LUCIANO DA CONCEIÇÃO BATISTA

INFLUÊNCIA DO SISTEMA ADENOSINÉRGICO NAS

RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS DE ANSIEDADE,

TOLERÂNCIA E REFORÇO POSITIVO INDUZIDAS PELO

ETANOL EM CAMUNDONGOS.

Florianópolis 2006

LUCIANO DA CONCEIÇÃO BATISTA

INFLUÊNCIA DO SISTEMA ADENOSINÉRGICO NAS

RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS DE ANSIEDADE,

TOLERÂNCIA E REFORÇO POSITIVO INDUZIDAS PELO

ETANOL EM CAMUNDONGOS.

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Farmacologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Reinaldo N. Takahashi

Florianópolis 2006

Aos meus pais, Márcia e Flávio, por todo o amor,

carinho, incentivo e dedicação; às minhas irmãs,

Flavielle e Marcelle, amo muito vocês!

“Os homens em geral formam suas opiniões guiando-se antes pela vista do

que pelo tato; pois todos sabem ver, mas poucos sentir. Cada qual vê o que

parecemos ser, mas poucos sentem o que realmente somos”.

Maquiavel

PRECISA-SE

De pessoas que tenham os pés na terra e a cabeça nas estrelas. Capazes de sonhar, sem medo de seus sonhos. Tão idealistas que transformem seus sonhos em metas. Pessoas tão práticas que sejam capazes de tornar suas metas realistas. Pessoas determinadas que nunca abram mão de construir seus destinos e arquitetar suas vidas. Que não temam mudanças e saibam tirar proveito delas. Que tornem seu trabalho objeto de prazer e uma porção substancial de realização pessoal. Que percebam na visão e na missão de suas empresas, um forte impulso para a sua própria motivação. Pessoas com dignidade e que se conduzam com coerência em seus discursos, seus atos, suas crenças e seus valores. Precisa-se de pessoas que questionem, não pela simples contestação, mas pela necessidade íntima de só aplicar as melhores idéias. Pessoas que mostrem sua face serena de parceiros leais, sem se mostrar superiores nem inferiores, mas... iguais. Precisa-se de pessoas ávidas por aprender e que se orgulhem de absorver o novo. Pessoas com coragem para abrir caminhos, enfrentar desafios, criar soluções, correr riscos calculados sem medo de errar. Precisa-se de pessoas que construam suas equipes e se integrem nelas. Que não tomem para si o poder, mas saibam compartilhá-lo. Pessoas que não se empolguem com o próprio brilho, mas com o brilho do resultado alcançado em conjunto. Precisa-se de pessoas que enxerguem as árvores, mas também prestem atenção na magia da floresta – que tenham percepção do todo e da parte. Seres humanos justos, que inspirem confiança e demonstrem confiança nos parceiros, estimulando-os, energizando-os, sem receio que lhe façam sombra e sim orgulham-se deles. Precisa-se de pessoas que criem em torno de si um ambiente de entusiasmo, de liberdade, de responsabilidade, de determinação, de respeito e de amizade. Precisa-se de seres racionais. Tão racionais que compreendam que sua realização pessoal está atrelada à vazão de emoções. É na emoção que encontramos a razão de viver. Precisa-se de gente que saiba administrar as COISAS e liderar PESSOAS. Precisa-se urgentemente se repensar um novo ser.

TUDO SE INICIA NA PRÓPRIA PESSOA

Autor desconhecido

AGRADECIMENTOS

A todos aqueles que me acompanharam, e acompanham, nestes anos de formação e que

permitiram a realização de uma série de projetos, de sonhos e fantasias, e de amizades, que

felizmente vão muito além desta dissertação.

Aqueles que construíram e compartilham do sonho de fazer pesquisa e ciência, e de alguma

forma mudar nossa realidade, fazendo disso uma paixão e dedicação.

A esta energia poderosa, muitas vezes chamada de Deus, que sempre me guia e ilumina,

dando força e motivação para prosseguir o meu caminho.

Ao Professor Reinaldo, um grande mestre, pela honra de ter usufruído de sua sabedoria,

amizade e orientação, que tem contribuído enormemente para minha formação científica, pessoal e

intelectual. E pelo privilégio de conviver em um “ambiente enriquecido” e “enriquecedor” desde

minha iniciação científica.

Aos Professores do Departamento de Farmacologia desta instituição, pelos ensinamentos,

pela convivência, e pelo cultivo da arte do saber.

A toda a minha família, em especial aos meus pais Márcia e Flávio; minhas irmãs Flavielle e

Marcelle; a minha tia Júlia e tio ‘Zezo’ (in memorian) e aos meus primos André, Juliano e

Cristiane, por todo o amor, apoio incondicional e amizade.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Psicofarmacologia I, Rui, Leandro, George,

Fabrício (Juca), Pamplona, Pablo, Meigy, Vanessa, Rafael, pela agradável e harmoniosa

convivência, pelos sonhos e projetos compartilhados... alguns em execução!

Aos amigos e colegas da “Farmaco”, pelas conversas e risadas nos corredores, pelas

discussões “filosóficas” e pela agradável companhia.

Aos amigos Rui e Leandro, dois grandes irmãos que vem me acompanhando tanto nos

momentos de alegria quanto de frustração desde o tempo da graduação, pela estreita colaboração

para a realização deste estudo. Obrigado pelos seus conselhos, solidariedade e, mais do que tudo,

AMIZADE.

À Vanessa, por todo o seu carinho, apoio, dedicação e convivência, que proporcionaram

formidáveis momentos de alegria e felicidade ao longo desta jornada. E a toda a sua família, em

especial ao Leonardo, Elaine, Zeneide, Rodrigo, Gisele e à pequena Isabela.

Aos amigos de hoje e sempre: Karina, Alex, Carolzinha, Michel, Atahualpa, Rodrigo,

Enrico, Jana, Santamaria, Gó, Ricardo, Cado, Giorgio, Ênio, Jonh, Guigo, Gled, Sandra, Marco e

Patrícia, pelos inúmeros momentos agradáveis e de descontração, e por vocês fazerem parte da

minha vida de uma maneira muito especial.

Aos novos amigos: Vivi, Fernando e Elisa, por terem me mostrado um novo Caminho, cheio

de harmonia, paz, amor, sabedoria e conexão com a natureza.

À Marina, linda e encantadora, pelo carinho, sensibilidade, amizade, e por ser uma mulher

maravilhosa que encontrei no final desta etapa.

A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia, que sempre me ajudaram no que

fosse preciso.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), à Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de Santa Catarina (FAPESC), pelo apoio financeiro.

AHÔ MITAKUYE OYASIN

Sumário

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS iv

LISTA DE FIGURAS vi

LISTA DE TABELAS ix

RESUMO x

ABSTRACT xii

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Efeitos comportamentais do etanol 2

1.2. Sistemas de Neurotransmissores envolvidos nos efeitos do etanol 10

1.3. Sistema adenosinérgico x etanol 12

2. OBJETIVOS 21

2.1. Objetivos gerais 21

2.2. Objetivos específicos 21

3. MATERIAL E MÉTODOS 22

3.1. Animais 22

3.2. Drogas e reagentes 22

3.3. Modelos comportamentais 23

3.3.1. Labirinto em cruz elevado 23

3.3.2. Campo aberto 24

3.3.3. Rota-rod 25

3.3.4. Preferência condicionada de lugar 27

i

Sumário

3.4. Procedimentos experimentais 29

3.4.1. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no efeito

tipo-ansiolítico do etanol no labirinto em cruz elevado 29

3.4.2. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda (ressaca)

do etanol em camundongos 29

3.4.3. Dosagem sanguínea de etanol durante a ressaca 30

3.4.4. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no

comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol 30

3.4.5. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A na tolerância

rápida à perda da coordenação motora induzida pelo etanol 31

3.4.6. Efeito do antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina

cafeína nas fases de aquisição e expressão da preferência condicionada de lugar

induzida pelo etanol em camundongos 31

3.5. Análise Estatística 32

4. RESULTADOS 33

4.1. Efeito do tratamento agudo com etanol em comportamentos

relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado 33

4.2. Efeito de agonistas e antagonistas dos receptores de adenosina

A1 e A2A no labirinto em cruz elevado e campo aberto 35

4.3. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no efeito

tipo-ansiolítico do etanol no labirinto em cruz elevado 40

4.4. Efeito da administração combinada de etanol e do agonista

seletivo dos receptores de adenosina A1 CCPA em comportamentos

ii

Sumário relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado 42

4.5. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda

(ressaca) do etanol em camundongos 44

4.6. Dosagem sanguínea de etanol durante a ressaca 46

4.7. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no

comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol 46

4.8. Desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação

motora ao etanol ao longo do tempo 54

4.9. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A na

tolerância rápida à perda da coordenação motora induzida pelo etanol 55

4.10. Aquisição da preferência condicionada de lugar induzida

pelo etanol 59

4.11. Efeito da cafeína nas fases de aquisição e expressão da preferência

condicionada de lugar induzida pelo etanol em camundongos 60

5. DISCUSSÃO 63

6. CONCLUSÕES 79

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80

8. ANEXOS 103

iii

Lista de Abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA – adenosina deaminase

ADP – adenosina di-fosfato

AMP – adenosina mono-fosfato

5’-AMP – monofosfato 5’-adenosina

AMPc – monofosfato de 3’,5’-adenosina cíclico

ANOVA – análise de variância

ATP – adenosina tri-fosfato

Ca2+ - íons cálcio

CCPA - 2-cloro-N6-ciclopentiladenosina

Cl- - íons cloreto

DPCPX - 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina

DPMA - N6-[2-(3,5-dimetoxifenil)-2-(2-metilfenil)etil]adenosina

DSM – Manual Diagnóstico Estatístico

E.P.M. – erro padrão da média

g/kg – gramas por quilogramas

GABA – ácido gama-aminobutírico

GMPc - guanidina monofosfato cíclico

h - horas

i.p. - intraperitoneal

K+ - íons potássio

KO - nocaute

LTP – potenciação de longa duração

mg/dl – miligramas por decilitro

iv

Lista de Abreviaturas

mg/kg – miligramas por quilogramas

min - minutos

mM - micromolar

Na2+ - íons sódio

nM - nanomolar

NMDA – n-metil-D-aspartato

SAH - S-adenosil homocisteína

s.c. - subcutânea

SNC – Sistema Nervoso Central

ZM241385 - 4-(2-[7-amino-2-{2-furil}{1,2,4}triazolo-{2,3-a}{1,3,5}triazin-5-il-

amino]etil)fenol

v

Lista Figuras

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama descrevendo o ciclo da dependência 4

Figura 2. Esquema simplificado dos mecanismos intracelulares e extracelulares

responsáveis pela formação e regulação metabólica da adenosina 14

Figura 3. Labirinto em cruz elevado utilizado para avaliação de

comportamentos relacionados à ansiedade 24

Figura 4. Arena do teste do campo aberto utilizado para avaliação da atividade

locomotora 25

Figura 5. Rota-rod utilizado para avaliação da coordenação motora. 26

Figura 6. Caixa de condicionamento de lugar utilizado para a avaliação

de propriedades reforçadoras de drogas 27

Figura 7. Efeito do tratamento agudo com etanol em comportamentos

relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado 34

Figura 8. Efeitos do tratamento com antagonistas adenosinérgicos em

camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado 39

Figura 9. Efeito do tratamento com antagonistas adenosinérgicos no

efeito tipo-ansiolítico induzido pelo etanol em camundongos avaliados

no labirinto em cruz elevado 41

Figura 10. Efeito da administração combinada de etanol e do agonista

seletivo dos receptores de adenosina A1 CCPA sobre comportamentos

relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado 43

Figura 11. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda

(ressaca) do etanol em camundongos 45

Figura 12. Concentração sanguínea de etanol (mg/dL) verificada em

vi

Lista Figuras

intervalos de 0,5; 2, 4, 6 ou 12 h após a administração aguda de etanol

(4,0 g/kg, i.p.) em camundongos 46

Figura 13. Efeito do tratamento com adenosina no comportamento

tipo-ansiogênico induzida pela ressaca do etanol em camundongos

avaliados no labirinto em cruz elevado 48

Figura 14. Efeito do tratamento com o agonista seletivo dos receptores de

adenosina A1 CCPA no comportamento tipo-ansiogênico induzida pela ressaca

do etanol em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado 50

Figura 15. Efeito do tratamento com o agonista seletivo dos receptores

de adenosina A2A DPMA no comportamento tipo-ansiogênico induzida

pela ressaca do etanol em camundongos avaliados no labirinto

em cruz elevado 51

Figura 16. Efeito da administração do antagonista dos receptores A1

DPCPX (3,0 mg/kg, i.p.), 15 min antes da injeção do CCPA (agonista do

receptor A1, 0,05 mg/kg, i.p.) ou veículo (i.p.) em camundongos

previamente (18 h antes) tratados com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e testados

30 min depois no labirinto em cruz elevado 53

Figura 17. Desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação

motora ao etanol ao longo do tempo 55

Figura 18. Efeito do antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina

cafeína no desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação

motora induzida pelo etanol em camundongos avaliados no rota-rod 57

Figura 19. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no

desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora

induzida pelo etanol em camundongos avaliados no rota-rod 58

vii

Lista Figuras

Figura 20. Aquisição da preferência condicionada de lugar quanto ao tempo

de permanência no compartimento pareado com etanol (0,5; 1,0 ou 2,0 g/kg, i.p.)

ou salina em camundongos 59

Figura 21. Efeito da cafeína (10,0; 20,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) na aquisição

da preferência condicionada de lugar ao etanol (2,0 g/kg, i.p.) em camundongos 61

Figura 22. Efeito da cafeína (10,0 ou 20,0 mg/kg, i.p.) na expressão da

preferência condicionada de lugar ao etanol (2,0 g/kg, i.p.) em camundongos 62

Figura 23. Diagrama ilustrando a participação dos receptores A1 de

adenosina no ciclo da dependência ao etanol 78

viii

Lista de Tabelas

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características dos subtipos de receptores de adenosina presentes

no SNC 17

Tabela 2. Efeito da administração de agonistas adenosinérgicos em

camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado 36

Tabela 3. Efeitos da administração de agonistas adenosinérgicos em

camundongos avaliados no campo aberto 37

ix

Resumo

RESUMO

Um número crescente de evidências tem apontado para o neuromodulador adenosina como

um importante mediador de várias respostas comportamentais, moleculares e celulares promovidas

pelo etanol, tanto em humanos quanto em roedores. Contudo, relativamente pouco se sabe sobre o

envolvimento deste sistema em comportamentos relacionados à ansiedade após tratamento agudo

ou após a abstinência do etanol, bem como nas respostas neuroadaptativas verificadas após a

exposição repetida, como o desenvolvimento de tolerância e reforço positivo do etanol,

supostamente implicados na iniciação, manutenção e recaída ao consumo de etanol em modelos

animais.

O objetivo do presente trabalho foi investigar o papel dos receptores de adenosina no efeito

tipo-ansiolítico do etanol, bem como avaliar o potencial de agonistas dos receptores de adenosina

A1 e A2A em reduzir o comportamento tipo-ansiogênico observado durante a abstinência aguda

(ressaca) em camundongos testados no labirinto em cruz elevado. Além disso, o envolvimento dos

receptores de adenosina no desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora ao

etanol, assim como na preferência condicionada de lugar induzida pelo etanol em camundongos,

também foram investigados neste estudo.

Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez, que os receptores de

adenosina, principalmente os receptores A1, modulam as repostas tipo-ansiolíticas induzidas pela

administração aguda de etanol (1,2 g/kg, i.p.), assim como o efeito tipo-ansiogênico (ressaca)

verificado 18 h após o tratamento sistêmico com uma dose elevada de etanol (4,0 g/kg) em

camundongos testados no labirinto em cruz elevado. Os presentes resultados evidenciam ainda que

o bloqueio dos receptores A1 para adenosina, mas não dos receptores A2A, modula importantes

neuroadaptações funcionais observadas durante a exposição repetida ao etanol, como o

desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora em camundongos testados no

x

Resumo

rota-rod. Além disso, demonstram que o bloqueio não-seletivo dos receptores de adenosina,

mediado pela cafeína, não altera o reforço positivo induzido pelo etanol em camundongos avaliados

no teste da preferência condicionada de lugar.

Em conjunto, estas evidências sugerem que a manipulação farmacológica do sistema

adenosinérgico possui potencial para atenuar os efeitos do uso do etanol, podendo representar uma

importante ferramenta no tratamento do alcoolismo. Além disso, a complexidade e diversidade dos

componentes envolvidos no desenvolvimento do alcoolismo (sensibilidade inicial, tolerância,

sensibilização, abstinência, desejo e recaída), requerem estudos mais detalhados e amplos para uma

melhor compreensão e caracterização das bases neurobiológicas envolvidas nesta doença.

xi

Abstract

ABSTRACT

Recent evidence indicates a direct role for the neuromodulator adenosine in mediating many

of the cellular and behavioral responses to ethanol in both humans and rodents. The anxiolytic

property of ethanol and the elevated signs of anxiety observed during withdrawal from chronic as

well as acute ethanol exposure represent important motivational factors for its consumption and the

development of alcohol dependence. Moreover, the tolerance mechanisms and reinforcement, can

determine a person’s short-term or acute response to ethanol, as well as the establishment of the

long-term or chronic craving for alcohol that characterizes dependence.

The aim of the present study was to evaluate the role of adenosine receptors in the

anxiolytic-like effect of ethanol, as well as the potential of adenosine A1 and A2A receptor agonists

in reducing the anxiety-like behavior during acute ethanol withdrawal (ressaca) in mice tested in the

elevated plus-maze. Furthermore, the influence of adenosine receptors in the development of rapid

tolerance to ethanol-induced motor incoordination, and the ability of the caffeine to modify ethanol-

induced conditioned place preference also had been examined in mice.

The results indicated that acute previous administration of “non-anxiogenic” doses of

caffeine (non-selective antagonist, 10.0 mg/kg, i.p.) and DPCPX (adenosine A1 receptor antagonist,

3.0 mg/kg, i.p.), but not ZM241385 (adenosine A2A receptor antagonist, 1.0 mg/kg, i.p.),

significantly reduced the anxiolytic-like effect of ethanol (1.2 g/kg, i.p.), as well as blocked the

rapid tolerance to ethanol-induced motor impairment in mice. Moreover, an anxiolytic-like response

was observed by the co-administration of “non-anxiolytic” doses of the selective adenosine A1

receptor agonist CCPA (0.125 mg/kg) and ethanol (0.6 g/kg). On the other hand, the acute

administration of “non-anxiolytic” doses of adenosine and CCPA, but not the adenosine A2A

receptor agonist DPMA, at the onset of peak withdrawal (18 h), reduced this anxiogenic-like

response. In addition, the effect of CCPA on anxiety-like behavior of ethanol ressaca was reversed

xii

Abstract

by pretreatment with the selective adenosine A1 receptor antagonist DPCPX. On the other hand,

caffeine did not inhibit the acquisition and expression of ethanol-induced conditioned place

preference.

These results reinforce the involvement of adenosine in anxiety and suggest that the

activation of adenosine A1 receptors, but not adenosine A2A receptors, mediate the anxiolytic-like

effect and the rapid tolerance to ethanol-induced motor impairment in mice. Moreover, they

indicate the potential of adenosine A1 receptor agonists to reduce the anxiogenic effects during

ethanol withdrawal. Taken together, these data suggest that pharmacological manipulation of

adenosine signalling represents a potentially useful tool for the prevention and treatment of

alcoholism.

xiii

Introdução

2

Introdução

1. INTRODUÇÃO

As bebidas alcoólicas têm sido utilizadas desde o início da história humana, sendo os

primeiros registros datados de 6000 a.C., no antigo Egito e Babilônia (Vaillante, 1999). Estudos

antropológicos mostram que inúmeros relatos da mitologia grega referem-se ao álcool etílico ou

etanol como uma substância divina. Na Idade Média, ao ser introduzido o processo de destilação

pelos árabes, os alquimistas passaram a acreditar que o etanol era o tão procurado elixir da vida,

sendo utilizado como remédio para praticamente todas as doenças, conforme indicado pelo termo

gálico whiskey (usquebaugh, que significa “água da vida”) (O’brien, 1996).

Atualmente, reconhece-se que o valor terapêutico do etanol é extremamente limitado, e que

o consumo crônico deste em quantidades excessivas representa um grave problema clínico e social.

O consumo de etanol, tabaco e outras drogas de abuso estão presentes em quase todos os países do

mundo, sendo que mais da metade da população das Américas e da Europa já experimentou etanol

alguma vez na vida (OMS, 2004).

No Brasil, estima-se que uma em cada dez pessoas tenha problemas decorrentes do consumo

indevido de etanol, sendo este responsável por aproximadamente 80-85% das internações em

hospitais e clínicas psiquiátricas (CEBRID, 2002). Além disso, o consumo de etanol está

relacionado com 50% dos casos de morte em acidentes automobilísticos, 50% dos homicídios e

25% dos suicídios (Leite, 2001). Por estas e outras razões, o consumo abusivo de etanol é

reconhecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma doença, devendo, por este

motivo, ser desvinculado de qualquer conotação moral ou de valores referentes ao indivíduo.

1

Introdução

1.1. Efeitos comportamentais do etanol

O etanol promove uma variedade de efeitos fisiológicos e comportamentais que aparecem

em duas etapas distintas (uma estimulante e outra depressora) (Chandler et al., 1998). Nos

primeiros momentos após a ingestão de etanol, podem aparecer os efeitos estimulantes, como

euforia, desembaraço, que frequentemente são acompanhados da redução de estados de ansiedade e

estresse. Esta estimulação aparente resulta, em grande parte, da redução dos mecanismos do

controle inibitório do encéfalo (O’brien, 1996).

À medida que o nível plasmático de etanol se eleva, começam a surgir os efeitos

depressores, como o comprometimento da coordenação motora e fala, confusão mental e sedação,

além de prejudicar a concentração e a memória. Em concentrações extremamente elevadas

(alcoolemia de 300 a 500 mg/dL), o efeito depressor fica exacerbado, ocorrendo náusea e vômito,

seguidos de anestesia profunda, depressão respiratória, perda dos reflexos e hipotermia, podendo

até provocar coma e morte (Fadda e Rossetti, 1998; Nutt, 1999). Esta ampla variedade de efeitos

parece ser devido à complexa interação do etanol com os diversos sistemas excitatórios e inibitórios

encefálicos (Nutt, 1999).

Cronicamente, o etanol leva a um processo conhecido como demência alcoólica, resultando

em prejuízo neurológico, com comprometimento tanto das funções intelectuais (percepção,

memória, emoção), quanto motoras (por degeneração cerebelar). Entre várias outras alterações o

sistema hepático é extremamente afetado pelo etanol, podendo causar cirrose e hepatite com o seu

consumo crônico (Pritchard e Nagy, 2005). No sistema hematológico pode ocorrer elevação do

volume corpuscular médio das células vermelhas (eritrócitos ou hemáceas) devido à deficiência de

ácido fólico, resultando, eventualmente, em anemia megaloblástica, além de plaquetopenia e

leucopenia, comprometendo o sistema imunológico (Ballard, 1997; Bode e Bode, 2005). Em outros

sistemas como o gastrintestinal, o consumo de etanol pode originar câncer, gastrite e úlceras (Jian et

al., 1986; Bode e Bode, 1997; 2005). No sistema endócrino/reprodutivo, diminuição do nível do

2

Introdução

hormônio antidiurético, hipoglicemia, feminilização em homens, infertilidade e diminuição da

libido, além de carências nutricionais, lesões musculares e dermatológicas (Emanuele e Emanuele,

1997).

O alcoolismo, ou mais precisamente, a síndrome da dependência do etanol, pode ser

definido como um complexo transtorno comportamental caracterizado pelo consumo excessivo, uso

compulsivo (perda do controle sobre o consumo) e pela preocupação exagerada em obter o etanol

(Koob, 2003). A euforia que segue após a primeira dose de etanol, particularmente familiar para

muitos, como perda do julgamento e controle, pode levar, após o uso crônico, a intensificação da

quantidade consumida e o persistente desejo pela droga, envolve complexas interações entre fatores

genéticos, psicosociais, ambientais e neurobiológicos (Weiss e Porrino, 2002).

Desta maneira, a dependência do etanol envolve um grande número de interações entre

diversos mecanismos neurais, incluindo a sensibilidade aguda ao etanol, desenvolvimento de

tolerância, sensibilização e dependência, bem como de um intenso desejo em consumir a droga

(muitas vezes chamado de “fissura”) (Lovinger e Crabbe, 2005).

Por muitos anos foi proposto que o etanol exercia seus efeitos neurobiológicos

principalmente por aumentar a fluidez das membranas, alterando a função de macro-moléculas

presentes nas membranas celulares. Entretanto, nos últimos 20 anos muitas evidências têm apontado

para a ação do etanol em sítios hidrofóbicos específicos das proteínas, modulando determinada

função através da alteração de sua estrutura tridimensional (Kiefer e Mann, 2005).

Neste sentido, o etanol pode produzir tanto ações diretas em moléculas que levam à

intoxicação e influenciam respostas para o consumo crônico, como também atuar indiretamente em

outros alvos moleculares, modulando desta maneira a expressão ou função de moléculas que são

alvos diretos do etanol ou alterando a função de circuitos neurais envolvidos em processos mais

elaborados responsáveis pelo desenvolvimento da dependência e de mudanças neuroadaptativas

residuais, que conferem vulnerabilidade à recaída (Koob, 2003; Lovinger e Crabbe, 2005). Estas

3

Introdução

alterações contribuem para os estágios agudos e crônicos do uso do etanol, influenciando a

vulnerabilidade ao abuso e, por conseguinte, a expressão do alcoolismo (Lovinger e Crabbe, 2005).

Segundo a teoria proposta por Koob e Le Moal (1997), a dependência a uma determinada

substância se desenvolve através de um ciclo em espiral que aumenta em amplitude após a

experiência repetida, resultando no estado patológico conhecido como dependência. Neste ciclo três

componentes são de fundamental importância: a Preocupação-Expectativa, um importante fator

motivacional para o início do uso/consumo de determinada substância; Intoxicação (uso/abuso), um

componente amplamente associado ao reforço positivo; e Estado afetivo negativo (abstinência), um

componente associado com o reforço negativo (Koob e Lê Moal, 1997).

Preocupaçãoo Expectativa

Abstinência

Sensibilização

Figura 1. Diagrama descrevendo o ciclo da dependência a partir de uma perspectiva psiquiátrica,

com os diferentes critérios para o diagnóstico da dependência às substâncias psicoativas segundo o

DSM-IV, Adaptado de Koob e Le Moal (1997).

4

Introdução

Uma das razões do consumo de álcool pelos humanos é devido a sua ação ansiolítica. A

ansiedade tem sido geralmente relacionada com o desenvolvimento da dependência, bem como

recaída, ao etanol e outras drogas de abuso. De acordo com a hipótese de redução de tensão,

descrita inicialmente por Conger (1956), a propriedade ansiolítica do etanol seria um importante

fator motivacional para o seu consumo, já que muitos indivíduos dependentes têm relatado que

utilizam bebidas alcoólicas para reduzir sua ansiedade (Conger, 1956; Pohorecky, 1981; Newlin e

Thomson, 1990).

Conceitualmente, a ansiedade pode ser caracterizada como um estado emocional

experimentado subjetivamente como desagradável ou ameaçador, sendo comumente acompanhada

de alterações fisiológicas e comportamentais, como mudanças no humor (apreensão ou medo) e na

cognição (dificuldade de raciocínio, desatenção), entre outros (Nutt, 1990; Graeff et al., 2003).

Embora a ansiedade tenha sido relacionada a uma resposta subjetiva e inerente à espécie

humana, uma vez que animais de laboratório não podem verbalmente relatar seus estados

subjetivos, muitos modelos experimentais têm sido propostos para o desenvolvimento de novos

agentes terapêuticos, bem como na caracterização do mecanismo de ação de drogas

psicoterapêuticas utilizadas na clínica, além da descoberta de novas estruturas e alvos moleculares

envolvidos na patofisiologia dos transtornos psiquiátricos (Ramos e Mormède, 1998).

Uma grande variedade de modelos comportamentais tem sido desenvolvida para investigar

estados emocionais de ansiedade em roedores (Flint, 2003), sendo que alguns destes buscam avaliar

comportamentos de defesa característicos da espécie, ou seja, baseados na etologia. O labirinto em

cruz elevado é o mais conhecido de todos os modelos animais para o estudo da ansiedade

experimental (File, 1992; Rodgers, 1997; Ramos e Mormède, 1998; Kliethermes et al., 2005). Este

modelo foi primeiramente validado para ratos (Pellow et al., 1985) e, posteriormente, para

camundongos (Lister, 1987), sendo baseado na aversão natural dos roedores por espaços abertos

(Treit et al., 1993; Fernandes e File, 1996), além de ser farmacologicamente sensível para as ações

5

Introdução

de agentes ansiolíticos e ansiogênicos que, respectivamente, aumentam e diminuem a exploração

nos braços abertos do labirinto (Dawson et al., 1995; Bertoglio e Carobrez, 2002; Amico et al.,

2004; Carobrez e Bertoglio, 2005).

O efeito ansiolítico do etanol tem sido extensivamente descrito em diferentes modelos

animais de ansiedade, como no labirinto em cruz elevado (Blatt e Takahashi, 1999; Ferreira et al.,

2000; LaBuda e Fuchs 2002; Da Silva et al., 2005), na caixa claro-escuro (Bilkei-Gorzo et al.,

1998) e no teste de interação social (File et al., 1976; Varlinskaya e Spear, 2002), entre outros.

Além disso, sinais elevados de ansiedade são observados tanto em humanos quanto em

roedores quando o etanol é abruptamente retirado após a sua exposição crônica (para revisão ver

Kliethermes, 2005). A síndrome de abstinência é um dos critérios de diagnóstico para a

caracterização da dependência as drogas, e tem sido frequentemente relacionada com prejuízos da

função fisiológica e aumento do estado afetivo negativo, sintomas fortemente associados com a

recaída (Cloninger, 1987). O perfil sintomático da abstinência ao etanol tem sido bem estabelecido

em humanos e outros animais, e incluem náusea, tremores, hipertermia, taquicardia, irritabilidade,

ansiedade, depressão e insônia, sendo mais severos nos períodos iniciais da retirada (Finn e Crabbe,

1997; Kliethermes, 2005).

Uma forma de abstinência ao etanol, conhecida como abstinência aguda ou ressaca, pode

ocorrer após uma única ingestão de grandes quantidades de etanol. Alguns sintomas da ressaca em

humanos incluem cefaléia, diarréia, anorexia, fadiga e tremores (para revisões ver Smith e Barnes,

1983; Wiese et al, 2000), além de alterações psicológicas como aumento na ansiedade, sensação de

culpa e depressão (Smith e Barnes, 1983; Bogin et al, 1986).

Modelos comportamentais de retirada ao etanol têm consistentemente demonstrado um

aumento nos níveis de ansiedade durante o período de abstinência após exposição crônica ao etanol

em roedores (File et al, 1991, 1993; Lal et al, 1991; Knapp et al, 1993; Gatch et al, 1999; Gatch e

Lal, 2001). No entanto, poucos estudos têm examinado a presença destes sintomas após a

6

Introdução

administração aguda de etanol. Gauvin e colaboradores (1992, 1993), utilizando o pentilenotetrazol,

uma substância com conhecidas propriedades ansiogênicas, em tarefas de discriminação de drogas,

tem demonstrado que ratos injetados intraperitonealmente com altas doses de etanol (3,0 e 4,0

g/kg), apresentam um maior número de respostas de pressão na barra induzidas pelo

pentilenotetrazol, quando testados 9 a 18 h após o desafio agudo com etanol, sugerindo que esta

resposta reflete estados de ansiedade relacionados à ressaca.

Recentemente, algumas evidências têm mostrado que, 18 h após a administração aguda de

etanol (4,0 g/kg, i.p.), ratos adultos apresentam uma exploração reduzida nos braços abertos do

labirinto em cruz elevado (Doremus et al., 2003), e uma significante supressão social no teste de

interação social (Varlinskaya e Spear, 2004), respostas consistentes com um perfil ansiogênico (File

et al, 1976; Pellow et al, 1985).

Como mencionado anteriormente, a exposição crônica ao etanol causa neuroadaptações que

contribuem para o uso e abuso continuado de etanol (Weiss et al., 2001; Heinz et al., 2003),

envolvendo diversos mecanismos moleculares que são influenciados por fatores genéticos e

ambientais, ou pela interação entre estes (Lovinger e Crabbe, 2005).

O fenômeno de tolerância, caracterizado como uma redução na intensidade do efeito da

droga ao longo do tempo, ou em outras palavras, diminuição da sensibilidade à droga após

intoxicação (Chandler et al., 1998; Kalant 1998), é uma forma bastante comum de neuroadaptação

produzida pela exposição repetida ao etanol, e tem sido relatada como um importante componente

que pode levar ao alcoolismo, sendo listada como um dos critérios de diagnóstico pelo Manual

Diagnóstico Estatístico (American Psychiatric Association – APA, DSM-IV RT, 2000). Além disso,

a tolerância ao etanol apresenta muitas implicações clínicas e farmacológicas importantes, sendo

utilizada como modelo experimental para outros tipos de processos neurodegenerativos (Kalant,

1998). Estes estudos têm se revelado muito importantes para a avaliação do consumo (Waller et al.,

7

Introdução

1983; Ploj et al., 2002) e da dependência do etanol (American Psychiatric Association – APA,

DSM-IV RT, 2000).

Muitas evidências têm mostrado que os mecanismos de tolerância podem contribuir para a

manutenção ou agravamento da dependência do etanol, permitindo ou ocasionando elevados níveis

de consumo, que contribuem para o risco de complicações fisiológicas advindas do alcoolismo

(Schuckit, 1986; Kalant, 1998). Além disso, um número crescente de evidências mostra que os

mecanismos de tolerância compartilham muitos aspectos com processos de aprendizado e memória

(Kalant et al., 1971; Kalant, 1996).

O desenvolvimento da tolerância está relacionado com eventos complexos que podem

envolver diferentes mecanismos como: mudanças na absorção, distribuição, metabolismo e

excreção (tolerância farmacocinética ou disposicional) (Kalant et al., 1971; Le et al., 1989);

mudanças nos níveis celulares ou em receptores (tolerância farmacodinâmica ou celular) (Kalant et

al., 1971; Tabakoff et al., 1995); bem como, mudanças no sistema neural afetado pela droga, mas

que não está diretamente envolvido no efeito por ela mediado (tolerância comportamental) (Stewart

e Badiani, 1993).

A tolerância ao etanol pode ocorrer de maneira tempo-dependente (Khanna et al., 2002),

sendo comumente designada como tolerância aguda, desenvolvida com o curso de uma simples

exposição ao etanol (Kalant et al., 1971; Khanna et al., 2002); tolerância crônica, geralmente

detectada após dias, semanas ou meses de exposição repetida de etanol (Kalant et al., 1971;

Littleton, 1980; Kalant e Khanna, 1990; Tabakoff, 1995; Boulouard et al., 2002); e tolerância

rápida, usualmente detectada após duas exposições ao etanol com um intervalo de 8-24 horas

(Crabbe et al., 1979; Khanna et al., 1991; Da Silva et al., 2001; Barbosa e Morato, 2002). A

magnitude da resposta observada na tolerância rápida é frequentemente semelhante à verificada

após o tratamento crônico com etanol, sendo, portanto, considerada como um indicador de

tolerância crônica (Khanna et al., 1996).

8

Introdução

Muitos ensaios comportamentais de intoxicação e tolerância ao etanol têm sido relatados em

diferentes espécies, incluindo camundongos e envolvem, principalmente, aspectos da coordenação

motora ou alteração da temperatura corporal (Crabbe et al., 1979; Khanna et al., 2002). Estes

métodos também são utilizados para o estudo de drogas com ações hipnóticas e sedativas (Lovinger

e Crabbe, 2005).

Por outro lado, a exemplo de outros distúrbios da dependência, a recaída ao uso de álcool

após longos períodos de abstinência é um aspecto comum do alcoolismo (Kuzmin et al., 2003).

Uma resposta fisiológica condicionada e a sensação de intenso desejo (fissura) podem ocorrer

quando usuários abstinentes encontram sinais preditivos de consumo e disponibilidade pela droga

(Childress et al., 1988). Esta associação “aprendida”, entre os sinais ambientais e os efeitos de

reforço (positivo e negativo) gerados por substâncias psicoativas, é um importante componente da

dependência em humanos (Vanderschuren e Everitt, 2004).

Diversos modelos animais têm contribuído para a identificação de fatores que estão

envolvidos nos aspectos motivacionais e reforçadores que levam à retomada e procura pelo etanol.

Este comportamento pode ser iniciado ou mantido tanto por estímulos primários (efeito

farmacológico da droga per se), como também por estímulos secundários (sinais

ambientais/contexto associados ao consumo da droga) (Chester e Cunningham, 2002;

Vanderschuren e Everitt, 2004).

Um modelo experimental comumente utilizado para examinar tanto os mecanismos de

desejo/fissura eliciado por sinais ambientais, quanto às propriedades reforçadoras/gratificantes das

drogas de abuso em animais é o teste de preferência condicionada de lugar (para revisão ver

Tzschenke, 1998). Neste paradigma, um estímulo contextual particular ou um determinado

compartimento (estímulo condicionado) é pareado com o efeito produzido pela droga (estímulo

incondicionado). O impacto motivacional desta associação (droga/compartimento) é que determina

9

Introdução

a preferência ou a aversão dos animais pelo compartimento pareado previamente com a droga

(Chester e Cunningham, 2002).

1.2. Sistemas de Neurotransmissores envolvidos nos efeitos do etanol

Estudos eletrofisiológicos, bioquímicos e comportamentais sugerem que as respostas

neuronais do etanol envolvem diversas vias de transdução de sinal ativadas por diferentes

neurotransmissores, hormônios, enzimas e canais iônicos, modulando alterações de curto (agudo) e

longo (crônico) prazo na expressão de genes e nas funções neurais (Ron e Jurd, 2005). Neste

sentido, um grande número de evidências sugere que os sistemas GABAérgico e glutamatérgico

desempenham um papel fundamental nos efeitos do etanol (Grobin et al., 1998; Krystal et al.,

2003).

A exposição aguda ao etanol potencializa a transmissão inibitória mediada pelo ácido γ-

aminobutírico (GABA), um neurotransmissor que atua sobre receptores específicos para este

aminoácido, e modula, por exemplo, a abertura de canais permeáveis ao íon cloreto (Cl-) em várias

regiões encefálicas (Tabakoff, 1995; Grobin et al., 1998). Muitos dos efeitos comportamentais

promovidos pelo etanol (efeito ansiolítico, anestésico, sedativo, prejuízo da atividade cognitiva e de

processos motores) estão relacionados à sua capacidade de interagir com o receptor ionotrópico

GABAA (Frey et al., 1981; Givens e McMahon, 1995).

Desta maneira, os efeitos mediados pelo etanol são potencializados por agonistas, e

atenuados por antagonistas ou agonistas inversos dos receptores gabaérgicos. O consumo crônico de

etanol modifica a estrutura destes receptores, promovendo alterações tanto na composição das

subunidades, quanto na sensibilidade para ligantes, que culminam em “down-regulation”

compensatória deste sistema (Grobin et al., 1998; Hanchar et al., 2004).

A neurotransmissão sináptica glutamatérgica, e especialmente a mediada por receptores

glutamatérgicos do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), um receptor ionotrópico que controla a

10

Introdução

abertura de canais permeáveis aos íons cálcio (Ca2+), sódio (Na2+) e potássio (K+) (Tabakoff,

1995), têm recebido, assim como o sistema GABAérgico, considerável atenção em relação ao seu

papel na regulação dos efeitos mediados pelo etanol (Siggins et al., 2003). A administração aguda

de etanol consistentemente resulta na atenuação dose-dependente da neurotransmissão excitatória

mediada pelo aminoácido glutamato (Liljequist, 1991; Tsai et al., 1995; Honse et al., 2004).

O antagonismo do receptor NMDA promovido pelo etanol, dentre outras ações, é

responsável pela inibição da potenciação de longo prazo (LTP, do inglês “long-term potentiation”),

tanto in vivo quanto in vitro (Morrisett e Swartzwelder, 1993), promovendo graves conseqüências

nos processos de desenvolvimento do SNC, aprendizado e memória (Gonzáles e Jaworski, 1997).

Contudo, o tratamento crônico com etanol resulta em um bloqueio de longo-prazo sobre os

receptores NMDA, levando a alterações estruturais, que culminam em “up-regulation”

compensatória deste sistema (Chandler, 2003; Honse et al., 2004).

Além das modificações na função dos receptores NMDA e GABAA (Chandler et al., 1998),

o etanol também interage com outros sistemas de neurotransmissores, dentre eles o sistema

dopaminérgico (Cohen, 1997) e o opióide (Weiss e Porrino, 2002). O etanol aumenta, de maneira

dose-dependente, o disparo de neurônios dopaminérgicos das regiões A9 e A10 que se projetam,

respectivamente, para o estriado e em estruturas límbicas, promovendo um aumento na liberação de

dopamina nestas áreas (Carlsson e Lindqvist, 1973; Mereu et al., 1984; Gessa et al., 1985; Imperato

e DiChiara, 1986; Appel et al., 2003). No mesmo sentido, a administração de etanol aumenta a

concentração extracelular de endorfinas no núcleo accumbens, contribuindo para as propriedades de

reforço do etanol (Weiss e Porrino, 2002).

Como sugerido para grande parte das drogas de abuso, a ação do etanol no sistema

dopaminérgico mesolímbico, formado por neurônios dopaminérgicos que se originam na área

tegmentar ventral (VTA) e se projetam para regiões prosencefálicas, como núcleo accumbens,

córtex pré-frontal, amígdala e hipocampo (Nestler, 2001), e o conseqüente aumento na liberação de

11

Introdução

dopamina no núcleo accumbens, uma importante área envolvida nas sensações prazerosas (Koob et

al., 1998; Everitt e Wolf, 2002), parece mediar às propriedades de reforço e recompensa

apresentadas pelo consumo de etanol (Tabakoff e Hoffmann, 1987; Wise e Bozarth, 1987; Koob,

1992; Risinger et el., 2000; Cunningham et al., 2000).

Além disso, manipulações na expressão de genes para os receptores dopaminérgicos, como

também, metodologias com animais nocaute (KO) para estes receptores, mostram que

camundongos KO para os receptores D1 e D2 de dopamina consomem menos, e apresentam uma

reduzida preferência condicionada de lugar ao etanol (El-Ghundi et al., 1998; Cunningham et al.,

2000; Risinger et al., 2000).

Os sistemas de neurotransmissão serotonérgico (Kelai et al., 2003), canabinóide (Hungund e

Basavarajappa, 2000), colinérgico (Cardoso et al., 1999), adenosinérgico (Mailiard e Diamond,

2004), além das inúmeras cascatas de transdução de sinais, como os sistemas de segundos

mensageiros (Ron e Jurd, 2005), também são afetados direta ou indiretamente pelo tratamento

agudo ou repetido de etanol. Esta ampla variedade de sistemas envolvidos nos diferentes efeitos

produzidos pelo etanol, constitui alvos potenciais para o desenvolvimento de novas farmacoterapias

no tratamento do alcoolismo (Spanagel e Zieglgänsberger, 1997).

1.3. Sistema adenosinérgico x etanol

O envolvimento do sistema adenosinérgico nas ações centrais do etanol foi inicialmente

relatado no início da década de 80 (Dar et al., 1983; Proctor e Dunwiddie, 1984). No presente

momento, um grande número de evidências tem mostrado a participação da adenosina em respostas

celulares e comportamentais mediadas pelo etanol (Hack e Christie, 2003; Mailliard e Diamond,

2004). A cafeína, um antagonista não seletivo dos receptores de adenosina, tem sido utilizada para

reduzir os efeitos de intoxicação aguda ocasionados pelo etanol (Hasenfratz et al., 1993; Lorist e

Tops, 2003).

12

Introdução

Estudos têm proposto que o etanol estimula a sinalização adenosinérgica principalmente

através de dois mecanismos: um envolve o metabolismo de etanol pelo fígado, que produz acetato,

e este pode ser metabolizado formando adenosina no SNC (Carmichael et al., 1991; Kiselevski et

al., 2003), e o outro, observado em culturas celulares, envolve a inibição de transportadores

específicos de adenosina (Nagy et al., 1990; Krauss et al., 1993; Choi et al., 2004). Somente nos

últimos anos, estudos têm mostrado que a maioria das drogas de abuso, dentre elas cocaína,

opióides, canabinóides e etanol, causam alterações nas vias de sinalização mediadas pela adenosina

em diversas estruturas encefálicas ligadas à etiologia da dependência (Hack e Christie, 2003).

A adenosina, um nucleotídeo purinérgico endógeno, está envolvida na modulação de

diferentes processos fisiológicos de muitos sistemas, e tem sido implicada em processos normais

(homeostáticos) e patofisiológicos, como epilepsia (Ahlijanian e Takemori, 1985), transtornos

neurológicos (Popoli et al., 1997), isquemia cerebral (Ongini et al., 1997), além de processos

neurodegenerativos como a doença de Parkinson (Hauber e Munkle, 1996; Gale e Martyn, 2003).

Perifericamente, a adenosina tem efeitos marcantes sobre o sistema cardiovascular, além de

modular respostas inflamatórias e imunológicas, renais, respiratórias, entre outras (para revisão ver

Kaiser e Quinn, 1999; Ribeiro et al., 2003).

A adenosina não corresponde a um neurotransmissor clássico, uma vez que não existem

evidências de armazenamento vesicular e, tampouco, da liberação dependente de cálcio (processo

conhecido como exocitose), sendo, portanto, classificado como um neuromodulador (Hack e

Christie, 2003). As concentrações basais de adenosina são dependentes do equilíbrio entre múltiplos

mecanismos que regulam sua produção, liberação, recaptação e metabolismo (para revisão ver

Latini e Pedata, 2001; Dunwiddie e Masino, 2001). Nas sinapses centrais, a concentração basal de

adenosina é relativamente baixa, entre 30 e 300 nM (Dunwiddie e Diao, 1994; Fredholm et al.,

1999).

13

Introdução

No SNC, a adenosina pode ser formada intracelularmente através da degradação do 5’-AMP

(5-adenosina monofosfato) e então liberada via transportadores específicos de nucleosídeos, ou

então pelo metabolismo rápido de nucleotídeos de adenina (ATP, ADP e AMP) liberados no espaço

extracelular (Dunwiddie et al., 1997; Latini e Pedata, 2001). Desta maneira, a formação de

adenosina pode ocorrer tanto fora, quanto dentro das células, e depende da atividade de

determinadas enzimas, conhecidas como nucleotidases e fosfodiesterases. As nucleotidases podem

defosforilar virtualmente apenas nucleotídeos de adenina formando 5’-AMP que, por sua vez, é

novamente defosforilado pela 5’-nucleotidase, dando origem a adenosina (Dunwiddie et al., 1997;

Cunha et al., 1998, 2000; Zimmermann, 2000; Figura 2). Outro mecanismo é a formação de

adenosina a partir do metabolismo intracelular do AMPc. Embora este processo tenha sido

mostrado indiretamente, tanto a adenosina per se quanto o 5’-AMP podem ser transportados para o

espaço extracelular via transportadores específicos de nucleosídeos (Craig et al., 1994).

Figura 2. Esquema simplificado dos mecanismos intracelulares e extracelulares responsáveis pela

formação e regulação metabólica da adenosina. AMPc, monofosfato de 3’,5’-adenosina cíclico; 5’-

AMP, monofosfato 5’-adenosina; ENT1, transportador responsável pelo transporte passivo; ENT2,

transportador responsável pelo transporte passivo; PDE, fosfodiesterase; SAH, S-adenosil

homocisteína. Adaptado de Hack e Christie (2003).

14

Introdução

Os níveis de adenosina extracelular são rapidamente regulados pela atividade de

transportadores específicos de nucleosídeos, que modulam a recaptação de adenosina para o interior

da célula, visto que o bloqueio destes transportadores aumenta os níveis basais de adenosina

(Crawley et al., 1983; Ballarin et al., 1991; Mailliard e Diamond, 2004). O transporte bidirecional

de adenosina é mediado principalmente por duas classes de transportadores funcionalmente

distintos: o transporte ativo dependente de Na+, que direciona a captação de adenosina contra um

gradiente de concentração, e o transporte facilitado (passivo), encontrado predominantemente no

SNC, que possibilita o transporte de adenosina em ambas as direções, dependendo do gradiente de

concentração (Thorn e Jarvis, 1996; Latini e Pedata, 2001).

Em condições fisiológicas, o fluxo de adenosina através do transporte passivo ocorre para o

interior da célula, uma vez que a concentração intracelular de adenosina é menor do que no espaço

extracelular. Contudo, estes transportadores podem regular o efluxo de adenosina em condições em

que seus níveis intracelulares estão elevados (Brundege e Dunwiddie, 1998; Dunwiddie e Masino,

2001). Por outro lado, após sua captação a adenosina pode ser metabolizada tanto por fosforilação,

mediada pela adenosina quinase, quanto por deaminação, mediada pela adenosina deaminase

(ADA), formando 5’-AMP e iosina, respectivamente (Hack e Christie, 2003). A adenosina ainda

pode ser metabolizada para S-adenosil homocisteína (SAH) via uma reação reversível catalisada

pela SAH hidrolase (Latini e Pedata, 2001; Dunwiddie e Masino, 2001) (Figura 2).

A influência da adenosina sobre os níveis encefálicos de AMPc forneceu a primeira

evidência molecular sobre a função de seus receptores e sua diferenciação em subtipos. As

respostas neurais mediadas pela ativação destes receptores são dependentes da formação, difusão

entre os espaços intracelulares e extracelulares, e degradação da adenosina (Dunwiddie, 1985).

Além disso, técnicas de biologia molecular têm demonstrado que os efeitos fisiológicos da

adenosina são transduzidos através de receptores acoplados à proteína G (α<β<γ) e subseqüente

interação com diversos sistemas efetores que incluem além do AMPc, GMPc (guanodina

15

Introdução

monofosfato cíclico), fosfodiesterases, fosfolipase A2, canais iônicos de Ca2+ e K+, entre outros

(Olah e Stiles, 1995; Birnbaumer e Birnbaumer, 1995; Lorist e Tops, 2003). Desta maneira, as

respostas neurais mediadas pela adenosina dependem do tipo e quantidade de transportadores e

receptores presentes nas diversas regiões encefálicas.

Até o presente momento, quatro subtipos de receptores de adenosina (A1, A2A, A2B e A3),

codificados por quatro genes distintos, têm sido clonados e caracterizados em diferentes espécies de

mamíferos, incluindo humanos e camundongos (Olah e Stiles, 1995; Fredholm et al., 2001). Os

receptores A1 e A3 interagem com proteínas G inibitórias (Gi/o) sensíveis à toxina pertussis,

promovendo uma inibição da atividade da enzima adenilato ciclase e, consequentemente, redução

dos níveis de AMPc. Por outro lado, os receptores A2 (A2A e A2B) estão acoplados a proteínas G

estimulatórias (Gs ou Golf), levando a um aumento na atividade da enzima adenilato ciclase e nos

níveis de AMPc (Daly et al., 1983; Feoktistov e Biaggioni, 1997; Kull et al., 2000). A Tabela 1

mostra, resumidamente, os subtipos de receptores de adenosina presentes no SNC.

Os receptores A1 estão presentes em quase todas as regiões encefálicas, e medeiam as suas

ações inibitórias, sendo predominantemente localizados nos terminais pré-sinápticos, modulando a

liberação de uma variedade de neurotransmissores (Fredholm e Dunmiddie, 1988; Hack e Christie,

2003). Estes receptores são expressos em concentrações elevadas em estruturas como o hipocampo,

córtex cerebral e cerebelar e núcleos talâmicos (Goodman e Snyder, 1982; Fastbom et al., 1987;

Deckert et al., 1988), enquanto que, níveis moderados são encontrados no caudado-putamen e

núcleo accumbens (Lorist e Tops, 2003). Por outro lado, os receptores A2A, presentes

principalmente nas espinhas dendritícas das células neurais, apresentam uma localização mais

limitada que os receptores A1, sendo encontrados em altas concentrações em regiões encefálicas

ricas em dopamina, como o estriado, o núcleo accumbens e o tubérculo olfatório, apresentando

reduzida expressão em outras áreas do SNC (Ongini e Fredholm, 1996; Moreau e Huber, 1999).

16

Introdução

Tabela 1. Características dos subtipos de receptores de adenosina presentes no SNC.

Receptor CE50 Adenosina

Transdução de sinal Acoplado a proteína G

Efeitos neurofisiológicos

Distribuição

A1 ≈ 70 nM ↓ Adenilato ciclase

↑ GIRKs

↑ Canais de Ca2+

↑ PLC

Gi e Go ↓ Liberação de

neurotransmissores

Hiperpolarização

Amplamente

distribuído

A2A ≈ 150 nM ↑ Adenilato ciclase

↓/↑ Canais de Ca2+

↑ MAPK

Gs e Golf ↓/↑ Liberação de

neurotransmissores

↑ AMPc

Tubérculo olfatório;

estriado e núcleo

acumbens

A2B ≈ 5100 nM ↑ Adenilato ciclase

↑ PLC

↑ IP3

↑ MAPK

Gs ↑ AMPc Amplamente

distribuído

(baixos níveis)

A3 ≈ 6500 nM ↓ Adenilato ciclase

↑ PLC

↑ [Ca2+]i

↑ IP3

Gi e Gq ↓ Inibição mediada

mGluR

↓ Inibição sináptica

mediada por A1

Amplamente

distribuído

(baixos níveis)

Abreviações: ↑, ativa; ↓, inibe; GIRK, canal de potássio acoplado à proteína G; PLC,

fosfolipase C; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato; [Ca2+]i, concentração intracelular de Ca2+; MAPK,

proteína quinase ativada por mitógeno; AMPc, monofosfato de adenosina cíclico; mGluR, receptor

glutamatérgico do tipo metabotrópico. Adaptado de Hack e Christie, 2003.

Muitas evidências têm mostrado o envolvimento direto dos receptores de adenosina em

comportamentos relacionados à ansiedade e emocionalidade (Imaizumi et al., 1994; Millan, 2003).

Camundongos com deleção gênica dos receptores A1 apresentam um aumento nos níveis de

ansiedade (Johansson et al, 2001; Giménez-Llort et al, 2002; Lang et al, 2003), e as ações

ansiogênicas dos antagonistas destes receptores, como a cafeína, tanto em roedores quanto em

humanos, têm sido geralmente atribuído ao bloqueio dos receptores A1 (Pellow et al, 1985;

17

Introdução

McCloskey et al, 1990; Jain et al, 1995; Florio et al, 1998). De maneira contrária, a administração

de agonistas dos receptores A1 promove respostas tipo-ansiolíticas em vários modelos animais

(Imaizumi et al., 1994; Jain et al., 1995).

Embora nenhuma evidência consistente tenha sido obtida, até o presente momento, para os

efeitos tipo-ansiolíticos induzidos pela ativação dos receptores A2A (Jain et al, 1995; El Yacoubi et

al, 2000), muitos autores tem mostrado que camundongos nocautes para estes receptores, parecem

ser mais “ansiosos” e “agressivos” do que os respectivos camundongos controles (Ledent et al.,

1997). Além disso, estudos clínicos têm encontrado uma significante associação entre

polimorfismos no gene do receptor A2A e transtornos de pânico, além do fato de indivíduos

relatarem quadros de ansiedade após o tratamento agudo com cafeína (Alsene et al, 2003; Hamilton

et al, 2004). Apesar destas evidências, nenhum estudo até o presente momento investigou o

envolvimento do sistema adenosinérgico no efeito ansiolítico induzido pelo etanol.

Outros estudos sugerem que os receptores de adenosina podem modular muitos dos sinais da

abstinência ao etanol, como tremores e convulsões (Jain et al., 1995; Zeraati et al., 2006). Concas e

colaboradores (1994) descreveram uma significante redução da síndrome de abstinência ao etanol

após o tratamento com o agonista seletivo do receptor A1, CCPA, enquanto a ausência dos

receptores A2A ou seu bloqueio crônico com ZM241385 resulta em uma redução das convulsões

induzidas pela abstinência ao etanol em camundongos (El Yacoubi et al., 2001).

Além disso, o tratamento com o agonista seletivo dos receptores A1, R-PIA, bem como com

o agonista seletivo do receptor A2A, CGS 21680, tem produzido resultados similares ao atenuar a

abstinência do etanol em camundongos (Kaplan et al., 1999). Contudo, alguns estudos (Gatch et al.,

1999) têm produzido resultados conflitantes entre o sistema adenosinérgico e os elevados níveis de

ansiedade observados durante a abstinência ao etanol. Portanto, são necessários estudos mais

abrangentes para uma melhor compreensão do papel dos receptores de adenosina nos sinais

observados após a retirada do etanol.

18

Introdução

Paralelamente, pouco é conhecido sobre a participação dos receptores para adenosina no

desenvolvimento da tolerância ao etanol. Estudos experimentais demonstram que animais

desafiados com etanol após o tratamento crônico com agonistas do receptor A1, e vice-versa,

mostraram perda reduzida da coordenação motora, quando comparados com animais controle (Dar

e Clark, 1992; Dar, 1993), sugerindo o desenvolvimento de tolerância cruzada entre estes dois

compostos (Dar, 1993). Entretanto, os mecanismos pelo qual o sistema adenosinérgico modula o

desenvolvimento de tolerância ao etanol ainda permanecem obscuros.

Além disso, tem sido bem documentado que a cafeína, além de outros compostos que atuam

sobre o sistema adenosinérgico, apresenta propriedades reforçadoras e motivacionais em humanos

(Griffiths e Mumford, 1995) e roedores (Steigerwald et al., 1988; Zarrindast e Moghadamnia, 1997;

Patkina e Zvartau, 1998). Neste sentido, muitos estudos mostram que a cafeína pode produzir tanto

preferência (doses baixas), quanto aversão de lugar (doses moderadas e altas), quando testada no

paradigma da preferência condicionada de lugar (Brockwell et al., 1991; Brockwell e Beninger,

1996; Patkina e Zvartau, 1998). Estudos recentes têm mostrado que os receptores de adenosina

modulam a preferência condicionada de lugar induzida pela cocaína (Poleszak e Malec, 2002) e

anfetamina (Poleszak e Malec, 2003) em ratos, sugerindo uma importante participação do sistema

adenosinérgico no reforço positivo de drogas de abuso. Todavia, poucos estudos têm investigado o

envolvimento do sistema adenosinérgico nos processos reforçadores e motivacionais induzidos pelo

etanol em roedores.

Embora o repertório comportamental dos animais de laboratório seja significativamente

diferente dos humanos, e fatores inerentes contribuírem na suscetibilidade individual para o abuso

do etanol e alcoolismo, a utilização de modelos experimentais tem contribuído enormemente para a

descoberta de novos alvos moleculares e sistemas neurais, além de caracterizar de fatores genéticos

e ambientais que influenciam o desenvolvimento da dependência ao etanol.

19

Introdução

A capacidade de interação do etanol com múltiplos sistemas de neurotransmissores,

associado com os efeitos neuromodulatórios da adenosina tanto in vivo quanto in vitro, tem

fornecido um enorme interesse no potencial terapêutico deste sistema para o tratamento do

alcoolismo. Contudo, relativamente pouco se sabe sobre o envolvimento deste sistema em

comportamentos relacionados à ansiedade após tratamento agudo ou após a abstinência do etanol,

bem como nas respostas neuroadaptativas verificadas após a exposição repetida, como o

desenvolvimento de tolerância e reforço positivo do etanol, supostamente implicados na iniciação,

manutenção e recaída ao consumo de etanol em modelos animais.

20

Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos gerais

Investigar o envolvimento do sistema adenosinérgico nas propriedades ansiolíticas da

administração aguda de etanol, ansiogênicas da retirada de etanol (ressaca), bem como no

desenvolvimento da tolerância rápida e nas propriedades motivacionais induzidas pela

administração repetida de etanol.

2.2. Objetivos específicos

Verificar o papel dos receptores de adenosina A1 e A2A no efeito ansiolítico produzido pela

administração aguda de etanol em camundongos testados no labirinto em cruz elevado;

Investigar o efeito de agonistas dos receptores A1 e A2A na ansiedade experimental

induzida pela abstinência aguda (ressaca) ao etanol em camundongos testados no labirinto

em cruz elevado;

Avaliar o papel de antagonistas dos receptores A1 e A2A no desenvolvimento da tolerância

rápida na perda da coordenação motora induzida pelo etanol em camundongos testados no

rota-rod;

Investigar o efeito do antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina cafeína nas fases

de aquisição e expressão do reforço positivo ao etanol em camundongos avaliados no teste

da preferência condicionada de lugar.

21

Material e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos albinos suíços machos, pesando entre 30–40 g, com

aproximadamente 3 meses de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de

Santa Catarina (UFSC). Os animais foram alojados em gaiolas plásticas (42 x 34 x 17 cm) com no

máximo 25 animais, e mantidos no biotério setorial do Departamento de Farmacologia, em

ambiente com temperatura controlada (23 ± 1°C), sob um ciclo claro-escuro de 12 horas (período

claro a partir das 7:00 h) e livre acesso a comida e água. Os animais foram transportados do

Biotério para a sala de experimento uma hora antes dos procedimentos, que foram todos realizados

entre as 10:00 e 18:00 h. Todos os experimentos realizados no presente estudo estão de acordo com

o guia do Comitê de Ética da UFSC para o Uso de Animais (Nº 258/CEUA/UFSC), que segue os

“Princípios e cuidados com animais de laboratório” da publicação do NIH n° 85-23.

3.2. Drogas e reagentes

O etanol (Merck, Brasil) foi diluído em salina (NaCl 0,9%) na concentração, dependendo do

protocolo experimental, de 12% p/v para as doses 0,6; 1,2 ou 2,4 g/kg, de 14% p/v para as doses

0,5; 1,0; 2,0 ou 2,25 g/kg e de 20% p/v para a dose 4,0 g/kg.

A adenosina (Sigma Chemical Co., USA; 1,0; 5,0 ou 10,0 mg/kg), agonista não-seletivo dos

receptores de adenosina, bem como os agonistas seletivos do receptores de adenosina A1 e A2A, 2-

cloro-N6-ciclopentiladenosina (CCPA) (Tocris Cookson, USA; 0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg) e N6-

[2-(3,5-dimetoxifenil)-2-(2-metilfenil)etil]adenosina (DPMA) (Tocris Cookson, USA; 0,1; 1,0 ou

5,0 mg/kg), respectivamente, além dos antagonistas, não-seletivo - cafeína (Sigma Chemical Co.,

USA; 3,0; 10,0; 20,0 ou 30.0 mg/kg), A1 seletivo - 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX)

(Tocris Cookson, USA; 3,0 ou 6,0 mg/kg) e A2A seletivo - 4-(2-[7-amino-2-{2-

22

Material e Métodos

furil}{1,2,4}triazolo-{2,3-a}{1,3,5}triazin-5-il-amino] etil)fenol (ZM241385) (Tocris Cookson,

USA; 0,5; 1,0 ou 3,0 mg/kg), foram dissolvidos em salina com 5% de dimetilsulfóxido (DMSO).

A solução controle consistiu de salina para etanol, e de salina com 5% de DMSO para

adenosina, CCPA, DPMA, cafeína, DPCPX e ZM241385. Todas as doses das drogas, selecionadas

de acordo com estudos piloto e trabalhos prévios da literatura (Jain et al., 1995; Florio et al., 1998;

El Yacoubi et al., 2000; Barbosa e Morato, 2001; Da Silva et al., 2001), foram administradas

intraperitonealmente (i.p.), em volume de 0,1 ml por 10 g de peso corporal (com exceção do etanol,

onde o volume administrado variou conforme a dose utilizada).

3.3. Modelos comportamentais

3.3.1. Labirinto em cruz elevado

O labirinto em cruz elevado foi utilizado para detectar efeitos tipo-ansiolíticos e/ou

ansiogênicos de drogas administradas em camundongos (Lister, 1987). O aparelho foi construído

em madeira coberta com fórmica preta impermeável, e é constituído de dois braços cercados por

paredes (braços fechados), colocados perpendicularmente a dois braços desprovidos de parede

(braços abertos), estando o conjunto elevado 60 cm em relação ao assoalho (Figura 3). Cada braço,

tanto os abertos quanto os fechados, apresenta 18 cm de comprimento por 6 cm de largura, sendo

conectados por uma plataforma central (6 x 6 cm). Os experimentos foram conduzidos sob baixa

intensidade de luz (12 lux).

23

Material e Métodos

Figura 3. Labirinto em cruz elevado utilizado para avaliação de comportamentos relacionados à

ansiedade.

Cada animal foi colocado no centro do labirinto com a face voltada para o braço fechado,

onde foram observados por um período de 5 min. O efeito tipo-ansiolítico foi definido como um

aumento na proporção de entradas nos braços abertos dividido pelo número de entradas totais nos

braços (abertos e fechados), e o tempo de permanência nos braços abertos relativo ao tempo total de

permanência em ambos os braços. A diminuição destes parâmetros indica um efeito tipo-

ansiogênico. Quando um camundongo colocou as quatro patas em um braço, uma entrada foi

quantificada. O número total de entradas nos braços fechados foi utilizado como medida de

atividade locomotora.

3.3.2. Campo aberto

Para a avaliação da atividade locomotora dos camundongos, foi utilizado o teste do campo

aberto, de acordo com a metodologia caracterizada por Holland e Weldon (1968). O aparelho

24

Material e Métodos

consiste em uma caixa de fórmica impermeável preta de 30 x 30 cm (dividido por linhas brancas em

9 quadrados de 10 x 10 cm) e paredes pretas de 15 cm (Figura 4). A iluminação no centro do campo

aberto foi de 12 lux. Cada animal foi colocado no centro do campo aberto onde foi registrado, por

um período de 5 min, o número total de cruzamentos pelos quadrantes (locomoção horizontal) e o

número de respostas de levantar (locomoção vertical).

Figura 4. Arena do teste do campo aberto utilizado para avaliação da atividade locomotora.

3.3.3. Rota-rod

A coordenação motora dos animais foi avaliada no teste do rota-rod (Rotamex-V-EE/85,

EUA), controlado por um sistema computacional (Columbus Instruments Computer-Counter

Interface, OH, EUA). O aparelho consiste de uma caixa de acrílico dividida em quatro

compartimentos com uma barra rotacional entre eles, que pode girar com velocidade constante ou

com aceleração regulável de 1 rpm/s. Abaixo da barra rotatória, localiza-se um sistema fotoelétrico,

que permite o registro de queda do animal e a aplicação de um choque de 0 a 1 mA. O equipamento

25

Material e Métodos

estava acoplado a um computador PC-XT, tornando possível a programação dos experimentos e o

registro de dados (Figura 5).

Figura 5. Rota-rod utilizado para avaliação da coordenação motora.

Os animais foram treinados sob aceleração contínua (1 rpm/s) em sessões de 1 min, sendo

que ao cair da barra rotatória recebiam um choque nas patas de 0,3 mA por 2 s, retornando em

seguida para a sua caixa. A latência (s) para a queda dos animais da barra rotatória (que

corresponde à velocidade rotacional da barra) foi quantificada como desempenho motor. Animais

que, ao longo de 15 treinos (6 treinos/dia), não apresentaram um desempenho motor entre 20-40 s

foram descartados (aproximadamente 10%). Após a seleção, grupos experimentais e controle foram

formados respeitando o peso corporal e o desempenho motor na última sessão. Com este

procedimento, os animais apresentavam um desempenho motor basal semelhante em ambos os dias

para todos os grupos.

26

Material e Métodos

3.3.4. Preferência condicionada de lugar

Os experimentos de preferência de lugar foram realizados em caixas de acrílico retangulares

(54 x 15 x 15 cm), divididas por portas de guilhotina em dois compartimentos de iguais dimensões

(22 x 15 cm), separadas por um compartimento central (10 x 15 cm) (Figura 6). Um dos

compartimentos tem paredes pretas com listras brancas horizontais, sendo a textura do chão

gradeada, enquanto o compartimento oposto tem paredes brancas com listras pretas verticais e a

textura do chão lisa. O compartimento central tem paredes e chão marrons. Ambos os

compartimentos têm aproximadamente a mesma iluminação (5 lux) e foram limpos com solução

alcoólica de 10% após a exposição de cada animal no aparelho.

Figura 6. Caixa de condicionamento de lugar utilizado para a avaliação de propriedades

reforçadoras de drogas.

Cada experimento consistiu de três fases: pré-condionamento (2 dias), condicionamento (4

dias) e pós-condicionamento (1 dia). Durante a fase de pré-condicionamento, todos os animais

foram colocados no compartimento central, com livre acesso aos três compartimentos por 10 min.

Este mesmo procedimento foi repetido 2 h depois. O tempo de permanência (em segundos) dos

animais em cada compartimento foi avaliado no dia seguinte durante 15 min (pré-teste), definindo o

nível de preferência basal dos animais por cada ambiente/contexto. A metodologia experimental

27

Material e Métodos

empregada neste estudo foi o paradigma do condicionamento de lugar conhecido como unbiased

(i.e., sem viés), onde as condições experimentais são selecionadas para resultar em uma preferência

balanceada dos animais para ambos os compartimentos durante o pré-teste (Cunningham et al.,

2003; Kuzmin et al., 2003). Neste sentido, os animais que permaneceram acima de 85% em um dos

dois compartimentos foram excluídos do experimento.

A fase de condicionamento consistiu de duas sessões diárias de 25 min durante 4 dias

consecutivos (total de 8 sessões: 4 com solução controle e 4 com etanol). Em cada um dos quatro

dias de condicionamento, camundongos foram tratados com salina (i.p.) e, imediatamente após,

foram confinados em um dos compartimentos por 25 min (primeira sessão diária de

condicionamento). Duas horas depois, na segunda sessão diária de condicionamento, os animais

foram tratados com etanol (0,5; 1,0 ou 2,0 g/kg, i.p.) ou salina (i.p.), e confinados por 25 min no

compartimento oposto à primeira sessão. O grupo controle recebeu salina (i.p.) em ambos os

compartimentos. Todos os grupos foram contrabalançados durante a sessão de condicionamento nos

compartimentos, ou seja, metade dos animais do grupo recebeu salina (ou etanol) no compartimento

com paredes pretas e listras brancas horizontais e chão gradeado, enquanto que a outra metade

recebeu etanol (ou salina) no compartimento oposto.

O teste de pós-condicionamento foi conduzido 24 h após a última sessão de

condicionamento. Durante este teste, camundongos em um estado livre da droga (exceto nos

experimentos que avaliaram a expressão da preferência condicionada de lugar) foram colocados no

compartimento central com livre acesso aos compartimentos do aparelho, e o tempo de permanência

(s) de cada animal em cada compartimento foi quantificado durante 15 min (pós-teste). A diferença

do tempo de permanência no compartimento associado com etanol durante o pós-teste (pós-

condicionamento) versus o pré-teste (pré-condicionamento) foi utilizada como medida de

preferência de lugar induzido pela droga. Nos experimentos controle (camundongos condicionados

com salina em ambos os compartimentos), o compartimento utilizado como referência para a

28

Material e Métodos

análise da preferência de lugar foi o compartimento utilizado na segunda sessão de

condicionamento com salina.

3.4. Procedimentos experimentais

3.4.1. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no efeito tipo-ansiolítico do

etanol no labirinto em cruz elevado

Para investigar a participação dos receptores A1 e A2A no efeito tipo-ansiolítico induzido

pelo etanol em camundongos testados no labirinto em cruz elevado, foram administradas doses

“não-ansiogênicas” (selecionadas após a realização de estudos piloto) dos antagonistas

adenosinérgicos, cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0 mg/kg, i.p.), DPCPX (antagonista do

receptor A1, 3,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista do receptor A2A, 1,0 mg/kg, i.p.) ou solução

controle (i.p.), 15 min antes do tratamento com etanol (1,2 g/kg, i.p.). A seguir, 15 min após este

tratamento, os animais foram colocados no centro do labirinto em cruz elevado onde os parâmetros

comportamentais (descritos anteriormente) foram registrados por um período de 5 min.

Em outro experimento, para investigar uma possível interação sinérgica entre a ativação do

receptor A1 e o etanol em respostas tipo-ansiolíticas observadas em camundongos testados no

labirinto em cruz elevado, foi administrada uma dose selecionada de CCPA (agonista do receptor

A1, 0,125 mg/kg, i.p.) 15 min antes da injeção aguda de etanol (0,6 g/kg, i.p.), e 15 min após este

tratamento, os animais foram testados no labirinto em cruz elevado.

3.4.2. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda (ressaca) do

etanol em camundongos

Para investigar um possível comportamento tipo-ansiogênico durante a ressaca do etanol ao

longo do tempo, grupos independentes de camundongos foram testados no labirinto em cruz

elevado 0,5, 6, 12, 18 ou 24 h após a administração aguda de etanol (4,0 g/kg, i.p.) ou salina (i.p.).

29

Material e Métodos

3.4.3. Dosagem sanguínea de etanol durante a ressaca

As concentrações sanguíneas de etanol foram determinadas, em grupos distintos de animais,

em intervalos de 0,5, 2, 4, 6 e 12 h após a injeção aguda de etanol (4 g/kg, i.p.). A dosagem

sangüínea foi realizada pelo método da cromatografia gasosa utilizando o aparelho Thermo Quest

Autosystem. Uma amostra de 0,5 ml de sangue, coletada da cauda, foi misturada com 0,5 ml de

uma solução 1,6 g/l de n-propranolol, utilizado como padrão interno. As amostras foram incubadas

por 7 min a 75°C. As cromatografias foram registradas e os cálculos básicos realizados pelo

programa de computador Chrom-card.

3.4.4. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no comportamento tipo-

ansiogênico induzido pela ressaca do etanol

Para investigar o papel dos receptores A1 e A2A no comportamento tipo-ansiogênico

induzido pela ressaca do etanol, camundongos foram submetidos ao labirinto em cruz elevado 18 h

(baseado no experimento anterior) após a administração de etanol (4,0 g/kg, i.p.), sendo que grupos

independentes de animais foram tratados previamente (30 min antes dos testes comportamentais)

com agonistas dos receptores de adenosina, adenosina (agonista não-seletivo, 1,0; 5,0 ou 10,0

mg/kg, i.p.), CCPA (agonista do receptor A1, 0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg, i.p.), DPMA (agonista do

receptor A2A, 0,1; 1,0 ou 5,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.).

Um experimento subseqüente foi realizado para investigar se os efeitos produzidos pelo

CCPA, no comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol, estão realmente

relacionados à ativação dos receptores A1. Para isso, foi administrada uma dose selecionada

(baseado em experimentos piloto) do antagonista seletivo do receptor A1 DPCPX (3,0 mg/kg, i.p.),

15 min antes da injeção de CCPA (0,05 mg/kg, i.p.). Os animais foram submetidos ao labirinto em

cruz elevado 18 h após o tratamento com etanol (4,0 g/kg, i.p.). DPCPX e CCPA foram

administrados, respectivamente, 30 e 15 min antes do teste.

30

Material e Métodos

3.4.5. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A na tolerância rápida à perda da

coordenação motora induzida pelo etanol

Para investigar o papel dos receptores de adenosina A1 e A2A no desenvolvimento da

tolerância rápida ao etanol, diferentes grupos de camundongos treinados foram pré-tratados com

cafeína (antagonista não-seletivo, 3,0; 10,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.), DPCPX (antagonista do receptor

A1, 3,0 ou 6,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista do receptor A2A, 0,5 ou 1,0 mg/kg, i.p.) ou

solução controle (i.p.). Dez min depois, cada grupo foi novamente dividido em dois, e cada

subgrupo recebeu etanol (2,25 g/kg, i.p.) ou salina (i.p.). Então, os animais foram testados no rota-

rod após 20 min. Vinte e quatro horas depois, todos os grupos (incluindo os controles) receberam

um dose desafio de etanol (2,25 g/kg, i.p.), e foram testados no rota-rod 20 min após este

tratamento, para avaliar o desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação motora.

3.4.6. Efeito do antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina cafeína nas fases de

aquisição e expressão da preferência condicionada de lugar induzida pelo etanol em camundongos

Para investigar o envolvimento dos receptores de adenosina na aquisição da preferência

condicionada de lugar ao etanol, camundongos foram tratados durante a sessão de condicionamento

(4 dias consecutivos) com cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0, 20,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) ou

salina (i.p.), 10 min antes da segunda sessão da fase de condicionamento (administração

intraperitoneal de 2,0 g/kg de etanol ou salina). A avaliação do efeito reforçador foi realizada 24 h

após a última sessão de condicionamento, na ausência de tratamento, onde foi registrado o tempo de

permanência dos animais nos compartimentos da caixa de condicionamento (teste de pós-

condicionamento), conforme procedimento já descrito anteriormente.

Para avaliar o envolvimento dos receptores de adenosina na expressão da preferência

condicionada de lugar ao etanol, os experimentos foram realizados como descritos acima

(administração de 2,0 g/kg de etanol durante as sessões de condicionamento), exceto que a cafeína

31

Material e Métodos

(10,0 ou 20,0 mg/kg, i.p.) ou salina (i.p.) foi somente administrada 10 min antes do teste de pós-

condicionamento.

3.5. Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). As comparações

estatísticas entre as médias dos grupos foram inicialmente realizadas por análise de variância

(ANOVA) de uma, duas ou três vias, adequadas ao protocolo experimental. Posteriormente, os

grupos foram comparados entre si empregando-se o teste post-hoc de Newman-Keuls ou LSD

(dependendo do protocolo experimental). A probabilidade aceita como indicativo da existência de

diferença estatisticamente significante foi p≤0,05. Todas as análises foram realizadas utilizando o

programa estatístico “Statistic 5.0 ®”.

32

Resultados

4. RESULTADOS

4.1. Efeito do tratamento agudo com etanol sobre comportamentos relacionados à

ansiedade no labirinto em cruz elevado

Os resultados da administração de etanol (0,6; 1,2 ou 2,4 g/kg, i.p.) nos animais avaliados no

labirinto em cruz elevado estão ilustrados na Figura 7. A ANOVA de uma via revelou um efeito

significante para o fator tratamento na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(3,24) =

25,54; p<0,0001], bem como na porcentagem de entradas nos braços abertos [F(3,24) = 7,68;

p<0,001], sem diferenças estatisticamente significantes com relação ao número de entradas nos

braços fechados [F(3,24) = 1,61; p=0,21].

O teste subseqüente de Newman-Keuls indicou que o etanol nas doses de 1,2 e 2,4 g/kg,

aumentou significativamente a exploração dos animais nos braços abertos do labirinto, sem

alterações significativas na freqüência de entradas nos braços fechados, demonstrando um efeito

tipo-ansiolítico destas doses de etanol (Figura 7).

33

Resultados

0

15

30

45

60

75

* *

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45

60

75

% E

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da n

os b

raço

s ab

erto

s

* *

0

5

10

15

Controle 0,6 1,2 2,4 g/kg

Etanol

Entra

das

nos

braç

os fe

chad

os

Figura 7. Efeito do tratamento agudo com etanol sobre comportamentos relacionados à ansiedade

no labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados com etanol (0,6; 1,2 ou 2,4 g/kg) ou salina,

e 15 min depois, testados no labirinto em cruz elevado. Os dados são representados como média ±

E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0.05 comparado com o grupo controle (salina) (teste de

Newman-Keuls).

34

Resultados

4.2. Efeito de agonistas e antagonistas dos receptores de adenosina A1 e A2A no labirinto

em cruz elevado e campo aberto

Os resultados da administração aguda de adenosina (agonista não-seletivo dos receptores de

adenosina, 1,0; 5,0 ou 10,0 mg/kg, i.p.), CCPA (agonista do receptor A1, 0,05; 0,125 ou 0,25

mg/kg, i.p.), DPMA (agonista do receptor A2A, 0,1; 1,0 ou 5,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle

(i.p.), em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado e no teste do campo aberto estão

sumarizados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. A ANOVA de uma via indicou um efeito

significante para o fator tratamento na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(9,63) =

6,61; p<0,0001] e na porcentagem de entradas nos braços abertos [F(9,63) = 4,83; p<0,0001], sem

diferença significativa para o número de entradas nos braços fechados [F(9,63) = 1,26; p=0,28].

As comparações post-hoc (Newman-Keuls) indicaram que somente a maior dose testada do

agonista seletivo dos receptores de adenosina A1 CCPA (0,25 mg/kg, i.p.) aumentou

significativamente a exploração dos animais pelos braços abertos do labirinto (p<0,05), sem alterar

significativamente o número de entradas nos braços fechados, demonstrando um efeito tipo-

ansiolítico do CCPA nesta dose (Tabela 2).

35

Resultados

Tabela 2. Efeito da administração de agonistas adenosinérgicos em camundongos avaliados no

labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados com adenosina (agonista não-seletivo, 1,0; 5,0

ou 10,0 mg/kg, i.p.), CCPA (agonista do receptor A1, 0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg, i.p.), DPMA

(agonista do receptor A2A, 0,1; 1,0 ou 5,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.), e 30 min depois,

testados no labirinto em cruz elevado.

Tratamento (mg/kg, i.p.)

% TBA % EBA EBF N

Controle 29,9 + 3,8 37,1 + 2,4 9,2 + 0,8 8

Adenosina (1,0) 28,7 + 4,1 34,9 + 3,1 9,8 + 0,8 8

Adenosina (5,0) 23,4 + 2,4 37,1 + 3,8 8,8 + 0,8 7

Adenosina (10,0) 28,9 + 4,6 31,8 + 3,1 9,3 + 0,3 7

CCPA (0,05) 24,2 + 1,4 29,3 + 1,9 9,4 + 0,6 7

CCPA (0,125) 28,7 + 1,5 32,6 + 1,5 10,8 + 0,3 7

CCPA (0,25) 51,3 + 2,5* 49,0 + 1,6* 9,9 + 0,4 8

DPMA (0,1) 27,8 + 3,9 31,6 + 3,8 9,6 + 1,0 7

DPMA (1,0) 26,8 + 2,7 31,4 + 2,2 10,7 + 1,0 7

DPMA (5,0) 23,9 + 3,2 30,6 + 2,2 8,3 + 0,4 7

Os dados são representados como média ± E.P.M. de 7-8 animais por grupo. % TBA, porcentagem de tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado; % EBA, porcentagem de entradas nos braços abertos do labirinto em cruz elevado; EBF, número total de entradas nos braços fechados; N, número de animais. *p<0,05 comparado com o grupo controle (teste de Newman-Keuls).

Além disso, o tratamento agudo com estes agentes adenosinérgicos não alterou os

parâmetros comportamentais analisados no campo aberto: número de quadrantes cruzados [F(9,62)

= 0,87; p=0,15] e número de respostas de levantar [F(9,62) = 1,03; p=0,43] (Tabela 3).

36

Resultados

Tabela 3. Efeitos da administração de agonistas adenosinérgicos em camundongos avaliados no

campo aberto. Os animais foram tratados com adenosina (agonista não-seletivo, 1,0; 5,0 ou 10,0

mg/kg, i.p.), CCPA (agonista A1, 0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg, i.p.), DPMA (agonista A2A, 0,1; 1,0

ou 5,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle, e 30 min depois, testados no campo aberto.

Tratamento (mg/kg, i.p.)

Número de cruzamentos

Respostas de levantar

N

Controle 72,9 + 3,5 22,0 + 2,0 8

Adenosina (1,0) 76,1 + 5,7 28,9 + 3,3 8

Adenosina (5,0) 66,3 + 2,3 26,8 + 2,4 7

Adenosina (10,0) 70,7 + 4,2 29,0 + 4,3 7

CCPA (0,05) 58,0 + 1,8 24,1 + 1,4 7

CCPA (0,125) 62,3 + 2,2 23,8 + 2,7 7

CCPA (0,25) 66,1 + 2,3 26,1 + 2,9 8

DPMA (0,1) 72,2 + 6,6 30,5 + 3,8 6

DPMA (1,0) 61,8 + 5,9 32,1 + 5,2 7

DPMA (5,0) 58,6 + 2,2 23,4 + 3,1 7

Os dados são representados como média ± E.P.M. de 6-8 animais por grupo. N, número de animais.

Os efeitos do tratamento agudo com cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0 ou 30,0 mg/kg,

i.p.), DPCPX (antagonista do receptor A1, 3,0 ou 6,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista do

receptor A2A, 1,0 ou 3,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.) estão ilustrados na Figura 8. A

ANOVA de uma via revelou um efeito significante para o fator tratamento tanto na porcentagem de

tempo gasto nos braços abertos [F(6,49) = 10,58; p<0,0001], quanto na porcentagem de entradas

nos braços abertos [F(6,49) = 8,64; p<0,0001], sem diferença significativa para o número de

entradas nos braços fechados [F(6,49) = 1,40; p=0,23].

37

Resultados

O teste post-hoc de Newman-Keuls demonstrou que a maior dose de cafeína (30,0 mg/kg,

i.p.) e DPCPX (6,0 mg/kg, i.p.) utilizadas no presente estudo, reduziram significantemente as

porcentagens de entradas e tempo gasto nos braços abertos (p<0,05), indicando um efeito tipo-

ansiogênico da cafeína e DPCPX nestas doses (Figura 8).

38

Resultados

0

10

20

30

40

**

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

10

20

30

40

**

% E

ntra

das

nos

braç

os a

bert

os

0

5

10

15

Controle10 3 6 1 330

Cafeína DPCPX ZM241385

mg/kg

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ados

Figura 8. Efeitos do tratamento com antagonistas adenosinérgicos em camundongos avaliados no

labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados com cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0 ou

30,0 mg/kg, i.p.), DPCPX (antagonista A1, 3,0 ou 6,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista A2A,

1,0 ou 3,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.), e 30 min depois, testados no labirinto em cruz

elevado. Os dados são representados como média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05

comparado com o grupo controle (teste de Newman-Keuls).

39

Resultados

4.3. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no efeito tipo-ansiolítico do etanol

no labirinto em cruz elevado

Os resultados da administração sistêmica de doses “não-ansiogênicas” de cafeína

(antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina, 10,0 mg/kg, i.p.), DPCPX (antagonista do

receptor A1, 3,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista do receptor A2A, 1,0 mg/kg, i.p.) ou veículo

(i.p.) sobre o efeito tipo-ansiolítico induzido pelo etanol (1,2 g/kg, i.p.) podem ser vistos na Figura

9. A ANOVA de uma via revelou um efeito significante para o fator tratamento na porcentagem de

tempo gasto nos braços abertos [F(5,39) = 13,39; p<0,0001] e na porcentagem de entradas nos

braços abertos [F(5,39) = 10,36; p<0,0001], sem diferença significativa para o número de entradas

nos braços fechados [F(5,39) = 1,58; p=0,19].

As comparações subseqüentes indicaram que a cafeína (10,0 mg/kg, i.p.) e o DPCPX (3,0

mg/kg, i.p.), mas não o ZM241385 (1,0 mg/kg, i.p.), bloqueou o efeito tipo-ansiolítico do etanol

(1,2 g/kg, i.p.) em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado (teste de Newman-Keuls,

p<0,05) (Figura 9).

40

Resultados

0

25

50

75

** *

#

#

% T

empo

no

s b

raço

s ab

erto

s

0

25

50

75

* * *

##

% E

ntra

das

nos

braç

os a

bert

os

0

5

10

15

20

Controle 1,2 Etanol

Controle 10Cafeína

3DPCPX

1ZM241385

Etanol

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ados

Figura 9. Efeito do tratamento com antagonistas adenosinérgicos no efeito tipo-ansiolítico induzido

pelo etanol em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados

com doses “não-ansiogênicas” de cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0 mg/kg, i.p.), DPCPX

(antagonista A1, 3,0 mg/kg, i.p.), ZM241385 (antagonista A2A, 1,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle

(i.p.) 15 min antes da injeção de etanol (1,2 g/kg, i.p.), e 15 min depois, testados no labirinto em

cruz elevado. Os dados são representados como média ± EPM de 7-8 animais por grupo. *p<0.05

comparado com o grupo controle. #p<0.05 comparado com o grupo que recebeu somente etanol

(1.2 g/kg, i.p.) (teste de Newman-Keuls).

41

Resultados

4.4. Efeito da administração combinada de etanol e do agonista seletivo dos receptores de

adenosina A1 CCPA sobre comportamentos relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado

A Figura 10 ilustra os resultados da administração combinada do CCPA (0,125 mg/kg, i.p) e

etanol (0,6 g/kg ,i.p.) em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. A ANOVA de uma

via indicou um efeito significante para o fator tratamento na porcentagem de tempo gasto nos

braços abertos [F(3,23) = 17,58; p<0,0001], na porcentagem de entradas nos braços abertos [F(3,23)

= 34,28; p<0,0001], sem alterações significativas quanto ao número de entradas nos braços

fechados [F(3,23) = 1,51; p=0,24].

O teste subseqüente de Newman-Keuls indicou que o tratamento com o agonista do receptor

A1 CCPA (0,125 mg/kg, i.p.; sem efeito per se) 15 min antes da injeção de etanol (0,6 g/kg, i.p.;

também sem efeito per se) aumentou significativamente a exploração dos animais nos braços

abertos, sem alterações significativas na freqüência de entradas nos braços fechados, sugerindo um

efeito sinérgico entre o CCPA e do etanol sobre respostas tipo-ansiolíticas em camundongos

avaliados no labirinto em cruz elevado (Figura 10).

42

Resultados

0

25

50

75

*

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

25

50

75

*

% E

ntra

das

nos

braç

os a

berto

s

0

5

10

15

Controle 0,6Etanol

0,125 CCPA

0,125 CCPA + 0,6 Etanol

Entra

das

nos

braç

os fe

chad

os

Figura 10. Efeito da administração combinada de etanol e do agonista seletivo dos receptores de

adenosina A1 CCPA sobre comportamentos relacionados à ansiedade no labirinto em cruz elevado.

Os animais foram tratados com CCPA (0,125 mg/kg, i.p.) 15 min antes da injeção de etanol (0,6

g/kg, i.p.), e 15 min depois, testados no labirinto em cruz elevado. Os dados são representados como

média ± E.P.M. de 8-9 animais por grupo. *p<0,05 comparado com o grupo controle (teste de

Newman-Keuls).

43

Resultados

4.5. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda (ressaca) do etanol

em camundongos

A Figura 11 ilustra os efeitos da administração sistêmica de etanol (4,0 g/kg, i.p.) ou solução

controle (salina, i.p.) em camundongos avaliados em diferentes intervalos de tempo (0,5, 6, 12, 18

ou 24 h) no labirinto em cruz elevado. A ANOVA revelou uma interação significativa entre o

tratamento versus tempo na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(4,62) = 2,85;

p<0,05], na porcentagem de entradas nos braços abertos [F(4,62) = 3,32; p<0,05] e no número de

entradas nos braços fechados [F(4,62) = 5,82; p<0,001].

O teste post-hoc de Newman-Keuls revelou que a administração de etanol (4,0 g/kg, i.p.)

reduziu significativamente a porcentagem de entradas e tempo gasto nos braços abertos 12 e 18

horas após a administração de etanol (p<0,05), demonstrando um efeito tipo-ansiogênico da

abstinência de etanol nestes tempos. Além disso, o grupo avaliado 0,5 h após o tratamento com

etanol (4,0 g/kg, i.p.) no labirinto em cruz elevado, apresentou uma significativa diminuição na

atividade locomotora quando comparado com o grupo controle, verificado pela redução do número

total de entradas nos braços fechados (p<0,05) (Figura 11).

44

Resultados

0

15

30

45

*

*

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45

**

% E

ntra

das

nos

braç

os a

berto

s

0

4

8

12

Controle Etanol

*

0,5 6 12 18 24 0,5 6 12 18 24 h

Entra

das

nos

braç

os fe

chad

os

Figura 11. Comportamento tipo-ansiogênico induzido pela abstinência aguda (ressaca) do etanol em

camundongos. Os animais foram tratados com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e testados no labirinto em cruz

elevado após 0,5, 6, 12, 18 ou 24 h. Os dados são representados como média ± E.P.M. de 7-8

animais por grupo. *p<0,05 comparado com o grupo controle avaliado no mesmo tempo (teste de

Newman-Keuls).

45

Resultados

4.6. Dosagem sanguínea de etanol durante a ressaca

A figura 12 ilustra a média das concentrações plasmáticas de etanol (mg/dL), 0,5; 2, 4, 6 ou

12 h após a administração aguda de etanol (4,0 g/kg, i.p.) em camundongos. A ANOVA de uma via

revelou um efeito significante para o fator tempo [F(4,26) = 187,43; p<0,0001].

As comparações post-hoc (teste de Newman-Keuls) indicaram que as concentrações

plasmáticas de etanol diminuíram significativamente a partir de 4 h após a injeção de etanol

(p<0,05). Além disso, o tempo de depuração estimado para a eliminação completa de etanol sérico

foi de aproximadamente 8,5 h após o tratamento com etanol (Figura 12).

0 2 4 6 8 10 12

0

100

200

300

400

500

Tempo após tratamento (h)

Con

cent

raçã

o sa

ngüí

nea

de e

tano

l (m

g/dl

)

Figura 12. Concentração sanguínea de etanol (mg/dL) verificada em intervalos de 0,5; 2, 4, 6 ou 12

h após a administração aguda de etanol (4,0 g/kg, i.p.) em camundongos. Os dados são apresentados

como média ± E.P.M. de 6-7 animais por grupo.

4.7. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A no comportamento tipo-

ansiogênico induzido pela ressaca do etanol

Os efeitos da administração de adenosina (agonista não-seletivo dos receptores de

adenosina, 1,0; 5,0 ou 10,0 mg/kg, i.p.) no comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca

do etanol (4,0 g/kg, i.p.), em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado são ilustrados na

Figura 13. A ANOVA de uma via revelou um efeito significante para o fator tratamento na

46

Resultados

porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(3,24) = 16,73; p<0,0001] e na porcentagem de

entradas nos braços abertos [F(3,24) = 92,63; p<0,001], sem diferença significativa quanto ao

número de entradas nos braços fechados [F(3,24) = 1,14; p=0,35].

O teste subseqüente de Newman-Keuls indicou que a adenosina, nas doses de 5,0 e 10,0

mg/kg (i.p.), produziu um aumento significativo (p<0,05) na exploração dos braços abertos do

labirinto em cruz elevado, sem nenhuma alteração quanto ao número de entradas nos braços

fechados, sugerindo que a ativação dos receptores de adenosina reverte o comportamento tipo-

ansiogênico observado durante a ressaca do etanol em camundongos (Figura 13).

47

Resultados

0

15

30

45*

*

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45 * *

% E

ntra

das

nos

braç

os a

berto

s

0

4

8

12

ControleAdenosina (mg/kg)

1 5 10

Etanol (g/kg)

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ados

Figura 13. Efeito do tratamento com adenosina no comportamento tipo-ansiogênico induzido pela

ressaca do etanol em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. Os animais foram

tratados com adenosina (1,0; 5,0 ou 10,0 mg/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.) 18 h após o

tratamento com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e 30 min antes de serem expostos ao labirinto em cruz

elevado. Os dados são representados como média ± E.P.M. de 7 animais por grupo. *p<0.05

comparado com o grupo controle (teste de Newman-Keuls).

48

Resultados

A Figura 14 mostra os efeitos do tratamento com o agonista seletivo dos receptores A1 para

adenosina CCPA (0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg, i.p.) na ansiedade induzida pela ressaca do etanol (4,0

g/kg, i.p.) em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. A ANOVA de uma via revelou

um efeito significante para o fator tratamento na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos

[F(3,24) = 13,46; p<0,0001], na porcentagem de entradas nos braços abertos [F(3,24) = 13,05;

p<0,0001], e no número de entradas nos braços fechados [F(3,24) = 9,51; p<0,001].

As comparações post-hoc (Newman-Keuls) indicaram que o CCPA, nas doses de 0,05 e

0,125 mg/kg (i.p.), produziu um aumento seletivo na exploração dos braços abertos do aparelho,

sem nenhuma alteração quanto à freqüência de entradas nos braços fechados. Além disso, as

análises revelaram que a maior dose de CCPA (0,25 mg/kg, i.p.) diminuiu significantemente a

atividade locomotora dos animais quando comparado com o grupo controle, verificado pela redução

do número total de entradas nos braços fechados (p<0,05) (Figura 14).

Como pode ser visto na Figura 15, em contraste com os resultados obtidos com o tratamento

com adenosina e CCPA, a administração do agonista seletivo dos receptores A2A para adenosina

DPMA (0,1; 1,0 ou 5,0 mg/kg, i.p.) não alterou significativamente os parâmetros comportamentais

observados durante a ressaca do etanol nos animais expostos ao labirinto em cruz elevado:

porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(3,24) = 0,86; p=0,47], porcentagem de entradas

nos braços abertos [F(3,24) = 0,11; p=0,95] e número de entradas nos braços fechados [F(3,24) =

0,05; p=0,98].

49

Resultados

0

15

30

45*

**

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45 * **

% E

ntra

das

nos

braç

os a

bert

os

0

4

8

12

ControleCCPA (mg/kg)

0,05 0,125 0,25

*

Etanol (g/kg)

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ado

s

Figura 14. Efeito do tratamento com o agonista seletivo dos receptores de adenosina A1 CCPA no

comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol em camundongos avaliados no

labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados com CCPA (0,05; 0,125 ou 0,25 mg/kg, i.p.)

ou solução controle (veículo, i.p.) 18 h após o tratamento com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e 30 min antes

de serem expostos ao labirinto em cruz elevado. Os dados são representados como média ± E.P.M.

de 7 animais por grupo. *p<0,05 comparado com o grupo controle (teste de Newman-Keuls).

50

Resultados

0

15

30

45

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45

% E

ntra

das

nos

braç

os a

berto

s

0

4

8

12

ControleDPMA (mg/kg)

0,1 1,0 5,0

Etanol (g/kg)

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ados

Figura 15. Efeito do tratamento com o agonista seletivo dos receptores de adenosina A2A DPMA

no comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol em camundongos avaliados no

labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados com DPMA (0,1; 1,0 ou 5,0 mg/kg, i.p.) ou

solução controle (veículo, i.p.) 18 h após o tratamento com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e 30 min antes de

serem expostos ao labirinto em cruz elevado. Os dados são representados como média ± E.P.M. de

7 animais por grupo.

51

Resultados

Os efeitos da administração do antagonista seletivo dos receptores A1 DPCPX (3,0 mg/kg,

i.p.) 15 min antes do tratamento com CCPA (0,05 mg/kg, i.p.) na ansiedade induzida pela ressaca

do etanol (4,0 g/kg, i.p.) em camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado são ilustrados na

Figura 16. A ANOVA de uma via revelou um efeito significante para o fator tratamento na

porcentagem de tempo gasto nos braços abertos [F(3,21) = 21,74; p<0,0001] e porcentagem de

entradas nos braços abertos [F(3,21) = 40,12; p<0,0001], sem diferença significativa para a

freqüência de entradas nos braços fechados [F(3,21) = 0,18; p=0,91].

O teste subseqüente de Newman-Keuls mostrou que a dose testada de DPCPX, quando

administrada isoladamente, não alterou significativamente os parâmetros comportamentais

avaliados no labirinto em cruz elevado. Entretanto, esta mesma dose de DPCPX foi capaz de

reverter o efeito tipo-ansiolítico produzido pelo CCPA durante a ressaca do etanol (p<0,05),

reforçando o efeito seletivo do CCPA sobre os receptores A1 para adenosina nos presentes

resultados (Figura 16).

52

Resultados

0

15

30

45

*

% T

empo

nos

bra

ços

aber

tos

0

15

30

45 *

% E

ntra

das

nos

braç

os a

bert

os

0

4

8

12

Controle 3,0DPCPX

0,05 CCPA

3,0 DPCPX + 0,05 CCPA

mg/kg

Etanol (g/kg)

mg/kg

Entr

adas

nos

bra

ços

fech

ados

Figura 16. Efeito da administração do antagonista dos receptores A1 DPCPX (3,0 mg/kg, i.p.), 15

min antes da injeção do CCPA (agonista do receptor A1, 0,05 mg/kg, i.p.) ou veículo (i.p.) em

camundongos previamente (18 h antes) tratados com etanol (4,0 g/kg, i.p.), e testados 30 min depois

no labirinto em cruz elevado. Os dados são representados como média ± E.P.M. de 6-7 animais por

grupo. *p<0.05 comparado com o grupo controle (teste de Newman-Keuls).

53

Resultados

4.8. Desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação motora ao etanol ao

longo do tempo

Os efeitos da administração de etanol (2,25 g/kg, i.p.) ou solução controle (i.p.) no

desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação motora dos animais avaliados no rota-

rod ao longo do tempo (20, 40 e 60 min) são ilustrados na Figura 17. A ANOVA de três vias

(tratamento x tempo x dia) com medidas repetidas revelou um efeito significante para o fator

tratamento [F(1,42) = 13,37; p<0,001], para o fator tempo [F(2,42) = 14,57; p<0,0001], para o fator

dia [F(1,42) = 8,18; p<0,001] e para a interação tratamento versus dia [F(1,42) = 69,40; p<0,0001].

As comparações post-hoc (LSD) revelaram que a administração de etanol (2,25 g/kg, i.p.)

induziu um significante prejuízo motor aos 20 e 40 min, mas não aos 60 min, nos animais avaliados

no rota-rod no dia 1 (p<0,05). No dia 2, este mesmo perfil comportamental foi observado no grupo

controle desafiado com etanol (2,25 g/kg, i.p.). Entretanto, houve uma melhora tempo-dependente

(mais evidente aos 20 min após o tratamento com etanol) do desempenho motor do grupo de

animais tratados com etanol em ambos os dias, indicando um desenvolvimento consistente de

tolerância rápida ao etanol (Figura 17).

54

Resultados

0

10

20

30

40

S E60

**

*

Dia 1 Dia 2

#

S E40

S E20 20

SE EE40

SE EE60

SE EEmin

*#

Latê

ncia

(s)

Figura 17. Desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação motora ao etanol ao longo

do tempo. No dia 1, os animais foram tratados intraperitonealmente com salina (S) ou etanol (E,

2,25 g/kg), e testados no rota-rod 20, 40 e 60 min após este tratamento. A tolerância rápida foi

avaliada no dia 2, quando todos os animais receberam uma dose desafio de etanol (2,25 g/kg, i.p.),

sendo novamente avaliados no rota-rod aos 20, 40 e 60 min. O grupo EE recebeu etanol em ambos

os dias, enquanto o grupo SE recebeu salina no dia 1 e etanol no dia 2. Os resultados são

apresentados como média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0.05 comparado com o respectivo

grupo controle do mesmo dia, #p<0,05 comparado com o desempenho motor do mesmo grupo no

dia 1 (teste LSD).

4.9. Envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A na tolerância rápida à perda da

coordenação motora induzida pelo etanol

Os efeitos da administração de cafeína (3,0; 10,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) em relação à

tolerância rápida ao etanol podem ser visualizados na Figura 18. A ANOVA de três vias (pré-

tratamento x tratamento x dia) revelou um efeito significativo para o fator tratamento [F(1,56) =

394,45; p<0,0001], para o fator dia [F(1,56) = 524,78; p<0,0001] e para os fatores de interação

entre o pré-tratamento x tratamento [F(3,56) = 3,26; p<0,01] e pré-tratamento x tratamento x dia

[F(3,56) = 2,89; p<0,05].

55

Resultados

Confirmando o experimento anterior, as comparações post-hoc indicaram o

desenvolvimento de tolerância rápida avaliado no dia 2, no grupo tratado com etanol em ambos os

dias (LSD, p<0,05). Além disso, o pré-tratamento com cafeína (3,0; 10,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) não

alterou o desempenho motor dos animais tratados com salina (i.p.) ou etanol (2,25 g/kg, i.p.) no dia

1, sugerindo que o tratamento agudo com cafeína, nas doses testadas, não afeta a coordenação

motora destes animais. Contudo, nenhum dos grupos tratados com a associação de cafeína e etanol

no dia 1 apresentou uma melhora no desempenho motor quando avaliados no dia 2, sugerindo que

todas as doses testadas de cafeína bloquearam o desenvolvimento de tolerância rápida à perda da

coordenação motora induzida pelo etanol (Figura 18).

56

Resultados

0

10

20

30

40

Controle 10 30

Dia 1 Dia 2

S E

#*

* * **

S E S E S E3

Cafeína

SE EE SE EE SE EE SE EE

Controle 10 303Cafeína

mg/kg

Latê

ncia

(s)

Fig

ura

18.

Efe

ito

do

ant

ago

nist

a

não

-seletivo dos receptores de adenosina cafeína no desenvolvimento de tolerância rápida à perda da

coordenação motora induzida pelo etanol em camundongos avaliados no rota-rod. No dia 1, quatro

grupos foram tratados com salina (i.p.) ou cafeína (3,0; 10,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) 10 antes de receber

salina (S) ou etanol (E, 2,25 g/kg, i.p.), e foram testados no rota-rod 20 min depois. A tolerância

rápida foi avaliada no dia 2, quando todos os animais receberam uma dose desafio de etanol (2,25

g/kg, i.p.), e foram novamente testados no rota-rod 20 min depois. O grupo EE recebeu etanol em

ambos os dias, enquanto o grupo SE recebeu salina no dia 1 e etanol no dia 2. Os resultados são

apresentados como média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 comparado com o respectivo

grupo controle do mesmo dia, #p<0,05 comparado com o desempenho motor do mesmo grupo no

dia 1 (teste LSD).

A Figura 19 ilustra os efeitos da administração dos antagonistas seletivos dos receptores de

adenosina DPCPX (antagonista A1, 3,0 e 6,0 mg/kg, i.p.) e ZM241385 (antagonista A2A, 0,5 e 1,0

mg/kg, i.p.) no desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol. A ANOVA de três vias (pré-

tratamento x tratamento x dia) revelou um efeito significativo para o fator tratamento [F(1,70) =

250,0; p<0,0001], para o fator dia [F(1,70) = 247,56; p<0,0001] e para a interação pré-tratamento

vs. tratamento [F(4,70) = 2,98; p<0,02].

As análises subseqüentes indicaram que o pré-tratamento com DPCPX (3,0 e 6,0 mg/kg,

i.p.) ou ZM241385 (0,5 e 1,0 mg/kg, i.p.) não atenuaram a perda da coordenação motora induzida

57

Resultados

pelo et

ura

19.

En

vol

vi

me

nto

dos

rec

ept

mo

/kg, i.p.) ou

ZM241385 (antagonista do receptor A2A, 0,5 ou 1,0 mg/kg, i.p.) 10 antes de receber salina (S) ou

A Figura 20 ilustra a média ± E.P.M. da diferença do tempo de permanência dos animais no

reado com etanol (0,5; 1,0 ou 2,0 g/kg, i.p.) durante o pós-teste (pós-

anol (2,25 g/kg, i.p.) nos animais avaliados no rota-rod no dia 1. Contudo, o pré-tratamento

com DPCPX (3,0 e 6,0 mg/kg, i.p.), mas não com ZM241385 (0,5 e 1,0 mg/kg, i.p.), 10 min antes

da injeção de etanol (2,25 g/kg, i.p.) no dia 1, inibiu a melhora do desempenho motor avaliado no

dia 2 (LSD, p<0.05), sugerindo que o bloqueio dos receptores A1 para adenosina impede o

desenvolvimento de tolerância rápida ao etanol (Figura 19).

Fig Dia 1

ores de adenosina A1 e A2A no desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação

tora induzida pelo etanol em camundongos avaliados no rota-rod. No dia 1, cinco grupos foram

tratados com salina (i.p.) ou DPCPX (antagonista do receptor A1, 3,0 ou 6,0 mg

0

10

20

30

S E

#*

* * ** *

*#*

#

S ES ES ES E SE EE SE EE SE EE SE EE SE EE

Controle 3

DPCPX

6 0,5

ZM241385

1 Controle 3

DPCPX

6 0,5

ZM241385

1 mg/kg

Latê

ncia

(s)

Dia 240

etanol (E, 2,25 g/kg, i.p.), e testados no rota-rod 20 min depois. A tolerância rápida foi avaliada no

dia 2, quando todos os animais receberam uma dose desafio de etanol (2,25 g/kg, i.p.), e foram

novamente testados no rota-rod 20 min depois. O grupo EE recebeu etanol em ambos os dias,

enquanto o grupo SE recebeu salina no dia 1 e etanol no dia 2. Os resultados são representados

como média ± E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 comparado com o respectivo grupo controle

do mesmo dia, #p<0,05 comparado com o desempenho motor do mesmo grupo no dia 1 (teste

LSD).

4.10. Aquisição da preferência condicionada de lugar induzida pelo etanol

compartimento pa

58

Resultados

condici via revelou um

efeito s

onamento) versus o pré-teste (pré-condicionamento). A ANOVA de uma

ignificante para o fator tratamento no tempo gasto no compartimento pareado com etanol

[F(3,28) = 4,07; p<0,02]. As comparações subseqüentes indicaram que o etanol induziu uma

significante preferência condicionada de lugar na dose de 2,0 g/kg (i.p.) quando comparado com o

grupo controle (p<0,01), indicando a propriedade de reforço positivo do etanol nesta dose.

300

400*

a (s

-200

-100

0

100

200

0,5

Etanol

1 2 g/kgControle

Índi

ce d

e pr

efer

ci)

ên

Figura 20. Aquisição da preferência condicionada de lugar quanto ao tempo de permanência no

compartimento pareado com etanol (0,5; 1,0 ou 2,0 g/kg, i.p.) ou salina em camundongos. O índice

de preferência representa a diferença do tempo gasto no compartimento pareado depois (teste) e

ntes (basal) do condicionamento com etanol. Os resultados são representados como média ±

.11. Efeito da cafeína nas fases de aquisição e expressão da preferência condicionada de

lugar induzida pelo etanol em camundongos

a

E.P.M. de 8 animais por grupo. *p<0,05 comparado com o grupo controle (teste de Newman-

Keuls).

4

59

Resultados

O efeito da administração de cafeína na aquisição da preferência condicionada de lugar ao

etanol pode ser visto na Figura 21. A ANOVA de duas vias, sendo as variáveis independentes o pré-

tratame

g/kg) (p=0,09 e p=0,1,

respect

nto (salina ou cafeína 10,0, 20,0 e 30,0 mg/kg) e tratamento (salina ou etanol 2,0 g/kg), e a

variável dependente o tempo de permanência (s) dos animais condicionados no compartimento

pareado com etanol 2,0 g/kg, mostrou somente um efeito significante para o fator tratamento

[F(1,68) = 31,9; p<0,0001], replicando que a administração de etanol (2,0 g/kg,i.p.), durante as

sessões de condicionamento, produz preferência condicionada de lugar.

Mais importante, o pré-tratamento com as maiores doses de cafeína (20,0 e 30,0 mg/kg)

tendeu em atenuar a preferência de lugar induzida pelo etanol (2,0

ivamente). Além disso, a administração per se de cafeína (10,0; 20,0 ou 30,0 mg/kg), não

alterou a preferência dos animais pelo compartimento pareado, indicando que a cafeína, ao menos

nas doses testadas e neste protocolo experimental, não apresenta propriedades reforçadoras (Figura

21).

-200

-100

0

100

200

300

400

**

2 0

Cafeína (mg/kg)

10 20 30

SalinaEtanol 2 g/kg

2 0 2 0 2 0

Salina

Índi

ce d

e pr

efer

ênci

a (s

)

60

Resultados

Figura 21. Efeito da cafeína (10,0; 20,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) na aquisição da preferência

condicionada de lugar ao etanol (2,0 g/kg, i.p.) em camundongos. O índice de preferência

representa a diferença do tempo gasto no compartimento pareado depois (teste) e antes (basal) do

condicionamento com etanol. Os resultados são representados como média ± E.P.M. de 8-12

animais por grupo. *p<0,05 comparado com o respectivo grupo controle (teste de Newman-Keuls).

A Figura 22 ilustra o efeito da administração de cafeína na expressão da preferência

condicionada de lugar ao etanol. A ANOVA de duas vias revelou somente um efeito significante

para o fator tratamento [F(1,52) = 44,25; p<0,0001], indicando preferência condicionada de lugar

induzida pelo etanol (2,0 g/kg, i.p.). No entanto, as comparações subseqüentes demonstraram que a

cafeína (10,0 e 20,0 mg/kg, i.p.) não alterou o tempo de permanência dos animais no compartimento

pareado com etanol, sugerindo, ao menos em parte, que a cafeína não participa da expressão da

preferência de lugar ao etanol.

61

Resultados

-100

0

100

200

300

400

0 0 02

10

22

20

Cafeína (mg/kg)Controle

** *

SalinaEtanol 2 g/kg

Índi

ce d

e pr

efer

ênci

a (s

)

Figura 22. Efeito da cafeína (10,0 ou 20,0 mg/kg, i.p.) na expressão da preferência condicionada de

lugar ao etanol (2,0 g/kg, i.p.) em camundongos. O índice de preferência representa a diferença do

tempo gasto no compartimento pareado depois (teste) e antes (basal) do condicionamento com

etanol. Os resultados são representados como média ± E.P.M. de 8-11 animais por grupo. *p<0,05

comparado com o respectivo grupo controle (teste de Newman-Keuls).

62

Discussão

5. DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez, que os receptores de

adenosina, principalmente os receptores A1, modulam as repostas tipo-ansiolíticas induzidas pela

administração aguda de etanol (1,2 g/kg, i.p.), assim como o efeito tipo-ansiogênico (ressaca)

verificado 18 h após o tratamento sistêmico com uma dose elevada de etanol (4,0 g/kg). Os

presentes resultados evidenciam ainda, que o bloqueio dos receptores A1 para adenosina, mas não

dos receptores A2A, modula importantes neuroadaptações funcionais observadas durante a

exposição repetida ao etanol, como o desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação

motora. Além disso, estes resultados também demonstram que o bloqueio não-seletivo dos

receptores de adenosina, mediado pela cafeína, não altera o reforço positivo induzido pelo etanol.

Como mencionado na Introdução, um número crescente de evidências tem apontado para

uma participação do neuromodulador adenosina como um importante mediador de várias respostas

comportamentais, moleculares e celulares promovidas pelo etanol, tanto em humanos quanto em

roedores. A exposição aguda ao etanol aumenta a concentração extracelular de adenosina (Nagy et

al., 1990; Krauss et al., 1993). Dois principais mecanismos têm sido propostos para explicar este

aumento nos níveis basais de adenosina e, posteriormente, a ativação dos seus receptores após a

administração de etanol.

O primeiro envolve o metabolismo do etanol pelo fígado, que aumenta os níveis plasmáticos

de acetato, que pode atravessar a barreira hemato-encefálica e ser metabolizado formando

adenosina no SNC (Carmichael et al., 1991; Kiselevski et al., 2003). O segundo, envolve o bloqueio

seletivo, mediado diretamente pelo etanol, do transportador responsável pelo transporte passivo de

adenosina (equilibrative nucleotide transporter type 1, ENT1), inibindo desta maneira a recaptação

neuronal de adenosina (Nagy et al., 1990; Krauss et al., 1993; Choi et al., 2004).

63

Discussão

Grande parte dos estudos realizados até o presente momento tem confirmado a crença

popular de que a cafeína, um antagonista não seletivo dos receptores de adenosina, pode bloquear

os efeitos intoxicantes do etanol como, por exemplo, sedação e perda da coordenação motora,

induzidas por doses moderadas e altas de etanol em humanos (Franks et al., 1975; Burns e

Moskowitz, 1990; Fillmore e Vogel-Sprott, 1995; Liguori e Robinson, 2001; Drake et al., 2003).

Em animais de laboratório, estudos têm demonstrado que a cafeína, bem como antagonistas

seletivos dos receptores de adenosina, pode reduzir a perda do reflexo postural (El Yacoubi et al.,

2003), além de inibir a perda da coordenação motora promovida pelo etanol (Dar et al., 1983; Clark

e Dar, 1988; Dar, 1990; Meng e Dar, 1994; Barwick e Dar, 1998; Dar, 2001). Contudo, até o

presente momento nenhum estudo havia investigado a participação deste sistema nas propriedades

ansiolíticas do etanol.

Os resultados do presente estudo demonstram que o efeito tipo-ansiolítico induzido pelo

etanol (1,2 g/kg, i.p.) em camundongos é modulado, ao menos em parte, pela ativação dos

receptores de adenosina A1, uma vez que esta resposta é bloqueada pela administração prévia de

doses “não-ansiogênicas” dos antagonistas, cafeína (antagonista não-seletivo, 10,0 mg/kg, i.p.) e

DPCPX (antagonista seletivo dos receptores A1, 3,0 mg/kg, i.p.), mas não por ZM241385

(antagonista seletivo dos receptores A2A, 1,0 mg/kg, i.p.).

Este efeito não se deve a alterações motoras específicas, uma vez que, o número de entradas

nos braços fechados, parâmetro utilizado como medida indireta de atividade motora, não diferiu dos

demais grupos avaliados. Os presentes dados indicam ainda um aumento de respostas tipo-

ansiolíticas verificadas após a administração de doses “não-ansiolíticas” de CCPA (0,125 mg/kg,

i.p.) e etanol (0,6 mg/kg, i.p.), sugerindo um efeito sinérgico entre a ativação dos receptores A1 e o

etanol.

Além disso, os presentes resultados confirmam e estendem o envolvimento dos receptores

de adenosina em modelos experimentais de ansiedade e emocionalidade, uma vez que mostram a

64

Discussão

existência de respostas tipo-ansiogênicas induzidas pelos antagonistas destes receptores, cafeína

(30,0 mg/kg, i.p.) e DPCPX (6,0 mg/kg, i.p.), em camundongos avaliados no labirinto em cruz

elevado, enquanto o agonista dos receptores de adenosina A1 CCPA (0,25 mg/kg, i.p.) apresenta

um perfil tipo-ansiolítico neste paradigma.

Corroborando com estudos anteriores, que tem demonstrado as propriedades “ansiogênicas”

da cafeína em diferentes modelos animais de ansiedade, como por exemplo, no teste de interação

social (Baldwin et al., 1989; Bhattacharya et al., 1997), no labirinto em cruz elevado (Pellow et al.,

1985; Baldwin et al., 1989; El Yacoubi et al., 2000) e no teste da caixa claro-escuro (Imaizumi et

al., 1994; El Yacoubi et al., 2000), foi verificado que a maior dose de cafeína testada (30,0 mg/kg,

i.p.) reduziu a freqüência de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos de

camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado. Entretanto, estas propriedades ansiogênicas

não foram observadas com a menor dose de cafeína (10,0 mg/kg, i.p.).

De maneira semelhante ao verificado com a cafeína, a administração per se de DPCPX,

antagonista seletivo dos receptores A1, na maior dose testada (6,0 mg/kg, i.p.) exerce um efeito

tipo-ansiogênico nos animais avaliados no labirinto em cruz elevado. Este resultado contrasta com

estudos anteriores, que não verificaram comportamentos relacionados à ansiedade no labirinto em

cruz elevado após o tratamento com DPCPX (Jain et al., 1995; El Yacoubi et al., 2000). Contudo,

nestes estudos a faixa de doses utilizadas de DPCPX (0,05-5,0 mg/kg) pode explicar a discrepância

com os presentes resultados, uma vez que no presente estudo também não foi detectado nenhuma

atividade tipo-ansiolítica do DPCPX na menor dose testada (3,0 mg/kg, i.p.).

Por outro lado, uma série de estudos tem demonstrado que camundongos nocautes (KO) do

receptor de adenosina A1 apresentam elevados níveis de ansiedade (Johansson et al, 2001;

Gimenez-Llort et al, 2002; Lang et al, 2003). Além disso, confirmando o estudo de Florio e

colaboradores (1998), os presentes resultados indicam um efeito tipo-ansiolítico do CCPA (0,25

mg/kg, i.p.), um potente agonista seletivo dos receptores A1.

65

Discussão

Como previamente demonstrado por El Yacoubi e colaboradores (2000), a administração do

antagonista seletivo dos receptores A2A ZM241385 (1,0 ou 3,0 mg/kg, i.p.) não afetou nenhum dos

parâmetros comportamentais que foram registrados no labirinto em cruz elevado, indicando uma

ausência de efeito do ZM241385, ao menos nas doses testadas, neste modelo de ansiedade. Em

conjunto, estes resultados estão de acordo com estudos anteriores (Jain et al., 1995; Florio et al.,

1998; Johansson et al., 2001; Giménez-Llort et al., 2002; Lang et al., 2003) que tem demonstrado o

envolvimento dos receptores para adenosina (principalmente receptores A1) na modulação de

respostas relacionadas à ansiedade em camundongos.

O resultado mais relevante desta etapa do nosso estudo foi que a administração aguda de

doses “não-ansiogênicas” dos antagonistas dos receptores de adenosina, cafeína (10,0 mg/kg, i.p.) e

DPCPX (3,0 mg/kg, i.p.), mas não o ZM241385 (1,0 mg/kg, i.p.), bloqueou as ações tipo-

ansiolíticas do etanol (1,2 g/kg, i.p.) no labirinto em cruz elevado, sugerindo uma interação

funcional entre o sistema adenosinérgico e o etanol em comportamentos relacionados à ansiedade.

Corroborando com nossa hipótese, os presentes resultados mostram uma resposta sinérgica induzida

por doses “não-ansiolíticas” do agonista do receptor A1 CCPA (0,125 mg/kg, i.p.) e o etanol (0,6

g/kg, i.p.), visto que produziram um marcante aumento na freqüência de entradas e no tempo de

permanência nos braços abertos de camundongos avaliados no labirinto em cruz elevado.

O fato dos receptores de adenosina A1 modular as propriedades tipo-ansiolíticas do etanol

sugerem, como hipótese especulativa, que agonistas seletivos dos receptores A1 podem representar

uma importante ferramenta terapêutica para prevenir os efeitos ansiogênicos gerados pela

abstinência ao etanol, reduzindo a recaída em pacientes alcoólicos.

Para nosso conhecimento, somente um estudo havia testado o potencial desta hipótese no

tratamento da ansiedade induzida pela abstinência ao etanol. Gatch e colaboradores (1999)

investigaram o efeito do agonista e do antagonista seletivo dos receptores A1, R-PIA e CPT,

respectivamente, na abstinência induzida pela exposição crônica (7 dias) ao etanol em ratos. Os

66

Discussão

autores encontraram efeitos opostos ao esperado, com uma redução do tempo gasto nos braços

abertos do labirinto em animais tratados com R-PIA, sugerindo um efeito tipo-ansiogênico,

enquanto o antagonista para os receptores A1, o CPT, mostrou um efeito ansiolítico durante a

abstinência ao etanol.

A explicação proposta pelos autores para a inexistência da propriedade tipo-ansiolítica do

agonista do receptor A1 é que o número de receptores para adenosina está marcadamente reduzido

durante a abstinência ao etanol (Dar et al., 1983) e, portanto, poderia não haver receptores

suficientes para produzir um efeito, até mesmo quando todos os receptores estivessem

completamente ocupados. Entretanto, os autores não descartaram a importância de investigações

adicionais para avaliar os efeitos de agentes adenosinérgicos durante a abstinência ao etanol (Gath

et al., 1999).

Neste sentido, outro objetivo proposto no presente trabalho foi investigar o potencial de

agonistas do receptor A1 e A2A em reduzir a ansiedade experimental verificada durante a

abstinência aguda (ressaca) ao etanol (4,0 g/kg, i.p.) em camundongos testados no labirinto em cruz

elevado. Os presentes resultados mostram um desenvolvimento tempo-dependente de

comportamentos tipo-ansiogênicos verificados após a administração aguda de etanol (4,0 g/kg, i.p),

indicado pela significante redução na exploração dos braços abertos do labirinto em cruz elevado.

Esta “ansiedade” induzida pela abstinência aguda ao etanol foi mais pronunciada 18 h após a

administração de etanol, um intervalo de tempo em que o etanol foi completamente depurado do

organismo. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores, que têm demonstrado um

aumento no comportamento tipo-ansiogênico durante a ressaca do etanol em ratos adultos avaliados

em testes de vocalização ultrassônica (Brasser e Spear, 2002), no labirinto em cruz elevado

(Doremus et al, 2003) e no teste de interação social (Varlinskaya e Spear, 2004). Mais importante,

nossos resultados mostram pela primeira vez que a ativação de receptores A1, mas não de

67

Discussão

receptores A2A, reduz o comportamento tipo-ansiogênico observado durante a abstinência aguda ao

etanol em camundongos.

No presente estudo, a administração aguda de doses “não-ansiolíticas” de adenosina (5,0 e

10,0 mg/kg, i.p.) ou do agonista seletivo dos receptores A1 CCPA (0,05 e 0,125 mg/kg, i.p.), mas

não do agonista seletivo dos receptores A2A DPMA (0,1-5,0 mg/kg, i.p.), diminuiu o

comportamento tipo-ansiogênico durante a ressaca do etanol em camundongos, verificado pelo

aumento da exploração dos braços abertos do labirinto em cruz elevado. Esta resposta parece ser

especificamente dependente da ativação dos receptores A1, pois o efeito do CCPA (0,05 mg/kg,

i.p.) no comportamento tipo-ansiogênico induzido pela ressaca do etanol, foi bloqueado pelo pré-

tratamento com o antagonista seletivo dos receptores A1 DPCPX (3,0 mg/kg, i.p.).

Além disso, os efeitos da administração dos agonistas e antagonistas dos receptores de

adenosina, empregados no presente estudo, sobre comportamentos relacionados à ansiedade e

emocionalidade avaliada no labirinto em cruz elevado, parecem não estar, ao menos nas doses

testadas, associados a um comprometimento da função motora dos camundongos, uma vez que não

foram observadas diferenças significativas quanto ao número total de entradas nos braços fechados

do labirinto. Além disso, os parâmetros comportamentais avaliados no campo aberto, número de

cruzamentos e atos de levantar, medidas diretas da atividade locomotora, também não apresentaram

alterações significativas.

Os sinais negativos verificados durante a abstinência ao etanol, como por exemplo, náuseas,

tremores, taquicardia, irritabilidade e ansiedade, são frequentemente verificados nos períodos

iniciais após a exposição, geralmente, prolongada do consumo de etanol, tanto em humanos, como

em roedores (para revisão ver Finn e Crabbe, 1997; Kliethermes, 2005), e representam um

importante fator motivacional para a recaída ao consumo de etanol (Cloninger, 1987). Muitos

estudos têm consistentemente demonstrado um aumento no comportamento tipo-ansiogênico

68

Discussão

durante o período de abstinência após a exposição crônica ao etanol em roedores (File et al, 1991,

1993; Lal et al, 1991; Knapp et al, 1993; Gatch et al, 1999; Gatch e Lal, 2001).

Os presentes resultados replicam e estendem estudos anteriores (Concas et al, 1994; Kaplan

et al, 1999) que têm investigado o potencial de agonistas do receptor A1 em reduzir os sinais de

abstinência após a exposição crônica de etanol. Concas e colaboradores (1994) demonstraram que o

CCPA inibe os sintomas de abstinência, como tremores e convulsões, em ratos tratados

repetidamente com etanol (12,0 – 18,0 g/kg diariamente por 6 dias), um efeito bloqueado pelo

DPCPX. Resultados semelhantes foram relatados por Kaplan e colaboradores (1999) em

camundongos que receberam uma dieta liquida de etanol durante 14 dias, e tratados com o agonista

do receptor A1 R-PIA durante o período de abstinência ao etanol.

Pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares e as regiões anatômicas envolvidas na

modulação dos receptores de adenosina sobre as respostas comportamentais observadas durante a

ressaca do etanol. Em função dos nossos resultados, uma hipótese especulativa pode ser sugerida.

Muitos estudos têm demonstrado que agonistas dos receptores A1 podem inibir a liberação neural

do glutamato (Dolphin e Prestwich, 1985; Fredholm et al, 1989) e da acetilcolina (Jin et al, 1993;

Ribeiro et al, 1996), dois neurotransmissores excitatórios que apresentam um importante papel na

síndrome de abstinência ao etanol (Rossetti e Carboni, 1995; Imperato et al, 1998).

Desta maneira, este mecanismo pode, ao menos em parte, explicar a presente eficácia da

adenosina e CCPA, agonistas dos receptores de adenosina, em reduzir o comportamento tipo-

ansiogênico induzido pelo ressaca do etanol.

Adicionalmente, estudos experimentais de união/ligação específica (binding) têm

demonstrado o envolvimento dos receptores A1 na modulação dos efeitos da abstinência ao etanol.

A abstinência após a exposição crônica de etanol produz um aumento na densidade dos receptores

A1 em regiões cerebelares (Concas et al, 1996) e no córtex cerebral (Daly et al, 1994) de roedores.

69

Discussão

No mesmo sentido, Jarvis e Becker (1998) demonstraram que, após a exposição crônica ao

vapor de etanol, como também, após simples e/ou repetidos episódios de abstinência, ocorre um

aumento na densidade dos receptores A1 em regiões corticais, sem, no entanto, produzir alterações

significativas nos receptores A2A para adenosina no estriado. Juntos, estes resultados indicam que a

expressão aumentada dos receptores A1 para adenosina, um receptor usualmente acoplado a

proteína G inibitória (Gi e Go), parece ter uma importante participação nas alterações adaptativas

observadas durante a abstinência ao etanol.

Além disso, é importante enfatizar que o sistema adenosinérgico parece estar envolvido não

somente na expressão de sinais de abstinência ao etanol, como também de outras drogas de abuso,

como opióides e cocaína. Por exemplo, muitos estudos mostram que agonistas dos receptores A1 e

A2A atenuam, enquanto antagonistas destes receptores potencializam, os sinais de abstinência

induzidos pela morfina em camundongos (Kaplan e Sears, 1996; Zarrindast et al, 1999) e em ratos

(Salem e Hope, 1997).

De acordo com estas considerações, parece que o neuromodulador adenosina é crucial

durante os periodos de abstinência para as diferentes drogas de abuso, uma vez que a ativação de

seus receptores produz um “tonus” inibitório (reduzindo os sinais específicos de abstinência

associados à cada droga), que quando bloqueados, resulta em aumento de comportamentos

característicos de abstinência.

Como já relatado na Introdução, além dos sinais característicos observados na abstinência ao

etanol, a sua ingestão excessiva e prolongada leva a importantes alterações neuroadaptativas em

diversos sistemas neuronais associados com o desenvolvimento de tolerância e sensibilização, além

de alterações residuais que expressam a vulnerabilidade à recaída (Koob, 2003). Estudos realizados

com indivíduos que apresentam histórico familiar de alcoolismo sugerem que existe uma associação

entre a baixa resposta (ou sensibilidade) para os efeitos do etanol e o risco para o desenvolvimento

do alcoolismo (Schuckit, 1994).

70

Discussão

A exposição repetida resulta, freqüentemente, na diminuição da resposta para os efeitos do

etanol no SNC. Esta adaptação, referida como tolerância, é influenciada por fatores genéticos e

ambientais. A tolerância tem ocupado um lugar proeminente na pesquisa do alcoolismo, visto que o

seu desenvolvimento tem sido reconhecido como uma importante característica da dependência, e é

ainda listado como um dos critérios de diagnóstico pelo DSM-IV RT (American Psychiatric

Association – APA, DSM-IV RT, 2000), bem como representa um importante indicador da

suscetibilidade ao alcoolismo (Schuckit, 1986).

Devido às dificuldades inerentes no estudo com humanos, tem-se desenvolvido numerosos

paradigmas para o estudo da tolerância em modelos animais, geralmente testes de coordenação

motora, sedação e hipotermia (Crabbe et al., 1994). Com estes modelos, ao menos três formas de

tolerância tem sido definidas operacionalmente, tolerância aguda, rápida e crônica (Kalant et al.,

1971), e são em grande parte dependentes da quantidade e maneiras de exposição ao etanol, além do

modelo experimental utilizado para mensurar a tolerância (Le, 1990; Khanna et al., 1993).

Dentre estes, o desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol têm sido frequentemente

observado em resposta a uma segunda dose administrada 8-24 h após a primeira exposição ao

etanol (Crabbe et al. 1979; Khanna et al. 1993, 1996; Barbosa e Morato 2001; Da Silva et al., 2001;

Wazlawik e Morato 2003; Varaschin et al., 2005).

Como relatado anteriormente, muitas evidências têm sugerido que os receptores de

adenosina A1, localizados em regiões encefálicas essenciais para o controle motor como, por

exemplo, estriado, cerebelo e córtex motor, são alvos primários na modulação da perda da

coordenação motora induzida pelo etanol (Dar et al., 1983; Clark e Dar, 1988; Dar, 1990; Meng e

Dar, 1994, 1995; Barwick e Dar, 1998; Dar, 2001). A ativação dos receptores A1 para adenosina

potencializa a perda da coordenação induzida pelo etanol, enquanto o bloqueio destes receptores

diminui esta resposta (Mailliard e Diamond, 2004).

71

Discussão

Contudo, poucos estudos têm caracterizado o envolvimento deste sistema nos mecanismos

de tolerância à perda da coordenação motora ao etanol. Desta forma, investigamos a participação

dos receptores A1 e A2A no desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora

ao etanol em camundongos avaliados no rota-rod.

Os presentes resultados sugerem que os receptores de adenosina (principalmente os

receptores A1) modulam esta importante resposta neuroadaptativa, uma vez que a administração

intraperitoneal (i.p.) aguda de cafeína (3,0, 10,0 ou 30,0 mg/kg) ou do antagonista seletivo dos

receptores A1 DPCPX (3,0 ou 6,0 mg/kg, i.p.) 10 min antes da injeção de etanol (2,25 g/kg, i.p.) no

dia 1, bloqueou o desenvolvimento da tolerância rápida à perda da coordenação motora ao etanol

avaliada no dia 2. No entanto, a administração do antagonista seletivo dos receptores A2A

ZM241385 (0,5 ou 1,0 mg/kg, i.p.) não foi efetivo em bloquear esta resposta.

A exposição crônica ao etanol induz alterações neuroadaptativas que resultam tanto na

redução da expressão do transportador (ENT1) responsável pela recaptação de adenosina , quanto

da inibição do ENT1 mediada pelo etanol, sugerindo um mecanismo de down-regulation

compensatório no sistema de adenosina após a exposição repetida de etanol (Nagy et al., 1990). De

acordo com esta hipótese, estudos têm demonstrado que o bloqueio do “tônus” inibitório mediado

pela adenosina, produz animais menos sensíveis aos efeitos agudos do etanol e com elevado

consumo voluntário de etanol (Naassila et al., 2002; Choi et al., 2004). Além disso, estas alterações

estão associadas com uma redução da atividade dos receptores de adenosina A1 no núcleo

accumbens (Choi et al., 2004).

Entretanto, Kiselevski e colaboradores (2003) demonstraram recentemente que o tratamento

crônico (7 dias) com etanol (3,5 g/kg, i.p.) aumentou a concentração extracelular de adenosina no

córtex cerebral, sem alterações em outras regiões encefálicas, como o hipotálamo e estriado de

ratos.

72

Discussão

Por outro lado, é importante mencionar que, ao contrário do observado em trabalhos

anteriores (Dar, 1990; Meng e Dar, 1994, 1995; Barwick e Dar, 1998; Dar, 2001), os antagonistas

de adenosina empregados no presente estudo, não alteraram a perda da coordenação motora

observada após a administração de etanol no dia 1 e, tampouco, o desempenho motor de

camundongos tratados com salina no teste do rota-rod. Estes resultados devem-se, provavelmente,

às diferenças no protocolo experimental (como por exemplo, a velocidade de rotação do rota-rod e o

tempo de exposição dos animais no modelo) utilizado no presente estudo.

Além disso, nossos resultados contrastam com as descrições prévias feitas por Fillmore

(2003), em que a administração combinada de etanol e cafeína aumentou a tolerância ao prejuízo do

desempenho psicomotor induzido pelo etanol. Provavelmente, esta diferença se deve a mudanças

relativas ao protocolo experimental, como por exemplo, forma de administração, dose utilizada,

fatores contextuais, e histórico do uso de outras substâncias psicoativas.

Nossos resultados reforçam trabalhos prévios da literatura (Barbosa e Morato, 2001; Da

Silva e Takahashi, 2001), mostrando que a administração de etanol, na dose de 2,25 g/kg (i.p.),

promove um acentuado prejuízo no desempenho motor de camundongos avaliados no teste do rota-

rod, com recuperação gradual ao longo do tempo. Além disso, comprova o desenvolvimento da

tolerância rápida para a perda da coordenação motora induzida pela repetida administração de

etanol (2,25 g/kg, i.p.) em um curto intervalo de tempo (24 h), visto que foi estatisticamente

significante somente aos 20 e 40 min após a administração repetida de etanol (2,25 g/kg, i.p.) no dia

2, sugerindo que este fenômeno é tempo-dependente, e que fatores farmacocinéticos não são

inteiramente responsáveis por este evento.

Muitos estudos têm mostrado que a tolerância rápida parece envolver principalmente

mecanismos funcionais (relacionados com a farmacodinâmica), do que disposicionais (relacionados

com eventos farmacocinéticos), desde que as concentrações sanguíneas de etanol tanto do grupo

73

Discussão

experimental, quanto do grupo controle, no segundo dia do experimento (dose desafio de etanol)

sejam semelhantes (Khanna et al., 1994).

Confirmando esta hipótese, estudos anteriores (Khanna et al., 1994; Barbosa e Morato 2001;

Zaleski et al. 2001) têm demonstrado que a administração de drogas que foram eficazes em prevenir

o desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol em camundongos, não alterou os níveis

plasmáticos de etanol no dia 2. Neste sentido, a cafeína e o DPCPX parecem influenciar

especificamente o desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol, sem causar outros efeitos per se

que podem interferir com a interpretação destes resultados. Portanto, nossos resultados sugerem que

o desenvolvimento da tolerância rápida para a perda da coordenação motora ao etanol em

camundongos é modulado pela ativação dos receptores A1.

Por outro lado, estudos têm mostrado que estímulos condicionados desempenham um papel

fundamental no desenvolvimento de tolerância ao etanol, sugerindo o envolvimento do aprendizado

nas respostas compensatórias induzidas pelo etanol (Chen, 1968; LeBlanc et al., 1973; Crowell et

al., 1981). A oportunidade de praticar uma tarefa sob o efeito do etanol facilita a tolerância para os

efeitos hipotérmicos (Le et al., 1979), bem como para os efeitos sobre a coordenação motora de

animais (Chen, 1968; Bitrán e Kalant, 1991).

Como descrito na Introdução, o aumento de dopamina no núcleo accumbens, uma

importante estrutura ligada ao sistema de recompensa, na antecipação de consumo ou durante a

exposição ao etanol, sinaliza a presença do reforço, levando o animal a um estado de alerta, onde o

processo associativo de aprendizado e a evocação de comportamentos direcionados à procura do

reforço estariam facilitados (Gonzáles et al., 2004).

Desta maneira, certas condições experimentais, assim como fatores ambientais (não

farmacológicos), apresentam um papel importante no desenvolvimento, não só da tolerância, como

também de outros aspectos que levam à dependência as drogas de abuso (Fillmore e Vogel-Sprott,

1998; Bartholow et al., 2003).

74

Discussão

Segundo a teoria proposta por Robinson e Berridge (1993), a administração repetida de

drogas de abuso induz neuroadaptações no organismo, alterando de maneira duradoura o

funcionamento dos sistemas de recompensa “sensibilizados” à droga e aos estímulos a ela

associados, promovendo comportamentos compulsivos de busca e consumo da droga (Robinson e

Berridge, 1993).

Uma resposta fisiológica condicionada e a sensação de intenso desejo (fissura) podem

ocorrer quando usuários abstinentes encontram sinais preditivos de consumo e disponibilidade pela

droga (Childress et al., 1988). Esta associação “aprendida” entre os sinais ambientais e os efeitos de

reforço (positivos e negativos) gerados por substâncias psicoativas é um importante componente da

dependência em humanos (Vanderschuren e Everitt, 2004).

Estudos buscando demonstrar o envolvimento dos receptores de adenosina nas propriedades

motivacionais de consumo do etanol têm sido conflitantes. Arolfo e colaboradores (2004)

mostraram que o antagonista dos receptores A2A DMPX apresenta um efeito bifásico na

modulação do consumo de etanol: 10,0 e 20,0 mg/kg diminuem, enquanto 1,0 mg/kg aumentam o

consumo de etanol em ratos machos Long Evans, fornecendo a primeira evidência farmacológica

que os receptores A2A podem regular o consumo de etanol em roedores (Arolfo et al., 2004).

No entanto, estudos com camundongos KO do receptor A2A, assim como KO do

transportador responsável pelo transporte passivo de adenosina (equilibrative nucleotide transporter

type 1, ENT1), mostraram que estes animais são menos sensíveis aos efeitos agudos do etanol e

consomem mais etanol comparado com o grupo controle, confirmando a hipótese que a

sensibilidade ao etanol é um bom parâmetro preditivo para o desenvolvimento do alcoolismo

(Naassila et al., 2002; Choi et al., 2004).

Uma técnica que evidencia as propriedades reforçadoras das drogas, independentemente do

comportamento de auto-administração, é a do pareamento dos efeitos da droga com determinado

contexto ambiental que, posteriormente (passado o efeito da droga), será apresentado ao animal em

75

Discussão

situação de escolha (Bozarth, 1991; Tzschentke, 1998; Cunningham et al., 2000). O

condicionamento de lugar é um procedimento Pavloviano comumente utilizado para avaliar os

efeitos de reforço (positivos ou negativos) gerados por substâncias psicoativas (Tzschentke, 1998;

Chester e Cunningham, 2002).

Existe um grande número de evidências mostrando que o etanol, dependendo do protocolo

experimental e doses empregadas, induz preferência condicionada de lugar em diversas linhagens

de camundongos (Cunningham et al., 1991; Crabbe et al., 1992; Cunningham et al., 1992; Boyce-

Rustay e Cunningham, 2004; Bechtholt e Cunningham, 2005; Font et al., 2006). No presente

estudo, foi confirmado que o etanol na dose de 2,0 g/kg, mas não nas doses de 0,5 e 1,0 g/kg,

promoveu uma significante aquisição e expressão da preferência condicionada de lugar, quando

comparado com o grupo controle.

Os resultados do presente estudo mostram ainda que a cafeína (10,0, 20,0 e 30,0 mg/kg, i.p.)

não alterou a aquisição nem a expressão da preferência de lugar ao etanol, sugerindo que o sistema

adenosinérgico, ao menos em parte, apresenta um pequeno papel na modulação dos efeitos

motivacionais do etanol. Estes resultados contrastam com estudos anteriores, que têm demonstrado

que a administração de baixas doses tanto de agonistas quanto de antagonistas dos receptores para

adenosina, incluindo a cafeína, diminuem a expressão da preferência condicionada de lugar

induzida pela cocaína (Poleszak e Malec, 2002), e anfetamina (Poleszak e Malec, 2003), sugerindo

um envolvimento do sistema adenosinérgico nas propriedades reforçadoras e gratificantes de drogas

com potencial de abuso.

A investigação dos efeitos motivacionais da cafeína e de agonistas e antagonistas dos

receptores de adenosina, tem demonstrado que estes compostos apresentam, dependendo da dose e

do protocolo experimental de preferência de lugar utilizado, propriedades tanto de reforço positivo

quanto aversivo em camundongos (Steigerwald et al., 1988; Brockwell et al., 1991; Brockwell e

Beninger, 1996; Zarrindast e Moghadamnia, 1997). Entretanto, no presente estudo, nenhuma das

76

Discussão

doses de cafeína testadas (10,0; 20,0 ou 30,0 mg/kg, i.p.) apresentaram propriedades motivacionais

quando avaliadas no nosso paradigma experimental. Estas discrepâncias nos resultados utilizando

cafeína per se podem ser explicados pelas diferenças nos protocolos experimentais (procedimento

com viés versus sem viés, diferentes sinais contextuais, diferente duração da sessão de

condicionamento, bem como diferentes linhagens de roedores utilizadas).

Todavia, são necessários estudos adicionais com outros agentes seletivos do receptor de

adenosina A2A, ou de outras doses de ZM241385, para descartar completamente o envolvimento

deste subtipo de receptor em comportamentos relacionados à ansiedade, bem como nos mecanismos

de tolerância e nas propriedades motivacionais do etanol.

Embora não tenham sido medidos os níveis sanguíneos ou encefálicos de etanol em animais

tratados com os agonistas e antagonistas dos receptores de adenosina, utilizados no presente estudo,

uma possível interação farmacocinética entre estes compostos e a ressaca do etanol pode ser

descartada, uma vez que estes compostos foram administrados aproximadamente 18 h após a

injeção de etanol (4,0 g/kg, i.p.), tempo em que o etanol já foi completamente eliminado do

organismo. Além disso, estudos anteriores mostraram que camundongos KO dos receptores de

adenosina não apresentam alterações significantes nos níveis sanguíneos de etanol (El Yacoubi et

al., 2001).

Em vista da sua complexidade, o tratamento do alcoolismo, uma doença crônica que envolve

fatores genéticos, psicossociais e ambientais, produzindo diversas e importantes neuroadaptações no

SNC, consistem no conjunto de intervenções psicológicas, sociais e farmacoterapêuticas, que tem

como principal objetivo reduzir a dependência física, o desejo e a recaída ao consumo de etanol.

Até o presente momento, os fármacos utilizados no tratamento e prevenção da dependência ao

etanol são o disulfiram, acamprosato e naltrexona, que embora não sejam eficazes para todos os

dependentes, são medicamentos aprovados nos Estados Unidos e na maioria dos países europeus

(Kiefer e Mann, 2005). Desta maneira, a investigação de novos alvos farmacológicos pode vir a

77

Discussão

originar terapias alternativas para o tratamento e prevenção das diversas alterações promovidas pela

exposição crônica ao etanol.

Em conclusão, os resultados do presente estudo confirmam e estendem o envolvimento dos

receptores de adenosina no controle da ansiedade, e mostram pela primeira vez, que os receptores

A1 modulam importantes aspectos envolvidos no desenvolvimento do alcoolismo, como nas ações

ansiolíticas de seu uso, ansiogênicas verificadas após a retirada do etanol, assim como no processo

de tolerância ao etanol, sem, no entanto, interferir nos efeitos de reforço positivo induzidos pelo

etanol. Em conjunto, estes resultados sugerem o potencial da manipulação farmacológica do sistema

adenosinérgico para atenuar os efeitos do uso do etanol, assim como no tratamento do alcoolismo

(Figura 23).

Ativação dos receptores A1Bloqueio dos receptores A1

Reforço negativo Ansiolítico

R orço positivo efx

Sensibilização

A cia bsxtinênx

Preocupação Expectativa

Figura 23. Diagrama (adaptado de Koob e Le Moal, 1997) ilustrando a participação dos receptores

A1 de adenosina no ciclo da dependência ao etanol. O bloqueio dos receptores A1 inibe o efeito

ansiolítico e a tolerância rápida ao etanol (Amarelo), enquanto que a ativação destes receptores reduz

a ansiedade induzida pela abstinência do etanol (Azul).

78

Conclusões

6. CONCLUSÕES

O efeito tipo-ansiolítico induzido pelo etanol é modulado pelos receptores de

adenosina A1, mas não pelos receptores A2A, indicando uma interação funcional

entre o sistema adenosinérgico e o etanol em comportamentos relacionados à

ansiedade.

Camundongos manifestam um comportamento tipo-ansiogênico, verificado pela

redução da exploração dos braços abertos do labirinto em cruz elevado, 12 e 18 h

após administração aguda de etanol (4 g/kg).

A ativação dos receptores de adenosina A1, mas não A2A, reduz as respostas de

ansiedade observadas durante abstinência (ressaca) do etanol em camundongos

testados no labirinto em cruz elevado.

O desenvolvimento de tolerância rápida à perda da coordenação motora ao etanol é

modulado pelos receptores de adenosina A1, mas não pelos receptores A2A, desde

que esta resposta adaptativa foi bloqueada pela administração aguda de DPCPX, um

antagonista seletivo destes receptores.

O bloqueio não-seletivo dos receptores de adenosina atenuou a aquisição, mas não a

expressão da preferência condicionada de lugar ao etanol.

79

Referências Bibliográficas

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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102

8. ANEXOS

PUBLICAÇÃO DE PARTE DOS RESULTADOS EM PERIÓDICOS

CIENTÍFICOS QUALIS “A”

103

104

“O presente trabalho foi impresso com o apoio da CAPES, entidade do

Governo Brasileiro voltada para a formação de recursos humanos”.