I - Extração e Caracterização Espetroscópica Da Mioglobina Da Carne
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Extração e Caracterização Espetroscópica da Mioglobina da CarneBioquímica Experimental II
Faculdade de CiênciasLicenciatura em Bioquímica
PL23 | Grupo 1
2013/2014
Alexandra Lança 43230
Olena Mukan 44359
Patrícia Antunes 43149
Patrícia Sequeira 43242
Docente: Maria Luísa Serralheiro
Mioglobina
Objetivos Gerais
• Extração e identificação das formas reduzida e oxidada da Mioglobina através das
duas propriedades espetrais.
• Estudo das reações redox de interconversão das espécies.
2
Mioglobina
• Proteína monomérica
• Massa molecular: 16,949Da
• Armazenamento e transporte de oxigénio
• Possui um grupo heme
• Músculos cardíaco e esquelético
Figura 1 – Diversas representações daestrutura da Mioglobina.
3
Figura 2 – Representação da estrutura da Mioglobina.
4
Transporte de Oxigénio
Oxigénio pouco solúvel em soluções
aquosas
Difusão do oxigénio pelos tecidos é
ineficiente
Nenhuma das cadeias laterais das proteínas é
adequada para a ligação reversível do
oxigénio.
Metal de Transição
FerroCobre
Têm de possuir elevada tendência para ligação
ao oxigénio
5
Ferro nas proteínas
Ferro Livre Espécies altamente reativas de oxigénio
Danos no DNAe noutras moléculas
Ligação a estruturas que sequestram e/ou o tornam menos reativo.
Grupo Heme Composto associado de modopermanente a uma proteína eque contribui para a funçãodessa proteína.
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Grupo Heme
Complexa estrutura orgânica em anel: porfirina IX À qual está ligada um único átomo de Fe no estado ferroso.
Carácter doador deeletrões pelo que ajudama impedir a conversão doferro do heme (estadoferroso) para férrico.
Estado ferroso: liga o oxigénio de forma reversível.Estado férrico: não liga o oxigénio.
Figura 3 –Grupo Heme.7
Met-Mb e Oxy-Mb
Figura 4 – Representação dasduas ligações de coordenaçãodo Fe²⁺ perpendiculares aoplano do sistema do anel daporfirina.
8
Met-Mb e Oxy-Mb
Met-Mb Oxy-Mboxidação
redução
[FeIII-H2O-Mb][FeII-O2-Mb]
Figura 5 – Representação da forma Met-Mb. Figura 6 – Representação da forma Oxy-Mb.9
Procedimento
Esquema 1– Procedimento do trabalho realizado.10
Met-Mb e Oxy-Mb
Solução A
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de potássio,
conduzindo à produção de Met-Mb:
Fe2+-O2-Mb + K6[FeCN6] Fe3+-H2O-Mb (Equação 1)
Solução B
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito de sódio,
conduzindo à produção de Oxy-Mb:
Fe3+-H2O-Mb + Na2S2O4 Fe2+-O2-Mb (Equação 2)
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Análise dos Espetros
• Sobrenadante• Solução A• Solução B
Análise dos Espetros
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Espetros de Absorção no UV-Visível
Amostra Região Visível Região de Soret
Met-Mb 635nm 504nm 409nm
Oxy-Mb 580nm 542nm 417nm 348nm
Quadro 1 – Picos de absorção das formas da mioglobina na região do visível e na região de Soret.
𝜀409𝑛𝑚𝑀𝑒𝑡−𝑀𝑏 = 179 𝑚𝑀−1. 𝑐𝑚−1
𝜀417𝑛𝑚𝑂𝑥𝑦−𝑀𝑏
= 128 𝑚𝑀−1. 𝑐𝑚−1
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Espetros de Absorção no UV-Visível - Sobrenadante
Figura 7 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para oSobrenadante. Foram lidas as absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 8 – Espectro de Absorção (UV-Vis) do Sobrenadante. Fonte:Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.
14
Espetros de Absorção no UV-Visível – Solução A
Figura 9 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para asolução A (Met-Mb). Foram lidas absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 10 – Espectro de Absorção (UV-Vis) da Solução A (Met-Mb). Fonte: Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.
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Figura 11 – Espectro de Absorção (UV-Vis) obtido para asolução B (Oxy-Mb). Foram lidas absorvências noscomprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,409nm e 417nm.
Figura 12 – Espectro de Absorção (UV-Vis) da Solução B (Oxy-Mb). Fonte: Artigo “Microburger Biochemistry: Extraction and SpectralCharacterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas andLaura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, KansasState University, Manhattan, KS 66506”.
Espetros de Absorção no UV-Visível – Solução B
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Registo das Absorvências
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Sobrenadante
1/3
635 0,172
542 0,523
505 0,395
580 0,488
409 3,152
417 3,222
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Solução A
1/5
635 -0,005
542 0,009
505 0,028
580 -0,002
409 0,801
417 0,533
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Solução B
1/5
635 -0,003
542 0,05
505 0,022
580 0,049
409 0,415
417 0,499
Quadro 2 – Registo das absorvênciasmedidas para o sobrenadante nosrespetivos comprimentos de onda apósleitura dos espetros.
Quadro 3 – Registo das absorvênciasmedidas para a solução A nos respetivoscomprimentos de onda após leitura dosespetros.
Quadro 4 – Registo das absorvênciasmedidas para a solução B nos respetivoscomprimentos de onda após leitura dosespetros.
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Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer: Abs=εlc
Solução A
Abs –Absorvência (a 409nm registou-se 0,801) - Coeficiente de absorção molar (=179mM-1.cm-1)c –Concentração de Met-Mbl – percurso ótico (l=1 cm)
𝐴𝑏𝑠 = 𝜀𝑙 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 ↔
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 =𝐴𝑏𝑠
𝜀𝑙↔
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 =0,801
179 × 1↔
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 = 4,47 × 10−3𝑚𝑀
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 × 5 ↔
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 4,47 × 10−3 × 5 ↔
𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = 2,235 × 10−2𝑚𝑀 = 2,235 × 10−5𝑀
Como a solução A sofreu uma diluição de 1:5 tem-se que a concentração de Met-Mb é:
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Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer
A massa molecular da mioglobina é 16949 g/mol, como a Met-Mb possui na
sua constituição água tem-se que a massa molar da Met-Mb corresponde a
16949+2x1+15,999=16966,99gmol-1:
𝑚 = 𝑀 × 𝑛 ↔
𝑚 = 16966,99𝑔/𝑚𝑜𝑙 × 2,235 × 10−5𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿 ↔ 𝑚 = 0,3792 𝑔𝐿−1
𝑚 = 0,3792 𝑚𝑔/𝑚𝐿
Como o volume de amostra recolhido na SEC foi de 1,2mL obtém-se a massa de Met-Mb:
𝑚 = 0,3792𝑚𝑔
𝑚𝐿× 1,2𝑚𝐿 = 0,4550𝑚𝑔
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Determinação da massa de proteína nas soluções A e B: Lei de Lambert-Beer
Para a solução B, correspondente à Oxy-Mb foram aplicados os mesmocálculos.
Solução A (Met-Mb) Solução B (Oxy-Mb)
Comprimento de onda utilizado (nm) 409 417
Absorvência 0,801 0,499
(mM-1.cm-1) 179 128
[proteína] M 2,235 × 10−5 1,949 × 10−5
Massa molar (g/mol) 16966,99 16964,99
Volume recolhido (mL) 1,2 2,8
Massa (mg) 0,4550 0,9257
Quadro 5 –Comparação de diversos parâmetros para determinação da massa de proteína entre as soluções A e B.
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Doseamento proteico
• Método de Lowry
• Método do Biureto
• Método de Bradford
• Sobrenadante
• Solução A
• Solução B
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Método de Lowry
• Técnica com o objetivo de determinar a concentração proteica numa determinada
solução recorrendo ao reagente Folin Ciocalteau.
Solução proteica Reagente de FolinCiocalteau
Complexo de cor Azul
Condições alcalinas
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Método do Biureto
Amostra de proteína contendo duas ou mais
ligações peptídicas.
Reagente de Biureto(Sulfato de Cobre Alcalino)
Complexo púrpura
• Leitura das Absorvências a 280nm.• Construção de uma reta de calibração.
Os extratos celulares contém muitos outros compostos que absorvem a 280nm.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑚𝑔.𝑚𝐿−1 = 1.55𝐴280𝑛𝑚 − 0.76𝐴260𝑛𝑚 23
Método de Bradford
Resíduos de aminoácidos com cadeias laterais básicas/aromáticas
Corante Coomassie BlueG-250
Coloração Azul
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Método Biureto Lowry Bradford
Exactidão Alta Média Mais alta que Lowry
Especificidade
Para compostos com
2 ou mais ligações
peptídicas
Reage com resíduos de
tirosina e triptofano.
Suscetível a agentes
interferentes
Reage com resíduos de
aminoácidos com
cadeias laterias
básicas/aromáticas
Rapidez da Execução Lenta Média Rápido
Precisão Preciso Preciso Preciso
Quadro Resumo dos Métodos
Quadro 6 –Comparação dos três métodos de doseamento proteico.
25
Preparação da Curva de Calibração
Solução (mL)
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11BSA(0,35
mg/mL)
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0 0
Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30 0,40
Água 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20 0,10
Reagente C 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.
Reagente D 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
DEIXAR REPOUSAR À TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINUTOS.
Volume final 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25
Quadro 7 –Composição dostubos utilizadospara o métodode Lowry.. 26
Preparação da Curva de Calibração
Tubos Absorvência
Registada
1 0,000
2 0,093
3 0,182
4 0,278
5 0,324
6 0,400
7 0,520
Determinação da concentração de
proteína padrão em cada tubo:
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 2=[𝐵𝑆𝐴] × 𝑉(𝐵𝑆𝐴)𝑎𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜
𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑛𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜↔
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 2=0,35 × 0,05
3,25= 0,0054 𝑚𝑔/𝑚𝐿
Quadro 8 – Registo das absorvências relativasaos tubos para construção da reta de calibração.
27
Curva de Calibração
Tubos Absorvência [proteína]
(mg/mL)
1 0,000 0,0000
2 0,093 0,0054
3 0,182 0,0108
4 0,278 0,0162
5 0,324 0,0215
6 0,400 0,0269
7 0,520 0,03230
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 0,0350A
bs
(75
0n
m)
[proteína]/tubo (mg/mL)
Curva de Calibração - Método de Lowry
y = 15,361x + 0,0086
R² = 0,992
Quadro 9 – Registo das absorvências econcentrações proteicas determinadas relativasaos tubos para construção da reta de calibração.
Gráfico 1 – Reta de Calibração para o método deLowry.
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Determinação da concentração proteica
SobrenadanteTubos Absorvência
8 0,480
9 0,789
10 1,025
11 1,231
y=mx+b y=Abs e x=[proteína]
Abs=m[proteína]+b
Com m=15,361 e b=0,0086
Exemplo Tubo 8:
𝐴𝑏𝑠𝑡𝑢𝑏𝑜 8 = 𝑚[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8+𝑏 ↔ [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=𝐴𝑏𝑠𝑡𝑢𝑏𝑜 8−𝑏
𝑚↔
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=0,480−0,0086
15,361↔ [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎]𝑡𝑢𝑏𝑜 8=0,031 mg/mL
Quadro 10 – Registo das absorvênciasdos tubos com as amostras relativas aosobrenadante.
29
Determinação da concentração proteica – Fatores de Diluição
Inicialmente realizou-se uma diluição de 1:20 para análise
espetrofotométrica e para o doseamento proteico, então à concentração
determinada pelo método de Lowry multiplica-se o fator de diluição que tem o valor
20:
𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(1) = 𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 × [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] 𝑡𝑢𝑏𝑜 8↔
[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] 𝑡𝑢𝑏𝑜 8= (1) 20× 0,031 ↔ 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(1) = 0,6138 mg/mL
30
Determinação da concentração proteica – Fatores de Diluição
Quando adicionada a amostra aos tubos de ensaio a analisar, deu-se uma
nova diluição devido à presença do reagente C, do reagente D e da água. Assim é
necessário determinar o fator de diluição:
𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑎 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜
𝑓𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜=0,1
3,25= 0,030769
𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 8(2) = 0,6138 ×1
0,030769= 19,95 𝑚𝑔/𝑚𝐿
Volume de amostra = 0,1 mLVolume total do tubo = 3,25 mL
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Registo das concentrações proteicas - Sobrenadante
O mesmo procedimento foi aplicado a todos os restantes tubos do
sobrenadante, da solução A e da Solução B.
Tubos Absorvência 1º Fator diluição 2º Fator diluição [proteína] final (mg/mL)
8 0,480 1/20 0,0308 19,95
9 0,789 1/20 0,0615 16,51
10 1,025 1/20 0,0923 14,34
11 1,231 1/20 0,1231 12,93
Quadro 11 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativasao sobrenadante.
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Registo das concentrações proteicas – Solução A
Tubos Absorvência 1º Fator de Diluição 2º Fator de Diluição [proteína] final
8 0,566 1:5 0,0308 5,897
9 0,940 1:5 0,0615 4,926
10 0,186 1:5 0,0923 0,625
11 1,425 1:5 0,1231 3,746
Quadro 12 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativas à solução A.
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Tubos Absorvência 1º Fator de Diluição 2º Fator de Diluição [proteína] final
8 0,439 1:5 0,0308 4,553
9 0,657 1:5 0,0615 3,430
10 0,882 1:5 0,0923 3,080
11 1,075 1:5 0,1231 2,820
Registo das concentrações proteicas – Solução B
Quadro 13 – Registo das absorvências, diluições e concentração proteica final relativas à solução B.
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[Proteína]
mg mL-1
[Met-Mb]
mg mL-1
[Oxi-Mb]
mg mL-1
Mproteína
(mg)
η (%) Grau de
Purificação
Sobrenadante 19,95 - - 19,95 100 1
Solução A 5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,023
Solução B 4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0464
Quadro de purificação
𝜂 =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝐴
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒× 100
𝐺𝑟𝑎𝑢 𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎ção =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑀𝑒𝑡 − 𝑀𝑏 𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝐴
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑏𝑟𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒
Quadro 14 –Quadro de purificação.
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• http://www.uniprot.org/uniprot/P02192 consultado a 21/03/2014 14h19• http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1 consultado a 21/03/2014 14h34• http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html consultado a 22/03/2014
15h20
Bibliografia
36