HIPÓXIA TUMORAL E CANCRO DA PRÓSTATA: ANÁLISE DO ... · Gráfico 1- Percentagem de volume...

HIPÓXIA TUMORAL E CANCRO DA PRÓSTATA: ANÁLISE DO POLIMORFISMO FUNCIONAL DO GENE DO FACTOR

INDUTÍVEL POR HIPÓXIA 1 ALFA, HIF1A

Avelino Fraga Ferreira

Dissertação de Mestrado em Oncologia

JAN 2009

HIF-1 e Cancro da Próstata

3

AVELINO MANUEL FRAGA FERREIRA

HIPÓXIA TUMORAL E CANCRO DA PRÓSTATA: ANÁLISE DO POLIMORFISMO FUNCIONAL DO GENE DO

FACTOR INDUTÍVEL POR HIPÓXIA 1 ALFA, HIF1A

Dissertação de candidatura ao grau de Mestre em Oncologia submetida ao

Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto.

Orientador – Professor Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva

Professor Auxiliar Convidado com Agregação

Afiliação – Instituto Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

Data: Janeiro 2009

Editor: Avelino Manuel Fraga Ferreira

Morada: R. Salgueiro Maia, 224; 4460-802 Custóias, Matosinhos

[email protected]

telefone: 917261436

Avelino Fraga Ferreira 4


5

Agradecimentos

Ao Dr. Ricardo Ribeiro, colega e amigo sem quem este trabalho e os que se

seguirão não seriam possíveis.

Ao Serviço de Urologia do Hospital Militar D. Pedro V que me proporcionou

todos os meios, a colaboração e as dispensas necessárias para conseguir

concretizar este trabalho.

Ao Prof. Dr. Rui Medeiros por me ter acolhido na sua equipa de investigação

apesar das minhas limitações cientificas e pouca disponibilidade de tempo.


7

Indice Geral

RESUMO _________________________________________________________ 13 ABSTRACT _______________________________________________________ 15 RESUMÉ _________________________________________________________ 17 1 - INTRODUÇÃO __________________________________________________ 21 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ________________________________________ 25

2.1- CANCRO DA PRÓSTATA: EPIDEMIOLOGIA GERAL_________________ 25

2.2 - ONCOBIOLOGIA MOLECULAR DO CANCRO PRÓSTATA____________ 26

2.3 - HIPÓXIA E CANCRO __________________________________________ 28

2.4 - HIPÓXIA E FACTOR INDUTÍVEL POR HIPÓXIA - 1 ALFA_____________ 29

2.5 - HIF 1Α E CANCRO DA PRÓSTATA: EVIDÊNCIAS E HIPÓTESES ______ 37

3 - OBJECTIVOS ___________________________________________________ 43 3.1 - OBJECTIVO ESPECÍFICO______________________________________ 43

4 - MATERIAL E MÉTODOS __________________________________________ 47 4.1 - POPULAÇÃO________________________________________________ 47

4.2 - PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ____________________________ 47 4.2.1 - Genotipagem do polimorfismo HIF1A 1772C>T (P582S) ____________ 48

4.3 - ANÁLISE ESTATÍSTICA _______________________________________ 48

5 - RESULTADOS __________________________________________________ 53 5.1 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO PRÓSTATA ____________________ 53

5.2 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA AGRESSIVIDADE DO CANCRO PRÓSTATA __________________________________________ 54

5.3 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA __________________________________________________ 56

6 - DISCUSSÃO ____________________________________________________ 61 6.1 - DISTRIBUIÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T EM POPULAÇÕES NORMAIS: IMPLICAÇÕES EPIDEMIOLÓGICAS E METODOLÓGICAS. ___________________________ 62

6.2 – ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T COM SUSCEPTIBILIDADE PARA CaP ___________________________________ 64

6.3 - POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA EVOLUÇÃO CLÍNICA E NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA ______________________________________ 66

6.4 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA HORMONAL, AVALIANDO O INTERVALO LIVRE DE DOENÇA67

7 - CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS __________________________ 73 8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS __________________________________ 79


ANEXOS _________________________________________________________ 91 ANEXO I - Apresentação realizada a 7 de Fevereiro 2009 no 2º World Congress on Controversies in Urology (CURy09) que decorreu em Lisboa.__________ 93

ANEXO II - Artigo de revisão submetido para publicação nas Actas Urológicas Espanholas, “Hipoxia tumoral – papel de HIF“.________________________ 95

Índice de Figuras

Figura 1 - Estrutura Molecular de HIF-1 _________________________________ 30

Figura 2 - Regulação das sub unidades HIF sob a tensão de O2 _______________ 31

Figura 3 - Respostas determinadas pelo HIF ______________________________ 32

Figura 4 - Regulação da estabilidade e actividade do HIF ____________________ 33

Figura 5 - Regulação do HIF-1α ________________________________________ 34

Figura 6 - Vias de sinalização e regulação do HIF-1________________________ 35

Figura 7 - Papel duplo do HIF na sobrevida e morte celular ___________________ 36

Figura 8 - Mutação de HIF-1 identificada por PCR e sequenciação do DNA______ 39

Figura 9 - Estrutura do HIF-1α e sequência de aminoácidos no exon 12. _________ 40

Figura 10 – Exemplo de análise genotípica para o polimorfismo HIF1A P582S,

segundo o método de distribuição alélica. ________________________________ 48

Índice de Gráficos

Gráfico 1- Percentagem de volume tumoral avaliada por análise anatomo-patológica,

de acordo com o polimorfismo HIF1A+1772 C>T (média e desvio padrão). _______ 55

Gráfico 2 -Sobrevida cumulativa, segundo a análise de regressão de Cox para o

Intervalo Livre de Doença, de acordo com o polimorfismo HIF1A+1772 C>T. _____ 56


9

Índice de Quadros

Quadro 1 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo HIF1A+1772C>T no

grupo de Controlos e de Casos 53

Quadro 2 - Distribuição Genotipica do polimorfismo HIF1A+1772 C>T no grupo

Controlo e no grupo de Casos, de acordo com o modelo recessivo 54

Quadro 3 - Risco para os portadores do alelo T do polimorfismo HIF1A+1772C>T no

momento do diagnóstico para apresentar doença avançada, metástases, Gleason ≥ 8,

PSA > 20ng/dl e AI por comparação com o grupo controlo. 55

Quadro 4 - Análise da resposta terapêutica da Doença Localizada e da Doença

Avançada 57

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Frequências genotípicas do polimorfismo HIF1A+1772C>T em populações

controlo, comparadas com o presente estudo 63

Tabela 2 - Polimorfismo HIF1A+1772C>T em diferentes estudos 65


Abreviaturas e siglas

A AR - Receptor de androgénios AD – Androgénio dependência AI – Androgénio independência AIPC - Cancro da próstata androgénio independente Akt – Cinases activadas por mitogénios ARNT - translocador nuclear de hidrocarbonetos aril C CaP – Cancro próstata C – Citosina CA9 - anidrase carbónica 9 D DNA – Ácido desoxiribonucléico DHT – Dihidrotestosterona E EAU – European Association of Urology, Associação Europeia de Urologia EGF - Factor de crescimento epidérmico EGFR – Receptor do factor de crescimento epidérmico F FIH-1 - Factor Inibidor de HIF-1 G GST - glutationa S transferase GLUT1 - transportador 1 de glicose


11

H HIF1A - factor indutível por hipóxia – 1 alfa HRE - Elemento de Resposta à Hipóxia I IGF - factor de crescimento insulínico IGFBP - proteína de ligação do IGF IC - Intervalo Confiança ILD - Intervalo livre de doença M MAPK - cinases de proteínas activadas por mitogénios mTOR - mammalian target of rapamycin N NCCN - National Comprehensive Cancer Network NLS - local sinalização nuclear O OD – Odds ratio ODD - domínio de degradação oxigénio dependente P PSA – Antigénio específico da próstata PHD – Domínio de prolil hidroxilases PIN - Neoplasia Intra Epitelial da próstata PI3K – Cinase de fosfatidilinositol 3-OH PTEN - gene supressor Phosphatase and Tensin Homolog PCR-RFLP: Polymerase chain reaction – restriction fragment lenght polymorphism


R ROS - espécies reactivas de oxigénio Real Time PCR – Real time polymerase chain reaction S SNP’s – single nucleotide polymorphisms T TGFα - factor de crescimento de transformação alfa T - Timina TAD - domínios de transactivação TNFα - Factor de necrose tumoral TNM - Tumor, Nodulos linfáticos regionais, Metastases à distância

TRAMP - tansgenic adenocarcinoma mouse prostate U UICC - International Union Against Cancer V VHL - Von Hippel Lindau VEGF - factor de crescimento do endotélio vascular


13

RESUMO

O Cancro da Próstata (CaP) é a segunda neoplasia mais frequente do homem.

É uma doença heterogénea, com comportamento biológico e clínico muito variado,

estando envolvidos na sua etiologia factores ambientais, hormonais e genéticos. Deste

modo, é compreensível o esforço que tem vindo a ser feito no sentido de perceber os

mecanismos subjacentes ao CaP, que expliquem o desenvolvimento e progressão da

doença.

Sabe-se que a progressão da doença está frequentemente associada à hipóxia

e esta à angiogénese. Por outro lado, muitos estudos evidenciam que a hipóxia

tumoral possui um relevante impacto na expressão genética. Muitos destes genes

estão sob o controlo do factor indutível por hipóxia – 1 alfa (HIF-1α), cujos níveis estão

substancialmente aumentados em vários tipos de tumores.

O papel central do HIF-1α na homeostasia do oxigénio sugere que a sua

expressão poderá ser crítica no desenvolvimento do CaP e nos fenótipos letais de

CaP. Vários estudos publicados implicam o HIF-1α no CaP metastático, tendo-se

verificado que esta molécula se torna desregulada no tumor prostático e assim conduz

à transcrição de genes adaptativos à hipóxia envolvidos na carcinogénese e

progressão tumoral da próstata.

Modificações no ambiente de hipóxia devido à variação de concentração

relativa do HIF-1α por influência do polimorfismo HIF1A+1772C>T, poderá condicionar

a carcinogénese, a proliferação, a progressão e metastização tumoral do CaP.

No presente trabalho, foi realizado um estudo do tipo caso-controlo, com o

objectivo de analisar a influência deste polimorfismo na susceptibilidade para o

desenvolvimento e evolução clínica de CaP.

Foram analisadas amostras de DNA de setecentos e vinte e seis homens

(726), dos quais quatrocentos e noventa e quatro (494) com CaP e duzentos e trinta e

dois (232) com o diagnóstico histopatológico de hipertrofia benigna próstata (HBP). A

análise do polimorfismo HIF1A+1772C>T foi realizada por PCR em Tempo Real (RT-

PCR).

Os resultados mostram que os portadores heterozigóticos têm um risco

significativamente aumentado para desenvolver CaP (OR=1,55, p=0,037)

relativamente à população controlo.

Também se verificou que os portadores T apresentam doença mais agressiva

no momento do diagnóstico, verificando-se um risco significativamente aumentado


(p=0,017) para o desenvolvimento de metastização à distância e ter doença avançada

no momento do diagnóstico (p=0,044), existindo ainda uma tendência para os

portadores T apresentarem à data do diagnóstico PSA > 20ng/ml (p=0,056) e grau de

Gleason ≥ 8 (p=0,083). Verificou-se ainda que a percentagem de volume tumoral

histológicamente identificado nas amostras de material prostático, foi

significativamente maior nos indivíduos portadores do alelo T (p=0,03). Contudo, não

se verificou associação com significado estatístico entre o genótipo do polimorfismo

HIF1A+1772C>T e o desenvolvimento de Androgénio Independência (AI).

Relativamente à evolução clínica do CaP em tratamento hormonal para AI, a

análise multivariada através do modelo de regressão de Cox evidenciou um risco

relativo 59% menor para os portadores CT/TT, após ajustamento para a idade, estádio

da doença, PSA e hábitos tabágicos, (OR=0.41; IC95%=0.19-0.90, p=0.026). Os

portadores homozigóticos C apresentam um tempo médio até AI significativamente

inferior aos portadores T (104.3 vs. 115.2 meses, respectivamente).

Nos doentes com doença avançada, verifica-se a presença de maior

percentagem de tumor nos doentes que vêm a ter AI (p=0,042) o que poderá estar

relacionado com maior hipóxia em tumores com maior volume. Verifica-se também

uma tendência para o PSA seja mais elevado (p=0,069). Contudo a presença do

polimorfismo não se mostrou relevante em relação àqueles que o não têm.

A avaliação do perfil genético individual relativamente a este polimorfismo, em

populações maiores e com maior número de controlos, poderá vir a contribuir para a

compreensão de eventuais mecanismos de desenvolvimento e progressão tumoral do

CaP, podendo vir a constituir um elemento a ter em conta na susceptibilidade para

CaP e na evolução clínica destes doentes.


15

ABSTRACT

Prostate Cancer (CaP) is the second most common cancer in men. It is a

heterogeneous disease with clinical and biological behavior very varied, being involved

in its etiology environmental factors, hormonal and genetic. Thus, it is understandable

that the effort has been made to understand the mechanisms underlying the CAP, to

justify the development and progression of disease.

It is known that the progression of the disease is often associated with hypoxia

and that the angiogenesis. Moreover, many studies suggest that tumor hypoxia has a

significant impact on gene expression. Many of these genes are under the control of a

hypoxia inducible factor - 1 alpha (HIF-1α), whose levels are aberrantly increased in

various types of tumors.

The central role of HIF-1α in the oxygen homeostasis suggests that their

expression may be critical in the development of CaP and the lethal phenotypes of

CaP. Several published studies involving the HIF-1α in the metastatic CaP it was found

that this molecule is deregulated in prostate tumor and thus leads to the transcription of

genes involved in adaptation to hypoxia carcinogenesis and tumor progression of

prostate cancer.

Changes in the environment of hypoxia due to the change in concentration of

HIF-1α by the influence of polymorphism HIF1A+1772C>T, may influence the

carcinogenesis, proliferation, tumor progression and metastasis of CaP.

In this work, a study was conducted case-control, to examine the influence of

this polymorphism in susceptibility to the development and clinical progression of CaP.

We analyzed DNA samples from seven hundred and twenty-six men (726), of

which four hundred and ninety four (494) with CaP and two hundred and thirty two

(232) with the histopathologic diagnosis of benign prostatic hypertrophy (BPH). The

analysis of polymorphism HIF1A+1772C>T was performed by Real Time PCR (RT-

PCR).

The results show that heterozygous carriers have a significantly increased risk

for developing CaP (OR = 1.55, p=0.037) relative to population control.

It also found that T carriers have more aggressive disease at diagnosis, with a

significantly increased risk (p=0.017) for the development of metastasis at a distance

and have advanced disease at diagnosis (p=0.044), with still a tendency for T carriers

submit to the date of diagnosis PSA>20ng/ml (p=0.056) and Gleason grade of ≥ 8

(p=0.083). It was also found that the percentage of tumor volume histologically


identified in samples of prostate material was significantly higher in subjects carrying

the T allele (p=0.03). However, no association was found with statistical significance

between the genotype of the polymorphism HIF1A+1772C>T and the development of

androgen independence (AI).

Regarding clinical evolution of AI CaP to hormone treatment in the multivariate

analysis by the Cox regression model showed a 59% lower relative risk for patients

CT/TT, after adjustment for age, stage of disease, PSA and tobacco, (OR=0.41, 95%

CI=0.19-0.90, p=0.026). The homozygous C patients have a median time to AI

significantly lower than the T carriers (104.3 vs. 115.2 months, respectively).

In patients with advanced disease, there is the presence of higher percentage

of tumor in patients who have come to AI (p=0.042) which may be related to hypoxia in

larger tumors with higher volume. There is also a tendency for the PSA is higher

(p=0.069). However the presence of the polymorphism was not relevant in relation to

those that do not.

The assessment of the individual genetic profile for this polymorphism in

populations with larger populations and larger number of controls, could contribute to

the understanding of possible mechanisms of tumor development and progression of

CaP and may be a factor to take into account to CaP susceptibility and clinical outcome

of these patients.


17

RESUMÉ

Le cancer de la prostate (CaP) est la deuxième néoplasie plus fréquente chez

l’homme. Il s’agit d’une maladie hétérogène, avec un cours biologique et clinique très

variable, dont l’étiologie repose sur des facteurs ambientaux, hormonels et génétiques.

C’est ainsi compréhensible l’effort développé pour déchiffrer les mécanismes

subjacents au CaP, qui justifient le développement et la progression de la maladie.

On sait que la progression de la maladie est souvent associée à l’hypoxie, et

celle-ci à l’angiogenèse. En plus, de nombreuses études mettent en relief que l’hypoxie

tumorale a un impact remarquable sur l’expression génétique. Beaucoup de ces gènes

sont sous le contrôle du facteur inductible par hypoxie -1 alpha (HIF-1α), dont les

niveaux sont anormalement augmentés parmi différents types de tumeurs.

Le rôle central du HIF-1α dans l’homéostasie de l’oxigène suggère que son

expression pourra être critique dans le développement du CaP et dans les phénotypes

mortels du CaP. Plusieurs études publiées impliquent le HIF-1α au CaP métastatique,

verifiant que cette molécule devient déréglée dans la tumeur prostatique, entraînant

comme ça la transcription des gènes adaptatifs à l’hypoxie, engagés dans la

carcinogenèse et dans la progression tumorale de la prostate.

Des changements dans l’ambiance d’hypoxie à cause de la variation de

concentration relative du HIF-1α par influence du polymorphisme HIF1A+1772C>T,

pourront conditionner la carcinogenèse, la prolifération, la progression et la

métastatisation tumorale du CaP.

Dans ce travail on a entrepris une étude cas-contrôle envisageant analyser

l’influence de ce polymorphisme sur la susceptibilité pour le développement et

l’évolution clinique du CaP.

On a évalué des échantillons de DNA de septcent vingt-six hommes (726), dont

quatrecent quatre-vingt-quatorze (494) avec CaP et deuxcent trente-deux (232) avec le

diagnostique histopathologique d’hypertrophie bénigne de la prostate (HBP). L’analyse

du polymorphisme HIF1A+1772C>T a été réalisée par PCR en temps- réel (RT-PCR).

Les résultats éprouvent que les porteurs hétérozygotiques ont un risque

considérablement plus haut pour développer CaP (OR=1.55 ; p=0.037) par rapport à la

population-contrôle.

On a aussi vérifié que les porteurs T présentent une maladie plus agressive au

moment du diagnostique, avec un risque considérablement augmenté (p=0.017) pour


le développement de métastatisation à distance et pour avoir une maladie avancée au

moment du diagnostique (p=0.044) ; il existe également une tendance pour que les

porteurs T présentent au moment du diagnostique un PSA >20 ng/ml (p=0.056) et un

degré de Gleason ≥ 8 (p=0.083). On a encore vérifié que le pourcentage de volume

tumoral histologiquement identifié aux échantillons de matériel prostatique a été

considérablement plus grand chez les individus porteurs de l’allèlé T (p=0.03).

Cependant, on n’a pas constaté une association avec signification statistique entre le

génotype du polymorphisme et le développement d’androgène independance (AI).

En ce qui concerne l’évolution clinique vers AI du CaP, l’analyse multivariée au

moyen du modèle de régression de Cox a mis en évidence un risque relatif 59%

inférieur pour les porteurs CT/TT, aprés le necéssaire ajustement à l’âge, à la phase

de la maladie, au PSA et au tabac (OR=0.41 ; IC95%=0.19-0.90 ; p=0.026). Les

porteurs homozygotes C présentent un temps moyen jusqu’à AI significativement

inférieur aux porteursT (104.3 vs.115.2 mois, respectivement).

Chez les patients avec maladie avancée, on vérifie la présence d’un plus grand

pourcentage de tumeur parmi ceux qui parviendront à avoir AI (p=0.042), ce qui pourra

être en rapport avec une plus grande hypoxie chez les tumeurs les plus volumeuses.

On vérifie aussi une tendance pour que le PSA soit plus haut (p=0.069). Cependant, la

présence du polymorphisme ne s’est pas révelée remarquable par rapport à ceux qui

ne l’ont pas.

L’évaluation du profil génétique individuel concernant ce polymorphisme chez

des populations plus nombreuses et avec un plus grand numéro de contrôles, pourra

devenir une contribution pour la compréhension d’éventuels mécanismes de

développement et de progression tumorale du CaP, ce qui pourra devenir un élément à

être en considération dans la susceptibilité pour CaP et pour l’évolution clinique de ces

malades.

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Capítulo I -Introdução


21

1 - INTRODUÇÃO

O Cancro da Próstata (CaP) é uma das patologias mais frequentes e

controversas da Medicina actual. De facto, nos últimos anos temos assistido a uma

procura crescente de cuidados de saúde nesta área e ao desenvolvimento de muitos

avanços científicos acompanhados de grande evolução tecnológica. O aparecimento

do antigénio específico da próstata (PSA), permitiu o diagnóstico mais precoce da

doença e conduziu a grandes progessos e maiores prespectivas de cura. A tecnologia

progrediu imenso permitindo diagnósticos mais fáceis, mais rápidos, mais precisos e

tratamentos mais cómodos e com muito menos sequelas. Contudo, os tratamentos

fundamentais foram desenvolvidos há mais de cinquenta anos e assim permanecem.

De facto, a prostatectomia radical continua a ser o melhor tratamento para a doença

local e a hormonoterapia o tratamento mais frequente para a doença avançada.

O CaP é uma doença heterogénea, com comportamento biológico muito

variado, tornando difícil a sua abordagem terapêutica, sendo fundamental identificar os

cancros agressivos e dirigir para estes os esforços e as armas disponíveis.

Desde há vários anos que se reconhece a existência de uma componente

genética no CaP. Estima-se que cerca de 42% do risco de cancro da próstata possa

ser devido a influências genéticas. [1] Uma pequena proporção de casos pode ser

atribuída a efeitos monogénicos, raros e com alta penetrância, embora a larga maioria

seja de etiologia multifactorial, envolvendo factores de risco ambientais e variantes

genéticas de baixa penetrância, actuando isoladamente ou em conjunto. Muitas

variantes genéticas têm sido estudadas, mas os resultados mantêm-se sem utilidade

na prática clínica. [1]

A identificação de genes de susceptibilidade para CaP acrescentará ao nosso

conhecimento contributos na área da fisiopatologia molecular do cancro, permitindo

refinar a identificação de grupos de risco e estabelecer relações com a resposta a

fármacos. Acresce o facto de que várias terapêuticas actuais - hormonoterapia,

fármacos anti-angiogénicos, radioterapia - poderão ser influenciadas por variações

genéticas individuais com carácter funcional, em alguns dos genes das moléculas

reguladoras da hipóxia ou dos seus receptores. Assim, consideramos que o estudo do

polimorfismo funcional no gene do factor indutível por hipóxia 1 alfa (HIF1A), poderá

contribuir para a definição de perfis de resistência à terapêutica ou susceptibilidade

para desenvolver CaP.

CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica

HIF-1 e Cancro da Próstata 25

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1- CANCRO DA PRÓSTATA: EPIDEMIOLOGIA GERAL

O CaP constitui um importante problema de saúde pública, sendo a segunda

neoplasia mais frequente no homem. [1]

Nos EUA em 2006 ocorreram cerca de 234 460 novos casos e 27 350 mortes

devido a CaP,[2] constituindo o cancro não dermatológico mais frequente no homem e

a segunda causa de morte por cancro masculino, representando cerca de 33% dos

novos casos de tumor e cerca de 10% das causas de morte por cancro masculino. [2-4]

Na Europa, o CaP é a principal causa de morte nos homens. Em 2004, terão

ocorrido 202 100 casos e 68 200 mortes por CaP. [5]

Em Portugal, a estimativa de novos casos de CaP para 2000, era de 2973

casos, constituindo a segunda neoplasia mais frequente no homem, depois do cancro

colo rectal. [6] O risco de um homem português desenvolver cancro até aos 75 anos,

segundo esse estudo, é de 25,9%, sendo o risco de que esse cancro seja da próstata

de 3,2% e de 3,0% o risco de morrer de CaP. No ano de 2003 em Portugal, o CaP foi

a neoplasia com maior taxa de incidência em homens com mais de 60 anos de

idade.[7]

Ainda relativamente às taxas de incidência de CaP, verifica-se uma grande

heterogeneidade geográfica, conforme os países e populações estudadas, verificando-

se taxas de incidência mais elevadas nas populações afroamericanas e nos países

ocidentais desenvolvidos, enquanto as mais baixas se verificam nas populações

asiáticas.[8] Tal pode ficar a dever-se a factores genéticos, ambientais, sociais –

acesso a cuidados médicos, por exemplo - que podem afectar o desenvolvimento e

progressão da doença, [5] mas os principais factores de risco para CaP unanimemente

reconhecidos, continuam a ser a Idade, a Raça e a História Familiar de CaP. [3, 13-15]

Deste modo, compreende-se o grande interesse em conhecer a patogenese do

CaP, já que se trata de uma patologia frequente, com morbilidade e mortalidade

importante e portanto com repercussão económica e social significativa.

O CaP apresenta uma grande variabilidade clínica. Em algumas situações,

verifica-se que os doentes com CaP permanecem assintomáticos, sem que o

diagnóstico tenha sido suspeitado, vindo a morrer de outras causas. Sabe-se que

frequentemente a doença é indolente, de crescimento lento, podendo nunca ter



importância clínica. [9,10] Isso pode dever-se à idade avançada na altura do

diagnóstico, ao crescimento lento verificado em muitos tumores ou à resposta à

terapêutica instituída. [11] Contudo, por vezes esta neoplasia é muito agressiva desde

início ou torna-se rapidamente progressiva, após um período de latência variável.

Deste modo, é compreensível o esforço que tem vindo a ser feito no sentido de

perceber os mecanismos biológicos, genéticos e ambientais subjacentes ao CaP, que

justifiquem o desenvolvimento, a progressão e o comportamento heterogéneo da

doença. [11,12]

De facto, devido à idade avançada em que muitos tumores da próstata

aparecem, estima-se que o número de doentes com CaP latente – CaP presente, mas

nunca detectado ou diagnosticado - seja maior que o número de homens com CaP

clinicamente detectado, sendo necessário conhecer melhor os mecanismos biológicos

que vão determinar que em alguns doentes o CaP permaneça silencioso, enquanto

noutros evolui e se torna clinicamente significativo. [11]

Nas últimas décadas, tem-se verificado uma diminuição da mortalidade por

CaP e ao mesmo tempo um aumento da sua incidência, [16,17] o que parece ficar a

dever-se a um diagnóstico mais eficaz, que estará certamente relacionado com a

melhoria dos cuidados de saúde e com a utilização do PSA. O aumento do número de

casos diagnosticados, tem permitido detectar doença mais cedo e deste modo, tratar

os doentes com doença localizada, obtendo maiores taxas de sobrevida. Por outro

lado, o melhor conhecimento do comportamento da célula neoplásica, tem permitido

uma maior eficácia no tratamento dos doentes com doença avançada. [18] Contudo,

diferentes estudos, têm falhado na demonstração da evidência de menor mortalidade

de CaP em populações submetidas a programas de rastreio. [19,20]

2.2 - ONCOBIOLOGIA MOLECULAR DO CANCRO PRÓSTATA

Recentemente, a descodificação do genoma humano, tem permitido grandes

avanços no conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos no aparecimento e

desenvolvimento das neoplasias, permitindo constatar que pequenas diferenças nas

sequências de DNA, podem justificar diferentes susceptibilidades para o

desenvolvimento neoplásico e sua evolução, tendo o conhecimento destas

variabilidades implicações ao nível do tratamento e do prognóstico dos doentes.

No contexto da epidemiologia molecular, os polimorfismos genéticos

caracterizam-se por variações na sequência de DNA (mutações) que existem nos



indivíduos normais e que estão presentes em pelo menos 1% da população. [21] A

maioria dos polimorfismos associados a cancro, ocorre em genes envolvidos no

controlo da proliferação e diferenciação celular, na reparação do DNA e na

manutenção da integridade do genoma, isto é, ocorrem em áreas chave para o

desenvolvimento das neoplasias. Os polimorfismos mais frequentes, são

caracterizados pela alteração de apenas um nucleotideo na sequência de DNA,

designando-se por “ Single Nucleotide Polymorphisms “, SNP’s. [22]

Os SNP’s são a principal fonte de variabilidade individual. Cada indivíduo, é

portador de um vasto grupo de polimorfismos genéticos, o que lhe confere um

património genético único, sendo habitualmente neutros ou com comportamento

benigno. Embora as variantes em genes de susceptibilidade possam expressar

diferenças fenotípicas, em alguns casos, estes polimorfismos associam-se à iniciação

ou à progressão de doenças oncológicas, sendo importante estudar a relação entre o

desenvolvimento de cancro e a existência (ou não) de determinado polimorfismo, de

modo a ser avaliado um perfil genético de cada doente. [23] O individuo, como portador

de um conjunto de polimorfismos variáveis, apresentará um perfil de carcinogénese

muito singular e alguns desses polimorfismos, podem ser caracterizados como

variantes genéticas funcionais, sendo a sua ocorrência responsável por padrões de

expressão alterados, originando diferenças na expressão genética com capacidade

para alterar a produção de determinada proteína e o microambiente tumoral exercendo

influência decisiva na homeostasia local, alterando a qualidade e quantidade dos

factores proteícos envolvidos, sendo desse modo decisivos no processo de

desenvolvimento da neoplasia. Assim se compreende a importância de conhecer o

carácter individual de cada doente, conferido pelo seu património genético que inclui o

conjunto dos seus polimorfismos, analisando as consequências destas variantes

genéticas no desenvolvimento da neoplasia.

Existem vários estudos epidemiológicos sobre a frequência de SNP’s e a sua

associação a CaP. Os mais estudados têm sido genes envolvidos na via de síntese

dos androgénios ou do seu metabolismo, da via de factores de crescimento

nomeadamente do Factor de Crescimento Insulínico (IGF), da via de metabolismo de

carcinogénios, da reparação do DNA, da inflamação crónica ou da angiogénese.

Considerando que o CaP é androgénio dependente, foram estudados o papel

de polimorfismos de vários genes envolvidos na síntese, metabolismo, transporte e

regulação dos androgénios.[24] Contudo, os resultados conhecidos ainda não permitem

suportar o papel de algum gene em particular, tendo sido estudados e encontrados

riscos aumentados para os polimorfismos dos genes CAG e GGN, [25] SRD5A2, [26]



CYP17, [26,27] CYP19, [26,28,29] HSD17B3 e HSD3B1 [30-31] dos receptores androgénicos

(AR), mas com resultados não conclusivos.

Devido à forte evidência de relação entre o CaP e os factores de crescimento,

envolvendo nomeadamente a insulina e o IGF, tem sido estudada a associação entre

polimorfismos de IGF e CaP. Alguns estudos envolvendo o gene da insulina (INS) e o

gene receptor da Vit D (VDR), mostraram-se positivos, mas sem risco aumentado para

CaP. [25,32,33]

Os genes codificadores das enzimas que metabolizam os carcinogénios,

podem também ter importante papel no CaP, embora os resultados de estudos no

gene da glutationa S transferase (GST) – GSTT1, GSTP1 e GSTM1 – sejam

controversos, [34-39] o mesmo se verificando para estudos em genes reparadores de

DNA. [40]

A investigação realizada sobre a associação da inflamação com o CaP, tem

apresentado resultados interessantes, nomeadamente em variantes genéticas

envolvendo o TGFβ e COX-2. [41,42]

Relativamente à angiogénese tumoral, estudos em polimorfismos de genes de

moléculas envolvidas no equilíbrio angiogénico (VEGF, IL-8 e IL-10), mostraram com

alguma consistência a associação destes marcadores moleculares com

desenvolvimento do CaP. [43]

Contudo, é pouco provável que um só gene ou um só SNP explique um cancro,

nomeadamente o CaP na sua grande variabilidade e susceptibilidade. Quando

observados os dados existentes na sua totalidade, verificam-se variações nos

polimorfismos genéticos, mas a sua contribuição clara para o CaP ainda não é

evidente, sendo necessários novos estudos e envolvendo maiores populações. [1]

2.3 - HIPÓXIA E CANCRO

A hipóxia, definida como a diminuição de oxigénio nos tecidos normais para

valores de tensão inferiores a 7%, é significativamente inferior nos tumores onde a sua

tensão média é de 1,5%. [44,45]

A oxigenação tumoral, é habitualmente muito instável e heterogenea, em

consequência da arquitectura vascular local e da heterogenidade funcional dos

tecidos, ocorrendo flutuações no fluxo de sangue local que conduzem a menor

perfusão sanguínea do parênquima tumoral. [46-48]



O crescimento tumoral até à dimensão macroscópica só é possível, como

resultado da neovascularização induzida pela secreção de factores angiogénicos, [49]

os quais irão promover um aumento do fluxo sanguíneo tumoral, garantindo o aporte

de oxigénio e nutrientes necessários à proliferação celular. [50] Deste modo, a hipóxia

tecidual parece ser um mecanismo central responsável pela modificação relacionada

com as necessidades de oxigénio e nutrientes, como o pH ou o estado bioenergético,

que em conjunto formam o micro ambiente metabólico do tumor. [51] A hipóxia pode

conduzir a uma melhoria do estado de oxigenação do tumor e assim promover

subsequentemente a sua progressão. [52-55]

As células tumorais para sobreviver, adaptam-se à baixa pressão de O2 e

aumentam a vascularização, estando envolvidos muitos produtos genómicos na neo

angiogénese tumoral. Um dos mais investigados é o VEGF, segregado pelas células

em hipóxia. Como já referido, para além de aumentar a vascularização, a hipóxia vai

iniciar resposta celular múltipla com a activação de proto ocogenes, [56] aumento do

transporte de glicose (GLUT1), [57] indução de enzimas glicolíticas (ENO1) [58] e

indução de vários genes apoptóticos (GADD45). [59]

De facto, os tumores primariamente hipóxicos, têm maior risco de progressão,

recorrência e morte, independentemente do tratamento inicial. [51, 60-66]

Estas adaptações, contribuem para a sobrevida fenotípica e agressividade

clínica. [67] Os clones de células cancerosas têm a capacidade de adaptação aos

meios de hipóxia, quer nos locais primários, quer nos locais de metastização. Os

mecanismos genéticos e epigenéticos de adaptação à hipóxia, como a instabilidade

genética, glicolise aeróbica, perca de controle do ciclo celular, perda dos sinais de

apoptose normais, são todos características de malignidade. [68]

2.4 - HIPÓXIA E FACTOR INDUTÍVEL POR HIPÓXIA - 1 ALFA

O Factor Indutível por Hipóxia, Hypoxia Inducible Factor, HIF, é um factor de

transcrição encontrado em células de mamíferos sob reduzida tensão de oxigénio e

que possui um papel central nas respostas celulares e sistémicas à hipóxia. [69-71]

O HIF-1 é um heterodímero composto por uma subunidade alfa de 120 kD

complexada com uma subunidade beta de 91-94 kD, dispostas em dupla hélix (bHLH),

que pertence a uma família de factores de transcrição que consiste em três sub

unidades alfa - HIF 1α, HIF 2α, HIF 3α – e uma sub unidade beta – HIF 1β – também

denominada translocador nuclear de hidrocarbonetos aril (ARNT). As interacções entre



os domínios bHLH de ambas as sub-unidades, regulam a sua dimerização. [72-78] Fig.

1.

bHLH αPASP402 P564ODD TAD-N ID

N803TAD-C

bHLH PAS

Actividade Transcrição

HRE

Dimeriza

ção

P300/CBP

NLS-N VHL

OH OH

α

β

NLS-C

Figura 1 - Estrutura Molecular de HIF-1 (adaptado de Shi YH et al in World J Gastroenterol 2004; 10 (8):1082-1087)

A subunidade alfa é rapidamente degradada em condições normais mas é

estabilizada pela hipóxia, sabendo-se que este factor regula o crescimento e a

evolução tumoral, podendo também representar um potencial alvo terapêutico, já que

é possível ajustar e regular a resposta do HIF.

O gene HIF1A, que codifica o HIF-1α, foi localizado no cromossoma 14q21-q24

contendo 15 exões, [79-80] é induzido por hipóxia, activando a transcrição de vários

genes de moléculas envolvidos em Oncobiologia, parecendo ser particularmente

importante na angiogénese tumoral. [81-82]

A hipóxia por si só é um forte factor epigenético para regular a proteína HIF-1α.

Para além de inibir as PHDs e a HIF-1α, gera radicais livres de oxigénio, que são

capazes de estabilizar a proteína HIF-1α [83-86] e de induzir os genes HIF1A e VEGF.

[87] Quando se estabelece a hipóxia, há uma resposta celular anti-apoptótica, [88]

sendo activados os factores de transcrição HIF-1α e HIF-2α, sabendo-se que o HIF-1α

gera um heterodímero com o HIF-1β (ARNT) no Elemento de Resposta à Hipóxia

(HRE), conduzindo à produção de VEGF, GLUT1 e CA9 – Fig. 2

O HIF1, regula através da expressão da sua sub unidade HIF1α, [89] a

expressão de genes associados à adaptação à hipóxia, como o VEGF e múltiplos

outros genes reguladores da via glicolítica que promovem a adaptação metabólica à

hipóxia sendo também regulado pela pressão de O2. [90]



Figura 2 - Regulação das sub unidades HIF sob a tensão de O2 (adaptado de T. Acker and K.H. Plate in Tumor Angiogenesis, Basic Mechanisms, ed. 2008, pág. 198.)

Este factor de transcrição activa genes cujas proteínas produzidas ou

aumentam a disponibilidade de oxigénio ou permitem a adaptação metabólica à

deprivação de oxigénio. Sabe-se que o HIF actua sobre genes codificadores da

eritropoietina, transferrina, endotelina 1, sintetase indutível de oxido nítrico, hemo-

oxigenase 1, factor de crescimento vascular endotelial (VEGF), factor de crescimento

insulínico 2 (IGF2), proteína de ligação 1, 2 e 3 do factor de crescimento insulínico

(IGFBP 1,2,3), transportadores de glicose (GLUTs) e enzimas glicolíticas, controlando

a expressão de mais de 40 genes e produtos proteícos envolvidos na angiogénese,

eritropoiese, glicólise, invasão, apoptose, tónus vascular, regulação do pH,

homeostasia epitelial e resistência a fármacos. [81,82,91,92] Múltiplas funções estão

dependentes do HIF, sabendo-se que mais de 60 genes-alvo são por ele induzidos, [70]

enquanto outros são reprimidos. [93,94] - Fig. 3.



Figura 3 - Respostas determinadas pelo HIF actua como o maior regulador fisiológico à Hipoxia (adaptado de T. Acker and K.H. Plate in Tumor Angiogenesis, Basic Mechanisms, ed. 2008, pág. 200)

A porção N-terminal da molécula (aminoácido 1-390) contem o domínio bHLH-

PAS, que é necessário para a dimerização e ligação ao DNA – Fig 1. O domínio C-

terminal tem como função sinalizar a translocação do HIF-1α para o núcleo, a

estabilização proteíca e a interacção com o co-activador p300. [91, 95-97]

Na presença de O2, os domínios das hidroxilases de prolina (PHD1, 2 e 3)

causam hidroxilação específica em dois resíduos de prolina (P402 e P564) no ODD do

HIF-1α. [98] Esta hidroxilação vai permitir o reconhecimento do HIF-1α pela proteína

Von Hippell Lindau (pVHL), formando-se o complexo E3 ubiquitina, tornando-o um alvo

para degradação. [99-102] Esta hidroxilação requer O2 e ferro, pelo que a sua

modificação pode desempenhar um papel na sua sensibilização. Jaakkola et al, [101]

demonstraram que a interacção entre a pVHL e o domínio específico do HIF-1α, é

regulado por hidroxilação do resíduo de prolina (HIF-1α P564) por uma enzima

denominada HIF-1α prolil hidroxilase (HIF-PH) – Fig. 4



Figura 4 - Regulação da estabilidade e actividade do HIF (adaptado de M.C. Brahimi-Horn in Tumor Angiogenesis, Basic Mechanisms, ed. 2008, pág. 176)

A pVHL é produto do gene VHL, possuindo um papel relevante como supressor

tumoral e tendo múltiplas funções, uma das quais, regular o HIF. [101]

A estabilidade e actividade transcripcional do HIF-1α, em situações de hipóxia,

são reguladas por outros mecanismos moleculares para além da hidroxilação,

sabendo-se por exemplo que a acetilação da lisina 532 pela acetiltransferase (ARD 1)

regulada por hipóxia, contribui para a ligação do HIF-1α a VHL. [58]

Em hipóxia, as PHDs (que requerem O2 para actuar) são inibidas e o HIF-1α já

não é degradado resultando a sua acumulação na forma heterodimizada com a sub

unidade beta (HIFβ). [103] Outro sensor de O2 é o Factor Inibidor de HIF-1 (FIH-1) que

hidroxila o HIF-1α na presença de O2 no resíduo de Asparagina 803 no domínio de

activação de transcrição de C-terminal (C-TAD), mas em hipóxia fica inactivo,

permitindo interacção com os co-activadores CBP/p300. [104]

As sub unidades HIF-1α e HIF-1β, formam um heterodímero, que migra para o

núcleo e liga-se ao HRE induzindo ou reprimindo a sua transcrição activando genes

envolvidos na adaptação à hipóxia, sobrevivência celular, angiogénese e

metastização, como por exemplo o VEGF, o factor de crescimento de transformação

alfa (TGF-α) o transportador 1 de glicose (GLUT1) a anidrase carbónica (CA9), entre

muitos outros que se sabe estarem envolvidos no desenvolvimento e agressividade

tumoral. [105] Fig. 3 e Fig. 5.



Enquanto o controlo da expressão genética de HIF-1β é ainda largamente

desconhecida e está associada a níveis celulares constantes, a actividade

transcripcional do gene HIF1A, encontra-se regulada pela tensão de oxigénio celular.

[106]

Figura 5 - Regulação do HIF-1α (adaptado de Molecular Medicine 2005, published by Cambridge University Press)

Adicionalmente, sabe-se que a expressão do HIF1A pode ser regulada por

outras vias, nomeadamente vias de sinalização intracelular, como a protéina cinase B

(AKT) e 3 Fosfatidil inositol cinase (PI3K), embora ainda não seja completamente claro

o exacto papel dessas vias de regulação. A via PI3K/PTEN/AKT/FRAP é uma via

modeladora da expressão de HIF-1α. [107-112]

Foram ainda descritas outras moléculas reguladoras do HIF1A, tais como

espécies reactivas de oxigénio (ROS) intervenientes na carcinogénese ou citoquinas

como o factor de necrose tumoral (TNFα) e a angiotensina, bem como outras vias de

sinalização como a RAS/RAF1/MEK1/ERK 1/2 e/ou p53/JNK, que são activadas em

resposta a oncogenes, factores de crescimento ou hipóxia - Fig 6. [113-115]



Figura 6 - Vias de sinalização e regulação do HIF-1 (adaptado de Shi YH et al in World J Gastroenterol 2004; 10(8): 1082-108)

O HIF possui um papel central quer nos mecanismos fisiológicos

homeostáticos, quer nos patológicos. [116-117] Actua sobre genes alvo, estando

envolvido na resposta à hipóxia mas também na homeostasia do oxigénio.

O principal regulador do HIF, é o oxigénio. [118] O segundo mais importante, são

os oncogenes que podem contribuir para estabilizar a proteína ou degradá-la. [119]

A biologia do cancro e a sua progressão, entre outros factores, vai depender da

alteração do metabolismo e transporte da glicose e da adaptação celular à hipóxia. Os

tumores não podem crescer sem angiogénese que permita a difusão de O2, glicose e

outros nutrientes. [120] Fig. 7.

O HIF-1α, é a sub unidade regulada por O2 que determina a actividade do

HIF1, que vai transactivar genes capazes de conduzir à produção proteica de produtos

que ou aumentam a disponibilidade de O2 ou permitem adaptação metabólica à falta

de O2, estando os produtos desses genes, implicadas na progressão tumoral. [88, 121-

124]



PO2

HIFα

Morte Celular

PO2

HIFα

Morte Celular

Figura 7 - Papel duplo do HIF na sobrevida e morte celular (adaptado de T. Acker and K.H. Plate in Tumor Angiogenesis, Basic Mechanisms, ed 2008, pág. 210)

A angiogénese consiste no desenvolvimento de novos vasos a partir da rede

vascular pré existente, tendo um papel preponderante em vários mecanismos

fisiopatológicos benignos (cicatrização, feridas, isquemia, retinopatia diabética) e

malignos. Tendo o VEGF um papel fundamental na angiogénese [126-126] e sendo o

VEGF regulado pelo HIF, [127] parece existir um racional oncobiológico para estudar a

repercussão, nos doentes com CaP, de uma variante genética funcional no gene

HIF1A.

Existe actualmente evidência de que os vasos tumorais, são desorganizados e

sem estrutura adequada à circulação, conduzindo com frequência ao colapso. Como o

crescimento tumoral exige oxigénio, nutrientes e função metabólica adequada para se

desenvolver, torna-se necessário promover a angiogénese para inibir a apoptose das

células tumorais desencadeada pela hipóxia. Deste modo, a angiogénese como

resposta à hipóxia tumoral, é mediada pelo HIF-1α. [116]

O HIF-1α tem sido considerado um factor chave na regulação de VEGF e do

seu receptor (VEGFR), bem como de outros factores angiogénicos. Estudos

imunocitoquímicos em diversos modelos tumorais, [128] revelaram sobre expressão de

HIF-1α associada a aumento do VEGF e aumento de vascularização e metastização,

resultando em pior prognóstico. [129-137]



2.5 - HIF 1Α E CANCRO DA PRÓSTATA: EVIDÊNCIAS E HIPÓTESES

A homeostasia da próstata normal é androgénio dependente. A dihidro

testosterona (DHT) liga-se aos receptores androgénios (AR) e este complexo vai

actuar sobre genes-alvo que fazem aumentar o crescimento celular, a sobrevida das

células e a produção de PSA.

O crescimento do CaP é também androgénio dependente ocorrendo células

que proliferam e células que morrem, sendo os androgénios os principais reguladores

desse ratio, estimulando a proliferação e inibindo a apoptose.

Muitos doentes apresentam-se com doença localizada sendo submetidos a

tratamento curativo, vindo contudo a ocorrer recorrência do cancro. Outros doentes,

apresentam-se desde logo com doença avançada. Para aqueles que recorrem ou para

os que são desde inicio tumores avançados, existe ainda o tratamento hormonal que

vai causar regressão do CaP por falta de estímulo à proliferação celular, ocorrendo

mais apoptose que proliferação.

Os AR têm papel importante no desenvolvimento, progressão e resposta

terapêutica ao CaP, constituindo a deprivação de androgénios o tratamento mais

frequente e antigo de CaP [138] e que por si só também induz ambiente de hipóxia

transitória. [139-140]

De facto, diversos estudos com animais, sugerem que a deprivação

androgénica vai gerar um estado de hipóxia transitória no tecido prostático levando à

morte endotelial, degeneração capilar e vasoconstrição nos tecidos prostáticos. Estes

estudos, também demonstram que as células recorrentes de CaP podem sobreviver

em ambiente de hipóxia constituindo clones de células resistentes. [141-145] Deste

modo, vários autores têm vindo a demonstrar que a hipóxia em CaP pode ser

determinante na progressão tumoral e no prognóstico da doença. [146-147]

Park et al em 2006, [148] mostraram que a actividade de ligação e transcrição de

AR aumenta em consequência de hipóxia consequente a tratamento, verificando-se

que os níveis de HIF-1α e de mRNA VEGF, aumentam com a duração da hipóxia e

diminuem durante a reoxigenação. Estes resultados, sugerem que os mecanismos de

estimulação de AR por hipóxia/reoxigenação, são únicos e parecem envolver a

sinalização de HIF-1α.

Os androgénios, estimulam directamente a angiogénese através da activação

de receptores de factores de crescimento e da via de sinalização fosfatidilinositol-3-

cinase/AKT, conduzindo à regulação independente de HIF-1α e sobre expressão de

VEGF ocorrendo na fase inicial do desenvolvimento da neoplasia. [103,111,148-149]



A deprivação androgénica é um tratamento frequente do CaP. Mas,

frequentemente com o decorrer da doença, o tratamento falha, surgem células

sobreviventes, denominando-se o tumor androgénio independente (AIPC, androgen

independent prostate cancer). Contudo, continua a exprimir AR e genes reguladores

de AR sugerindo a existência de um papel dos AR na sobrevida e crescimento das

células deste CaP agora androgénio independente. [150]

O tratamento hormonal falha porque as células outrora dependentes dos

androgénios para crescer, o fazem agora de modo androgénio independente (AI).

Muitos cancros tornam-se na sua evolução androgénio independentes (AI) progridem

e metastizam, havendo várias vias para que um CaP se torne AI e entende-las é o

primeiro passo para poder evitar e tratar esta forma letal de CaP. [151]

Os mecanismos de desenvolvimento da AI baseiam-se em alterações

genéticas com aparecimento de mutações ao nível dos AR [152,153] que vão determinar

aumento da sensibilidade dos AR a baixos níveis de androgénios [154] ou aumento da

expressão de AR por amplificação do gene que codifica o AR, [155] continuando a

funcionar dependentes dos androgénios, mas agora para níveis muito baixos. Pode

haver ainda aumento da produção endógena, induzida por mutações que conduzam a

vias paralelas independentes dos AR. Por outro lado, verifica-se que alguns doentes

em AI têm expressão aumentada do gene BCL2 [156] responsável por bloquear a

apoptose. Recentemente, alguns estudos [157,158] referem a possibilidade de haver sub

populações celulares iniciais – prostate epitelial stem cels - de células androgénio

independentes, que após se iniciar o tratamento hormonal, vão permanecer viáveis e

mais tarde terem a possibilidade de proliferar. Outra possibilidade, consiste na

activação dos AR por factores de crescimento [159] ou por activação dos receptores da

tirosina cinase [160] ou pelas vias da MAPK (mitogen activated protein kinase) e AKT e

não pelos androgénios. [110, 161-162]

O estudo de Boddy JL, [103] demonstra que o HIF regula o VEGF o que já havia

sido proposto pelo trabalho de Stefanou em 2004 [164] em que os níveis de VEGF eram

mais elevados nos doentes com CaP do que no tecido normal, HBP e PIN. Mas este

estudo também vem demonstrar que os androgénios usam a via da hipóxia para

controlar os níveis de VEGF no CaP, ao demonstrar que os níveis de HIF-1α estão

fortemente relacionados com os AR, suportando os trabalhos de Mabjeesh [111] de que

os androgénios activam o HIF-1α, conduzindo à expressão de VEGF nos tumores da

próstata androgénio sensíveis.

A eventual associação do polimorfismo HIF1A C1772T com o CaP AI, pode ter

importantes implicações para conhecer o desenvolvimento e progressão da doença.

[149, 167-170]



Estudos recentes, [169] têm demonstrado a existência de dois polimorfismos

nucleotídeos simples (SNP’s) no gene HIF-1α, resultando na substituição de

aminoácidos no ODD – Fig 8 e 9.

A: Gene HIF-1α em que NAD e CAD indicam os domínios N e C terminais para transcrição.A mutação de nucleotideos de CCA para TCA está assinalada com sublinhado.B: Sequência proteica junto do C terminal do ODD em que a Prolina é substituída por Serina.

A: Gene HIF-1α em que NAD e CAD indicam os domínios N e C terminais para transcrição.A mutação de nucleotideos de CCA para TCA está assinalada com sublinhado.B: Sequência proteica junto do C terminal do ODD em que a Prolina é substituída por Serina.

Figura 8 - Mutação de HIF-1 identificada por PCR e sequenciação do DNA (adaptado de Fu XS in Prostate 2005; 63:215-221)

Mutações neste domínio regulador, podem resultar na sobre expressão desta

proteína e consequentes alterações na expressão de genes alvo, contribuindo para

que as células malignas adquiram resistência terapêutica.

Estes polimorfismos foram estudados no carcinoma colo rectal, [165] carcinoma

células renais, [166] carcinoma espinocelular cabeça e pescoço e CaP, [168-169] mas com

estudos escassos e não conclusivos em CaP.

Também se verifica que o mRNA de HIF1A está sobre expresso em linhas

celulares de CaP de rato e com potencial metastático, quando se compara com tecido

normal, bem como em linhas celulares derivadas de metástases ósseas de CaP

humano. [110]

De modo concordante, em humanos, tem sido encontrada expressão

aumentada de HIF-1α em tumores da próstata. [112,121] O HIF-1α está sobre expresso

no CaP em relação ao tecido prostático normal. [121] Nas lesões de PIN alto grau,

verifica-se aumento de HIF-1α em relação ao tecido normal e à hiperplasia benigna. [149] Também se observa sobre expressão de HIF-1α nas metástases ósseas e níveis

aumentados de hipóxia estão associados a estadios clínicos mais altos. A sobre

expressão de HIF-1α parece ser um evento precoce na patogenese do CaP,



demonstrado também em modelos animais com ratinhos TRAMP (tansgenic

adenocarcinoma mouse prostate). [163,170-171] Estudos de imunohistoquímica

conduzidos por Zhong em 2004, [149] demonstraram a regulação do HIF 1α e de VEGF

em áreas de CaP quando comparado com tecido normal e com áreas de HBP, bem

como a sua presença nas áreas de PIN.

Figura 9 - Estrutura do HIF-1α e sequência de aminoácidos no exon 12. verifica-se a posição dos aminoácidos substituídos pelos polimorfismos; os números indicam a posição dos nucleotídeos ou dos aminoácidos (adaptado de Keiji Tanimoto in Carcinogenesis 2003, vol 24, nº 11, pág. 1780)

CAPÍTULO 3

OBJECTIVOS

Capítulo 3 - Objectivos


3 - OBJECTIVOS

O papel do HIF-1α no desenvolvimento e progressão do CaP não é claro e

baseados nas observações feitas por outros autores, analisamos uma série de

doentes com CaP procurando alterações no ODD que possam aumentar a

estabilidade de HIF-1α.

Neste estudo pretendemos investigar a associação entre um polimorfismo

funcional no HIF-1α em doentes com doença localizada, com doença localmente

avançada e com CaP AI, tentando relacionar o perfil genético com a evolução clínica,

no sentido de avaliar o papel do HIF-1α no desenvolvimento e progressão do CaP,

utilizando como população controlo doentes com HBP histologicamente comprovada.

3.1 - OBJECTIVO ESPECÍFICO

Analisar a frequência do polimorfismo genético HIF1A P582S em doentes com

CaP e doentes com HBP e avaliar a sua relação com a susceptibilidade para CaP.

Estudar a associação deste polimorfismo com as características clínico

patológicas dos doentes com CaP e sua evolução clínica.

Avaliar a influência do polimorfismo no intervalo livre de androgénio

independência (AI) em doentes submetidos a tratamento com bloqueio androgénico.

Capítulo 3 - Objectivos


CAPÍTULO 4

MATERIAL E MÉTODOS

Capítulo 4 - Material e Métodos


4 - MATERIAL E MÉTODOS

4.1 - POPULAÇÃO

Neste estudo tipo caso-controlo foram analisadas amostras de DNA de 726

homens. Quatrocentos e noventa e quatro (67,2±7,7 anos de idade) foram

diagnosticados histopatologicamente com cancro da próstata (Casos) entre 1997 e

2008 no Hospital Militar do Porto, Hospital S. João e Centro Hospitalar de Lisboa

Central. Para estadiamento, foi usada a Classificação TNM da UICC (Tumor, Node,

Metastasis) de 2002, 6th edition, sendo definida Doença Local para doentes com T1-

T2, Nx-N0, M0 e Doença Localmente Avançada para doentes com tumores T3-T4, Nx-

N1, M0-M1.

Neste grupo de doentes com cancro da próstata, 55.9% (n=276) apresentavam

no momento do diagnóstico doença localizada e 44.1% (n=218) doença avançada.

Trezentos e dezanove doentes (319) foram submetidos a tratamento hormonal, dos

quais 23.2% (n=74) se tornaram AI.

Foram também incluídos no estudo 232 homens (66,8±7,6 anos de idade) sem

evidência de doença oncológica (Controlos) com diagnóstico histopatológico de

hiperplasia benigna da próstata. Após informação sobre o estudo, todos os

participantes consentiram participar, de acordo com os princípios da Declaração de

Helsínquia.

Duzentos e vinte doentes (n=220) foram submetidos a tratamento com intenção

curativa - cirurgia, radioterapia ou braquiterapia – definido por valores de PSA de 0,0

ng/ml 3 meses após a cirurgia, 2.0 ng/ml 12 meses após RT e 0.5 ng/ml 12 meses

após BT (critérios da EAU e NCCN) tendo-se verificando a ocorrência de recidiva

bioquímica em 9,3% dos doentes (intervalo de follow up entre 12-132 meses).

4.2 - PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

Após obtenção de consentimento informado, foram colhidos de cada indivíduo

8ml de sangue venoso periférico por venopunção do antebraço. O isolamento de DNA

genómico foi efectuado através do método de centrifugação por colunas - kit de

extracção QIAmp DNA Blood Mini Kit, Quiagen.



4.2.1 - Genotipagem do polimorfismo HIF1A 1772C>T (P582S)

A genotipagem do polimorfismo HIF1A 1772C>T (P582S) foi efectuada através

do método Taqman SNP (Applied Biosystems), por PCR em Tempo Real (RT-PCR).

Foram utilizadas sondas específicas (assay C__25473074_10, Applied Biosystems)

com afinidade para cada uma das sequências nucleotídicas que envolvem os

nucleótidos C e T do locus +1772 do gene HIF1A, cada uma com um fluorocromo

acoplado (VIC-nucleótido C, FAM-nucleótido T). Num volume de mix de 5µl por

amostra, foram adicionados Taqman Master mix (2.5 µl), Taqman assay (0.125 µl) e

H2Odd (2.375 µl). Para um volume de reacção total de 6 µl adicionou-se 1µl de DNA

(0.1 µg). As condições de reacção foram as seguintes: 95ºC (10 min), seguido de 40

ciclos de desnaturação a 92º C (15 seg) e annealing/extensão a 60º C (1min). O

software “7300 System SDS” foi utilizado para discriminação alélica (Fig. 10). Como

controlo de qualidade da genotipagem, foram usados controlos negativos para

confirmar a ausência de contaminação e o procedimento de genotipagem foi repetido

em 10% das amostras, com reprodutibilidade total.

Figura 10 – Exemplo de análise genotípica para o polimorfismo HIF1A P582S, segundo o método de distribuição alélica.

4.3 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística de variáveis categóricas foi efectuada considerando as

distribuições genotípicas estratificadas de acordo com os grupos (CaP, HBP), com as

características clinicopatológicas dos pacientes (grau Gleason, % de tumor, estadio da

doença, androgénio independência, metástases à distância e PSA de diagnóstico < 10



ng/ml, 10-20ng/ml e ≥ 20 ng/ml). Foi usado o teste qui-quadrado (2) para análise de

diferenças entre genótipos.

Relativamente às variáveis contínuas (idade de diagnóstico, intervalo livre de

doença e PSA diagnóstico), foi testada a normalidade através dos testes Kolmogorov

Smirnov e Shapiro-Wilk. Posteriormente foi usado o teste Mann-Whitney U para

variáveis não-paramétricas e o teste T Student para variáveis paramétricas, como

métodos de comparação das médias de acordo com os genótipos.

O grau de associação entre o polimorfismo genético e CaP, foi calculado

através do Odds Ratio (OR) e respectivos intervalos de confiança 95% (IC 95%). Foi

aplicada no cálculo do OR a regressão logística binomial considerando como

covariável a idade de diagnóstico (≥67 anos vs. <67 anos). Utilizou-se o modelo

recessivo para análise de risco de CaP associado ao polimorfismo HIF1A P582S,

devido às repercussões funcionais previamente descritas na literatura.

A análise multivariada da associação entre a variante genética HIF1A P582S e

o tempo até androgénio independência nos doentes em tratamento hormonal, foi

efectuada através da regressão de Cox usando como covariáveis o estadio (local vs

avançado) o tabaco (fumador vs não fumador) a idade (< 67 vs ≥ 67 anos) e o valor de

PSA (< 20 vs ≥ 20ng/ml). As curvas de sobrevida foram extrapoladas a partir da

regressão de Cox.

Os valores de PSA no momento do diagnóstico foram estratificados de acordo

com os pontos de corte de PSA 10ng/ml (≥10ng/ml vs. <10ng/ml) e PSA 20ng/ml (

≥20ng/ml vs. <20ng/ml) de acordo com a associação a neoplasia maligna e risco de

micrometastização oculta à distância, respectivamente. O grau de Gleason (2-10) foi

estratificado segundo 3 grupos (≤ 6, 7, ≥8), de acordo com a associação a doença

mais agressiva.

A androgénio independência (AI) foi definida em doentes a fazer tratamento

hormonal, com níveis séricos de castração, após manipulação hormonal de segunda

linha, verificando-se três aumentos consecutivos dos valores de PSA, havendo no

espaço de duas semanas um aumento do valor de PSA de pelo menos 50%,

implicando sempre progressão da doença apesar dos níveis de castração se

manterem – Testosterona < 50ng/dl.

O intervalo livre de doença (ILD) designa-se como intervalo de tempo (em

meses) entre a data de diagnóstico e a data de AI e entre o tratamento curativo e a

recidiva bioquímica, definida pela subida em duas medidas consecutivas do PSA com

valores > 0,2ng/ml para a Cirurgia Radical, PSA > 2ng/ml para os doentes submetidos

a Radioterapia e PSA > 0,5ng/ml para doentes submetidos a Braquiterapia.



Os dados foram analisados usando o Statistical Package for Social Sciences —

SPSS for Windows (version 15.0) e foram considerados estatisticamente significativos

valores de p inferiores a 0.05.

CAPÍTULO 5

RESULTADOS

Capítulo 5 - Resultados


53

5 - RESULTADOS

5.1 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO PRÓSTATA

A distribuição das frequências genotípicas do polimorfismo HIF1A+1772C>T

entre o grupo controlo e o grupo de homens com cancro da próstata, está descrita no

Quadro 1. Observam-se diferenças estatisticamente significativas da distribuição dos

genótipos entre o grupo controlo e o grupo de casos, verificando-se frequências mais

elevadas do genótipo CT nos doentes com CaP. Os portadores heterozigóticos, têm

um risco significativamente aumentado para desenvolver CaP, comparando com os

portadores CC (OR=1,55, p=0,037). As frequências alélicas, foram semelhantes em

cada um dos grupos estudados, não se verificando qualquer diferença

estatisticamente significativa (p=0,216).

Quadro 1 - Frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo HIF1A+1772C>T no grupo de Controlos e de Casos

Controlos Casos

N N OR IC 95% p

(Frequência) (Frequência)

Genotipos

CC 190(0,82) 376(0,76) Referente - -

CT 36(0,16) 111(0,23) 1,55 1,00-2,40 0,037

TT 6(0,02) 7(0,01) 0,81 0,49-1,34 0,379*

Alelos

C 414(0,90) 863(0,87) Referente - -

T 48(0,10) 125(0,13) 1,25 0,87-1,81 0,216

OR, "odds ratio"

IC95%, Intervalo Confiança 95%

* Teste Exacto Fisher


A análise de acordo com o perfil fenotípico funcional, estratificando os

genótipos segundo o modelo recessivo (CC vs. CT/TT), permite observar uma sobre

representação de portadores T no grupo de CaP, comparativamente com os Controlos

(frequências genotípicas 0,24 vs 0,18 respectivamente) – Quadro 2. Existe uma

tendência de risco aumentado de cancro nos portadores de T (aOR= 1,47, IC

95%=0,98-2,20, p=0,063) após ajustamento para a idade.

Quadro 2 - Distribuição Genotipica do polimorfismo HIF1A+1772 C>T no grupo Controlo e no grupo de Casos, de acordo com o modelo recessivo

Controlos Casos N(frequência) N(frequência) OR IC 95% p

Genótipos

CC 190(0,82) 376(0,76) Referente - _

CT/TT 42(0,18) 118(0,24) 1,41 0,95-2,09 0,084

aOR=1,47, IC 95%=0,98-2,20, p=0,063

aOR, Odds Ratio com ajustamento para idade

5.2 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA AGRESSIVIDADE DO CANCRO PRÓSTATA

O Quadro 3, evidencia a análise de risco para os portadores de T serem

diagnosticados com doença agressiva. A estratificação dos indivíduos com CaP

segundo as características anatomo patológicas e de acordo com a distribuição dos

genótipos do polimorfismo HIF1A+1772C>T, demonstra um risco significativamente

aumentado para que os portadores de T desenvolvam metastização à distância

(p=0,017) e para terem doença avançada no momento do diagnóstico (p= 0,044).

Existe uma tendência estatística para que os portadores T tenham no momento do

diagnóstico valores de PSA > 20ng/ml (p= 0,056) e para apresentarem Gleason ≥ 8

(p=0,083), no momento do diagnóstico, ou seja, doença mais agressiva. Não se



55

verificou associação com significado estatístico entre o genótipo do polimorfismo

HIF1A+1772C>T e o desenvolvimento de Androgénio Independência (p=0,161).

Quadro 3 - Risco para os portadores do alelo T do polimorfismo HIF1A+1772C>T no momento do diagnóstico para apresentar doença avançada, metástases, Gleason ≥ 8, PSA > 20ng/dl e AI por comparação com o grupo controlo. Genótipos HIF1A1772 C>T

CC CT/TT aOR IC 95% p

Grupo Controlo 190 (0,82) 42 (0,18) Referente

Gleason ≥ 8 58 (0,73) 21 (0,27) 1,72 0,93-3,15 0,083

Metástases 45 (0,69) 20 (0,31) 2,16 1,15-4,06 0,017

D. Localmente Avançada 106 (0,74) 38 (0,26) 1,69 1,02-2,81 0,044

Androgénio-independência 56 (0,76) 18 (0,24) 1,6 0,83-2,98 0,161

PSA ≥ 20 76 (0,73) 28 (0,27) 1,72 0,99-3,00 0,056

aOR, Odds Ratio ajustado para idade

Em 261 casos, avaliou-se a percentagem de volume tumoral histologicamente

identificado, tendo-se observado nas amostras de material prostático submetido a

análise anatomo-patológica, que a percentagem de volume tumoral era

significativamente maior nos indivíduos TT/TC (p=0.03) - Gráfico 1.

CC portT (TT/TC)

HIF 1772 C>T

0

20

40

60

% T

umor

Gráfico 1- Percentagem de volume tumoral avaliada por análise anatomo-patológica, de acordo com o polimorfismo HIF1A+1772 C>T (média e desvio padrão).

Mann-Whitney U p=0.033 *


5.3 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA

A análise multivariada do intervalo livre de doença (ILD) nos doentes

submetidos a tratamento hormonal, foi efectuada através do modelo de regressão de

Cox, tendo-se evidenciado um risco 59% menor para os portadores CT/TT, após

ajustamento para a idade, estádio da doença, PSA e consumo de tabaco (OR=0,41;

IC95%=0,19-0,90; p=0,026) - Gráfico 2. Os homozigóticos C apresentam um tempo

médio até AI significativamente inferior aos portadores T (104.3 vs. 115.2 meses,

respectivamente).

Gráfico 2 -Sobrevida cumulativa, segundo a análise de regressão de Cox para o Intervalo Livre de Doença, de acordo com o polimorfismo HIF1A+1772 C>T.

Quando estratificados segundo o estadio da doença – Quadro 4 - em doença

localizada e doença avançada, verificamos no primeiro grupo doentes que a

associação com recidiva bioquímica, parece estar relacionada apenas com os valores

do PSA > 10ng/ml no momento do diagnóstico (p=0,032). No grupo de doentes com

doença avançada, observa-se a existência de relação da percentagem de volume

tumoral com desenvolvimento de AI (p=0,042) e de uma tendência para a relação

entre os valores de PSA e o aparecimento de AI (p=0,069).



57

Quadro 4 - Análise da resposta terapêutica da Doença Localizada e da Doença Avançada Doença localizada Doença avançada Rec Bioq S/ Recidiva p Com AI Sem AI p

Genótipos HIF

CC 14(0,78) 56(0,76) 55(0,76) 45(0,69)

CT/TT 4(0,22) 18(0,42) 0,851 17(0,24) 20(0,31) 0,346

Gleason

≤7 19(0,90) 65(0,93) 32(0,59) 42(0,63)

>8 2(0,10) 5(0,07) 0,888 22(0,41) 25(0,37) 0,859

%Tumor SEM 16,114,62 15,01,93 0,795 79,33+/-4,67 60,337,00 0,042

PSA SEM 7,960,76 6,30,35 0,032 158,4945,47 68,9417,57 0,069

SEM, Erro Padrão da Média

CAPÍTULO 6

DISCUSSÃO

Capítulo 6 - Discussão


6 - DISCUSSÃO

Apesar da grande evolução tecnológica verificada nos últimos anos, o

conhecimento e fundamentalmente o tratamento do CaP, pouco tem evoluído. O CaP,

continua a ser uma doença heterogénea, com múltiplas facetas, variando

consideravelmente no seu perfil genético e comportamento biológico o que torna difícil

e complexa a sua abordagem terapêutica, sendo fundamental detectar e identificar os

cancros agressivos, dirigindo para estes os esforços e os recursos disponíveis.

No desenvolvimento do tumor e determinante para a sua agressividade,

residem importantes factores de progressão próprios das células neoplásicas, mas

condicionados pela variabilidade genética do hospedeiro.[1]

Actualmente, é consistente o papel determinante da hipóxia na adaptação

genética e epigenética de clones celulares, aumentando a capacidade de invasão e de

metastização. [67,68] A adaptação das células neoplásicas à hipóxia, tornam os tumores

mais difíceis de tratar e eventualmente mais resistentes às terapêuticas existentes. A

hipóxia por si só é um forte factor epigenético para regular a proteína HIF-1α, gerando

radicais livres de oxigénio, que são capazes de a estabilizar e de induzir os genes

HIF1A e VEGF. [86,87] Por outro lado, a hipóxia é um mediador da instabilidade

genómica e da reparação de DNA, contribuindo para a activação de oncogenes e

inactivação de genes supressores tumorais promovendo a angiogénese, progressão e

metastização. [53-55] Adicionalmente, um número crescente de estudos evidencia que a

hipóxia tumoral possui um impacto relevante na expressão genética, com alterações

nas enzimas glicolíticas, factores de crescimento ou moléculas pró-angiogénicas, as

quais parecem ser um factor de agressividade e progressão tumoral. [51]

De facto, a identificação do sistema de transcrição do HIF em 1995 por

Semenza e Wang [72] foi fundamental para perceber a fisiologia do O2, estando

actualmente bem estabelecido que o HIF e a hipóxia são os maiores determinantes de

angiogénese e que regulam os mecanismos pró-invasão e de metastização .[92-94].

Contudo, também se sabe que a resposta do hospedeiro à hipóxia, reflecte o

perfil genético individual, sendo os polimorfismos a principal fonte de variabilidade,

associando-se frequentemente à iniciação e progressão tumoral. O conhecimento da

distribuição das frequências alélicas dos SNPs em diferentes populações e em cada

indivíduo, poderá constituir um importante auxílio para interpretar a variabilidade da

evolução clínica e da resposta terapêutica, para tumores aparentemente semelhantes.



6.1 - DISTRIBUIÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T EM POPULAÇÕES NORMAIS: IMPLICAÇÕES EPIDEMIOLÓGICAS E METODOLÓGICAS.

No presente estudo – Tabela 1 – em que a população controlo apresentava

comprovadamente patologia benigna (n=232) verificamos que a frequência genotipica

dos portadores T, é concordante com a verificada em outros estudos, mas

significativamente distinta da distribuição observada em dois estudos europeus

(Irlanda e Turquia) e num estudo envolvendo população americana (EUA) –

Ollerenshaw 2004, Apaydin 2008, Chau 2005, respectivamente.

O trabalho de Chau et al, [167] que envolve indivíduos americanos de diferentes

etnias, caucasianos e negros, apresenta uma frequência dos genótipos CT/TT

significativamente mais baixa que a do presente estudo (0,09 vs 0,18, p=0,005). Um

outro estudo realizado na população turca (Apaydin et al, 2008) evidencia uma

frequência dos genotipos CT/TT significativamente mais elevada comparativamente

com o presente estudo (0,33 vs 0,18, p=0,002). Estes dois estudos, parecem reflectir

as características étnicas subjacentes ao perfil correspondente ao seu património

genético, que, é sabido, confere distintos contextos individuais de exposição e de risco

para cancro. [1, 13, 15]

Estas diferenças na distribuição genotípica entre populações controlo, poderá

atribuir-se igualmente ao processo de inclusão dos indivíduos nos estudos. Enquanto

nestes estudos foram recrutados indivíduos sem evidência de doença aparente, sem

definição de critérios, sem estratificação para a raça ou a idade e sem medição dos

valores de PSA, no presente estudo, para garantir a inexistência de CaP, foram

incluídos apenas homens com comprovação histológica de ausência de CaP,

características demográficas semelhantes aos casos e avaliados os seus valores de

PSA. Apesar de permanecer por estabelecer de modo definitivo o papel da HBP na

etiopatogenia do CaP, não podemos excluir que o microambiente indutor de

hiperplasia da próstata, possa incluir mecanismos de hipóxia, o que a verificar-se

tornará esta população controlo, sem cancro, ainda mais semelhante aos indivíduos

com CaP. Julgamos que estudos futuros, poderão também verificar o papel da hipóxia

e do HIF-1α no processo de desenvolvimento da HBP.

Relativamente ao estudo de Ollerenshaw et al, [166] realizado em caucasianos

irlandeses, verifica-se uma frequência de CT/TT completamente invertida,

comparativamente com todos os estudos efectuados até ao momento (CC, 0.01;

CT/TT, 0.99). Estes resultados poderão ser atribuídos à metodologia utilizada (PCR-



RFLP) e à ausência de métodos distintos para confirmação de 10% dos resultados da

genotipagem. Comulativamente, tentamos inicialmente no nosso laboratório reproduzir

o método descrito por Ollerenshaw nas nossas amostras, verificando-se grande

dificuldade em termos de sensibilidade e reprodutibilidade comparativamente com o

método de RT-PCR (discriminação alélica).

No presente estudo, salientamos o facto de envolver um número significativo

de doentes, comprovadamente com patologia benigna, apresentando doentes com

idade semelhante à população com CaP e glândulas prostáticas com volume e valor

de PSA muito semelhantes. Tabela 1 - Frequências genotípicas do polimorfismo HIF1A+1772C>T em populações controlo, comparadas com o presente estudo

* Teste qui-quadrado de Pearson

Etnias: asiática (), caucasiana (), negróide ()

RT-PCR, Real Time-PCR

PCR-RFLP, PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism

DHPLC, Denaturing High-Performance Liquid Chromatography

Contudo, como veremos, existe uma dificuldade real em replicar as alterações

encontradas nos SNP. Em nossa opinião e de outros autores, [1] tal deve-se a vários

factores. Em primeiro lugar devido ao modesto efeito que cada polimorfismo possa ter

apesar da sua importância relativa. Depois devido ao fraco poder das amostras

estudadas geralmente envolvendo 100 a 500 casos, insuficiente para demonstrar a

influência de cada SNP. Por outro lado, em regra para cada polimorfismo são

estudadas populações diferentes, com graus de gravidade de doença diferente, não

permitindo retirar conclusões homogéneas. Estudos com maiores populações e com

Polimorfismo HIF1A +1772

População N CC CT/TT p * Genotipagem Referência

Portugal () 232 190 (0,82) 42 (0,18) Ref. RT-PCR Presente estudo,2008

Japão () 100 89 (0,89) 11 (0,11) 0,105 Sequenciação Kuwai, 2004

UK () 162 1 (0.01) 161 (0.99) <0,0001 PCR-RFLP Ollerenshaw, 2004

USA (, ) 196 179 (0,91) 17 (0,09) 0,005 Sequenciação Chau, 2005

Suécia () 258 213 (0,83) 45 (0,17) 0,848 PCR-RFLP Fransen, 2006

USA (?) 1271 995 (0,81) 239 (0,19) 0,653 PCR-RFLP Li, 2007

Turquia () 102 68 (0,67) 34 (0,33) 0,002 PCR-RFLP Apaydin, 2008

China () 104 93 (0,89) 11 (0,11) 0,080 PCR-RFLP Ling, 2005

Japão () 110 98 (0,89) 12 (0,11) 0,088 DHPLC Tanimoto, 2003

Japão () 572 494 (0,86) 78 (0,14) 0,107 RT-PCR Yamada, 2005



critérios semelhantes dos doentes analisados são necessários para clarificar o papel

dos SNP no CaP. [1]

6.2 – ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T COM SUSCEPTIBILIDADE PARA CaP

Estudos recentes de imunohistoquímica, demonstraram uma expressão

aumentada de HIF-1α em doentes com PIN sugerindo que possa estar envolvido na

fase inicial de carcinogénese. [136] Os doentes com PIN, podem não continuar o seu

desenvolvimento para cancro ou então vir a produzir tumor histologicamente não

relevante, pensando-se que a angiogénese possa ser determinante na modificação da

história natural da doença.[149] A angiogénese vai aumentar a oferta de oxigénio e de

nutrientes que proporcionam o crescimento celular e a transformação. [173] Comparado com tecido prostático normal ou com HBP, no PIN de alto grau evidencia-

se importante actividade angiogénica reflectida pela presença de maior densidade

microvascular [174] tendo vários estudos demonstrado aumento da expressão de

VEGF e de proteínas de ligação do IGF (IGFBP2 e IGFBP3) em doentes com PIN alto

grau. [175,176]

Vários estudos demonstraram previamente que o HIF-1α se encontra sobre-

expresso em vários tipos de tumores, quando comparados com os respectivos tecidos

normais, incluindo nos tumores da próstata, [121,149] parecendo ser evidente que a

sobre expressão de HIF-1α possa ocorrer desde as fases iniciais da carcinogénese.

O estudo de Fu XS et al, [169] demonstrou que a variante genética

HIF1AP582S, é uma variante estável e que pode contribuir para a iniciação ou

desenvolvimento neoplásico de cancro de elevado grau ao permitir o aumento dos

níveis de HIF-1α e aumentar a expressão de genes alvo do HIF-1α. Assim, devido à

sua repercussão funcional e por representar um mecanismo central no

desenvolvimento neoplásico, este polimorfismo será um bom candidato como factor de

risco para desenvolvimento neoplásico e como marcador de doença de mau

prognóstico em doentes com cancro, quer para a sua evolução, quer como factor de

prognóstico terapêutico.

Os resultados do presente estudo, em que foi estudada uma população de

doentes com CaP em diferentes estádios de evolução, comparada com uma

população controlo caracterizada por apresentar comprovadamente patologia benigna,



permitem constatar risco aumentado nos portadores CT para desenvolver CaP,

comparativamente com os portadores CC (OR=1,55, p=0,037). Após ajuste estatístico

para a idade, verificou-se que os portadores T apresentavam tendência para

desenvolver CaP (aOR= 1,47; IC 95%=0,98-2,20; p=0,063). A reduzida frequência

genotípica de homozigóticos T parece estar de acordo com estudos realizados em

outras populações.

Devemos contudo referir que a população controlo do presente estudo, quando

comparada com estudos semelhantes – Tabela 2 – é constituída por doentes com

patologia benigna comprovada por histologia. No entanto, o número reduzido de

controlos (n=232) relativamente aos casos (n=494) pode ter interferido no poder

estatístico da análise, contribuindo para a ausência de significância estatística.

No presente estudo, não observamos associação com AI, ao contrário do

trabalho de Chau et al, [167] no entanto a diferença no processo de inclusão de

controlos e suas características, a variabilidade étnica dos indivíduos nesse estudo e

até o número reduzido de doentes com AI (n=74) no nosso estudo, são explicações

plausíveis para a falta de consistência entre estudos quanto à influência do

polimorfismo HIF1A+1772C>T no desenvolvimento de AI.

Tabela 2 - Polimorfismo HIF1A+1772C>T em diferentes estudos

Modelo

Oncológico

N

controlos

N

casos

OR*ª IC 95% p Referência

Ca Prostata 232 494 1,41 0,95-2,09 0,084 Presente estudo, 2008

Ca Prostata HR 232 74 1,6 0,83-2,98 0,161 Presente estudo, 2008

Ca Prostata HR 196 196 2,29 1,19-4,45 0,007 Chau et al, 2005[167]

Ca Prostata 300 402 4,18 1,11-17,9 0,018 Mabjeesh et al, 2007[177]

Ca Colo rectal 258 198 0,88 0,52-1,49 0,61 Fransen et al, 2006 [178]

Ca Colo rectal 100 100 0,00 0,00-0,44 0,0006 Kuwai et al, 2004 [165]

Ca Cel Renais 162 160 0,06 0,00-0,41 0,0002 Ollerenshaw et al, 2004[166]

* OR sem ajustamento para outras covariáveis; ª OR para desenvolver doença nos portadores CT/TT



De modo semelhante ao presente trabalho, Mabjeesh NJ et al [177] num estudo

sobre o polimorfismo HIF1A P582S envolvendo 402 doentes de raça judaica,

verificaram significativa susceptibilidade para CaP nos portadores (OR:4,10;

IC95%:1,11-17,9; p=0,018) mas esta alteração não se mostrou relevante em qualquer

outra característica clínica ou patológica da população estudada, tendo usado como

população controlo 300 mulheres com idade entre 20 e 45 anos.

6.3 - POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA EVOLUÇÃO CLÍNICA E NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA

O défice de oxigénio foi demonstrado em várias neoplasias humanas,[60]

parecendo ser responsável pela eficácia limitada de alguns tratamentos oncológicos,

nomeadamente radioterapia e quimioterapia. [51]

Por outro lado, parece haver uma relação directa entre angiogénese e

metastização em diversos tipos de tumores como melanomas, gliomas, pulmão,

mama, ovário, próstata e bexiga, [128-132] verificando-se que proteínas alvo do HIF-1α,

estão envolvidas na proliferação, sobrevida, adesão e mobilidade das células

neoplásicas. A sobre expressão de HIF-1α combinada com mutações inactivadoras

em genes supressores como VHL, p53, PTEN ou amplificação de oncogenes Akt,

RAS, ERK1/2, tem sido frequentemente observada em doentes oncológicos, estando

estas alterações associadas ao crescimento tumoral, invasão e metastização.

A expressão aumentada de HIF-1α, está associada a menor sobrevida no

cancro da mama e do útero e a má resposta terapêutica no cancro nasofaríngeo,

constituindo suporte à influência da hipóxia tumoral no prognóstico. [60, 129, 133-135]

No CaP, em particular doentes com cancro metastizado ou AI, foi já

demonstrado que o gene VEGF, principalmente induzido pelo HIF-1α, está

frequentemente sobre expresso [136-137] sugerindo o papel central do HIF1A na

mediação deste processo.

Du et al, [172] confirma níveis mais elevados de HIF-1α em tecido de CaP

quando comparado com tecido normal e com HBP. Estes investigadores, verificaram

que à medida que o CaP progride, a quantidade e densidade de microvasos aumenta,

em função do grau tumoral o que pode ser coordenado com o aumento da hipóxia e

subsequente produção de VEGF.

No nosso trabalho, analisada a associação do polimorfismo com as

características anatomo patológicas dos casos, verifica-se um risco significativamente



aumentado nos portadores de T (p=0,017) para o desenvolvimento de metastização à

distância e para ter doença avançada no momento do diagnóstico (p= 0,044). Verifica-

se ainda uma tendência mais marcada nos portadores T, para ter PSA > 20ng/ml (p=

0,056) e Gleason ≥ 8 (p=0,083), no momento do diagnóstico. Estes resultados,

permitem no constatar que há uma tendência de associação do polimorfismo com

doença mais agressiva. No entanto, não se verificou associação com significado

estatístico entre o genótipo do polimorfismo HIF1A+1772C>T e o desenvolvimento de

AI.

Outro parâmetro avaliado, foi a percentagem de volume tumoral

histologicamente identificado, tendo-se verificado que a percentagem de volume

tumoral foi significativamente maior nos indivíduos TT/TC (p=0.03) e que estava

associada ao aparecimento de AI (p=0,042). Estes resultados, poderão estar

relacionados com a existência de ambiente tumoral com mais biodisponibilidade de

HIF-1α, favorecendo a progressão da doença.

6.4 - ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO HIF1A+1772C>T NA RESPOSTA À TERAPÊUTICA HORMONAL, AVALIANDO O INTERVALO LIVRE DE DOENÇA

O meio ambiente tumoral é bem caracterizado se o entendermos como uma

flutuação de hipóxia e deprivação de nutrientes, que conduz à adaptação genética e

epigenética de clones celulares, aumentando a capacidade de invasão e de

metastização. Por outro lado, estas adaptações à hipóxia, tornam os tumores mais

difíceis de tratar e com maior resistência às terapêuticas existentes. Estudos recentes,

têm vindo a mostar que o HIF, pode ter um papel importante na resistência a

tratamentos, através da regulação da glicoproteina P. [83-85]

Estudos experimentais em células de CaP de rato, demonstram que uma

sobre-expressão de HIF-1α se associa a maior crescimento tumoral e potencial

metastático. [163]

O papel central do HIF-1α na homeostasia do oxigénio sugere que a sua

expressão poderá ser crítica no fenótipo letal do CaP. Vários estudos publicados

implicam o HIF-1α no CaP metastático, tendo-se verificado que esta molécula se torna

desregulada no tumor prostático e assim conduz à transcrição de genes adaptativos à

hipóxia envolvidos na carcinogénese e progressão tumoral. [121,149,163]

Cumulativamente, existem outras evidências com plausabilidade biológica que

envolvem o HIF-1α em vias conhecidas de tumorigénese e metastização do CaP.



Está bem estabelecido que os androgénios e o respectivo receptor possuem

um papel central no desenvolvimento de CaP. [12] Evidências recentes sugerem que a

angiogénese também é regulada por androgénios através da mediação do HIF1α.[111]

Assim, variações na sequência nucleotídea do ODD do HIF1A que contribuam para a

sua estabilização, conduzindo à expressão de VEGF e consequentemente a

angiogénese, podem favorecer um fenótipo tumoral mais agressivo. A hipóxia regula a

angiogénese através do HIF. Na próstata, a expressão de VEGF está correlacionada

com a presença de androgénios num processo mediado pelo HIF, verificando-se no

CaP sob bloqueio androgénico uma diminuição do VEGF e um aumento nos tumores

androgénio independentes. [164] No CaP, os androgénios regulam o HIF-1α através dos AR e por sinalização

dos receptores da tirosina cinase. [68] A sobre expressão de HIF1α não é só devida à

epigenética consequente à hipóxia tumoral, parecendo existir um papel dos

androgénios e seus receptores. Os anti androgénios podem bloquear a transcrição de

HIF-1α e a produção de VEGF. [162] Por outro lado, a produção de EGF que é também

androgénio mediada, actua através do EGFR nas células de CaP pela via

PI3K/AKT/mTOR para aumentar os níveis de HIF-1α. [110] Recentemente Boddy et al, [103] demonstraram que a expressão de HIF-1α e de HIF-1β estavam significativamente

relacionadas com os receptores androgénios, com receptores da tirosina cinase e com

a sinalização PI3K/AKT-1/mTOR. [68,107,110]

Em estudos recentes envolvendo doentes com CaP AI, identificou-se a

presença da variante no locus +1772C>T (P582S) identificando-se mutações no ODD

de HIF-1α. A presença destas mutações, significa que a activação de HIF-1α pode ser

seleccionada para tornar expressa esta proteína em condições não apropriadas (não

previstas) o que pode conduzir a aumento da agressividade biológica e contribuir para

a resistência a tratamentos.[106,167-169] Contudo, são estudos com número de

doentes envolvidos insuficiente para permitir conclusões, estando por realizar estudos

de Epidemiologia Molecular sobre a frequência do polimorfismo HIF1α P582S em CaP. No presente estudo, a análise multivariada do ILD através do modelo de

regressão de Cox evidenciou um risco relativo 59% menor para os portadores CT/TT,

após ajustamento para a idade, estadio da doença, PSA e hábitos tabágicos,

(OR=0.41; IC95%=0.19-0.90, p=0.026). Os portadores homozigóticos C apresentam

um tempo médio até AI significativamente inferior aos portadores T (104.3 vs. 115.2

meses, respectivamente).

Trata-se de um resultado não previsto e paradoxal em relação ao referido na

literatura, tanto mais que a população estudada no presente estudo, apresenta maior



agressividade tumoral para os portadores T, dando a ideia de que estes tumores ao

terem mais angiogénese, poderiam ter mais condições para resposta à terapêutica.

Outra explicação plausível reside no facto de que os mecanismos de AI serem mal

conhecidos bem como o papel dos androgénios no seu aparecimento e deste modo, o

tratamento hormonal associado à presença deste polimorfismo, poder funcionar de

modo diferente nos tumores AI e AD, sendo desconhecida a influência do HIF na

génese da AI. [111] Contudo, julgamos que tal poderá ficar a dever-se ao facto de a

população estudada ser escassa, com apenas 74 doentes considerados em AI, o que

poderá conduzir a este tipo de resultados.

Nos doentes com doença avançada verifica-se como única conclusão a

presença de maior percentagem de tumor, nos doentes que vêm a ter AI (p=0,042) o

que poderá ter a haver com maior hipóxia nesses tumores. Há também uma tendência

para o PSA seja mais elevado (p=0,069). Contudo a presença do polimorfismo não se

mostrou relevante em relação àqueles que o não têm.

CAPÍTULO 7

CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS

Capítulo 7 – Conclusão e perspectivas futuras


7 - CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS

Alguns polimorfismos poderão estar associados à carcinogénese, outros ao

desenvolvimento e progressão do cancro. O seu papel, em muitos casos, ainda não é

claro.

Um dos aspectos mais intrigantes do CaP, consistirá na associação de

diferentes polimorfismos em genes envolvidos na sua etiopatogenia e que poderão

condicionar a sua evolução muitas vezes, para tumores à partida aparentemente

semelhantes.

Os estudos envolvendo variantes genéticas no HIF-1α na susceptibilidade para

cancro são ainda escassos e controversos, verificando-se variabilidade nas

frequências genotípicas entre diferentes populações estudadas para diferentes

neoplasias.

O HIF-1α, parece ser um importante factor de transcrição na biologia do cancro

da próstata. É expresso nos estados iniciais da carcinogénese, estando essa

expressão relacionada com indicadores de diagnóstico e de prognóstico para recidiva

precoce e metastização, contribuindo para o estabelecimento do HIF-1α como

potencial biomarcador. A sua importância na progressão tumoral, torna-o um alvo

plausível nas estratégias terapêuticas, sobretudo pela interferência com a

angiogénese.

Contudo, o papel deste factor de transcrição no desenvolvimento de CaP e na

sua evolução, permanece indefinido. No entanto, considerando a elevada

vascularização da doença é provável que qualquer alteração na expressão de HIF-1α,

possa afectar o crescimento do tumor e a sua progressão. Será de particular interesse

verificar a associação entre o factor de transcrição do HIF e a disponibilidade de

oxigénio, a angiogénese e o aumento de expressão dos genes relativos a esses

factores. O HIF-1α, poderá vir a ser um marcador precoce de carcinogénese, um

biomarcador de progressão ou até vir a constituir um alvo terapêutico do CaP. Deste

modo, consideramos que as suas variantes genéticas, devem ser estudadas como

factor de risco para o desenvolvimento do cancro da próstata e como marcador de

mau prognóstico, quer no decurso da evolução da doença, quer como factor preditivo

da resposta terapêutica.

Os resultados do presente trabalho em que foi usada como população controlo

doentes com HBP comprovada por resultado histológico, confirmam que a incidência

do alelo T está de acordo com o verificado em outras populações estudadas. De

Capítulo 7 – Conclusão e perspectivas Futuras


acordo com os resultados de outros autores, [167, 177] verificamos que os portadores do

genótipo CT têm um risco significativamente aumentado para desenvolver CaP. No

presente trabalho, verificamos que os portadores deste polimorfismo, apresentam

maior risco para desenvolverem metastização à distância, terem maior percentagem

de volume tumoral nas peças histológicas e terem doença avançada no momento do

diagnóstico. Apresentam ainda uma tendência para se apresentarem no momento de

diagnóstico com valores de PSA > 20ng/ml e grau de Gleason ≥ 8, ou seja, com

doença mais agressiva. Contudo, não se demonstrou para os portadores deste

genótipo, risco para o desenvolvimento de AI e paradoxalmente o ILD nos doentes

submetidos a tratamento hormonal é maior.

Parece-nos que devido ao potencial em promover / reprimir a angiogénese e

proliferação celular, estes polimorfismos funcionais poderão ser responsáveis pelo

desenvolvimento de cancro avançado.

No decurso do presente estudo, verificamos como são ainda tão

desconhecidos os mecanismos de hipóxia, angiogénese e resposta aos

antiandrogénios, bem como o desenvolvimento da hormono resistência no decurso da

terapêutica hormonal do CaP. Por outro lado, os mecanismos pelos quais esta

mutação aumenta a actividade transcripcional do HIF1A, ainda não estão

completamente esclarecidos.

Deste modo, em nossa opinião são necessários mais estudos para verificar a

frequência deste SNP e a sua associação a CaP, bem como a associação a maior

agressividade clínica e pior prognóstico. Estudos futuros, devem ter maior número de

controlos, continuando a usar população com HBP – dada a sua particular afinidade

com a população com CaP – aumentar o número de doentes com AI, estudar a

repercussão fenotípica do polimorfismo e o seu papel na progressão tumoral, tentando

relacionar os polimorfismos com outros factores já conhecidos de agravamento da

doença como são o PSA, grau de Gleason, estádio clínico e percentagem de volume

tumoral, com o objectivo de adicionar variáveis do próprio hospedeiro que contribuam

para concretizar normogramas com maior fiabilidade na previsão da susceptibilidade,

resposta terapêutica e eventual previsão de sobrevida dos doentes afectados.

Em próximos trabalhos, tentaremos também esclarecer o eventual papel da

hipóxia e do HIF-1α no desenvolvimento e progressão da própria HBP, procurando

contribuir para esclarecer a fisiopatologia desta importante e tão frequente patologia.

Mas para serem adequadamente estudados, é muito importante seleccionar

bem as populações a estudar e segui-las durante tempo suficiente, já que os SNP

podem ter acções directas ou indirectas no micro ambiente tumoral, sendo difícil

extrapolar resultados, sobretudo em curto espaço de tempo.

Capítulo 7 – Conclusão e perspectivas futuras


A identificação de genes de susceptibilidade para CaP, acrescentará ao nosso

conhecimento contributos na área da patofisiologia molecular do cancro, permitindo

melhorar a identificação de grupos de risco e tentar estabelecer relações com a

resposta a fármacos.

Capítulo 7 – Conclusão e perspectivas Futuras


CAPÍTULO 8

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Capítulo 8 - Referências bibliográficas


8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 - Hsing AW, Chokkalingam AP. Prostate Cancer Epidemiology. Frontiers in Bioscience 11(2006), 1388-1413. 2 - Jemal A, Siegel R, Ward E. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 2006; 56:106-30. 3 - Jemal A, Murray T, Samuels A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 2003; 53:5–26. 4 - Cooperberg MR, Moul JW, Carroll PR. The changing face of prostate cancer. J Clin Oncol 2005; 23: 8146-51. 5 - Boyle P, Ferlay J. Cancer incidence and mortality in Europe, 2004. Ann Oncol 2005; 16:481-8. 6 - P.S. Pinheiro,, J.E. Tyczynski, F. Bray, J. Amado, E. Matos, D.M. Parkin, Cancer incidence and mortality in Portugal, European Journal of Cancer 39 (2003) 2507–2520. 7 - Roreno(2007), Registo Oncológico Regional do Norte em 2003, Instituto Português de Oncologia do Porto. 8 - Parkin D., Bray F., Ferlay J., Pisani P. Global Cancer Statistics 2002. CA Cancer J Clin 2005; 55(2):74-108. 9 - Johansson JE. Expectant management of early stage prostatic cancer. Swedish experience. J Urol 1994;152:1753-6. 10 - Albertsen PC, Handley JA, Gleason DF, Barry MJ. Competing risk analysis of men aged 55-74 years at diagnosis managed conservatively for clinically localized prostate cancer. JAMA1998; 280:975-80.

11 - Rujiter E, Van de Kaa C, Miller G, et al: Molecular genetics and epidemiology of prostate cancer. Endocr Rev 20(1), 1999: 22-45. 12 - Nupponen N, Visakorpi T. Molecular Biology of progression of prostate cancer. Eur Urol 1999; 35: 351-354. 13 - Hsing, AW, L. Tsao and SS Devesa: international trends and patterns prostate cancer incidence and mortality. Int J Cancer 2000; 85:60-67. 14 - Cook L.S., M. Goldoft, S.M. Schwartz and N.S. Weiss: incidence of adenocarcinoma of the prostate in asian immigrants to the US and their descendantes. J Urol 1999; 161: 152-155. 15 - Stanford JL, Ostrander EA. Familial prostate cancer. Epidemiol Ver 2001; 23:19-23. 16 - Ries L, Eisner M, Kosary C et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2000. Bethesda, MD: National Cancer Institute, 2003. Available at seer.cancer.gov/csr/1975_2002. 17 - Majeed A, Babb P, Jones J, Quinn M. Trends in prostate cancer incidence, mortality and survival in England and Wales, 1971-1998. BJU Int 2000; 85: 1058-1062. 18 - Bill-Axelson A, Holmberg L, Ruutu M, et al. Radical prostatectomy versus watchful waiting in early prostate cancer. N Engl J Med 2005; 352: 1177—1184. 19 - Coldman A, Phillips N, Pickles T. Trends in prostate cancer incidence and mortality change by screening intensity. CMAJ 2003; 168: 31-35.



20 - Frankel S, Smith GD, Donovan J, Neal D. Screening for prostate cancer. Lancet 2003; 361: 1122-1128. 21 - Knudsen L, Loft S, Autrup H. Risk assessment: the importance of genetic polymorphisms in man. Mut Res 2001; 482(1-2): 83-88. 22 - Erichsen HC, Chanock SJ: SNPs in cancer research and treatment. Br J Cancer (2004); 90(4): 747-751. 23 – Medeiros R., Epidemiologia Molecular no caminho da farmacogenómica, 2005; 27-28. 24 - Hsing, A.W., J.K. Reichardt and F.Z. Stanczyk: Hormones and prostate cancer: current perspectives and future directions. Prostate 2002; 52: 213-235. 25 - Zeegers, M.P., L.A. Kiemeney, A.M. Nieder and H. Oster: How strong is the association between CAG and GGN repeat length plymorphisms in the androgen receptor gene and prostate câncer risk? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 1765-1771. 26 - Latil, A. G., R. Azzouzi, G.S. Cancel, E.C. Guillaume , B. Chchan-Priollet, P.L. Berthon and O. Cussenot: Prostate carcinoma risk and allelic variants of genes involved in androgen biosynthesis and metabolism pathways. Cancer 2001; 92: 1130-1137. 27 - Modugno, F., J.L. Weissfeld, D.L., Trump, J.M. Zmuda, P. Shea, J. A. Cauley and R.E. Ferrell: Allelic variants of aromatase and the androgen and estrogen receptors: toward a multigenic model of prostate cancer risk. Clin Cancer Res 2001; 7, 3092-3096. 28 - Nam RK, WW Zhang , J. Trachtenberg, MA Jewett, M. Emami, D. Vesprini, W. Chu, M. Ho, J. Sweet, A. Evans, A. Toi, M. Pollak and SA Narod: Comprehensive assessment of candidate genes and serological markers for the detection of prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12, 1429-1437. 29 - Cicek, MS, DV Conti, A. Curran, PJ Neville, P.L. Paris, G.Casey and JS Witte: association of prostate cancer risk and aggressiveness to androgen pathway genes: SRD5A2, CYP17 and AR. Prostate 2004; 59, 69-76. 30 - Chang, BL, SL Zheng, GA Hawkins, SD Isaacs, KE Wiley, A Turner, JD Carpten, ER Bleecker, PC Walsh, JM Trent and J.Xu: Joint effect of HSD3B1 and HSD3B2 genes is associated with hereditary and sporadic prostate cancer susceptibility, Cancer Res 2002; 62, 1784-1789. 31 - Margiotti, K, E Kim, CL Pearce, E Spera, G Novelli and JK Reichardt: association of the G289S single nucleotide polymorphism in the HSD17B3 gene with prostate cancer in Italian men. Prostate 2002; 53, 65-68. 32 - Ntais, CA, A. Polycarpou and J.P. Ioannidis: Vitamin D receptor gene polymorphisms and risk of prostate cancer: a meta analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12, 1395-1402. 33 - Medeiros, R., A. Morais, A. Vasconcelos, S. Costa, D. Pinto, J. Oliveira and C. Lopes: The role of vitamin D receptor gene polymorphism in the susceptibility to prostate cancer of a southern European population. J Hum Genet 2002; 47, 413-418. 34 - Kote-Jarai, Z., D. Easton, S.M. Edwards, S. Jefferies, F. Durocher, R.A. Jackson, and R. Eeles: Relationship between glutathione S-transferase M1, P1 and T1 polymorphisms and early onset prostate cancer. Pharmacogenetics 2001; 11, 325-330. 35 - Joseph, M.A., K.B. Moysich, J.L. Freudenheim, P.G. Shields, Y. Zhang and C.B. Ambrosone: Cruciferous vegetables, genetic polymorphisms in glutathione S-transferases M1 and T1, and prostate cancer risk. Nutr Cancer 2004; 50, 206-213. 36 - Medeiros, R., A. Vasconcelos, S. Costa, D. Pinto, P. Ferreira, F. Lobo, A. Morais, J. Oliveira, C.Lopes: Metabolic susceptibility genes and prostate cancer risk in a southern European population:

Capítulo 8 – Referências bibliográficas


The role of glutathione S-transferases GSTM1, GSTM3 and GSTT1 genetic polymorphisms. Prostate 2004; 58, 414-420. 37 - Costa S., D. Pinto, A. Morais, A. Vasconcelos, J. Oliveira, C. Lopes and R. Medeiros: Acetylation genotype and the genetic susceptibility to prostate cancer in a southern European population: Prostate 2005;16, 16-25. 38 - Antognelli, C., L. Mearini, V.N. Tales, A. Giannantoni and E. Mearini: Association of CYP17, GSTP1 and PON1 polymorphisms with the risk of prostate cancer. Prostate 2005; 63, 240-251. 39 - Rebbeck, T.R., J.M. Jaffe, A.H. Walker, A.J. Wein and S.B. Malkowicz: Modification of clinical presentation of prostate tumors by a novel genetic variant in CYP3A4. J. Natl Cancer Inst 1998; 90, 1225-1229. 40 - Ritchey, JD, WY Huang, AP Chokkalingam, YT Gao, J Deng, P. Levine, FZ Stanczyk and AW Hsing: Genetic variants of DNA repair genes and prostate cancer: a poplulation based study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prv 2005;14. 41 - Ewart-Toland, A., JM Chan, J. Yuan, A. Balmain and J. Ma: A gain of function TGFB1 polymorphism may be associated with late stage prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13, 759-764. 42 - Panguluri, RC, LO Long, W.Chen, S. Wang, W Isaacs and RA Kittles: COX-2 gene promoter haplotypes and prostate cancer risk. Carcinogenesis 2004; 30, 30-37. 43 - Lin, C.C., H.C. Wu, F.J. Tsai, H.Y. Chen and W.C. Chen: Vascular endothelial growth factor gene-460 C/T polymorphism is a biomarker for prostate cancer. Urology 2003; 62, 374-377. 44 - Zander R, Vaupel P. Proposal for using a standardized terminology on oxygen transport to tissue. Adv Exp Med Biol 1985;191:965–70. 45 - Vaupel P. The role of hypoxia induced factores in tumor progression Oncologist 2004, 9(suppl 5): 10-17. 46 - Moulder JE, Rockwell S. Tumor hypoxia: its impact on cancer therapy. Cancer Metastasis Rev 1987;5:313–41. 47 - Vaupel P, Kallinowski F, Okunieff P. Blood flow, oxygen and nutrient supply, and metabolic microenvironment of human tumors: a review. Cancer Res 1989; 49:6449–65. 48 - Kimura H, Braun RD, Ong ET et al. Fluctuations in red cell flux in tumor microvessels can lead to transient hypoxia and reoxygenation in tumor parenchyma. Cancer Res1996;56:5522–8. 49 - Folkman J. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J Med. 1995 Dec 28;333(26):1757-63. 50 - Harris AL. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2002 Jan;2(1):38-47. 51 - Thews O, Wolloscheck T, Dillenburg W, Kraus S, Kelleher DK, Konerding MA, Vaupel P. Microenvironmental adaptation of experimental tumours to chronic vs acute hypoxia. Br J Cancer. 2004 Sep 13;91(6):1181-9. 52 - Coleman CN, Mitchell JB, Camphausen K. Tumor hypoxia: chicken, egg, or a piece of the farm? J Clin Oncol. 2002 Feb 1;20(3):610-5. 53 - Subarsky P, Hill RP. The hypoxic tumour microenvironment and metastatic progression. Clin Exp Metastasis 2003;20:237–50.



54 - Choudhury A, Cuddihy A, Bristow RG. Radiation and new molecular agents part I: targeting ATM-ATR checkpoints, DNA repair, and the proteasome. Semin Radiat Oncol 2006;16:51–8. 55 – Bristow RG and Richard P. Hypoxia, DNA repair and genetic instability, Nature Reviews, March 2008, volume 8, pag 180-192. 56 - Gleadle JM and Ratcliffe PJ. Induction of hypoxia inducible factor 1, erythropoietin, vascular endothelial growth factor and glucose transporter 1 by hypoxia: evidence against a regulatory role for Src kinase. Blood 1997; 89:503-509. 57 - Airley R, Loncaster J, Davidson S, Bromley M, Roberts S, Patterson A, Hunter R, Stratford I and West C. Glucose transporter glut 1 expression correlates with tumor hypoxia and predicts metastasis free survival in advanced carcinoma of the cervix. Clinical Cancer Research 2001; 7:928-934. 58 - Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, Passantino R, Concordet JP, Maire P, Giallongo A. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia- inducible factor 1. JBiol Chem 1996; 271: 32529-32537. 59 - Prince BD and Calderwood SK. GADD45 and GADD153 messenger RNA levels are increased during hypoxia and after exposure of cells to agents which elevate the levels of the glucose regulated proteins. Cancer Research 1992; 52:3814-3817. 60 - Hockel M, Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. J Natl Cancer Inst. 2001 Feb 21; 93(4):266-76. 61 - Milosevic M, Fyles A, Hedley D, Hill R. The human tumor microenvironment: invasive (needle) measurement of oxygen and interstitial fluid pressure. Semin Radiat Oncol 2004; 14:249–58. 62 - Milosevic M, Chung P, Parker C, Bristow R et al Androgen Withdrawal in Patients Reduces Prostate Cancer Hypoxia: Implications for Disease Progression and Radiation Response. Cancer Res 2007; 67(13):6022–25. 63 - Chan N, Milosevic M, Bristow RG. Tumor hypoxia, DNA repair and prostate cancer progression: new targets and new therapies. Future Oncol 2007; 3:329-341; 64 - Chaudary N, Hill RP. Hypoxia and metastasis. Clin Cancer Res 2007; 13:1947-1949. 65 - Vaupel P, Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impact in clinical outcome. Cancer Metastasis Ver 2007; 26:225-239. 66 - Dachs GU, Tozer GM. Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation. Eur J Cancer 2000; 36:1649-60. 67 - Acs G, Xu X, Chu C, Acs P and Verma A. Prognostic significance of erythropoietin expression in human endometrial carcinoma. Cancer 2004; 100:2376-2386. 68 - KS Kimbro and JW Simons. Hypoxia-inducible factor in human breast and prostate cancer. Endocrine Related Cancer (2006) 13: 739-749. 69 - Semenza GL. HIF-1 and human disease: One highly involved factor. Genes Dev 2000; 14:1983–1991. 70 - Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 2003; 3:721–732. 71 - Kaelin WG.Jr. Molecular basis of the VHL hereditary cancer syndrome. Nat Rev Cancer 2002; 2:673–682. 72 - Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1995; 270:1230–1237.



73 - Tian H, McKnight SL, Russell DW. Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev 1997; 11:72–82. 74 - Ema M, Taya S, Yokotani N, Sogawa K, Matsuda Y, Fujii-Kuriyama Y. A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1α regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:4273–4278. 75 - Flamme I, Frohlich T, von ReuternM, KappelA, Damert A, Risau W. HRF, a putative basic helix-loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to hypoxia-inducible factor-1 alpha and developmentally expressed in blood vessels. Mech Dev 1997; 63:51–60. 76 - Gu YZ, Moran SM, Hogenesch JB, Wartman L, Bradfield CA. Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha. Gene Expr 1998; 7: 205–213. 77 - Wenger RH. Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factores, and O2-regulated gene expression. FASEB J 2002;16:1151-1162. 78 - Michel G, Minet E, Ernest I, Roland I, Durant F, Remacle J, Michiels C. A model for the complex between the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its consensus DNA sequence. J Biomol Struc Dyn 2000; 18: 169-179 79 - Semenza GL, Rue EA, Iyer NV, Pang MG, Kearns WG. Assignment of the hypoxia inducible factor 1α gene to a region of conserved synteny on mouse chromosome 12 and human chromosome 14q. Genomics 1996; 34:437-9. 80 - Iyer NV, Leung SW, Semenza GL. The human hypoxia inducible factor 1 alpha gene: HIF1A struture and evolutionary conservation. Genomics 1998; 52: 159-165. 81 - Semenza GL. HIF-1 and tumor progression: pathophysiology and therapeutics. Trends Mol Med. 2002; 8(4 Suppl):S62-7. 82 - Semenza GL. Involvement of HIF 1in human cancer. Intern Med 2002; 41: 79-83. 83 - Brown JM and Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities and problems for cancer therapy. Cancer Res,1998; 58:1408-1416. 84 - Wartenberg M, Ling FC, Muschen M, et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. FASEB J 2003;17:503–5. 85 - Comerford KM, Wallace TJ, Karhausen J, et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) gene. Cancer Res 2002;62:3387–94. 86 - Kaelin WG. ROS: really involved in oxygen sensing. Cell Metabolism 2005; 1:357-358. 87 - Muzandu K, Shaban Z, Ishizuka M, Kasusaka A and Fujita S. Nitric Oxide enhances catechol estrogen induced oxidative stress in LNCaP cells. Free Radical Research 2005; 39:389-398. 88 - Semenza GL. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 1999; 15:551-578. 89 - Jiang BH, Semenza GL, Bauer C, Martin HH. Hypoxia inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension. Am J Physiol 1996; 271:C1172-80. 90 - Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW, Koods RD, Semenza GL. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia inducible factor 1. Mol Cell Biol 1996; 16:4604-13.



91 - Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R, Semenza GL. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1996; 271:17771-8. 92 - Semenza GL. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med 2003;54:17–28. 93 - Manalo DJ, Rowan A, Lavoie T, Natarajan L, Kelly BD, Ye SQ, Garcia JG, Semenza GL. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood 2005; 105:659-669. 94 - Jain RK, Normalizing tumor vasculature with anti angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat Med 2001; 7: 987-89. 95 - Vandromme M, GauthierRouviere C, Lamb N, Fernandez A. Regulation of transcription factor localization: Fine-tuning of gene expression. Trends Biochem Sci 1996; 21: 59-64 96 - Jiang BH, Zheng JZ, Leung SW, Roe R, Semenza GL. Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension. J Biol Chem 1997; 272: 19253-19260 97 - Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, Salic A, Asara JM, Lane WS, Kaelin WG Jr. HIFalpha targeted for VHLmediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science 2001; 292:464–468. 98 - Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, Hewitson KS, O’Rourke J, Mole DR, Mukherji M, Metzen E, Wilson MI, Dhanda A, Tian YM, Masson N, Hamilton DL, Jaakkola P, Barstead R, Hodgkin J, Maxwell PH, Pugh CW, Schofield CJ, Ratcliffe PJ. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 2001; 107:43–54. 99 - Min JH, Yang H, Ivan M, Gertler F, Kaelin WG Jr, Pavletich NP. Structure of an HIF-1alpha-pVHL complex: Hydroxyproline recognition in signaling. Science 2002; 296:1886–1889. 100 - Yu F, White SB, Zhao Q, Lee FS. HIF-1alpha binding to VHL is regulated by stimulus-sensitive proline hydroxylation. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:9630–9635. 101 - Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, Kriegsheim A, Mukherji M, Schofield CJ, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 2001; 292:468–472. 102 - Masson N, Willam C, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ. Independent function of two destruction domains in hypoxiainducible factor-alpha chains activated by prolyl hydroxylation. EMBO J 2001; 20:5197–5206. 103 – Boddy JL. The androgene receptor is significantly associated with vascular endothelial growth factor and hypoxia sensing via HIF1α, HIF2α and the prolyl hydroxylases in human prostate cancer, in Clinical Cancer Research, 2005; Vol 11, 7658-7663. 104 - Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ, Whitelaw ML. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science 2002; 295:858–861. 105 - Melillo G. Inhibiting hypoxia inducible factor 1 for cancer therapy. Mol Cancer Res. 2006; 4:601-605. 106 - Jeong JW, BaeMK,KimSH, Sohn TK, BaeMH,YooMA, Song EJ, Lee KJ, Kim KW. Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediated acetylation. Cell 2002; 111: 709–720. 107 - Laughner E, Taghavi P, Chiles K, Mahon PC, Semenza GL.HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) synthesis: Novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression. Mol Cell Biol 2001; 21:3995–4004.



108 - Arsham AM, Plas DR, Thompson CB, Simon MC. Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling is neither required for hypoxic stabilization of HIF-1 alpha nor sufficient for HIF-1-dependent target gene transcription. J Biol Chem 2002; 277: 15162–15170. 109 - Mottet D, Dumont V, Deccache Y, Demazy C, Ninane N, Raes M, Michiels C. Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells. J Biol Chem 2003; 278:31277–31285. 110 - Zhong H, Chiles K, Feldser D, Laughner E, Hanrahan C, Georgescu MM, Simons JW, Semenza GL. Modulation of hypoxiainducible factor 1 alpha expression by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3- inase/PTEN/AKT/FRAP pathway in human prostate cancer cells: Implications for tumor angiogenesis and therapeutics. Cancer Res 2000; 60: 1541-1545 111 - Mabjeesh NJ, Willard MT, Frederickson CE, Zhong H, Simons JW. Androgens stimulate hypoxia-inducible factor 1 activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol 3’-kinase/protein kinase B in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 2003; 9:2416-25. 112 - Outi RS, Kimmo JS, Nina NN, Ola B, Tapio V. Amplification of the HIF 1α gene in prostate cancer, in Cancer Genetics and Cytogenetics, 2001; 128: 31-34. 113 - Gao N, Ding M, Zheng JZ, Shi X, Jiang BH. Vanadate-induced expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and vascular endothelial growth factor through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and reactive oxygen species. J Biol Chem 2002; 277: 31963-31971 114 - Haddad JJ, Land SC. A non-hypoxic, ROS-sensitive pathway mediates TNF-alpha-dependent regulation of HIF-1alpha. FEBS Lett 2001; 505: 269-274 115 - Chandel NS, McClintock DS, Feliciano CE, Wood TM, Melendez JA, Rodriguez AM, Schumacker PT. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1 alpha during hypoxia - A mechanism of O-2 sensing. J Biol Chem 2000; 275: 25130-25138 116 – Yong HS, Wei GF, Hypoxia inducible factor in tumor angiogenesis. World J Gastroenterol 2004; 10(8): 1082-1087. 117 - Stroka DM, Burkhardt T, Desbaillets I, Wenger RH, Neil DA, Bauer C, Gassmann M, Candinas D. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia. FASEB J 2001; 15:2445–2453. 118 - Chan DA, Sutphin PD, Denko NC, Giaccia AJ. Role of prolyl hydroxylation in oncogenically stabilized hypoxia-inducible factor-1alpha. J Biol Chem 2002; 277: 40112-40117 119 - Blancher C, Moore JW, Robertson N, Harris AL. Effects of ras and von Hippel-Lindau (VHL) gene mutations on hypoxia-inducible factor (HIF)-1 alpha, HIF-2 alpha, and vascular endothelial growth factor expression and their regulation by the phosphatidylinositol 3 ‘-kinase/Akt signaling pathway. Cancer Res 2001; 61: 7349-7355 120 - Dang CV and Semenza GL. Oncogenic alterations of metabolism. Trends Biochem Sci, 1999; 24:68-72. 121 - Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, Lim M, Hilton DA, Zagzag D, Buechler P, Isaacs WB, Semenza GL, Simons JW. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in common human cancers and their metastases. Cancer Res 1999; 59:5830–5835. 122 - Singh VN, Singh M, August JT, et al. Alterations in glucose metabolism in chick-embryo cells transformed by Rous sarcoma virus: intracellular levels of glycolytic intermediates. Proc Natl Acad Sci USA 1974; 71:4129–32.



123 - Vordermark D, Kraft P, Katzer A, Bolling T, Willner J, Flentje M. Glucose requirement for hypoxic accumulation of hypoxia inducible factor 1alpha. Cancer Lett 2005; 230:122-133 124 - Van den Eynden GG, Van der Auwera I, Van Laere SJ, Colpaert CG, Turley H, Harris AL, Van Dam P, Dirix LY, Vermeulen PB, Van Marck EA. Angiogenesis and hypoxia in lymph node metastases is predicted by the angiogenesis and hypoxia in the primary tumour in patients with breast cancer. BR J Cancer 2005; 93:1128-1136. 125 - Brahimi-Horn MC, Pouyssegur J. The hypoxia inducible factor and tumor progression along the angiogenic pathway. Int Rev Cytol, 2005; 242:157-213. 126 - Pugh CW, Ratcliffe PJ. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat Med 2003; 9:677-684. 127 - Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptores. Nat Med 2003; 9:669-676. 128 - Talks KL, Turley H, Gatter KC, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ, Harris AL. The expression and distribution of the hypoxiainducible factors HIF-1 alpha and HIF-2 alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages. Am J Pathol 2000; 157: 411- 421. 129 - Bos R, Zhong H, Hanrahan CF, Mommers EC, Semenza GL, Pinedo HM, Abeloff MD, Simons JW, van Diest PJ, van der Wall E. Levels of hypoxia-inducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 309-314. 130 - Giatromanolaki A, Koukourakis MI, Sivridis E, Turley H, Talks K, Pezzella F, Gatter KC, Harris AL. Relation of hypoxia inducible factor 1 alpha and 2 alpha in operable non-small cell lung cancer to angiogenic/molecular profile of tumours and survival. Br J Cancer 2001; 85: 881-890. 131 - Shi BM, Wang XY, Mu QL, Wu TH, Liu HJ, Yang Z. Angiogenesis effect on rat liver after administration of expression vector encoding vascular endothelial growth factor D. World J Gastroenterol 2003; 9: 312-315. 132 - Jaeger TM, Weidner N, Chew K, Moore DH, Kerschmann RL, Waldman FM, Carroll PR. Tumor angiogenesis correlateswith lymph-node metastases in invasive bladder-cancer. J Urol 1995;154: 69-71. 133 - Bos R, van der Greijer AE, Shvarts A, Meijer S, Pinedo HM, Semenza GL, van Diest PJ, van der Wall E. Levels of hypoxiainducible factor-1alpha independently predict prognosis in patients with lymph node negative breast carcinoma. Cancer 2003; 97: 1573-1581. 134 - Aebersold DM, Burri P, Beer KT, Laissue J, Djonov V, Greiner RH, Semenza GL. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha: a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer. Cancer Res 2001; 61: 2911-2916. 135 - Li Z, Wang D, Na X, Schoen SR, Messing EM, Wu G. The VHL protein recruits a novel KRAB-A domain protein to repress HIF-1alpha transcriptional activity. EMBO J 2003; 22:1857– 1867. 136 - Kondo K, Klco J, Nakamura E, Lechpammer M, Kaelin WG Jr. Inhibition of HIF is necessary for tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein. Cancer Cell 2002; 1: 237–246. 137 - George DJ, Regan MM, Oh WK, Tay MH, Manola J, Decalo N, Duggan S, Dewolf WC, Kantoff PW, Bubley GJ. Radical prostatectomy lowers plasma vascular endothelial growth factor levels in patients with prostate cancer. Urology 2004; 63: 327–332. 138 – Huggins C, Hodges CV. Studies on prostatic cancer: I. The effect of castration, of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. 1941. J Urol 2002;168: 9–12. 139 - Isaacs JT. Role of androgens in prostatic cancer. Vitam Horm 1994; 49:433–502.



140 - Isaacs JT. The biology of hormone refractory prostate cancer. Why does it develop? Urol Clin North Am 1999; 26:263–73. 141 - Shabsigh A, Chang DT, Heitjan DF, et al. Rapid reduction in blood flowto the rat ventral prostate gland after castration: preliminary evidence that androgens influence prostate size by regulating blood flowto the prostate gland and prostatic endothelial cell survival. Prostate 1998;36: 201–6. 149 - Jain RK, Safabakhsh N, Sckell A, et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95:10820–5. 143 - Hayek OR, Shabsigh A, Kaplan SA, et al. Castration induces acute vasoconstriction of blood vessels in the rat prostate concomitant with a reduction of prostatic nitric oxide synthase activity. J Urol 1999;162:1527–31. 144 - Movsas B, Chapman JD, Horwitz EM, et al. Hypoxic regions exist in human prostate carcinoma. Urology 1999; 53:11–8. 145 - Movsas B, Chapman JD, Hanlon AL, et al. Hypoxia in human prostate carcinoma: an Eppendorf pO2 study. Am J Clin Oncol 2001; 24: 458–61. 146 - Movsas B, Chapman JD, Greenberg RE, et al. Increasing levels of hypoxia in prostate carcinoma correlate significantly with increasing clinical stage and patient age: an Eppendorf pO(2) study. Cancer 2000; 89: 2018–24. 147 - Movsas B, Chapman JD, Hanlon AL. Hypoxic prostate/muscle pO2 ratio predicts for biochemical failure in patients with prostate cancer: preliminary findings. Urology 2002; 60:634–9. 148 - Park SY, Kim YJ, Gao AC, et al. Hypoxia increases androgen receptor activity in prostate cancer cells. Cancer Res 2006; 66:5121-9. 149 - Zhong H, Semenza GL, Simons JW, De Marzo AM. Up-regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is an early event in prostate carcinogenesis. Cancer Detect Prev 2004; 28:88-93. 150 - Trapman J, Cleutjens KB. Androgen-regulated gene expression in prostate cancer. Semin Cancer Biol 1997; 8:29–36. 151 – Brian J.F. and David F. The development of androgen independent prostate cancer, In www.nature.com/reviews/cancer, October 2001, vol 1, 34-45. 152 - Hyytinen ER et al. Genetic changes associated with the acquisition of androgen-independent growth, tumorigenicity and metastatic potential in a prostate cancer model. Br. J. Cancer; 1997; 75: 190–195. 153 - Marcelli M et al. Androgen receptor mutations in prostate cancer. Cancer Res. 2000; 60: 944–949. 154 - Gregory, C. W., Johnson, R. T. Jr, Mohler, J. L., French, F. S. & Wilson, E. M. Androgen receptor stabilization in recurrent prostate cancer is associated with hypersensitivity to low androgen. Cancer Res. 61, 2892–2898. 155 - Koivisto, P. et al. Androgen receptor gene amplification: a possible molecular mechanism for androgen deprivation therapy failure in prostate cancer. Cancer Res. 57, 314–319. 156 - Colombel, M. et al. Detection of the apoptosis suppressing oncoprotein Bcl2 in hormone-refractory human prostate cancers. Am. J. Pathol. 1993;143: 390–400.



157 - Craft, N. et al. Evidence for clonal outgrowth of androgenindependent prostate cancer cells from androgendependent tumors through a two-step process. Cancer Res. 1999; 59: 5030–5036. 158 - Isaacs, J. T. The biology of hormone refractory prostate cancer. Why does it develop? Urol. Clin. North Am. 1999;26: 263–273. 159 - Culig, Z. et al. Androgen receptor activation in prostatic tumor cell lines by insulin-like growth factor-I, keratinocyte growth factor, and epidermal growth factor. Cancer Res 1994; 54: 5474–5478. 160. Yeh, S. et al. From HER2/Neu signal cascade to androgen receptor and its coactivators: a novel pathway by induction of androgen target genes through MAP kinase in prostate cancer cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1999;96: 5458–5463. 161 - Graff, J. R. et al. Increased AKT activity contributes to prostate cancer progression by dramatically accelerating prostate tumor growth and diminishing p27Kip1 expression. J. Biol. Chem. 2000;275: 24500–24505. 162 - Cheng L, Zhang S, Sweeney CJ. Androgen withdrawal inhibits tumor growth and is associated with decrease in angiogenesis and VEGF expression in androgen independent CWR22Rv1 human prostate cancer model. Anticancer Res 2004; 24:2135-40. 163 - Zhong H, Agani F, Baccala AA, Laughner E, Rioseco-Camacho N, Isaacs WB, Simons JW, Semenza GL. Increased expression of hypoxia inducible factor 1 alpha in rat and human prostate cancer. Cancer Res 1998; 58:5280-4 164 - Stefanou D., Batistatou A, Kamina S. Expression of vascular endothelial growth factor and association with microvessel density in benig prostatic hyperplasia and prostate cancer. In Vivo 2004; 18:155-60). 165 - Kuwai T, Kitadai Y, Tanaka S, Kuroda T, Ochiumi T, Matsumura S, Oue N, Yasui W, Kaneyasu M, Tanimoto K, Nishiyama M, Chayama K. Single nucleotide polymorphism in the hypoxia-inducible factor-1alpha gene in colorectal carcinoma. Oncol Rep 2004; 12:1033-7. 166 - Ollerenshaw M, Page T, Hammonds J, Demaine A. Polymorphisms in the hypoxia inducible factor-1alpha gene (HIF1A) are associated with the renal cell carcinoma phenotype. Cancer Genet Cytogenet 2004; 153:122-6. 167 - Chau CH., Matthew G. Permenter, Seth M. Steinberg, Avi S Retter, William L. Dahut, Douglas K. Price, William D. Figg. Polymorphism in the Hypoxia-Inducible Factor 1α Gene May Confer Susceptibility to Androgen-Independent Prostate Cancer. Cancer Biology and Therapy 2005. 4:11; 38-41. 168 - Anastasiadis AG, Ghafar MA, Salomon L, Vacherot F, Benedit P, Chen MW, Shabsigh A, Burchardt M, Chopin DK, Shabsigh R, Buttyan R. Human hormone-refractory prostate cancers can harbor mutations in the O(2)-dependent degradation domain of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha). J Cancer Res Clin Oncol 2002; 128:358-62. 169 - Fu XS, Choi E, Bubley GJ, Balk SP. Identification of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) polymorphism as a mutation in prostate cancer that prevents normoxia-induced degradation. Prostate 2005; 63:215-21. 170 - Huss WJ, Hanrahan CF, Barrios RJ, Simons JW, Greenberg NM. Angiogenesis and prostate cancer: Identification of a molecular progression switch. Cancer Res 2001; 61:2736-43. 171 - Saramaki OR, Savinainen KJ, Nupponen NN, Bratt O, Visakorpi T. Amplification of hypoxia-inducible factor 1alpha gene in prostate cancer. Cancer Genet Cytogenet 2001; 128:31-4. 172 - Du Z, Fujiyama C, Chen Y and Masaki Z Expression of hypoxia inducible factor 1 alpha in human normal, benign and malignant prostate tissue. Chinese Medical Journal, 2003; 116: 1936-1939



173 - Folkman J, Watson K, Ingber D, et al. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989;339:58–61. 174 - Sinha AA, Gleason DF, Staley NA, et al. Cathepsin B in angiogenesis of human prostate: an immunohistochemical and immunoelectron microscopic analysis. Anat Rec 1995;241:353–62. 175 - Tennant MK, Thrasher JB, Twomey PA, et al. Insulin-like growth factor-binding protein-2 and -3 expression in benign human prostate epithelium, prostate intraepithelial neoplasia, and adenocarcinoma of the prostate. J Clin Endocrinol Metab 1996;81:411–20. 176 - Mazzucchelli R, Montironi R, Santinelli A, et al. Vascular endothelial growth factor expression and capillary architecture in high-grade PIN and prostate cancer in untreated and androgen-ablated patients. Prostate 2000;45: 72–9. 177 - Urtreger AO, Bar-Shira A, Matzkin H, Mabjeesh NJ. The homozygous P582S mutation in the Oxygen-Dependent Degradation Domain of HIF1α is associated with increased risk for prostate cancer. Prostate 2007; 67:8-13. 178 - Fransén K, Fenech M, Fredrikson M, Dabrosin C, Söderkvist P. Association between ulcerative growth and hypoxia inducible factor-1alpha polymorphisms in colorectal cancer patients. Mol Carcinog. 2006 Nov; 45(11): 833-40. 179 – Acker T, Plate KH, Brahimi-Horn, MC. Tumor Angiogenesis, Basic Mechanisms, ed. 2008.

ANEXOS

ANEXOS

93

ANEXO I - Apresentação realizada a 7 de Fevereiro 2009 no 2º World Congress on Controversies in Urology (CURy09) que decorreu em Lisboa.

ANEXOS

94

FUNCTIONAL GENETIC POLYMORPHISM IN THE HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1 ALPHA AND PROSTATE CANCER

Avelino Fraga 1,2,3, Ricardo Ribeiro 2,3, Francisco Pina 4, Fernando Calais Silva 5, Francisco Lobo 6, Vítor Silva 6, Rui Medeiros 2,3

1 Urology Department, D Pedro V Military Hospital, Porto, Portugal, 2 Molecular Oncology Group, Portuguese Institute of Oncology, Porto, 3 ICBAS, Abel Salazar BiomedicalSciences Institute, University of Porto, Portugal, 4 Urology Department, Hospital S. João, Porto, 5 Urology Department, Lisbon Medical Centre (Central Region), Lisbon, Portugal, 6 Urology Department, Portuguese Institute of Oncology, Porto, Portugal

INTRODUCTION AND OBJECTIVES

The overexpression of HIF-1α has been reported in some human malignancies like breast,

kidney, colon and prostate cancer. We currently know that HIF1, which is a master regulator

of genes involved in adaptation and survival under low oxygen conditions, is associated with

increased tumor aggressiveness and mortality due to cancer.

A single nucleotide polymorphism (SNP), within the oxygen-dependent domain of HIF1A

gene, located in locus +1772 in exon 12 has been identified as a non-synonym functional

variant responsible by a cytosine-to-thymine aminoacid substitution at codon 582. Recent

investigations demonstrated that this genetic variant is responsible for an increased HIF1A

transcriptional activity and higher levels of HIF-1α.

Our purpose was to compare genotype frequencies for the C1772T SNP in a prostate

cancer population and in a histologically confirmed control population without cancer (with

BPH). We also investigated if this SNP influences the clinical evolution of PSA and Gleason

score. We intended to analyze its association with PCa susceptibility and aggressiveness.

MATERIAL AND METHODS

This case-control study was undertaken in prostate cancer patients (n= 494, 67.27.7

years of age) and individuals with absence of histologically confirmed malignant

disease (n=232, 66,87.6 years of age), diagnosed between 1997 and 2008. The

clinical-pathological characteristics of prostate cancer patients are presented in Table

1. Cancer group included patients diagnosed with primary prostate cancer submitted to

adequate treatment according to institutional guidelines, and followed for a mean

period of 136-12 months.

RESULTS

The distribution of HIF-1α genotypes for C1772T in 494 PCa patients was 376 CC (76%) 111 CT (23%) and 7 TT (1%). The genotype distribution in 232 cases was 190 CC (82%) 36 CT

(16%) and 6 TT (2%). The C1772T genotype is more frequently found in the PCa population (p=0,037) – Table 2. The logistic regression analysis in genotypes stratified according to

recessive model revealed a trend towards an increased age-adjusted risk for PCa development in T carriers (OR=1.47, CI=0.98-2.20, p=0.063).

Compared with the control group, T-allele frequencies were significantly increased, after adjustment for age, in PCa patients with a more aggressive tumor phenotype (distant metastasis,

OR=2.16, CI=1.15-4.06, p=0.017; advanced disease, OR=1.69, CI=1.02-2.81, p=0.044; PSA > 20, OR= 1.72, CI=0.99-3.00, p=0.056; Gleason >7, OR=1.72, CI=0.93-3.15, p=0,083) –

Table 3. Furthermore, in a subgroup of patients (n=261) we observed a significantly higher percentage of prostatic tumor in T carriers compared with C homozygous (48.59.4 and

26.53.3, respectively, p=0.033) – Fig 1.

Table 1. Patients characteristics

N (%)

Stage (n=494)

Localized (T1, T2)Advanced (T3, T4, N+, M+)

276(55.9)218(44.1)

Treatment for localized disease * (n=220)

Recurrence 21 (9.3)

Hormonal-treatment (n=319)

Androgen Independent PCa 74 (23.2)

Our results support a role for the HIF-1α pathway in PCa carcinogenesis and agressiveness. The HIF1A+1772C>T functional polymorphism is associated with a significantly increased risk

of prostate cancer. This SNP might be a useful molecular marker for PCa susceptibility and as a predictive factor for aggressive tumor behaviour.

The World Congress on Controversies in Urology (CURy) 2009, Lisbon

After collection of peripheral blood

samples, genomic DNA was isolated.

Genotyping was performed by Real-Time

PCR allelic discrimination, using Taqman

assay.

* Radical Prostatectomy, Radiotherapy and/or Braquitherapy

Table 3. Risk for HIF1A 1772 T carriers to be diagnosed with advanced disease, metastasis, high Gleason grade (>7), PSA ≥ 20 ng.mL-1, and to develop androgen-independence, as compared to control group frequencies

Genotypes HIF1A 1772 C>T

CC CT/TT aOR IC 95% p

Control Group 190 (0,82) 42 (0,18) Referent

Gleason > 7 58 (0,73) 21 (0,27) 1,72 0,93-3,15 0,083

Metastasis 45 (0,69) 20 (0,31) 2,16 1,15-4,06 0,017

Localy advanced disease 106 (0,74) 38 (0,26) 1,69 1,02-2,81 0,044

Androgen-independence 56 (0,76) 18 (0,24) 1,6 0,83-2,98 0,161

PSA ≥ 20 76 (0,73) 28 (0,27) 1,72 0,99-3,00 0,056

* Fisher Exact Test

aOR, age-adjusted Odds Ratio

Figure 1. Tumor volume, represented as percentage of tumor found in patients, according to HIF1A +1772 C>T genotypes

p=0.033

Table 2. HIF1A 1772 C>T genotypes distribution in both groups

Control Group PCa Group

Genotypes N (frequencies) N (frequencies) OR IC 95% p

CC 190 (0.82) 376 (0.76) Referent

CT 36 (0.16) 111 (0.23) 1.55 1,00-2,40 0.037 TT 6 (0.02) 7 (0.01) 0.81 0.49-1.34 0.379*

REFERENCES

1. Hsing AW, Chokkalingam AP. Prostate Cancer Epidemiology. Frontiers in Bioscience 11(2006),388-1413.

2. Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1995; 270:1230–1237.

3. Semenza GL. Involvement of HIF 1in human cancer. Intern Med 2002; 41: 79-83.4. Outi RS, Kimmo JS, Nina NN, Ola B, Tapio V. Amplification of the HIF 1α gene in prostate cancer, In Cancer

Genetics and Cytogenetics, 2001; 128: 31-34.5. Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, Lim M, Hilton DA, Zagzag D, Buechler P, Isaacs WB, Semenza GL, Simons

W. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases. CancerRes 1999;59:5830–5835

6. Zhong H, Semenza GL, Simons JW, De Marzo AM. Up-regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is an earlyevent in prostate carcinogenesis. Cancer Detect Prev 2004; 28:88-93.

7. Fu XS, Choi E, Bubley GJ, Balk SP. Identification of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) polymorphism asa mutation in prostate cancer that prevents normoxia-induced degradation. Prostate 2005; 63:215-21.

8. Chau CH., Matthew G. Permenter, Seth M. Steinberg, Avi S Retter, William L. Dahut, Douglas K. Price, William D.Figg. Polymorphism in the Hypoxia-Inducible Factor 1α Gene May Confer Susceptibility to Androgen-IndependentProstate Cancer. Cancer Biology and Therapy 2005. 4:11; 38-41

CONCLUSIONS

ANEXOS

95

ANEXO II - Artigo de revisão submetido para publicação nas Actas Urológicas Espanholas, “Hipoxia tumoral – papel de HIF“.

ANEXOS

96

Introducción

El factor inducible por la hipoxia (factor inducible de hipoxia, HIF) es un factor de transcripción

que regula la respuesta celular a la hipoxia, que actúa como regulador de la homeostasis del

oxígeno. [1-3] La identificación de la transcripción HIF sistema Wang y Semenza, [4] es crucial

para entender la fisiología de O2, es ahora consciente de que la hipoxia HIF y son los

principales factores determinantes de la angiogénesis, y que, por ejemplo, la regulación de los

procesos de invasión factores determinantes de la agresividad del tumor y metástasis.

El principio activo factor de transcripción de genes que codifican las proteínas que aumentan la

disponibilidad de oxígeno o permitir la adaptación metabólica a la falta de oxígeno, control de la

expresión de decenas de productos de los genes y proteínas implicados en la angiogénesis, la

eritropoyesis, la glicólisis, invasión, apoptosis, tono vascular, regulación de pH, la homeostasis

epitelial y la resistencia a las drogas. [5,6] se identificaron más de 60 genes diana inducidos por

HIF [2], mientras que muchos otros son suprimidos [7], muchas de las funciones dependen de

HIF.[8]

Estructura molecular de HIF-1α

HIF1A el gen que codifica el HIF-1α se encuentra en el locus 14q21-P24 [9] que contiene 15

exones. [10] Se trata de un compuesto de heterodimers cadenas alfa (regulado por O2) y beta

dispuestos en doble hélice (bHLH), perteneciente a una familia de factores de transcripción que

consta de tres subunidades alfa - HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α - y una subunidad beta - HIF 1β -

también llamado translocan nucleares aril hidrocarburos (ARNT). [4,11-15]

Dos sitios de la señal de la energía nuclear (NLS), situada en la C-terminal (aminoácidos 718-

721) y la N-terminal (aminoácidos 17-33), pero sólo el C-terminal es el responsable de la

acumulación nuclear de HIF-1α . [16] Además, se sabe que HIF-1α contiene dos áreas de

transactivação (TAD) en el C-terminal (aminoácidos 531-575 y 786-826), que están separados

por una secuencia de aminoácidos (575 -- 786) que inhiben transactivação [17] (Figura 1).

La N-terminal de la molécula (aminoácidos 1-390) contiene el dominio bHLH-PAS, que es

necesario para la dimerización y la unión a ADN. [18] La interacción entre los dominios de

ambos bHLH sub-unidades, regular su dimerización.[19] El dominio C-terminal está diseñado

para la señal de la translocación de HIF-1α en el núcleo, la estabilidad de la proteína y la

interacción con co-activador P300. [17] En el campo de la oxígeno-dependiente de la

degradación (de ODD) de HIF-1α, los residuos de prolina en las posiciones 402 y 564, tienen

un importante impacto en la estabilidad de las proteínas en condiciones de normoxia, pueden,

cuando hidroxilado, el reconocimiento por proteína de Von Hippel Lindau (pVHL) y la posterior

activación de la vía ubiquitina degradación. [20-25] La hidroxilación de residuos de prolina en el

ANEXOS

97

IMPAR de HIF-1α es el paso fundamental que regula la estabilidad de la proteína [26a-27o]

(Figura 2). La actividad de la transcripción de genes HIF1A, es regulada por la tensión de

oxígeno celular. [28]

Mecanismos moleculares de acción de HIF e de activación de HIF1A

En presencia de O2, los ámbitos de la hidroxilación de la prolina (PHD1, 2 y 3) hidroxilación

causa en dos residuos de prolina (P402 y P564) en el IMPAR de HIF-1α [29] que permiten el

reconocimiento de HIF-1α por pVHL, es la formación de un complejo ubiquitina E3, que

convierte un objetivo HIF-1α de degradación. [30-33] Jaakkola et al [32] ha demostrado que la

interacción entre pVHL y un dominio específico de HIF-1α está regulado por la hidroxilación de

residuos de prolina (HIF-1α P564) por una enzima llamada HIF-1α prolil hidroxilasa (HIF -PH),

requieren de hierro y oxígeno.

Otro es el sensor de O2 para el Factor Inhibidor de HIF-1 (FIH-1) que el HIF-1α hidroxilo en

presencia de O2 en el residuo de asparragina 803 en la activación de la transcripción de C-

terminal (C-TAD), perrmanecendo inactivos en la hipoxia, lo que permite la interacción con co-

activadores CBP/p300 [34-35] (Figura 2). En la hipoxia, el O2 molecular no está disponible y,

por tanto, las enzimas son inactivos, lo que resulta en un aumento de los niveles de HIF-1α.

[36] La HIF-1α no hidroxilado degradadas y, por lo tanto, lo que en su acumulación en forma

heterodimizada con la subunidad beta (HIFβ). Heterodimers que migran al núcleo donde se

unen a secuencias específicas de ADN, la activación de genes implicados en la adaptación a la

hipoxia, la supervivencia celular, la angiogénesis y la metástasis, como factor de crecimiento

endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento de transformación -alfa (TGF-α), el

transportador de glucosa 1 (GLUT-1), la anhidrasa carbónica IX (CA9), entre muchos otros que

se sabe están implicadas en el desarrollo del tumor y la agresividad. [37-38]

Por lo tanto, el principal regulador de HIF es oxígeno. [22.39] El segundo más importante, son

los oncogenes que pueden contribuir a la estabilización de la proteína o se degrada. Por

ejemplo, el producto del gen supresor tumoral TP53, la proteína p53, inhibe la actividad de HIF-

1α, por lo que es un objetivo de la degradación proteossómica. [40] Sin embargo, deleciones o

mutaciones de TP53 puede facilitar la acumulación de HIF-1α en situaciones de hipoxia, el

aumento de la expresión de VEGF en las células tumorales. [41]

El producto de la VHL gen supresor tumoral, también regula la estabilidad de HIF-1α [42] ya la

presencia de oxígeno, pVHL pueden conectarse a la sub-unidad de HIF-1α convertir en un

objetivo prolil-hidroxilación. [25,27] Además, otros oncogenes (v-Src o RasV12) inhiben prolil-

hidroxilación, lo que resulta en la estabilización de HIF-1α. [39.42]

Se sabe que la expresión del gen HIF1A puede ser regulada por otras vías, incluyendo las vías

de señalización intracelular como la proteína quinasa B (Akt) y phosphatidyl-inositol 3-quinasa

(PI3K), aunque no totalmente claro qué papel estas vías de regulación. [43-48]

ANEXOS

98

Se describen HIF1A de otras moléculas reguladoras, como especies reactivas de oxígeno

(ROS) que participan en la carcinogénesis o citocinas como el factor de necrosis tumoral

(TNFα) y la angiotensina [49-52], y otras vías de señalización como RAS / RAF1/MEK1/ERK1/2

y / o p53/JNK, que se activan en respuesta a oncogenes, factores de crecimiento o la hipoxia

(Figura 3).

Funciones generales del gen HIF1A

La hipoxia es la reducción de la tensión de oxígeno tisular, que se define en términos clínicos

por la reducción de la disponibilidad local de oxígeno a niveles críticos, es decir, los valores de

tensión de menos del 7%. [53]

El HIF-1α está involucrado en respuesta a la hipoxia, sino también en la homeostasis del

oxígeno en respuesta a la isquemia de miocardio, isquemia cerebral, isquemia retiniana,

hipertensión pulmonar, la preeclampsia, retardo de crecimiento intrauterino retardado y el

cáncer. [54] tiene un papel central en los dos mecanismos homeostáticos fisiológicos, ya sea

en etiopatológicos. Actúa sobre los genes objetivo, dado que su función está regulada por

factores de crecimiento y las alteraciones genéticas implicadas en la progresión tumoral. [55]

La oxigenación del tumor suele ser muy inestable y heterogéneo, como consecuencia de la

arquitectura vascular local y la heterogeneidad funcional de los tejidos, [56] se producen

fluctuaciones en el flujo sanguíneo que provoca una disminución de la perfusión de la sangre

locales tejido tumoral. [57]

Aberrante barcos pueden desaparecer en cualquier momento, pero a veces pueden ser

reutilizados, lo que resulta en cambios bruscos que ocurren reoxygenation de la hipoxia local y

re-oxigenación, como resultado de la angiogénesis locales. [58-59]

Medio ambiente es el tumor bien caracterizado como un entendimiento de que la fluctuación de

la hipoxia y deprivação de nutrientes, dando lugar a los recursos genéticos y epigenéticos de

adaptación de los clones de células, el aumento de la capacidad de invasión y metástasis.

Además, estas adaptaciones a la hipoxia, que los tumores más difíciles de tratar y de una

mayor resistencia a las terapias. Una parte importante de este proceso es la adaptación de los

productos de los genes en respuesta a la hipoxia y muchos de estos genes reguladores de la

hipoxia están mediadas por HIF1A, [60] estima que alrededor del 1% del genoma está regulado

por la hipoxia. [2]

El tumor hipoxia por sí misma es un factor importante en la regulación epigenética de la

proteína HIF-1α. Además de los doctores e inhibir HIF-1α, hipoxia genera radicales libres de

oxígeno, que son capaces de estabilizar la proteína HIF-1α y la inducción de genes y el VEGF

HIF1A. [61-62]

Cuando a la hipoxia, una respuesta celular a fin de evitar la apoptosis. [63] y activar el factor de

transcripción HIF-1α que genera heterodimers con HIF-1β (Arnt) en el elemento de respuesta a

la hipoxia (HRE), lo que lleva a una respuesta celular a la activación de varios oncogenes, [64]

ANEXOS

99

aumentó vascularización con la producción del VEGF, el aumento de transporte de la glucosa

(GLUT1) y la actividad de la anhidrasa carbónica (CA9), y la inducción de la apoptosis de

varios genes. [65-67] Se sabe que el HIF actúa en los genes de codificación de la

eritropoyetina, la transferrina, la endotelina-1, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), hemo

oxigenasa-1, factor de crecimiento insulina-2 (IGF2), proteínas la conexión de 1, 2 y 3 del factor

de crecimiento de la insulina (IGFBP 1,2,3), transportadores de glucosa (excesos) y glicolíticas

enzimas [18,28,68] (Figura 4) la promoción de la adaptación metabólica a la hipoxia, y también

regirá por la presión de O2, en función de la sub-unidad de expresión de HIF-1α. [69-70] La

capacidad de adaptación a la hipoxia de las células malignas, es fundamental para el

crecimiento del tumor (Tabla 1).

Hipoxia, HIF y el cáncer

La hipoxia es significativamente menor en los tumores donde el promedio de la tensión de O2

es mayor que el 1,5%. [53, 79-80]

Las células tumorales para sobrevivir, tienen que adaptarse a baja presión, y aumentar la

vascularización pO2, muchos productos están implicados en genómica neo-angiogénesis

tumoral. Estas adaptaciones contribuirán a la supervivencia y el fenotipo clínico agresivo. [81]

La hipoxia tumoral se ha asociado a mal pronóstico en muchos tipos de cáncer. [82]

Clones de células tumorales tienen la capacidad de adaptarse a los microambientes hipóxico,

ya sea en locales de enseñanza primaria, o en los sitios de metástasis. Los mecanismos

genéticos y epigenéticos de adaptación a la hipoxia (inestabilidad genética, la glicólisis

aeróbica, la pérdida de control del ciclo celular, la pérdida de los signos de la apoptosis) son

características de malignidad [60] (Figura 5). Hay pruebas de que la hipoxia puede controlar y

mantener la inestabilidad genética. La inestabilidad genética puede reducir la reparación de

ADN y aumentar la tasa de mutaciones. [66]

El tumor intra-hipoxia es un factor de mal pronóstico observado en los tumores de próstata,

mama, músculo-esquelético, de cabeza y cuello y el cuello del útero [83-85], que se asocia con

una mayor tasa de fracaso de la RT y QT y el aumento de las metástasis. [66]

Es sabido que la activación de la glicólisis aeróbica, es un evento temprano en el proceso de

transformación neoplásica, probablemente como respuesta al aumento de la proliferación

celular, [86] porque las células con una elevada tasa de proliferación, consumen más oxígeno.

Los tumores han aumentado la glicólisis y sabiendo que la concentración de glucosa y de los

componentes de la influencia de la vía glicolíticas HIF. [87-88] El tumor es más ácido de pH

debido a la mayor producción de lactato y de CO2. Para sobrevivir, las células necesitan para

mantener un equilibrio entre el pH intracelular y extracelular, esto se logra a costa de diversos

transportistas. La anhidrasa carbónica IX (CA 9), ha papel clave en este balance, varios

estudios han demostrado la correlación entre la hipoxia, la angiogénesis, la HIF-1α y CA9. [89]

ANEXOS

100

Por lo tanto, los niveles de HIF se adaptan a mantener la elevada tasa de proliferación celular

y, por otra parte, el aumento de la proliferación celular puede aumentar la expresión de HIF.

[28] En las situaciones de hipoxia, en el que la acción de los factores de crecimiento conduce a

un aumento de la proliferación celular y, por tanto, necesitan más oxígeno, la HIF-1α se

expresó más y activa, que induce la expresión de genes que codifican para moléculas pro-

angiogénicos y permitir la adaptación metabólica a la hipoxia, el más potente activador de

genes que codifican las enzimas glicolíticas y factores de crecimiento pro-angiogénicos [28, 90-

93] ya que los tumores no pueden avanzar sin la angiogénesis que permite la difusión de

oxígeno, la glucosa y otros nutrientes. [77-78]

La angiogénesis es el desarrollo de nuevos buques de la red vascular pre existentes, teniendo

un papel de liderazgo en varios mecanismos fisiopatológicos benignos (la curación, la herida, la

isquemia, la retinopatía diabética) y malignas (el crecimiento del tumor y metástasis), y

sabiendo que el VEGF desempeña un papel clave en la angiogénesis y está regulada por HIF.

[94-96]

Ahora hay pruebas de que el tumor de los buques son desorganizados y sin estructura de

movimiento, a menudo, conducen al colapso. Dado que el crecimiento del tumor requiere

oxígeno, nutrientes y la función metabólica adecuada a su desarrollo, es necesario promover la

angiogénesis factores para inhibir la apoptosis de células tumorales causada por la hipoxia. Por

lo tanto, la angiogénesis tumoral en respuesta a la hipoxia, está mediada por HIF-1α. [55]

El HIF-1α se ha considerado un factor clave en la regulación del VEGF y su receptor (VEGFR)

y otros factores angiogénicos. Inmuno-histoquímica estudios en diversos modelos tumorales,

[71] puso de manifiesto en la expresión de HIF-1α asociada con un aumento del VEGF y el

aumento de la vascularización y la metástasis, resultando en peor pronóstico. [72-76] Parece

que hay una relación directa entre la angiogénesis y la metástasis en diversos tipos de tumores

como los melanomas, gliomas, pulmón, mama, ovario, vejiga y próstata [97-98], con el objetivo

de que las proteínas HIF-1α están implicados en la proliferación, la supervivencia, la

adherencia y la movilidad de las células neoplásicas.

Además, más de la expresión de HIF-1α inactivadoras combinado con mutaciones en genes

supresores como la BVS, p53, PTEN o amplificación de oncogenes Akt, RAS, ERK1 / 2, se ha

observado con frecuencia en los pacientes con cáncer, estos cambios se asocian con el

crecimiento tumor, invasión y metástasis. Zhong [99] ha demostrado el aumento de expresión

de HIF-1α en alrededor del 53% de los tumores incluyendo colon, estómago, páncreas,

pulmón, ovario, próstata, riñón, melanoma y glioblastoma. El aumento de expresión de HIF-1α,

está asociada a la supervivencia más corto en el cáncer de mama y de útero y la mala

respuesta al tratamiento en el cáncer nasofaríngeo, el apoyo a un papel de la hipoxia en el

pronóstico del tumor (Tabla 2). [72, 100-104]

En el cáncer de la próstata, se expresa en los estadios iniciales de la carcinogénesis y que la

expresión se relaciona con los indicadores de diagnóstico y pronóstico de la primera

recurrencia y metástasis, y el HIF-1α puede ser un biomarcador potencial de pronóstico. Su

importancia en la progresión tumoral, lo convierte en un objetivo plausible en las estrategias de

ANEXOS

101

prevención de quimioterapia, así como la capacidad de inhibir la angiogénesis. [60] Los

estudios experimentales en las células del cáncer de próstata en ratas, muestran que el exceso

de expresión de HIF-1α se asocia con un mayor crecimiento y potencial metastásico. [107] De

acuerdo, en los seres humanos, también ha encontrado una mayor expresión de HIF-1α en los

tumores de próstata. [48.99] En el PAC, en particular los pacientes con cáncer o la hormona-

resistentes metastizado, se ha demostrado que el gen VEGF, principalmente inducido por el

HIF-1α se expresa a menudo sobre-, lo que sugiere una acción de esta molécula en este

proceso. [105,106]

La activación de oncogenes y los factores de crecimiento, pueden inducir al sistema de HIF en

las células no hipoxiantes o amplificar la respuesta a la hipoxia. En efecto, varios factores de

crecimiento y citocinas en el estroma y el parénquima, también actúan como reguladores y de

inducir la expresión de HIF-1α, su capacidad de enlace y transactivação como factor de

crecimiento epidérmico (FEAG) [46 ] la TGFα, [92107] los factores de IGF 1 y el IGF 2, [108] y

la interleucina 1b. [109]

Además, estudios recientes muestran que HIF puede desempeñar un papel importante en la

resistencia a los tratamientos. [110-112]

El HIF sistema actúa como regulador de la máxima respuesta a la hipoxia, iniciando una

cascada de mecanismos que permitan el tumor para adaptarse al entorno hostil, surgiendo

como un importante factor de transcripción en la biología del cáncer.

CONCLUSIÓN

La activación de HIF está regulada por diferentes mecanismos a partir de la estabilización de

HIF-1α sub-unidad de la participación de múltiples vías y señales.

A la hipoxia, algunos genes supresores de tumor, factores de crecimiento y citoquinas,

aumentan la estabilidad y / o transactivação de HIF1A, resultando en un aumento de la

producción de HIF-1α posterior del tumor y la angiogénesis, la adaptación metabólica a la

hipoxia y promover la supervivencia celular, porque su acción en varios genes diana. El HIF-1α

será crucial en la iniciación de la angiogénesis, el crecimiento del tumor, la progresión y las

metástasis.

Parece, pues, fundamental para desarrollar formas para bloquear o inhibir la angiogénesis y

HIF-1α, reduciendo la posibilidad de desarrollar cáncer más agresivo y, por ende, reducir la

morbilidad y la mortalidad por cáncer. El HIF1A podría crear un marcador precoz de la

carcinogénesis, con valor predictivo de progresión tumoral y valor pronóstico.

ANEXOS

102

Bibliografia

1. Semenza GL. HIF-1 and human disease: One highly involved factor. Genes Dev 2000; 14:1983–1991. 2. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 2003; 3:721–732. 3. Kaelin WG.Jr. Molecular basis of the VHL hereditary cancer syndrome. Nat Rev Cancer 2002; 2:673–682. 4. Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1995; 270:1230–1237. 5. Semenza GL. HIF 1 and tumor progression: pathophysiology and therapeutics. Trends Mol Med 8: S62-67, 2002 6. Semenza GL. Involvement of HIF 1in human cancer. Intern Med, 41: 79-83, 2002 7. Manalo DJ, Rowan A, Lavoie T, Natarajan L, Kelly BD, Ye SQ, Garcia JG, Semenza GL. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood 2005; 105:659-669. 8. Jain RK, Normalizing tumor vasculature with anti angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat Med 7: 987-89, 2001. 9. Semenza GL, Rue EA, Iyer NV, Pang MG, Kearns WG. Assignment of the hypoxia inducible factor 1α gene to a region of conserved synteny on mouse chromosome 12 and human chromosome 14q. Genomics 1996; 34:437-9. 10. Iyer NV, Leung SW, Semenza GL. The human hypoxia inducible factor 1 alpha gene: HIF1A structure and evolutionary conservation. Genomics 1998; 52: 159-165. 11. Tian H, McKnight SL, Russell DW. Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev 1997; 11:72–82. 12. Ema M, Taya S, Yokotani N, Sogawa K, Matsuda Y, Fujii-Kuriyama Y. A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1alpha regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:4273–4278. 13. Flamme I, Frohlich T, von ReuternM, KappelA, Damert A, Risau W. HRF, a putative basic helix-loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to hypoxia-inducible factor-1 alpha and developmentally expressed in blood vessels. Mech Dev 1997; 63:51–60. 14. Gu YZ, Moran SM, Hogenesch JB, Wartman L, Bradfield CA. Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha. Gene Expr 1998;7: 205–213. 15. Wenger RH(2002) Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factores, and O2-regulated gene expression. FASEB J 16:1151-1162. 16. Vandromme M, GauthierRouviere C, Lamb N, Fernandez A. Regulation of transcription factor localization: Fine-tuning of gene expression. Trends Biochem Sci 1996; 21: 59-64. 17. Jiang BH, Zheng JZ, Leung SW, Roe R, Semenza GL. Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1 alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension. J Biol Chem 1997; 272: 19253-19260. 18. Jiang BH, Rue E, Wang GL, Roe R, Semenza GL. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1996; 271:17771-8. 19. Michel G, Minet E, Ernest I, Roland I, Durant F, Remacle J, Michiels C. A model for the complex between the hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its consensus DNA sequence. J Biomol Struc Dyn 2000; 18: 169-179 20. Huang LE, Gu J, Schau M, Bunn HF. Regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha is mediated by an O-2-dependent degradation domain via the ubiquitin- proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 7987-7992

ANEXOS

103

21. Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, Salic A, Asara JM, Lane WS, Kaelin WG Jr. HIFalpha targeted for VHLmediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science 2001;292:464–468. 22. Bruick RK, McKnight SL. A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 2001; 294:1337-40 23. Pause A, Lee S, Worrell RA et al, The von Hipple – Lindau tumor suppressor gene product forms a stable complex with human cul-2, a member of the Cdc53 family of proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:2156-61. 24. Lonergan KM, Iliopoulos O, Ohh M, et al. Regulation of hypoxia – inducible mRNAs by the von Hipple – Lindau tumor suppressor protein requires binding to complexes containing elongins B/C and Cul2. Mol Cell Biol 1998; 18:732-41. 25. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW et al. The tumor suppressor protein VHL targets hypoxia inducible factores for oxygen – dependent proteolysis. Nature 1999; 399:271-5. 26. Ohh M, Park CW, Ivan M, et al. Ubiquitination of hypoxia inducible factor requires direct binding to the beta domain of the von Hipple-Lindau protein. Nat Cell Biol 2000; 2:423-7. 27. Tanimoto K, Makino Y, Pereira T, Poellinger L. Mechanism of regulation of the hypoxia inducible factor 1 alpha by the von Hipple Lindau tumor suppressor protein. EMBO J 2000; 19: 4298-309. 28. Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, Passantino R, Concordet JP, Maire P, Giallongo A. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia- inducible factor 1. JBiol Chem 1996; 271: 32529-32537 29. Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, Hewitson KS, O’Rourke J, Mole DR, Mukherji M, Metzen E, Wilson MI, Dhanda A, Tian YM, Masson N, Hamilton DL, Jaakkola P, Barstead R, Hodgkin J, Maxwell PH, Pugh CW, Schofield CJ, Ratcliffe PJ. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 2001; 107:43–54. 30. Min JH, Yang H, Ivan M, Gertler F, Kaelin WG Jr, Pavletich NP. Structure of an HIF-1alpha-pVHL complex: Hydroxyproline recognition in signaling. Science 2002; 296:1886–1889. 31. Yu F, White SB, Zhao Q, Lee FS. HIF-1alpha binding to VHL is regulated by stimulus-sensitive proline hydroxylation. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:9630–9635. 32. Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, Kriegsheim A, Hebestreit HF, Mukherji M, Schofield CJ, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 2001; 292:468–472. 33. Masson N, Willam C, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ. Independent function of two destruction domains in hypoxiainducible factor-alpha chains activated by prolyl hydroxylation. EMBO J 2001; 20:5197–5206. 34. Jeong JW, BaeMK,AhnMY,KimSH, Sohn TK, BaeMH,YooMA, Song EJ, Lee KJ, Kim KW. Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediated acetylation. Cell 2002; 111: 709–720. 35. Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ, Whitelaw ML. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science 2002;295:858–861. 36. Jane L. Boddy. The androgene receptor is significantly associatedd with vascular endothelial growth factor and hypoxia sensing via hif1α, hif2α and the prolyl hydroxylases in human prostate cancer, in Clinical Cancer Research, Vol 11, 7658-7663, November 1, 2005. 37. Wykoff CC, Sotiriou C, Cockman ME, et al. Gene array of VHL mutation and hipoxia shows novel hipoxia induced genes and that cyclin D1 is a VHL target gene. Br J Cancer. 2004; 90: 1235-1243. 38. Melillo G. Inhibiting hypoxia inducible factor 1 for cancer therapy. Mol Cancer Res. 2006; 4:601-605. 39. Chan DA, Sutphin PD, Denko NC, Giaccia AJ. Role of prolyl hydroxylation in oncogenically stabilized hypoxia-inducible factor-1alpha. J Biol Chem 2002; 277: 40112-40117

ANEXOS

104

40. Dameron KM, Volpert OV, Tainsky MA, Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by P53 regulation of thrombospondin-1. Science 1994; 265: 1582-1584 41. Bouvet M, Ellis LM, Nishizaki M, Fujiwara T, Liu WB, Bucana CD, Fang B, Lee JJ, Roth JA. Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer down-regulates vascular endothelial growth factor expression and inhibits angiogenesis in human colon cancer. Cancer Res 1998; 58: 2288-2292 42. Blancher C, Moore JW, Robertson N, Harris AL. Effects of ras and von Hippel-Lindau (VHL) gene mutations on hypoxia-inducible factor (HIF)-1 alpha, HIF-2 alpha, and vascular endothelial growth factor expression and their regulation by the phosphatidylinositol 3 ‘-kinase/Akt signaling pathway. Cancer Res 2001; 61: 7349-7355. 43. Laughner E, Taghavi P, Chiles K, Mahon PC, Semenza GL.HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) synthesis: Novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression. Mol Cell Biol 2001;21:3995–4004. 44. Arsham AM, Plas DR, Thompson CB, Simon MC. Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling is neither required for hypoxic stabilization of HIF-1 alpha nor sufficient for HIF-1-dependent target gene transcription. J Biol Chem 2002;277:15162–15170. 45. Mottet D, Dumont V, Deccache Y, Demazy C, Ninane N, Raes M, Michiels C. Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells. J Biol Chem 2003;278:31277–31285. 46. Zhong H, Chiles K, Feldser D, Laughner E, Hanrahan C, Georgescu MM, Simons JW, Semenza GL. Modulation of hypoxiainducible factor 1 alpha expression by the epidermal growth factor/phosphatidylinositol 3- inase/PTEN/AKT/FRAP pathway in human prostate cancer cells: Implications for tumor angiogenesis and therapeutics. Cancer Res 2000; 60: 1541-1545 47. Mabjeesh NJ, Willard MT, Frederickson CE, Zhong H, Simons JW. Androgens stimulate hypoxia-inducible factor 1 activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol 3’-kinase/protein kinase B in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 2003; 9:2416-25. 48. Outi RS, Kimmo JS, Nina NN, Ola B, Tapio V. Amplification of hif 1α gene in prostate cancer, in Cancer Genetics and Cytogenetics 128(2001) 31-34. 49. Gao N, Ding M, Zheng JZ, Shi X, Jiang BH. Vanadate-induced expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and vascular endothelial growth factor through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and reactive oxygen species. J Biol Chem 2002; 277: 31963-31971 50. Gao N, Jiang BH, Corum L, Roberts JR, Antonini J, Zheng JZ, Flynn DC, Castranova V, Shi XI. p38 Signaling-mediated hypoxia- inducible factor 1alpha and vascular endothelial growth factor induction by Cr(VI) in DU145 human prostate carcinoma cells. J Biol Chem 2002; 277: 45041-45048 51. Haddad JJ, Land SC. A non-hypoxic, ROS-sensitive pathway mediates TNF-alpha-dependent regulation of HIF-1alpha. FEBS Lett 2001; 505: 269-274 52.Chandel NS, McClintock DS, Feliciano CE, Wood TM, Melendez JA, Rodriguez AM, Schumacker PT. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1 alpha during hypoxia - A mechanism of O-2 sensing. J Biol Chem 2000; 275: 25130-25138 53. Zander R, Vaupel P. Proposal for using a standardized terminology on oxygen transport to tissue. Adv Exp Med Biol 1985;191:965–70. 54. Stroka DM, Burkhardt T, Desbaillets I, Wenger RH, Neil DA, Bauer C, Gassmann M, Candinas D. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia. FASEB J 2001;15:2445–2453. 55. Yong HS, Wei GF. Hypoxia inducible factor in tumor angiogenesis. World J Gastroenterol 2004; 10(8): 1082-1087. 56. Vaupel P, Kallinowski F, Okunieff P. Blood flow, oxygen and nutrient supply, and metabolic microenvironment of human tumors: a review. Cancer Res 1989; 49:6449–65. 57. Kimura H, Braun RD, Ong ET et al. Fluctuations in red cell flux in tumor microvessels can lead to transient hypoxia and reoxygenation in tumor parenchyma. Cancer Res1996;56:5522–8.

ANEXOS

105

58. Brown JM, Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res 1998;58:1408–16. 59. Dewhirst MW. Concepts of oxygen transport at the microcirculatory level. Semin Radiat Oncol 1998;8:143–50. 60. Kimbro KS and Simons JW. Hypoxia-inducible factor in human breast and prostate cancer, Endocrine Related Cancer (2006) 13: 739-749. 61. Kaelin WG. ROS: really involved in oxygen sensing. Cell Metabolism 2005; 1:357-358) 62. Muzandu K, Shaban Z, Ishizuka M, Kasusaka A and Fujita S. Nitric Oxide enhances catechol estrogen induced oxidative stress in LNCaP cells. Free Radical Research 2005; 39:389-398. 63. Semenza GL. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia inducible factor 1. Annu Ver Cell Dev Biol. 1999; 15:551-578) 64. Gleadle JM and Ratcliffe PJ. Induction of hypoxia inducible factor 1, erythropoietin, vascular endothelial growth factor and glucose transporter 1 by hypoxia: evidence against a regulatory role for Src kinase. Blood 1997; 89:503-509 ) 65. Airley R, Loncaster J, Davidson S, Bromley M, Roberts S, Patterson A, Hunter R, Stratford I and West C. Glucose transporter glut 1 expression correlates with tumor hypoxia and predicts metastasis free survival in advanced carcinoma of the cervix. Clinical Cancer Research 2001; 7:928-934. 66. Robert G. Bristow and Richard P. Hypoxia, dna repair and genetic instability, Hill in Nature Reviews, March 2008, volume 8, pag 180-192. 67. Prince BD and Calderwood SK. GADD45 and GADD153 messenger RNA levels are increased during hypoxia and after exposure of cells to agents which elevate the levels of the glucose regulated proteins. Cancer Research 1992; 52:3814-3817). 68. Semenza GL. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med 2003;54:17–28. 69. Dachs GU, Tozer GM. Hypoxia modulated gene expression: angiogenesis, metastasis and therapeutic exploitation. Eur J Cancer 2000; 36:1649-60). 70. Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW, Koods RD, Semenza GL. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia inducible factor 1. Mol Cell Biol 1996; 16:4604-13. 71. Talks KL, Turley H, Gatter KC, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ, Harris AL. The expression and distribution of the hypoxiainducible factors HIF-1 alpha and HIF-2 alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages. Am J Pathol 2000; 157: 411-421 72. Bos R, Zhong H, Hanrahan CF, Mommers EC, Semenza GL, Pinedo HM, Abeloff MD, Simons JW, van Diest PJ, van der Wall E. Levels of hypoxia-inducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 309-314 73. Giatromanolaki A, Koukourakis MI, Sivridis E, Turley H, Talks K, Pezzella F, Gatter KC, Harris AL. Relation of hypoxia inducible factor 1 alpha and 2 alpha in operable non-small cell lung cancer to angiogenic/molecular profile of tumours and survival. Br J Cancer 2001; 85: 881-890 74. Shi BM, Wang XY, Mu QL, Wu TH, Liu HJ, Yang Z. Angiogenesis effect on rat liver after administration of expression vector encoding vascular endothelial growth factor D. World J Gastroenterol 2003; 9: 312-315 75. Toi M, Hoshina S, Takayangi T, Tominaga T. Association of vascular endothelial growth-factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast-cancer. Jpn Cancer Res 1994; 85: 1045-1049 76. Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, Takatsuka S, Kang SM, Ogawa M, Sawada T, Sowa M. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer 1996; 77: 858-863 77. Semenza GL. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol, 15:551-578, 1999.

ANEXOS

106

78. Kerbel RS. New targets, drugs and approaches for the treatment of câncer: na overview. Cancer Metastasis Rev, 17:145-147, 1998. 79. Vaupel P. The role of hypoxia induced factores in tumor progression Oncologist 2004, 9(suppl 5): 10-17. 80. Vaupel P, Kelleher DK and Hockel M. Oxygen status of malignant tumors: pathogenesis of hypoxia and significance for tumor therapy. Seminars in Oncology 2001, 28:29-35 81. Acs G, Xu X, Chu C, Acs P and Verma A. Prognostic significance of erythropoietin expression in human endometrial carcinoma. Cancer 2004; 100:2376-2386. 82. Vleugel MM, Greijer AE, Shvarts A, Van Der Groep P, Van Berkel M, Aarbodem Y, Van Tinteren H, Harris AL, Van Diest PJ and Van Der Wall E. Differential prognostic impact of hypoxia induced and diffuse HIF-1alpha expression in invasive breast cancer. Journal of Clinical Pathology, 2005; 58:172-177). 83. Chan N, Milosevic M, Bristow RG. Tumor hypoxia, DNA repair and prostate câncer progression: new targets and new therapies. Future Oncol 2007;3:329-341; 84. Chaudary N, Hill RP. Hypoxia and metastasis. Clin Cancer Res 2007; 13:1947-1949; 85. Vaupel P, Mayer A. Hypoxia in cancer: significance and impacto in clinical outcome. Cancer Metastasis Ver 2007; 26:225-239 86. Brand KA, Hermfisse U. Aerobic glycolysis by proliferating cells: a protective strategy against reactive oxygen species. FASEB J 1997;11:388–95. 87. Gatenby RA, Gilles RJ. Why do cancers have high aerobic glycolysis ? Nat Rev Cancer 2004; 4:891-899 88. Vordermark D, Kraft P, Katzer A, Bolling T, Willner J, Flentje M. Glucose requirement for hypoxic accumulation of hypoxia inducible factor 1alpha. Cancer Lett 2005; 230:122-133 89. Van den Eynden GG, Van der Auwera I, Van Laere SJ, Colpaert CG, Turley H, Harris AL, Van Dam P, Dirix LY, Vermeulen PB, Van Marck EA. Angiogenesis and hypoxia in lymph node metástases is predicted by the angiogenesis and hypoxia in the primary tumour in patients with breast câncer. BR J Cancer 2005; 93:1128-1136. 90. Semenza GL. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol 2000; 88: 1474-1480 91. Ryan HE, Lo J, Johnson RS. HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. Embo J 1998; 17: 3005-3015 92. Acker T, Plate KH. A role of hypoxia and hypoxia inducible transcription factores in tumor physiology. J Mol Med 2002; 80:562-575 93. Acker T, Plate KH. A role of hypoxia in tumor angiogenesis – molecular and cellular angiogenic crosstalk. Cell Tissue Res 2003; 80:562-575. 94. Brahimi-Horn MC, Pouyssegur J. The hypoxia inducible factor and tumor progression along the angiogenic pathway. Int Rev Cytol, 2005; 242:157-213 95. Pugh CW, Ratcliffe PJ. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat Med 2003; 9:677-684 96. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptores. Nat Med 2003; 9:669-676 97. Bochner BH, Cote RJ, Weidner N, Groshen S, Chen SC, Skinner DG, Nichols PW. Angiogenesis in bladder-cancer-relationship between microvessel density and tumor prognosis. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 1603-1612 98. Jaeger TM, Weidner N, Chew K, Moore DH, Kerschmann RL, Waldman FM, Carroll PR. Tumor angiogenesis correlateswith lymph-node metastases in invasive bladder-cancer. J Urol 1995; 154: 69-71

ANEXOS

107

99. Zhong H, De Marzo AM, Laughner E, Lim M, Hilton DA, Zagzag D, Buechler P, Isaacs WB, Semenza GL, Simons JW. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases. Cancer Res 1999;59:5830–5835. 100. Bos R, van der Greijer AE, Shvarts A, Meijer S, Pinedo HM, Semenza GL, van Diest PJ, van der Wall E. Levels of hypoxiainducible factor-1alpha independently predict prognosis in patients with lymph node negative breast carcinoma. Cancer 2003; 97: 1573-1581 101. Birner P, Schindl M, Obermair A, Breitenecker G, Oberhuber G. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in epithelial ovarian tumors: its impact on prognosis and on response to chemotherapy. Clin Cancer Res 2001; 7: 1661-1668 102. Aebersold DM, Burri P, Beer KT, Laissue J, Djonov V, Greiner RH, Semenza GL. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha: a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer. Cancer Res 2001; 61: 2911-2916 103. Hockel M, Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 266-276 104. Li Z, Wang D, Na X, Schoen SR, Messing EM, Wu G. The VHL protein recruits a novel KRAB-A domain protein to repress HIF-1alpha transcriptional activity. EMBO J 2003;22:1857– 1867. 105. Kondo K, Klco J, Nakamura E, Lechpammer M, Kaelin WG Jr. Inhibition of HIF is necessary for tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein. Cancer Cell 2002;1:237–246. 106. George DJ, Regan MM, Oh WK, Tay MH, Manola J, Decalo N, Duggan S, Dewolf WC, Kantoff PW, Bubley GJ. Radical prostatectomy lowers plasma vascular endothelial growth factor levels in patients with prostate cancer. Urology 2004;63:327–332. 107. Zhong H, Agani F, Baccala AA, Laughner E, Rioseco-Camacho N, Isaacs WB, Simons JW, Semenza GL. Increased expression of hypoxia inducible factor 1 alpha in rat and human prostate câncer. Cancer Res 1998; 58:5280-4 108. Treins C, Giorgetti-Peraldi S, Murdaca J, Semenza GL, Van Obberghen E. Insulin stimulates hypoxia-inducible factor 1 through a phosphatidylinositol 3-kinase/target of rapamycindependent signaling pathway. J Biol Chem 2002; 277: 27975-27981 109. Stiehl DP, Jelkmann W, Wenger RH, Hellwig-Burgel T. Normoxic induction of the hypoxia-inducible factor 1alpha by insulin and interleukin-1beta involves the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. FEBS Lett 2002; 512: 157-162 110. Brown JM and Giaccia AJ. The unique physiology of solid tumors: opportunities and problems for câncer therapy. Cancer Res, 58:1408-1416, 1998. 111. Wartenberg M, Ling FC, Muschen M, et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. FASEB J 2003;17:503–5. 112. Comerford KM, Wallace TJ, Karhausen J, et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) gene. Cancer Res 2002;62:3387–94.

ANEXOS

108

Cuadro 1. Moléculas reguladas por HIF-1α e su acción fisiopatológica

Molécula Funcion Referencia

VEGF Angiogénese [5-7,16,37,38,66,68,71-78] Eritropoietina Eritropoiese [5-7,16,66,68,77,78] GLUT-1 Glicólise [5-7,16,37,38,66,68,77,78] TGF-α Invasão e metastização [5-7,37,38,78] Transferrina Apoptose [5-7,16,68,77,78] Endotelina Tónus vascular [5-7,16,68,77,78] CA 9 Regulador pH [5-7,37,38,66,77,78] iNOS Resistência fármacos [5-7,16,68,77,78] IGF-2, Hemo-oxigenase 1 Homeostasia [5-7,16,68,77,78] IGFBP-1,2,3 Homeostasia [5-7,16,68,77,78]

Cuadro 2. Tumores muestran sobre-expresión de HIF evaluados por inmunohistoquímica

Referencia [99] [83-85] [97,98] [72,100-104] [48,60,105-107] Cólon X

Gástrico X

Pâncreas X

Pulmão X X

Ovário X X

Útero X X

Próstata X X X X

Rim X

Gliomas X X

Mama X X X

Cabeça/pescoço X

Melanoma X X

ANEXOS

109

Figura 1. Estrutura Molecular de HIF-1 (adaptado de Shi YH [55])

bHLH αPAS P402 P564ODD TAD-N ID N803

TAD-C

bHLH PAS

Actividade Transcrição

HRE

Dimerização

P300/CBP

NLS-N VHL

OH OH

α

β

NLS-C

Figura 2. Reglamento de la estabilidad y la actividad de HIF (adaptado de Brahimi-Horn [94])

ANEXOS

110

Figura 3. Vías de señalización y regulación de HIF-1α: oncogenes, factores de crecimiento hipoxia (adaptado de Shi YH et al [55])

Figura 4. Respuestas determinadas por HIF: actúa como el principal regulador fisiológico de la hipoxia (adaptado de Acker T, Plate KH [93])

ANEXOS

111

Figura 5. Reglamento de HIF-1α (adaptado de Molecular Medicine 2005, Cambridge University Press)

Figura 6. Papel de HIF en la supervivencia y la muerte celular (adaptado de Acker T, Plate KH [93])

PO2

HIFα

Morte Celular

PO2

HIFα

Morte Celular

HIPÓXIA TUMORAL E CANCRO DA PRÓSTATA: ANÁLISE DO ... · Gráfico 1- Percentagem de volume...

Documents

Transcript of HIPÓXIA TUMORAL E CANCRO DA PRÓSTATA: ANÁLISE DO ... · Gráfico 1- Percentagem de volume...