Injetar e deixar 20 horas

• Células injetadas e reveladas para ativação de lacZ 20 horas depois da injeção

• Todavia, a idade da célula no momento da injeção era calculada sabendo a posição dela na placa (grid) e acompanhando o ciclo de divisão

Outros promotores, tecido-específicos, tb funcionam mais se

injetados no início da fase S

Mas elas passam por +1 ciclo nessas 20 horas!

• O fato sugere que a competência foi adquirida logo na hora da injeção e não foi recuperada pelo ciclo

• Vamos esperar só 3 horas?– Injetar depois da div.

– Tem que usar PCR

– Deu igual!

controle

controle

Duas injetadas na mesma célula

• O repórter pode ser LacZ ou EGFP

• Células injetadas, espera-se algumas horas de acordo com protocolo

• Early S sempre mais ativa (na mesma célula)

Preparar nucleossomo e fazer PCR

• A detecção de lacZ (injetado) ou de actina (celular) foi igual, logo o DNA injetado virou nucleossomal!

Injeção de dois plasmídios com genes de tamanho diferente

• Um injetado no início e outro no final da fase S

• Preparação nucleossomal

• Precipitação de cromatina com anti - H4 acetilada

• PCR quantitativo do precipitado: early tem mais acetilação

Input Boundl

Controles

• Gene ativo: actina

• Gene Inativo: Ig-kappa

early late

l

TSA inibe desacetilase

• Early: não adianta inibir desacetilase

• Late:– Tratamento simultâneo reverte

– Tratamento tardio não

– Já empacotou! Estável!

RT-PCR

Plasmídio que replica (origem BPV, célula com E1/E2)

• Qdo replica, plasmídio perde padrão de metilação bacteriana e fica resistente a Dpn I

• Em 3 horas eles replicam (30-40%)

• Imunoprecipitação do plasmídio com anti – H4 acetilada

• Elimina-se quem não replica com Dpn I

H4 desacetilada é comum no X tardio e bandas G

• Inseriram pUC por transfecção (ops, esse DNA agora é cromossômico)– Deve ter inserido em diferentes tipos de bandas

• Marcaram Early e Late replication com Budr

• Precipitaram com anti – H4 acetilada

• O ppt era enriquecido de cópias de pUC marcadas com BUdr early (mas não com BUdr late) – early = desacetilado

Onde fica a HDAC2?

• Em bandas G, de replicação tardia

• Competência transcricional é dependente da fase S

• Replicação precoce é montada em estrutura de cromatina mais acessível

• Replicação tardia em regiões inativas

• Eixo ao longo do tempo do ciclo celular que permite a manutenção de efeitos epigenéticos