2.1. Extração de Enzimas

Empregaram-se folhas jovens de mudas mantidasem casa de vegetação e folhas maduras, sem lesões, deárvores adultas, de plântulas obtidas por microculturae a partir de sementes. As sementes foram tratadas comhipoclorito de sódio (300 ppm de cloro ativo), lavadasem água destilada, colocadas sobre papel de filtro úmidoem placas de Petri, por dois ou três dias, e utilizadasapós a germinação. As microculturas de brotações epi-

-- 425

ISOENZIMAS DE Eucalyptus: TÉCNICASPARA EXTRAÇÃO E ELETROFORESE*

Ingrid PetersCNPF / EMBRAPA - Curitiba - PR - BrasilAcelino Couto AlfenasUniversidade Federal de ViçosaViçosa - MG - BrasilAparecida Maria MoreiraBahia Sul CeluloseTeixeira de Freitas - BA - BrasilFrancisco de Assis RibeiroCAF - Bom Despacho - MG - BrasilFrancisco Carlos GiIIi MartinsAracruz Florestal S/AAracruz - ES - Brasil

RESUMOO objetivo do presente estudo foi determinar os

métodos mais adequados para a extração e a separaçãoeletroforética de isoenzimas de eucalipto. Examinaram-

* Trabalho apresentado no 6." Congresso Florestal Brasilei-ro. realizado em Campos do [ordão - São Paulo - Brasil, de22 a 27 de serem bro de 1990.

se zimogramas em gel de amido, obtidos a partir deextrato de folhas, de pólen e de plântulas mantidas pormicropropagação e de plântulas obtidas de sementes.Testaram-se quatro métodos mecânicos para a macera-ção dos tecidos vegetais, cinco sistemas - tampão paraa extração das enzimas e 16 sistemas-tampão (gel/eletrodo) para a eletroforese. São apresentados e dis-cutidos os resultados obtidos com o uso dos sistemas-tampão na identificação de 37 enzimas nos quatro ma-teriais mencionados. Este trabalho fornece uma escolhade marcadores isoenzimátios aplicáveis no melhoramen-to de eucalipto.

1 - INTRODUÇÃO

A descrição da estrutura genética de populaçõesvegetais naturais ou cultivadas depende da disponibili-dade de marcadores que demonstram a variabilidadenelas presente. Os marcadores genéticos podem ser mor-fológicos ou químicos. As isoenzimas são marcadoresquímicos que representam enzimas estruturalmente dis-tintas, mas compatíveis com um mesmo substrato. Ge-ralmente são controladas por um ou por poucos lócusgênicos que, por sua vez, são identificáveis por meiode análise de segregação.

A herança de marcadores isoenzimáticos tem sidodescrita em numerosas espécies florestais (NEALE etalii, 1984; BROWN et alii, 1985). A análise de isoenzi-mas nas espécies florestais tem proporcionado informa-ções importantes sobre a variabilidade genética dentroe entre populações (LlNHAET et ali i, 1981; HAM-RICK e LOVELESS, 1986; GURIES e LEDIG, 1979;YEH et ali i, 1976), sobre os sistemas de cruzamento(BROWN et alii, 1975; FRIPP et alii, 1987) e sobreas relações taxonômicas entre espécies (COPES e BECK-WITH, 1977; YEH e ARNOTT, 1986; BURGUESS eBELL, 1983 e 1985). A utilização de isoenzimas comomarcadores genéticos tem, ainda, gerado informaçõesque permitem determinar métodos mais eficientes demelhoramento, e tem, também, orientado o manejo e aconservação de recursos genéticos florestais (BROWNe MORAN, 1981; FRYER, 1987, MITTON et alii,1979).

Neste estudo procurou-se determinar os métodosmais adequados para a extração e a separação eletro-forética de isoenzimas de Eucalyptus spp., para queesses marcadores possam ser utilizados no monitora-mento da diversidade genética em populações-base nomelhoramento e na produção de sementes híbridas.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

mas I, 11, III, IV, V. VI, VII, VIII, IX e X. Utilizaram-se os quatro tampões de extração mencionados no item3. Verificou-se, ainda em que fatia do gel obtém-se amelhor resolução para estas enzimas.

Com base nos resultados dos testes preliminares,passou-se a utilizar o tampão D para a extração dasenzimas nos quatro tecidos. Testaram-se, então, nove ..sistemas eletroforéticos em combinação com 36 enzirnas,Os nove sistemas incluíram o I e o IV já mencionadose os sistemas adicionais XI, XII. XIII. XIV, XV e XVI(Tabela I).

córmicas foram cedidas pela Companhia Aracruz Flo-restal e multiplicadas na Universidade Federal de Vi-çosa. O pólen foi extraído de anteras por agitação emágua destilada, sedimentado por centrifugação e ressus-penso nos tampões de extração de isoenzimas descritosposteriormente. A suspensão de pólen foi utilizada ime-diatamente ou armazenada a -20°C.

2.2. Métodos de Extração

Compararam-se os métodos de trituração em homo-geneizador de vidro, em Polytron e o manual, usando-sefolhas previamente cortadas em finas tiras. O homoge-neizador de vidro consiste de um pistão rotativo, quefricciona o material contra as paredes de um tubo devidro mantido em banho de gelo. O triturador Polytronpossui lâminas rotativas protegidas por um envólucrometálico. Para a trituração no Polytron, o material foicortado em pequenas seções e colocado imeditamenteem solução-tampão, contida em um tubo de ensaio man-tido em banho de gelo.

. Testaram-se dois métodos de trituração manual. Noprimeiro utilizou-se uma placa de acrílico (12 X 12 em)com escavacões (2 em de diâmetro e 0,5 cm de profun-didade), nas quais as amostras foram trituradas com oauxílio de um bastão de vidro. A placa foi mantida so-bre uma barra de gelo. No segundo, o material foi tri-turado em almofariz de porcelana previamente mantidono congelador (- 20UC). Após a trituração, o extratofoi filtrado mediante o uso de um pedaço de lenço depapel colocado sobre o macerado. A trituração de plân-tulas foi feita sempre em placa de acrílico dado o pe-queno tamanho desse material. Em todos os métodos oextrato protéico foi absorvido em tiras (12 X 5 mm)de papel crornatográfico Whatrnan :5 MM e armazena-das em tubos Eppendorf a - 20UC para uso posterior(ALFENAS,et alii. 1990).

2.3. Tampões de Extração

Para a extração das enzimas, testaram-se as seguin-tes soluções. assim denominadas: tampão A (BROWNet alii, 197'5), tampão B (ARULSEKAR e PARFITT,1986), tampão C (MARTY et alii, 1984), tampão D(PARKS et alii, 1983) e tampão E (J. L. HAMRICK,manual de laboratório não publicado). A constituiçãodesses tampões e das demais soluções utilizadas nessetrabalho foram previamente descritas por ALFENASet alii (1990).

2.4. Eletroforese

A eletroforese foi conduzida em géis de amido a13 %, preparados com as soluções-tampão próprias paracada sistema. Após a eletroforese, cada gel foi cortadohorizontalmente em fatias individuais que foram imer-sas nas soluções específicas para a revelação de cadaenzima (ALFENAS et alii. 1990).

2.4.1. Seleção de Sistemas-Tampão para aExtração de Enzimal e para a Eletroforese

Realizaram-se teste preliminares avaliando-se a ati-vidade, migração e resolução das enzimas ACP, ADH,CL-EST. {3-EST, GDH, GOT, MDH e PGI com os siste-

3 - RESULTADOS

3.1. Métodos de Extração

Dentre os quatro métodos de extração testados, atrituração manual, em almofariz de porcelana, de pólene folhas obtidas de microcultura, folhas de mudas oufolhas de plantas adultas, preservou melhor a atividadecnzimática .

A trituração em almofariz de porcelana requer umvolume menor de tampão de extração do que a homoge-neização com pistão de vidro ou com o Polytron, e per-mite obter-se extratos mais concentrados. Além disso, aobtenção do extrato pelos dois métodos mecânicos émais demorada. pois requer centrifugação para a elimi-nação de detritos. É possível que a manipulação maisdemorada do extrato por esses métodos tenha favorecidoa perda de atividade das enzimas. A trituração de folhase pólen em placa de acrílico e bastão de vidro forneceuresultados comparáveis à trituração em quando se de-seja preparar poucas amostras. ou quando o material épor natureza pequeno.

3.2. Tampão de Extração

O tampão de extração D (P ARKS et alli, 1983) foio que melhor conservou a atividade enzirnática em extra-tos foliares, passando a ser utilizado rotineiramente nostestes posteriores. O tampão C foi superior aos demaispara as enzimas MDH e ADH de plântulas. Os tam-pões A, C e E não serviram para a extração ~e e~z.imasde folhas. O tampão B tampão tornou-se mais eficientequanto à resolução das bandas ao se aumentar .0 volu.meutilizado em relação à quantidade de material Ioliar.Em compensação, a diluição do extrato tornou as ~a~l-das menos intensas. O tampão de extração e a posiçaoda fatia do gel influenciaram a resolução de determina-das enzimas (Tabela 2).

3.3. Sistemas Eletroforéticos

Os sistemas IV, V e V I não proporcionaram migra-cão suficiente das enzimas no gel para permitir a separa-~ão das bandas (Tabela 3), formando-se junto à origem.O sistema II destacou-se como o melhor para ADH,n-EST. j:I-EST e PG I nos tecidos em que essas enzimasmostraram atividade. O sistema VI I I mostrou bons re-sultados para GDH e GOT e para ACP. exceto em pólen.M ui tas cornbinacões enzimaltecido/sistema eletroforéti-co não proporcionaram a formação de bandas de ativi-dade nos géis: outras geraram bandas de baixa resolu-ção. Os sistemas I e VI foram incluídas no segundo gru-

42b ~~ _

po de sistemas eletroforéticos testados. Nessa segundaetapa, a estração das enzimas foi feita, manualmente,triturando-se as folhas, as microculturas e o pólen, emalmofariz de porcelana, com o tampão D, sobre gelo. NaTabela 4 encontram-se os resultados dos ensaios com as36 enzirnas. Como os resultados dos ensaios preliminarespara {:J-EST foram em geral inferiores aos obtidos paran-EST. a primeira não foi incluída nos testes subse-qüentes. Adotou-se um sistema de notas na descriçãodos zirnogramas. Para cada enzima escolheram-se osquatro melhores sistemas eletroforéticos, sendo a notamáxima I. Para as enzimas com mais de quatro siste-mas recomendáveis, as notas foram repetidas. Os sis-temas que não funcionaram ou que não proporcionaramresolução suficiente estão identificados na Tabela 4 porum asterisco, e os não testados foram assinalados comsinal ncgativo.

Como nem todas as enzimas foram ativas nos qua-tro materiais estudados e os sistemas eletroforéticos nãoforam igualmente apropriados para esses tecidos, serãodiscutidos, em seguida, os resultados obtidos para cadaenzima separadamente.

3.4. Enzimas

Aconitase (ACO - EC 4.2.1.3): encontrou-se ati-vidade de aconitase apenas em microcultura. Os siste-mas I e III proporcionaram os melhores resultados paraesse material.

Álcool desidrogenase (ADH - EC 1.1.1.1): nãose detectou atividade de ADH em extratos foliares. Ossistemas X I e X II foram os melhores para descrever aADH em microcultura e plântulas. Todos os sistemasmostraram atividade de ADH em pólen, mas apenas osistema I XV separou duas zonas de atividade para estasenzirnas, nesse material.

Aldolase (ALD - E 4.1.2.13): o sistema XII re-sultou em uma banda forte para microcultura, plântulase pólen. Os sistemas I e XIV mostraram bandas debaixa intensidade, porém separaram três bandas distin-tas para rnicrocultura. com melhor resolução no últimosistema. Não se encontrol atividade de ALD em folhas.

Alanina desidrogcnasc (ALDH - EC 1.4.1.1):' ossistemas X I e X I I mostraram bandas de boa resolucãopara folhas. microcultura e pólen. O pólen formou ban-das de coloração negativa no gel , as quais não foramatribuídas à cnzirna A LDH.

Cutalase (CAT - EC 1.11.1.6): não houve ativi-dade nos tecidos examinados.

Diaiorase (VI A - EC /.6.4.3): houve atividadede DIA detectável em folhas, microcultura e plântulas,sendo mais intensa nas primeiras. A resolução das ban-das foi baixa nos sistemas XIV e XV\. Não se forma-ram zimogramas aproveitáveis pelos demais sistemas. Opólen não formou bandas. mas apresntou atividade dediaforase.

Endopeptulase (ENP -- EC 3.4.. ): não houveatividade nos tecidos examinados.

Enzima málica (ME - EC /.1.1.40): a enzima má-lica pode ser muito útil como marcador genético em

pólen, se for polimórfica. Houve muita atividade e boaresolução em bandas de ME de pólen nos sistemas VI,XI, XII, XII I e XIV. O sistema 1I1 mostrou duas ban-das de ME em microcultura, as quais não são separadaspelos sistemas XI e XII. Os demais sistemas não for-mararn bandas para microcultura. Ao se analisar poli-morfismo em clones de E. cloezina observou-se quealguns não apresentaram atividade de ME em folhas.Para folhas, os melhores resultados foram com o sis-tema XIII.

«-Esterase (a-EST - EC 3.1.1.1): a resolução e aatividade nos zimogramas de folhas e microcultura fo-ram ótimas ao se usar o sistema VI. As bandas perde-ram resolução no sistema XVI e perderam intensidadee migração no sistema I. A resolução foi pobre nossistemas III e XII.

Fenil-ulanina-prolina peptidase (PEP-PAP - EC.3.4.13): obtiveram-se bons resultados com as enzimas

PEP-PAP usando os sistemas 1I1 e XII. Pouca atividadedestas enzimas foi revelada no sistema 6. Não foramtestados os sistemas XI, XIII e XV. Os demais siste-mas não formaram bandas de PEP-PAP nos géis.

Fosiatase ácida (ACP - EC 3.1.3.2): os sistemasX I e X II ofereceram a melhor atividade e resoluçãopara as bandas de ACP nos quatro materiais examina-dos. Os sistemas XI, XI I e V I são igualmente aconse-lháveis pará" microculturas. As plântulas oriundas desementes apresentaram pouca ou nenhuma atividade deACP. Quando presentes, as bandas de ACP foram fra-cas, mas de boa resolução. Com o sistema XI, as plântu-Ias exibiram uma banda adicional marrom e nítida, quenão parece ser atribuível a pigmentos. O extrato depólen originou uma banda intensa e uma outra difusacom menor migração.

Fosiatase alcalina (ALP - EC 3.1.3.1): não houveatividade nos tecidos examinados.

Fosloglucoisomerase (PGI - EC 5.3.1.9): o siste-ma X III mos! rou três bandas fortes e uma mais fracana amostra de pólen examinada. Os demais sistemasmodificaram esse padrão de bandas em número ou mo-bilidade. Nos sistemas I, XIV e XV detectaram-se duasregiões de atividade para extratos de folhas, microcul-tura e plântulas, as quais não são separadas nos outrossistemas. Os sistemas I e I I I não mostraram a atividadede PGl em plântulas. Nos sistemas III, XI, XII e XV,extratos de pólen formaram bandas secundárias, demenor migração, repetindo o padrão das bandas prin-cipais. Estas bandas podem representar artefatos oumodificações induzidas a estas isoenzimas por essessistemas.

Fosjogluconato desidrogenase (6-PGDH - EC1././.44): os sistemas I e X II mostraram atividade de6-PGDH em folhas. microcultura e pólen. Microculturaapresentou atividade mais alta. Os sistemas VI, XIV eXV I não proporcionaram a formação de bandas. O sis-tema I separou duas bandas distintas para microcul-tura e pólen, o que os outros sistemas não fizeram.

Fosjoglucomutose (PGM - EC 2.7.5.1): os siste-mas XIV c XV foram eficientes para demonstrar PGM

____________________________________________________________________________________________~~27

de folhas, microculturas e pólen. Formaram-se duas re-giões de atividade. Somente os sistemas XI e XII mos-traram atividade de PGM em plântulas. Os sistemas VI,XIII e XVI apresentaram atividade somente para pólen.As bandas de PG M colapsam em uma única região nossistemas I I I, XI e XI I, apesar de migrarem bastante.Bandas secundárias foram observadas para pólen nossistemas XI e XII.

Fumarase (FUM -- EC 4.2.1.2): microcultura epólen formaram duas bandas bem separadas e de boaresolução nos sistemas X I e XI I. Os sistemas VI e XII Imostraram baixa atividade e resolução nesses dois teci-dos. Os demais sistemas não serviram. As folhas e asplântulas não apresentaram atividade de fumarase.

Galactose desidrogenase (GLDH - EC 1.1.1.48):as folhas e o pólen mostraram atividade de GLOH comos sistemas 111, XI e XII, e muito fracamente, também,com sistema XIII. Nos sistemas T, XV e XIV houve for-mação de banda somente para o pólen. Os zirnogramasmostraram apenas uma zona de atividade. Não se encon-trou atividade de GLOH ao se usarem os sistemas VIe XVI.

a-Glicerofosfato desidrogenase (n-GPDH - EC1.2.1.8): o sistema X li proporcionou uma banda comboa resolução em microcultura e pólen. Os sistemas I eXIV mostraram uma banda com baixíssima atividadepara microcultura. Os demais tecidos ou sistemas nãodemonstraram atividade desta enzima.

Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (G3PDH -EC 1.2.1.12): esta enzima pode ser uti-lizada para mi-crocultura (sistemas VI e XII) e pólen (sistema XII). Osdemais tecidos apresntaram fraquíssima ou nenhumaatividade de G3POH. Não foi detectada atividade destaenzima em folhas e plântulas.

Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH - EC1.1.1.49): nenhum dos nove sistemas testados revelouatividade de G6POH em plântulas. Para folhas e micro-cultura, os sistemas I lI, XI e XII mostraram boa ativi-dade. Para pólen, os sistemas III, VI, XI e XII tiveramboa migração e atividade. Encontrou-se apenas uma zonade atividade para essa enzima em todos os tecidos.

Glucoquinase (GK - EC 2.7.1.2): formaram-seduas zonas de atividade de GK em extratos de folhas,microcultura e pólen ao se usar o sistema XIV. As ban-das de microcultura foram mais intensas do que às dosoutros tecidos. Somente microcultura formou bandas como sistema XV I e suas posições relativas ficaram modifi-cadas, comparadas ao sistema XIV. Os demais sistemasnão revelaram atividades de G K em quaisquer dos teci-dos examinados.

Glucose desidrogenase (GLUDH - EC 1.1.1.47):microcultura formou uma banda com os sistemas I, 111,VI e XII, sendo fraca nesses dois últimos. No sistemaXII, folhas e pólen também formaram bandas, a maisintensa sendo a de microcultura. Não houve bandas comos demais sistemas.

ts-Glucoeidase ((J-GLU - EC 3.2.1.21): apenasmicrocuItura, com os sistemas XI e XII, formou umabanda. Os sistemas VI, XII I e XVI resultaram em géisde cor azul-escura após a revelação, o que os diferenciou.dos demais sistemas. No sistema VI pode-se distinguir abanda formada por microcultura, embora esta contrastepouco com a cor do gel. Os sistemas I, 111, XV e XVInão mostraram bandas.

Glutamato desidrogenase (GDH - EC 1.4.1.2):bandas de atividade de GOH foram formadas com ossistemas XI e XII para microcultura e pólen. Bandasmuito fracas foram detectadas, também, para folhas eplântulas. As folhas e o pólen apresentaram duas zonasde atividade de GOH ao se usarem esses dois sistemas.A zona de atividade com menor migração no zimogramasde pólen não aparece quando se usa o sistema I. Os sis-temas I, 111, XIII, XIV e XV também mostraram ativi-dade de GOH em pólen, porém com menor resolução.

Glutamato-oxaloacetato transaminase (GOT - EC2.6.1.1): os sistemas I, XIV e XV não são aconselháveispara esta enzima. Os sistemas 111, VI, XI, XII e XVIforam comparáveis em seus padrões de bandas. Os sis-temas XI e XII destacaram-se para microcultura e plân-tulas, com duas regiões de atividade e boa resolução. Ossistemas I e XVI mostraram-se superiores em intensi-dade e resolução de bandas em extratos de pólen. Háduas regiões eletroforéticas distintas para GOT em mi-crocultura, plântulas e pólen. Extratos de folhas mos-traram uma só região de atividade e uma faixa maismóvel de pigmento.

Hexoquinase (HK - EC 2.7.1.1): não funcionounos tecidos examinados.

/socitrato desidrogenase (lDH EC 1.1.1.42):todos os tecidos mostraram atividade de IDH quando seusaram os sistemas Xl e XII. A resolucão das bandasde IOH foi baixa em todos os sistemas. Somente os sis-temas XI e XII revelaram atividade de IOH em plântu-Ias. Para pólen, obtiveram-se duas regiões se confundemcom as dos sistemas XI e XII. O sistema I não propor-cionou migração.

Lactato desidrogenase (LDH - EC 1.1.1.27): osresultados dos testes para LDH foram ruins com todosos nove sistemas testados. Observaram-se bandas fracase difusas para os extratos de folhas e ainda mais fracaspara os de pólen com os sistemas I, XI e XII. Bandas nãoatribuíveis à LOH formam-se próximas à origem, nozimograma de folhas.

Leucina aminopeptidase (LAP - EC 3.4.11.1): osistema XIII resultou em alta atividade de LAP para fo-lhas e microcultura. Este sistema separou muito bem ospigmentos foliares (marrom) e as bandas de LAP (azuis).Não se detectou banda de pigmento nos zimogramas demicrocultura. Os extratos de pólen e de plântulas mos-traram uma faixa de pigmento alaranjado após a eletro-forese com os sistemas 111, XI e XII. Este pigmento nãointerfere nas bandas de LAP. Os sistemas XI, XII e XIIIforam os que melhor preservaram a atividade de LAPde plântulas. Formaram-se três bandas distintas de LAP

I

428 ----------------------~--~----------------------

para pólen com o sistema XIV e duas de maior intensi-dade nos sistemas XI e XII. Os demais formaram umabanda intensa de LAP para pólen.

Manitol desidrogenase (MADH - EC 1.1.1.67):não houve atividade nos tecidos examinados.

Ma/ato desidrogenase (MDH - EC 1.1.1.37): foiencontrada atividade de MDH nos quatro materiais ecom os nove sistemas testados. Os melhores sistemasforam o XIV e o XV. Oito bandas, distribuídas em duasregiões de atividade, foram observadas no zimogramade folhas da planta de E. cloeziana testada. Aparente-mente, há três lócus gênicos controlando esta enzimanesse material. Comparando-se zimogramas obtidos nosoutros sistemas, pôde-se notar a sobreposição de bandas,o que dificulta a interpretação destes.

Peroxidase (PO - EC 1.11.1.7): somente micro-cultura produziu bandas de· PO. Os sistemas mais ade-quados foram o X I e o XII, com três de atividade, com-preendendo quatro bandas no total. Os sistemas I, XIVe XV não favoreceram a migração das enzimas e as ban-das, difusas, concentraram-se próximas à origem. Ossistemas 111, VI, XIII e XVI resultaram em baixa ativi-dade, não havendo formação de banda.

Polifenoloxidase (PPO - EC 1.14.18.1): somentemicrocultura mostrou atividade de. PPO. Os sistemasXIII e XVI formaram uma banda com migração aceitá-vel para este material. Os sistemas XI e XII proporcio-naram pouca migração da enzima no gel.

Shiquimato desidrogenase (SKDH - EC 1.1.1.25):os sistemas XIV e XV .mostrararn boa atividade deSKDH em folhas e microcultura. Obtiveram-se duasbandas para microcultura, as quais não foram separadaspelos demais sistemas. Extratos de plântulas mostraramatividade de SKDH nos sistemas XI, XII e XVI e ban-das muito fracas nos' outros sistemas.

Sorbitol clesidrogenase (SDH - EC 1./.1.14): nãofuncionou nos tecidos examinados.

Superáxido dismutase (SOO - EC /.15.1.1): nãofuncionou nos tecidos examinados.

4 - DISCUSSÃO

A eficiência de cada combinação de tampões gel/eletrodo quanto à migração, à atividade e à resoluçãonos zimogramas depende da enzima e do tecido testados.Freqüentemente observou-se que determinado tecidoapresenta atividade enzimática e boa resolução quandoensaiado com um tampão, mas não apresenta com outro.A migração das bandas, no entanto, parece independentedo tecido, isto é, quando não há migração adequada, asbandas formam-se próximas à origem, nos quatro mate-riasi estudados. Quando isso acontece há sobreposiçãode bandas e os. zimogramas não são interpretáveis. Istoocorreu com a enzima MDH, por exemplo, que é bemresolvida pelos sistemas X IV e XV, mas não é interpre-tável no sistema VI.

A atividade das enzimas diferiu consideravelmenteentre os materiais vegetais aqui estudados. Como é dese esperar. nem todos os genes que controlam as enzi-

mas em questão são ativos nos diversos estádios do de-senvolvimento da planta ou nos seus diferentes órgãos.Outra razão para as diferenças de atividade entre essesmateriais consiste na adequação da solução-tampão deextração e da combinação de soluções-tampões gel/ele-trodo. Folhas, por exemplo, podem conter fenóis queprecipitam as enzimas durante a extração. Os mesmosfenóis parecem não estar presentes nas sementes e nopólen e parecem estar presentes em baixa concentra-ção nas plântulas e em microcultura.

Os sistemas eletroforéticos Xl e XIl (HAMRICK,1986( e XIV foram os que mais destacaram quanto aonúmero de enzimas que resolvem. Dentre as 37 enzimastestadas, sete não produziram bandas em todos os qua-tro materiais. Resultados satisfatórios foram obtidos com19 enzimas em folhas, 30 em plântulas sob microcultura,14 em plântulas obtidas de sementes e 22 em pólen. Asplântulas obtidas por micropropagação de brotaçõesepicórmicas são um excelente material para o exame deisoenzimas em Eucalyptus, embora de difícil obtençãona prática. Apresentaram o maior número de enzimasativas e melhor resolução de zimograma. Sabe-se, entre-tanto, que o processo de micropropagação pode induzirmodificações deste material para análise genéticas.

Para a maioria das finalidades práticas, usam-seplântulas obtidas de sementes. De modo a facilitar ostrabalhos dvaboratório, podem-se combinar 19 enzimasativas em plântulas e três sistemas-tampão gel-eletrodo:

Sistema Xl: ACP, ADH, ALDH, GDH, GOT,IDH, PGM.

Sistema XII: ADH, ALD, ALDH, GOT, G3PDH,LAP, PEP-PAP, PGM.

Sistema XIV: DIA, MDH, PG ..

Cada gel comporta em média 20 amostras e podeser cortado horizontalmente, proporcionando três ouquatro fatias de boa qualidade. Desse modo, são neces-sários cinco géis de amido para a análise de 20 amos-tras e 19 enzimas. Outros sistemas devem ser escolhidosao se combinarem enzimas para os demais materiais.

TABELA 1

SISTEMAS-TAMPÃO PARA ELETROFORESE.AS RECEITAS PARA ESSES SISTEMAS

FORAM DESCRITAS POR ALFENAS et aiii (1990)

Sistema Autor(es) Sistema Autor(es)

Brown et alii, 1975 IX Ridgeway et alii.1970

/I Hakim-Elahi,1980 X Selander e Tang,1969

!lI Hakim-Elahi,1980 Xle Hamrick eIV Cheliak, 1985 XII Lovelles, 1986V Cheliak e PiteI, 1984 XlI! Scandalios (1969)VI Moran e Bell, 1985 XIV Cayton e Tretiak

Markert e (1977VII Faulhaber, 1965 XV Alfenas et alii

(1990)VIII Markert e XVI Phillips e Brow

Faulhaber.1965 (1977)

________________ ~ ~ ~429

TABELA 2

EFEITO DO TAMPÃO DE EXTRAÇÃO E DA POSiÇÃO DA FATIA NO GEL. SOBRE A ATIVIDADE E A RESOLUÇÃODE ENZIMAS EMPREGADAS NOS TESTES PRELI MINARES EM EUCALYPTUS

Sistemas

VIEnzirnas

ADH MDH a-EST 8-EST GOT PGI GDH ACP

Posição Tampão de Extração B

1 O O + + + + + O2 O O + + + + + O3 O O + + + O4 O O + + O

Tampão de Extração D

1 + O O O O2 + O O O O3 + O O O O +4 + O O O O +

+ atividade e resolução aceitáveis; O = sem atividade;atividade aceitável. mas resolução baixa: sistemas: I (BROWN e/ alii, 1975); VI (MORAN & BELL. 1983).

TABELA 3

RESILUÇÃO E ATIVIDADE DE ENZIMAS EM DIFERENTES SISTEMAS ELETROFORÉTICOS ETECIDOS DE EUCALYPTUS

Sistema Gel/eletrodoMaterial

Enzima Vegetal 11 IV V VI VII VIII IX X

ACP FI N N N * N NMe 2 N N * 1 NPI 2 N ., N * 1 NPo * N N N * * N

ADH FI N * N * *Me 2 N N 2 NPI * N N * * *Po N N 2 N 2

(L-EST FI * N N NMe 3 N N 2 NPI N N *Po N N N * *

8-EST FI * N 2 *Me 2 * N 2 N 2PI * N * * *Po * N * * * * *

GDH FI * N *Me * ':' * 2 N 2 *PI * - - * * 1 *Po * N N 1 2

GOT FI * N 1 2Me N * N 1 2PI 2 * * N 2 1Po N N * * 1 2 *

GPI FI N N 1 NMe 2 N N 2 N 2 1PI 2 N N 2 N 2 2Po N N N 1 1

MDH FI * * N * N *Mc * N 2 N *PI N 2 N *Po N 2 *

N não houve migração (bandas muito próximas à origem).Não houve atividade suficiente para interpretação.Sistema com má resolução.

1. 2 ou 3 = Sistemas aceitáveis para cada material. em ordemFI = Folha: "-1c - rnicrocultura: PI = plântula e Po = pólen.

de prioridade.

*

4)O ~ ~~ _

TABELA 4

RESOLUÇÃO E ATIVIDADES DE ENZIMAS SEPARADAS POR ELETROFORESE EM DIFERENTES SISTEMAS-TAMPÃOPARA GEL E ELETRODOS

EnzimaMaterialVegetal

111

Sistema Gel/ eletrodo

VI XII XIII XIV XV XVIXI

ACO* 3

FIMePIPo

2* * *

* *** * *

ACP2*

FIMePIPo

*33

21"

2121

43

*

"*

*

2

*

*** *

ADH

*

FIMePIPo

*

4 *

* * ****

**

***

**

3*

2I2

112

31 * 2

LD3*

FIMePIPo

423

4"3 2

11 *

* **** *

*122

ALDH* *

** *

FIMePIPo

**

***

* ****

*ALP

**

****

****

FIMePIPo

**

* **

"*** *

CAT **

FIMePIPo

* **

*"

**

****

**

DIA FIMePIPo

*"

*"

* *

*

**

1111

2222* *

ENP

* *

FIMePIPo

***

* ****

**

****

*

* *a-EST *

*22**

FIMePIPo

33*

*** *

**

*

FUM " ****

•***

FIMePIPo

**"

::<; *

* *

**

GDH **

* ****

FIMePIPo

33

*

* *

**

4**

**

4 *

*2222

**

GK2

FIMePIPo

**

** *

23

*

**

*

* **

"

*{3-G LU *

**

****

FIMePIPo

*

**

* * * * ****

**** *

*** * *

**

GLUDH FIMePIPo

"3

* *

*

****

***

****

****

2 2*

"*

431

CONTINUAÇÃO DA TABELA 4

EnzimaXVI

MaterialVegetal III VI

Sistema GeIjeIetrodo

XI XII XIII XIV XV

GLDH *,*FIMe'PIPo

* *- *

* *2**

***

* **,**

*..**

* -**2

**

**

GOT *FIMePIPo

* * 1213

1112

2113

* **

****

**

322

* ***

* **

a-GPDH ***

*****

* ****

***

****

FIMePIPo

***

* ****

** *

***

G3PDH **

***

* ****

*,***

****

FIMePIPo

****

* *

**

**

3**

2**

G6PDH ***

FIMePIPo

**

12

*3,*,

31*

23* ..

****

****

....**2 2 2

HK*

FIMePIPo

* **

* ****

***..

****

,* ..****

** *

*

**..

**..*

**

IDH ..**

FIMePIPo

.. ....**

1II3

..***

1123

....*

......*

22**

..** 2

LDH* *..

*

FIMePIPo

**..

***.. **

I**.•

* ..*.....• *

1**..

* ***..

.•..LAP *

**

24**

FIMePIPo

332*

..***

.......•4212

4212

332*

1I14

MADH **

FIMePIPo

* ***

**

****

*..* **

ME3

* ** * *

**

FIMePIPo

**....

* ....**

* ..*..*

2*

**

*.•*

* *2 43

MDH FIMePIPo

* ****

****

****

**** *

**

****

222

****

PEp·PAP*

FIMePIPo

.. 2222

3333

1I1I

* *

**

****

***

**

PO *FIMePIPo

****

* ****

* ***..

***..

**..

***..

****

**

*..- 6PGDH *

*FIMePIPo

.• **..

13**

....**

....21**

2** *

P.GI*

FIMePIPo

*.•*

33**

4422

*

CONTINUAÇÃO DA TABELA 4Sistema Gel/eletrodo

MaterialVegetal III VI XI XII XIII XIV

FI 3 * * * * *Me 3 * * * * *PI * * * * *Po * * * * * * 2FI * * * * * * *Me * * * * 2 *PI * * * * * * *Po * * * * * * *FI * * * * *Me 2 * 2 *PI * * * * *Po 1 * * *FI 3 * * * * *Me 3 * * * * *PI * * * * * * *Po * * * * * * 2FI * * * * *Me * * * * *PI * * * * *Po * * * * *

EnzimaXV XVI

PGM *

PPO

SDH

SKDH

SOD

22*

***

****

********

22*

********

FI.: Folha; Me: Mieroeultura; PI: Plântulas; Po: Pólen.Notas 1 a 4: Classificação dos sistemas eletroforéticos.A nota I corresponde ao melhor dos 9 sistemas em cada caso.*. indica atividade e/ou resolução insuficientes.

5 - LITERATURA CITADAALFENAS. A.C.; PETERS. 1.; BRUNE, W. & PASSADOR,G.c. Eletroforese de proteínas e isoenzimas de fungos e essên-

cias florestais. SI F/UFV, Viçosa, MG 1990. (no prelo).

ARULSEKAR, S. & D.E. PARF[TT 1986. lsozyme analysisprocedures for stone fruits, almends. grape, walnut, pista-chie. and figo Hort. Sei. 21 :928-933.

ROYLE. T./.B. & E.K. MORGENSTERN 1985. Inheritance andlinkage relationships of some isozymes of black spruce inNew Brunswick. Cano /. Far. Res. 15:992-996.

BROWN, A.H.D. & C.F. MORAN 1981. Isozymes and thegenetic resourees of forest trees. ln: M.T. Conkle In:M.T. Conkle (Tech. Coord.). Proc. Symp. Isozymes ofNorth Amaerica Trees and Forest Insects. Iuly 27, 1979.Rerkeley. CA. USDA Forest Servo Gen. Tech. Rep. PSW-48.

RROWN, A.H.D., A.C. MATHESON & K.G. ELDRIDGE1975. Estimation of the mating system of Eucalyptus oblíquaL'Hérit. by using allozyne polymorphisms. Aust. I. Bot.23:931-949.

BURGESS, /.P. & /.C. BELL 1985. The identify of trees curorcntly known as Eucalyptus grandis in the Republic of-South Africa based on isozyme frequencies. South Afr.For. /. 135:24-30.

CHELlAK, W.M. e PITEL, I.A. Techiniques for starch gelelectrophoresis of enzymes from forest tree species. Infor-mation Report PI·x-42. Patawawa National Forestry Insti-tute, Canadian Forest Service. 49 p. 1984.

COPES, D.L. & R.C. BECKWITH 1977. lsoenzyrne identifica-tion of Picea glauca, P. sitchensis and P. lutzii populations.Bot. Gaz. 138:512-521.

FRIPP; Y.I., A.R. GRIFF[N & G.F. MORAN 1987. Variation. in allele frequencies in the outeross polIen of Eucalyptus

regnans throughout a flowering season. Heredity. 59:161-171.

FRYER, I.H. i987. Agreement between patterns of rnorpholo-gical variabitlity and isozyme band phenotypes in PitchePine. Sieva Genetica. 36: 199-206.

GURIES, R.P. & F.T. LEDIG 1981. Genetic Strueture of popu-lations and differentiation in forest trees. In: M.T. ConkleIn: M.T. Conkle (Tech. Coord.). Proc. Symp. Isozymes ofNorth Amaerica Trees and Forest Insects. [uly 27, 1979.Berkeley. CA. USDA Forest Servo Gen. Tech. Rep. PSW-48.

HAKIM·ELAHI. A. 1980. Temporal changes in population struc-ture of the slender wild oat (A vena barbate) as measuredby allozyrne plymorphisms Ph.D. Dissertation. Universityof California, Davis. 124 p.

HAMRICK. I.L., M.D. LOVELESS 1986. Isozyme variation intropical trees: procedures and preliminary results. Biotro-pica. 18:201-207.

L1NHART. Y.B., /.B. MITTON, K.B. STURGEON & M.L.DAVIS 1981. An analysis of genetic architecture in popula-tions of ponderosa pine. In: M.T. Conkle (Tech. Coord.).Proc. Symp. Isozymes of North Amaerica Trees and Forestinseets. [uly 27, 1979. Berkeley, CA. USDA Forest ServoGen. Tech. Rep. PSW-48.

MARKERT, C.L. & FAULHABER, I. Lactate dehydrogenaselsozyrne patterns of fish. J. Exp. Zoology. 159:319-332. 1965.

MARTY, T.L.; O'MALEY, D.M. & GURIES, R.P.A. Manualforstarch gel eletrophoresis: new microware edition. Staffpaper series N." 120. University of Wiscosin. 24 p. 1984.

MITTON, J.B.; LINHART, Y.B.; STURCEON, K.B. & HAM·RICK, J.L. Allozyne polymorphisms detected in matureneedle tissue of ponderosa pine. I. Hered. 70:86-89. 1979.

MORAN, C.F. & C. BELL 1983. Euealyptus. ln: S.D. Tanksley& T.I. Orton (Eds) Isoenzymes in Plant Genetics andBreeding. Part B. Elesevier, Amsterdam. p. 423-441.

NEALE, D.B., J.C. WEBER & ADAMS 1984. lnheritance ofneedle tissue isozymes in Douglas-fir. Cano J. Genet, Cytol.26:459-468.

PARKS, C.R., G. MILLER, J.F. WENDEL & K.M. MeDOU·DAL 1983. Genetic divergence within the gens Lirioden-dron (Magnoliaceae). Ann. Missouri Bot. Gard. 70:658-666.

PHILIPS. M.A. & BROWN, A.H.D. Mating system and hibri-dity in Eucalyptus pancillora. Aust. J. Biol. Sei. 30:337-344.1987.______________________________________________~-----------------------43~

~

o; Fl<

BR

RIDGWAY, G.'.; SHELBURNE. S.W. & LEWIS, R.D. Poly-morphisms in the esterases of atlantic herning. Transactiono fthe American Fisheris Society. 99: 14 I: 151. 1970.

SELANDER, R.K. & Y ANG, S.Y. Protein polymorphisms andgenetic hcterozigosity in a wild population of lhe housemouse (Mus IIIUSCIIIIIS). _Genctics. 6~.:953 667. 1969.

YEH, F.C., M.A.K. KHALlL. Y.A. EL·KASSABY & D.C.TRUST 1986. Allozyme variation in Pinus marianu lrornNew foundland: genetic diverssity, population structure,and analysis of differentiation Cano l . For. Res. 16:713-720.

YEH. r.c. & '.T. ARNOTT 1986. Electrophoretic and mor-phological dif'Icrentiation 1'0 Piceu sitchensis. Picea glaucaanel tlieir livbriils. Can. '. For Rcs. /6:791-798.