor através do monitoramento e aplicação de inseticidas (BOVÉ, 2006).
Entretanto, o conjunto de ferramentas disponível para o manejo do HLB não
impediu o avanço da doença nos últimos anos. No Estado de São Paulo, o HLB foi
responsável pela eliminação de 42,6 milhões de plantas entre 2007 e 2015 de acordo com
a Coordenadoria de Defesa Agropecuária. Entre 2005 e 2012, houve um replantio de 1,2
milhão de plantas cítricas (FUNDECITRUS, 2013). Em seu levantamento mais recente,
o Fundecitrus aponta que 17,89% das laranjeiras do parque citrícola de São Paulo e das
regiões do Triângulo e Sudoeste de Minas Gerais apresentam sintomas de HLB. O
número corresponde a 35 milhões de plantas doentes no campo. Destas, 44% apresentam
sintomas severos, com perdas de produção ao redor de 50%. Em algumas regiões do
Estado de São Paulo, a incidência de plantas sintomáticas é mais expressiva, chegando a
42,5% (FUNDECITRUS, 2015b).
Frente aos danos potenciais dessa doença e dificuldade de controle, o setor
citrícola busca novos métodos de controle que sejam eficazes e menos agressivos ao meio
ambiente e à saúde humana. A indução de resistência na planta é um método de controle
não convencional, mas que apresenta potencial para o controle do HLB como uma
ferramenta adicional ao manejo integrado de medidas de controle.
A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes
existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos
(CAVALCANTI et al., 2005). Os agentes indutores capazes de ativar ou induzir respostas
de resistência nas plantas são chamados de eliciadores ou indutores, podendo apresentar
natureza química variada (SMITH, 1996).
Estudos recentes (AGNELLI, 2011), sob condições controladas e utilizando-se
inoculação por meio de enxertia de borbulhas provenientes de ramos sintomáticos de
plantas afetadas pelo HLB, indicaram que o indutor de resistência acibenzolar-S-metílico
(ASM), comercializado como Bion®, retardou o aparecimento de plantas cítricas
infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’.
A eficácia do agente indutor está relacionada com os metabólitos de defesa
produzidos pela planta, como proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP) – dos
tipos quitinases e glucanases (BONALDO et al., 2015) e que, por sua vez, estão
associados com a quantidade do composto indutor fornecido à planta. Nesse sentido,
3
estudos sobre doses e intervalos entre aplicações são fundamentais para que sejam obtidos
resultados adequados com o indutor de resistência.
Os resultados de AGNELLI (2011) indicam que o uso do ASM pode ser
promissor na indução de resistência contra infecção por ‘Ca. L. asiaticus’. Acredita-se
que a indução de resistência com o uso do ASM possa ser uma opção para o controle
preventivo do HLB em condições de infecção natural, através do seu vetor Diaphorina
citri, uma vez que esse, possivelmente, contem uma menor quantidade de bactéria em
comparação a borbulhas infectadas provenientes de ramos assintomáticos. Abaixo de uma
determinada concentração da bactéria é possível que as plantas resistam e que seus
mecanismos de defesa possam conferir proteção contra as infecções (PELZ-STELINSK
et al., 2010).
No presente contexto, as seguintes hipóteses foram consideradas: (i) aplicações
foliares sequenciais com o indutor de resistência ASM inibem ou retardam o
desenvolvimento de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas e (ii) o efeito de ASM
sobre a desenvolvimento de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ em plantas cítricas depende da
combinação entre dose e intervalo utilizados.
Dessa forma, objetivou-se com o presente trabalho, quantificar o efeito de
aplicações foliares sequenciais de ASM, em diferentes doses e intervalos, sobre os
sintomas e o desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através
de enxertia de borbulhas infectadas e psilídeos infectivos, em condições de campo.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Huanglongbing
O HLB é uma doença que afeta severamente a cultura dos citros, ameaçando sua
viabilidade econômica. É conhecido na China há mais de cem anos, tendo sido relatado
pela primeira vez em 1919 com esse nome (huanglongbing), que significa “doença do
ramo amarelo” (REINKING, 1919; LIN, 1956). No continente africano, uma doença com
sintomas similares foi descrita em 1937, com o nome de greening (VAN DE MERWE &
ANDERSON, 1937). Nos diversos países asiáticos onde ocorre, o HLB está associado à
presença da bactéria ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, enquanto que, no continente
africano, à presença de Ca. L. africanus. Nas Ilhas Reunião e Maurício foram detectadas
as duas espécies de liberibacter (GARNIER & BOVÉ, 1996).
4
No Brasil, o HLB foi relatado em 2004, estando inicialmente restrito a 35
municípios na região central do Estado de São Paulo. A maior parte das amostras
sintomáticas analisadas em 2004 estava infectada por Ca. L. americanus, uma nova
espécie de liberibacter identificada e caracterizada no final daquele ano (COLETTA-
FILHO et al., 2004; TEIXEIRA et al., 2005a; TEIXEIRA et al., 2005b; TEIXEIRA et al.,
2005c).
A proporção entre as espécies de liberibacters associadas ao HLB inverteu-se a
partir de meados de 2006: em 2009 cerca de 96% das 11.000 amostras analisadas pelo
Fundecitrus para a ocorrência de HLB estavam associadas à presença de ‘Ca. L.
asiaticus’, mostrando a melhor adaptação desta espécie às nossas condições (TEIXEIRA
et. al., 2010).
Hoje o HLB está disseminado em todas as regiões citrícolas do Estado de São
Paulo, e também está presente nos Estados de Minas Gerais e Paraná. Em São Paulo, a
porcentagem de blocos ou talhões afetados e de incidência de plantas aumentou de 18,6%
e 0,6% em 2008 para 53,3% e 3,8% em 2011, e para 64,1% e 6,9% em 2012,
respectivamente (LOPES et al., 2013). Em seu levantamento mais recente, o Fundecitrus
aponta que 17,89% das laranjeiras do parque citrícola de São Paulo e das regiões do
Triângulo e Sudoeste de Minas Gerais têm HLB, sendo que em algumas regiões do Estado
de São Paulo, a incidência de plantas sintomáticas é mais expressiva, chegando a 42,5%
(FUNDECITRUS, 2015b).
2.1.1 Etiologia do HLB
Antes da adoção do termo chinês huanglongbing (doença do ramo amarelo)
como nome oficial da doença, a mesma recebeu diversas denominações de acordo com o
local de ocorrência dos sintomas como greening (inversão de cores na fase de
amadurecimento dos frutos) na África do Sul, dieback (seca de ponteiros) na Índia,
phloem degeneration (necrose do floema ou degeneração do floema) na Indonésia, likubin
(declínio) em Taiwan e leaf mottling (folha mosqueada) nas Filipinas (BOVÉ, 2006).
Em 1956, Lin Kung Hsiang, professor da Universidade de Guangzhou na China,
obteve sucesso na transmissão da doença por enxertia, provando ser a mesma de origem
biótica ou infecciosa (LIN, 1956). Até o final dos anos 60, o agente do HLB era
considerado ser de origem viral. Entretanto, em 1970, LAFLECHE & BOVÉ, através de
microscopia eletrônica, relataram a presença de um procarioto nos vasos do floema de
plantas de laranja doce que apresentavam sintomas de HLB (TEIXEIRA et al., 2010). Em
5
1984, por meio de estudos de microscopia eletrônica, identificou-se a membrana celular
interna e externa nestes procariotos, o que possibilitou a caracterização definitiva como
bactérias Gram-negativas (GARNIER et al., 1984).
Caracterizações adicionais vieram com o sequenciamento de regiões gênicas do
cluster rplKAJL-rpoBC (operon ribosomal β), que mostrou que as bactérias do HLB
possuíam a mesma estrutura gênica para este locus presente em Eubactérias
(VILLECHANOUX et al., 1993). A caracterização detalhada foi estabelecida com a
obtenção do gene ribosomal 16S (16SrDNA) do isolado asiático de Poona (Índia) e
africano de Nelspruit (África), o que colocou as liberibacters em um grupo distinto dentro
do grupo das alfa-proteobactérias, dentro da ordem das rizobactérias (Rhizobium spp.,
Agrobacterium spp., Bortadella spp. e outras) (JAGOUEIX et al., 1994; JAGOUEIX et
al., 1996; JAGOUEIX et al., 1997).
Com a caracterização molecular e ferramentas apropriadas de detecção (sondas
para hibridação e primers para PCR), a identificação de plantas com liberibacter deixou
de ser efetuada somente pela microscopia eletrônica de transmissão e um número maior
de amostras pôde ser avaliado. Desta maneira, as liberibacters foram extensivamente
associadas a plantas apresentando sintomas de HLB, sendo assim consideradas a causa
primária da doença, mesmo que para a confirmação da etiologia do HLB seja necessário
o isolamento, cultivo da bactéria e a reprodução dos sintomas (SECHLER et al., 2009),
para a conclusão dos postulados de Koch.
Três espécies de Ca. Liberibacter estão associadas ao HLB dos citros, ‘Ca.
Liberibacter africanus’, ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ e ‘Ca. Liberibacter americanus’,
sendo que as duas últimas ocorrem no Brasil (COLETTA-FILHO et al., 2004; TEIXEIRA
et al., 2005a; TEIXEIRA et al., 2005b; TEIXEIRA et al., 2009).
Além das liberibacters, dois casos envolvendo a associação de sintomas do HLB
com fitoplasmas foram confirmados nos últimos anos. Em ambos os casos, o vetor desses
fitoplasmas não é conhecido. No Brasil, no final de 2007, foi confirmada a associação de
um fitoplasma do grupo 16SrDNA-IX com plantas de citros exibindo sintomas típicos de
HLB. Com base na caracterização de genes verificou-se que este fitoplasma exibe 99%
de identidade com o representante do grupo Pigeon Pea Phytoplasma (TEIXEIRA et al.,
2008c). Este grupo de fitoplasmas possui representantes de ocorrência na América, porém
são pouco estudados quanto a características genéticas, vetores e gama de hospedeiros.
Em 2009, um fitoplasma similar ao ‘Candidatus Phytoplasma asteris’,
pertencente ao grupo 16SrDNA-I, foi associado aos sintomas do HLB na China, sendo
6
encontrado isoladamente ou associado a ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas cítricas (CHEN et
al., 2009).
As informações acumuladas ao longo dos anos sugerem a existência de uma
associação causal entre liberibactérias e HLB, apesar de outros organismos, como é o
caso dos fitoplasmas, também estarem associados a sintomas idênticos aos do HLB em
plantas cítricas (TEIXEIRA et al., 2010).
2.1.2 Danos do HLB sobre plantas cítricas
O início do aparecimento de sintomas em plantas com HLB é caracterizado pela
presença de um ou poucos ramos com folhas amareladas, geralmente em poucas plantas
no pomar. As folhas contidas nesses ramos perdem parte da coloração verde,
apresentando-se amarelas e verdes, sem uma delimitação clara entre essas duas cores.
Esse tipo de sintoma é chamado de “mosqueado” ou blotchy mottle. Esse é o sintoma
mais característico de plantas com HLB, tendo sido observado em todos os locais nos
quais a doença foi descrita até hoje, independentemente do agente causal, do hospedeiro
e da condição ambiental. Há assimetria entre essas regiões de coloração diferente
assemelhando-se aos lados opostos do limbo foliar, definidos pela nervura central
(BOVÉ, 2006).
Frutos também podem apresentar assimetria, tamanho reduzido e ficam
incompletamente maduros. Cortando-o no sentido longitudinal, é possível verificar
internamente filetes alaranjados na columela, que partem da região de inserção com o
pedúnculo (Figura 1). O albedo, em alguns casos, apresenta uma espessura maior do que
a de um fruto sadio. Também ocorre queda intensa e precoce dos frutos. As sementes
geralmente abortam, ficam pequenas, mal formadas e de coloração escura. Com o
progresso dos sintomas, aumenta a proporção de frutos sintomáticos e caídos. A redução
na produção de frutos pode ser de até 100%, dependendo da proporção da copa afetada e
da idade da planta (BASSANEZI et al., 2006).
7
Figura 1 Corte longitudinal ilustrando sintoma do HLB em fruto: filetes alaranjados
na columela, partindo da região de inserção com o pedúnculo.
Além da queda precoce, frutos sintomáticos são menores e apresentam-se mais
ácidos e com menor teor de sólidos solúveis, porcentagem e qualidade de suco
(BASSANEZI et al., 2006). Os sintomas podem ser vistos durante o ano todo, mas
aparecem com mais frequência nas estações de outono e inverno.
2.1.3 Transmissão do agente associado ao HLB
As três espécies de Ca. Liberibacter que ocorrem nos citros podem ser
transmitidas através de material vegetal infectado via enxertia (BOVÉ, 2006). A
transmissão via enxertia de tecidos infectados apresenta resultados variáveis dependendo
da espécie de Liberibacter. Nesse caso, ‘Ca. L. asiaticus’ é mais facilmente transmitida
para plantas cítricas do que Ca. L. americanus (LOPES et al., 2009a).
Naturalmente, a disseminação ocorre planta a planta nos pomares através de
psilídeos. O inseto adquire a bactéria quando se alimenta em plantas doentes e, uma vez
infectado, permanece assim toda sua existência. Duas são as espécies de psilídeos
associadas à transmissão de ‘Ca. Liberibacter spp.’: Diaphorina citri, de ocorrência na
Ásia e Américas, e Trioza erytreae, presente na ÁfriCa. A D. citri transmite as espécies
asiática e americana de liberibacter (CAPOOR et al., 1967; YAMAMOTO et al., 2006),
8
enquanto T. erytreae transmite a espécie africana (MCCLEAN & OBERHOLZER,
1965).
D. citri é um inseto de coloração cinza, com manchas escuras nas asas que mede
de 2 a 3 mm de comprimento (Figura 2) e que pode na sua fase adulta viver de 3 a 4
meses. O inseto se aloja em todas as variedades cítricas e na murta (Murraya paniculata).
Na fase adulta, é encontrado nas folhas e ramos com uma inclinação de 45º, o que ajuda
no seu reconhecimento. Há ocorrência do inseto durante o ano inteiro, mas a sua
população é maior durante o período de brotações da planta cítrica (FUNDECITRUS,
2009).
Figura 2 Ovos (A), ninfas (B) e adultos (C) de Diaphorina citri (Fonte: USDA).
No Brasil, ‘Ca. L. asiaticus’ é a espécie que prevalece em associação com o
HLB. No Estado de São Paulo, a doença se espalhou mais lentamente em regiões com
verão de temperaturas relativamente mais elevadas, como as regiões norte e nordeste do
Estado de São Paulo, provavelmente em função da influência do clima sobre a
multiplicação da bactéria na planta e na aquisição do agente causal pelo psilídeo. Em
condições controladas, LOPES et al. (2013) constataram que a multiplicação de ‘Ca. L.
asiaticus’ e aquisição do patógeno por D. citri foi inferior em plantas mantidas sob regime
de temperaturas mais elevadas (24 a 38 °C) do que em plantas mantidas sob regime de
temperaturas mais baixas.
2.1.4 Manejo do HLB
9
Não existem métodos curativos para o HLB e o controle preconizado baseia-se
na exclusão das fontes de inóculo através do plantio de mudas sadias, da eliminação de
plantas sintomáticas e do controle do inseto vetor. Adicionalmente, recomenda-se a
eliminação de hospedeiros alternativos, como as murtas (Murraya paniculata)
(BELASQUE JUNIOR et al., 2009).
O controle químico do vetor é a medida de controle mais facilmente adotada pelo
citricultor. É um método que requer uso intensivo e constantes aplicações de inseticidas,
que impactam no custo de produção. No entanto, questiona-se se apenas a adoção de
controle químico seria capaz de controlar doenças com vetores, pois embora o uso de
inseticidas seja uma ferramenta eficaz no controle do inseto vetor, somente a redução da
população de D. citri no campo não tem contribuído para a diminuição da disseminação
do HLB.
De acordo com FUNDECITRUS (2015b), em comparação com o levantamento
até a safra de 2012, a incidência de plantas com HLB aumentou em 159%. A evolução
indica que o citricultor deve ser rigoroso na adoção das medidas de manejo da doença no
seu pomar e em áreas vizinhas, com controle sistemático do inseto transmissor e
eliminação de plantas doentes.
Os danos potenciais dessa doença e dificuldade de controle trazem a necessidade
de busca por novos métodos de controle que, além de eficazes, sejam menos agressivos
ao meio ambiente e à saúde humana.
2.2 Indução de resistência
A resistência induzida consiste no aumento da expressão da resistência por meio
da utilização de agentes externos (indutores), sem qualquer alteração do genoma da
planta, ocorrendo de maneira não específica, através da ativação de genes que codificam
diversas respostas de defesa, como proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP),
por exemplo, quitanases e glucanases; enzimas envolvidas na rota de síntese de
fitoalexinas, como a fenilalanina amônia-liase; acúmulo de lignina em tecidos
circunvizinhos ao local de penetração de microrganismo, entre outras (CAVALCANTI
et al., 2005).
Em função da rota de sinalização que leva a expressão das defesas, a indução de
resistência pode ser dividida em resistência induzida que contém o ácido salicílico (AS)
como principal sinalizador, sendo denominada de resistência sistêmica adquirida ou SAR
(do inglês – systemic acquired resistance) (MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1998), e como
10
resistência sistêmica induzida ou ISR, quando os sinalizadores principais independem do
AS (BOSTOCK, 2005). Porém, para se evitar confusões, muitos autores preferem usar o
termo geral indução de resistência (IR) (KUHN et al., 2006).
A IR apresenta como vantagens a efetividade contra vírus, bactérias, fungos e
nematóides; estabilidade devido à ação de diferentes mecanismos de resistência; caráter
sistêmico, persistente e natural quanto à proteção; economia de energia metabólica e
utilização do potencial energético para resistência em todas as plantas susceptíveis
(PASCHOLATI, 2002). Como desvantagens, é uma resistência parcial e que pode
requerer reativações temporárias. Por outro lado, por ser parcial e inespecífica, a
resistência induzida não impõe pressão de seleção sobre o patógeno, dificultando, assim,
a quebra de resistência (SILVA & RESENDE, 2001).
2.3 Indutores de resistência
A busca por sistemas de produção que possam conciliar alta produtividade com
a redução de impactos negativos sobre o meio ambiente é essencial para o alcance da
sustentabilidade da citricultura. Neste contexto, a ativação dos mecanismos de resistência
das plantas deixando que ela própria se proteja contra patógenos é uma estratégia
desejável para o futuro.
Entende-se como agente indutor de resistência qualquer composto ou fator capaz
de ativar mecanismos de defesa na planta. São considerados eliciadores ou elicitores
moléculas que estimulam qualquer resposta de defesa nas plantas podendo ser
classificados, quanto à origem, em bióticos e abióticos (CAVALCANTI et al., 2005).
Indutores bióticos são organismos vivos ou partes destes capazes de ativar
respostas de defesa localizadas ou de maneira sistêmica em plantas. Bactérias, fungos,
vírus, nematoides e insetos são alguns exemplos (DUKE et al., 1987). Indutores abióticos
podem ser classificados em indutores físicos, como temperatura e radiações ultravioletas,
e em indutores químicos como o ácido salicílico (AS), acibenzolar-S-metílico (ASM),
ácido jasmônico, entre outros (CAVALCANTI et al., 2005).
2.3.1 Acibenzolar-S-metílico (ASM)
Avanços nas pesquisas envolvendo a indução de resistência em plantas vêm
sendo acompanhados pelo surgimento de produtos comerciais, como o Bion, Messenger,
Elexa, Orizamate e Oxycom.
11
O acibenzolar-S-metílico (ASM) é o composto mais estudado e mais eficiente
como ativador de genes que codificam a resistência de plantas (MORAES, 2006). Esse
composto tem se mostrado mais eficiente na indução de resistência quando comparado
ao AS e ao ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA), além de apresentar baixa fitotoxidez
(GORLACH et al., 1996; KUNZ et al., 1997).
A duração da resistência induzida desencadeada por ASM afeta o progresso da
doença em função da produção de compostos associados à defesa na planta. O ASM,
derivado benzotiadiazólico, é um composto sintético análogo funcional do ácido
salicílico. Da mesma forma que o ácido salicílico (AS), o ASM atua como ativador
químico de resistência, fornecendo proteção contra o mesmo espectro de patógenos e
ativando a expressão dos mesmos genes que atuam principalmente na produção de
proteínas-RP (CAVALCANTI et al., 2005).
PARKINSON et al. (2015), estudando a eficiência de ASM sobre o
desenvolvimento de Passionfruit woodiness virus (PWV) e sobre a atividade de proteínas
relacionadas a patogênese em maracujazeiro, demonstrou o aumento da atividade de
quitinase e β-1,3-glucanase em folhas tratadas com ASM e subsequente inoculação.
Entende-se que há necessidade de harmonização entre doses e intervalos entre
aplicações de um indutor de resistência para que se obtenha uma adequada indução na
planta. A importância desta harmozinação foi demonstrada por HUANG et al. (2012) em
estudo sobre o controle de Xanthomonas spp em tomateiro através do indutor de
resistência ASM. PARKINSON et al. (2015), comparando concentrações de 0,10 e 0,05
g do ingrediente ativo ASM por litro, verificaram maior atividade dessas proteínas em
folhas tratadas com a menor concentração de ASM. Esses trabalhos mostram que nem
sempre se obtém um incremento na indução de resistência através do aumento de doses,
e que há necessidade de estudos de doses e intervalos entre aplicações para a validação
do uso de indutores de resistência no manejo de doenças em cada cultura.
As interações Tobbaco mosaic virus, Cercospora nicotianae, Phytophthora
parasitica, Erwinia carotovora e Pseudomonas syringae pv. tabaci em fumo; Erysiphe
graminis em trigo; infecções bacterianas em pimentão; e Xanthomonas vesicatoria em
tomate são alguns exemplos de sucesso do uso do ASM como indutor de resistência no
controle de doenças (KUHN et al., 2006).
No Brasil, o ASM foi registrado junto ao Ministério da Agricultura e
Abastecimento, sob o nome comercial Bion pela Syngenta Proteção de Cultivos LTDA,
para proteção contra doenças em algodoeiro, batata, cacaueiro, citros, melão, tomateiro e
feijoeiro (AGROFIT, 2015).
12
Em citros é indicado no controle da bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da
clorose variegada dos citros (CVC) (AGROFIT, 2015). A indução de resistência pelo
ASM contra o cancro cítrico (Xanthomonas citri) também é comprovada (GRAHAM &
MEYERS, 2011 e 2013; MILLER et al., 2011).
Para o HLB, ainda não há comprovação de que o ASM pode ser utilizado dentro
do manejo da doença. Todavia, AGNELLI (2011) demonstrou que o ASM retardou o
aparecimento de plantas cítricas com ‘Ca. L. asiaticus’ em condições controladas, quando
aplicado em plantas inoculadas artificialmente por meio de enxertia de borbulhas
provenientes de ramos sintomáticos de plantas afetadas pelo HLB. Acredita-se que a
indução de resistência através do ASM possa ser eficaz como controle preventivo do HLB
em condições de infecção natural, através do seu vetor, uma vez que esse, possivelmente,
contém uma menor quantidade de bactéria em comparação a borbulhas infectivas
provenientes de ramos assintomáticos.
Abaixo de um determinado título da bactéria é possível que as plantas resistam
e que seus mecanismos de defesa possam conferir proteção contra as infecções (PELZ-
STELINSK et al., 2010). Destaca-se a necessidade de estudos que avaliem a capacidade
do ASM em induzir a resistência em plantas cítricas contra o desenvolvimento ‘Ca. L.
asiaticus’ em condições de infecção mais próximas da forma natural da disseminação da
doença nos pomares.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Condições experimentais
Dois experimentos foram implementados: (i) realizado por infecção artificial via
enxertia de borbulhas provenientes de ramos de plantas ‘Candidatus Liberibacter
asiaticus’ positivas (Las+) e (II) por infecção via inoculação de psilídeos infectivos (Las+)
em ramos em desenvolvimento (brotações).
Ambos os experimentos foram conduzidos no município de Holambra-SP
(22º38’55”S 47º04’49”O), utilizando-se a variedade de copa laranjeira Pêra [Citrus
sinensis (L.) Osbeck] enxertadas sobre limoeiro cravo (C. limonia Osbeck). As plantas
foram transplantadas com espaçamento de 7m entre linhas e 2m entre plantas. O pomar
foi conduzido com sistema de irrigação por gotejo, em solo de textura média (Figura 3).
As mudas para os ensaios foram adquiridas de um viveiro comercial certificado
para produção de mudas cítricas segundo as normas da CDA (COORDENADORIA DE
13
DEFESA AGROPECUÁRIA DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2006). Com o objetivo
de certificar que as mesmas eram sadias quanto a HLB, algumas plantas foram amostradas
e suas folhas submetidas para análise de qPCR antes de se iniciar o experimento.
Amostras resultaram em ausência de Las. Em função do uso de psilídeos no experimento
II, algumas mudas foram previamente expostas à alimentação de insetos não infectivos
para checar o efeito de resíduos de inseticidas nas mudas. A não ocorrência de
mortalidade indicaram ausência de residual significativo de inseticidas. Em ambos os
experimentos foram adquiridas mudas com três pernadas para facilitar a inoculação de
psilídeos em voal.
Figura 3 Área experimental, Holambra-SP.
3.2 Infecção artificial via enxertia
O início do experimento deu-se pela inoculação através do método da enxertia,
descrito por LOPES & FRARE (2008). Foi realizado um corte longitudinal de
aproximadamente quatro centímetros em lados opostos do caule a ser inoculado, mais ou
menos cinco centímetros acima da linha de junção do porta-enxerto com a copa. Em
seguida, um segmento de quatro centímetros de comprimento (borbulhão), com diâmetro
equivalente a 2/3 do caule da planta a ser inoculada, foi removido de ramo infectado
(Las+) e após corte longitudinal foi afixado na região do corte. Cada planta recebeu dois
borbulhões, de aproximadamente 5 mm de diâmetro e 15 mm de comprimento,
enxertados em lados opostos no caule.
14
A fixação do borbulhão foi feita por meio de fitas de plástico transparente de
dois centímetros de largura (fitilho), comumente empregadas na formação de mudas em
viveiros. O fitilho foi removido do caule 20 dias após a enxertia (após o pegamento do
enxerto), quando as mudas foram transplantadas em campo. Antes da remoção do fitilho,
as mudas foram mantidas em casa de vegetação (temperatura entre 20,4 e 26,5 °C,
umidade relativa do ar entre 70 a 75% e irrigações duas vezes ao dia) para evitar
movimentação entre o caule e a borbulha, o que poderia comprometer o pegamento da
enxertia. O controle negativo foi constituído de plantas enxertadas com borbulhões
provenientes de mudas sadias (testemunha Las-), como descrito anteriormente.
Os ramos infectados com HLB foram fornecidos pelo Centro APTA Citros
Sylvio Moreira/IAC, previamente confirmados em qPCR, infectados apenas com a
espécie ‘Ca. L. asiaticus’.
3.3 Infecção via inoculação de psilídeos adultos infectivos
Para obtenção dos psilídeos infectivos foi utilizada uma população de psilídeos
conhecida, isenta de Las, que foi confinada em plantas fontes de HLB, diagnosticadas
com ‘Ca. L. asiaticus’ através de PCR. Inicialmente, optou-se por utilizar adultos
oriundos da primeira geração da população não infectiva, criada nas plantas fontes (Las+).
Porém, foi uma metodologia que trouxe desafios significativos de implementação,
tornando-se inviável, em função do elevado número de insetos e plantas fontes demandas
frente ao número de tratamentos e repetições do experimento. Dessa forma, ao invés de
criá-los em planta fonte para as demais inoculações, optou-se em utilizar insetos adultos
expostos às plantas fontes pelo período de 20 dias. Adotou-se o período de 20 dias em
função de testes preliminares de qPCR que asseguraram ser um período suficiente para a
aquisição da bactéria pelos adultos.
As plantas fonte (Las+) foram fornecidas pelo Fundo de Defesa da Citricultura
(Fundecitrus), previamente confirmadas em qPCR e correspondentes apenas à espécie
‘Ca. L. asiaticus’. O confinamento nas plantas fontes, mantidas em casa de vegetação
(temperatura entre 23,5 e 27,5 °C, umidade relativa do ar entre 70 a 75% e irrigações duas
vezes ao dia), foi realizado em brotações de aproximadamente metade do seu
comprimento final e folhas tenras com 6 a 7 cm de comprimento (estádio V3-V5, de
acordo com a chave descritiva de estádios fenológicos de vegetação em citros da
STOLLER® - Figura 4).
15
Figura 4 Descrição de estádios fenológicos de vegetação em citros (Fonte:
Stoller®).
Durante todo o experimento, foram realizadas cinco inoculações em cada planta,
sendo o intervalo entre as mesmas de 60 dias. A primeira inoculação foi realizada aos
cinco dias após o início dos tratamentos. Foram confinados 20 psilídeos infectivos em
cada planta, permanecendo na mesma pelo período de 15 dias. Após retirados, foi
avaliada a porcentagem de mortalidade dos insetos e os mesmos foram encaminhados
para análise de qPCR para confirmação da presença de ‘Ca. L. asiaticus’. O confinamento
em campo foi realizado em ramos com folhas entre o estádio V3-V5, em algumas plantas
V7 em função da dificuldade de padronização de brotações em condições de campo. O
controle negativo constituiu-se de plantas confinadas com psilídeos não infectivos
(testemunha Las-), como descrito anteriormente.
3.4 Tratamentos Indutores
16
Os tratamentos foram aplicados via foliar (pulverizador propelido a gás
carbônico) utilizando-se um volume de 50 mL de água por planta. Foram trabalhados
quatro intervalos de aplicação: 15, 30, 45 e 60 dias. Ambos os experimentos (I e II) foram
submetidos aos mesmos tratamentos de dose e intervalo de aplicação, diferindo apenas
quanto à metodologia de inoculação de ‘Ca. L. asiaticus’. A descrição dos tratamentos
segue na Tabela 1. As testemunhas (Las- e Las+) não receberam nenhum tratamento.
Em ambos os experimentos seguiu-se um cenário preventivo para o uso do
indutor de resistência. No experimento I, a primeira aplicação foi efetuada logo após a
enxertia. Assumiu-se que: (i) há um tempo mínimo para que a união dos tecidos da planta
e da borbulha ocorra; (ii) a transmissão da bactéria da borbulha para a planta requer a
união desses tecidos; e (iii) que esse tempo de união dos tecidos é suficiente para que o
tratamento, e seu efeito indutor, anteceda a chegada da bactéria na planta. No experimento
II, o confinamento dos psilídeos foi realizado aos cinco dias após a primeira aplicação.
Foram utilizadas 14 repetições por tratamento, sendo que cada planta representou uma
parcela. O delineamento experimental foi blocos ao acaso.
Tabela 1 Descrição dos tratamentos, doses e intervalos de aplicação do indutor de
resistência para os experimentos I e II.
Tratamento Dose
(mg i.a2/planta)
Dose
(mg p.c3/planta)
Intervalo entre
aplicação (dias)
1. Testemunha Las- - - -
2. Testemunha Las+ - - -
3. ASM 500 WG¹ 25 50 15
4. ASM 500 WG 50 100 15
5. ASM 500 WG 25 50 30
6. ASM 500 WG 50 100 30
7. ASM 500 WG 100 200 30
8. ASM 500 WG 50 100 45
9. ASM 500 WG 100 200 45
10. ASM 500 WG 200 400 45
11. ASM 500 WG 50 100 60
12. ASM 500 WG 100 200 60
13. ASM 500 WG 200 400 60
¹Aplicações realizadas pelo período de 12 meses. ASM = acibenzolar-S-metílico,
ingrediente ativo do produto comercial Bion 500 WG; 2ingrediente ativo; 3produto
comercial.
17
3.5 Avaliações
Aos 60, 120, 180, 270, 360 (ambos experimentos), 440 (experimento via
psilídeos) e 500 (experimento enxertia) dias após o início dos tratamentos, a presença de
Las foi avaliada pelo método de PCR (polymerase chain reaction) em tempo real (qPCR),
identificando as plantas ‘Ca. L. asiaticus’ positivas coletando-se seis folhas por planta
(duas folhas em cada pernada). As mesmas foram encaminhadas para o laboratório do
Fundecitrus, no município de Araraquara-SP, para análise de qPCR.
Aos 440 dias foi realizada poda drástica no experimento I (via enxertia). Para
última coleta deste experimento, aguardou-se a rebrota das plantas, de modo que a coleta
de amostras ocorreu apenas aos 500 dias após o início dos tratamentos. A operação de
poda drástica foi um artifício utilizado para estimular a brotação e a multiplicação da
bactéria nos vasos do floema dos novos brotos (AGNELLI, 2011).
Durante a coleta das folhas, as plantas dos experimentos foram observadas
quanto a incidência dos seguintes sintomas: mosqueado assimétrico, nervura amarelada e
espessa, deficiência de zinco (cloroses internervais contrastantes às nervuras central e
laterais verde-escuras das folhas) leve (até 10% de cloroses no limbo foliar), média (10 a
50% de cloroses no limbo foliar) e severa (acima de 50% de cloroses no limbo foliar),
deficiência de manganês (clorose internerval - folhas jovens) e deficiência de magnésio
(clorose em forme de V – folhas velhas), por serem estes os sintomas mais comuns
associados ao desenvolvimento do HLB e que se evidenciaram durante a condução dos
experimentos. Plantas saudáveis foram classificadas como sem sintomas (Figura 5). Ao
final das avaliações notou-se significativa queda de folhas em diversas plantas, de forma
que esses dados também foram avaliados para ambos os experimentos.
18
Figura 5 Sintomas associados ao HLB observados durante a condução dos
experimentos. (A) mosqueado, (B) nervura amarelada e espessa, (C) deficiência de zinco
leve, (D) deficiência de zinco média, (E) deficiência de zinco severa, (F) deficiência de
manganês, (G) deficiência de magnésio e (H) sem sintomas.
Avaliações de diâmetro de caule (com auxílio de um paquímetro digital, 5 cm
acima da região da enxertia) e altura de plantas (régua) foram realizadas aos 0 (prévia),
180 e 360 dias após o início dos tratamentos com o objetivo de identificar e quantificar o
efeito das aplicações sobre o desenvolvimento das plantas.
3.6 Análise qualitativa através de qPCR
3.6.1 Extração de DNA das folhas
A extração de DNA das amostras foi conduzida utilizando o método do CTAB
(MURRAY & THOMPSON, 1980). Foram pesados 0,5 g de material vegetal (pecíolo e
nervura central), picado com lâmina sobre papel toalha, colocado em sacola plástica e o
macerado em homogeneizador Homex.
Após a maceração, o tampão foi transferido com pipeta Pasteur para um
microtubo de 2 mL e incubadas em banho-maria a 65 °C por um período de 30 minutos.
Após a incubação, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 18.000
g e 900 μL do sobrenadante foram recuperados para outro tubo de 2 mL, onde se
adicionou o mesmo volume de clorofórmio:álcool isoamil (24:1). Após a
homogeneização, os tubos foram centrifugados a 18.000 g por mais cinco minutos.
Recuperou-se 800 μL do sobrenadante, transferindo-o a outro tubo de 1,5 mL,
sendo adicionado 480 μL de isopropanol. Após o processo, as amostras foram incubadas
19
por 30 minutos a -4 ºC para a precipitação do DNA. Após esse período, as amostras foram
centrifugadas por 20 minutos a 18.000 g, o sobrenadante descartado e o pellet
(precipitado) lavado com 900 μL de etanol 70 %, centrifugado por dez minutos a 18.000
g. Esse processo foi repetido mais um vez para obtenção de um DNA limpo de sais.
Em seguida, os tubos contendo DNA foram secos em “speed vacum” por seis
minutos e o DNA ressuspenso em 50 μL de água ultrapura e armazenado a 4 ºC.
3.6.2 Extração de DNA de Diaphorina citri
A extração do DNA das amostras foi conduzida utilizando-se o método do
CTAB (MURRAY & THOMPSON, 1980). As amostras de insetos foram maceradas,
com auxílio de um pistilo, em tubos de 1,5 mL contendo 400 μL de tampão e, em seguida,
incubadas a 65 °C por um período de 30 minutos. Após incubação, as amostras foram
centrifugadas por 5 minutos a 960 g. Foram recuperados 350 μL do sobrenadante e
adicionados a 350 μL da solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Após
homogeneização, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 15.300 g.
Posteriormente, 300 μL do sobrenadante foi transferido para novos tubos e em cada
amostra acrescentou-se 180 μL de isopropanol para precipitação do DNA através de
incubação a -20 °C por 30 minutos. Após esse período, as amostras foram centrifugadas
a 15.300 g por 20 minutos, o sobrenadante descartado e o pellet lavado duas vezes com
700 μL de etanol 70%. Esse processo foi repetido mais um vez para obtenção de um DNA
limpo de sais.
Em seguida, os tubos contendo DNA foram secos em “speed vacum” por dez
minutos e o DNA ressuspenso em 30 μL de água ultrapura.
3.6.3 Detecção de ‘Ca. Liberibacter asiaticus’ através de qPCR
As amostras do processo anterior foram analisadas para a detecção de presença
de ‘Ca. L. asiaticus’ através do método PCR em tempo real (qPCR), considerado mais
sensível do que o PCR convencional para a detecção de ‘Ca. L. asiaticus’ (LI et al, 2006;
TEIXEIRA et al., 2005b). Para a detecção de de ‘Ca. L. asiaticus’ foram utilizados os
oligonucleotídeos e sonda descritos por LI et al. (2006).
Para cada reação, usou-se 1 μL de DNA, Master Mix [1x], 0,5 μM dos primers
HLBas e HLBr e 0,2 μM da sonda HLBp, em um volume final de reação igual a 12 μL.
A reação de polimerase em cadeia (PCR) consistiu de desnaturação inicial por dois
20
minutos a 50 ºC, 95 ºC durante dez minutos, seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 95 ºC
e 45 segundos a 59 ºC de anelamento e extensão. Os controles utilizados foram: sadio
(sem a presença de ‘Ca. Liberibacter spp.’), positivo (DNA com a presença de ‘Ca.
Liberibacter asiaticus’) e negativo (água – ausência de DNA).
As leituras da fluorescência foram realizadas no equipamento StepOnePlus™
Real-Time PCR System (Applied Biosystems) a cada ciclo de amplificação e,
posteriormente, analisados com o StepOne™ Software v2.3. As amostras que obtiveram
um Ct (número de ciclos de PCR necessários para que a fluorescencia ultrapasse o limiar
de detecção) abaixo de 35 foram consideradas positivas para ‘‘Ca. L. asiaticus’’.
3.7 Análises estatísticas
Para verificar a possível ocorrência de diferenças significativas entre os
tratamentos, as médias dos parâmetros quantitativos (diâmetro do caule e altura de
planta), foram submetidas a análise de variância e posteriormente, comparadas pelo teste
de Scott-Knott (5%), utilizando o software SISVAR. Para os dados qualitativos não
paramétricos (resultados qualitativos de qPCR), foi utilizado o teste do qui-quadrado de
Pearson em pares, comparando-se os tratamentos que receberam ASM com a testemunha
positiva e negativa, considerando-se o valor de P < 0,05, através do software SAS
INSTITUTE INC. (2013).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Experimento 1 – Infecção via enxertia
4.1.1 Desenvolvimento de plantas
Analisando-se os resultados de desenvolvimento de plantas pelos parâmetros
diâmetro do caule e altura de plantas, não detectou-se diferenças significativas entre os
tratamentos (Tabelas 2 e 3).
21
Tabela 2 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o diâmetro do
caule de plantas jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores
representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.
Tratamento Dose² Intervalo³ Diâmetro do caule (mm)
4
0DAIA5
180DAIA 360DAIA %Incremento6
1. Testemunha Las- - - 9,8 11,4 19,4 98
2. Testemunha Las+ - - 9,7 11,7 18,5 91
3. ASM 500 WG¹ 25 15 9,8 11,9 18,7 91
4. ASM 500 WG 50 15 9,3 11,6 18,3 97
5. ASM 500 WG 25 30 9,6 11,7 18,5 93
6. ASM 500 WG 50 30 9,3 11,5 18,4 98
7. ASM 500 WG 100 30 9,7 12,0 18,9 95
8. ASM 500 WG 50 45 9,5 12,0 20,4 115
9. ASM 500 WG 100 45 9,5 11,7 16,9 78
10. ASM 500 WG 200 45 9,2 11,3 18,8 104
11. ASM 500 WG 50 60 8,9 11,3 19,3 117
12. ASM 500 WG 100 60 9,3 11,6 20,1 116
13. ASM 500 WG 200 60 10,3 11,7 19,9 93
Scott-Knott 5% - CV (%) 9,71 NS7
9,88 NS 17,33 NS 21,07 NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4medição: 5
cm acima da enxertia; 5dias após início das aplicações; 6em relação ao tempo zero
(0DAIA); 7não significativo.
O desenvolvimento de plantas é um importante parâmetro que sempre deve ser
acompanhado em estudos com indutores de resistência. O custo fisiológico da indução de
resistência foi um tema bastante discutido em trabalhos anteriores no que diz respeito a
uma troca ou compensação entre controle da doença e reduções em produtividade
(VALLAD & GOODMAN, 2004; WALTERS et al., 2005). Resultados indicam que essa
compensação varia de acordo com espécie e condições ambientais (WALTERS et al.,
2005).
LI et al. (2016), em experimentos com diversos indutores de resistência em
condições de campo para o controle de HLB em citros, constataram efeito positivo sobre
produtividade e qualidade de frutos. Possivelmente, o resultado observado seja reflexo do
efeito positivo dos indutores, permitindo as plantas agirem suprimindo o
desenvolvimento do HLB ao longo do tempo. Os autores não observaram efeitos
22
negativos relacionados a um possível custo fisiológico da indução de resistência, fato que
infere sobre a viabilidade do uso de indutores em nível comercial, portanto sem impacto
negativo sobre a produtividade.
No presente estudo, trabalhou-se com plantas jovens por um curto período de
tempo, apenas um ano, não sendo possível a realização de avaliação de produtividade. No
Brasil, ainda faltam informações para um melhor entendimento do efeito de compensação
do ASM e outros indutores de resistência sobre produtividade de plantas cítricas ao longo
de safras.
23
Tabela 3 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de plantas
jovens infectadas por ‘Ca. L. asiaticus’ através da enxertia. Valores representam a média
de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.
Tratamento Dose² Intervalo³ Altura de plantas (cm)
0DAIA4
180DAIA 360DAIA %Incremento5
1. Testemunha Las- - - 73 78 108 48
2. Testemunha Las+ - - 74 83 100 35
3. ASM 500 WG¹ 25 15 77 83 105 36
4. ASM 500 WG 50 15 76 83 98 29
5. ASM 500 WG 25 30 73 82 99 36
6. ASM 500 WG 50 30 74 81 98 32
7. ASM 500 WG 100 30 76 84 96 26
8. ASM 500 WG 50 45 79 83 115 46
9. ASM 500 WG 100 45 78 85 94 21
10. ASM 500 WG 200 45 75 82 102 36
11. ASM 500 WG 50 60 72 80 107 49
12. ASM 500 WG 100 60 74 80 104 41
13. ASM 500 WG 200 60 71 82 109 54
Scott-Knott 5% - CV (%) 9,89 NS6 9,36 NS 15,41 NS 30,19 NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4dias após
início das aplicações; 5em relação ao tempo zero (0DAIA); 6não significativo.
4.1.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’
A evolução do número de plantas Las+, no ensaio I (enxertia) ocorreu de forma
pouco significativa até os 180 dias após o início das aplicações (DAIA) – dados não
mostrados. Até aquele momento, apenas uma planta Las+, dentre as 14 repetições, foi
identificada na testemunha Las+ (Tabela 4). A maioria dos tratamentos com ASM
começou a mostrar alguma manifestação de ‘Ca. L. asiaticus’, porem não houve
diferenças significativas quando comparados à testemunha Las+.
Aos 270 DAIA, a testemunha Las+ apresentou cinco plantas positivas (36 %)
para ‘Ca. L. asiaticus’. Como esperado, nenhuma planta positiva para ‘Ca. L. asiaticus’
foi identificada na testemunha Las- até aquele momento. Os únicos tratamentos que foram
significativamente iguais à testemunha Las- e distintos da testemunha Las+ foram os
tratamentos 6 e 9: 50 mg i.a. planta-1 (com intervalos de 30 dias entre as aplicações) e 100
mg i.a. planta-1 (com intervalos de 45 dias entre as aplicações), os quais apresentaram
24
apenas uma e duas plantas Las+, atingindo 79 e 60 % de eficiência em controle (fórmula
de Abbott), respectivamente, quando comparados à testemunha Las+ (Tabela 4).
Embora esses mesmos tratamentos com ASM não tenham se diferenciado
significativamente da testemunha Las+ aos 360 DAIA (Tabela 4), foram os únicos
tratamentos que se mantiveram semelhantes à testemunha Las-, mantendo uma eficiência
em controle em torno de 50% quando comparados à testemunha Las+.
Após 360 DAIA, as aplicações com ASM foram encerradas para todos os
tratamentos. Aos 440 DAIA, realizou-se poda drástica em todas as plantas com a
finalidade de estimular a brotação e a atividade da bactéria nos vasos do floema antes de
se realizar a última coleta de folhas para análise em qPCR, de acordo com AGNELLI
(2011).
Embora a testemunha Las+ tenha atingido elevada incidência (64%) de plantas
positivas para ‘Ca. L. asiaticus’ durante o experimento (Tabela 4), notou-se que não
houve efeito significativo de Las sobre o diâmetro de caule e altura de plantas (Tabelas 2
e 3), dentro do período observado.
25
Tabela 4 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a da presença de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens infectadas através de
enxertia. Total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 500 dias após o início das aplicações do indutor.
Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
180 DAIA4 270 DAIA 360 DAIA 500 DAIA
Total5 %6 Vs7
Las-
Vs
Las+ %E8 Total % Vs Las-
Vs
Las+ %E Total %
Vs
Las-
Vs
Las+ %E Total %
Vs
Las-
Vs
Las+ %E
1. Test. Las- - - 0 - NS9 NS - 0 - NS * - 1 7 NS * - 2 14 NS * -
2. Test. Las+ - - 1 7 NS NS - 5 36 * NS - 9 64 * NS - 10 71 * NS -
3. ASM 500 WG¹ 25 15 2 14 NS NS - 8 57 * NS 0 9 64 * NS 0 10 71 * NS 0
4. ASM 500 WG 50 15 2 14 NS NS - 7 50 * NS 0 8 57 * NS 11 9 64 * NS 9
5. ASM 500 WG 25 30 1 7 NS NS - 4 29 * NS 21 6 46 * NS 28 7 54 * NS 24
6. ASM 500 WG 50 30 1 8 NS NS - 1 8 NS * 79 4 31 NS NS 52 9 69 * NS 2
7. ASM 500 WG 100 30 2 14 NS NS - 4 29 * NS 21 7 54 * NS 16 8 62 * NS 13
8. ASM 500 WG 50 45 1 7 NS NS - 4 29 * NS 21 6 43 * NS 33 7 50 * NS 30
9. ASM 500 WG 100 45 1 7 NS NS - 2 14 NS * 60 4 33 NS NS 48 7 58 * NS 18
10. ASM 500 WG 200 45 0 - NS NS - 6 43 * NS 0 8 57 * NS 11 9 64 * NS 9
11. ASM 500 WG 50 60 2 14 NS NS - 4 29 * NS 21 6 43 * NS 33 9 64 * NS 9
12. ASM 500 WG 100 60 4 29 * NS - 6 43 * NS 0 7 50 * NS 22 11 79 * NS 0
13. ASM 500 WG 200 60 2 14 NS NS - 5 36 * NS 0 7 50 * NS 22 8 57 * NS 20
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após início das aplicações; 5total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’
por tratamento; 6porcentagem de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 7análise estatística versus testemunha Las- ou Las+; 8porcentagem
de eficiência de controle (fórmula de Abbott) em relação a testemunha Las+; 9NS: não significativo e * significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
26
Aos 500 DAIA, todos os tratamentos com ASM foram semelhantes à testemunha
Las+ e distintos da testemunha Las- para o teste do qui-quadrado de Pearson (Tabela 4).
Esses resultados descartam falhas de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia
que poderiam justificar a menor percentagem de plantas Las+ nos tratamentos que se
destacaram neste estudo.
Em metodologia de infecção similar ao experimento I, porém trabalhando-se
com a dose de 0,8 g.L-1 (20 mg i.a.L-1) em aplicações foliares com intervalo de 20 dias, e
em casa de vegetação, AGNELLI (2011) constatou superioridade significativa entre ASM
e testemunha Las+ apenas aos 180 DAIA, atigindo o máximo de 50% de eficiência em
controle durante todo o seu experimento. A partir dos 270 DAIA, ASM se assemelhou
novamente à testemunha Las+, e ambos os tratamentos atingiram mais de 90% de plantas
Las+ ao final das avaliações (após poda drástica), da mesma forma como realizado neste
trabalho.
Sabe-se que a indução confere uma resistência parcial e que pode requerer
reativações temporárias (SILVA & RESENDE, 2001), pois a duração da resistência
induzida desencadeada por ASM afeta o progresso da doença em função da manutenção
da produção de compostos associados à defesa na planta. Os resultados obtidos aos 500
DAIA sugerem que a continuidade das aplicações com ASM, em intervalos de 30 e 45
dias nas doses de 50 e 100 mg i.a. planta-1, respectivamente, é necessária para a
manutenção da indução de resistência em plantas cítricas.
Preservando-se as devidas diferenças entre o experimento I e o trabalho
conduzido por AGNELLI (2011), nota-se que, com o passar do tempo, o número de
plantas infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’ nos tratamentos com ASM aumenta, atingindo
níveis similares à testemunha Las+. Este comportamento mostra que, sob as condições
testadas, a resposta da planta, frente a ativação por ASM, retardou a detecção da bactéria,
porém não foi capaz de eliminar ou inibir completamente a presença de Las.
Todavia, ambos os trabalhos mostram que, mesmo em condições mais agressivas
que a forma de transmissão do HLB em condições de campo, existem de fato propriedades
que dificultam a manifestação de ‘Ca. L. asiaticus’, o que evidencia o potencial de uso
do ASM como mais uma alternativa para o manejo de HLB em citros.
LI et al. (2016), em condições de campo, testando diversos indutores de
resistência para o controle de HLB em citros, constatou diminuição significativa do
crescimento da população de ‘Ca. L. asiaticus’ e redução na severidade da doença entre
15 a 30%, quando comparado a testemunha. O ácido β-aminobutírico (BABA) e 2,1,3-
benzothiadiazole (BTH) foram os tratamentos que mostraram maior estabilidade de
27
desempenho. Os resultados foram obtidos em pomares de 4 a 10 anos de idade, em plantas
sintomáticas, previamente confirmadas quanto a presença de ‘Ca. L. asiaticus’ através de
qPCR.
Embora BHT e ASM diferenciem-se em nível de estrutura química (Figura 6),
pertencem ao mesmo grupo químico (benzotiadiazol) e possuem modo de ação similar,
sugerindo que os resultados de BHT sejam mais um indicativo do potencial de ASM. As
descorbertas de LI et al. (2016) validam o potencial de uso de indutores de resistência na
estratégia de manejo do HLB e adicionam informações para um cenário curativo de
aplicação.
Figura 6 Estrutura química do BTH (A) e ASM (B) (Fonte: Sigma Aldrich® e
Syngenta®).
Durante todo o experimento não foi observado incremento em controle de ‘Ca.
L. asiaticus’ através do aumento de doses do indutor ASM. Dentre todas as combinações
testadas, apenas duas apresentaram desempenho satisfatório: 50 mg i.a. planta-1 (com
intervalos de 30 dias entre as aplicações) e 100 mg i.a. planta-1 (com intervalos de 45 dias
entre as aplicações).
O entendimento dos dados obtidos está ligado, possivelmente, aos mecanismos
envolvidos no processo de indução de resistência. O ASM atua como ativador químico
de resistência, fornecendo proteção contra patógenos através da ativação da expressão
dos genes que atuam, principalmente, na produção de proteínas-RP (CAVALCANTI et
al., 2005).
GORLACH et al. (1996), estudando o efeito de indutores de resistência sobre o
desenvolvimento de Erysiphe graminis f sp tritici em trigo, encontrou correlação positiva
entre ativação de genes (wheat chemically induced genes - WCI) e controle do patógeno
em plantas induzidas e, posteriormente, inoculadas, bem como a existência de um limiar
de ativação, ou seja, de uma dose mínima do indutor para que expressão gênica,
resistência e níveis de controle do patógeno observados fossem significativos.
28
PARKINSON et al. (2015), estudando a eficiência de ASM sobre o
desenvolvimento de Passionfruit woodiness virus (PWV) em maracujazeiro, comparou
concentrações de 0,10 e 0,05g do ingrediente ativo ASM por litro, verificando maior
atividade de proteínas-RP (quitinase e β-1,3-glucanase) em folhas tratadas com a menor
concentração de ASM, demonstrando que nem sempre se obtém um incremento na
indução de resistência através do aumento de doses, e que a intensidade de ativação de
genes ligados à resistência necessita de quantidades específicas de indutores.
A respeito de intervalos entre aplicações, os melhores resultados foram
encontrados para os intervalos de 30 e 45 dias. Para estudos de indução de resistência, a
harmonização utilizada entre dose e intervalo entre aplicações mostra-se mais relevante
do que o entendimento do efeito de doses e intervalos isoladamente. A importância desta
harmonização foi demonstrada por HUANG et al. (2012) onde, em estudo sobre o
controle de Xanthomonas spp em tomateiro através do indutor de resistência ASM, a
eficiência de ASM em campo também esteve associada à frequência e dose aplicada, não
havendo um incremento na indução de resistência através do aumento de doses.
4.1.3 Evolução de sintomas associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’
Trabalhando com HLB em plantas cítricas inoculadas através do método da
enxertia, LOPES et al. (2009a) e AGNELLI (2011), observaram os primeiros sintomas
associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’ aos 120 dias após inoculação, porém
ocorrendo de forma pouco significativa e aleatória entre os tratamentos. No experimento
I, houve maior incidência a partir dos 270 DAIA. A avaliação de 270 DAIA foi refeita
aos 360 DAIA, porém como não houve mudanças significativas de uma época para outra,
neste trabalho optou-se por registrar apenas os resultados aos 270 DAIA.
O sintoma que mais se observou no experimento foi de deficiência de zinco, o
qual foi segmentado em leve, médio e severo. No entando, em função da baixa e aleatória
incidência os dados de deficiência de zinco leve e médio não são mostrados.
Com relação ao desenvolvimento de sintomas de deficiência nutricional, apenas
para zinco intenso foram observadas diferenças significativas. Na comparação em pares
com a testemunha Las+, nenhum dos tratamentos, com exceção da testemunha Las-, se
diferenciou significativamente. Os tratamentos que se destacaram na indução de
resistência para ‘Ca. L. asiaticus’ (6 e 9) apresentaram valores mais baixos de incidência
de zinco severo, porém apenas o tratamento 6 (50mg i.a.planta-1 em intervalos de 30 dias)
foi semelhante à testemunha Las- (Tabela 5).
29
Segundo ALVARENGA (2013), essas desordens nutricionais são decorrentes de
prejuízos que a doença causa ao transporte de fotoassimilados na planta afetada pelo HLB
e consequentemente de elementos minerais das raízes para as folhas, como o
aparecimento de clorose no limbo foliar (Zn e Mn).
De acordo com VAHLING et al. (2011), o estudo do genoma da bactéria ‘Ca. L.
asiaticus’ tem revelado a presença de operons para a absorção de zinco e outros minerais,
indicando que esse pode ser um dos mecanismos de virulência ou associados aos sintomas
observados em plantas infectadas.
TIAN et al. (2014), utilizando imagem micro-XRF, observou que zinco esteve
preferencialmente localizado em tecidos do floema de folhas e caules sadios, porém
ausente em tecidos infectados, encontrando concentrações de zinco até 10 vezes maiores
em tecidos sadios. ZHANG et al. (2016) levantaram a hipótese de que sintomas
caracterizados como deficiência de zinco comumente presentes em plantas Las+ podem
resultar da absorção, pela bactéria, do nutriente do hospedeiro. Os autores, testando
diferentes doses de zinco, concluiram que embora plantas Las+ demonstrassem
deficiência de zinco, o fornecimento do nutriente aumentou os níveis no patógeno.
Possivelmente, o sequestro de zinco pelo metabolismo bacteriano seja uma explicação
para a pronunciada manifestação das deficiências severa de zinco, acompanhado à
evolução de plantas Las+ no experimento I.
O desenvolvimento do sintoma de mosqueado nas folhas, considerado como
sintoma típico e diagnóstico para a identificação da doença no campo, foi observado com
baixa freqüência e de forma não significativa, sendo esse resultado semelhante ao de
LOPES et al. (2009a) e AGNELLI (2011). O espessamento da nervura das folhas também
foi insignificante (Tabela 6).
Com a evolução dos sintomas de deficiência nutricional, em especial para o
zinco severo, ao final do experimento observou-se queda acentuada de folhas, realizando-
se também esta avaliação para todos os tratamentos. Para queda de folhas, os resultados
obtidos foram semelhantes à deficiência de zinco severa (Tabela 6).
Excluindo-se sintomas de deficiências leves (zinco, manganês e magnésio),
classificou-se cada planta em sintomática e assintomática – sem sintomas (Tabela 6).
Todos os tratamentos se diferenciaram significativamente da testemunha Las-, sendo que
a mesma apresentou 100% de suas plantas sem sintomas.
De modo geral, todos os tratamentos que receberam enxertia de borbulhas
infectadas com ‘Ca. L. asiaticus’, incluindo aqueles que mais interferiram na taxa de
infecção da bactéria, exibiram os sintomas avaliados, em especial para a deficiência
30
severa de zinco. Neste sentido, houve semelhança com os resultados obtidos por
AGNELLI (2011), onde mesmo no tratamento com ASM, que foi capaz de retardar a
detecção de ‘Ca. L. asiaticus’, os sintomas avaliados apareceram. A semelhança entre
esses trabalhos sugere que os sintomas observados são em grande parte em função da
agressividade do método de inoculação adotado.
COLETTA-FILHO et al. (2009) observaram uma relação direta entre a
concentração do patógeno e a expressão de sintomas. No entanto, no presente trabalho,
avaliando-se o desenvolvimento da doença através de respostas qualitativas em qPCR,
considera-se que não foi possível estabelecer uma boa conexão entre o desenvolvimento
da doença e o desenvolvimento de sintomas, visto que muitas vezes plantas identificadas
como Las+ através qPCR não apresentavam sintomas visuais em campo, ocorrendo com
frequência o contrário. A partir desta análise, sugere-se que, sempre que possível, a
diagnose em campo seja confirmada através de análise molecular.
31
Tabela 5 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas
por ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total), manganês, zinco+manganês e magnésio por
tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
Zinco (Severa) Zinco (Total) Manganês Zinco+Manganês Magnésio
Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+
1. Test. Las- - - 0 NS6 * 6 NS NS 10 NS NS 10 NS NS 1 NS NS
2. Test. Las+ - - 6 * NS 7 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
3. ASM 500 WG¹ 25 15 10 * NS 12 NS NS 13 NS NS 13 NS NS 0 NS NS
4. ASM 500 WG 50 15 8 * NS 10 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
5. ASM 500 WG 25 30 4 * NS 10 NS NS 10 NS NS 10 NS NS 1 NS NS
6. ASM 500 WG 50 30 2 NS NS 9 NS NS 12 NS NS 12 NS NS 1 NS NS
7. ASM 500 WG 100 30 3 NS NS 11 NS NS 12 NS NS 12 NS NS 0 NS NS
8. ASM 500 WG 50 45 3 NS NS 11 NS NS 12 NS NS 12 NS NS 1 NS NS
9. ASM 500 WG 100 45 4 * NS 11 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
10. ASM 500 WG 200 45 6 * NS 11 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 1 NS NS
11. ASM 500 WG 50 60 4 * NS 11 NS NS 14 NS NS 14 NS NS 2 NS NS
12. ASM 500 WG 100 60 9 * NS 11 NS NS 11 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
13. ASM 500 WG 200 60 6 * NS 11 NS NS 13 NS NS 13 NS NS 0 NS NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las- ou
Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
32
Tabela 6 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens infectadas
por ‘Ca. L. asiaticus’ através de enxertia. Total de plantas com mosqueado, nevuras amareladas e super desenvolvidas, queda significativa de folhas e
sem sintomas por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
Mosqueado Nervuras Queda de folhas Sem sintomas
Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+ Total4 Vs Las- Vs Las+
1. Test. Las- - - 0 NS6 NS 0 NS NS 0 NS * 14 NS *
2. Test. Las+ - - 0 NS NS 3 NS NS 6 * NS 6 * NS
3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 3 NS NS 9 * NS 4 * NS
4. ASM 500 WG 50 15 2 NS NS 2 NS NS 7 * NS 6 * NS
5. ASM 500 WG 25 30 0 NS NS 2 NS NS 4 * NS 9 * NS
6. ASM 500 WG 50 30 0 NS NS 1 NS NS 2 NS NS 10 * NS
7. ASM 500 WG 100 30 0 NS NS 1 NS NS 3 NS NS 8 * NS
8. ASM 500 WG 50 45 1 NS NS 2 NS NS 3 NS NS 9 * NS
9. ASM 500 WG 100 45 2 NS NS 2 NS NS 4 * NS 7 * NS
10. ASM 500 WG 200 45 1 NS NS 1 NS NS 5 * NS 7 * NS
11. ASM 500 WG 50 60 2 NS NS 2 NS NS 4 * NS 6 * NS
12. ASM 500 WG 100 60 3 NS NS 3 NS NS 7 * NS 5 * NS
13. ASM 500 WG 200 60 1 NS NS 4 NS NS 7 * NS 5 * NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las- ou
Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
33
4.2 Experimento II – Inoculação via psilídeos infectivos
4.2.1 Desenvolvimento de plantas
Analisando-se os resultados de desenvolvimento de plantas pelos parâmetros
diâmetro de caule e altura de plantas, não foram detectadas diferenças significativas entre
os tratamentos (Tabela 7 e 8). Todavia, assim como no Experimento I, as mesmas
considerações sobre o efeito de compensação se aplicam ao Experimento II.
Tabela 7 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o diâmetro do
caule de plantas jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos.
Valores representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.
Tratamento Dose² Intervalo³ Diâmetro do caule (mm)
4
0DAIA5
180DAIA 360DAIA %Incremento6
1. Testemunha Las- - - 9,1 11,5 19,9 119
2. Testemunha Las+ - - 9,6 12,1 21,6 125
3. ASM 500 WG¹ 25 15 9,5 12,1 20,7 118
4. ASM 500 WG 50 15 9,4 12,0 20,3 116
5. ASM 500 WG 25 30 9,4 11,7 21,2 126
6. ASM 500 WG 50 30 9,5 12,5 23,1 143
7. ASM 500 WG 100 30 9,1 12,3 23,0 153
8. ASM 500 WG 50 45 9,4 11,9 21,1 124
9. ASM 500 WG 100 45 9,6 12,2 22,3 132
10. ASM 500 WG 200 45 9,0 12,3 23,2 158
11. ASM 500 WG 50 60 9,2 11,9 22,7 147
12. ASM 500 WG 100 60 9,5 12,7 22,9 141
13. ASM 500 WG 200 60 9,5 12,1 21,3 124
Scott-Knott 5% - CV (%) 9,72 NS7 10,02 NS 19,08 NS 37,07 NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4medição: 5
cm acima da enxertia; 5dias após início das aplicações; 6em relação ao tempo zero
(0DAIA); 7Não significativo.
34
Tabela 8 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a altura de plantas
jovens inoculadas com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Valores
representam a média de 14 plantas por tratamento. Holambra, SP.
Tratamento Dose² Intervalo³ Altura de plantas (cm)
0DAIA4
180DAIA 360DAIA %Incremento5
1. Testemunha Las- - - 75 79 109 45
2. Testemunha Las+ - - 75 81 115 53
3. ASM 500 WG¹ 25 15 77 81 107 39
4. ASM 500 WG 50 15 77 81 110 43
5. ASM 500 WG 25 30 77 82 124 61
6. ASM 500 WG 50 30 80 85 115 44
7. ASM 500 WG 100 30 79 85 126 59
8. ASM 500 WG 50 45 81 87 114 41
9. ASM 500 WG 100 45 81 84 127 57
10. ASM 500 WG 200 45 78 83 118 51
11. ASM 500 WG 50 60 79 85 123 56
12. ASM 500 WG 100 60 79 85 118 49
13. ASM 500 WG 200 60 79 84 115 46
Scott-Knott 5% - CV (%) 9,01 NS6 8,51 NS 16,04 NS 49,64 NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4dias após
início das aplicações; 5em relação ao tempo zero (0DAIA); 6Não significativo.
4.2.2 Evolução da presença de ‘Ca. L. asiaticus’
A eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos
foi baixa neste experimento (Tabela 9). Mesmo aos 440 DAIA, momento em que se
contabilizava 80 dias desde a última aplicação, apenas duas plantas na testemunha Las+
foi identificada como Las+. Desse modo, não foi possível discorrer sobre o efeito do
indutor de resistência ASM sobre o desenvolvimento de ‘Ca. L. asiaticus’, usando-se essa
metodologia de inoculação.
35
Tabela 9 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre a presença de ‘Ca. L. asiaticus’ em plantas jovens inoculadas através de psilídeos
infectivos. Total de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento aos 180, 270, 360 e 440 dias após o início das aplicações. Holambra,
SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
180 DAIA4 270 DAIA 360 DAIA 440 DAIA
Total5 %6 Vs7 Las- Vs Las+ %E8 Total % Vs Las- Vs Las+ %E Total % Vs Las- Vs Las+ %E Total % Vs Las- Vs Las+ %E
1. Test. Las- - - 0 - NS9 NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 8 NS NS -
2. Test. Las+ - - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS - 2 14 NS NS -
3. ASM 500 WG¹ 25 15 0 - NS NS - 2 15 NS NS - 3 23 NS NS - 3 23 NS NS -
4. ASM 500 WG 50 15 0 - NS NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS - 0 - NS NS -
5. ASM 500 WG 25 30 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS -
6. ASM 500 WG 50 30 1 7 NS NS - 2 14 NS NS - 2 14 NS NS - 3 21 NS NS -
7. ASM 500 WG 100 30 0 - NS NS - 0 - NS NS - 2 14 NS NS - 3 21 NS NS -
8. ASM 500 WG 50 45 0 - NS NS - 0 - NS NS - 2 15 NS NS - 4 31 NS NS -
9. ASM 500 WG 100 45 1 7 NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS -
10. ASM 500 WG 200 45 0 - NS NS - 0 - NS NS - 2 14 NS NS - 3 21 NS NS -
11. ASM 500 WG 50 60 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS -
12. ASM 500 WG 100 60 1 7 NS NS - 2 14 NS NS - 3 21 NS NS - 3 21 NS NS -
13. ASM 500 WG 200 60 0 - NS NS - 0 - NS NS - 1 7 NS NS - 1 7 NS NS -
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após início das aplicações; 5total de plantas positivas em qPCR para
‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 6porcentagem de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’ por tratamento; 7análise estatística versus testemunha
Las- ou Las+; 8 porcentagem de eficiência de controle (fórmula de Abbott) em relação a tesmunha Las+; 9NS: não significativo e * é significativo para o
teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
36
Aos 15 dias após cada inoculação, realizou-se uma avaliação de mortalidade dos
psilídeos, amostrando-se duas repetições por tratamento. Os insetos foram encaminhados
para confirmação de aquisição através da análise de qPCR. Exceto pela primeira
inoculação, não houve diferenças significativas entre os tratamentos quanto à mortalidade
de insetos (Tabela 10), o que nos permite descartar este parâmetro como um significativo
fator de variação. Embora a amostragem de insetos tenha confirmado a aquisição de ‘Ca.
L. asiaticus’, os resultados de transmissão mostraram baixa eficiência, mesmo na
testemunha Las+ (Tabela 9).
Tabela 10 Porcentagem de mortalidade de psilídeos adultos e resultado em qPCR
para ‘Ca. L. asiaticus’ (amostragem de insetos provinientes de duas repetições por
tratamento) após o período de inoculação em campo, aos 5, 60, 120, 180 e 240 dias após
início das aplicações. Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
Confinamento
5DAIA4
Confinamento
60DAIA
Confinamento
120DAIA
Confinamento
180DAIA
Confinamento
240DAIA
M5 Las+6 M Las+ M Las+ M Las+ M Las+
1. Test. Las- - - 18 A -/- 21 -/- 21 -/- 21 -/- 18 -/-
2. Test. Las+ - - 9 A +/+ 26 -/- 38 +/+ 27 +/+ 25 +/+
3. ASM 500 WG¹ 25 15 14 A +/+ 32 -/- 45 +/+ 28 +/+ 21 +/+
4. ASM 500 WG 50 15 18 A +/+ 31 +/- 35 +/+ 20 +/+ 25 +/+
5. ASM 500 WG 25 30 32 B +/+ 23 -/- 43 +/+ 16 +/+ 23 +/+
6. ASM 500 WG 50 30 17 A +/+ 26 -/- 38 +/+ 21 +/+ 16 +/+
7. ASM 500 WG 100 30 25 A +/- 22 -/- 41 +/+ 19 +/+ 19 +/+
8. ASM 500 WG 50 45 23 A +/+ 25 -/- 37 +/+ 17 +/- 26 +/+
9. ASM 500 WG 100 45 42 B +/+ 32 +/- 43 +/+ 31 +/+ 34 +/+
10. ASM 500 WG 200 45 24 A +/+ 24 -/- 35 +/+ 18 +/+ 22 +/+
11. ASM 500 WG 50 60 30 B +/+ 28 -/- 40 +/+ 20 +/+ 29 +/+
12. ASM 500 WG 100 60 34 B +/+ 20 -/- 36 +/+ 25 +/+ 14 +/+
13. ASM 500 WG 200 60 40 B +/+ 29 -/- 39 +/+ 24 +/+ 22 +/+
Scott-Knott (5%) - CV (%) 19,09 23,20 NS7 33,83 NS 25,76 NS 26,72 NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 dias após
início das aplicações; 5mortalidade (%) de insetos após o período de 15 dias de
inoculação; 6resultado em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’: resultado da primeira/segunda
repetição amostrada; 7não significativo.
Considerando-se os estudos que abordam o comportamento alimentar do
psilídeo, aquisição e proliferação de ‘Ca. L. asiaticus’, entende-se que dentre os principais
37
fatores que influenciariam sobre a eficiência de transmissão da bactéria pelo inseto vetor
neste experimento, estariam: (i) processo de aquisição da bactéria pelo inseto, (ii)
concentração da bactéria no psilídeo e (ii) comportamento alimentar do inseto.
INOUE et al. (2009), em estudo sobre a eficiência de transmissão de ‘Ca. L.
asiaticus’ por psilídeos, constatou que quando insetos adultos se alimentaram em plantas
infectadas, a concentração da bactéria não aumentou significativamente nesses insetos e
que a eficiência de transmissão através destes para plantas sadias foi baixa. Em
contrapartida, quando psilídeos se alimentaram em plantas fontes no estágio de ninfas, a
concentração da bactéria aumentou significativamente entre dez e 20 dias após o
confinamento desses insetos, resultando em taxas de transmissão para plantas sadias
próximas a 70% através de adultos recém-emergidos.
Os resultados de INOUE et al. (2009), bem como de outros autores (PELZ-
STELINSK et al., 2010; COLETTA-FILHO et al., 2014), sugerem que a multiplicação
da bactéria nos psilídeos é essencial para uma transmissão eficiente e mostram que é
difícil a transmissão através de insetos adultos, quando estes adquirem a bactéria na fase
adulta.
As bactérias associadas ao HLB são capazes de habitar o interior dos vasos de
floema. Pouco se conhece sobre sua biologia, uma vez que seu cultivo in vitro ainda não
é feito de modo rotineiro e sistemático. De modo geral, estas bactérias apresentam-se
distribuídas de modo errático e em baixas concentrações dentro dos vasos do floema
(MACHADO et al., 2010) de modo que, supostamente, o processo de aquisição,
inoculação e transmissão de ‘Ca. Liberibacter spp’ ocorre nos vasos floemáticos.
Em estudo sobre o comportamento alimentar de D. citri, BONANI (2009) sugere
que o mesmo é influenciado pela idade das folhas das plantas, visto que em folhas novas
o período de permanência e alimentação floemática é maior, o que traria implicações
sobre a eficiência de aquisição da bactéria.
No experimento II, o período de remoção dos insetos entre plantas fontes e
campo foi o menor possível justamente para minimizar possíveis efeitos negativos do
jejum dos insetos sobre a transmissão da doença. No cenário de aquisição, as plantas
fontes foram previamente preparadas através de podas, irrigação e adubação com
nitrogênio, com o objetivo de garantir o máximo de fluxo de brotações e folhas em estádio
V3. No campo, apesar de não se ter um bom controle sobre o fluxo de novas brotações,
as folhas dos ramos em que os insetos infectivos foram inoculados estavam entre V3-V5,
sendo algumas vezes inevitável a utilização de ramos com folhas em V7.
38
Motivado por entender o menor avanço do HLB em regiões de temperaturas
médias mais elevadas no Estado de São Paulo, LOPES et al. (2013) estudaram o efeito de
diferentes regimes de temperatura sobre o título de ‘Ca. L. asiaticus’ e sobre a aquisição
da bactéria por psilídeos, e constataram menor título (concentração da bactéria) nos
tecidos das folhas e menor eficiência de aquisição da bactéria por insetos em regimes de
temperaturas mais elevadas (24 a 38 ºC) quando comparado a regimes de temperaturas
menores (14 a 28 ºC).
As inoculações no experimento II ocorreram nos meses de Maio (2014), Julho
(2014), Setembro (2014), Novembro (2014) e Janeiro (2015). As temperaturas médias
mensais para cada mês em que ocorreu a inoculação, bem como a média dos últimos anos
para os mesmos meses, constam na Tabela 11. As temperaturas mínimas e máximas
mantiveram-se, praticamente, dentro dos intervalos mais amenos estudados por LOPES
et al. (2013), indicando que, provavelmente, não houve condições limitantes à
proliferação de ‘Ca. L. asiaticus’.
Tabela 11 Dados de temperatura (°C) para os meses de inoculação de psilídeos:
valores médios mensais, obtidos através do banco de dados do local do experimento.
Holambra, SP.
Momento da Inoculação Temperatura Mínima Temperatura Máxima
Maio 2014 14,8 26,5
Média 2004-2013 14,0 26,3
Julho 2014 12,7 25,1
Média 2004-2013 12,1 25,8
Setembro 2014 18,4 29,7
Média 2004-2013 15,0 28,8
Novembro 2014 22,1 29,7
Média 2004-2013 18,1 30,1
Janeiro 2015 23,9 33,1
Média 2004-2013 19,5 30,1
Possivelmente, o insucesso na transmissão da bactéria através de psilídeos não
esteja ligado à baixa taxa de aquisição pelos vetores e condições vegetativas das plantas
e ambientais em campo, mas, sim, à baixa concentração e proliferação de ‘Ca. L.
asiaticus’ nos insetos em função da forma em que o processo de aquisição foi conduzido
(aquisição na fase adulta), resultando em níveis insuficientes da bactéria no inseto para
que a transmissão para a planta se afetuasse de maneira significativa.
39
4.2.3 Evolução de sintomas de HLB associados ao desenvolvimento de ‘Ca. L.
asiaticus’
Embora o teste do qui-quadrado tenha capturado diferenças significativas para
algumas comparações entre os tratamentos e testemunha Las-, no contexto pode-se
considerá-las não representativas em função da baixa eficiência de transmissão via
psilídeos, uma vez que não houve diferença significativa entre as testemunhas Las- e Las+
para nenhum dos parâmetros avaliados (Tabelas 12 e 13).
Como ambos os experimentos (I e II) foram instalados no mesmo local e época,
considera-se que a baixa eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através de
psilídeos infectivos tenha como consequência uma menor frequência de sintomas, visto
que no experimento I (via enxertia) foram claramente maiores.
A menor eficiência de transmissão da bactéria no experimento II, nos permite
excluir o efeito de ‘Ca. L. asiaticus’ sobre a manifestação dos sintomas e melhor analisar
o efeito das aplicações sequênciais de ASM sobre diâmetro e altura de plantas.
Comparando-se todos os tratamentos que receberam ASM com as testemunhas Las+ e
Las-, pode-se afirmar que, no período avaliado, não houve efeito negativo ou fitotóxico
de ASM sobre diâmetro e altura de plantas.
40
Tabela 12 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas
com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Total de plantas com deficiência de zinco (severa e total), manganês, zinco+manganês e magnésio
por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
Zinco (Intenso) Zinco (Total) Manganês Zinco+Manganês Magnésio
Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+
1. Test. Las- - - 0 NS6 NS 4 NS NS 4 NS NS 7 NS NS 1 NS NS
2. Test. Las+ - - 1 NS NS 8 NS NS 7 NS NS 11 NS NS 2 NS NS
3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 8 NS NS 5 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
4. ASM 500 WG 50 15 1 NS NS 7 NS NS 7 NS NS 14 * NS 1 NS NS
5. ASM 500 WG 25 30 1 NS NS 6 NS NS 8 NS NS 12 NS NS 0 NS NS
6. ASM 500 WG 50 30 4 * NS 9 NS NS 7 NS NS 12 NS NS 3 NS NS
7. ASM 500 WG 100 30 3 NS NS 9 NS NS 6 NS NS 12 NS NS 0 NS NS
8. ASM 500 WG 50 45 1 NS NS 7 NS NS 10 * NS 11 NS NS 2 NS NS
9. ASM 500 WG 100 45 0 NS NS 5 NS NS 7 NS NS 11 NS NS 0 NS NS
10. ASM 500 WG 200 45 0 NS NS 10 * NS 5 NS NS 12 NS NS 1 NS NS
11. ASM 500 WG 50 60 2 NS NS 8 NS NS 6 NS NS 13 * NS 0 NS NS
12. ASM 500 WG 100 60 1 NS NS 7 NS NS 9 NS NS 12 NS NS 1 NS NS
13. ASM 500 WG 200 60 3 NS NS 8 NS NS 9 NS NS 13 * NS 0 NS NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las-
ou Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
41
Tabela 13 Efeito da aplicação do indutor de resistência ASM sobre o aparecimento de sintomas característicos de HLB em plantas jovens inoculadas
com ‘Ca. L. asiaticus’ através de psilídeos infectivos. Total de plantas com mosqueado, nervuras amareladas e super desenvolvidas, queda significativa
de folhas e sem sintomas por tratamento aos 270 dias após o início das aplicações. Holambra, SP.
Tratamento
Do
se²
Inte
rv.³
Mosqueado Nervuras Queda de folhas Sem sintomas
Total4 Vs5 Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+ Total Vs Las- Vs Las+
1. Test. Las- - - 1 NS6 NS 1 NS NS 13 NS NS 0 NS NS
2. Test. Las+ - - 3 NS NS 3 NS NS 10 NS NS 1 NS NS
3. ASM 500 WG¹ 25 15 3 NS NS 4 NS NS 8 NS NS 3 NS NS
4. ASM 500 WG 50 15 0 NS NS 0 NS NS 10 NS NS 1 NS NS
5. ASM 500 WG 25 30 0 NS NS 1 NS NS 9 NS NS 1 NS NS
6. ASM 500 WG 50 30 1 NS NS 2 NS NS 7 NS NS 4 * NS
7. ASM 500 WG 100 30 0 NS NS 2 NS NS 7 NS NS 3 NS NS
8. ASM 500 WG 50 45 0 NS NS 1 NS NS 11 NS NS 1 NS NS
9. ASM 500 WG 100 45 0 NS NS 0 NS NS 12 NS NS 0 NS NS
10. ASM 500 WG 200 45 0 NS NS 0 NS NS 10 NS NS 0 NS NS
11. ASM 500 WG 50 60 0 NS NS 1 NS NS 10 NS NS 2 NS NS
12. ASM 500 WG 100 60 0 NS NS 0 NS NS 9 NS NS 1 NS NS
13. ASM 500 WG 200 60 0 NS NS 1 NS NS 12 NS NS 3 NS NS
¹ASM = acibenzolar-S-metílico; ²mg de ingrediente ativo por planta; ³dias; 4 total de plantas por tratamento; 5análise estatística versus testemunha Las-
ou Las+; 6NS: não significativo e * é significativo para o teste do qui-quadrado de Pearson (P<0,05).
42
4.3 Comparação entre os métodos de infecção
Comparando-se a evolução de plantas Las+ ao longo do tempo entre a população
(todos os tratamentos juntos) de plantas no experimento I e II notamos uma superioridade
do método de enxertia a partir dos 180 DAIA, que após um ano atingiu 44% de plantas
Las+, em contraste aos 10% para o método via psilídeos (Figura 7).
Figura 7 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número
de plantas Las+ acumuladas na população do experimento com infecção via enxertia e
via psilídeos aos 60, 120, 180, 270, 360 e 440/500 dias após início das aplicações
(Holambra, SP).
Para a comparação entre as medotologias de infecção (enxertia vs psilídeo),
realizou-se o teste do qui-quadrado entre as testemunhas Las+ dos dois experimentos. A
partir dos 270 DAIA encontrou-se uma diferença significativa entre as metodologias, com
superioridade em eficiência de transmissão de ‘Ca. L. asiaticus’ através da metodologia
de enxertia de borbulhas. Aos 360 DAIA e 500 DAIA, a testemunha Las+ via enxertia
atingiu os valores de 65 e 71% de plantas positivas, em contraste aos 7 e 14% da metologia
via psilídeos (Figura 8).
43
Figura 8 Evolução de plantas positivas em qPCR para ‘Ca. L. asiaticus’. Número de
plantas Las+ acumuladas nas testemunhas (Las- e Las+) do experimento com infecção
via enxertia e via psilídeos ao longo do tempo, onde (NS) representa diferença não
significativa e (*) significativa. Holambra, SP.
4.4 Considerações
O presente estudo adicionou informações para condições de campo e trouxe mais
uma confirmação da indução efetiva de ASM sobre plantas jovens de citros infectadas
com ‘Ca. L. asiaticus’, desencadeando um efeito, supostamente, capaz de retardar a
multiplicação da bactéria. No entanto, para validação do uso de ASM no manejo do HLB,
é fundamental que se desenvolvam trabalhos com transmissão via psilídeos,
considerando-se plantas jovens e adultas (em produção). Para estes trabalhos, recomenda-
se a utilização de adultos infectados na fase de ninfas, visto que estudos têm demonstrado
que a transmissão de Las é mais eficiente para esses psilídeos (COLETTA-FILHO et al.,
2009; INOUE et al., 2009; PELZ-STELINSK et al., 2010; COLETTA-FILHO et al.,
2014).
Mesmo em condições agressivas de infecção, como a enxertia, o indutor de
resistência apresenta potencial de uso como alternativa adicional ao manejo do HLB em
citros. Houve contribuição sobre o entendimento de combinações de doses e intervalos
entre aplicações, que poderá direcionar estudos futuros, os quais são necessários para
confirmação da performance do indutor de resistência, bem como validação do uso de
doses e intervalos.
44
Frente a complexidade da interação entre doses e intervalos na indução de
resistência, aconselha-se a complementação com estudos que quantifiquem a ativação de
mecanismos de defesa da planta para o direcionamento de combinações ótimas, que
induzam resistência efetiva ao HLB e suportem a recomendação de intervalos entre
aplicações, baseando-se no tempo de duração da ativação após o uso do indutor de
resistência.
É fundamental que os resultados apresentem reprodutividade, através de um
número mínimo apropriado de experimentos com dose e intervalos. Em um patossistema
como o HLB, onde levam-se meses para que os sintomas da doença apareçam e para
detecção via qPCR do patógeno, e anos para se avaliar o efeito e a viabilidade do
tratamento, estudos da indução das vias de defesa podem ser utilizados para monitorar o
período de indução, o nível de resposta e inferir sobre a efetividade do indutor.
Possivelmente, a concentração de ‘Ca. L. asiaticus’ nos tecidos de plantas recém
infectadas através do vetor Diaphoria citri em condições naturais seja inferior à
concentração em plantas infectadas através de enxertia em condições experimentais
(AGNELLI, 2011). Isto sugere que o desempenho do indutor de resistência ASM possa
ser superior ao obtido neste trabalho. Suposição que ainda demanda comprovação
científica. De fato, ainda não existem informações que descartem o uso da indução de
resistência através do ASM como controle preventivo do HLB em condições de infecção
natural.
Existem ainda relatos de diversos autores (FORD et al., 2010; SUR & STORK,
2003; FRANCIS et al., 2009; GRAHAM et al., 2011; MILLER et al., 2011, GRAHAM
& MEYERS, 2013) sobre a capacidade de indução de resistência de outros ingredientes
ativos amplamente utilizados em citros para o controle de insetos, como thiametoxam e
imidacloprid. Assim são necessários trabalhos visando o entendimento do papel desses
defensivos, isoladamente ou combinados com ASM, as respostas de resistência das
plantas ao desenvolvimento das bactérias associadas ao HLB.
Informações de literatura sobre a eficiência de transmissão de Las por adultos de
D. citri, que adquirem a bactéria durante o estágio de ninfas, sugerem que este seja o
ponto chave do sucesso da disseminação do HLB em pomares, e inferem sobre a
importância da erradicação de plantas infectadas (fontes de inóculo) e do controle
eficiente de adultos, antes que deem início a novas gerações (presença de ninfas nas
brotações).
É essencial que nenhuma ferramenta disponível aos citricultores seja utilizada
de maneira isolada, pois o sucesso do manejo do HLB está associado à integração de
45
métodos como escolha da área para implementação do pomar, o uso de mudas sadias e
certificadas, nutrição equilibrada de acordo com as recomendações do Boletim 100 IAC,
inspeções frequentes visando a identificação de plantas sintomáticas, eliminação de
plantas infectadas, monitoramento da presença do psilídeo, controle sistemático do vetor,
maior frequência de pulverizações de inseticidas nas bordas dos talhões e manejo regional
do psilídeo (FUNDECITRUS, 2015c).
Considerando-se o avanço da doença no cenário atual da citricultura brasileira e
a importância sócio-econômica da cultura, é evidente a importância e a necessidade do
aprofundamento do tema indução de resistência, bem como outras tecnologias que sejam
agregadas ao manejo do HLB em citros.
5 CONCLUSÃO
Aplicações foliares sequenciais com o indutor de resistência acibenzolar-S-
metílico (ASM) retardaram a detecção de ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ em plantas
cítricas.
O efeito do indutor de resistência ASM sobre a detecção de ‘Ca. Liberibacter
asiaticus’ em plantas cítricas dependeu da combinação entre dose e intervalo utilizados,
sendo que as melhores respostas foram obtidas nas concentrações de 50 mg i.a. planta-1
com intervalo de 30 dias e 100 mg i.a. planta-1 com intervalo de 45 dias, as quais
apresentaram controle significativo de 79 e 60%, respectivamente, aos 270 dias após
início das aplicações.
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