H.Oliveira,E.Lopes,F.Nunes,F.Peixoto,A.L.Pinto-Sintra ... · Após a transferência para o meio de...
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Resumo O resveratrol é o princípio activo de muitos remédios tradicionais usados há séculos na medicina oriental. Todavia, só recentemente diversos estudos epidemiológicos revelaram uma correlação positiva entre o consumo moderado de vinho, que o resveratrol está presente no vinho e que é o principal responsável por esses benefícios. Uma forma de alargar os benefícios do resveratrol a mais consumidores, de forma natural e sem os riscos associados ao consumo de álcool, consiste em promover o consumo de uvas e em aumentar os teores deste antioxidante. Neste contexto, e também com o objectivo de promover uma cultivar Portuguesa com capacidade de fazer frente à globalização neste eixo de mercado, iniciou-se um programa de melhoramento da cultivar Dona Maria com recurso a ferramentas biotecnológicas. Esta resultou do cruzamento intraespecifico da Moscatel Graúdo (ex-Moscatel de Setúbal) com a Rosaky, efectuado em 1954, pelo Eng.º Agrónomo José de Almeida na Estação Agronómica Nacional. Os primeiros passos foram já alcançados, com o estabelecimento de culturas in vitro de Dona Maria para obtenção de material de base para ensaios de expressão e sobreexpressão da enzima stilbene sintase (responsável pela síntese de resveratrol) e a obtenção de umsistema de regeneração in H. Oliveira, E. Lopes, F. Nunes, F. Peixoto, A.L. Pinto-Sintra [email protected] Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5000-801 Vila Real, Portugal de expressão e sobreexpressão da enzima stilbene sintase (responsável pela síntese de resveratrol) e a obtenção de umsistema de regeneração in vitro via embriogénese somática. Análises preliminares comparativas entre as cultivares Dona Maria (branca) e Touriga Nacional (tinta), efectuadas por HPLC, mostraram um teor de resveratrol sem diferenças estatisticamente significativas, o que permite aliar as capacidades organolepticas da Dona Maria a um alimento funcional natural, de fácil consumo e ampla distribuição. Summary Resveratrol is the active ingredient in many traditional remedies used for centuries in oriental medicine. However, only recently several epidemiological studies have shown (1) a positive correlation between moderate wine consumption, (2) resveratrol is present in the wine and (3) that is primarily responsible for these benefits. One way to extend the benefits of resveratrol to more consumers, naturally and without the risks associated with alcohol consumption, is to promote the grape consumption and increasing levels of this antioxidant. In this context, and also to promote a Portuguese cultivar with a capacity to cope with globalization in the axis of the market, we began a program to improve the cultivar Dona Maria by biotechnological methods. This cultivar resulted from intra specific crosses of Moscatel Graúdo (ex Moscatel de Setúbal) with Rosaky, made in 1954 by Engineer agronomist José de Almeida, at Estação Agronómica Nacional. The first steps have already been achieved. Firstly, with the establishment of cultures in vitro of Dona Maria to obtain material for expression and over-expression screening of the enzyme stilbene synthase (responsible for the synthesis of resveratrol): secondly, with the obtaining an in vitro plant regeneration system by somatic embryogenesis. Preliminary comparative analysis among cultivars Dona Maria (white) and Touriga Nacional (red) by HPLC, showed a resveratrol level with no significant statistic differences, which allows to combine the capabilities of the organoleptic Dona Maria with a natural functional food, easy significant statistic differences, which allows to combine the capabilities of the organoleptic Dona Maria with a natural functional food, easy consumption and wide distribution. Resultados Os estames e os gineceus produziram calos primários nos dois meios de indução, com diferenças significativas entre os explantes mas não no seio de cada tipo de explante (Fig. 3a). Após a transferência para o meio de diferenciação, embora os gineceus tenham apresentado uma forte calogénese, comparativamente aos estames, não ocorreu produção de calos embriogénicos (Fig. 3ab). De facto, foram os estames que apresentaram melhores resultados globais na indução de embriogénese somática e na produção de embriões somáticos, embora muito baixa, o que contraria o que tem vindo a ser constatado em inúmeros genótipos de V. vinifera L. por inúmeros investigadores (Martinelli e Gribaudo, 2009). A indução em MCb (suplementado com 8.9 μ μ μM de BAP e 4.5 de μ μ μM 2,4-D) proporcionou melhores resultados que MCa (contendo 1 μ μ μM de BAP e 8.9 μ μ μM de 2,4-D), embora não significativas. A casta Dona Maria apresentou também, no que diz respeito à indução de rebentos adventícios, uma total ausência de resposta positiva à indução em 48 meios de cultura (dados não apresentados). Apesar da forte recalcitrância à morfogénese in vitro, foi possível observar embriogénese somática (calos embriogénicos) em 2 estames e embriões somáticos numa antera (Figs. 4 a-d). Discussão e Conclusões Apesar da baixa frequência de indução de embriogénese somática obtida, regista-se pela primeira vez a regeneração de plantas a partir de embriões somáticos nesta casta. O sucesso dos resultados obtidos a partir de material de campo depende bastante de condições meteorológicas favoráveis, pelo que se procedeu-se mais tarde à indução do mesmo tipo de explantes florais mas obtidos por forçagem de sarmentos. Embora ainda não devidamente contabilizados, os dados iniciais apontam Introdução e metodologia O consumo de fruta é importante para a protecção da saúde humana, advindo este benefício da actividade anti- oxidante de compostos fenólicos que estão presentes nos frutos e nas bebidas produzidas a partir destes (Park et al., 2009). Na videira, dado o conteúdo em resveratrol, quercetina e ácido gálico, entre outros, os seus produtos podem contribuir para diminuir a incidência de doenças cardiovasculares, para a prevenção de cancro e outras doenças, e a manutenção da estabilidade do genoma humano (Frankel e Meyer, 1999; Creasy e Creasy, 1999; Burns et al., 2000; Gatz e Wiesmuller, 2008). Promover o consumo de uvas é, desta forma, promover a saúde de uma forma natural e acessível. Em Portugal, assiste-se à introdução em larga escala de uvas de mesa de outros países, quer através da importação do fruto quer através da plantação de vinha, sem que as uvas autóctones sejam alvo de grande atenção. A cultivar Dona Maria apresenta um cacho grande, com compacidade média (Fig. 1a), e bagos muito grandes, de película espessa e polpa incolor com sabor a moscatel (Rocha et al., s/data). As folhas adultas (Fig. 1b) são quinquelobadas, de tamanho médio e obtidos por forçagem de sarmentos. Embora ainda não devidamente contabilizados, os dados iniciais apontam para um aumento claro da frequência de regeneração de embriões somáticos (dados não apresentados). Isto permite antever a possibilidade de se iniciar proximamente o estudo da expressão da silbene sintase no material obtido, para tentar despistar um possível variante somaclonal (Larkin e Scowcroft, 1981), bem como o de ter material vegetal para aplicar outras biotecnologias que possam aumentar as qualidades desta uva de mesa. Pela análise dos dados obtidos na determinação de trans-resveratrol (tabela 1), verificou-se uma satisfatória concentração deste nas grainhas, e em especial, nas películas das uvas de Dona Maria (3,758μg/g de material fresco), onde a biodisponibilidade é maior, pois permite uma maior absorção do resveratrol pelo organismo. A comparação dos teores de trans-resveratrol em folhas de Dona Maria (uma casta branca) com os valores encontrados em folhas de Touriga Nacional (uma casta tinta), permite comprovar que os efeitos benéficos do resveratrol não são devidos apenas ao consumo de vinho tinto em particular, mas antes ao consumo de uvas em geral. Fig. 3. (a) Efeito da interacção do tipo de explante e o meio de cultura na percentagem de calogénese primária em estames e gineceus, após 4 semanas de cultura nos meios de indução. (b) Efeito da interacção do tipo de explante e o meio de cultura na percentagem de embriogénese somática em estames e gineceus, após 8 semanas de cultura (4 semanas nos MCs + 4 semanas no meio de diferenciação). (a) (b) Fig. 4. Indução de embriogénese na casta Dona Maria. (a) Aspecto da cultura de estames e gineceus, após 2 semanas de cultura nos meios de indução. (b) Exemplo da extensa calogénese observada nos gineceus. (c) Exemplo da calogénese (menos intensa) no filete de um estame. (d) Aspecto da produção de embriões somáticos a partir de uma antera, sendo possível observar um embrião germinado. (a) (c) (b) (d) Amostra Área do pico Concentração (μg/mL) Concentração (μmol/L) Concentração de amostra fresca (μg/g ) Tabela 1- Concentrações de trans-resveratrol presente em diferentes orgãos e tecidos da casta Dona Maria e Touriga Nacional. incolor com sabor a moscatel (Rocha et al., s/data). As folhas adultas (Fig. 1b) são quinquelobadas, de tamanho médio e glabras (ibidem). Apresenta, assim, características que a tornam capaz de competir no mercado global das uvas de mesa. As análises comparativas entre as cultivares Dona Maria e Touriga Nacional efectuadas por HPLC, apresentaram resultados muito interessantes. Fig. 5. Espectro de absorvância do padrão de resveratrol, na forma trans (a) e cis (b). Peak #1 100% at 16.02 min -10,0 0,0 12,5 25,0 37,5 50,0 60,0 200 220 240 260 280 300 320 350 % nm 318.5 307.5 216.8 50% at 15.93 min: 999.78 -50% at 16.12 min: 999.81 (a) Peak #2 100% at 18.18 min -10,0 12,5 25,0 37,5 50,0 70,0 200 220 240 260 280 300 320 350 % nm 214.8 285.6 50% at 18.10 min: 999.92 -50% at 18.28 min: 999.89 (b) Recta de calibração com o padrão de resveratrol As formas cis e trans do resveratrol foram identificadas pela comparação dos espectros de absorvância característicos (Siemann et al., 1992) e a verificação dos picos de absorvância característicos (Figs. 5ab e 6ab, respectivamente, já que não se podem comparar tempos de retenção com outros trabalhos, visto que as colunas usadas e as condições de eluição foram diferentes (Lopes, 2009). A curva padrão com diferentes concentrações do padrão trans- resveratrol pode ser observada na Fig. 7 (ibidem). Amostra Área do pico (μg/mL) (μmol/L) amostra fresca (μg/g ) Folha da casta Dona Maria 0,542 0,830 3,64 1,660 Película da casta Dona Maria 8,030 4,633 20,30 3,758 Grainha da casta Dona Maria 6,801 4,110 18,00 3,363 Polpa da Casta Dona Maria 0 0 0 0 Folha da casta Touriga Nacional 0,873 0,979 4,29 1,958 O ponto de partida para este trabalho consistiu no desenvolvimento de um protocolo de regeneração de plantas de Dona Maria, por embriogénese somática. Este método tem demonstrado constituir uma ferramenta fundamental para a manipulação in vitro de videiras (Gray et al. 2005), permitindo a aplicação de metodologias importantes para modificar ou conservar as cultivares, consoante as necessidades. Para o efeito, utilizaram-se estames e gineceus de inflorescências Fig. 1. Aspecto do cacho (a) e das folhas adultas (b) da casta Dona Maria (adaptado de MAPA, s/data). Barra = 5 cm. Os cromatogramas obtidos com a análise dos teores em trans-resveratrol existente em folhas, películas e polpa de Dona Maria podem ser observados nas figuras seguintes (Figs. A publicitação deste tipo de dados permitirá alargar os benefícios do resveratrol a um leque mais alargado de pessoas, já que, por variados motivos (idade, tradição, gosto, etc.) nem todas podem usufruir desses vastos benefícios pelo consumo de vinho. E porque não satisfazer esta nova necessidade dos consumidores, com uma uva, com tão boas características organolépticas, de origem portuguesa, como a Dona Maria? No contexto económico-social em que o país se encontra, esta seria uma excelente necessidade de valorizar os activos nacionais, reduzindo certas exportações, que acabam por oprimir a produção nacional de uvas de mesa. Os elevados teores encontrados nas folhas permitem também perspectivar uma forma alternativa e adicional da ingestão de resveratrol (e outros polifenóis benéficos), através da utilização das folhas na confecção de diversos pratos , como a receita grega de folhas com arroz, ou diversas especialidades gourmet que utilizam as folhas de videira para cobrir carnes frias ou alguns doces. Fig. 6. Tempos de retenção dos isómeros trans (a) e cis (b) obtidos com a análise dos padrões. 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0 -200 250 500 750 1.000 1.250 1.600 ResveretrolEdgar #11 187.5 UV_VIS_2 m AU min WVL:306 nm (a) 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0 -100 125 250 375 500 625 800 ResveretrolEdgar #34 187.530min365nm UV_VIS_1 m AU min WVL:280 nm (b) Recta de calibração com o padrão de resveratrol y = 2,2172x - 1,2979 R 2 = 1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 50 100 150 200 Concentração em μg/mL Área do pico Série1 Linear (Série1) Fig.7. Recta padrão das diferentes concentrações de trans-resveratrol. imaturas (fase de cachos separados) colhidas na Quinta Nossa Sra. Lurdes, em Vila Real, em Maio de 2009. O estabelecimento in vitro, a composição dos meios de cultura e as condições de cultura foram efectuadas tal como descritas por Pinto-Sintra (2007), com pequenas alterações, de acordo com o esquema apresentado na Fig. 2. Estames e gineceus Etanol 70 % Ca(ClO) 2 + Tween 3x H 2 O estéril Desinfecção das inflorescências Colheita de inflorescências Recolha dos explantes Os cromatogramas obtidos com a análise dos teores em trans-resveratrol existente em folhas, películas e polpa de Dona Maria podem ser observados nas figuras seguintes (Figs. 8-10) e os resultados obtidos com a conversão dos valores de áreas obtidos pela corrida das amostras no HPLC conduziram aos dados da tabela 1. 500 1.000 1.400 ResveretrolEdgar #47 [modified by Dionex] 1 EXT306NM m AU WVL:306 nm Peak #1 100% at 15.77 min -10,0 70,0 200 250 300 350 % nm 318.6 306.5 216.8 No spectra library hits found! 400 600 800 1.000 ResveretrolEdgar #48 [modified by Dionex] 2 EXT306NM mAU 1 - 2,450 WVL:306 nm Peak #2 100% at 16.72 min -10,0 70,0 200 250 300 350 % nm 204.5 313.8 226.2 No spectra library hits found! Agradecimentos Ao Eng. Baltasar Carvalho, da DEGA/UTAD, pelo fornecimento do material vegetal e todos os esclarecimentos prestados ao longo do trabalho. À Professora Laura Torres, do Departamento de Agronomia, pelo empréstimo de uma lupa binocular, sem a qual não teria sido possível efectuar a cultura de explantes florais. À Teresa Morais, à Isabel Santos e à Alexandrina Aguiar, do Departamento de Genética e Biotecnologia, pela sua excelente assistência técnica. À Prof. Dr. Ana Alexandra Oliveira, do Departamento de Agronomia, pela cedência das fotos do cacho e folhas da casta Dona Maria. Ao Dr. Luís Carneiro, da Estação Agronómica Nacional, pela cedência da escassa bibliografia existente/disponível da casta Dona Maria. Estames e gineceus de ‘Dona Maria’ Embriogénese somática e Plantas regeneradas Indução de calogénese 26 o C, escuro Diferenciação 24 o C, 16h de luz Crescimento 24 o C, 16h de luz Fig. 2. Esquema da metodologia utilizada para a indução de embriogénese somática e regeneração de plantas de ‘Dona Maria’. 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0 -200 min 1 - 15,767 Fig. 8. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol da película de Dona Maria, com metanol-água (80-20%), no interior está o espectro de absorvância do composto com o tempo de retenção 15,767min, comprovando tratar-se de trans-resveratrol . 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0 -100 200 400 min 2 - 16,725 Fig. 9. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol das grainhas da cultivar Dona Maria, com metanol-água (80-20%), o ligeiro desvio no tempo de retenção deve-se ao efeito da força iónica, gerada pela acumulação de compostos com tempos de retenção próximos. No canto superior direito encontra-se o espectro de absorvância do composto com o tempo de retenção 16,765mim, que se assemelha ao do padrão do trans-resveratrol. Bibliografia BURNS, J., GARDNER, P. T., O’NEIL, J. CRAWFORD, S., MORECROFT, I., 2000. Relationship among Antioxidant Activity, Vasodilation Capacity and Phenolic Content of Red Wines, J. Agric. Food Chem., 48, pp. 220-230. CREASY, L. CREASY, M., 1999. Grape Chemistry and the significance of resveratrol: an overview. Pharm.Biol. Vol.36, pp. 8-13. FRANKEL, E. N., MEYER, A. S., 1999. Antioxidants in Grapes and Grape juices and their potencial health effects, Pharm.Biol., Vol. 36, Supplement, pp. 14–20. GATZ, A. WIESMULLER, L. 2008. Take a break—resveratrol in action on DNA Carcinogenesis, Vol.29 no.2, pp. 321–332. GRAY, D. J., 2005. Grape. In R.E. Litz (Ed.), Biotechnology of Fruit and Nut Crops, pp. 672-706. LARKIN, P.J., SCOWCROFT, W.R., 1981. Somaclonal variation: a nouvel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. App. Gen. 60, pp.197-214. LOPES, E., 2009. Expressão ectópica do gene da stilbene sintase (vst1) em plantas de tabaco, obtida por transferência mediada pelo Agrobacterium tumefaciens. Relatório Final de Estágio da Licenciatura em Bioquímica, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, pp. 43-48. MARTINELLI, L. GRIBAUDO, I., 2009. Somatic embryogenesis in grapevine. In: Grapevine molecular biology and biotechnology, 2nd Ed. K.A. Roubelakis-Angelakis (Springer Science & Business Media B.V.: Netherlands), pp. 277–284. PARK, H. J., KO, JM, AN NI, KIM, Y. S., CHA, H.,C., 2009. Contents of Trans-resveratrol in Korean Grape Cultivars, including “Kyoho”, J. O conteúdo de resveratrol de folhas, películas e polpa das cultivares Dona Maria e Touriga Nacional foram analisados por HPLC. Vinte e quatro horas após a indução por exposição do material vegetal a luz UV (311 nm, 5 minutos), o material foi macerado em azoto líquido e realizada a extracção a frio metanol/água (80-20%). Após purificação numa coluna C18 Sep-Pack, concentraram-se as amostras no evaporador rotativo, ressuspenderam-se numa solução alcoólica a 50%, filtraram-se e desgaseificaram-se antes da corrida final com uma coluna C18 do HPLC, com um gradiente entre os eluentes água e acetonitrilo. . Fig. 10. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol da polpa da cultivar Dona Maria, com metanol-água (80-20%). Não se verificou a presença de nenhum composto com tempo de retenção idêntico ao do resveratrol na polpa. Tal facto indica a sua ausência na polpa, ou as características da polpa (95%da polpa é água), levaram à diluição deste composto. 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0 -10 50 100 ResveretrolEdgar #49 3 EXT306NM mAU min WVL:306 nm PARK, H. J., KO, JM, AN NI, KIM, Y. S., CHA, H.,C., 2009. Contents of Trans-resveratrol in Korean Grape Cultivars, including “Kyoho”, J. Plant Biol. 52, pp. 319–324. PINTO-SINTRA, A. L., 2007. Establishment of embryogenic cultures and plant regeneration in the Portuguese cultivar ‘Touriga Nacional’ of V. vinifera L.. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 88, pp. 253-265. ROCHA, M., BARÃO, A., MARTINS J., S/data. Descrição de novas castas de uva de mesa. Ministério da Agricultura, Pescas e Alimentação – Instituto da vinha e do vinho – Estação Agronómica Nacional, pp. 2-3. SIEMANN, E., H., CREASY, L.,L., 1992, Concentration of the Phytoalexin Resveratrol in Wine, J.Enol.Vitic.Vol.43, pp. 49-52.
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ResumoO resveratrol é o princípio activo de muitos remédios tradicionais usados há séculos na medicina oriental. Todavia, só recentemente diversos
estudos epidemiológicos revelaram uma correlação positiva entre o consumo moderado de vinho, que o resveratrol está presente no vinho e que é
o principal responsável por esses benefícios. Uma forma de alargar os benefícios do resveratrol a mais consumidores, de forma natural e sem os
riscos associados ao consumo de álcool, consiste em promover o consumo de uvas e em aumentar os teores deste antioxidante.
Neste contexto, e também com o objectivo de promover uma cultivar Portuguesa com capacidade de fazer frente à globalização neste eixo de
mercado, iniciou-se um programa de melhoramento da cultivar Dona Maria com recurso a ferramentas biotecnológicas. Esta resultou do
cruzamento intraespecifico da Moscatel Graúdo (ex-Moscatel de Setúbal) com a Rosaky, efectuado em 1954, pelo Eng.º Agrónomo José de Almeida
na Estação Agronómica Nacional.
Os primeiros passos foram já alcançados, com o estabelecimento de culturas in vitro de Dona Maria para obtenção de material de base para ensaios
de expressão e sobreexpressão da enzima stilbene sintase (responsável pela síntese de resveratrol) e a obtenção de um sistema de regeneração in
H. Oliveira, E. Lopes, F. Nunes, F. Peixoto, A.L. Pinto-Sintra [email protected]
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5000-801 Vila Real, Portugal
de expressão e sobreexpressão da enzima stilbene sintase (responsável pela síntese de resveratrol) e a obtenção de um sistema de regeneração in
vitro via embriogénese somática.
Análises preliminares comparativas entre as cultivares Dona Maria (branca) e Touriga Nacional (tinta), efectuadas por HPLC, mostraram um teor de
resveratrol sem diferenças estatisticamente significativas, o que permite aliar as capacidades organolepticas da Dona Maria a um alimento funcional
natural, de fácil consumo e ampla distribuição.
SummaryResveratrol is the active ingredient in many traditional remedies used for centuries in oriental medicine. However, only recently several
epidemiological studies have shown (1) a positive correlation between moderate wine consumption, (2) resveratrol is present in the wine and (3)
that is primarily responsible for these benefits. One way to extend the benefits of resveratrol to more consumers, naturally and without the risks
associatedwith alcohol consumption, is to promote the grape consumption and increasing levels of this antioxidant.
In this context, and also to promote a Portuguese cultivar with a capacity to cope with globalization in the axis of the market, we began a program to
improve the cultivar Dona Maria by biotechnological methods. This cultivar resulted from intra specific crosses of Moscatel Graúdo (ex Moscatel de
Setúbal) with Rosaky, made in 1954 by Engineer agronomist José de Almeida, at Estação Agronómica Nacional.
The first steps have already been achieved. Firstly, with the establishment of cultures in vitro of Dona Maria to obtain material for expression and
over-expression screening of the enzyme stilbene synthase (responsible for the synthesis of resveratrol): secondly, with the obtaining an in vitro
plant regeneration system by somatic embryogenesis.
Preliminary comparative analysis among cultivars Dona Maria (white) and Touriga Nacional (red) by HPLC, showed a resveratrol level with no
significant statistic differences, which allows to combine the capabilities of the organoleptic Dona Maria with a natural functional food, easysignificant statistic differences, which allows to combine the capabilities of the organoleptic Dona Maria with a natural functional food, easy
consumption and wide distribution.
ResultadosOs estames e os gineceus produziram calos primários nos dois meios de indução, com diferenças significativas entre os explantes mas não no seio de cada tipo de explante (Fig.
3a). Após a transferência para o meio de diferenciação, embora os gineceus tenham apresentado uma forte calogénese, comparativamente aos estames, não ocorreu produção decalos embriogénicos (Fig. 3ab). De facto, foram os estames que apresentaram melhores resultados globais na indução de embriogénese somática e na produção de embriõessomáticos, embora muito baixa, o que contraria o que tem vindo a ser constatado em inúmeros genótipos de V. vinifera L. por inúmeros investigadores (Martinelli e Gribaudo, 2009).A indução em MCb (suplementado com 8.9 µµµµM de BAP e 4.5 de µµµµM 2,4-D) proporcionou melhores resultados que MCa (contendo 1 µµµµM de BAP e 8.9 µµµµM de 2,4-D), embora nãosignificativas. A casta Dona Maria apresentou também, no que diz respeito à indução de rebentos adventícios, uma total ausência de resposta positiva à indução em 48 meios decultura (dados não apresentados). Apesar da forte recalcitrância à morfogénese in vitro, foi possível observar embriogénese somática (calos embriogénicos) em 2 estames e embriõessomáticos numa antera (Figs. 4 a-d).
Discussão e Conclusões
Apesar da baixa frequência de indução de embriogénese somática obtida, regista-se pela primeira vez aregeneração de plantas a partir de embriões somáticos nesta casta.
O sucesso dos resultados obtidos a partir de material de campo depende bastante de condiçõesmeteorológicas favoráveis, pelo que se procedeu-se mais tarde à indução do mesmo tipo de explantes florais masobtidos por forçagem de sarmentos. Embora ainda não devidamente contabilizados, os dados iniciais apontam
Introdução e metodologia
O consumo de fruta é importante para a protecção da saúde humana, advindo este benefício da actividade anti-oxidante de compostos fenólicos que estão presentes nos frutos e nas bebidas produzidas a partir destes (Park et al.,2009).
Na videira, dado o conteúdo em resveratrol, quercetina e ácido gálico, entre outros, os seus produtos podemcontribuir para diminuir a incidência de doenças cardiovasculares, para a prevenção de cancro e outras doenças, e amanutenção da estabilidade do genoma humano (Frankel e Meyer, 1999; Creasy e Creasy, 1999; Burns et al., 2000; Gatz eWiesmuller, 2008).
Promover o consumo de uvas é, desta forma, promover a saúde de uma forma natural e acessível. Em Portugal,assiste-se à introdução em larga escala de uvas de mesa de outros países, quer através da importação do fruto queratravés da plantação de vinha, sem que as uvas autóctones sejam alvo de grande atenção. A cultivar Dona Mariaapresenta um cacho grande, com compacidade média (Fig. 1a), e bagos muito grandes, de película espessa e polpaincolor com sabor a moscatel (Rocha et al., s/data). As folhas adultas (Fig. 1b) são quinquelobadas, de tamanho médio e
obtidos por forçagem de sarmentos. Embora ainda não devidamente contabilizados, os dados iniciais apontampara um aumento claro da frequência de regeneração de embriões somáticos (dados não apresentados). Istopermite antever a possibilidade de se iniciar proximamente o estudo da expressão da silbene sintase no materialobtido, para tentar despistar um possível variante somaclonal (Larkin e Scowcroft, 1981), bem como o de termaterial vegetal para aplicar outras biotecnologias que possam aumentar as qualidades desta uva de mesa.
Pela análise dos dados obtidos na determinação de trans-resveratrol (tabela 1), verificou-se uma satisfatóriaconcentração deste nas grainhas, e em especial, nas películas das uvas de Dona Maria (3,758μg/g de materialfresco), onde a biodisponibilidade é maior, pois permite uma maior absorção do resveratrol pelo organismo. Acomparação dos teores de trans-resveratrol em folhas de Dona Maria (uma casta branca) com os valoresencontrados em folhas de Touriga Nacional (uma casta tinta), permite comprovar que os efeitos benéficos doresveratrol não são devidos apenas ao consumo de vinho tinto em particular, mas antes ao consumo de uvas emgeral.
Fig. 3. (a) Efeito da interacção do tipo de explante e o meio de cultura na percentagem decalogénese primária em estames e gineceus, após 4 semanas de cultura nos meios deindução. (b) Efeito da interacção do tipo de explante e o meio de cultura na percentagem deembriogénese somática em estames e gineceus, após 8 semanas de cultura (4 semanas nosMCs + 4 semanas no meio de diferenciação).
(a) (b)
Fig. 4. Indução de embriogénese na casta Dona Maria. (a) Aspecto da cultura de estames egineceus, após 2 semanas de cultura nos meios de indução. (b) Exemplo da extensa calogéneseobservada nos gineceus. (c) Exemplo da calogénese (menos intensa) no filete de um estame.(d) Aspecto da produção de embriões somáticos a partir de uma antera, sendo possívelobservar um embrião germinado.
(a)
(c)
(b) (d)
Amostra Área do picoConcentração
(μg/mL)
Concentração
(μmol/L)
Concentração de
amostra fresca (μg/g )
Tabela 1- Concentrações de trans-resveratrol presente em diferentes orgãos e tecidos da casta Dona Maria e Touriga Nacional.
incolor com sabor a moscatel (Rocha et al., s/data). As folhas adultas (Fig. 1b) são quinquelobadas, de tamanho médio eglabras (ibidem). Apresenta, assim, características que a tornam capaz de competir no mercado global das uvas de mesa. As análises comparativas entre as cultivares Dona Maria e Touriga Nacional efectuadas por HPLC, apresentaram resultados muito interessantes.
Fig. 5. Espectro de absorvância do padrão de resveratrol, na forma trans
(a) e cis (b).
Peak #1 100% at 16.02 min
-10,0
0,0
12,5
25,0
37,5
50,0
60,0
200 220 240 260 280 300 320 350
%
nm
318.5307.5
216.8
50% at 15.93 min: 999.78
-50% at 16.12 min: 999.81
(a)
Peak #2 100% at 18.18 min
-10,0
12,5
25,0
37,5
50,0
70,0
200 220 240 260 280 300 320 350
%
nm
214.8
285.6
50% at 18.10 min: 999.92
-50% at 18.28 min: 999.89
(b)
Recta de calibração com o padrão de resveratrol
As formas cis e trans do resveratrol foram identificadas pela comparação dos espectros deabsorvância característicos (Siemann et al., 1992) e a verificação dos picos de absorvânciacaracterísticos (Figs. 5ab e 6ab, respectivamente, já que não se podem comparar tempos deretenção com outros trabalhos, visto que as colunas usadas e as condições de eluição foramdiferentes (Lopes, 2009). A curva padrão com diferentes concentrações do padrão trans-resveratrol pode ser observada na Fig. 7 (ibidem).
Amostra Área do pico(μg/mL) (μmol/L) amostra fresca (μg/g )
Folha da casta Dona Maria 0,542 0,830 3,64 1,660
Película da casta Dona Maria 8,030 4,633 20,30 3,758
Grainha da casta Dona Maria 6,801 4,110 18,00 3,363
Polpa da Casta Dona Maria 0 0 0 0
Folha da casta Touriga Nacional 0,873 0,979 4,29 1,958
O ponto de partida para este trabalho consistiu no desenvolvimento de um protocolo de regeneração de plantas deDona Maria, por embriogénese somática. Este método tem demonstrado constituir uma ferramenta fundamental para amanipulação in vitro de videiras (Gray et al. 2005), permitindo a aplicação de metodologias importantes para modificarou conservar as cultivares, consoante as necessidades. Para o efeito, utilizaram-se estames e gineceus de inflorescências
Fig. 1. Aspecto do cacho (a) e das folhas adultas (b) da casta DonaMaria (adaptado de MAPA, s/data). Barra = 5 cm.
Os cromatogramas obtidos com a análise dos teores em trans-resveratrol existente em folhas, películas e polpa de Dona Maria podem ser observados nas figuras seguintes (Figs.
A publicitação deste tipo de dados permitirá alargar os benefícios do resveratrol a um leque mais alargado depessoas, já que, por variados motivos (idade, tradição, gosto, etc.) nem todas podem usufruir desses vastosbenefícios pelo consumo de vinho. E porque não satisfazer esta nova necessidade dos consumidores, com umauva, com tão boas características organolépticas, de origem portuguesa, como a Dona Maria?
No contexto económico-social em que o país se encontra, esta seria uma excelente necessidade de valorizar osactivos nacionais, reduzindo certas exportações, que acabam por oprimir a produção nacional de uvas de mesa.
Os elevados teores encontrados nas folhas permitem também perspectivar uma forma alternativa e adicionalda ingestão de resveratrol (e outros polifenóis benéficos), através da utilização das folhas na confecção dediversos pratos , como a receita grega de folhas com arroz, ou diversas especialidades gourmet que utilizam asfolhas de videira para cobrir carnes frias ou alguns doces.
Fig. 6. Tempos de retenção dos isómeros trans (a) e cis (b) obtidos com aanálise dos padrões.
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0
-200
250
500
750
1.000
1.250
1.600ResveretrolEdgar #11 187.5 UV_VIS_2mAU
min
1 - 16,025
2 - 18,2003 - 21,992 4 - 38,0255 - 38,075
WVL:306 nm
(a)
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0
-100
125
250
375
500
625
800ResveretrolEdgar #34 187.530min365nm UV_VIS_1mAU
min
1 - 16,033
2 - 18,183
3 - 30,167 4 - 37,6835 - 38,042
WVL:280 nm
(b)
Recta de calibração com o padrão de resveratrol
y = 2,2172x - 1,2979
R2 = 1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200
Concentração em µg/mL
Áre
a d
o p
ico
Série1
Linear (Série1)
Fig.7. Recta padrão das diferentes concentrações de trans-resveratrol.
ou conservar as cultivares, consoante as necessidades. Para o efeito, utilizaram-se estames e gineceus de inflorescênciasimaturas (fase de cachos separados) colhidas na Quinta Nossa Sra. Lurdes, em Vila Real, em Maio de 2009. Oestabelecimento in vitro, a composição dos meios de cultura e as condições de cultura foram efectuadas tal comodescritas por Pinto-Sintra (2007), com pequenas alterações, de acordo com o esquema apresentado na Fig. 2.
Estames e gineceus
Etanol 70 %
Ca(ClO)2 + Tween
3x H2O estéril
Desinfecção das inflorescências
Colheita de inflorescências Recolha dos explantes
Os cromatogramas obtidos com a análise dos teores em trans-resveratrol existente em folhas, películas e polpa de Dona Maria podem ser observados nas figuras seguintes (Figs.8-10) e os resultados obtidos com a conversão dos valores de áreas obtidos pela corrida das amostras no HPLC conduziram aos dados da tabela 1.
500
1.000
1.400ResveretrolEdgar #47 [modified by Dionex] 1 EXT306NMmAU WVL:306 nm
Peak #1 100% at 15.77 min
-10,0
70,0
200 250 300 350
%
nm
318.6306.5
216.8
No spectra library hits found!
400
600
800
1.000ResveretrolEdgar #48 [modified by Dionex] 2 EXT306NMmAU
1 - 2,450
WVL:306 nm
Peak #2 100% at 16.72 min
-10,0
70,0
200 250 300 350
%
nm
204.5
313.8226.2
No spectra library hits found!
AgradecimentosAo Eng. Baltasar Carvalho, da DEGA/UTAD, pelo fornecimento do material vegetal e todos os esclarecimentosprestados ao longo do trabalho. À Professora Laura Torres, do Departamento de Agronomia, pelo empréstimo deuma lupa binocular, sem a qual não teria sido possível efectuar a cultura de explantes florais. À Teresa Morais, àIsabel Santos e à Alexandrina Aguiar, do Departamento de Genética e Biotecnologia, pela sua excelenteassistência técnica. À Prof. Dr. Ana Alexandra Oliveira, do Departamento de Agronomia, pela cedência das fotosdo cacho e folhas da casta Dona Maria. Ao Dr. Luís Carneiro, da Estação Agronómica Nacional, pela cedência daescassa bibliografia existente/disponível da casta Dona Maria.
Estames e gineceus de ‘Dona Maria’
Recolha dos explantes
Embriogénese somática e
Plantas regeneradas Indução de calogénese
26oC, escuroDiferenciação
24oC, 16h de luz
Crescimento
24oC, 16h de luz
Fig. 2. Esquema da metodologia utilizada para a indução de embriogénese somática e regeneração de plantas de ‘Dona Maria’.
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0
-200min
1 - 15,767
Fig. 8. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol da película de Dona Maria, commetanol-água (80-20%), no interior está o espectro de absorvância do composto com otempo de retenção 15,767min, comprovando tratar-se de trans-resveratrol .
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0
-100
200
400
min
2 - 16,725
Fig. 9. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol das grainhas da cultivarDona Maria, com metanol-água (80-20%), o ligeiro desvio no tempo de retençãodeve-se ao efeito da força iónica, gerada pela acumulação de compostos com temposde retenção próximos. No canto superior direito encontra-se o espectro deabsorvância do composto com o tempo de retenção 16,765mim, que se assemelha aodo padrão do trans-resveratrol.
BibliografiaBURNS, J., GARDNER, P. T., O’NEIL, J. CRAWFORD, S., MORECROFT, I., 2000. Relationship among Antioxidant Activity, Vasodilation
Capacity and Phenolic Content of Red Wines, J. Agric. Food Chem., 48, pp. 220-230.CREASY, L. CREASY, M., 1999. Grape Chemistry and the significance of resveratrol: an overview. Pharm.Biol. Vol.36, pp. 8-13.FRANKEL, E. N., MEYER, A. S., 1999. Antioxidants in Grapes and Grape juices and their potencial health effects, Pharm.Biol., Vol. 36,Supplement, pp. 14–20.GATZ, A. WIESMULLER, L. 2008. Take a break—resveratrol in action on DNA Carcinogenesis, Vol.29 no.2, pp. 321–332.GRAY, D. J., 2005. Grape. In R.E. Litz (Ed.), Biotechnology of Fruit and Nut Crops, pp. 672-706.LARKIN, P.J., SCOWCROFT, W.R., 1981. Somaclonal variation: a nouvel source of variability from cell cultures for plant improvement.
Theor. App. Gen. 60, pp.197-214.LOPES, E., 2009. Expressão ectópica do gene da stilbene sintase (vst1) em plantas de tabaco, obtida por transferência mediada pelo
Agrobacterium tumefaciens. Relatório Final de Estágio da Licenciatura em Bioquímica, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, VilaReal, pp. 43-48.MARTINELLI, L. GRIBAUDO, I., 2009. Somatic embryogenesis in grapevine. In: Grapevine molecular biology and biotechnology, 2nd Ed.K.A. Roubelakis-Angelakis (Springer Science & Business Media B.V.: Netherlands), pp. 277–284.PARK, H. J., KO, JM, AN NI, KIM, Y. S., CHA, H.,C., 2009. Contents of Trans-resveratrol in Korean Grape Cultivars, including “Kyoho”, J.
O conteúdo de resveratrol de folhas, películas e polpa das cultivares Dona Maria e Touriga Nacional foram analisadospor HPLC. Vinte e quatro horas após a indução por exposição do material vegetal a luz UV (311 nm, 5 minutos), omaterial foi macerado em azoto líquido e realizada a extracção a frio metanol/água (80-20%). Após purificação numacoluna C18 Sep-Pack, concentraram-se as amostras no evaporador rotativo, ressuspenderam-se numa solução alcoólica a50%, filtraram-se e desgaseificaram-se antes da corrida final com uma coluna C18 do HPLC, com um gradiente entre oseluentes água e acetonitrilo.
.
Fig. 10. Cromatograma relativo à extracção de resveratrol da polpa da cultivar DonaMaria, com metanol-água (80-20%). Não se verificou a presença de nenhum compostocom tempo de retenção idêntico ao do resveratrol na polpa. Tal facto indica a suaausência na polpa, ou as características da polpa (95%da polpa é água), levaram à diluiçãodeste composto.
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 41,0
-10
50
100ResveretrolEdgar #49 3 EXT306NMmAU
min
WVL:306 nm
PARK, H. J., KO, JM, AN NI, KIM, Y. S., CHA, H.,C., 2009. Contents of Trans-resveratrol in Korean Grape Cultivars, including “Kyoho”, J.Plant Biol. 52, pp. 319–324.PINTO-SINTRA, A. L., 2007. Establishment of embryogenic cultures and plant regeneration in the Portuguese cultivar ‘Touriga Nacional’ of
V. vinifera L.. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 88, pp. 253-265.ROCHA, M., BARÃO, A., MARTINS J., S/data. Descrição de novas castas de uva de mesa. Ministério da Agricultura, Pescas e Alimentação –Instituto da vinha e do vinho – Estação Agronómica Nacional, pp. 2-3.SIEMANN, E., H., CREASY, L.,L., 1992, Concentration of the Phytoalexin Resveratrol in Wine, J.Enol.Vitic.Vol.43, pp. 49-52.
