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Luciana Correia de Almeida Regitano

Introdução

Desde a redescoberta dos princí-pios de Mendel, no início do séculoXX, o foco de atenção dos geneticis-tas passou a ser o gene, como uni-dade fundamental da variação bioló-gica. Com o desenvolvimento da ge-nética de populações, surge o con-ceito de utilização de genes indivi-duais como marcadores, com a fina-lidade de fazer inferências sobre ascaracterísticas de uma população,como, por exemplo, o conteúdo devariabilidade, os padrões de migra-ção, a seleção e a deriva genética.Além disso, a possibilidade de ana-lisar a segregação de genes marca-dores, para localizar e estimar o efei-to de poligenes que controlam carac-terísticas de interesse para o melho-ramento das espécies, fomentou ain-da mais o estudo de marcadores.

Marcadores genéticos são carac-terísticas de herança mendelianasimples, que possibilitam ainferência do genótipo a partir dofenótipo do indivíduo, permitindo quea segregação do gene marcadorseja acompanhada. A análise de se-gregação requer a existência de pelomenos duas formas alélicas, ou seja,a existência de polimorfismo no locomarcador.

Inicialmente, as características dis-poníveis para esse tipo de análiseeram as mutações que produziam,alterações morfológicas, como onanismo, a ausência de asas emDrosophila e a ausência de pêlos emcamundongos. Entretanto, tais muta-

ções são pouco freqüentes nas po-pulações naturais, em que a maiorparte da variação genética é de ca-ráter contínuo (Tanksley, 1993). Alémdisso, macromutações, como as ci-tadas acima, freqüentemente com-prometem a adaptação do indivíduo,o que reduz sua utilidade em estudosde comparação entre populações.

As primeiras contribuições aoestudo de marcadores genéticos emanimais foram as descobertas dospolimorfismos de antígenos eritrocitá-rios (Stormont & Cumley, 1943). Aanálise de marcadores foi ampliadacom o c'ese!lvo~vimento de técnicasde eletroforese de proteínas, asso-ciadas a métodos de coloração histo-química, que permitiram que a varia-ção genética das proteínas passas-se a ser estudada (Smithies, 1955).Esses marcadores têm sido intensa-mente utilizados para investigar aestrutura das populações, elucidandoquestões como fluxo gênico em po-pulações naturais, dispersão efilogenia. Apesar disso, apenas par-te da variação genética de uma es-pécie pode ser observada, aquelaresultante de mutações que ocorremem regiões codificadoras do geno-ma e causam alteração detectáveldo produto gênico.

Essa limitação foi superadacom o desenvolvimento das técnicasde análise de DNA e o conseqüentedesenvolvimento de diversos tipos demarcadores moleculares, que serãodiscutidos neste capítulo.

Polimorfismode comprimento defragmentos de restrição

A caracterização do polimorfis-mo de DNA tornou-se possível coma descoberta das endonucleases derestrição da Classe li, capazes decortar a molécula de DNA em sítiosespecíficos, denominados sítios derestrição. O número de cortes efetua-dos por determinada enzima de res-trição é função do número de sítiosde restrição presentes ao longo damolécula de DNA. A ocorrência devariação individual no número e notamanho dos Iraqrnentos formadospela digestão do DNA com umaenzima de restrição foi demonstradapor Grodzicker et aI. (1974), em ade-novírus. Essa variação é o resultadode mutações de ponto, que eliminamou criam sítios de restrição para de-terminada enzima, podendo tambémresultar de eventos de inserção ou dedeleção entre dois sítios de restriçãoadjacentes. Essa variação foi deno-minada polimorfismo de comprimen-to de fragmentos de restrição ouRFLP, sigla derivada do termo inglêsrestriction fragment /ength po/ymor-phism.

O método desenvolvido paraadenovírus não produziu resultadossatisfatórios em eucariotos superio-res. Em virtude do tamanho dogenoma dessas espécies, o númerode fragmentos resultantes da diges-tão com enzimas de restrição é mui-to grande. Conseqüentemente, ten-tativas de separar esses fragmentos

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por eletroforese em gel produziramum rastro ao invés de bandas discre-tas. A solução para esse problemasurgiu com o desenvolvimento da téc-nica de Southern b/ot (Southern,1975), na qual os fragmentos sepa-rados por eletroforese são transferi-dos para um suporte sólido, usual-mente uma membrana de nitrocelu-lose ou náilon, imobilizados e desna-turados. Explorando a tendência damolécula de DNA de formar fitas du-plas complementares, utiliza-se aseqüência de fita simples de DNAcomo sonda. A sonda é marcada comum isótopo radioativo, como o 32p,ou, mais recentemente, com molécu-las antigênicas que são detectadaspor anticorpos associados a enzimasque catalisam reações cromogênicasou quimiluminescentes. Como resul-tado, apenas os fragmentos comple-mentares à seqüência da sonda sãorevelados (Fig. 1).

As sondas utilizadas para aobtenção de marcadores RFLP po-dem ser originadas de regiõescodificadoras ou não. O emprego desonda de DNA complementar aoRNA mensageiro (cDNA) é o maiscomum e apresenta a vantagem denão conter seqüências repetitivas.Sondas anônimas, obtidas a partir defragmentos de DNA genômico aoacaso, possibilitam a rápida obten-ção de novos marcadores, além depermitirem a análise de regiões nãocodificadoras do genoma. Porém,em virtude da abundância de DNArepetitivo no genoma dos eucariotos,quando o objetivo é a obtenção de

27 )

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A. DNA genômico

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fl Digestão comendonucleasede restrição

0J" WC/..J ,0/J0[;~.fl Eletroforese emV gel de agarose

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(+)

B. cDNA em vetor

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da sonda*: cONA )

n Desnaturação,o hibridização

Sitio de restrição

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Seqüência alvo

C.I -

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Auto-radiografia

Fig. 1. Análise de RFLP pela técnica de Sou/hem blo/. A. Preparação do DNA a ser investigado: O DNAgenômico é digerido com endonucleases de restrição e os fragmentos separados em função dotamanho por meio de eletroforese. Os fragmentos são transferidos para um suporte sólido edesnaturados por tratamento alcalino, B. Preparação da sonda: O DNA complementar, obtido portranscrição reversa de um RNA mensageiro, é clonado em um vetor, que permite sua multiplicaçãoem bactérias. O cDNA é retirado do vetor por digestão com endonuclease de restrição, marcadocom "P e desnaturado. C. Hibridização e revelação dos fragmentos complementares à sonda,

marca dores unilocais, essas sondasdevem ser submetidas a um proces-so de seleção, de forma a garantirque apenas aquelas que represen-tam seqüências de cópia única se-jam empregadas.

Um aspecto importante dos mar-cadores RFLP é a prevalência de

28

dialelismo. Muitos dos locos marca-dores descritos são dialélicos, queroriginados de mutações de ponto oude mutações estruturais. Marcadoresdialélicos são bastante limitados parao mapeamento genético, em funçãodo número de cruzamentos informa-tivos, que é função do número de

progenitores segregando para omarcador (heterozigotos) e do núme-ro de progênies nas quais podemosatribuir um dos alelos ao progenitor .Essa relação pode ser quantificadapelo valor de conteúdo de informa-ção polimórfica (PIC), definido porBotstein et aI. (1980) como:

(

n-í 2) n-t n 2 2PIC= 1-f,-Pi - ~i~,2g P,

Nessa equação, o primeiro mem-bro corresponde à proporção de in-divíduos heterozigotos na população,pressupondo-se equilíbrio de Hardv-Weinberg. Essa proporção é tam-bém definida como diversidadegênica (Weir, !996). Dessa diversi-dade se subtrai a proporção espe-rada de progênies não informativas,isto é, aquelas em que não é possí-vel diferenciar o alelo paterno domaterno. Um exemplo seria o acasa-lamento de dois indivíduos hetero-zigotos idênticos (A,A2 x A,AJ emaproximadamente metade de suasprogênies, as progênies heterozi-gotas, o alelo A, poderia ter origemtanto paterna quanto materna. O rnes-mo raciocínio seria válido para a aná-lise da origem do alelo A2.

Outras desvantagens dos marca-dores RFLP são: presença de alelosraros, fazendo com que muitas po-pulações apresentem padrão mono-mórfico, e grau de dificuldade técni-ca. Como foi mencionado, a técnicadepende do desenvolvimento e daseleção de sondas a partir de biblio-tecas genômicas ou de cDNA. Uma

vez identificadas as combinações desonda e endonuciease de restriçãoque revelam polimorfismos, o proces-so de análise por Southern blot de-mora em torno de cinco dias, depen-dendo do sistema de detecção utili-zado. Apesar dessas limitações, em1990 mais de 120 locos haviam sidornapeados em bovinos (Kennedyet aI., 1990).

A técnica de PCRUma das mais marcantes contri-

buições ao estudo de marcadoresmotoculares foi o desenvolvimento datécnica de reação em cadeia dapolimerase (PC R). Essa técnica foidesenvolvida por Mullis, em 1983(Mullis,1990), mas sua importânciasó ficou demonstrada com a publica-ção dos primeiros trabalhos de apli-cação da PCR em diagnóstico dedoenças (Saiki et aI., 1985).

A técnica consiste na replicaçãodo DNA in vitro, catalisada por umaDNA polimerase. A reação requer apresença dos quatro tipos dedesoxinucleotídeos (dATP, dCTP,dTTP e dGTP) e de oligonucleo-tídeos sintéticos, complementares àsextremidades da região do DNA quese deseja amplificar. Esses oligonu-cleotídeos, denominados "iniciado-res" ou primers, funcionam comoponto de início para a síntese de umafita de DNA complementar à fita mol-de, que se estende a partir da extre-midade 3' de cada primer. Cada ci-cio de PCR envolve: a desnaturaçãoda molécula de DNA alvo, obtida por

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elevação da temperatura para 92ºCa 95ºC; anelamento dos primers porredução da temperatura até o pontoideal para a formação das pontes dehidrogênio entre cada par de primere a fita molde; e extensão da sínteseda nova fita de DNA. Uma vez que areplicação do DNA é semiconser-vativa, ou seja, a DNA polimerase uti-

liza um molde de fita simples de DNApara sintetizar uma fita complemen-tar, sem o qual a adição de nucleotí-deos é interrompida, as fitas recém-sintetizadas passam a funcionarcomo molde para o próximo ciclo.Ao final de vários ciclos obtém-se acú-mulo exponencial de cópias da regiãodelimitada pelos primers (Fig. 2).

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cópias daseqüência alvo = 2' ~

Fig. 2. Representação esquemática da reação em cadeia da polimerase (PC R).

A reação é iniciada com a desnaturação da molécula de DNA molde pelo aquecimento a 952C.A redução da temperatura para 50-602C permite o estabelecimento de pontes de hidrogênio entreos primers e as fitas de DNA molde (fase de anelamento). A enzima Taq DNA polimerase inicia aadição de nucleotideos complementares à fita molde a partir das extremidades 3' dos primers.Essa síntese ocorre entre 702C e 80ºC (fase de extensão). Os ciclos de desnaturação, anelamentodos primors e extensão da síntese se reputem por 25 a 30 vezes, resultando no acumulo de cópiasda seqüência de DNA delimitada pelos primers (seqüência alvo) proporcional ao número de ciclos.

30

A extensão da síntese da nova fitade DNA era originalmente catalisadapelo fragmento Klenow da DNApolimerase I que, por ser inativada àtemperatura de desnaturação doDNA, exigia adição de enzima a cadanovo ciclo de PCR.

A utilização de uma DNA poli me-rase isolada da bactéria Thermusaquaticus (Taq DNA polimerase),capaz de catalisar a síntese de DNAna faixa de temperatura de 70°C a80°C e de se manter estável entre94°C e 95°C, permitiu a automaçãoda técnica de PCR (Gelfand, 1989).

Uma das etapas fundamentais datécnica é o dcsenvolvimento de umpar de primers adequado para a re-gião que se pretende amplificar.Essa etapa requer conhecimento pré-vio da seqüência de nucleotídeos,pelo menos das extremidades dogene ou do segmento de DNA a seramplificado. Esse pré-requisito vemse tornando menos restritivo com odesenvolvimento de métodos auto-matizados de seqüenciamento ecom o crescente desenvolvimento deprogramas de seqüenciamento dogenoma de diversas espécies. Emvirtude da conservação evolutiva dosgenomas, quando a informação nãoé disponível para a espécie foco dotrabalho, é possível utilizar informa-ções de espécies relacionadas,optando-se pelo desenvolvimento deprimers para as seqüências de nu-cleotídeos mais conservados entreduas ou mais espécies.

Em geral, cada primercontém de20 a 30 nucleotídeos. Não deve con-

ter estruturas secundárias comple-xas, principalmente na extremidade3', a partir da qual se dá a extensãoda fita complementar. A complemen-taridade entre os dois primers tam-bém deve ser evitada, pois resulta naformação de dímeros que reduzemo rendimento da PCR (Saiki, 1989).

A temperatura de anelamento de-pende do tamanho e da seqüênciados oligonucleotídeos utilizados.Como regra geral, primers mais lon-gos e com maior conteúdo deguanina (G) e citosina (C) apresen-tam anelamento mais estável. O ide-ai é utilizar primers com conteúdo GCsemelhante ao da seqüência a seramplificada, com distribuição homo-gênea de purinas e pirimidinas, evi-tando a presença de stretches (repe-tições sucessivas) de polipurinas oupolipirimidinas, cujas estruturas se-cundárias podem comprometergrandemente o resultado. O delinea-mento de primers é, portanto, umprocedimento complexo e, dada suaimportância para o sucesso da téc-nica, recomenda-se a utilização desoftwares adequados. Alguns pro-gramas disponíveis são o OLlGO™Versão 4.1 (National Biosciences,Inc.) e o Primer Oesigner Versão 2.0(Scientific & Education Software).

Outras variáveis críticas da reaçãosão a concentração de Mg2+, deso-xinucleotídeos (dNTP) e de DNA mol-de. Como regra geral, o excesso deMg2+ resulta em acúmulo de produ-tos de amplificação inespecíficos esua falta na redução do rendimento

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da PCÁ. Essa concentração é de-pendente da concentração dosdesoxinucleotídeos (dNTP), uma vezque esses se ligam ao Mg2+,tornan-do-o indisponível no meio. Concen-trações de 1,S mM de MgCI2 são ge-ralmente adequadas em presença de200 11Mde cada dNTP (Saiki, 1989),mas podem ser manipuladas de acor-do com a necessidade. A concentra-ção de cada um dos dNTPs podevariar de SO a 200 11M,acima dissoa incorporação errônea de nucleo-tídeos é favorecida. A quantidade deDNA molde depende do tamanho doqenorna e da finalidade do ensaio.Rotineiramente, utilizam-se 100 ngde DNA, suficientes para conter de102 a 105 cópias do genoma dosmamíferos, mas é possível obteramplificação a partir do DNA conti-do em uma única célula. Quando aquantidade de DNA molde disponí-vel é muito pequena, como, porexemplo, na análise de biópsias deembriões ou de espermatozóidesindividuais, é possível utilizar primersaninhados, ou seja, em um primeirociclo de PCR amplifica-se um seg-mento maior e esse produto é sub-metido a um segundo ciclo com umpar de primers internos à seqüênciaamplificada. Esse processo aumen-ta a capacidade de visualização dosprodutos de amplificação, dispen-sando a posterior detecção porSouthern blot.

O impacto da técnica de PCR naanálise de marcadores de DNAdeve-se principalmente à sua simpli-cidade e sensibilidade. O principio de

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amplificação de DNA in vitro tem sidoutilizado para o desenvolvimento detécnicas de seqüenciamento eclonagem e para o desenvolvimentode novos tipos de marcadores, comoos RAPDs (polimorfismos de DNAamplificados ao acaso), AFLPs(polimorfismos de comprimento defragmentos amplificados) e micros-satélites. Além disso, muitos dospolimorfismos de restrição descritospelo método de Southern têm sidotransformados em marcadores base-ados em PCR específica.

Para a análise de RFLP utilizan-do PGR, as extremidades da sondaque revelou o polimorfismo sãoseqüenciadas, e as informações sãoutilizadas para a síntese de primerscomplementares (Ferreira & Gratta-paglia,199S). Quando a posição dosítio polimórfico é conhecida, porexemplo, dentro de um gene bemcaracterizado, os primers podemser desenvolvidos a partir de seqüên-cias publicadas ou catalogadas embases de dados, como o GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.govl). A re-gião que contém os sítios polimór-ficos de restrição é amplificada e osfragmentos produzidos pela digestãodos produtos de amplificação podemser então analisados em géis deagarose. O PCR-RFLP tem sido apli-cado no diagnóstico de doenças he-reditárias em animais, como discuti-do no capítulo 1.

Microssatél itesOs genomas dos eucariotos abri-

gam grande quantidade de DNA

~petitivo, classificado d~ acordocom o número de nucleotldeos e acomplexidade da seqüência quecompõe as repetições. As diferentesClasses são também caracterizadaspor comportamento típico quanto àdistribuição no genoma e quanto aomecanismo envolvido em suas ori-gens (Jobse et aI., 1995)., I

A variabilidade de seqüênciasrepetitivas foi demonstrada por Bellat'al. (1982), e posteriormente utili-zada para a produção de perfis ca-racterísticos de cada indivíduo pelatécnica de DNA fingerprinting(Jeffreys et ai., 1935). Essa técnicaé de grande utilidade na identifica-ção de indivíduos ou linhagens e emtestes de paternidade. Entretanto, aaplicação em estudos de populaçãopode ser dificultada pela elevadavariação intrapopulacional, não sen-do possível estabelecer um perfil ca-racterístico de uma população, prin-cipalmente naquelas que possuemuma base genética ampla. Além dis-so, sua natureza multilocal não per-mite admitir, sem detalhada análisede segregação, que fragmentos demesma taxa de migração sejamalelos idênticos de um mesmo loco(Brufordet aI., 1992).

Avanço importante na obtençãode marcadores hipervariáveisunilocais veio da utilização de umaclasse de DNA repetitivo, as seqüên-cias microssatélites ou SSR (simplesequence repeats). Os microssaté-lites são caracterizados por repeti-ções em tandem de um mono, di, triou tetranucleotídeo, localizadas den-

tro de regiões de seqüência única.Cada bloco de repetições é geral-mente menor do que 100 pares denucleotídeos (Tautz, 1989). Do mes-mo modo que outras regiõesrepetitivas do genoma, a variação donúmero de repetições em cada locoé provavelmente resultante de errosno deslocamento da DNA poli me-rase durante a replicação do DNA.

Os microssatélites poli(G) epoli(A) são os mais simples, enquan-to que poli(GT) são os mais freqüen-tes, aparecendo em aproximadamen-te S a 10 x 104 locos individuais nogeilOma dos mamíferos (8011er,1990). Muitos outros microssatélitesforam identificados até o momento eé possível que qualquer seqüência depoucos nucleotídeos possa represen-tar um microssatélite no genoma deeucariotos.

Os microssatélites podem seramplificados de maneira específicapela técnica de PCR, utilizandoprimers que contém parte da se-qüência flanqueadora. A amplifica-ção resulta em produtos de diferen-tes tamanhos, em função do númerode cópias da seqüência repetitivadelimitada pelos primers. A maiordificuldade técnica está relacionadaà identificação dos genótipos, prin-cipalmente nos locos microssatélitesconstituídos por repetições de um adois nucleotídeos, nos quais doisalelos adjacentes diferem entre si porapenas um ou dois pares de bases,respectivamente. Há necessidade,portanto, de separar os produtos dePCR por eletroforese em gel de

33

poliacrilamida de alta definição(Fig. 3). A identificação dos produtospode se valer de três estratégias: a)utilização de um dos primers marca-dos com isótopo radioativo. Essamarcação pode ser feita pela adiçãode [y'2P1ATP catalisada pela enzimaT4 polinucleotideoquinase; b) marca-ção de um dos primers com fluo-resceína e leitura em seqüenciadorautomático; e c) coloração do gel porimpregnação com prata.

O desenvolvimento de marcado-res microssatélites pode ser feitopela análise de seqüências contidasem bancos ue dedos, localizando-soaquelas que contêm SSRs e deline-ando-se primers para a região que

S rGTAGGACTCCTGA -- (CA)n-- CGTAACGTACGTA

GCATGCAT

*3·GTAGGACT 5'CATCCTGAGGACT -- (CT)n -- GCATTGCATGCAT

Eletrofaseemgelde poliacrilamida

flanqueia a repetição. Essa estraté-gia é limitada pela quantidade de in-formações catalogadas nos bancosde dados. Outra estratégia bastanteempregada é a seleção de fragmen-tos contidos em uma bibliotecagenômica. A seleção dos clones quecontêm microssatélites é realizadapela hibridação das colônias queconstituem a biblioteca com um oli-gonucleotídeo sintético marcado, com-posto pela repetição que se procura,por exemplo (dG-dT)15ou (dA-dA-dT)lO'para localizar as repetições dedinucleotídeos CA ou de trinucleotí-deo TIA, respectivamente. Os clonespositivos, isto é, ;lql 1010s quo ficarammarcados após a hibridização, sãoisolados e seqüenciados para o

Fig. 3. Esquema da análise demarcadores microssatélites uti-lizando a técnica de reação emcadeia da polimerase (PCR).A. Detalhe da seqüência a seramplificada. Os primers sãoindicados em vermelho, sendoo da esquerda marcado. B. Re-sultados após corrida em gel depoliacrilamida de alta resolução.A interpretação do padrão debandas é apresentada à es-querda da figura.

s ~GTAGGACT - CAJO - CGTACGTA

3' SCATCCTGA - CT)O - GCATGCAr

5' YGTAGGACT - CAz. - CGTACGTA

3' SCATCCTGA - CT 2'1- GCATGCAT

S 3'GTAGGACT - CA,. - CGTACGTA

~ SCATCCTGA - CT 1I- GCATGCAT

S YGTAGGACT - C~7 - CGTACGTA

Y 5'CATCCTGA - GT" - GCATGCAT

S YGTAGGACT - CA2I - CGTACGTA

Y SCATCCTGA -CTlI- GCATGCAT

Aulo-radiografia,seqüenciadorautomático oucoloraçãocomprata

34

desenvolvimento de primers comple-mentares às seqüências flanquea-doras do SSR.

Uma vez que os oligonucleotídeosutilizados são complementares à se-qüências de cópia única, obtém-semarcadores unilocais, altamentepolimórficos e de herança codomi-nante. Esses atributos são de gran-de valor para a construção de mapas

genéticos. Na Tabela 1, apresentam-se alguns exemplos de valores esti-mados para os parâmetros conteú-do de informação polifórmica (PIC),probabilidade de exclusão de pater-nidade (PE), heterozigosidade (H) ediversidade gênica (O) para marca-dores microssatélites e RFLP emalgumas populações de bovinos.

Tabela 1. Valores de conteúdo de informação polirnórfica (PIC), probabilidade de exclusão(PE), heterozigosidade (H) e diversidade gênica (O) para alguns marcadores em popula-ções brasileiras de raças bovinas.

Marcadores Canchim'"(N=41)

Charolês"(N=36)

Nelore'" Nelore'"(N=180) (N=63)

PIC 0,371 0,000

GH-Alul PE 0,151 0,000H 0,122 0,000O 0,329 0,000

Q. PIC 0,344 0,101..J

CSN3-Hinfl PE 0,196 0,051LI..o:: H 0,463 0,111

O 0,442 0,105

PIC 0,365 0,298LGB-Haelll PE 0,211 0,165

H 0,463 0,244O 0,481 0,365

PIC 0,712 0,640

CSFM50 PE 0,475 0,466H 0,780 0,669

w O 0,734 0,661I-:J·UJ PIC 0,554!;i

TEXAN15 PE 0,389li)li) H 0,577O O 0,589o::os PIC 0,878 0,685

BM1224 PE 0,529 0,521H 0,732 0,311O 0,734 0,729

'''Regitano,1997; "Tambasco etaI.,2000; "Rosa, 1997.

0,000 0,3130,000 0,1750,000 0,4170,000 0,389

0,147 0,3750,073 0,2190,175 0,5280,160 0,500

0,366 0,3730,176 0,2170,397 0,5830,481 0,497

0,696 0,5960,508 0,4370,810 0,6670,642 0,647

------~ .••• _~-~ '~~_"!"'"""

0,6420,4410,5080,688

0,7300,5800,6390,757

Distorções da segregação podemurgir em decorrência da "expansão"u "contração" do microssatélite du-ante a meiose. A freqüência dessesventos é da ordem de 10 -4 a 10-5

or loco, por gameta (Holmes, 1994).ntretanto, em presença de altera-5es do sistema de reparo, a taxa deiutação pode aumentar de cem alil vezes. A instabilidade resultantem sido associada ao desenvolvi-ento de alguns tipos de câncer;impson, 1996) e de doenças he-ditárias, como a síndrome do cro-osso mo X-frágil.

Considerando a freqüênciaissas seqüências e o tamanhoédio do genoma de mamífero de( 109 pares de nucleotídeos, seriaIssível construir mapas genéticos-sses espécies com aproximada-snts 10 mil locos microssatélitesoller, 1990). Em bovinos, os mapasnéticos compostos por uma combi-ção de marcadores RFLP e locoscrossatéute fomecem cobertura deroximadamente 90% do genomashop et aI., 1994; Barendse et aI.,14,1997).

.limorfismos de um,cleotídeo (SNPs)Js recentes avanços dos siste-s de seqüenciamento automati-10de ácidos nucléicos têm permi- 'Ique as seqüências que constitu-os cromossomos em diferentesvíduos sejam comparadas. Des-'erma, variações individuais, re-antes de mutações de ponto,

podem ser identificadas. Essas mu-tações podem ser substituições,deleções e adições de nucleotídeosque, uma vez caracterizadas, consti-tuem os marcadores SNPs, sigladerivada do termo inglês Singlenucleotide polymorphisms.

Os SNPs são marcadores atraen-tes para a análise genética por seencontrarem em praticamente qual-quer região do genoma ou seqüên-cia de interesse, como por exemplo,em exons de genes candidatos, po-dendo ter implicações diretas nasfunçóes da proteína correspondente.Outras características importantessão a maior estabilidade, quandocomparados aos marcadores mi-crossatélites, além da possibilidadede automação. Essa última é umavantagem considerável em situaçõesque exigem a análise de um grandenúmero de indivíduos e de marcado-res, como quando se utiliza marca-dores aleatórios para scans comple-tos de genomas para localização deQTLs.

Porém, a maioria dos marcadoresSNPs são dialélicos, resultando,como discutido anteriormente, empouca informação por loco. Do pon-to de vista de mapeamento, cincomarcadores SNPs fornecem aproxi-madamente a mesma informaçãoque um loco microssatélite, de tal for-ma que os mapas de SNPs devemter uma densidade maior do que osde microssatélites (Beuzen et aI.,2000).

Considera~ões finaisMarcadores genéticos são instru-

mentos importantes para os estudosde populações e para a compreen-são dos mecanismos de herança.O desenvolvimento de metodologiasde análise molecular tem permitidoa análise do genoma e das variaçõesexistentes tanto em regiões que co-dificam produtos gêl"icos quanto na-quelas cuja função permanece des-conhecida, permitindo a rápida ob-tenção de mapas genéticos satura-dos para as mais diversas espécies,como foi discutido no capítulo 1.

Entre as contribuições metodoló-gicas, a utilização da PCR para aanálise desses rnarcadores repre-senta importante redução no tempodespendido para a identificação dosgenótipos, além de permitir a identi-ficação do genótipo a partir de quan-tidades mínimas de material, como,por exemplo, biópsias de embriõese evidências forenses.

Recentes progressos têm sido al-cançados em decorrência do gran-de estímulo ao programa GenomaHumano, cujo objetivo é mapear eseqüenciar todos os genes da espé-cie. O mapeamento comparativo de-verá resultar em avanços significati-vos também em outras espécies demamíferos, uma vez que a conserva-ção de padrões cariotípicos, de se-qüências codificadoras e da ordemde genes nos cromossomos têmsido descritas em muitas espécies(Womack & MolI, 1986).

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