Identificação de marcadores microssatélites para o tubarão ...

Universidade Estadual Paulista

“Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Biociências de Botucatu

Identificação de marcadores microssatélites para o

tubarão Galeocerdo cuvier utilizando

sequenciamento de segunda geração

Natália Jade Mendes

BOTUCATU – SP

2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

Identificação de marcadores microssatélites para o

tubarão Galeocerdo cuvier utilizando

sequenciamento de segunda geração

Mestranda: Natália Jade Mendes

Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti

Co-orientadora: Dra. Vanessa Paes da Cruz

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas (Genética).

BOTUCATU – SP 2015

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Agradecimentos

Primeiramente eu agradeço a Deus por ter guiado a minha vida.

Agradeço a minha família Rute, Félis, Bruno, Donizete e aos meus irmãos mais novos

(Hícaro, Vitor e Vitória), vocês são o verdadeiro motivo por eu ter chegado até aqui. Em

especial a minha mãe, que é meu porto seguro, minha inspiração e exemplo de determinação.

A todos os demais, a minha avó, meus tios e meus primos. E ao meu namorado Rafael, por

todo apoio, paciência e companhia; você foi um presente que Deus colocou na minha vida.

Ao meu orientador Prof. Dr. Fausto Foresti por permitir me fazer parte de sua equipe,

pela confiança e por diversas vezes ter me mostrado o caminho correto. Você é um exemplo

de profissional e de pessoa.

Ao Prof. Dr. Cláudio Oliveira por todo o auxílio teórico e prático, um grande

pesquisador que nos inspira.

Ao líder do nosso grupo de pesquisa dos elasmobrânquios, o Prof. Dr. Fernando

Fernandes Mendonça, por todo ensinamento, pela confiança em mim depositada e pela

amizade. Também agradeço a todos do grupo dos elasmobrânquios, foram cinco anos de

muito aprendizado e risadas; impossível não falar sobre algumas pessoas como Bruno

(Pitera), Bruno (Guiodai) e Sâmia (Alka). Valeu por todo companheirismo dentro e fora do

laboratório.

A minha co-orientadora Dra. Vanessa Paes da Cruz e ao Dr. Fernando Yuldi que por

diversas vezes me auxiliaram e me ensinaram.

Ao pessoal do laboratório de Genética (Universidad de Santiago de Compostela, Lugo

/ Espanha) por toda assistência e ajuda.

Agradeço a todos do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes; vocês foram

essenciais na minha vida. Jefferson (Menudo), Fábio (Fio), Gabriel (Pink), Bruno Melo, Luz,

Dani e Guilherme (Varvito). O trabalho se tornou muito mais fácil com todos vocês fazendo

parte do meu dia-a-dia.

Agradeço a todos os meus amigos de Botucatu, em especial ao pessoal da República

Diladinho e as minhas amigas Letícia (Loba), Thaís (Balboa), Camila (Travs), Bruna (Treps),

Camila (Judi), Claraline (Migaia) e Luciana (Virose). Vocês são muito importantes para mim

e estarão sempre no meu coração.

Também agradeço a todos os meus amigos de São Carlos que fizeram a minha vida

mais feliz e, em especial, a todos do grupo “Etanois”.

E à FAPESP, pela bolsa de estudos concedida, muito obrigada!

vi

“Grandes realizações são possíveis quando se dá atenção aos pequenos começos.”

Lao-Tsé

vii

Resumo

Diversas espécies de tubarões têm sofrido drásticos declínios populacionais nas

últimas décadas, sendo as principais causas a pesca acidental e a pesca para obtenção de suas

nadadeiras destinadas ao lucrativo comércio asiático. Dentre as espécies fortemente

impactadas pela pesca, o tubarão-tigre, Galeocerdo cuvier, já apresenta fortes sinais de

declínios populacionais e é atualmente classificada na IUCN como “quase ameaçada”. No

entanto, avaliações precisas dos estoques ainda existentes e a aplicação de medidas que

viabilizem a sustentabilidade e o manejo adequado da pesca ainda permanecem

inconsistentes. A esse respeito, considera-se que informações sobre a estruturação genética

populacional neste grupo de organismos envolvendo a caracterização da variabilidade

genética, distribuição geográfica de estoques genéticos, padrões de migração, fluxo gênico,

eventos históricos, estruturas familiares e estratégias reprodutivas, aspectos especialmente

relevantes para o setor pesqueiro, poderiam contribuir de modo objetivo, fornecendo subsídios

para o manejo e conservação dos estoques. Considerando a urgente necessidade de controle

sustentável da pesca, este estudo desenvolveu marcadores microssatélites polimórficos a partir

de 2 amostras de DNA desta espécie e utilizando sequenciamento de segunda geração, através

do pirosequenciamento 454, na qual foram isoladas 71.059 sequências reads, sendo que as

filtragens e testes realizados resultaram em dez loci polimórficos de microssatélites. Estes

marcadores microssatélites foram caracterizados em 29 indivíduos da espécie Galeocerdo

cuvier provenientes do oeste do Atlântico e, dentre os 10 marcadores polimórficos obtidos, 9

mostraram-se independentes de ligação. A diversidade genética destes loci foi avaliada e

revelou um total de 48 alelos, com a apresentação de 3 a 7 alelos por locus (média de 5,3

alelos). Os marcadores microssatélite desenvolvidos também foram testados com resultados

positivos na detecção de polimorfismos em outras três espécies de tubarões, Carcharhinus

longimanus, Carcharhinus acronotus e Alopias superciliosus. Considera-se, portanto, que tais

marcadores poderão auxiliar em avaliações globais da estrutura genética populacional desta e

de outras espécies de tubarões, podendo contribuir de modo significativo para a geração de

informações sobre elasmobrânquios, além de poder subsidiar programas de manejo, controle

sustentável da pesca e conservação de espécies neste grupo de organismos.

Palavras - chave: Marcador molecular, Pirosequenciamento, Chondrichthyes, Conservação

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Abstract

Several species of sharks have suffered drastic population declines in recent decades, and

bycatch and fishing to obtain their fins destined for the lucrative Asian trade can be

considered the main causes. Among the species heavily impacted by fishing the tiger shark,

Galeocerdo Cuvier shows strong signs of declining populations and is currently classified in

the IUCN roll as "Near threatened". However, accurate assessments of remaining stocks and

the application of measures that enable the sustainability and proper management of fisheries

are still inconsistent. So, it is considered that information on population genetic structure in

this group of organisms involving the characterization of genetic diversity, geographic

distribution of genetic stocks, migration patterns, gene flow, historical events, family

structures and reproductive strategies, can be particularly relevant for the fishing sector, and

could contribute objectively by providing subsidies for the management and conservation of

stocks. Considering the urgent need for a sustainable fishing control, this study developed

polymorphic microsatellite markers from two DNA samples of this species and using second

generation sequencing through pyrosequencing, 71,059 reads sequences were isolated, and the

filtering and tests resulted in ten polymorphic microsatellite loci. These microsatellite markers

were characterized in 29 subjects of Galeocerdo cuvier sampled specimens from the western

Atlantic and among the 10 polymorphic markers obtained, 9 showed independent up

connection. The genetic diversity of these loci was evaluated and showed a total of 48 alleles,

with the presentation of 3 to 7 alleles per locus (average 5.3 alleles). The microsatellite

markers developed were also tested with positive results in detecting polymorphisms in three

other species of shark, Carcharhinus longimanus, Carcharhinus acronotus, and Alopias

superciliosus. It is therefore considered that such markers may assist in global population

genetic structure assessments of this and other shark species and can contribute significantly

to generate information on elasmobranchs, supporting management programs, the sustainable

control of fisheries and the conservation of species in this group of organisms.

Keywords: Molecular marker, Pyrosequencing, Chondrichthyes, Conservation

ix

Sumário

Introdução 1

1.1 Exploração pesqueira de tubarões 1

1.2 Tubarão Galeocerdo cuvier 3

1.3 Plano de ação para a conservação e gestão dos tubarões 5

1.4 Marcadores moleculares 7

1.5 Tecnologia de pirosequenciamento 8

Objetivos 10

2.1 Objetivos gerais 10

2.2 Objetivos específicos 10

Material e Métodos 11

3.1 Amostragem 11

3.2 Extração do DNA e sequenciamento 12

3.3 Seleção das sequências e desenho de primers 12

3.4 Validação dos loci de microssatélites 13

3.5 Adição de fluorocromo 14

3.6 Identificação de polimorfismos e análises estatísticas 14

Resultados 16

4.1 Pirosequenciamento e detecção das sequências microssatélites 16

4.2 Análises da eficiência e do polimorfismo das sequências microssatélites 16

4.3 Caracterização dos loci específicos desenvolvidos para G. cuvier 17

Discussão 20

5.1 Detecção e análise dos microssatélites 20

5.2 Caracterização de loci específicos desenvolvidos para G. cuvier 20

5.3 Amplificação heteróloga 22

Considerações Finais 24

Referências 25

x

Material Complementar 33

Apêndice I 34

Apêndice II 39

1

1 Introdução

1.1 Exploração pesqueira de tubarões

Os peixes da classe Chondrichthyes são caracterizados por apresentarem esqueleto

cartilaginoso e atualmente o grupo está organizado em duas subclasses, Holocephali, que

contém as quimeras e Elasmobranchi, formada pelas raias e tubarões (Inoue et al. 2010).

Componentes desta segunda subclasse, os tubarões estão presentes em todos os mares

e oceanos, em águas frias, temperadas, subtropicais e tropicais e possuem hábitos demersais

ou pelágicos (Compagno 1984). Em seu ambiente natural, o maior risco que sofrem estes

animais é a atividade antrópica, sendo que de acordo com Dulvy (2014), as principais

ameaças aos Chondrichthyes são representadas pela superexploração, através da pesca

direcionada e pela captura acidental, seguidas por perda de habitat e por mudanças climáticas.

Enquanto um terço das espécies de elasmobrânquios estão sujeitos à pesca direcionada,

algumas das mais ameaçadas têm diminuído suas populações também devido à captura

acidental nas pescarias dirigidas a outras espécies. De acordo com Dulvy (2014), embora o

comércio mundial de barbatanas seja amplamente reconhecido como um dos principais

motivos da mortalidade de tubarões e raias, a demanda por carne e óleo de fígado também têm

passado a representar ameaças substanciais. Estes fatores de ameaça aos Chondrichthyes,

somados às limitações ligadas à estratégia de vida do tipo K–Estrategista, que caracteriza

organismos de alta longevidade, crescimento lento, maturação sexual tardia e baixa

fecundidade, tornam os componentes deste grupo bastante vulneráveis à superexploração,

principalmente devido à baixa capacidade de recuperação das populações após episódios de

sobrepesca (Stevens et al. 2000)

Em relação aos dados estatísticos sobre a exploração pesqueira, a FAO (Organização

das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura) registrou de 1950 a 2000 um aumento

gradual e constante da captura de tubarões, raias e quimeras ao longo do tempo, sendo que os

valores de desembarque de cerca de 273.965 toneladas registrado em 1950 atingiram o auge

em 2000, com o registro de captura de cerca de 888.214 toneladas. No ano de 2013, a captura

mundial foi de aproximadamente 772.874 toneladas de Chondrichthyes, sendo o valor cerca

de 520.000 toneladas de tubarões e o restante formado por raias e quimeras (FAO 2014).

Em um contexto global, na última avaliação realizada em 2014, o Grupo de

Especialistas de Tubarões (SSG) da União Internacional para a Conservação da Natureza

(IUCN) classificou 181 (17.4%) espécies de Chondrichthyes, em um total de 1.041 avaliadas,

2

como “ameaçadas”. Estima-se ainda, que um quarto dos Chondrichthyes em todo o mundo já

podem estar ameaçados (249 espécies - 24%). Nesta mesma avaliação, levando em

consideração apenas o grupo dos tubarões, constatou-se que, dentre 465 espécies, também

avaliadas sob os critérios da IUCN, 74 (15.9%) se encontram em alguma categoria de ameaça

de extinção, sendo que 11 (1.1%) estão “Criticamente em Perigo”, 15 (1.4%) “Em Perigo” e

48 (4.6%) em estado “Vulnerável”. Apenas 115 (11.0%) das espécies conhecidas foram

classificadas em estado de "Menor Preocupação" e 67 (6.4%) espécies como "Quase

Ameaçada". Destaca-se ainda a classificação de 209 (20.1%) espécies como “Dados

Deficientes”, ressaltando a falta de informações relacionadas principalmente ao status

populacional deste grupo.

Entre as espécies de tubarões e raias mais explorados, as espécies circunglobais

apresentam maior complexidade na avaliação e monitoria de suas populações devido à sua

distribuição em vastas áreas geográficas (Baum et al. 2003). Deste modo, o efeito das capturas

ainda tem permanecido desconhecido para um grande número de espécies cosmopolitas,

sendo que a maioria das avaliações tem servido para detectar o colapso destes recursos e, de

certo modo, viabilizar atitudes relacionadas ao manejo e conservação das espécies e

populações apenas em nível regional (Castro et al. 1999).

Dentre os táxons conhecidos, a ordem Carcharhiniformes é a que se apresenta em

maior abundância e na qual estão relacionadas 41 espécies, sendo os membros da família

Carcharhinidae os mais afetados pelas atividades antrópicas (Compagno 1984). Entre estas

espécies, o tubarão-tigre, Galeocerdo cuvier (Péron & Lesueur 1822) (Figura 1) apresenta

distribuição global em mares tropicais e temperados e no Atlântico Ocidental ocorre desde

Massachusetts, nos EUA até o Uruguai, incluindo localidades do Golfo do México, Caribe e

do Brasil (Compagno 1984) (Figura 2).

3

1.2 Tubarão Galeocerdo cuvier

Figura 1 - Ilustração do tubarão Galeocerdo cuvier.

Fonte: http://www.arkive.org/tiger-shark/galeocerdo-cuvier/image-G37326.html#src=portletV3api

O tubarão-tigre (Galeocerdo cuvier) é o maior tubarão da família Carcharhinidae,

podendo atingir mais de 5 metros de comprimento; esta espécie possui reprodução

ovovivípara (Whitney & Gerald 2007), podendo ocorrer numa frequência bianual ou trianual

(Heithaus 2001), produzindo uma média de 6 a 56 filhotes (Simpfendorfer 2009).

Sua classificação taxonômica pode ser descrita como segue:

Os tubarões-tigre apresentam hábito alimentar diverso, incluindo peixes menores

(piscívoros), as tartarugas e caranguejos (Heithaus 2001), sendo considerados predadores de

topo e geralmente exigem grandes áreas de forrageamento (Heupel et al. 2014). Desse modo,

CLASSE: Chondrichthyes SUBCLASSE: Elasmobranchi ORDEM: Carcharhiniformes FAMÍLIA: Carcharhidae GÊNERO: Galeocerdo

ESPÉCIE: cuvier

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a espécie é propensa a percorrer longas distâncias e estar em contato com diferentes habitats e

ecossistemas, estando assim, mais suscetíveis às ameaças antrópicas (Heupel et al. 2014).

Figura 2 - Mapa global da distribuição da espécie de tubarão Galeocerdo cuvier. Em vermelho estão representadas as áreas com a maior probabilidade de ocorrência e em amarelo as áreas de menor probabilidade de ocorrência. Fonte: www.aquamaps.org, version of Aug. 2013. Web. Accessed 9 Mar. 2015.

Estudos que utilizam marcação corporal com chips têm fornecido as melhores

informações sobre a movimentação do tubarão-tigre disponíveis até o momento, sobretudo em

águas próximas ao Hawai - EUA (Randall 1992; Holland et al. 1999; Papastamatiou et al.

2013), nas águas do Atlântico (Hazin et al. 2013) e nas águas próximas à Austrália (Heithaus

et al. 2007; Werry et al. 2014; Ferreira et al. 2015). De acordo com Randall (1992), os dados

fornecidos a partir de uma série de avaliações indicam dois padrões de movimentação onde

foram observadas: (a) recapturas bastante próximas umas das outras, sugerindo a permanência

dos indivíduos em uma área geográfica relativamente pequena e (b) um padrão com

migrações de longa distância, muitas vezes após um curto período de tempo. Esses dados

indicam que os padrões de abundância local podem ser diferentes entre as regiões e podem

estar associados à filopatria (Papastamatiou et al. 2013) e/ou a fatores ambientais, como

temperatura da água e disponibilidade de presas (Heithaus 2001; Lowe et al. 2006; Meyer et

al. 2010; Papastamatiou et al. 2013).

Esta espécie é capturada em praticamente todo o mundo, tanto em pescarias dirigidas

quanto em pescas consideradas acidentais. Recentemente, o aumento no valor dos produtos

5

como óleo de fígado, carne, pele e nadadeiras provenientes do tubarão-tigre alavancou a

pressão da pesca comercial sobre esta espécie em todo o mundo, especialmente devido à

procura pelas nadadeiras. Assim, as capturas da espécie têm sido documentadas em diversas

áreas, incluindo no Atlântico Ocidental (Bonfil 1994) e nas águas próximas à Austrália

(Stevens et al. 1984). De acordo com a FAO (2014), de 2003 a 2012 o registro global de

tubarão-tigre capturado atingiu um total de 638.000 toneladas, sendo que em 2012 foram

registradas 76.000 toneladas. No Brasil a captura foi de 106 toneladas no período de 2003 a

2012.

De acordo com Bonfil (1994), há indícios consistentes de que em áreas onde as

capturas voltadas para a pesca comercial desta espécie têm sido intensivas, a abundância já foi

significativamente reduzida. No entanto, enquanto a espécie é classificada como "Quase

ameaçada" pela União Internacional para a Conservação da Natureza (IUCN), devido a fortes

evidências de declínio em algumas populações (Simpfendorfer 2009), a informação em larga

escala ainda é desconhecida e seu real status de conservação pode estar ainda mais

comprometido (Ferreira et al. 2015). Portanto, informações básicas para o manejo da pesca,

tais como a caracterização da estrutura genética populacional com a identificação dos níveis

de variabilidade, identificação de possíveis restrições geográficas ao fluxo gênico e a

existência de populações locais, ainda permanecem globalmente desconhecidas.

1.3 Plano de ação para a conservação e gestão dos estoques de tubarões

Para a adoção de medidas efetivas visando à conservação das espécies de tubarões

fortemente impactadas pela pesca é necessária a participação de acordos internacionais, com

diversas nações agindo em conjunto, uma vez que a distribuição das espécies não é regida

pelos limites geográficos dos países. Em 1999 foi criado um Plano de Ação Internacional para

a Conservação e Gestão dos Tubarões (IPOA-Sharks) pela Comissão das Pescas (COFI) da

Organização das Nações Unidas Para Alimentação e Agricultura (FAO), dando origem a

diversos planos nacionais, com metas em comum entre os países participantes como o Brasil,

EUA, Inglaterra, Austrália, Canadá, Malásia, países do Mediterrâneo, Equador, Senegal, entre

outros. No Brasil este plano foi elaborado em 2005 pela Sociedade Brasileira para o Estudo

dos Elasmobrânquios – SBEEL, mas somente em 2009 foi aprovada pelo Ministério do Meio

Ambiente a “Proposta de Plano de Gestão para o Uso Sustentável do Grupo de

Elasmobrânquios Sobreexplotados ou Ameaçados de Sobreexplotação no Brasil”, que veio

conferir prioridade à gestão, pesquisa e conservação das espécies listadas como ameaçadas de

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extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação na Instrução Normativa do

IBAMA de 2004.

Nesta Instrução Normativa ficou definido como “Espécies ameaçadas de extinção”

aquelas com alto risco de desaparecimento na natureza num futuro próximo; como “Espécies

sobreexplotadas” aquelas cujas condições de captura de uma ou todas as classes de idade são

tão elevadas que causam a redução da biomassa, o potencial de desova e as capturas no futuro

a níveis inferiores aos de segurança; e finalmente, como “Espécies ameaçadas de

sobreexplotação” aquelas cujo nível de exploração encontra-se próximo ao de

sobreexplotação (MMA 2004). O texto oficial da IN MMA Nº 05/2004 estabeleceu ainda o

prazo máximo de cinco anos para desenvolvimento e implantação de planos de recuperação

de espécies ameaçadas ou planos de gestão para os estoques em risco de agravamento, de

forma a retomar o uso sustentável para espécies sobreexplotadas ou ameaçadas de

sobreexplotação, sob a coordenação do IBAMA - MMA e com a participação de outros

segmentos da sociedade.

Em 2012, O Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) publicou a Instrução Normativa

Interministerial IN MMA/MPA Nº 14/2012, em conjunto com o Ministério do Meio

Ambiente, proibindo no Brasil a pesca de tubarões e raias apenas para o comércio de

barbatana. A Instrução estabeleceu normas e procedimentos para o desembarque, o transporte,

o armazenamento e a comercialização de tubarões e raias capturados nas águas jurisdicionais

brasileiras e em alto-mar, por embarcações nacionais e estrangeiras arrendadas no Brasil. Por

esta norma, todos os tubarões e raias desembarcados em território nacional devem estar com

todas as suas nadadeiras naturalmente aderidas ao corpo. Assim, com esta observação

específica da nova lei, busca-se combater a prática do finning, onde o único interesse está na

retirada das nadadeiras, com o posterior descarte das carcaças ao mar.

Em 2013, por proposição brasileira, a Convenção sobre o Comércio Internacional de

Espécies Ameaçadas de Fauna e Flora Silvestres (CITES) adotou a medida pelo controle do

comércio internacional de cinco espécies de tubarão e duas de raias mantas, devido ao estado

de vulnerabilidade no qual se encontram.

Entre as prioridades relacionadas no plano nacional de conservação constam pesquisas

que visam à caracterização genética populacional dos estoques, monitoria das áreas protegidas

ou áreas de berçário e monitoramento dos desembarques nos principais portos comerciais para

a obtenção de dados populacionais, bem como de pesquisas para a identificação de áreas

prioritárias para as espécies sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação, além de

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também estimular atividades de pesquisas conjuntas e participação de pesquisadores em

fóruns internacionais para espécies que sejam recursos compartilhados (IBAMA 2009).

1.4 Marcadores moleculares

Principalmente para o setor pesqueiro, a identificação e manutenção de estoques

diferenciados são fundamentais pela sua relação direta com a produtividade total e uso

sustentável dos recursos (Carvalho & Hauser 1994), sendo um dos objetivos básicos dos

programas de controle e manejo de espécies em perigo a conservação da variabilidade

genética (Lacy & Lindenmayer 1995). Esta questão é especificamente relevante no ambiente

marinho, onde as barreiras físicas parecem ser menos efetivas (Avise 1994; Palumbi 1994),

sugerindo uma tendência à homogeneização genética (Levy & Cassano 1994; Ward et al.

1995; Bonhomme et al. 2002). Contudo, a premissa errônea de que populações marinhas são

geneticamente uniformes pode estimular a sobre-exploração, reduzir ainda mais os níveis de

variabilidade, diminuir a produção comercial total e determinar a eliminação de estoques

locais (Smith et al. 1990; Kuusipalo 1999).

O conhecimento sobre marcadores de DNA evoluiu de um estado experimental e está

atualmente sendo incorporado aos programas voltados para a conservação de espécies de

forma prática e eficiente. Existem muitos tipos de marcadores moleculares que são utilizados,

de acordo com os objetivos de cada pesquisa. Dentre os diversos marcadores moleculares

existentes, os microssatélites, também chamados de SSR (Simple Sequence Repeats)

destacam-se em várias áreas, incluindo a área forense, a epidemiologia molecular,

parasitologia, genética de populações e da conservação, mapeamento genético e análises

genéticas de características complexas (Chistiakov et. al 2006)

Os microssatélites são formados por unidades de sequências de bases repetidas “em

tandem” (Tautz 1989) e estão presentes principalmente em regiões não-codificantes do

genoma, enquanto que sua presença é relativamente rara nas regiões codificantes (Li et al.

2002). Os microssatélites são conhecidos por apresentarem na maioria das vezes, o maior

conteúdo de informação de polimorfismo dentre todos os marcadores moleculares (O’Reilly

& Wright 1995) e tal característica ocorre em função de particularidades inerentes a estas

sequências, tais como o pequeno tamanho total com cerca de 100 pb, tipo de herança

codominante que permite a comparação de populações com base nas suas frequências alélicas

(Bruford et al. 1996) e também por se apresentarem bastante variáveis quanto ao número de

repetições de suas sequências (Variable Number of Tandem Repeats - VNTRs).

8

Devido às características como abundância, co-dominância e alto nível de diversidade,

os SSRs tem sido amplamente utilizado em estudos populacionais, resultando em informações

importantes para o manejo e conservação de populações naturais sob processo de sobre-

exploração (Batista, 2010). Portanto, a prospecção dos SSRs constitui-se em uma ferramenta

de grande importância para o estabelecimento de programas de conservação biológica. Em

elasmobrânquios ainda é reduzida a quantidade de marcadores genéticos moleculares

disponíveis, impedindo ou dificultando a elaboração de estudos genéticos populacionais

(Maduna et al. 2014). Esta deficiência ocorre até mesmo na família Carcharhinidae, que

possui a maior quantidade das espécies de tubarões (Keeney & Heist 2003; Ovenden et al.

2006; Fitzpatrick et al. 2011; Giresi et al. 2012b; Mendes et al. 2015). Uma alternativa para o

desenvolvimento de estudos genéticos populacionais é a aplicação da amplificação

heteróloga, com a utilização dos marcadores identificados em outras espécies (Fitzpatrick et

al. 2011; Taguchi et. al 2013; Mendes et. al 2015), visto que os testes de transferabilidade de

marcadores podem ser muito informativos entre os distintos gêneros e espécies, e até mesmo

em diferentes famílias (Barbara et al. 2007).

O método mais tradicional de desenvolvimento de microssatélites apresenta limitações

relacionadas ao tempo de processamento e ao custo elevado, especialmente quando se trata de

bibliotecas de DNA não normalizadas. Neste sentido, novas tecnologias de sequenciamento,

conhecidas como Sequenciamento de Segunda Geração (Next-Generation Sequencing, NGS),

chamados também de Próxima Geração, estão em desenvolvimento e representam uma

alternativa viável para o desenvolvimento de marcadores microssatélites tanto para espécies

modelo, como para aquelas cujo genoma ainda não foi sequenciado (Schirmer et al. 2010).

1.5 Tecnologia de pirosequenciamento

As novas tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de

sequenciamento de nova geração, são capazes de gerar informação sobre milhões de pares de

bases em uma única corrida e assim, a geração de dados ocorre em um curto espaço de tempo.

Esta maior eficiência advém do uso in vitro em sistemas de suporte sólidos para as unidades

de sequenciamento, tornando dispensável o intensivo e demorado trabalho laboratorial de

produção de clones bacterianos in vitro, da montagem das placas de sequenciamento e da

separação dos fragmentos em géis.

Entre os sequenciamentos de nova geração utilizados até o presente momento, apenas a

técnica de pirosequenciamento (Ronaghi et al. 1996) foi realmente empregada em maior

9

escala para análise da diversidade genética de muitos organismos, tais como em fungos

(Santana et al. 2009; Magain et al. 2010), artrópodes (Rasmussen & Noor 2009; Zhang et al.

2010), anfíbios (Nair et al. 2011), elasmobrânquios (Mendes et al. 2015), peixes ósseos

(Dubut et al. 2010; Saarinen & Austin 2010), répteis/aves (Allentoft et al. 2009; Castoe et al.

2010; Lerner & Fleischer 2010) e mamíferos (Vanpe et al. 2009).

A plataforma 454 FLX da Roche foi a primeira plataforma de sequenciamento de

segunda geração a ser comercializada. Esta plataforma realiza o sequenciamento com base em

sínteses, o pirosequenciamento (Ronaghi et al. 1998), que ocorre em uma sequência

planejada, coordenada por 3 enzimas DNA polimerase, que são Sulfurilase ATP, Luciferase e

Apirase. Os nucleotídeos são identificados por serem estas enzimas adicionadas e testadas

individualmente, mediante a polimerização e liberação de um pirofosfato inorgânico (PPi). Os

sinais e sua intensidade são capturados por uma câmera CCD e indicam que determinado

nucleotídeo correspondente ao fluxo emitido foi incorporado à cadeia de DNA. Estes

processos devem ser muito bem coordenados, sendo adicionados e liberados elementos em

quantidades molares, específicas de cada um dos reagentes e enzimas (Agah et al. 2004). A

emissão de luz produzida pela cascata de reações enzimáticas é detectada e registrada na

forma de um pico denominado pirograma, o qual é diretamente proporcional ao número de

nucleotídeos incorporados na sequência. Pode-se resumir a tecnologia de pirosequenciamento

como um processo que se baseia nos métodos de sequenciamento por detecção do pirofosfato

luminométrico, produzido pela incorporação de nucleotídeos na reação (Ronaghi et al. 1998).

10

2 Objetivos

2.1 Objetivos gerais

Considerando a urgente necessidade de estudos populacionais que possibilitem a

aplicação de medidas de conservação para um grande número de espécies de tubarões e a

reduzida quantidade de informações disponíveis sobre marcadores moleculares que permitam

viabilizar estas medidas, este projeto pretende contribuir com a geração de ferramentas que

possibilitem a realização de futuros estudos genéticos populacionais através da utilização de

marcadores moleculares do tipo microssatélite, prospectados para a espécie Galeocerdo

cuvier utilizando a técnica do pirosequenciamento. A eficiência dos marcadores

desenvolvidos também foi avaliada em espécies filogeneticamente próximas, pela aplicação

da amplificação heteróloga, visando uma maior abrangência de aplicação dos loci

caracterizados.

2.1 Objetivos específicos

Para atingir tais objetivos, foram realizadas as seguintes atividades:

• Desenvolvimento de bibliotecas genômicas para a espécie Galeocerdo cuvier a partir da

técnica de pirosequenciamento;

• Busca de regiões microssatélites nos fragmentos aleatórios sequenciados;

• Desenho dos pares de iniciadores que flanqueiam as regiões microssatélites do genoma de

G. cuvier;

• Padronização das condições de amplificação dos iniciadores desenvolvidos para cada uma

das regiões microssatélites;

• Caracterização do polimorfismo dos marcadores que apresentarem os melhores padrões de

amplificação;

• Avaliação da transferabilidade dos marcadores identificados em Galeocerdo cuvier em

outras 3 espécies de tubarões que também estão inseridos na lista vermelha da IUCN,

sendo que Carcharhinus longimanus e Alopias superciliosus estão identificados como

“vuneráveis” e o Carcharhinus acronotus está classificado como “quase ameaçado”.

11

3 Material e Métodos

3.1 Amostragem

No presente estudo foram utilizadas amostras provenientes da coleção de tecidos de

peixes que se encontram disponíveis no Laboratório de Biologia e Genética de Peixes do

Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP, que conta atualmente com cerca de 200

amostras representantes da espécie Galeocerdo cuvier. Tais amostras foram retiradas de

exemplares do tubarão–tigre em atividades de desembarques da frota pesqueira em

localidades no litoral do Estado de São Paulo; também foram obtidas em regiões costeiras do

arquipélago de Fernando de Noronha a partir de trabalhos científicos com captura,

amostragem e soltura; e ainda através de pesquisadores colaboradores do “Florida Program

for Shark Research”, da Universidade da Flórida. Porções de tecido obtidos das nadadeiras

e/ou tecido muscular foram coletadas e armazenadas em etanol 95% para garantir a

integridade e qualidade dos tecidos para análises moleculares. Nas análises desenvolvidas

neste estudo foram utilizadas 29 amostras, sendo estas provenientes de São Paulo (12

amostras), Fernando de Noronha (6 amostras) e Flórida (11 amostras) (Figura 3).

11

6

12

12

Figura 3 - Mapa indicando os grupos amostrais da espécie de tubarão Galeocerdo cuvier utilizados neste trabalho. As localidades de coleta estão indicadas como São Paulo – BR (12), Fernando de Noronha – BR, (6), Florida – EUA (11).

Também foi realizada a amplificação heteróloga dos marcadores identificados em

Galeocerdo cuvier em 6 amostras de Carcharhinus acronotus coletadas na costa de São

Paulo, 5 amostras de Carcharhinus longimanus e 5 amostras de Alopias superciliosus,

coletados no nordeste do Atlântico tropical por observadores de bordo, em capturas realizadas

por pesquisadores do Instituto Português do Mar e da Atmosfera (IPMA), Portugal.

3.2 Extração do DNA e sequenciamento

O DNA genômico foi extraído de exemplares de Galeocerdo cuvier em placas de fibra

de vidro (Ivanova et al. 2006) de acordo com o protocolo proposto pelo fabricante. Após a

extração, a concentração e qualidade do DNA foram determinadas em espectrofotômetro

(NanoDrop ND-1000), tendo sido obtido um valor de razão de absorbância (A) A260/A280

acima de 1,8 e concentração de aproximadamente 100ng.µL.

O DNA de 2 indivíduos desta espécie foi agrupado para a realização do

pirosequenciamento, realizado no Instituto Agrobiotecnológico de Rosário - INDEAR, na

Argentina. A plataforma utilizada foi desenvolvida pela Roche Applied Science denominado

“Sequenciamento genômico 454 GS-FLX Roche Titanium”. Foi constatado que esta

plataforma, se comparada a outras plataformas comercializadas na ocasião, possuía a

vantagem de gerar sequencias reads de maior tamanho e consequentemente possibilitava a

realização do desenho dos primers. Detalhes do procedimento de pirosequenciamento foram

descritos segundo o autor Margulies et al. 2005. Ao final do processo do pirosequenciamento,

os dados são processados por um programa específico do equipamento, o qual gera arquivos

que contêm a identidade e a qualidade de cada base de cada read a partir dos sinais brutos

obtidos. O Serviço de sequenciamento contratado neste projeto junto a 454 GS-FLX Roche

(Instituto Agrobiotecnológico de Rosário / INDEAR, Argentina) disponibiliza os arquivos das

amostras submetidas ao sequenciamento do DNA genômico em um website

(http://webservices.indear.com/).

3.3 Seleção das sequências e desenho de primers

Após a aquisição das sequências geradas, foi realizada uma primeira filtragem para a

identificação de microssatélites com o uso do software online Batch Primer3 (You et al.

2008) e ainda, de modo simultâneo, foram desenhados primers de acordo com cada loci.

http://webservices.indear.com/

13

Uma vantagem da utilização deste software é a possibilidade de se submeter até 500

sequências em uma única vez. Uma segunda filtragem foi realizada posteriormente com o

software Primer 3.0 (Rozen & Skaletsky 2000), sendo que os primers foram desenhados com

base nos critérios de tamanho ótimo de primer de 20 pb (min = 18, max = 22 pb), temperatura

ideal de anelamento em torno de 60 º C (min = 55 º C, max = 63 º C), quantidade de GC ótima

de 60% (min = 40%, max = 80%) e o tamanho do produto amplificado variando de 50-500

bp.

Após a identificação in silico das sequências microssatélite, foi realizada uma análise

de redundância; para isso foi feita primeiramente a busca de sequências complementares,

aplicando o software Online Reverse Complement (bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).

Em seguida, as sequências foram agrupadas e alinhadas no software Clustel W (Thompson et

al. 1994), sendo possível identificar sequências duplicadas para o mesmo locus.

3.4 Validação dos loci de microssatélites

Os primers sintetizados foram hidratados e estocados em concentração de 100ng/l. A

verificação da efetividade da seleção dos fragmentos contendo sequências microssatélites foi

testada inicialmente em seis amostras. Para a reação em cadeia de polimerase (PCR) foi

utilizado o termociclador Applied Biosystems (Veriti, Thermal Cycler) nas seguintes

condições: desnaturação inicial de 10 min a 95°C; 30 ciclos de 94 °C durante 45s, sendo a

temperatura de anelamento (TA) de cada par de primer testada de 51 °C a 57 °C durante 50 s;

72°C por 50s; e, no final dos ciclos, foi feita uma extensão final de 72 ° C durante 20 min. O

volume total da reação foi de 10,0 ul e consistiu de 0.20X Tampão de PCR, MgCl2 a 0,25

mM, 0,05 mM de cada dNTP, 0,5 unidades de polimerase Platinum Taq DNA (Invitrogen by

Life Technologies), 0,10 uM de cada Primer e 30 ng de DNA molde.

Para verificar a efetividade da reação e da amplificação dos fragmentos, 1,5 l do

produto da PCR e 1,5 l de GelRed Nucleic Acid Gel Stain, (10,000X in water – 0,5 ml –

Biotium) foram aplicados nas placas e submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%. Os

produtos amplificados foram comparados com o ladder 1Kb plus (Invitrogen), sendo

posteriormente visualizados em um transiluminador e fotografados com câmera digital

utilizando o programa Kodak Digital Science.

14

3.5 Adição de fluorocromo

A partir dos resultados visualizados no gel de agarose, foram selecionados os loci que

apresentaram amplificação positiva. Para a realização da genotipagem e verificação do

polimorfismo, foram adicionados fluorocromos às reações de amplificação, com a utilização

de 3 primers (Schuelke 2000): (1) um único primer universal, o M13, marcado com

fluorescência; (2) um primer forward específico para cada locus, acrescido de uma pequena

sequência complementar 5´ TGTAAAACGACGGCCAGT 3´ conhecida como cauda M13,

com a finalidade de gerar complementaridade com o M13 marcado; e (3) um primer

específico reverse.

Esta técnica, além de permitir uma genotipagem com baixo custo em sequenciador

automático, também possibilita a mobilidade dos fluorocromos (Schuelke 2000) e evita o

desperdício de primers específicos marcados, que muitas vezes são usados para poucas

reações. Os fluorocromos utilizados foram o FAM, com um comprimento de onda de 518nm,

representado pela cor azul e o HEX, com um comprimento de onda de 556 nm, representado

pela cor verde. A reação de PCR realizada com a adição da cauda e do primer M13

(fluorescência) foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Schuelke 2000.

Para verificar a efetividade da reação e a amplificação dos fragmentos foram aplicados

1,5 l do produto da PCR, 1,5l de GelRed Nucleic Acid Gel Stain, (10,000X in water – 0,5

ml – Biotium). Este mix foi submetido à eletroforese, com visualização feita em gel de

agarose a 1%. Os produtos amplificados foram comparados com o ladder 1Kb plus

(Invitrogen), sendo posteriormente visualizados em um transiluminador e fotografados com

câmera digital utilizando o programa Kodak Digital Science.

3.6 Identificação de polimorfismos e análises estatísticas

Para a identificação de polimorfismos foi realizada a eletroforese capilar dos

fragmentos microssatélites em sequenciador automático 3130xl (Applied Biosystem Life

Technologies). Pelo fato de cada amostra possuir um fluorocromo distinto, foi possível

colocar neste estudo 2 amostras em uma única raia na placa de sequenciamento,

possibilitando a otimização da genotipagem com a realização do dobro do número de

genotipagens em cada placa.

A transferabilidade dos loci de Galeocerdo cuvier foi testada para as espécies dos

tubarões Carcharhinus longimanus e Alopias superciliosus com a utilização de 5 amostras

para cada espécie e para Carcharhinus acronotus, com a utilização de 6 amostras, tendo sido

15

utilizado neste procedimento o mesmo protocolo de PCR anteriormente descrito por Shuelke

2000. Os tamanhos dos alelos foram determinados com o uso do ROX 500 (Applied

Biosystems), com um comprimento de onda de 602nm como padrão interno, enquanto que

para estimar o tamanho dos alelos foi utilizado o programa GeneMapper 3.7 (Applied

Biosystems).

Nas análises estatísticas foi utilizado inicialmente o software GenAlex Analysis 6.1

(Peakall & Smouse 2006) para a construção e exportação das matrizes nos formatos

específicos de cada programa. Posteriormente, foi usado o software Arlequim 3.5 (Excoffier et

al. 2010) que permitiu calcular as inferências de heterozigosidade, número de alelos e o teste

de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) (valor de significância P < 0,05). Os níveis de

significância para os testes de HWE foram ajustados com o uso das correções de Bonferroni

(Rice 1989), sendo a correção padrão para HWE (P ≤ α/k), onde α representa o índice de

significância 0,05 e k o número de loci. O software Arlequim 3.5 também foi utilizado para

realizar o teste de desequilíbrio de ligação (teste exato de Fisher a 5% de probabilidade) que

realiza análises de contingência para cada par de loci e estima se um genótipo de um locus é

independente do genótipo de outro locus. O programa Cervus v.3.0.7 (Marshall et al. 1998)

foi aplicado para verificar a presença de alelos nulos, o coeficiente de endogamia (Fis) e o

conteúdo de informação polimórfica (PIC> 0.5).

http://www.nature.com/hdy/journal/v99/n6/full/6801019a.html

16

4 Resultados

4.1 Pirosequenciamento e detecção das sequências microssatélite

A partir do material genômico gerado pela tecnologia de pirosequenciamento, foi

obtido um total de 71,059 sequências, com um tamanho médio de 367 pb, que consiste de

26.075.405 nucleotídeos, o que representa cerca de 0,75% do genoma, assumindo um

tamanho de genoma de G. cuvier como sendo de 3,44 Gb, calculado a partir do tamanho do

genoma do tubarão Rhincodon typus, segundo Read et al. (2015). A identificação in silico das

sequências microssatélite com os softwares Batch Primer 3 e Primer 3 resultou em 159

repetições microssatélites, conforme apresentado na Tabela 1. Posteriormente, a partir dos

dados geradores pelo software Primer 3, foram selecionados visualmente 30 loci

microssatélites, sendo que 21 repetições mostraram-se dinucleotídicas, 4 trinucleotídicas e 5

tetranucleotídicas (Tabelas 2).

Tabela 1. Identificação das sequências microssatélites analisadas utilizando os softwares Batch Primer3 e Primer 3.

Dinucleotídeos Trinucleotídeos Tetranucleotídeos Pentanucleotídeos SSRs totais

1º Filtragem Batch Primer 3

360 40 115 55 615

2º Filtragem Primer 3

75 21 31 20 159

4.2 Análises da eficiência e do polimorfismo das sequências microssatélites

Após 30 conjuntos de primers sintetizados, o primeiro teste realizado com os primers

microssatélites foram testados em quatro temperaturas distintas, sendo 51ºC, 53 ºC, 55ºC e

57ºC para a amplificação dos fragmentos, que se encontram relacionados na Tabela 2 e que

foram posteriormente confirmadas em gel de agarose. Cada par de primers foi testado em

amostras de seis indivíduos, tendo sido selecionados 20 conjuntos de primers, dos quais 10

foram descartados (TIG_3, TIG_8, TIG_9, TIG_13, TIG_16, TIG_20, TIG_23, TIG_24,

TIG_26, TIG_28), uma vez que não produziram nenhum fragmento na reação de amplificação

visualizada em gel de agarose (Tabela 2).

17

Os resultados obtidos revelaram a presença de 20 pares de primers, que apresentaram

amplificação positiva e estes foram sintetizados com cauda M13 (Schuelke 2000) nos primers

forward (Tabela 2), conforme descrito em Materiais e Métodos.

4.3 Caracterização dos loci específicos desenvolvidos para G. cuvier

Quanto à avaliação de polimorfismos, os 20 marcadores selecionados foram testados

em 29 amostras e genotipados no sequenciador automático 3130xl (Applied Biosystem Life

Technologies), sendo posteriormente estimado o número e tamanho dos alelos identificados.

Dentre os 20 marcadores selecionados, 10 mostraram-se monomórficos (TIG_2,

TIG_4, TIG_11, TIG_14, TIG_18, TIG_21, TIG_22, TIG_27, TIG_29, TIG_20) (Tabela 2) e

por este motivo foram descartados das análises. Os 10 loci microssatélites restantes

mostraram-se polimórficos, sendo que destes 9 foram caracterizados como dinucleotídeos e 1

como trinucleotídeo (Tabela 2).

Tabela 2 - Descrição e identificação dos polimorfismos dos conjuntos de primers microssatélites para Galeocerdo cuvier.

NOME PRIMER MOTIF TM T°C AMPLIFICAÇÃO POLIMORFISMO FLUOROCROMO TIG_1 F: CTCTTGACGGTGCTCGATC

R:AATGGCAACTTTTCCTGTCC (AC)10

138 53ºC POSITIVA POLIMÓRFICO HEX

TIG_2 F: GGACTATGACACTCGGCCTTT R:CTTGGTGGAACCTTGCCTTA

(AC)8

334 55ºC

POSITIVA MONOMÓRFICO -

TIG_3 F: GCCTGAACTTAATGAGGCTTTC R:AGAGGTTGTGGACCCAAGAG

(AC)8

104 55ºC

NEGATIVA - -

TIG_4 F: CACAAGAGTGGGCAGTAGGG R:TGTAACCAAACGAATCAAAACA

(AC)21 245 51ºC POSITIVA MONOMÓRFICO -

TIG_5 F: GCCAGCATCCATTCATACAG R:AGAGGGAAGTGGTGTGTGGT

(CT)8

265 55ºC

POSITIVA POLIMÓRFICO HEX

TIG_6 F: GGTTCGGCAGCATGTGAG R:CCCTCGTTGAATGTTTCCTT

(GA)8


TIG_7 F: CACCAACCTCCCCATCAC R:CAGACATTCCTCCTCCATCC

(AC)15 192 57ºC POSITIVA POLIMÓRFICO FAM

TIG_8 F: CTCCCACTCCTTTCATCTTCA R:CCAACACTGCCATCTCCAC

(CT)9 330 55ºC

NEGATIVA - -

TIG_9 F: CACGGACACACACTCTCACA R:GAAACACAGGCACACAGCAC

(AC) 9

222 57ºC NEGATIVA - -

TIG_10 F: CTCAGCAGGTCTGGACAACA R:GGTGGTAGGAACATGGAACG

(GT)10


TIG_11 F: TGCAAAACAATGGAGTGGAA R:CTCCCTCTGATGCCTTGATG

(AG)11

148 51ºC POSITIVA MONOMÓRFICO -

TIG_12 F: TGCCATGAGTGCTGTTTTTC R:TGCCGCATTGTTACTGCTAC

(CA)11

359 53ºC POSITIVA POLIMÓRFICO FAM

TIG_13 F: CATGCCTCAAAGCACTCAAC R:CCTGGATCTGACCTCTGGAA

(GA)9

186 55ºC

NEGATIVA - -

TIG_14 F: AGTGACCGCTTGGACAGACT R:GGCTGAGTGCTGCTTTCC

(AG)9


TIG_15 F: AACTGCCAAAAGGGACAAGA R:GTAAGCCCAACAGACCATCC

(TG)15

216 53ºC POSITIVA POLIMÓRFICO FAM

TIG_16 F: GCACTTCTTTTGGGCTATGG R:GGTGTTCCTTCGTCAGGTGT

(AC)9

187 55ºC

NEGATIVA - -

TIG_17 F: TGAAGCTAACGAGGGGTCTG R:AGCGCAGAAGATCAAGAGGA

(GT)11

255 55ºC


TIG_18 F: CCTATGACACTCGGCCTTTC R:TCGACTGGAGACTGGCAATT

(CA)8

90 55ºC


18

NOME PRIMER MOTIF TM T°C AMPLIFICAÇÃO POLIMORFISMO FLUOROCROMO TIG_19 F: TGCTTGTGTCTGAGGTGAGTG

R:TTGGAGGTTCAATCCGAGAC (TG)10

408 55ºC


TIG_20 F: AGATGGGGAATGGGGAATAG R:CCCCGACCTCTCTCTCTG

(AG)8

114 55ºC

NEGATIVA - -

TIG_21 F: AGTCCATTTCCTGCCCTCTC R:TTTGATTCCTGGCTTGAGGT

(CA)8


TIG_22 F: GAAGCGAATGGGTCAAAGAG R:GCTGGTGTATGGCACTGAGA

(AGG)5

247 55ºC


TIG_23 F: CTCCTTGTTCCCTGCTTGAG R:CTTCCCACCCTCCACTACC

(GGA)5


TIG_24 F: TACTCCAATCCCCCTGACAC R:ATTTTTAGCCTCTCGCATCG

(CAC)5


TIG_25 F: CCGTGCCTATGTGGATTTCT R:CTTGAAGAGAGTGGGCGAAG

(CCT)5

488 55ºC

POSITIVA POLIMÓRFICO FAM

TIG_26 F: TCAACTCCTCCACTGCTCAA R:AATCGTGTGTGGCAGGTATG

(CCAC)5

206 55ºC

NEGATIVA -

TIG_27 F: AGTTGGCGAGAGTTGGCTTT R:ATCTATCCATGTCCCCCACA

(AGAT)4

123 55ºC

POSITIVA MONOMÓRFICO

TIG_28 F: CGCTGGAGGTAGAAGTGGTC R:TCATCCCATTGATTCCCTGT

(AATA)4


TIG_29 F: ACTGCCATCCCTGAAACAAA R:TTGTGACTGACCCTTCATCG

(AAAC)5


TIG_30 F: TGTGCGATTCACCTAACCAC R:CGACTGGGGGATTTTTACAG

(TTTA)4

204 55ºC


TM: tamanho esperado do fragmento. TºC: temperatura de anelamento estimada para cada primer.

No teste de desequilíbrio de ligação foi encontrada uma ligação nas comparações par a

par entre os loci, sendo por isso que o primer TIG_6 também foi descartado. Um total de 48

alelos foram encontrados, variando de 3 para o TIG_25 e 7 (TIG_1, TIG_7, TIG_12) alelos

por locus e média de 5,30. A heterozigosidade observada (HO) variou de 0,16 (TIG_17) a

1.00 (TIG_10), com uma média de 0,55 para todos os loci. A heterozigosidade esperada (HE)

apresentou uma variação entre 0.20 (TIG_25) a 0.72 (TIG_7), sendo que a média foi de 0,50

(Tabela 3).

Apesar do valor da heterozigotosidade observada ser maior que a de heterozigotos

esperados em quase todos os loci (com exceção do locus TIG_17), ocorreu um desvio

significativo no Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p> 0.01) em 2 loci (TIG_10 e TIG_17) após a

correção Bonferroni para múltiplos testes (Tabela 3). Também foi analisado o coeficiente de

endogamia, que mostrou um valor significativo apenas para o locus TIG_17, com 0,71

(Tabela 3). Dentre os loci estudados não foi verificada a presença de alelos nulos e, de acordo

com a classificação sugerida por Botstein et al. 1980, todos os loci foram considerados

altamente informativos, com PIC > 0,5 (Tabela 3).

19

Tabela 3. Descrição dos 9 loci microssatélites isolados para o tubarão Galeocerdo cuvier. LOCI PRIMER SEQUENCE (5’→3’) MOTIF

N NA RANGE(BP) HO HE EHW FIS PIC F(NULL)

TIG_1

F_ CTCTTGACGGTGCTCGATC R_AATGGCAACTTTTCCTGTCC

(AC)10

29 7 116 - 154 0.758 0.642 0.711 -0.184 0.710 -0.194

TIG_5 F_GCCAGCATCCATTCATACAG R_AGAGGGAAGTGGTGTGTGGT

(CT)8

26 4 203-257 0.384 0.337 1.000 -0.141 0.589 -0.239

TIG_7 F_CACCAACCTCCCCATCAC R_CAGACATTCCTCCTCCATCC

(AC)15 27 7 169-183 0.925 0.726 0.318 -0.280 0.811 -0.101

TIG_10 F_CTCAGCAGGTCTGGACAACA R_GGTGGTAGGAACATGGAACG

(GT)10 29 5 256-276 1.000 0.655 0.000 -0.539 0.608 -0.245

TIG_12 F_TGCCATGAGTGCTGTTTTTC R_TGCCGCATTGTTACTGCTAC

(CA)11

28 7 364-376 0.535 0.520 0.543 -0.030 0.682 -0.213

TIG_15 F_AACTGCCAAAAGGGACAAGA R_GTAAGCCCAACAGACCATCC

(TG)15

25 6 231-241 0.520 0.463 0.675 -0.124 0.650 -0.233

TIG_17 F_TGAAGCTAACGAGGGGTCTG R_AGCGCAGAAGATCAAGAGGA

(GT)11

25 4 268-286 0.160 0.554 0.000 0.715 0.734 -0.138

TIG_19 F_TGCTTGTGTCTGAGGTGAGTG R_TTGGAGGTTCAATCCGAGAC

(TG)10

27 5 337-353 0.555 0.443 0.677 -0.260 0.627 -0.214

TIG_25 F_CCGTGCCTATGTGGATTTCT R_CTTGAAGAGAGTGGGCGAAG

(CCT)5 27 3 331-349 0.222 0.206 1.000 -0.075 0.511 -0.285

N: número de indivíduos analisados; Na: número de alelos; He: heterozigosidade esperada; Ho: heterozigosidade observada; EHW: teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg; FIS: coeficiente de endogamia; PIC: conteúdo de informação polimórfica; F(null): alelos nulos.

Na Tabela 4 são apresentados os resultados obtidos na amplificação heteróloga

utilizando material genômico de outras três espécies de tubarões, C. longimanus, C. acronotus

e A. superciliosus. Para C. longimanus os testes foram realizados em 5 indivíduos e foi

encontrado apenas 1 locus polimórfico (TIG_15), enquanto que para A. superciliosus e C.

acronotus foram utilizados 5 e 6 indivíduos, respectivamente, sendo que os resultados das

análises revelaram apenas 1 locus polimórfico para A. superciliosus (TIG_7) e 2 loci

polimórficos para C. acronotus (TIG_17, TIG_5).

Tabela 4. Descrição dos dados da amplificação heteróloga em 3 espécies de tubarões -

Carcharhinus longimanus, Carcharhinus acronotus e Alopias superciliosus.

C. ACRONOTUS C. LONGIMANUS A. SUPERCILIOSUS

Loci N Na Range(bp) N Na Range(bp) N Na Range(bp) TIG_1

6 2 116-118 6 2 118-134 6 2 104-118

TIG_5 6 3 260-264 6 2 331-335 6 2 265-273 TIG_7 6 2 170-180 6 2 162-170 6 3 152-170

TIG_10 6 2 251-253 6 1 304 6 1 307

TIG_12 6 2 296-364 6 2 246-296 6 2 372-418 TIG_15 6 1 336 6 3 290-310 6 2 288-312

TIG_17 6 3 242-270 6 2 210-224 6 1 268 TIG_19 6 0 0 6 1 316 6 2 386-394

TIG_25 6 1 396 6 1 358 6 2 388-398

N: número de indivíduos analisados; Na: número de alelos

20

5 Discussão

5.1 Detecção e análise dos microssatélites

O presente estudo teve por objetivo a identificação de marcadores moleculares do tipo

microssatélite no tubarão-tigre, Galeocerdo cuvier, obtidos com a aplicação de técnica de

sequenciamento de segunda geração. A partir de 71.059 sequencias reads obtidas do material

genômico da espécie G. cuvier, foi detectado um grande número de sequências que

apresentaram repetições dinucleotídicas, sendo que a prevalência deste tipo de repetição

também permaneceu após a seleção dos loci microssatélites, onde o software Batch Primer3

identificou 360 loci com repetição dinucleotídica dentre 615 loci analisados (55,5%). Tal

proporção foi mantida e ocorreu também após análise mais apurada no software Primer3, que

apresentou 75 loci microssatélites com repetição dinucleotídica dentre 159 loci (47,1%). Esta

alta frequência de dinucleotídios mostrou similaridade com resultados descritos em outros

trabalhos realizados com tubarões, como Carcharhinus longimanus – 75% (Mendes et al.

2015), Carcharhinus limbatus – 75% (Keeney & Heist 2003), Ginglymostoma cirratum –

55% (Heist et al. 2003) e com Mustelus canis – 75% (Giresi et al. 2012a).

Os 10 loci polimórficos caracterizados neste estudo possuem um conteúdo informativo

considerado alto. Neste contexto, é possível que a ampla presença de repetições

dinucleotídicas (90%) tenha contribuído para a alta taxa de polimorfismo encontrada. De

acordo com Eisen (1999), microssatélites são sequências que apresentam alta frequência de

mutações, originada pelo deslizamento da DNA polimerase durante a replicação e favorecida

pela natureza repetitiva da sequência das cópias dinucleotídicas, sendo estas geralmente mais

propensas a alterações no número de repetições em decorrência deste processo.

5.2 Caracterização de loci específicos desenvolvidos para G. cuvier

Apesar dos 10 loci identificados para esta espécie serem polimórficos, foi necessário

excluir o marcador TIG_6, uma vez que este evidenciou ligação com outro alelo no teste de

desequilíbrio de ligação (DL). A associação não aleatória entre alelos de loci ligados deve ser

considerada, uma vez que estes transmitem as mesmas informações genéticas, tornando

desnecessária a utilização de um dos pares dos loci ligados. De acordo com Ridley (2006), o

desequilíbrio de ligação pode existir em consequência da seleção que favorece indivíduos

com combinações particulares de alelos, loci fortemente ligados, deriva aleatória e

21

cruzamentos não aleatórios, o que leva ao aumento do índice de homozigotos e consequentes

desvios de ligação.

A média da heterozigosidade esperada (HE) identificada no tubarão tigre foi menor

que aquela encontrada em outras espécies de peixes marinhos, que apresentam médias

próximas a 0.79 (DeWoody et al. 2000). Outras pesquisas corroboram este fato e, de acordo

com Martin (1992), as taxas de mutação em tubarões apresentam valores mais baixos em

comparação com aqueles identificados em outros vertebrados. Neste trabalho, a

heterozigosidade observada foi maior que a heterozigosidade esperada, sugerindo um excesso

de heterozigotos em relação ao modelo de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). No tubarão

Ginglymostoma cirratum foi encontrada uma média da He e Ho de 0,53 e 0,54,

respectivamente, considerando 9 loci microssatélite, com um total de 45 alelos em 29

indivíduos, conforme descrito por Heist et al. (2003). No tubarão Prionace glauca Fitzpatrick

et al. (2011) descreveram valores médios de He e Ho de 0,59 e 0,58, respectivamente, em 10

loci microssatélites estudados, em um total de 110 alelos encontrados em 120 indivíduos. O

tubarão Carcharhinus limbatus apresentou valores de He de 0,54 e Ho de 0,53 em 15 loci

microssatélites estudados, segundo Keeney & Heist (2003), sendo que o número total de

alelos foi de 125 em 22 indivíduos analisados. No entanto, no trabalho por Bernard et al.

(2015), que analisou 40 indivíduos da espécie de tubarão tigre originário do arquipélago

havaiano, as médias encontradas foram de 0,68 e 0,67, o que é um pouco maior do que as

médias apresentadas no presente estudo.

Apesar dos valores de Ho e He registrados nos estudos apresentarem certas

semelhanças entre as espécies mencionadas, uma discrepância significativa é encontrado na

quantidade de alelos identificados em algumas espécies, mesmo entre os resultados aqui

descritos para o tubarão-tigre, que poderiam ocorrer devido a diferenças no número de

indivíduos e no número de loci analisados. Ainda assim, a variabilidade populacional da

espécie em questão também deve ser considerada. Deve ser considerado também que

possivelmente um alto grau de isolamento entre os grupos de amostras de tubarão tigre

avaliadas neste estudo e aquele apresentado por Bernard et al. (2015), podem refletir

diferenças populacionais de profundidade, incluindo os níveis de variabilidade genética. Tal

situação pode ser esperada ocorrer, uma vez que as amostras analisadas são provenientes de

diferentes Oceanos. Assim, a constatação de diferenças significativas nos níveis de

heterozigosidade entre os diferentes grupos não seria imprevista. O declínio da população

pode afetar a diversidade alélica, sendo que as diferenças alélicas encontradas podem ser

22

consideradas numa perspectiva de contribuição destes marcadores para caracterizar a estrutura

genética populacional das espécies, permitindo a sua avaliação atual e previsão futura, bem

como quantificar o impacto da exploração humana na variabilidade genética das espécies e,

assim, seu potencial evolutivo e resistência às mudanças ambientais.

O desvio no Equilíbrio de Hardy-Weinberg para os loci TIG_17 (0,71) pode ser

explicado por um valor significativo no coeficiente de endogamia intrapopulacional (Fis)

(Kordicheva et al. 2010). Este foi o único locus com um valor positivo para o Fis e os valores

positivos dão indícios de uma deficiência de heterozigotos (Holsinger & Weir 2009; Weir &

Hill 2002), que consequentemente resultaria em uma diminuição na variabilidade genética. A

presença de alelos nulos também é uma explicação para valores de desequilíbrio na equação

de Hardy-Weinberg quando se considera um locus microssatélite (Kordicheva et al. 2010).

Contudo, a presença destes elementos genômicos não foi detectada neste trabalho. Este fato é

considerado positivo, uma vez que poderia ser uma indicação de boa qualidade do marcador

utilizado. Neste sentido, outra análise genética que também pode indicar um marcador de alta

qualidade é o Índice de Polimorfismo (PIC), o qual se mostrou altamente informativo para

todos os loci. Apesar do número de alelos ter sido baixo em comparação àqueles obtidos em

alguns estudos com tubarões, o índice de polimorfismo foi alto, o que pode ter ocorrido

porque este índice não depende apenas do número de alelos, mas também da sua frequência

para cada marcador (Guo & Elston 1999).

5.3 Amplificação heteróloga

Muitos estudos vêm utilizando primers heterólogos, que se referem a marcadores

descritos para uma determinada espécie e utilizados em outras espécies devido principalmente

à falta de marcadores específicos ou ao alto custo e tempo para o desenvolvimento de primers

espécie – específicos para loci microssatélites, (Oliveira et al. 2006). A transferabilidade dos

marcadores pode ser extremamente alta quando aplicada em espécies ou gêneros

filogeneticamente relacionados.

Os marcadores microssatélite identificados para a espécie G. cuvier foram testados,

com a aplicação da técnica de amplificação heteróloga em amostras de material genético de

três espécies de tubarões que estão inseridos na lista vermelha da IUCN, Carcharhinus

longimanus e Alopias superciliosus que estão identificadas como ‘’vulneráveis’’ e

Carcharhinus acronotus que está classificada como ‘’quase ameaçada’’. Para a espécie

Alopias superciliosus não há loci SSRs espécie-específicos. Os resultados mostram que as três

23

espécies testadas apresentaram amplificação positiva após avaliações no gel de agarose.

Contudo, os resultados obtidos após a genotipagem evidenciaram que a maioria dos loci são

monomórficos para as três espécies analisadas, sendo C. acronotus a espécie mais bem-

sucedida com relação à transferabilidade, com 2 loci polimórficos (TIG_17, TIG_5). Para as

espécies C. longimanus e A. superciliosus foi observado apenas 1 locus polimórfico para cada

uma delas, TIG_15 e TIG_7, respectivamente.

Em outros trabalhos onde também foram realizadas tentativas de amplificação

heteróloga com estas três espécies, o resultado obtido foi similar. No trabalho de Fitzpatrick et

al. 2011, foram desenvolvidos dez loci espécie-específicos para o tubarão Prionace glauca e

na amplificação cruzada para o tubarão C. acronotus foram obtidos apenas dois loci

polimórficos em quatro indivíduos e para o tubarão C. longimanus obteve-se apenas um locus

polimórfico em quatro indivíduos. Em um estudo desenvolvido por Taguchi et. al (2013)

foram identificados quinze loci espécie-específicos para o tubarão Isurus oxyrinchus e na

amplificação cruzada com o tubarão A. superciliosus, apenas dois loci com oito indivíduos

tiveram uma amplificação satisfatória.

Apesar destes resultados terem demonstrado um baixo polimorfismo na amplificação

heteróloga, outros estudos têm demonstrado resultados satisfatórios, nos quais a taxa de

sucesso foi de 31,8% a 95,5%, diminuindo a taxa de sucesso proporcionalmente com o

aumento da distância evolutiva entre as espécies (Maduna et al. 2014). De acordo com

Barbara et al. (2007), a amplificação heteróloga com marcadores polimórficos pode ser

esperada na maioria dos grupos de animais, dentro e entre os gêneros e até mesmo entre

diferentes famílias. Nos resultados do presente estudo, a hipótese da utilização de uma

amostragem com baixa quantidade de indivíduos poderia explicar o fato dos resultados não

serem totalmente corroborados. Assim, com a complementação da amostra, espera-se que

mais alelos possam ser encontrados.

Considera-se, pois que os marcadores identificados e apresentados neste estudo

possam auxiliar nas avaliações globais destas espécies, possibilitando a elaboração de

programas de planejamento adequados para a sua preservação, considerando o potencial

evolutivo de cada uma de suas populações, além de contribuir com o conhecimento científico

biológico de um grupo taxonômico ainda pouco explorado.

24

6 Considerações Finais

A metodologia de sequenciamento de segunda geração (pirosequenciamento) se

mostrou muito eficiente quando aplicada na identificação de marcadores moleculares do tipo

microsatélite em uma espécie de tubarão, Galeocerdo cuvier, visto que gerou uma grande

quantidade de sequencias reads a partir de duas amostras de DNA total em um curto espaço

de tempo e com custo relativamente baixo. Foram identificados trinta loci para a espécie,

possibilitando o desenvolvimento de 10 marcadores polimórficos e 9 independentes de

ligação, que se mostraram funcionais para o tubarão-tigre. A aplicação da técnica de

amplificação heteróloga utilizando as sequências microssatélites identificadas para a espécie

G. cuvier em amostras de material genético de outras espécies de tubarões, Carcharhinus

longimanus, Carcharhinus acronotus e Alopias superciliosus revelaram que alguns destes loci

também são funcionais na detecção de polimorfismos nestas espécies.

De modo geral, os marcadores microssatélites identificados são de extrema

importância para futuros estudos sobre sua estrutura genética populacional, tanto para a

espécie em questão da qual foram identificados os marcadores, como para outras espécies de

tubarões de espécies ou gêneros proximamente relacionados, constituindo-se numa ferramenta

de grande utilidade no desenvolvimento de programas voltados para o manejo das populações

e sua conservação.

25

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33

8. Material Complementar

O presente trabalho teve como material complementar o isolamento de marcadores

moleculares microssatélites para espécie Carcharhinus longimanus (Apêndice I), publicado

com o título “Microsatellite loci in the oceanic whitetip shark and cross-species amplification

using pyrosequencing technology” (DOI 10.1007/s12686-015-0435-5). Tais marcadores

poderão ser aplicados em abordagens do DNA nuclear para avaliações da variabilidade

genética, estruturas populacionais, fluxo gênico, além de questões parentais, tais como

identificações de paternidade múltipla e partenogênese.

Ainda, houve o desenvolvimento de material didático sobre os tubarões, sua conservação e

seu papel ecológico, direcionado aos estudantes do ensino básico. Seu resultado é apresentado

no Apêndice II e originou a cartilha com o ISBN: 9798-85-919272-0-3, intitulada “Tubarões:

ameaça ou ameaçados?”.

34

Apêndice I

39

Apêndice II

Identificação de marcadores microssatélites para o tubarão ...

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