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Joaquim Miguel dos Santos Fonseca

Impacto dos Biorreatores de perfusão na Produção de Biofármacos

Universidade Fernando Pessoa

Faculdade de Ciências da Saúde

Porto 2018

Joaquim Miguel dos Santos Fonseca

Impacto dos Biorreatores de perfusão na Produção de Biofármacos

Trabalho original realizado por:

(Joaquim Miguel dos Santos Fonseca)

Trabalho apresentado à

Universidade Fernando Pessoa

como parte dos requisitos da

obtenção do grau de mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Impacto dos Biorreatores de Perfusão na Produção de Biofármacos

I

Resumo

Os biorreactores têm um papel central na indústria biofarmacêutica, como sistemas

artificiais de crescimento e manutenção das culturas celulares. Este facto motivou

contínuos esforços nos últimos 50 anos com vista ao seu aperfeiçoamento em

termos de desenho e operacionalidade visando a obtenção de unidades processuais

cada vez mais eficientes.

Apesar das configurações batch e fed-batch serem ainda as mais utilizadas pela

indústria apresentam várias limitações como: elevado tempo de inatividade entre

lotes; volumes finitos de cultura; custos mais elevados e análises prévias

exaustivas de microrganismos e células animais para entender os seus requisitos

em relação à sua formulação e produtividade.

Assim gradualmente a indústria biofarmacêutica tem procurado alterar o

paradigma para a produção em modo contínuo em perfusão. A perfusão é o

processo contínuo de alimentação da fermentação, com cultura permanentemente

fresca, enquanto as células ficam retidas em dispositivos de retenção no biorreator.

A colheita em modo contínuo; a remoção contínua dos produtos instáveis; a maior

produtividade de volume; modelos scale-down mais compactos; densidade celular

maior dos produtos; operação de fabrico durante períodos mais longos e a redução

dos custos operacionais são algumas das vantagens que os biorreatores de perfusão

apresentam face aos modelos tradicionais batch e fed-batch.

No momento já existem diversas empresas como a SanofiÓ, MerkÓ e BayerÓ que

já utilizam o bioprocesso de perfusão, nas suas unidades fabris para a produção de

biofármacos.

O presente trabalho, apresenta uma visão do processo biotecnológico que utiliza os

biorreactores em contínuo no modo perfusão procurando antecipar qual irá ser o

seu impacto, na indústria farmacêutica.

Palavras-chave: Biorreatores, Biofármacos, Perfusão, Bioprocesso contínuo


II

Abstract

Bioreactors play a central role in the biopharmaceutical industry, as artificial systems

for growing and maintaining cell cultures. This has led to continuous efforts over the

last 50 years to improve its design and operation in order to obtain more efficient units.

Although batch and fed-batch reactor configurations are still the most used by the

industry, they present several limitations such as: high batch downtime; finite volumes

of culture; higher costs and a thorough pre-analysis of microorganisms and animal cells

in order to understand their requirements in terms of formulation and productivity.

Gradually the biopharmaceutical industry has sought to change the paradigm for

continuous production in perfusion configuration, a continuous fermentation feed

process, with a permanently fresh culture, while the cells are retained in retention

devices in the bioreactor.

Continuous harvesting; the continuous removal of unstable products; higher volume

productivity; more compact scale-down models; higher cell density of the products;

manufacturing operation for longer periods and the reduction of operational costs are

some of the advantages that the perfusion mode presents.

At the moment, there are already several companies such as SanofiÓ, MerkÓ and

BayerÓ that already use the perfusion bioprocess, in their plants for the production of

biopharmaceuticals.

The present work presents a vision of the biotechnological process that uses bioreactors

in continuous mode in perfusion seeking to anticipate what will be its impact in the

pharmaceutical industry.

Keywords: Bioreactors, Biopharmaceuticals, Perfusion, Continuous Bioprocessing


III

Agradecimentos

Ao Professor Doutor Sérgio Barreira, pela disponibilidade, compreensão, simpatia e

apoio prestado, ao longo de todo o meu percurso académico.

À minha mãe, irmãs e Mafalda!

“The past, like the future, is

indefine and exits only as a

spectrum of possibilities”

Stephan Hawking


IV


V

Índice de Conteúdos

Resumo.........................................................................................................I

Abstract........................................................................................................II

Índice de figuras..........................................................................................VI

Índice de tabelas.......................................................................................VIII

Lista abreviaturas........................................................................................IX

Objetivos.......................................................................................................1

Metodologia..................................................................................................1

I. Introdução ............................................................................................................ 2 1.1 Breve perspetiva histórica da indústria biofarmacêutica .......................................... 3

1.2 Biofármacos (Classes; variações, aplicações) ........................................................... 4

1.3 Biossimilares ............................................................................................................ 8

II. Processo de produção de biofármacos .................................................. 11 2.1. Processos de produção em biotecnologia ................................................................ 11

2.2. Esquema do processo e avaliação ............................................................................ 12

2.3. Fabrico do principio ativo ........................................................................................ 13

2.4. Produção de produtos biofamacêuticos ................................................................... 15

2.5 Fatores-chave para avaliação de bioprocessos. ......................................................... 16

2.6. Sistemas de expressão .............................................................................................. 17

2.7. Fermentação ............................................................................................................. 22

2.8. Esterilidade e tecnologia de esterilização ................................................................ 24

2.9. Equipamento e tecnologia ........................................................................................ 25

2.10. Purificação ............................................................................................................. 27

2.11. Tecnologia para separação celular e isolamento do produto ................................. 27

2.12. Concentração e estabilização da proteína alvo ...................................................... 28

2.13. Tecnologia para purificação final .......................................................................... 29

III. Design e tipos de bioprocessos ........................................................................ 31

3.1. Bioprocesso .............................................................................................................. 31

3.2. Tipos de bioprocesso ................................................................................................ 31


VI

3.3. Produção em contínuo de produtos biológicos ........................................................ 34

IV. Bioprocesso contínuo em modo perfusão ..................................................... 37 4.1. História ..................................................................................................................... 38

4.2. O regresso da perfusão ............................................................................................. 39

4.3. Caracterização do bioprocesso de perfusão ............................................................. 40

4.4. Produtividade do processo de perfusão .................................................................... 43

4.5. Dispositivos de retenção celular .............................................................................. 45

4.6. Definição de estado estacionário ............................................................................. 47

4.7. A perfusão ................................................................................................................ 48

4.8. Formatos inovadores de perfusão ............................................................................ 50

4.9. Tipos de biorreatores para culturas em contínuo modo perfusão.............................53

4.10. Estratégias para o desenvolvimento do meio de cultura em perfusão ................... 56

4.11. Requisitos específicos da linhagem celular ........................................................... 58

4.12. Modelos scale-down para processos em perfusão ................................................. 59

4.13. Vantagens do bioprocesso em contínuo em modo perfusão..................................60

4.14. Bioprocessos que já utilizam o modo perfusão ...................................................... 61 4.15. Interpretação dos casos .......................................................................................... 67

V. Conclusão ............................................................................................... 68

Referências Bibliográficas ....................................................................................... 72


VII

Índice de Figuras

Figura 1. Edição de genes................................................................................................3 Figura 2. Diferentes classes de biofármacos ................................................................... .5 Figura 3. Esquema global do bioprocesso.......................................................................12 Figura 4. Sequência de produção de um Biofármaco......................................................13 Figura 5. Biofármaco na forma líquida ........................................................................... 15 Figura 6. Fase final do processo de fabrico de um biofármaco.......................................16 Figura 7. Banco de armazenamento de células para produção de Biofármacos.............18 Figura 8. Exemplo de um sistema de expressão microbiano..........................................19 Figura 9. Merkmillipore CellventoÔ CHO-100 líquido para batch e perfusão..............20 Figura 10. Esquema simplificado que expressa a interação de vários parâmetros do

bioprocesso no ambiente da célula...............................................................22 Figura 11. Gráfico do ciclo de vida celular no processo de fermentação........................23 Figura 12. Desenho típico de um biorreator de agitação no modo batch........................25 Figura 13. Instalação de um scale-up de biorreatores de agitação GE Healthcare Ó.....27 Figura 14. Esquema dos dispositivos de retenção ATF e TFF usados no modo

perfusão........................................................................................................29 Figura 15. Esquema gera da fase downstream................................................................30 Figura 16. Esquema representativo do modo fed-batch; contínuo; híbrido....................32 Figura 17. Configuração do biorreator SartoriusÒ 2000 L em modo contínuo.............34 Figura 18. GE KUBIOÒ fábrica modular para a produção de biofármacos...................39 Figura 19. a) esquema representativo de um modo perfusão com um sistema ATF de

retenção celular acopolado b) RepligenÓ XcellÔ ATF System....................46 Figura 20. Esquema típico de dispositivos de retenção celular acústico (Biosep Acustic

perfusion systemÒ).........................................................................................47 Figura 21. Esquema típico do modo perfusão.................................................................48


VIII

Figura 22. Sistema de cromatografia multicoluna para biorretores bioprocesso modo perfusão(CadenceBioSMB).........................................................................51

Figura 23. Biorreatores GE Healhcare Ó........................................................................53 Figura 24. Biorreator WAVEÒ GE Healhcare Ó...........................................................54 Figura 25. Biorreator icellisÒ.........................................................................................55 Figura 26. Biorreator Hollow Fiber.................................................................................55 Figura 27. Linhagem celular CHO..................................................................................59 Figura 28. Configuração do bioprocesso contínuo em modo perfusão de USP-DSP….63 Figura 29. Imagem 360º do laboratório MerckÓ............................................................64 Figura 30. Biorreatores Mobius Ò 1000L.......................................................................65

Figura 31. Possível abordagem para integração de bioprocessos em contínuo desde USP

a DSP. ............................................................................................................71


IX

Índice de Tabelas

Tabela 1. O Top 10 de vendas mundial de Biofármacos..................................................7 Tabela 2. Biossimilares em pipeline e respetiva empresa produtora................................9 Tabela 3. Características do bioprocesso em modo fed-batch vs perfusão.....................35 Tabela 4. Biofarmácos em comercialização produzidos pelo modo perfusão................36 Tabela 5. Comparação dos rendimentos entre Fed-batch e Perfusão.............................44 Tabela 6. Biorreatores disponíveis no mercado para o bioprocesso contínuo em modo

perfusão...........................................................................................................56 Tabela 7. Interpretação dos casos apresentados..............................................................67


X

Lista de abreviaturas

𝑪𝒑,𝒊–Concentração do produto no instante i

𝑪𝑺𝑷𝑹𝒔𝒕𝒂𝒕- Taxa de perfusão celular específica

𝑪𝑺𝑷𝑹𝒄𝒓𝒊𝒕 - Taxa de perfusão celular crítica

𝑪𝑺𝑷𝑹𝒎𝒊𝒏- Taxa de perfusão celular mínima

𝒒𝒑,𝒊-Produtividade celular no dia i

𝒒𝑺-Taxa de consumo específica de substrato

𝑿𝒎𝒂𝒙- Densidade celular máxima

API – Substância ativa

ATF- Dispositivo de retenção celular

CAPEX - Investimento em capital

𝑪𝑭𝑩-Fed-batch concentrado

CHO - Células dos ovários do Hamster Chinês

BHK - Células dos rins do Hamster bébé

𝑪𝑹𝑫𝒔 - Dispositivos de retenção celular

CSPR - Taxa de retenção celular específiva

Da - Dalton

𝑫𝑯𝑭𝑹-Dihidrofolato redutase

DNA - Ácido desoxirribonucleico

EPO - Fator de crescimento

𝑭-Caudal

FDA - Food and drug administration

FSH - Hormona estimulante do folículo

G-CSF - Fator estimulante de granulócito

GE - General EletricsÓ

IFN - Interferões

IL - Interleucinas

SiRNA - Small infering RNA

GMP - Boas práticas de fabrico

TFF - Filtração de fluxo tagencial

𝑮𝑺-Glutamina sintetase


XI

𝑯 - Volume de colheita

HPV - Papiloma vírus Humano

LC-MS - Cromatografia líquida com espectro de massa

mAbs - Anticorpos monoclonais

MCB - Banco de células central

𝑵𝑮𝑺-Nova geração de sequenciação

NSo - Linha celular de ratos

OPEX - Investimento operacional

𝑷 - Taxa de perfusão

PAT - Tecnologia de monotorização analítica

𝑷𝑪𝑶𝟐-Pressão parcial de dióxido de carbono

QDP - Qualidade por desenho

𝒓-Taxa de reação

𝑹𝑻-Tempo de residência

𝑹𝑻𝒎𝒂𝒙-Tempo máximo de residência

𝑺 - Margem de segurança

STR - Biorreator de tanque agitatado

𝑺𝑻𝒀- Cultura celular no espaço temporal de fermentação

USP - Upstream

DSP - Downstream

HCP - Proteínas hospedeiras

𝑽𝑪𝑫 - Taxa de troca média

𝑽𝑷-Produtividade volumétrica

𝒗𝒗𝒗𝒅- Taxa específica de volume

WCB - Células de trabalho

𝑿 - Densidade celular

𝒀-Rendimento da produção


1

Objectivos Pretende-se com este trabalho descrever o que são biorreatores de perfusão, as suas

vantagens e o impacto que a sua utilização está ter na produção de biofármacos. Serão

também apresentados e analisados exemplos de bioprocessos que já utilizam o modo

perfusão.

Metodologia A metodologia utilizada é a descritiva nível I. Teve por base artigos científicos

pesquisados em vários motores de busca como o Pubmed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), Science Direct

((http://www.sciencedirect.com/), b-on (http://www.b-on.pt/), UpToDate

(http://www.uptodate.com/pt/home), assim como o Google Académico

(http://scholar.google.pt/).

Utilizaram-se como palavras-chave “perfusion bioreactors”, “continuous upstream and

downstream bioprocessing”, “continuous processing in pharmaceutical industry”,

“bioengineering”, “biopharmaceuticals”, “value creation in pharmaceutical industry”,

“proteins into drugs”. Foram ainda consultadas publicações de órgãos oficiais, bem

como livros técnicos especializados na área da biotecnologia farmacêutica.

Com base na pesquisa bibliográfica efetuada elaborou-se este trabalho de revisão.


2

I. Introdução 1.1. Breve perspetiva histórica da indústria biofarmacêutica

Pode dizer-se que foi a descoberta acidental da penicilina por Alexander Fleming

(Fleming, 1929) e a sua posterior produção à escala industrial, juntamente com outros

antibióticos durante a 2ª Guerra Mundial, que constituem o marco fundador da indústria

biofarmacêutica. Desde 1950, mais de 1000 diferentes antibióticos foram isolados e

usados para o tratamento de doenças, crescimento de animais e protecção de plantas

(Newman & Setford, 2006).

Desde os anos 50, o uso de enzimas e posteriormente de anticorpos, iniciou outro campo

importante da biotecnologia, a imunoterapia. O primeiro biossensor de glucose foi

introduzido por Leland C.Clark em 1954, iniciando o conceito de monitorização de

glucose no sangue, que nos dias de hoje está presente num mercado de vários milhares

de milhões de dólares (Newman & Setford , 2006).

No final da segunda metade do séc. XX, a revelação das estruturas proteicas, a

elucidação dos mecanismos de reparação celular e síntese proteica, incluindo o

isolamento das enzimas de replicação do DNA, enzimas de restrição e polimerases,

levou a um rápido desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante (Kohler &

Milstein, 1975).

A tecnologia de DNA recombinante (in vitro), permitiu a clonagem e expressão de

proteínas em vectores bacterianos com grande eficiência (Schimd et al., 2016). Esta

vantagem tecnológica fornece um maior número de proteínas, candidatas a agentes

terapêuticos. Em paralelo desenvolveram-se, através da técnica de hibridoma,

anticorpos monoclonais com locais de ligação específicos a antigénios, facilmente

preparados e purificados em larga escala, (Kohler & Milstein, 1975).

Estes progressos culminaram na produção economicamente viável da chamada insulina

humana recombinante em 1982 (Valonzuela et al., 1982)).


3

Outro exemplo notável da aplicação dos vectores plasmídicos foi a transformação e

produção em massa, de vacinas com o antigénio da Hepatite B, economicamente viável,

chamada insulina humana recombinante. Tecnologia similar, é hoje usada para produzir

a vacina GardasilÒ (HPV) na prevenção do cancro do colon do útero (Zhou et al.,

1991).

Um dos marcos recentes na indústria biofarmacêutica foi a descoberta do método de

edição do genoma CRISPR “Science's 2015 Breakthrough of the Year” (Travis, 2015).

Foi concebido após uma empresa de iogurtes em 2007, identificar um mecanismo de

defesa inesperado que a bactéria usa para combater os vírus.Esta técnica permite criar

genes e poderá a vir ser decisiva para erradicar doenças. Já foi sugerida a edição

deliberada do DNA de embriões humanos (Figura 1) (Condliffe, 2016).

Figura 1. Edição de genes (adaptado https://www.jointhealthmagazine.com/gene-

therapy-arthritis.html)

Presentemente a indústria farmacêutica produz um número diverso de moléculas, desde

fatores de coagulação, hormonas, enzimas, anticorpos monoclonais e vacinas. Devido à

sua complexa estrutura tridimensional, cada processo aplicado à produção tem

configuração específica, resultando em moléculas com propriedades físico-químicas

distintas.


4

1.2. Biofármacos (Classes; variações; aplicações)

As pequenas moléculas de síntese química, conhecidas como os medicamentos

tradicionais, apresentam, normalmente um peso molecular de 500 Da. O seu pequeno

tamanho está diretamente relacionado com a sua atividade biológica, e uma pequena

alteração na sua configuração química, implica, alterações na sua atividade terapêutica,

traduzindo-se na prática, num novo fármaco (Strachen et al., 2013).

As proteínas e péptidos naturais constituem a maior classe de biofármacos. Trata-se,

portanto, de moléculas de peso molecular superior (> 1000 Da) e por norma, apresentam

o mesmo nome comercial, mesmo com pequenas diferenças em 1 ou 2 aminoácido

(Strachen et al., 2013).

Como se referiu acima, a insulina humana recombinante, foi o primeiro biofármaco a

chegar ao mercado em 1982 (Strachen et al., 2013). Ao longo dos anos seguintes, foram

introduzidos outros sistemas biológicos para expressar proteínas recombinantes, fungos,

insectos, plantas e células de mamíferos, criando assim várias classes de biofármacos.

O ritmo de identificação de biomoléculas candidatas a biofármacos aumentou muito e

hoje, com a relativamente baixa taxa de introdução no mercado de moléculas de síntese

química candidatas a medicamentos de referência, as principais empresas da indústria

farmacêutica e novas empresas biotecnológicas, estão cada vez mais a investir no

desenvolvimento de medicamentos biológicos (EFPIA, 2017).

A Food and Drug administation (FDA), aprovou até 2013, 60% de biofármacos, que

foram desenvolvidos para o tratamento de cancros, infeções, doenças inflamatórias e

cardiovasculares (Bioplan Associates, 2012).

Os péptidos, proteínas e ácidos nucleicos são os principais componentes dos

biofármacos agrupados em classes distintas (Chen et al., 2013)


5

Legenda. A) mAb B) IFNs C) Enzima D) Somatropina E) Fator de crescimento celular

F) IL-2 G) Tecido activador do plasminogénio H) Factor de coagulação IX I) G-CSF J)

EPO K) Anticoagulante Hirudin L) Vacina Hepatite B M) Aptâmero. (adaptado

https://www.rcsb.org ).

Figura 2. Diferentes classes de biofármacos

Na classe de medicamentos biológicos à base de proteínas, os anticorpos monoclonais

(mABS), são aqueles que apresentam, em termos de estrutura e farmacocinética, maior

complexidade. São produzidos através de técnicas in vitro, hibridoma, e sistemas

biológicos de expressão em biorreactores. Grande parte desta classe é usada para

tratamento de cancros (RituximabÒ, BencazimabÒ, por exemplo) e doenças autoimunes

(AdalinumabÒ; InfluxinalÒ. GolimunabÒ) Os anticorpos monoclonais constituem a

classe terapêutica de biofármacos em maior expansão. 7 dos 10 biofármacos mais

vendidos em 2015, são anticorpos monoclonais.


6

As enzimas são outro grupo complexo, incluindo moléculas como a glucocerobrosidase,

a-galatosidase e asparaginase, entre outras.

No caso das hormonas, a complexidade estrutural ainda é maior e pode ir desde uma

cadeia polipeptídica simples a proteínas heterodiméricas. A hormona de crescimento

(Somotripona), a hormona folicular (FSH), a insulina, o glucagon, os factores

sanguíneos, compostos por factores de coagulação, como o factor VII e IV, aplicados no

tratamento da hemofília A e B respectivamente são exemplos de biofármacos desta

classe.

As proteínas trombolíticas, o tecido activador do plasminogénio, anticoagulantes, factor

de crescimento (EPO) e (G-CSF), usados no tratamento de doenças cardiovasculares

constituem outra classe. Factores de crescimento de tipos de células não sanguíneas,

também são usadas como moléculas terapêuticas (factor de crescimento endotelial;

proteínas osteogénicas), por exemplo, para regenerar tecido ósseo.

Por último, as citoquinas, importantes moléculas do sinal modelar da resposta imune são

compostas por duas subclasses, os interferões (IFN), como IFN-a; IFN-b; IFN-d,

usados no tratamento da hepatite B e C, esclerose múltipla, e alguns tipos de cancro; e

as interleucinas (ILs); IL-1; IL-2; IL-12”), usadas para activar as células do sistema

imunológico, em especial as células T, no tratamento de doenças autoimunes.

Muitas das proteínas das diferentes classes terapêuticas, são usadas na prevenção de

doenças e assim classificadas como vacinas. Diversas vacinas profiláticas, compostas

por péptidos, DNA, e proteínas recombinantes encontram-se disponíveis no mercado.

Um grupo de biofármacos ainda com menor expressão no mercado, mas cuja

importância está a crescer gradualmente com a evolução e no avanço nos estudos na

área da genómica e medicina personalizada são os ácidos nucleicos; vacinas de DNA;

siRNA; formulações baseadas em oligonucleótidos (Aptâmeros). O desenvolvimento

mais lento desta classe deve-se, eficácia e mecanismo de ação pouco conhecidos e a

questões de ética.


7

Na Tabela 1 apresentam-se os biofármacos mais vendidos na atualidade (Walsh, 2010;

Nelson et al., 2010; Swich et al., 2012; Zhou et al., 2012).

Tabela 1. O Top 10 de vendas mundiais de Biofármacos

Empresa Biofármaco Vendas 2015(M$) Vendas 2016(M$)

AbbVieÓ HumiraÒ $14,012 $16,078

Gilead SciencesÓ HarnoviÒ $13,864 $9,081

Amgen/PfizerÓ EnbrelÒ $8,697 $8,874

Roche/ÓBiogenÓ RituxamÒ $8,354 $8,583 Johnson&JohnsonÓ/Merk

Ó RemicadeÒ $8,760 $7,829

CelgeneÓ RevlimidÒ $5,801 $6,974

RocheÓ AvastinÒ $6,654 $6,752

RocheÓ HeceptinÒ $6,509 $6,751

SanofiÓ LantusÒ $6,054 $6,770

PfizerÓ Prevenar

13Ò $6,245 $5,718

Considerando todas as classes e sub-classes de medicamentos biológicos desenvolvidos

até à data, estes podem ser divididos em diversos tipos de acordo com as modificações

na sua estrutura. Estas modificações aumentam a sua aplicação terapêutica, eficácia,

segurança e precisão do mecanismo de acção. As variações no local activo da molécula,

são consideradas para produzir biofármacos com qualidade, com melhor

farmacocinética, chamados biofármacos de 2ª e 3ª geração (Kohno et al., 2007).

As variações na sua estrutura, em geral, resultam na redução da imunogenicidade,

alterações no perfil farmacocinético, aumento do tempo de semi-vida, ou geração de

novas proteínas (proteínas híbridas), como as proteínas de fusão, compostas por

diferentes cadeias polipeptídicas (EtanesceptÒ), composto por um receptor de citoquina

constituído por uma região com um anticorpo em fusão com o seu carbono terminal

(Kohno et al., 2007).


8

As proteínas terapêuticas como, mAbs, FSA, EPO ou G-CSF, são glicoproteínas. O

perfil de glicolisação, que é, a adição de açúcares de larga cadeia polipeptídica nos

locais de glicosilação, pode influenciar positivamente ou negativamente a molécula

produzida, modificando a sua nomenclatura ou nível de actividade (Kohno et al., 2007).

Novas tecnologias e sistemas terapêuticos, como nanoestruturação, já são utilizados

para aumentar o tempo de semi-vida, conduzir o fármaco pelo corpo. Outra abordagem

é a ligação de proteínas a estruturas farmacológicas já existentes para aumentar a

especificidade e aumentar a atividade biológica e melhorar as propriedades físico-

químicas. (Gebauer et al., 2009).

Com o desenvolvimento tecnológico dos biofármacos, aumenta também a sua

segurança, na prevenção, controlo e cura de doenças como o cancro, artrite reumatóide,

doença de Alzeimer, diabetes, dermatites, doença e Crohn, esclerose múltipla, fibrose

cística, hemofilia, trombose, lepra, lupus e diversas doenças cardíacas.

O tratamento da esclerose múltipla usando o IFN-b recombinante, aumenta a qualidade

de vida de muitos pacientes, reduzindo o numero de recaídas em 30 % dos indivíduos

(Aggernal, 2013). Na artrite reumatoide, a nova bioterapia, reverte a degeneração da

ligação apenas 48h após o início do tratamento. Diversos Biofármacos, já demonstram

actuar seletivamente em células cancerígenas apresentando menos efeitos tóxicos do

que os procedimentos quimioterapêuticos mais comuns. (A.G Roche).

Devido ao seu tamanho e sensibilidade, grande parte dos biofármacos, são

administrados via parentérica, absorvidos em primeiro, pelo sistema linfático. (Reis et

al., 2011; Amgen, 2012).

1.3. Biossimilares

A progressiva expiração de patentes levou à produção de uma segunda geração de

produtos biofarmacêuticos, os chamados biossimilares (Fryklind, et al., 2014). Em

termos gerais, pois pode mudar de país para país de acordo com agência reguladora, um

biossimilar corresponde a um biofármaco que é idêntico ao biofármaco referência

(Tsuruta et al., 2015).


9

Os biossimilares são produzidos através de bioprocessos que apresentam diferenças, nas

linhas celulares ou sistemas de expressão em relação ao bioprocesso do biofármaco de

referência, para produzir maior concentração de produto final com atividade biológica

aumentada (Mellstad et al., 2008).

O grande problema, na produção desta classe é a dificuldade de demonstrar que é um

bioproduto similar ao biofármaco de referência, incluindo, diferenças estruturais e

diferenças no processo de produção. É necessária uma avaliação específica para cada

novo biossimilar (Fryklind et al., 2014).

Tabela 2. Biossimilares em pipiline e a respetiva empresa

Molécula Empresa

G-CSF Teva Pharmaceuticals

G-CSF Mochida/Fuji Pharma

Somatropin JCR Pharmaceuticals

Trastuzumab Celltrion

Infliximab Celltrion

alfa-Follitropin Dong-A Pharmaceuticals

alfa-Follitropin Teva Pharmaceuticals

alfa-Follitropin Finox Biotech

Etanercept Celltrion

Etanercept LG Life Sciences

Etanercept Merk

alfa-Darbepotin Avestagen

Eritropoitina Hospira

Interferão-beta Reliance Life Sciences

Interferão-alfa-2b Amoytop Biotech

Trastuzumab GreenCross


10

Nos últimos anos, a indústria biofarmacêutica tem demonstrado o interesse crescente em

comercializar biossimilares, (Tabela 2) (Wilson & Wood, 2015). Em 2015, 47 novos

biossimilares estavam em fase de estudo clínico (Sackman et al., 2014).


11

II. Processo de produção de biofármacos

2.1. Processo de produção em biotecnologia

Em comparação com a indústria farmacêutica tradicional, de síntese química, as

moléculas produzidas pela indústria biofarmacêutica são singulares por dois aspetos:

são muito grandes e são produzidas em organismos vivos, o que resulta numa

variabilidade notável (Jozala et al.,2016):

• As moléculas de sequências peptídicas podem ter diferentes estruturas

(primárias; secundárias; terciárias; isoformas; locais de glicolisação).

• A mesma molécula interage com diferentes substâncias em locais específicos

com diferentes mecanismos de interação.

• As proteínas são muito sensíveis às perturbações mecânicas e térmicas.

• Os produtos biológicos são difíceis de caracterizar.

A grande dificuldade de caracterização de um fármaco proteico é a principal razão para

a complexidade do seu processo de produção. É virtualmente impossível gerar a

proteína alvo pura devido aos seus subprodutos e impurezas (Valente et al., 2015).

Na purificação, a diferença entre os produtos de interesse e ou produtos indesejáveis,

geralmente é pequena, pois o tamanho e configuração são similares. A escolha dos

métodos de separação aplicáveis é limitada devido à baixa estabilidade química,

diversidade dos pesos moleculares e similaridade e uniformidade dos mecanismos de

interação (Valente et al., 2015).

Assim sendo, o produto que emerge do processo é constituído por uma mistura de

substâncias em que a proteína alvo constitui o ingrediente essencial, mas em que os

restantes componentes são determinados pelo próprio processo (Valente et al., 2015).


12

Um problema adicional que os biofármacos apresentam é a complexidade do produto

em si, constituído por diversas substâncias. Normalmente é impossível de obter uma

análise precisa da mistura formada no final do processo. Se houver desvios

significativos do processo de fabrico estabelecido, a identidade dos subprodutos do

bioprocesso é geralmente impossível de determinar e eles não são detetados pelos

métodos analíticos implementados. Na fase do ensaio clínico, será difícil declarar a

segurança e eficácia destas novas substâncias. A qualidade do produto não pode se

definida sem qualquer dúvida. Em biotecnologia a máxima “o processo determina o

produto” aplica-se (Cohen et al., 2018).

2.2. Esquema do processo e avaliação

São duas as principais áreas do processo, a fermentação (produção da biomolécula

alvo), e a purificação (purificação da biomolécula alvo). A produção da substância ativa

resulta numa substância medicamentosa não formulada, em que a biomolécula está

presente numa solução adequada para armazenamento a longo prazo (Behme, 2015).

Figura 3. Esquema global do bioprocesso

A etapa subsequente é a transformação das substâncias ativas num fármaco (obtenção

da forma farmacêutica segura). Aqui, os aspetos clínicos (tolerância, dose), segurança

(grau de pureza), logística (transporte, armazenamento), e embalagem, têm que ser

considerados (Behme, 2015).


13

Na produção farmacêutica, as áreas de formulação/enchimento e embalagem podem ser

distinguidas. A formulação envolve, normalmente o tamponamento ou liofilização da

forma. Quando é introduzido no recipiente final (ampola, seringa), é criado o produto

final. Enquanto o produto não for rotulado, é considerado semi-acabado. Assim o último

passo do processo de fabrico do biofármaco, engloba a rotulagem e embalamento final

(Behme, 2015).

2.3. Fabrico do princípio ativo

Legenda: I. Inoculação cultura celular II. Fermentação III. Separação celular IV.

Isolamento/Concentração V. Polimento; a) Cultura da linha celular b) Meio de cultura

c) Água d) Água/tampão/géis e) Água/tampão/géis

Figura 4. Sequência da produção de um biofármaco.

O processo de produção inicia-se com a cultivação de células. Uma alíquota contendo

material celular, retirado do banco de células viáveis, é incubado num balão de agitação.

De seguida uma sequência de etapas scale-up, tipicamente diferentes em volume (1:10),

vai gerar uma cultura de inoculação para incubar no fermentador (Brod et al., 2009). As

células são propagadas e a proteína alvo é produzida na etapa de fermentação. Os

nutrientes necessários para o metabolismo celular, são fornecidos através do meio de

cultura. Após a colheita das células do biorreator, o sobrenadante é separado da massa

celular; a separação pode se feita por centrifugação ou filtração (Brod et al., 2009).


14

Se a expressão do produto é intracelular em corpos de inclusão, as células têm que ser

lisadas, para as proteínas alvo serem dissolvidas em meio aquoso. Pode ser necessário

um processo de reformulação que restaurar a estrutura tridimensional e, portanto, a

funcionalidade terapêutica da proteína (Brod et al., 2009).

Após reformulação, a solução existente, contém a biomolécula na forma correta e as

impurezas das etapas precedentes. Estes procedimentos são similares, para produtos de

expressão extracelular após separação da biomassa. Neste caso a biomolécula, não

reside nas células, mas sim no sobrenadante aquoso. O isolamento e concentração

podem ser efetuados por cromatografia de captura ou ultrafiltração; um tampão aquoso

(suplementado com estabilizadores proteicos) é adicionado para condicionar a solução

para subsequente purificação (Borys et al., 2015).

Antes do processo downstream se iniciar, existe frequentemente um processo de

retenção, para desacopolar os processos de fermentação (upstream) e purificação.

Depois do isolamento/concentração, a proteína é obtida em uma solução, livre de

impurezas. Todas estas etapas constituem o upstream do processo (Borys et al., 2015).

A purificação final, downstream, recorre a uma variada gama de cromatografias. O

objetivo desta fase é a remoção de impurezas semelhantes ao produto, como proteínas

hospedeiras (HCPs), formas desnatadas da proteína ou outros subprodutos. O fim da

cadeia de processos é marcado, mais uma vez, por uma ultrafiltração para preparar o

produto para as etapas seguintes (Oien et al, 2017).

É necessária especial atenção ao enchimento dos volumes necessários, pois é uma

operação que exige precauções de esterilização e higiene. No final obtemos uma

proteína dissolvida, mais pura possível, com ótima estabilidade para armazenamento a

longo prazo em condições moderadas. Na forma mais usual de procedimentos

industriais (processo descontínuo), depois da purificação final, é novamente necessária

uma fase de retenção para separar o processo de fabrico da proteína da etapa de fabrico

do biofármaco (Oien et al, 2017).


15

2.4. Produção de produtos biofarmacêuticos

Na produção biofarmacêutica, a solução que contém a proteína alvo é transformada em

um biofármaco apropriado para tratamento terapêutico, fácil de utilizar por médicos e

pacientes. As formas farmacêuticas mais comuns dos biofármacos são forma líquida

(Figura 4) ou liofilizada, como um pó. Para injeção via parentérica, o pó é reconstituído

com água purificada ou uma solução fisiológica (Fischer et al, 2016).

Figura 5. Biofármacos na forma líquida

Na formulação (Figura 6), o tampão de armazenamento, pode ser substituído por um

tampão adequado para a injeção. Se o produto tiver que ser liofilizado, um agente

crioprotector deve ser adicionado ao líquido para evitar a degradação da proteína

durante o processo de congelamento. O ajuste do pH, também é comum. Na composição

subsequente, o líquido é preenchido no recipiente primário, que é muitas vezes um

frasco de vidro; são também utilizados outros tipos de recipientes, como seringas pré-

cheias, campânulas ou cartuchos. O produto é liofilizado se a estabilidade da forma

líquida não estiver garantida (Fischer et al, 2016).


16

Figura 6. Fase final do processo de fabrico de um biofármaco

No último passo, rotulagem e embalagem, o biofármaco recebe o “make-up” específico

de cada país, incluindo as informações relevantes para a segurança, bem como as

embalagens de venda e transporte (Fischer et al, 2016).

2.5. Fatores-chave para avaliação de bioprocessos.

Questões relacionadas com a performance global do processo são frequentemente

avaliadas, sendo os custos e a reprodutibilidade do processo, as principais preocupações.

Quando um conceito de bioprodução é implemantado, o desenvolvimento do processo

tem que delinear metas bem definidas abordando os seguintes fatores (González &

Woodely, 2010):

• Concentração de fermentação: é a concentração de produto que se atinge em

gramas por litro de volume no final da fermentação. Para determinado processo,

esta depende, do tempo, taxa de crescimento celular, densidade celular e a

produtividade celular individual.

• Rendimento global: cada uma das etapas do processo downstream está

associada a uma perda de produto mais ou menos significativa.


17

• Tipo e capacidade do processo: o tipo e a capacidade das etapas do processo

determinam a configuração e tempo necessário. A capacidade individual de cada

etapa indica a frequência com que essa etapa deve ser realizada para o fabrico da

quantidade desejada de produto.

• Tempo do processo: é o principal fator para a avaliação da melhor configuração

e otimização da fábrica de produção.

• Dados analíticos: têm que ser claros e bem tratados, para um controlo e

monotorização contínua de todas as etapas.

• Robustez do processo: um processo consistente tem que ser robusto, isto é, o

produto apresenta qualidade constante dentro dos parâmetros de avaliação, para

ser tecnicamente controlado e validado. A maior tolerância a variações diminui

os riscos de rejeição. Para avaliar a robustez do processo, devem-se observar os

intervalos específicos dos inputs (velocidade de agitação; taxa de fluxo de gás;

intervalos de temperatura; fluxo de volumes) como parâmetros críticos.

• Matérias-primas e instrumentos tecnológicos: as matérias-primas mais

importantes são o meio de cultura e as soluções tampão, géis de cromatografia,

água farmacêutica, e material de embalagem.

• Estabilidade do produto: a estabilidade do produto é a capacidade de manter as

suas propriedades inalteradas, durante um longo período de tempo, em

determinadas condições ambientais. Por norma, os biofármacos tendem a

degradar-se com o tempo e são sensíveis a condições ambientais extremas. A

estabilidade do produto tem impacto significativo, no desenho do processo, bem

como, no transporte e armazenamento.

2.6. Sistemas de expressão

A célula é central no processo biotecnológico. É o “micro reator” no qual o princípio

ativo é produzido. A sua performance, determina o tamanho do processo de fermentação

e o tipo de purificação. A proteína alvo é sintetizada pela célula selecionada a partir da

sua expressão proteica. A totalidade da célula hospedeira e a sua informação genética

modificada são designados o sistema de expressão (Subramanian, 2018).


18

Os sistemas de expressão podem ser classificados como sistemas microbianos, de

mamíferos e transgénicos. As células de insetos, eucariotas, não têm um papel

significativo a produção em grande escala (Subramanian, 2018).

As células que são usadas para inocular o fermentador são armazenadas num banco de

células (Figura 7). O banco de células é o material inicial mais importante de um

processo biotecnológico, sendo necessário, testes, identificação e estabilidade do

conteúdo com frequência (Subramanian, 2018).

Legenda: I. Produção de substrato celular II. Expansão celular III. Alíquota e

congelamento IV. Descongelamento e expansão celular V. Alíquota e congelamento VI.

Descongelamento e expansão VII. Amplificação celular

Figura 7. Banco de armazenamento de células para produção de biofármacos

i. Sistemas de expressão microbianos

Os sistemas de expressão microbiana são constituídos por bactérias (Figura 7)

(Escherichia coli e outras espécies de bacillus), leveduras (Saccharomyces cerevisae,

Pichia pastoris, Hansenula pulymorpha), e fungos (Aspergillus niger). Mas

particularmente a E.coli e a S.cerevisiae (Demain, Vaishnav, 2009).

O código genético para a expressão, o vetor expressão, da proteína alvo pode ser ativo

fora do genoma da célula hospedeira ou integrado no genoma. A forma integrada é a


19

mais estável, pois não se degrada tanto como a forma epissómica. Contudo a

transformação genética da forma epissómica normalmente gera um maior número de

cópias na célula, o que aumenta a performance da síntese (Demain, Vaishnav, 2009).

Figura 8. Exemplo de um sistema de expressão microbiano

O código genético para a expressão, o vetor expressão, da proteína alvo pode ser ativo

fora do genoma da célula hospedeira ou integrado no genoma. A forma integrada é a

mais estável, pois não se degrada tanto como a forma epissómica. Contudo a

transformação genética da forma epissómica normalmente gera um maior número de

cópias na célula, o que aumenta a performance da síntese (Demain, Vaishnav, 2009).

Todos os sistemas de expressão microbianos, são caracterizados por grande robustez e

meio de cultura baratos. Podem ser fermentados até escalas de 100.000 L e atingir

concentrações de 1000 mg𝑙AB.

Legenda: I. Gene humano da insulina II. Plasmídeo bacteriano III. Plasmídeo recombinante IV. Transformação bacteriana V: Purificação da proteína (Insulina recombinante)


20

A grande vantagem destes sistemas é o seu rápido crescimento e fácil manipulação. Por

outro lado, a principal desvantagem é a incapacidade de criar modificações pós-

traducionais, como a glicosilação (Demain, Vaishnav, 2009).

Vários biofármacos já estão presentes no mercado, produzidos através de sistemas de

expressão microbianos, como HumulinÒ, ProtropinÒ,BetaferonÒ, NovolinÒ,

RevascÒ, entre outros.

ii. Sistema de expressão mamíferos

As células dos mamíferos podem-se aproximar do padrão de glicolisação humana, a

expressão de glicoproteínas. Os sistemas mais usados são as células dos ovários do

hamster chinês (CHO) (Figura 8), células do rim do hamster bebé (BHK) e as linhas

celulares de ratos (NSo) para produzir anticorpos monoclonais (Noé et al, 1998).

Figura 9. Merkmillipore CellventoÔ CHO-100 liquído para batch e perfusão

As células dos mamíferos necessitam de um meio de cultura mais complexo comparado

com os sistemas microbianos. Este meio de cultura é constituído por hormonas e fatores

de crescimento, de origem animal (Noé et al, 1998).

Outra diferença importante é o seu maior tempo de duplicação; enquanto que a E.coli

leva 20 minutos para a fissão binária, as células de mamíferos replicam-se em 20-30

horas (Noé et al, 1998).


21

De referir que praticamente todas as linhagens celulares podem ser cultivas, para além,

do produto final apresentar grande densidade celular na cultura suspensa no biorreator e

não depender de nenhuma matriz sólida para o seu crescimento (Noé et al, 1998).

Os sistemas de expressão de células de mamíferos têm expressão extracelular e podem

concentrações de vários mil miligramas por litro. Os valores mais comuns descritos a

partir da produção das linhas celulares, para processos comerciais, no momento não

passam os 2000 𝑚𝑔𝑙AB; os volumes de fermentação podem chegar ao 25000 l. Os

vetores de expressão mamíferos podem ser integrados ou epissómicos (Jianwei, 2012).

Concluindo, as grandes vantagens dos sistemas de expressão mamíferos são a

possibilidade de modificações pós-translacionais essenciais para as funcionalidades da

proteína, as desvantagens incluem a lenta taxa de crescimento e as exigentes condições

das culturas (Jianwei, 2012).

Biofármacos produzidos através das linhas celulares CHO como, EpogenÒ,

RecombinateÒ e anticorpos HerceptinÒ e AvastinÒ e produzidos pelas linhas celulares

BHK, KogenateÒ e NovoSevenÒ, já estão disponíveis para uso humano.

iii. Sistemas transgénicos

Os sistemas transgénicos são animais ou plantas geneticamente modificados. Estes

sistemas, como a planta do tabaco ou o milho, não estão desenvolvidos como os

sistemas microbianos e mamíferos. A sua elevada produtividade leva-os a serem

considerados como competidores dos sistemas mamíferos, mas questões sobre a sua

estabilidade genética e boa práticas de fabrico (GMP) constituem entraves à sua

generalização (Bertolini et al, 2016).

2.7. Fermentação

Na fermentação, as células são cultivadas no biorreator, o fermentador, para produzir a

biomolécula alvo. Quanto o maior número de células disponíveis no volume de


22

fermentação, maior o rendimento do produto. Para atingir os objetivos da fermentação,

devem estar reunidas as seguintes condições (Larroche et al, 2008):

• um ambiente favorável para o crescimento celular, com o objetivo de alcançar

uma grande densidade celular.

• otimizar a expressão com o objetivo de atingir uma grande produtividade

celular.

Em paralelo, a biofarmácia e tecnologia ditam os seguintes requisitos adicionais

(Larroche et al, 2008):

• A gama de subprodutos expressos pelas células deve ser a menor possível. É

conseguido com a criação de condições para uma fermentação homogénea.

• A gama de produtos e subprodutos, relacionadas com o processo, deve ser bem

definida e de fácil separação.

Figura 10. Esquema simplificado que expressa a interação de vários parâmetros do

bioprocesso no ambiente da célula

O rendimento global da fermentação depende da extensão de impurezas. Estas devem

ser eliminadas em etapas de purificação, etapas essas que estão associadas a perdas de

biomolécula alvo (Larroche et al, 2008).


23

A atividade celular (Figura 9), crescimento e metabolismo, depende de vários

parâmetros como, a quantidade de nutrientes, o valor do pH, a temperatura, a densidade

celular, concentração e toxicidade dos produtos celulares e disponibilidade de oxigénio.

As células multiplicam-se por divisão; depois de atingirem o fim do seu ciclo de vida,

morrem, acumulando biomassa no reator (Larroche et al, 2008).

Figura 11: Gráfico do ciclo de vida das células na fermentação

No processo típico (Figura 11), após inoculação do biorreator no ponto zero, as células

necessitam de tempo para se adaptar às novas condições do meio; aqui não se deteta

crescimento. Esta fase de latência, é seguida por uma fase de crescimento exponencial

em que há aumento da biomassa por meio de divisão celular. Depois da fase

exponencial, segue-se a fase estacionária e é caracterizada, por um equilíbrio entre

célula novas e células mortas. Esta limitação no crescimento1 pode se causada por um

consumo excessivo de um nutriente específico ou formação de um subproduto tóxico

(Larroche et al, 2008).

1Num sistema fechado, em batch, o processo termina na fase de morte celular, devido à limitação de substratos.

Fase de Latência

Fase exponencial

Fase estacionária

Morte Celular

Concentração do produto


24

Assim que um número razoável de células é alcançado, uma quantidade de produto

pode ser detetada no volume de fermentação; o pico da fermentação é atingido quando o

número de células é elevado e a taxa de expressão desejada. O declínio da concentração

do produto é geralmente uma consequência da baixa estabilidade da proteína, que pode

perder a sua estrutura tridimensional ou sofrer degradação proteolítica (Larroche et al,

2008).

2.8. Esterilidade e tecnologia de esterilização

É fundamental a esterilização prévia do fermentador. No entanto, a esterilização

completa não é essencial nesta fase, só na purificação é que existe esse estreito controlo.

Quanto mais “aberto” um processo é para o meio ambiente, mais rigorosos são os

requisitos. Por exemplo, a produção do banco de células, é necessário que o processo

seja realizado numa bancada com ar ultra purificado para evitar contaminações. No caso

dos biorreatores, é só suficiente garantir a esterilidade dentro da cuba de fermentação.

De referir que todos os produtos, matérias e superfícies, têm que ser estéreis (Chen et

al., 2015).

Existem três grandes tipos de esterilização em processo biotecnológicos:

• Esterilização por calor

• Filtração esterilizante

• Esterilização por radiações

O método aplicado depende do bioprocesso a ser realizado.

2.9. Equipamento e tecnologia

Tradicionalmente a fermentação é executada em biorreatores de agitação (Figura 12).

Este tipo de reator é ainda o mais usado pela indústria biofarmacêutica, tanto com

sistemas microbianos como mamíferos (Eibl & Loffelholz, 2014).


25

Legenda: a) agente anti espuma e/ou ajuste do pH b) Meio de cultura c) Ligação à

bomba d) Inoculação e) Amostra f) Válvula inferior g) Pressão h) Temperatura i)

Controlo por visualização j) Nível da cultura k) Oxigénio l) Turbidez

Figura 12. Desenho típico de um biorreator de agitação no modo batch

Estes reatores estão disponíveis numa gama de volumes que vai dos poucos litros

(escala laboratorial) até 75000L para produção industrial (Behme, 2015) (Figura 13). A

fermentação inicia-se depois da esterilização do vaso do biorreator com a inoculação do

meio de cultura e caldo celular. O oxigénio é alimentado durante todo o processo por

um sistema arejamento; o ar residual é purgado por um tubo na cabeça do vaso. Uma

porta adicional é necessária para adicionar os agentes espuma e controlar o pH com

adição de hidróxido de sódio ou ácido fosfórico. A proteína final da fermentação é

colhida pela válvula inferior (Behme, 2015).


26

O agitador serve para homogeneizar as condições de fermentação, dispersar bolhas de

gás, melhorar a transferência de calor e o movimento fluido, evitar a agregação de

células e de biomassa nas paredes do tanque. O biorreator é equipado com uma manta

de aquecimento, que pode ser utilizada, também, no modo de refrigeração após a

esterilização para uma fermentação exotérmica (Behme , 2015).

Agentes de limpeza, como o hidróxido de sódio diluído ou água, são introduzidos pela

porta de limpeza e distribuídos pelo tanque através de bolas de pulverização (Behme ,

2015).

Para além da temperatura e pressão, o nível de capacidade, o oxigénio dissolvido e

turvação (como medida da densidade celular), são dados de interesse monitorizados,

que podem ser analisados por uma porta de vidro e/ou acoplados a computadores com

software sofisticados, capazes de realizar medições em tempo real. Uma porta de

amostra é indispensável para rastrear todo o processo de fermentação para a sua

validação e implementação em processos futuros (Behme , 2015).

Todos os processos de fermentação em biorreatores de agitação são compostos pelas

seguintes etapas:

ü Preparação

i) Pré-limpeza

ii) Esterilização

iii) Preparação do meio de cultura

iv) Se necessário: testes de filtragem para o processo de downstream

v) Se necessário: testes de pressão no caso de montagem de outros dispositivos

e controlo de limpeza.

ü Bioprocesso

ü Limpeza do equipamento


27

Figura 13. Instalação de um scale-up de biorretaores de agitação (GE Healthcare Life

Sciences)

Normalmente os processos podem ser realizados paralelamente para melhor otimização

das práticas de fabrico industrial (Clemens et al., 2009)

2.10. Purificação

Na purificação, o processo downstream (Figura 15), podem ser consideradas as

seguintes etapas (Graumnan & Jungbauer, 2012):

• Separação das células: separação das células da colheita

• Isolamento/concentração: redução do volume a ser purificado e facilitar a

separação de impurezas.

• Purificação final: purificação da biomolécula alvo de substâncias difíceis de

separar.


28

2.11. Tecnologias para separação celular e isolamento do produto

Após a colheita do biorreator, efetua-se a separação celular. Esta separação de partículas

sólidas do líquido aquoso é conseguida por filtros, centrífugas ou decantadores. O

processo de filtração pode ser efetuado pelo método clássico como filtrações de fluxo

normal ou alternativamente no modo de fluxo tangencial2 (Coffman et al., 2017).

A centrífugas e decantadores, são mais fáceis de operar do que as unidades com filtros e

são mais vezes utilizados como a primeira etapa para a separação celular. Perdas de

produto durante a separação celular são causadas pela água residual ligada às células

descarregadas que que a proteína está dissolvida. Os rendimentos típicos desta etapa são

na ordem dos 95% a 98% (Clincke et al., 2013).

2.12. Concentração e estabilização da proteína alvo

Nesta fase do processo, obtida uma proteína alvo na sua forma biologicamente ativa

numa solução isenta de impurezas sólidas, duas etapas permanecem por se realizar

(Clincke M. et al., 2013) :

• Estabilização da proteína3

• Redução do volume a ser processado na purificação final para que o

equipamento seja menor e mais económico.

A proteína pode ser estabilizada por inativação4 ou separação das substâncias

desintegrantes. A inativação pelo calor de curta duração, pode ser a alternativa mais

viável, que não afeta o rendimento do processo, mas também pode alterar a estabilidade

da proteína (Clincke M. et al., 2013).

O processo mais eficiente é eliminar as protéases o mais rápido possível. Como também

são proteínas, são relativamente semelhantes à proteína alvo. Podemos conseguir

separar as duas se existirem diferenças moleculares significativas ou na solubilidade em

2Ultrafiltração. 3 Prevenção da degradação da proteína por protéases. 4 implica mais perdas de rendimento em etapas de purificação subsequentes.


29

água. Para o primeiro caso a técnica de adsorção ou cromatografia será o mais indicado,

para o segundo uma extração de 2 fases. Ao mesmo tempo estas operações concentram

o produto (Clincke M. et al., 2013).

Os processos cromatográficos que ligam a proteína alvo e são implementados antes da

concentração da colheita são designados como etapas de captura direta (Clincke M. et

al., 2013).

Figura 14. Esquema dos dispositivos de retenção ATF e TFF usados em modo de

perfusão.

Um dos métodos mais importantes para a concentração e clarificação da colheita celular

é a filtração de fluxo tangencial (TFF), também conhecida como filtração de fluxo

cruzado, utilizando uma membrana filtrante (Figura 14). A filtração de fluxo cruzado

impede a formação de uma camada de impurezas que impede o fluxo transmembranar,

apesar que a formação de uma pequena camada de impurezas à superfície da membrana,

aumenta a eficiência da filtração (Clincke M. et al., 2013).

2.13. Tecnologias para a purificação final

A concentração e isolamento têm como objetivo e remover as sustâncias relacionadas

com o processo de fermentação. No final desta etapa geralmente, é apresentada uma


30

solução que está livre de células e partículas sólidas e tem uma aparência incolor. Esta

solução contém a proteína alvo, bem como impurezas de baixo e alto peso molecular. O

objetivo da purificação final é a remoção dessas impurezas (Morbidelli et al., 2016).

A purificação final é principalmente baseada em princípios de cromatografia, mas a

cristalização, precipitação e processos de membrana também são utilizados (Morbidelli

et al., 2016).

Legenda: I. Centrifugação II. Inativação das Proteases III/IV/V. Cromatografia VI.

Inativação de vírus VII. Nanofiltração VIII. Filtração esterelizante

Figura 15. Esquema geral da fase dowstream

Do polimento resulta a proteína alvo na pureza máxima, biofármaco, para tratamento

dos pacientes, assim, os aspetos de segurança são muito importantes nesta área do

processo. Outra tarefa crucial da purificação final é garantir a pureza biológica do

produto final, antes de ser transferido para a formulação e enchimento estéril

(Morbidelli et al., 2016).

Embora existam caminhos típicos para a purificação de proteínas, há uma grande

variedade de processos downstream (Morbidelli et al., 2016).Os valores típicos do

rendimento global desta etapa variam entre 45% a 80% (Li & Qiu, 2013).


31

III. Design e tipos de bioprocessos 3.1. Bioprocesso

O bioprocesso tecnológico inclui o upstream, biorreator, e processo downstream. Os

biorreatores são o elemento central do bioprocesso seja para a produção de biomassa,

biossíntese de metabolitos, ou biotransformação. Os bioprocessos são influenciados por

vários parâmetros que têm que ser optimizados com vista a desenvolver um processo

económico (Tomaz-Soccol et al., 2016).

O bioprocesso usualmente requer menos energia do que a síntese química tradicional e,

frequentemente, matérias-primas mais baratas; além disso pode ser usado para obter

produtos que não podem ser produzidos pelos métodos baseados em síntese química.

Um processo que é altamente controlado e monitorizado, tem o potencial para produzir

os produtos desejados de forma rápida e consistente com maiores rendimentos; este

rendimento é alcançado se controlarmos e monitorizarmos as principais variáveis e

desenvolvermos estratégias de controlo de gestão (Tomaz-Soccol et al., 2016).

O biorreator mais comum utilizado pela indústria é o de agitação, em que a parte

central, o tanque, contém as células em crescimento no meio de cultura (Figura 12).

Normalmente o biorreator é equipado com uma sonda de pH, regulador da temperatura,

e oxigénio dissolvido e monitorizado por uma sonda e pela taxa de agitação (Tomaz-

Soccol et al., 2016).

No modo de cultura em contínuo o meio de cultura fresco, é adicionado e paralelamente

a cultura é retirada continuamente, enquanto no modo perfusão, o meio de cultura é

adicionado e retirado quando as células são removidas do reator (Larroche et al., 2016).

3.2. Tipos de Bioprocesso

Consoante o tipo de biorreactor usado existem três tipos de fermentação: batch, fed-

batch e fermentação em contínuo.


32

i. Batch

A fermentação em batch decorre num sistema parcialmente fechado, em que as matérias

são carregadas para o biorreator, descontaminadas antes do processo começar, e

removidas no fim. Neste tipo, as condições da operação estão em constante mudança ao

longo do tempo. O único material que é adicionado ou removido durante a fermentação

são os gases (𝑂F; 𝐶𝑂F) e soluções de controlo de pH. Os produtos intracelulares e

extracelulares, são recolhidos no final do processo.

A principal desvantagem do processo em batch é o elevado tempo de inatividade entre

lotes, tempo que inclui, a carga e descarga do biorreator, limpeza, esterilização, e o

recomeço do processo. A otimização do pH e temperatura pode melhorar a

performance, comparando com operações de pH e temperatura constante (Martins &

Souto-Maior, 2003; Cora et al., 2008).

ii. Fed-batch

O bioprocesso diz-se em modo fed-batch (Figura 15), quando um ou mais nutrientes são

alimentados para o biorreator durante a cultura e os produtos da síntese proteica

permanecem no reator até ao final do processamento.

Figura 16. Esquema representativo do modo fed-batch; contínuo em perfusão; híbrido.


33

Uma das vantagens deste método é que a concentração do substrato que alimenta o meio

celular, pode ser mantida nos níveis desejados (Yamane, 1978). A cultura fed-batch

mais simples, é a aquela em que a taxa de alimentação de um substrato limitante é

constante. Este é o processo mais utilizado pela indústria biofarmacêutica, para atingir

células de grande densidade em que as fontes, são alimentadas de forma intermitente ou

contínuo

A operação em fed-batch, é uma estratégia única de regular a concentração de

compostos que são chave, para controlar as taxas de reação o que é uma vantagem

competitiva em relação ao modo em batch.

Existem duas abordagens clássicas para a fermentação em modo fed-batch; volume fixo

e volume variável. No modo volume fixo o substrato limitante é alimentado sem

diluição do volume. O volume de cultura é mantido constante. No modo de volume

variável, este varia de acordo com o tempo de fermentação (Yamane & Shimizu, 1984).

Existem vantagens e desvantagens no modo fed-batch; as vantagens são a produção de

células de grande densidade, devido à extensão do tempo de trabalho; condições

controladas de substrato durante a fermentação; controlo sobre a produção de

subprodutos; repressão catabólica como resultado da limitação de substratos para a

formação de produtos; a substituição de água perdida por evaporação. Existem algumas

limitações, nomeadamente por necessitar de técnicos altamente especializados para

operar o biorreator e uma análise prévia exaustiva de microrganismos e células animais,

para entender os seus requisitos em relação à sua formulação e produtividade.

Existem diversas guidelines para operar no modo fed-batch para produzir diversos

produtos, tais como, aminoácidos, antibióticos, enzimas e biomassa microbial

(Minihane & Brown, 1980).

iii. Bioprocesso em modo contínuo

Na fermentação em contínuo (Figuras 16 e 17), uma ou mais correntes de alimentação

com nutrientes, são alimentadas continuamente ao biorreator e a corrente de efluente


34

que contém, as células, produtos e resíduos é também removida continuamente. A fase

estacionária é mantida, ajustando uma taxa de fluxo volumétrica igual, para as correntes

de alimentação e efluente de colheita.

A produção industrial em modo contínuo está geralmente associada com a utilização

económica em escala de produtos. A transferência de qualquer tecnologia de produção,

de um modo em batch para um em contínuo é sinónimo de maturidade de determinada

indústria. Já se observou na indústria automóvel, com a revolução de Henry Ford nos

anos 20 e 30 do século XX, na indústria petrolífera nos anos 50 e 60, na indústria

alimentar 50-60, e agora, na indústria farmacêutica e biofarmacêutica.

Figura 17. Configuração do biorreator Sartorius 2000 L em modo contínuo

O estabelecimento da parceria de desenvolvimento Novartis /MIT (Instituto tecnológico

de Massachusetts) para a estratégia de produção contínua de princípios ativos de síntese

química (Larroche et al., 2016), resultou numa transferência de conhecimento para a

produção em contínuo de biofármacos (Thomaz-Soccol et al., 2016).

3.3. Produção em contínuo de produtos biológicos

Até recentemente não foi dada atenção especial à produção em contínuo de

biofármacos, apesar da produção de proteínas de origem animal ter já atingindo uma

dimensão de grande escala industrial, em volumes de milhares de litros. No início,

estudos teóricos sobre estruturas de custo foram conduzidos, apontando benefícios em

menor CAPEX e menor OPEX em maiores concentrações (Sinclaire & Brown, 2013).


35

No presente os estudos focam-se na etapa downstream, para produtos de grande volume,

como os mAbs na escala de 1000-2000 kg/ano; outros, procuram chamar especial

atenção ao benefício de produtos de baixo volume como biofármacos de quantidade de

10-100 kg/ano (Sinclaire & Brown, 2013) (Tabela 3).

Tabela 3. Características gerais do bioprocesso em modo fed-batch vs perfusão

Características Fed-batch Contínuo (perfusão)

Tipo de biorreator Uso único ou aço inoxídável Uso único ou aço inoxídável

Escala 2000-20000 L 50-2000 L Densidade celular 5-30 ×10L células/ml 30-120 ×10L células/ml Duração da cultura 12-20 dias 20-60 dias

Concentração do produto 0,5-0,8 g/l 20% de fed-batch

Colheita No final de batch Diário/contínuo Acumulação de resíduos Sim/alta Não/residual

Tempo de residência Durante todo o período da cultura 2-4 dias

Estabilidade do produto Alta Baixa Complexidade Moderada Elevada

Controlo do processo Moderada Elevado

Skills operacionais Moderada Sofisticado Qualidade do porduto Grande Baixa

Risco de contaminação Moderado Moderado

Consumo de meio de cultura Moderado/elevado Muito elevado

Custos operacionais Moderado/elevado Moderado

Capacidade de purificação Baixa Muito elevada

Investimento inicial Elevado Moderado

Riske (2012) refere que na produção de concentrações levadas os maiores custos estão

associados ao processo downstream.

A indústria biofarmacêutica é tradicionalmente conservadora. O investimento em

inovação é mais dedicado ao produto, do que ao processo/tecnologia do processo em si.

Contundo, novos cenários de negócios, criam fortes necessidades de melhoria,

preferencialmente inovações disruptivas (Sinclair & Brown, 2013; Johnson, 2015).


36

Atualmente há cada vez mais produtos no mercado e ainda mais candidatos em ensaios

clínicos, que já estão a ser fermentados em contínuo no modo perfusão (Sinclair &

Brown, 2013; Johnson, 2015) (Tabela 4).

Tabela 4. Biofármacos em comercialização produzidos através do modo perfusão

Biofármaco Indicação clínica Empresa Introdução no

mercado (US) Capacidade do Biorreator (L)

Reopro® Antitrombótico Jassen

Biotech© 1994 500

Remicade® Artrite reumatoide

Jassen Biotech© 1998 500/1000

Simulect® Rejeição de transpantes Novartis© 1998 250

Simponi® Artrite reumatoide

jassen Biotech© 2009 500/1000

Stelara® Doença de Crohn Jassen Biotech© 2009 500

Xigris® Sépsis Eli Lilly© 2001 1500

Rebif® Esclerose múltipla

Merk-Sereno© 1998 75

Kogenate-FS® Hemofilia A Bayer© 2000 200

Fabrazyme® Doença de Fabry Genzyme© 2003 2000


37

IV. Bioprocesso contínuo em modo perfusão

A perfusão designa o processo contínuo de alimentação da fermentação com cultura

permanente fresca, enquanto as células ficam retidas no biorreactor num dispositivo de

retenção. O processo de perfusão consegue ser altamente produtivo, devido à

capacidade de produzir células com grande densidade, com a contínua adição de

nutrientes em simultâneo com a remoção de metabolitos do bioprocesso. Neste modo

conseguem-se atingir valores de densidade até 2×10N células /ml consoante a taxa de

perfusão, linhagem celular e tipo de cultura (Ozturk, 2006; Xie & Zhoiu, 2006).

Os processos de perfusão, controlados por operadores especializados, estão em

funcionamento durante meses e o produto final são proteínas frágeis produzidas em

grande quantidade e reprodutibilidade (Wurm, 2004).

Este modo de produção apresenta, baixos níveis de impurezas, devido há grande

viabilidade celular, a possibilidade de integrar a etapa downstream em contínuo, a

compatibilidade Quality by Design (QdD) e a tecnologia de monitorização analítica

(PAT) (Wurm, 2004).

A produção em contínuo de proteínas em modo de perfusão com integração da

cromatografia já foi aplicada e operou interruptamente durante 30 dias (Warikoo et al.,

2012).

O tempo médio do processo dura em média de 2 semanas até vários meses. Para atingir,

grande densidade celular no estado estacionário, parte das células é removida, para

aumentar a viabilidade e prevenir a acumulação de células-mortas (Deschênes, 2006).

As grandes vantagens do modo de operação em perfusão são:

• Grande volume de produção;

• Qualidade celular no estado estacionário;

• Baixo tempo de residência do produto final no biorreator.


38

Por outro lado, é um processo de complexo a nível de equipamento e controlo e com

elevada taxa de insucesso. Em perfusão existe um grande consumo de cultura, principal

custo associado a esta operação, e o volume de colheita final contém níveis baixos de

produto concentrado, logo é necessário o tratamento deste em downstream (Pollock et

al., 2013).

4.1. História

A primeira produção industrial em perfusão foi descrita nos anos 80 e apresentava,

comparativamente ao processo em batch, maiores níveis de concentração celular e

produtividade (Himmelfarb & Martin, 1969). Nesta época os dispositivos de retenção

mais usados eram os “gravimetric settlers”, com baixas capacidades de retenção celular,

e os filtros de rotação, com baixa viabilidade e dificuldade de scale-up, aumentando os

custos de manutenção, o que levou à interrupção do processo industrial em perfusão

(Woodside et al, 1998). A necessidade de fornecer em contínuo cultura fresca conduz à

necessidade de dispositivos fiáveis para atingir os volumes e densidade, para uma

produção rentável.

Nos anos 90, com a evolução da tecnologia e a disponibilidade de linhas celulares mais

avançadas, o processo de fed-batch já conseguia atingir concentrações de produto na

ordem de 1g/l com menor complexidade técnica e maior facilidade de operação em

biorreatores até 20 𝑚O. O sucesso do bioprocesso em fed-batch desacelerou o

desenvolvimento da tecnologia dos spins filters e outros dispositivos de retenção. A

cultivação fed-batch é o método dominante em upstream das últimas décadas (Langer &

Rader, 2014). Nos últimos 25 anos, o rendimento do volume aumentou 20 vezes nos

processos industriais. As bases para este desenvolvimento, foram o aumento na

qualidade das linhas celulares, sistemas de expressão mais fortes, meios de cultura mais

avançados e específicos e o maior controlo analítico do processo (Wurm, 2004).

Contudo o modo em perfusão continuou a ser utilizado para produzir moléculas como,

fator VIII, interferões e enzimas terapêuticas (Pollock et al, 2013).


39

4.2. O regresso da perfusão

Nos últimos anos verificou-se um regresso aos bioreatores de perfusão. Em comparação

com o processo em fed-batch, a grande viabilidade celular e elevada produtividade em

biorreatores relativamente pequenos em culturas em contínuo ao longo do tempo, são as

principais vantagens (Eibl et al., 2009, 2010).

A tendência em utilizar a tecnologia single-use, com a configuração de perfusão, tem a

vantagem de baixo investimento inicial, custos mais baixos de operação, e permite

maior flexibilidade nos riscos de contaminação, apesar da capacidade máxima de

volume de trabalho estar limitada a 2000 L (Eibl et al., 2009, 2010). No modo de

perfusão, os sistemas single-use relativamente pequenos, atingem concentrações

comparáveis com o modo fed-batch (10-20 𝑚O ) (Pollock et al., 2013).

Figura 18. GEÓ KUBIOÔ fábrica modular para produção de biofármacos

Com a capacidade de produzir biofármacos estáveis e instáveis, combinado com o uso

de sistemas single-use e meios de cultura melhorados (o que permitiu um maior volume

de produção e menor quantidade destes), o modo perfusão está a tornar-se numa

tecnologia válida para a indústria biofarmacêutica, pois consegue, com menor

investimento, integrar unidades de produção mais pequenas e flexíveis com grandes


40

níveis de performance na taxa de crescimento, viabilidade e evitar limitações de

produção (Vijayasankaran et al., 2009; Konstatinov et al., 2006).

4.3. Caracterização do bioprocesso de perfusão

A taxa de perfusão (𝑃), é definida como a taxa fornecimento de meio de cultura ao

biorreator. Para atingir um volume de colheita (𝐻),𝐻 = 𝑃. Normalmente, estas taxas

são expressas por taxas específicas (V meio de cultura/ V do bioreator / dia) (vvd)). Se

for aplicada uma estratégia de purgas do meio de cultura celular, esse volume (𝐵)

também deve ser reabastecido, aumentando a taxa de perfusão 𝑃(𝑑𝑖𝑎AB) em

comparação com a taxa de colheita 𝐻(𝑑𝑖𝑎AB) (Xie & Zhoiu, 2006; Ozturk, 1996).

𝑃 = 𝐵 + 𝐻

Para dispositivos “abertos” de retenção de células (𝐶𝑅𝐷𝑠) com capacidade de retenção

< 100%, a taxa de colheita pode ser dividida matematicamente em colheita livre

células e uma corrente de purga igual à densidade celular no biorreator, o que permite

simular, o desempenho dos 𝐶𝑅𝐷𝑠 “abertos”, utilizando 𝐶𝑅𝐷𝑠"fechados” com uma

linha celular descartável para detetar as possíveis perdas celulares dos sitemas

“abertos”, facilitando assim o processo de transferência de uma tecnologia para a outra

(Xie & Zhoiu, 2006; Ozturk, 1996).

A taxa de perfusão celular específica 𝐶𝑆𝑃𝑅 é um parâmetro importante para descrever

a quantidade de nutrientes por célula num bioprocesso em contínuo e permite, controlar

de forma precisa, as operações em perfusão (Xie & Zhoiu, 2006; Ozturk, 1996). A taxa

de perfusão e a densidade celular viável são necessárias para calcular a 𝐶𝑆𝑃𝑅, como

demonstrado na equação,

𝐶𝑆𝑃𝑅 =𝑃𝑋b

em que 𝐶𝑆𝑃𝑅 = 𝑡𝑎𝑥𝑎𝑑𝑒𝑝𝑒𝑟𝑓𝑢𝑠ã𝑜𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓í𝑐𝑎 (nl/célula/dia), 𝑃 =

𝑡𝑎𝑥𝑎𝑑𝑒𝑝𝑒𝑟𝑓𝑢𝑠ã𝑜(𝑑𝑖𝑎AB), 𝑋 = 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑎𝑑𝑒𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 (10L𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙)


41

A 𝐶𝑆𝑃𝑅 descreve o volume disponível de cultura por célula e dia e é um indicador, da

quantidade de nutriente necessário por célula. A quantidade ótima e mínima de 𝐶𝑆𝑃𝑅,

varia consoante a cultura e linhagem celulares utilizadas, entre 50-500 (nl/célula/dia)

(Konstatinov et al., 2006). O 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs define-se como a taxa de fluxo mínima, de

cultura celular fresca para uma determinada linhagem celular. Uma pequena alteração

no 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs, mesmo temporária, através de um crescimento descontrolado da cultura

ou interrupção do fornecimento de meio de cultura, pode diminuir a taxa de

crescimento, viabilidade, e produtividade específica.

Controlar a 𝐶𝑆𝑃𝑅 a um nível constante (𝐶𝑆𝑃𝑅tuvu), permite concentrações consistentes

de nutrientes com a alteração das densidades celulares, por exemplo, durante a fase

exponencial de crescimento (Ozturk, 1996). A redução da 𝐶𝑆𝑃𝑅, para taxas de perfusão

no limite do𝐶𝑆𝑃𝑅qrs, permite atingir concentrações de produtos similares ao processo

fed-batch, através da redução do caudal, reduzindo o volume médio necessário de meio

de cultura (Konstatinov et al., 2006).

O volume de meio de cultura é referido como a quantidade de nutrientes adicionados e

consumidos durante o processo de perfusão. Um bom aproveitamento do meio de

cultura é indicado por concentrações residuais de nutrientes (i.e, glucose, aminoácidos,

etc.) no sobrenadante no biorreator, e colheita final. Aumentar a eficiência do processo

de perfusão passa por aumentar o aproveitamento do meio de cultura, apesar de ser

necessário, que alguns nutrientes mantenham concentrações mínimas para evitar

respostas celulares limitantes do processo (Adams et al., 2007).

A composição nutricional do meio, condiciona a densidade celular máxima que pode ser

cultivada com determinada taxa de perfusão de meio de cultura recíproca 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs. A

𝐶𝑆𝑃𝑅 mínima pode ser determinada, permitindo às células crescerem a uma taxa de

perfusão absoluta. À medida que a densidade celular aumenta, a 𝐶𝑆𝑃𝑅 irá diminuir até

se atingir a 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs(Konstatinov et al., 2006). O ótimo será sempre aumentar a

composição nutricional do meio e diminuir a 𝐶𝑆𝑃𝑅 para atingir uma densidade celular

constante e utilizar a menor quantidade possível de meio nutritivo, ou aumentar a


42

densidade celular do processo para melhorar a produtividade. Estes valores são

características importantes para comparar vários meios de cultura, no modo de perfusão,

𝑀𝑒𝑑𝑖𝑢𝑚𝑑𝑒𝑝𝑡ℎ = 𝐶𝑆𝑃𝑅𝑚𝑖𝑛AB = 𝑋qvy×𝑃AB,

se 𝐶𝑆𝑃𝑅 = taxa de perfusão celular específica (nl/célula/dia), 𝑃 = taxa de perfusão

(𝑑𝑖𝑎AB), 𝑋 =densidade celular (10L𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙).

Se o estado estacionário for atingido, o processo de perfusão deverá ser configurado

com uma margem de segurança (𝑆), com uma 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs, para facilitar uma taxa de

crescimento ótima, grande viabilidade, e grande especificidade de produção. Este valor

é definido por 𝐶𝑆𝑃𝑅z{ru.

𝐶𝑆𝑃𝑅z{ru = 1 + 𝑆 ×𝐶𝑆𝑃𝑅qrs.

A margem de segurança necessária depende do processo, linhagem celular, composição

do meio de cultura e técnica de execução operacional. Normalmente, se reduzirmos a

margem de segurança a produtividade irá aumentar, assim com a quantidade de meio de

cultura, mas a probabilidade de falha no processo aumenta exponencialmente, por

exemplo, interrupções na perfusão. O aumento da margem de segurança resulta num

processo mais robusto, com maior taxa de fluxo média reduzindo o consumo de meio de

cultura (Adams et al., 2007).

Para determinar a taxa metabólica, o equilíbrio de massa é aplicado, a uma taxa de fluxo

e volume constantes (Adams et al., 2007). A taxa de consumo específico pode ser

determinada a partir da taxa de troca média, 𝑉𝐶𝐷, e a diferença de concentração de

substrato em meio de cultura fresco e no sobrenadante. O sistema de equações

diferenciais que permite calcular a concentração de substrato num processo de perfusão

é:

𝑑𝑐t×𝑉𝑑𝑡 = 𝐹rs×𝑐t,rs − 𝐹��u×𝑐t,��u − 𝑟×𝑉,

𝐹rs = 𝐹��u = 𝐹,


43

𝑃 =𝐹𝑉´,

𝑑𝑐t𝑑𝑡 = 𝑃× 𝑐�,rs − 𝑐�,��u − 𝑟,

𝑟 = 𝑞t×𝑋,

𝑑𝑐t𝑑𝑡 = 𝑃× 𝑐�,rs − 𝑐�,��u − 𝑞t×𝑋,

em que 𝑉 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑑𝑜𝑏𝑖𝑜𝑟𝑒𝑎𝑡𝑜𝑟 (l), 𝐹 = 𝑐𝑎𝑢𝑑𝑎𝑙 (l/dia), 𝑃 = 𝑡𝑎𝑥𝑎𝑑𝑒𝑝𝑒𝑟𝑓𝑢𝑠ã𝑜

(𝑑𝑖𝑎AB), 𝑐t = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜𝑑𝑒𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜(g/l), 𝑟 = 𝑡𝑎𝑥𝑎𝑑𝑒𝑟𝑒𝑎çã𝑜 (g/l/dia), 𝑞� =

𝑡𝑎𝑥𝑎𝑑𝑒𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑒𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜(g/célula/dia),𝑋 =

𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟(10L𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/ dia)

Este sistema é utilizado para determinar o consumo e taxas de produção de substrato,

metabolitos, e produtos em bioreatores de perfusão sem retenção de substratos ou

metabolitos (Adams et al., 2007).

4.4 Produtividade do processo de Perfusão

A maior produtividade do processo em perfusão, em relação ao modo fed-batch, é

reconhecida como a sua grande vantagem. Contudo, devido às constantes diluições do

conteúdo do biorreator, os “tieters” no processo em perfusão, são em média inferiores

comparando com o processo em fed-batch, se o produto não ficar retido no biorreator

(Yang et al., 2016)

A produtividade volumétrica (𝑉𝑃(g/l/dia)) define-se como o rendimento do produto por

volume do biorreator. É calculada a partir da concentração do produto no momento,

multiplicada pela taxa de colheita e descreve a produtividade, em um determinado

momento.

𝑉𝑃r = 𝑐�,r×𝐻r = 𝑋r×𝑞�,r,


44

em que 𝑉𝑃 =Produtividade volumétrica (g/l/dia), 𝑐�,r= concentração de produto no dia

i (g/l), 𝐻 =taxa de colheita de cultura ( 𝑑𝑖𝑎AB), 𝑋 = densidade celular (10L𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 /

𝑚𝑙), 𝑞� = produtividade celular específica (pg/célula/dia) (Yang et al., 2016).

Tabela 5. Comparação dos rendimentos entre Fed-batch e Perfusão

Fed-batch Perfusão

Densidade celular viável 17 60

Densidade total 34 90

Viabilidade 50 70

Concentração do produto 6 1,1

Taxa de troca de meio de cultura 0,05 2

Produtividade volumétrica 0,43 2,2

Ciclos por ano 20 7

Total acumulado(kg) 24 139

O rendimento (𝑌(𝑔)) da produção em upstream, é definido como a massa do produto

acumulado. Em fed-batch, o rendimento é igual à concentração de produto da colheita

multiplicado pelo volume da colheira. No caso de o bioprocesso ser em modo “fed-

batch concentrado”, o produto é retido no biorreator e a colheita é efetuada de modo

similar ao processo fed-batch. Para células de elevada densidade, a biomassa sólida

(volume celular concentrado (%)), é uma fração significativa do volume total de meio

da cultura que é necessário considerar (Yang et al., 2016). Na perfusão, o rendimento

diário é igual à massa acumulada de produto desde o início do processo.

𝑌r = 𝑐�,r×𝐻r,r

�

em que 𝑌 = rendimento (g), 𝑐� =concentração do produto (g/l), 𝐻= taxa de colheita

(𝑑𝑖𝑎AB).


45

O Space time yield (𝑆𝑇𝑌(g/l/dia)) é igual ao rendimento 𝑌 (equação anterior), dividido

pela duração do processo e pelo volume do biorreator. É por vezes confundido com a

produtividade volumétrica, mas é uma definição mais precisa da produtividade geral de

um processo em upstream. A diferença na produtividade entre o processo fed-batch e

processo em perfusão é melhor entendida em termos de 𝑆𝑇𝑌 (Langer & Rader, 2014).

𝑆𝑇𝑌r =𝑌r

𝑉��×(𝑡r − 𝑡�),

em que 𝑌= rendimento (g), 𝑡 = tempo do processo (dias).

Para calcular a produtividade celular (𝑞�,r) pode-se utilizar a seguinte equação,

𝑞�,r = ( 𝑐�,r − 𝑐�,rAB × 𝑡r − 𝑡rAB)AB + 𝑃×𝑐�,r ×𝑋AB,

em que, 𝑞� =produtividade celular específica (pg/célula/dia), 𝑃 =taxa de perfusão

(𝑑𝑖𝑎AB), 𝑐� =concentração de produto (g/l), 𝑋 = densidade celular ( 10Lcélulas /ml) .

De notar que em contraste com o rendimento, 𝑞� tem que ser calculado, com base na

taxa de perfusão 𝑃, e não pela taxa de colheita 𝐻, se aplicada uma estratégia de purga.

Neste caso de acordo com a equação 𝑃 = 𝐵 + 𝐻, 𝑃 é maior que 𝐻, devido à taxa de

purga 𝐵. O produto produzido pelas células, mas perdido pela purga, deve ser

considerado para evitar uma subestimação do valor 𝑞� (Langer & Rader, 2014).

4.5. Dispositivos de retenção celular

Para conseguir-se a perfusão, é necessário anexar ou incluir no biorreator um

dispositivo de retenção celular (CRD) (Figura 19). A seleção deste dispositivo tem

grande impacto, no processo de perfusão, na densidade celular e produtividade. Os

CRDs são classificados como sistemas fechados se existir uma barreira física, por

exemplo, uma membrana de filtração, com 100% de retenção celular, ou sistemas


46

abertos, que permitem que uma fração das células passe pelo sistema deixando o

biorreator (Woodside et al., 1998).

a) b)

Figura 19. a) Esquema representativo de um modo perfusão com um sistema ATF de

retenção celular acoplado; b) RepligenÓXcellÔ ATF System.

Os sistemas fechados permitem densidades celulares mais altas, mas maior acumulação

de células mortas e detritos no biorreator, resultando em menor viabilidade da cultura e

incrustação da membrana, bloqueando o filtro (Kelly et al., 2014). Vários estudos

realizados por Clincke et al. & Karst et al., em sistemas ATF e TFF demonstram o

supramencionado (Clincke, et al, 2013, Karst, et al, 2016).

Em contraste, os dispositivos de retenção abertos podem ser mais fáceis de operar

durante longos ciclos de processo, já que as células mortas e detritos são constantemente

removidos do biorreator (Baptista et al., 2013; Godawat et al., 2012). No entanto, os

parâmetros de CRDs abertos requerem otimização adicional afetando a densidade

celular, e portanto, o volume de produtividade no processo de perfusão, em última

análise, é limitado. A eficiência do dispositivo de retenção tem que ser considerada em

escala e tecnologia adequada para alcançar um desempenho comparável. Por último, a

colheita não estará isenta de células indesejáveis, logo, no processo de downstream é

necessário um passo adicional de remoção de células (Godawat et al., 2012).

Os dispositivos de retenção celular mais relevantes no modo de perfusão são:


47

• Colonizadores de células – cónicos e inclinados

• Centrifugadoras

• Imobilização celular

• Filtros de rotação, internos e externos

• Filtros Hollow Fiber

• Ressonância Acústica (Figura 20)

• Microfiltração

• Filtração tangencial alternada (ATF)

Figura 20. Esquema típico de dispositivo de retenção celular acústico (BioSep Acustic

perfusion systemÒ)

4.6. Definição de estado estacionário (celular)

Os bioprocessos em modo contínuo, oferecem a vantagem de poderem ser operados no

estado estacionário, ou fase estacionária, ou seja, quando não ocorrem alterações nos

parâmetros críticos do processo, enquanto este se mantiver estável. Nos processos de

perfusão com células de mamíferos, a duração do estado estacionário é tipicamente


48

limitada, devido à instabilidade genética dos organismos e limitação operacional dos

dispositivos de retenção celular (Subramamian, 2014).

Para uma fase operacional em estado estacionário, é necessário que todos os inputs e

outputs, bem como, todos os parâmetros do biorreator se mantenham constantes, ao

longo do tempo, como por exemplo, a densidade celular viável, viabilidade,

concentração e qualidade do produto, concentração de metabolitos e nutrientes, pH

(Subramamian, 2014).

Pode ser necessário observar o processo durante vários dias para determinar se o estado

estacionário foi atingido pois alguns nutrientes podem ser consumidos a uma taxa

ligeiramente maior do que a taxa de consumo de nutrientes frescos, de modo que uma

limitação só se tornará evidente, após algum tempo de execução do bioprocesso. Em

resumo, o estado estacionário em perfusão de cultura celular é difícil de atingir, manter

e demonstrar (Subramamian, 2014).

4.7. A Perfusão

O processo em perfusão (Figura 21) pode ser segmentado em diferentes fases

sequenciais: depois da inoculação, as células crescem, tipicamente, de forma

exponencial durante vários dias (fase crescimento exponencial).

Figura 21. Esquema típico do modo perfusão


49

A perfusão é iniciada e a taxa de perfusão aumenta para prevenir a limitação de

nutrientes para o meio e se atingir grande densidade celular. Quando se atinge a VCD

alvo, o processo estabiliza para manter esta VCD até ao período de transição. No

ambiente ideal, resulta na fase estacionário durante vários dias. Durante as várias fases,

as células requerem diferentes concentrações de nutrientes, sendo necessário otimizar a

cultura, de acordo com esta variável (Vijayasankaran et al., 2009).

Um aspeto crítico no desenho do processo em modo perfusão é a estabilidade do

produto. Alguns produtos (e.g, fatores sanguíneos, enzimas terapêuticas e algumas

proteínas de fusão), são propensos a modificações bioquímicas no biorreator, como

cortes enzimáticos, oxidação, desaminação o que afeta negativamente a eficácia

terapêutica dos produtos. Para estes, o tempo de residência no biorreator é um

parâmetro crítico do processo. No passado recente, a perfusão era aplicada a estes

biofármacos, apesar da alternativa do modo fed-batch, pois este modo não permite

controlar o tempo de residência. O tempo máximo de residência 𝑅𝑇qvy, pode ser

determinado experimentalmente, e o processo de perfusão desenhado de acordo com

esses resultados. Se a taxa de perfusão for selecionada para manter 𝑅𝑇 < 𝑅𝑇qvy, a

otimização do meio de cultura e processo, leva à produção de células com maior

densidade celular e/ou uma maior produtividade do processo em geral, mantendo a

qualidade e eficácia do produto (Konstatinov et al., 2006; Trummer et al., 2006).

Um parâmetro que também é importante na implementação de processos de perfusão, e

que está a ser discutido, é se é realmente desejável manter o estado estacionário, durante

longos períodos de tempo. A operação na fase estacionária, requer um controlo ativo da

densidade celular, como por exemplo, rejeitar a parte da cultura celular (purga). Como

esta estratégia, inclui a rejeição de produto, o rendimento geral do processo diminui.

Várias estratégias, para reduzir a taxa de crescimento, podem ser utilizadas; controlar a

quantidade de nutrientes, adicionar inibidores de crescimento, ou redução da

temperatura (Yang, et al, 2016)., para reduzir as perdas de produto por purga. Outros

processos de perfusão, para evitar perdas de produto, são realizados sem purgas,

maximizando a produtividade, em detrimento do estado estacionário. Em geral, como o

processo é altamente dinâmico, não se consegue atingir o estado estacionário. Por

exemplo, se a taxa de colheita se mantiver constante e as células com um crescimento

sem restrições, o 𝐶𝑆𝑃𝑅 mudará constantemente (Chuppa et al., 1997; Fox et al., 2003).


50

Importante referir, que a introdução de limitações, na concentração de nutrientes e

alteração da temperatura, pode alterar o metabolismo celular (Du et al., 2015). Na

produção de mAb em modo batch, foram testadas temperaturas entre 28 e 37º C em

células de hibridoma (Reuveny et al., 1986). A 31ºC, foi visível, maior viabilidade

celular e menor índice de absorção de glucose. Outros resultados mostraram uma

influência positiva com a redução da temperatura para 33ºC, na densidade celular e

absorção de glucose (Sureshkumar & Murtharasan, 1991). A taxa específica de

produção manteve-se constante no intervalo de 34 a 39ºC (Bloemkolk et al., 1992).

Com células CHO foi demonstrado que a diminuição da temperatura de 37 para 34ºC,

não influenciou a densidade celular ou a viabilidade celular, mas sim a taxa de

crescimento. Ainda se verificou que o intervalo de temperaturas utilizado não

influenciou a taxa de produção de mAb.

A aplicação destes resultados no modo perfusão pode resultar em taxas de perfusão

mais baixas e por consequência, diminuição do meio de cultura e volumes a serem

tratados no processo em downstream. Outra vantagem de temperaturas de fermentação

mais baixas, é a menor taxa de consumo de 𝑂F, que pode limitar em larga-escala o

processo de produção (Ozturk et al., 1996). Para concluir, o processo de controlo da

temperatura, pode ter grande impacto no metabolismo celular e, como consequência,

controlar as necessidades dos meios de cultura, que precisam ser considerados, durante

o processo e desenvolvimento do meio de cultura. Se as taxas metabólicas são

determinadas, com o objetivo de otimizar o consumo de nutrientes, as temperaturas alvo

devem ser aplicadas para garantir que a absorção seja a adequada.

A absorção de nutrientes e a taxa de produção de metabolitos também se alteram, com a

𝐶𝑆𝑃𝑅, como já referido (𝐶𝑆𝑃𝑅qrs < 𝐶𝑆𝑃𝑅z{ru). Em contraste, em processos sem

rejeição de células, o crescimento celular irá parar automaticamente quando, 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs

e𝑋qvy forem atingidos, indicativo de aproveitamento completo do meio de cultura

disponível. Um processo dinâmico, como o apresentado, permite um controlo

simplificado e uma diminuição do tempo para a produção de células com maior

densidade e utilização mais económica de meio de cultura.


51

4.8 Formatos inovadores de perfusão

O processo escolhido para produzir produtos instáveis é o modo de perfusão. Contudo,

existem exemplos de moléculas estáveis produzidas através do bioprocesso em perfusão

como os mAb (Pollock et al., 2013) estando-se a avaliar outras aplicações inovadoras de

processos de perfusão. Se é possível produzir moléculas estáveis e instáveis, através de

processos de perfusão, esta técnica pode ser aplicada a uma plataforma única upstream,

para diferentes produtos biofarmacêuticos em instalações flexíveis (Figura 18) de

produção de multiprodutos (Gottschalk, et al., 2013).

O caminho do desenvolvimento é a intensificação do uso da perfusão. Com o aumento

dos custos para a indústria biofarmacêutica, a perfusão torna-se fundamental devido aos

possíveis ganhos de produtividade em relação aos processos fed-batch standard. O

tamanho dos biorreatores necessários podem ser reduzidos, permitindo menores

investimentos em instalações. A menor escala dos biorreatores, também permite o uso

de biorreatores descartáveis, que no presente, são limitados em termos de volume

(Pollock et al., 2013; Eibl et al., 2010). Num formato chamado “fed-batch

concentrado” (CFB) usam-se biorreatores anexados a um sistema ATF, equipado para a

nanofiltração, para não apenas reter células no biorreator, mas também o produto

(Zijlstra et al., 2013). Neste esquema, todo o meio de cultura gasto pode ser descartado,

pois não contém nenhum produto, o que simplifica o processo de recolha da colheita de

perfusão em dowstream.

Figura 22. Sistema de cromatografia multicoluna para biorreatores em processos no

modo perfusão (CadenceÔ BioSMB)


52

Não se deverá proceder à purga devido à alta concentração do produto no reator, a fase

estado estacionário não é atingida assim, a qualidade do produto é caracterizada em

função do tempo do processo ou no final do processo. Aqui a colheita e a purificação

são realizadas em modo batch. Foi relatado que o rendimento global destes processos é

reduzido por uma grande fração de sólidos no biorreator, bem como uma menor

produtividade específica, em comparação com o modo tradicional fed-batch, que será a

causa de uma diminuição do 𝐶𝑆𝑃𝑅 equivalente (Yang et al., 2016).

Em contraste é necessário atingir a fase estacionária, para implementar um processo

contínuo em perfusão para a produção de biofármacos, uma cadeia interrupta de

produção em upstream à purificação em dowstream utilizou um ATF no modo de

microfiltração, com acoplamento direto da perfusão em estado estacionário, para a

produção de anticorpos, bem como enzimas terapêuticas, a uma cromatografia de

afinidade semicontínua com várias colunas (Warikoo et al., 2012).

Uma das vantagens de uma longa duração do processo em perfusão é que podem

melhorar a taxa de utilização de uma fábrica de produção, pois serão menores os tempos

de paragem para a limpeza e preparação dos biorreatores. Neste exemplo, o processo

integrado em contínuo operou de forma autónoma durante várias semanas em fase

estacionária da cultura. (Yang, 2016).

Para além da aplicação da perfusão na fase de produção, já pode ser aplicada no

“inoculation train”, que normalmente é realizada em modo batch, numa série de

biorreatores de escala crescente. Neste processo, as células têm que se manter na fase

exponencial. Para evitar limitação nos nutrientes, a densidade celular é muito baixa. Ao

utilizar a perfusão, podemos atingir densidades celulares muito maiores sem limitação

de nutrientes, o que permite diminuir várias fases de expansão e aumentar a

flexibilidade de produção (Yang et al., 2014). As células também podem ser retiradas

do biorretor em perfusão e congeladas (Seth et al., 2013). Ao retirar o descongelamento

e as etapas de expansão do passo de produção, pode-se aumentar consideravelmente a

flexibilidade de uma unidade de produção biofarmacêutica.


53

4.9. Tipos de biorreatores para culturas em contínuo modo perfusão

i. Biorreatores de suspensão de tanque agitado

Os biorretores agitados mecanicamente (STR) (Figura 23), contendo culturas suspensas

ou dependentes de ancoragem no microportador, são a primeira escolha da indústria

biofarmacêutica. São os sistemas mais aceites, para culturas suspensas, pois permitem

uma operação simples e de fácil scale-up (Vijayasankaran et al., 2009).

Figura 23. GE Healthcare Biorreator

ii. Biorreatores de filtro fixo/flutuante

Os biorretores pré-esterilizados de uso único, de ação de onda ou balanço, de diferentes

fabricantes, fornecem uma solução capaz para operar em modo perfusão (Figura 24).

Neste caso, o movimento balanço dos sacos descartáveis, fornece a transferência de

oxigénio necessário para as células em cultura. Utiliza um filtro flutuante inovador, que

é mantido limpo e desobstruído pelo movimento de onda (Vijayasankaran et al., 2009).


54

Figura 24. WAVEÒ Bioreactor GE Healthcare Life SciencesÓ

iii. Biorreatores Packed Bed

Biorreatores do tipo Packed Bed (Figura 25) conseguem o aprisionamento de um tipo de

cultura, que pode manter uma variedade de células por longos períodos de tempo.

Nestes biorreatores a ruptura é baixa devido à imobilização das células em matriz

macroporosa (Vijayasankaran et al., 2009).

Figura 25. Biorreator icellisÒ 500 L


55

iv. Biorreatores em modo perfusão Hollow Fiber

Os Biorretores Hollow Fiber em modo perfusão permitem culturas de grande densidade

celular (Figura 26). As células, geralmente, são semeadas dentro de um cartucho, mas

fora das fibras ocas, no espaço extra capilar. Nesta configuração, o meio de cultura

fresco é bombeado através das fibras ocas, o que permite um direcionamento dos

produtos (Vijayasankaran et al., 2009).

Figura 26. Biorreator Hollow Fiber Cell LabÓ

Na Tabela 6 apresentam-se alguns biorreatores de perfusão disponíveis no mercado.


56

Tabela 6. Biorreatores disponíveis no mercado para o bioprocesso contínuo em modo perfusão.

Nome do biorreator Volume (L) Tipo de recipiente Mistura Fabricante

Wave 1-500 Pillow Rocking GE Helthcare

Biostat Cultibag RM 1-100 Pillow Rocking

Sartorius Stedium Biotech

XRS-20 2-20 Pillow Two-dimensional Rocking

Pall Life Sciences

Applifex 1-25 Pillow Stirrer Aplikon Biotech

Cell tainer® 0,2-35 / 5-275 Pillow ou square Stirrer Celltainer

Biotech

Hyclone™ 30-2000 Tankliner Stirrer Thermo Fisher

Hyperforma SUF 30/300 Tankliner Stirrer Thermo

Fisher

Biostat Cultibag STR 50-1000 Tankliner Stirrer

Sartorius Stedium Biotech

XDR™ 10-2000 Tankliner Stirrer GE Helthcare

XDR-50 MO 50 Tankliner Stirrer GE Helthcare Mobius

Cellready 50-2000 Tankliner Stirrer Merk-Millipore

Allegro™ 20-200 Tankliner Stirrer Pall Life Sciences

Nucleo™ 50-1000 Tankliner Paddle Pall Life Sciences

SBX 10-200 Tankliner Orbital shaker Kuhner

4.10. Estratégias para o desenvolvimento do meio de cultura em perfusão.

A já descrita heterogeneidade do bioprocesso em perfusão, indica que a formulação do

meio de cultura adequado aos diferentes tipos do mesmo processo é um desafio. Assim,

geralmente, os resultados ótimos são alcançados através de formulações personalizadas

e tendo em conta a linhagem celular, oferecidas por especialistas em meios de cultura.

Em alternativa, meios de cultura em plataformas de base de dados ou comercialmente

disponíveis, podem ser candidatas a serem utlizadas (Vijayasankaran et al., 2009).

Vários exemplos demonstram que o meio de cultura desenhado para o modo batch, que

normalmente apresenta, grandes concentrações de nutrientes, podem ser aplicados no


57

modo perfusão (Clutterbuck, 2015; Cunningham, 2014). Uma vez desenhada a

formulação inicial para determinada linhagem celular e o processo pretendido

identificado, várias vias para o desenvolvimento e otimização podem ser seguidas.

Vários métodos para melhorar o meio de cultura celular, estão a ser baseados em

estudos do metabolismo celular (Vijayasankaran et al., 2009). Geralmente, uma análise

à quantidade gasta de meio de cultura, dependendo da capacidade analítica do consumo

de vários nutrientes, bem como o estudo da produção de metabolitos. Estes dados, são

utilizados para eliminar limitações celulares, ao nível de um único componente. Uma

análise transcriptoma, pode ser utilizada em células CHO (Hammond et al., 2011;

Jayapal & Goudar, 2014; Kim, 2012). Este método simula as condições experimentais

numa amostra de células. Aplicou com sucesso uma nova geração de sequenciação

(NGS) para caracterizar a transcriptimo de células CHO de grande e pequena produção

(Shaub et al., 2010). Este desenvolvimento, permite aumentar os títulos através uma

concentração suplementar do(s) componente(s) limitantes do meio de cultura. A

transcriptômica que usa microarrys CHO foi validada com sucesso num scale-up de um

processo em perfusão (Jayapal & Goudar, 2014) e o estudo da resposta ao stress das

células CHO aplicado um desarranjo hidrodinâmico (Sieck et al., 2014). Estes métodos

têm grande potencial ao nível do comportamento celular e a um nível holístico. No

entanto, o design experimental requer muitos outros aspetos que podem causar

variações, e os resultados obtidos precisam de ser avaliados cuidadosamente, para

identificar as respostas específicas das condições experimentais (Polizzi & Kontoravdi,

2015). Para além de melhorar a composição do meio de cultura, estes métodos também

podem se aplicados em avanços nas linhagens celulares (Le et al., 2015).

As experiências empíricas, podem ser mais robustas, se se aplicar uma análise

multivariável e design experimental, reduzindo drasticamente o número de repetições

para monitorizar vários parâmetros, por exemplo, com os componentes e as suas

respetivas concentrações, diminuindo os custos associados (Rouiller et al., 2013). Para

esta abordagem. São necessários sistemas de alto rendimento com software para o

projeto e avaliação de resultados. Por outro lado, atinge-se parâmetros robustos e

viáveis, com a simples análise da viabilidade da densidade celular e produtividade.


58

A limitação mais comum do desenvolvimento de um meio de cultura, a ser utilizado

num bioprocesso em perfusão, é definir a taxa de consumo de substrato de uma

determinada linha celular para um novo meio de cultura, pois mesmo se conhecermos o

limite de um substrato para um determinado meio e linhagem celular, devido às

diferenças entre linhagens celulares e variações de clone para clone, o substrato vai

variar de célula para célula. Uma estratégia para ultrapassar esta limitação é a

introdução deliberada de um substrato à priori, limitado no meio de cultura. Ideal, será

um nutriente que possa ser medido de forma rápida e fácil, exemplo da glutamina ou

glucose. Se o nutriente limitante atingir concentrações baixas, a taxa de perfusão

aumentará, para evitar outras limitações (Jordan et al., 2013). Nos modelos scale-down,

é mais simples, pois é mais fácil controlar as limitações do meio de cultura, podem ser

implementados sem depender da escala do biorreator.

4.11. Requisitos específicos da linhagem celular

A primeira linha celular do ovário do hamster Chinês (CHO) foi isolada a partir do

Criscetulus griseus por Theodore T. Puck no final dos anos 50 (Tijo & Puck, 1958).

Nos anos 60, a linha celular CHO foi alvo de infeções virais e mutagéneses e no

processo várias adaptações nas linhagens celulares foram criadas. Em 1963, a linha

celular CHO-K1 dependente e prolina foi derivada do original (Rapp e Hsu, 1965,

Waubke et al., 1968). A linha celular CHO pode crescer em suspensão, é fácil de

manipular em scale-up e biorreatores em modo contínuo e pode crescer em ambientes

quimicamente bem definidos sem suplementos como proteínas.

Em 1987, o ativador do tecido plasminogénio foi aprovado pela FDA como o primeiro

biofármaco produzido por CHO (Kim, 2012). Hoje, a cultivação de células CHO é

usado pela indústria biofarmacêutica para produzir, anticorpos monoclonais e outros

fármacos proteínas, como fatores de crescimento e citoquinas pois apresenta capacidade

pós translacional e glicosilação idêntica aos humanos (Walsh & Jefferis, 2006).

As células CHO atingem grandes densidades viáveis, mais de 10�células/ml em modo

batch e fed-batch e volumes de20𝑚O (Kompla & Ozturk, 2006), e mais de

10Ncélulas/ml em modo de perfusão. Regularmente excedem taxas de 2g/l de proteínas

recombinantes por meio de seleção de células hospedeiras, vetores de expressão, L-


59

glutamina sintetase (GS) e seleção de estratégias como a deleção da dihidrofolato

redutase (𝑑ℎ𝑓𝑟A|A)por mutagénese. (Wood et al., 1990; Daramola et al., 2014). A

CHO original foi alvo de modificações e mutagéneses resultando em várias linhas que

existem os dias de hoje. (Figura 27). Cada linha celular tem os seus requisitos quanto ao

meio de cultura a ser utilizado, incluindo produtos específicos para a produção de

biofármacos. Para algumas linhagens, foram criadas plataformas específicas de meio de

cultura, desenvolvidas de acordo com o tipo de metabolismo celular, por exemplo,

Cellventoä (Figura 8) ou Ex-Cellâ (Lewis et al., 2013).

Apesar da importância da própria linha celular, os métodos de transfecção têm

importância a considerar. As células CHO são frequentemente transfretadas por DHFR

ou sistemas GS, usando marcadores seletivos adicionados como suplementos ao meio

de cultura (Palomares et al., 2010). O sistema GS seleciona as células que conseguem

crescer sem a adição de glutamina, permitindo a eliminação desta.

Figura 27. Linha celular CHO


60

4.12. Modelos de scale-down para processos de perfusão

O desenvolvimento de modelos scale-down é um método que reproduz as condições de

grande escala para um modelo similar em pequena escala. Similar ao clássico scale-up,

o modelo scale-down, precisa de simular um parâmetro limitante de um processo o mais

próximo possível da realidade, por exemplo, a transferência de oxigénio de vários

processos bacterianos (Oosterhuis & Kossem, 1984; Enfors et al., 2001; Sieck et al,

2018).

Em processos com células de mamíferos, o constante microambiente criado para a

cultura celular, é proposto, como o ajuste do pH, temperatura, nutrientes, mas também o

design do biorreator como ajuste da taxa de dissipação da energia específica, tempo de

mistura, velocidade de gás superficial, transferência de oxigénio, volume de gás de

retenção e 𝑝𝐶𝑂F (Oosterhuis & Kossem, 1984; Enfors et al., 2001; Sieck et al, 2018).

Vários autores definem a 𝐶𝑆𝑃𝑅 como o fornecimento meio de cultura fresco, para uma

única célula. O 𝐶𝑆𝑃𝑅 é independente da escala e do sistema de cultura, logo pode ser

aplicado em perfusão. Se todos os simuladores aplicarem o mesmo 𝐶𝑆𝑃𝑅, as células

têm comportamento metabólico similar. Será o melhor critério para modelos scale-down

em modo perfusão (Oosterhuis & Kossem, 1984; Enfors et al., 2001; Sieck et al, 2018).

4.13. Vantagens do bioprocesso em contínuo no modo perfusão

O bioprocesso em contínuo no modo perfusão em upstream, oferece as seguintes

vantagens sobre o processo em modo fed-batch (Sieck et al., 2018)

• O produto é colhido em modo contínuo;

• As condições de funcionamento do biorreator são constantes, e podem ser

controladas com precisão;

• Produtos instáveis são removidos continuamente;

• Maior produtividade de volume; 5 a 10 vezes maior;

• A produção pode ser feita em biorretores mais pequenos;

• Densidades celulares maiores;


61

• O biorreator pode operar continuamente, durante maiores períodos de tempo,

com células de elevada densidade;

• Custo de capital reduzido

• Redução de custos operacionais

Por outro lado, segundo Konstantinov & Cooney (Konstantinov & Cooney, 2014), os

fatores que podem limitar o processo de perfusão são os seguintes:

• A estabilidade do produto no ambiente no biorreator, pode requerer a sua

remoção após algum tempo de residência (𝑅𝑇qvy). A distribuição do tempo de

residência em 𝐶𝑆𝑇𝑅𝑠 tem que ser considerada.

• A taxa de perfusão pode ser limitada pelo dispositivo de retenção celular, para

um máximo (𝑃qvy), especialmente para grandes biorreatores em escala.

• A densidade máxima celular que o biorreator pode suportar, por exemplo, em

termos de 𝑂𝑇𝑅. Maiores 𝑂𝑇𝑅podem ser atingidas se, aumentarmos a taxa de fluxo

de oxigénio ou a velocidade de agitação. Ambos os parâmetros podem causar

“shear stress” ao produto numa das fases da produção. Em geral, ficou demonstrado

que a sensibilidade do “shear” é exagerada, e que são necessárias condições muito

adversas para alterar as modernas linhas CHO.

• O mais importante relativamente ao meio de cultura é que 𝐶𝑆𝑃𝑅qrs ou

𝐶𝑆𝑃𝑅z{ru limitem o possível 𝑋qvy devido ao 𝑃qvy do dispositivo de retenção

celular. A otimização do meio de cultura e linhagem celular para um determinado

processo em perfusão permitirá a otimização do espaço de produção.

4.14. Bioprocessos que já utilizam o modo perfusão.

A combinação de múltiplas etapas de processamento contínuo em perfusão numa

pequena zona de fabrico contínua já demonstrou apresentar maior produtividade em

termos do processo upstream e downstream (Rogler et al., 2015)


62

Os exemplos mais recentes até à data foram apresentados pela Sanofi-GenzymeÔ

(Framingham, MA), Merk Ô (Kenilworth, NJ) e pela Bayer Tecnology ServicesÔ

(Lerverkursen, Alemanha).

i. Produção de enzimas humanas recombinantes e mAbs - Sanofi Genzymeä

A Sanofi genzyme comercializa várias enzimas humanas recombinantes. Estas proteínas

são intrinsecamente instáveis e perdem atividade num biorreator no modo fed-batch.

Devido aos desafios relacionados com a estabilidade do produto, a produção em

upstream de enzimas recombinantes, foi implementada num biorretor em contínuo no

modo perfusão. A taxa de perfusão é normalmente de cerca de 1 volume de biorretor/dia

para que a proteína esteja muito menos tempo no biorreator do que num processo fed-

batch, que pode ser operado por mais de 14 dias até à colheita.

O processo em modo perfusão pode operar em contínuo durante 60 dias ou mais daí ser

acoplado a uma contínua purificação em dowstream. Esta estratégia já fi empregue com

sucesso para produção de enzimas humanas recombinantes e mAbs (Warikoo et al.,

2012). Mais recentemente, foi apresentada uma prova de um processo de fabrico

contínuo totalmente integrado para mAbs (Godawat et al., 2015).

Ao nível do upstream, o estudo conceptual, envolveu um biorreator de 12 L com

tecnologia ATF de retenção celular. O reator foi operado com 50-60 milhões de

células/ml e uma taxa de perfusão de 2-3 volumes de biorreator/dia (0,04-0,05

nl/célula/dia). A produtividade específica estabilizou por volta de 0,8 g/L/dia,

produzindo 10 g/dia de produto (a concentração da alimentação efluente estava entre

0,28-0,42 mg/l).

A solução de alimentação passou por um filtro de 0,2 µm, para um bolsa de 2 l antes de

entrar no processo de cromatografia por captura. Este passo foi implementado num

sistema 3C-PCC (GE HealthcareÔ), operação em 3 colunas de proteína A. O sistema

3C-PCC foi operado para cada coluna seja eluída a cada 4 horas. A inativação de vírus

envolveu 1 hora de incubação a pH baixo. Os picos de eluição foram assim inativados


63

um a um, antes da purificação da solução de produto intermediário (Subramamian,

2018).

Antes do refinamento, o produto inativado foi diluído para reduzir a condutividade por

adição em linha de um tampão de diluição. A solução intermediária foi então aplicada

noutro sistema 3C-PCC com três colunas de troca de iões. (Capto SÒ). O produto já

eluído fez-se passar por uma membrana de adsorção diretamente ligada ao sistema 3C-

PCC. O processo de troca de iões foi operado de tal modo que o produto foi eluído a

cada 2h e o adsorvente de membrana lavado e regenerado a cada 24h. As condições de

eluição do processo de permuta de catiões, foram desenhadas para não ser necessário

ultrafiltração, antes da formulação (Subramamian, 2018).

Nenhum sistema integrado de controlo de processo foi utilizado para garantir que as

taxas de fluxo volumétrico entre as operações das unidades subsequentes fossem

equilibradas automaticamente (Subramamian, 2018).

Figura 28. Configuração do Bioprocesso contínuo em modo perfusão de USP-DSP

ii. O bioprocesso Merk & Co. Inc.

A Merk & Co. Inc. é uma das empresas pioneiras do bioprocesso contínuo integrado. A

Genzyme adotou a abordagem passo a passo (Warikoo et al., 2012), para validar o

princípio de uma plataforma de bioprodução integrada. A Merk começou a integrar


64

desde o início as unidades operacionais, utilizando componentes de uso único sempre

que possível.

O laboratório é desenhado em alinhamento em ferradura, a começar com um biorreator

em perfusão de 10 l na extremidade inicial até à extremidade final, local de recolha final

do biofármaco (Brower, 2015). No centro do alinhamento, existe uma ilha analítica

centralizada, que realiza vários ensaios em amostras que podem ser retiradas em quase

qualquer fase do processo. (Figura 29)

Figura 29. Imagem 360º do laboratório da MerckÓ

O biorretor em modo perfusão é operado a 1g/l/dia de produtividade específica e as

concentrações de saída do biorreator são aproximadamente de 1g/l. A retenção celular é

realizada usando um sistema de filtração de fluxo tangencial de formato único da

Specrum LabsÔ. A cromatografia Proteína A é implementada num sistema BioSMB da

Pall Life SciencesÔ(Figura 22). A esterilidade do sistema BioSMB é protegida usando

um filtro que é substituído diariamente. O produto eluído é recolhido para um pequeno

vaso para gerir o fluxo intermitente proveniente do sistema de cromatografia

multicoluna Proteína A. A inativação de vírus é realizada num reator de fluxo acoplado,

que é dimensionado para proporcionar o tempo de incubação estipulado. Após adição da

solução tampão num recipiente sobre pressão, o produto inativado é aplicado na coluna

de troca de iões. O fluxo aplicado diretamente a outro sistema BioSMB, que opera a

etapa de cromatografia de troca de catiões (Poros HS, ThermoÒ) em modo de captura

do produto agregado.


65

A abordagem única da Merk utiliza um sistema operado de uma forma contínua, com

biorreatores em modo perfusão e todas as unidades totalmente controladas, para que as

taxas de fluxo que passam de um sistema para o outro serem automaticamente

equilibradas. Para além destas vantagens, todas as amostras para caracterização do

biofármaco e controlo do processo são automaticamente recolhidas e analisadas por um

sistema LC-MS e uma UPLC. Todas as unidades e sistemas analíticos, são controlados

por um sistema de processamento central, Delta V. A plataforma é desenhada para

suportar a implementação de ferramentas de análise de dados multivariados, permitindo

o controlo adaptativo das operações (Subramanian et al, 2018).

Figura 30. Biorreator MobiusÒ 1000 L

iii. Produção de mAbs - Bayer Technology Services

A divisão da BayerÓ de produção de biofármacos abordou o problema criando uma

plataforma industrial contínua e em formato de uso único (Klutz et al., 2015). Uma vez

montado por completo, a plataforma visa um fluxo de sistema tecnicamente fechado e,

portanto, que seja concebível para operar todo o processo numa sala única. Com esta

abordagem, a Bayer estimou que a produção completa, em biorretores em modo

perfusão, para um determinado biofármaco possa ser feita numa sala de apenas 19,2 ×

9,6 m de área com 2 biorretores de perfusão (200L), todos os sistemas de

processamento downstream e tanques de preparação de tampões e meio de cultura. Uma

escala piloto para instalação deste bioprocesso foi implementada num espaço com uma


66

área de 7×14 m em 2 seções. A primeira, com o processo upstream com 2 biorreatores

em perfusão (10 l) com colonizadores de gravidade inclinados para a retenção celular.

Os biorreatores foram operados a uma taxa de perfusão de 3 volumes de biorreator/dia.

A densidade celular estacionária viável, estava na gama de 60 a 70 milhões de

células/ml e a produtividade específica de 5,3 g/célula/dia. A solução colheita teve uma

concentração de produto aproximadamente 0,115 mg/ml.

A solução límpida foi filtrada via 2 filtros Sartoguard NFÒ. Após alguns dias, atinge-se

a pressão máxima num dos filtros, após o que, o fluxo do produto passa para o outro. A

colheita foi pré concentrada e recolhida para um reservatório, usando o método de

filtração “Hollow Fiber”, o que permitiu uma concentração da colheita dos biorreatores

de 0,7 g/l.

Uma vez que a capacidade total de produção das secções de upstream e downstream não

estavam totalmente alinhadas, foram operadas em cascatas de etapas separadas. No

entanto no processo downstream, as operações estavam ligadas, para estabelecer uma

plataforma de purificação totalmente contínua. A cromatografia de captura de mAbs foi

operada usando o sistema BioSMBÒ. A inativação de vírus é realizada por um

dispositivo de fluxo invertido.

O refinamento do biofármaco consiste em 2 etapas de cromatografia. Na fábrica de

Leverkursen, foi realizado num modo misto (Capto AdhereÒ, GE HealthcareÓ) e uma

etapa de cromatografia de permuta aniónica (Hypercel STAR AXÒ, Pall Life

SciencesÓ) (Subramanian, 2018). Ambas as etapas foram operadas no modo de fluxo

contínuo. A etapa de cromatografia mista, foi configurada como um processo de

cromatografia de coluna múltipla, com um passo de carga contracorrente; a troca de

aniões foi executada no modo de fluxo contínuo com duas unidades alternadas. As duas

etapas são combinadas com um sistema BioSMBÒ. O processamento final em

downstream, envolve filtragem adicional, filtração de vírus, formulação e etapas de

controlo biológico de impurezas.


67

Todo o processo foi automatizado, usando o sistema Siemens PCS7Ò. Exceto o

processo upstream (biorretores e dispositivos de retenção celular), todo o processo

downstream foi estabelecido para um único uso.

4.15. Interpretação dos casos

Ambos os casos apresentados, apresentam uma combinação de biorretores de perfusão

com um processo contínuo downstream. É interessante reconhecer a as similaridades

entre os três processos (Tabela 7), para perceber a direção futura dos bioprocessos na

indústria biofarmacêutica. Todos os processos apostam em biorretores em modo de

perfusão e uma multicoluna Proteína A para a etapa de recolha do produto. Os desafios

incluem os dispositivos de retenção celular e inativação viral.

Tabela 7. Comparação das configurações dos casos apresentados

Biorreator GenzymeÓ MerkÓ BayerÓ

Configuração Perfusão (12l) Perfusão (10 l) Perfusão (2x 10 l)

Retenção celular ATF TFF Gravidade inclinado

Captura 3C-PCC BioSMB BioSMB

Inativação Vírus Sim Sim Sim

Polimento (1) 3C-PCC Capto-S Troca de aniões BioSMB (modo

mistura)

Polimento (2) Sartobif Q BioSMB Cation IX Troca de aniões

Automação Não Delta V Siemens DCS

Produção 8 g/dia 10 g/dia 22.7 g/dia

Análise offline Integrado offline


68

V. Conclusão

Os biofármacos são a classe com mais rápido crescimento de produtos farmacêuticos

inovadores. A FDA aprovou 45 novos biofármacos em 2015, e no momento mais de

400 moléculas estão em fase de estudo clínico maioritariamente mAbs, anticorpos

conjugados com fármacos, anticorpos multiespecíficos, proteínas manipuladas com

glicano e fragmentos de outros fármacos.

Apesar do sucesso crescente, a indústria biofarmacêutica continua a enfrentar desafios

competitivos rigorosos, nomeadamente económicos, regulatórios e políticos. Como

resultado, há um impulso significativo para aumentar a produtividade geral dos

bioprocessos farmacêuticos, reduzindo os prazos de desenvolvimento, custos de

produção, mas mantendo a qualidade do produto.

As cadeias de abastecimento precisam de ser simplificadas e ágeis para responder às

necessidades dos pacientes numa abordagem mais personalizada. A sincronização de

fabrico deve diminuir o tempo entre o início da produção e a comercialização do

biofármaco. O conceito de medicamento personalizado, suportado por um bioprocesso

contínuo em modo perfusão fornece uma abordagem para minimizar os custos de

inventário, reduzir o preço final e tornar os biofármacos acessíveis a toda a população

mundial.

Estas questões estão a pressionar a indústria para se afastar das tradicionais instalações

de produção, com biorretores de aço inoxidável fixos e a optar alternativamente por

módulos mais flexíveis e híbridos.

A produção de mAbs integrando a perfusão e a cromatografia multi-coluna, com a

eliminação dos tempos de pausa, e membranas de purificação de alto rendimento, pode

levar a uma significativa e redução de custos.

Irá permitir, que o fornecimento de adapte à procura em mudança e a um portfólio de

múltiplas modalidades de fabrico de biofármacos.


69

Os biossimilares são outro aspeto no desenvolvimento da tecnologia que otimize os

atuais processos. O primeiro anticorpo genérico já entrou no mercado e isto aumentou a

pressão para desenvolver bioprocessos económicos e mais rápidos para de se manterem

competitivos.

Contudo, não é só necessário melhorar o desenvolvimento do processo e implementar

novas unidades de fabrico, mas também melhorar a qualidade do produto em si.

Em USP a eficiência do processo e as concentrações dos produtos aumentaram

significativamente nas últimas décadas, resultando em concentrações de anticorpos na

gama 10-13 g/l em processos fed-batch, e até 25 g/l via bioprocesso em modo perfusão

(fruto do uso de dispositivos de retenção celular). Os resultados dessa otimização são;

concentrações do produto elevadas, menor tempo de retenção no reator, grande

produtividade e qualidade bem definida.

O processo de perfusão pode fornecer níveis muito maiores de produtividade do que os

sistemas alimentados por lotes (batch e feed-batch), reduzindo assim os custos de

produção. O processo de perfusão está muito mais próximo do estado estacionário do

que um processo alimentado por batch, e, por norma, produz um produto mais

consistente especialmente para moléculas que são sensíveis a mudanças nas condições

dentro de um biorreator.

A perfusão só ainda não é usada com a maior frequência em grande parte porque é mais

complexo de configurar do que os processos alimentados por batch. A perfusão requer a

remoção e substituição contínua do fluido de cultura de células com meios frescos,

mantendo um volume constante no biorreator. Complexidades adicionais podem advir

de possíveis variações no tempo de execução total e na necessidade de manter um

sistema estéril. Mas com uma abordagem de qualidade por design (QbD), um processo

de produção de perfusão pode ser projetado e implementado de forma eficiente e

económica.

A integração total contínua do bioprocesso, desde USP a DSP, é uma estratégia

alternativa para o futuro da indústria biofarmacêutica. Em USP, esta tecnologia já esta

bem estabelecida. Os novos desenvolvimentos nos dispositivos de retenção resultaram


70

na alteração para a tecnologia de fluxo tangencial (ATF). Este dispositivo permite aos

processos em modo de perfusão convencionais, produzirem células de grande densidade

celular e concentrar o produto no biorreator.

Em DSP as novas tecnologias de cromatografia contínua de separação, precisam de ser

significativamente mais eficientes e menos dispendiosas porque a sua implementação à

escala industrial exigirá investimentos elevados. Em todo o caso um bioprocesso

totalmente em contínuo tem redução de custos entre 30-50%.

A integração do processo não passa só por melhorias em DSP e na otimização das

etapas de forma isolada. Novas impurezas terão que ser consideradas, no bioprocesso

totalmente contínuo, uma vez que as atividades vão aumentar as concentrações de

biofármaco, mas muitas vezes, este aumento é paralelamente acompanhado por novas

impurezas geradas, estruturalmente mais similares à biomolécula alvo e, por isso, mais

difíceis de separar. Os parâmetros de otimização do futuro têm que considerar estas

impurezas e abordar a questão de diminuir quantidade produzida de produto, para

alterar o perfil de impurezas.

A integração do processamento em USP e DSP em modo contínuo poderá ser uma

ferramenta útil para a otimização total dos bioprocessos em perfusão (Figura 31).

Dados os benefícios já estabelecidos do bioprocesso em contínuo modo perfusão é

altamente provável que esta configuração venha a ser adotada na produção da maioria

dos biofármacos na próxima década.


71

Figura 31. Possível abordagem para integração de bioprocessos em contínuo desde

USP a DSP.

Alvo terapêutico

Futuro: otimização dos sistemas biológicos

Conhecimento atual em tecnologia de cultura celular

Fermentação; validação por métodos

estatísticos

• Caracterização das unidades operacionais

• Novas Tecnologias

• Modelos de determinação de

parâmetros

(Otimização por simulação)

Simulação do processo de integração USP-DSP

Colheita Celular

Condições reais

USP

DSP Biorreatores em contínuo


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