Sheyla M. C. Máximo Bicalho, Andréa P.B. Borges, Cleuza de Faria Rezende et. al.

HAP-91® E COL.HAP-91® CASUISTICAS E ESTUDOS

CIENTÍFICOS

4a Edição

JHS Laboratório Químico Ltda Rua Ouro Branco 345 - Alvorada -34650-120 - Sabará - MG

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Diagramação: Revisão: Sheyla M. C. Máximo Bicalho Capa: Gustavo Pereira Paiva e Herman S. Mansur Produção Gráfica:

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Esse volume é formado por trabalhos desenvolvidos por alunos de Pós Graduação para obtenção do Grau de Mestres e Doutores nas Escola de Veterinária – UFMG, UFV, Depto.de Química – UFMG, sob a orientação das Doutoras Sheyla M.C.Máximo Bicalho, Cleuza de Faria Rezende, Andréa P. B. Borges e por profissinais da Odontologia, Ortopedia, Neurocirurgia e Otorrinos

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“Eu sou parte de uma equipe. Então, quando venço, não sou eu apenas quem vence. De certa forma, termino o trabalho de um grupo enorme de pessoas” Ayrton Senna

SUMÁRIO

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RESUMO ________________________________________________ 01 CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO _______________________________ 03 I- 1 HISTÓRICO _______________________________________ 03 I- 2 CONSTITUIÇÃO DAS A PATITAS _____________________ 04 I- 3 ENXERTOS ÓSSEOS _______________________________ _05 I- 3.1 Autógenos e Alógenos ______________________________ 06 I- 3.2 Implantes sintéticos ________________________________ 08 I-4 HIDROXIAPATITA COMO CONSTITUINTE DO OSSO_______08 CAPITULO II: TÉCNICAS EXPERIMENTAIS_________________11 CAPÍTULO III: SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DA HAP-91® E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS _________________________ 12 III- 1 SÍNTESE DA HAP-91��______________________________12 III- 2 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA PRIMA E DA HAP-91®_13 III-3 TESTES BIOLÓGICOS_______________________________14 CAPITULO IV: APLICAÇÕES DA HAP-91® _________________16 IV- 1 PRIMEIRO EXPERIMENTO__________________________16 IV- 2 CASUISTICAS – Dra Cleuza F. Rezende ________________40

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IV-2A CÃO ____________________________________________40 IV-2B CÃO____________________________________________42 IV-2C CÃO____________________________________________43 IV-2D CABRA_________________________________________44 IV-2E CÃO____________________________________________45 CAPÍTULO V: TRABALHOS PUBLICADOS EM REVISTA E/OU APRESENTADOS EM CONGRESSOS __________________46 V- 1: Osteointegração da Hidroxiapatita Sintética HAP-91 no processo alveolar da mandíbula de cães: Aspectos Clínicos e Radiográficos ___46 V - 2: Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães: aspectos histológicos_____________________56 V. 3: O Efeito da Hidroxiapatita Sintética(HAP-91�) na regeneração óssea de defeitos provocados experimentalmente na região de furca em dentes de cães___________________________________________65 V.4: Valiação da Rugosidade cristalina e dissolução IN VITRO de recobrimentos de Hidroxiapatitas produzidos por Plasma Spray com quatro diferentes espessuras_________________________________68 V.5: Estudo da Hidroxiapatita Sintética associada ao colágeno hemostático( COL.HAP-91) como veículo de Antimicrobiano na

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profilaxia da infecção óssea pós-traumática em Coelhos __________76 V.6: Hidroxipatita sintética pura (HAP-91® ), Hidroxiapatita sintética associada ao colágeno (COL.HAP-91®) e Hidroxiapatita associada a lipossoma (INT.HAP-91®) como substituto ósseo em defeitos provocados na Tíbia de cães: Aspectos da osteointegração à Microscopia de Luz Transmitida____________________________________________79 V.7: Hidroxiapatita sintética-HAP-91 como substituo ósseo em defeito experimental provocado no terço proximal da Tíbia em cães:Aspectos à Microscopia Eletrônica de Transmissão_______________________ 91 V.8: HAP-91, INT.HAP-91 E COL.HAP-91 como substituto ósseo na regeneração óssea em cães: Avaliação Clínico-Cirúrgica e Radiológica ____________________________________________________101 V.9: Aspectos Clínicos- Cirúrgicos e Radiográficos da Hidroxiapatita Sintética na Diafise Proximal da Tíbia de cães________________103 V.10: Hidroxipatita Sintética na Diáfise proximal da Tíbia, de cães (Canis familiares). Avaliação histológica por microscopia eletrônica deretrodispersão.___________________________________________119

CAPÍTULO VI: RELATOS CLÍNICOS DO USO DA HAP-91® E DA COL-HAP-91®

OTORRINO VI-1: Tratamento cirúrgico da rinite atrófica: Descrição do uso de implantes nasais com COL-HAP-91® em uma nova via de acesso realizada pela Equipe do Dr. Dário Antunes Martins - 2007 _____132

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ODONTOLOGIA VI- 1 Relato de um caso clínico com o uso de HAP-91® e COl-HAP-91® Cirurgia realizada em 2003 pelo Dr. Carlos Alberto Bittencourt - Belo Horizonte - MG – 2007________________________________ 138 VI- 2.- Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91® cirurgia realizada na clínica da São Leopoldo Mandic – CPO SLMandic, Campinas, São Paulo, no curso de mestrado em periodontia em 2006 pelos profissionais DR. WILLIAM DE SIMONE E DR. WILLIAM BUELAU___________________________________________ 144 VI-3 - Relato de um caso clínico com o uso de HAP-91® e COl-HAP-91® Levantamento de seio maxilar bilateral usando HAP-91® e COl-HAP-91® para posterior colocação de implantes -Cirurgia realizada: Dr. W illiam de Simone e Dr. Anderson Muller -2006-____________________ 148 VI-4 - Relato de casos clínicos com o uso de HAP-91® Realizado na Faculdade de Odontologia da UFMG pelo Prof. Dr. Ivan Doche Barreiros - 2005 4A Primeiro caso______________________________________154 4B segundo caso______________________________________158 4C terceiro caso__________________________________ ____161 4D quarto caso _______________________________________163 4E quinto caso________________________________________165 VI – 5 Relato de caso clínico e histopatologia realizado pelo Dr. Alexsander Ribeiro Pedrosa ,e Dr.Glácio Ribeiro Junior - B.Hte - MG_______________________________________________167 VI -6 Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91® e HAP-91® realizado pelo dentista Mauro Fonseca de Freitas CRO-MG – 17.166 em 20 de setembro de 2000_______________________177

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VI- 7 Relato de Casos Clinicos com uso da HAP-91 realizados pelo Dr Murilo Gomes Batista – Belo Horizonte – MG 7A Procedimento de levantamento de seio maxilar usando a HAP-91® como preparação para colocação de implantes dentários_______179 7B Procedimento de levantamento de seio maxilar usando a HAP-91® como preparação para colocação de implante total da arcadas superior_____________________________________________182 7C Procedimento de levantamento de seios maxilares usando a HAP-91® como preparação para colocação de implante parcial na arcada superior_____________________________________________186 7D Acompanhamento de próteses sobre implantes colocados em seios maxilares enxertados somente com HAP-91_________________190 VI 8 Relatos de Três casos clínicos com uso da HAP-91® e PRP e HAP-91® pura realizados pelo Cirurgião Dentista Dr. Gustavo Ribeiro Gontijo CRO –MG 15025 – Mestrando em Periodontia pela UNICASTELO – Campinas SP 8A Abcesso Periodontal________________________________192 8B Periodontite Crônica-________________________________193 8C Envolvimento Endodôntico Periodontal_________________194 VI -9Relatos de casos clínicos da HAP-91® em enxertos ósseos na implandontia oral realizados pela equipe de Cirurgiões Dentistas

DAVID SERSON 9A Primeiro Caso Clínico_______________________________195 9B Segundo Caso Clínico_______________________________198 9C Terceiro Caso Clínico_______________________________200 9D Quarto Caso Clínico________________________________202 9E Quinto Caso Clínico________________________________204

10

VI- 10 Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91®realizado pelo Cirúrgião Dentista Dr. Ricardo Lúcio Bicalho Megale _____206 VI - 11 Relato de um caso clínico com o uso da HAP-91® realizado pelo Cirúrgião Dentista Dr. Jose Carlos M. Sousa Lima B.Hte_______________________________________________208 BUCO MAXILO VI- Reconstrução frontal com hidroxiapatita HAP-91®: relato de casos realizados pelo Dr. Adriano doValle Fernandes_______211 1A:. Primeiro Caso Clínico_____________________________212 1B:.Segundo Caso Clínico_____________________________216 1C: Terceiro Caso Clínico______________________________219 ORTOPEDIA VI- 1: Tratamento de ESCOLIOSE utilizando a HAP-91®: Relato de um caso realizado pelos Drs. W eslei Rezende Paim, Roberto Sakamoto Falcon e Marlon Sudario no Hospital SOCOR - Belo Horizonte - MG – 2006_______________________________________________ 225 VI -2: Tratamento de FRATURA utilizando a Hidroxiapatita HAP-91®: relato de um caso realizado pelos Drs. Weslei Rezende Paim, e Marlon Sudario no Hospital SOCOR – Belo Horizonte – MG___________228 VI -3: Eficácia do uso de cerâmica fosfocálcica HAP-19® na artrodese de cirurgia de coluna: Avaliação de 26 pacientes submetidos a tratamento cirúrgico de patologia discal da coluna vertebral, no período de marco a novembro de 2006, no serviço de cirurgia de coluna do Hospital Bandeirantes- SP-SP.___________________________________ 232

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VI -4 : Recuperação do Fêmur distal com a Hidroxiapatita HAP-91®: relato de um caso realizado pelos Drs. Ruy Rocha Gusman e Alceuleir Cardoso de Souza.____________________________________ 238 NEUROCIRUGIA VI- Relatos de casos clínicos da COL.HAP-91® em enxertos ósseos na Reconstituição da calota craniana sobre tela de titânio realizados na CLINICA NEUROCIRURGICA LEOPOLDO MORAIS FILHO - BOTAFOGO - RIO DE JANEIRO – RJ VI -1A: Ressecção de Tumor e reconstituição da Calota Craniana fronto ptelional esquerda_______________________243 VI -1B: Reconstituição do retalho frontal____________________ 245 Agradecimentos_____________________________________ 249

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RESUMO Como a hidroxiapatita, Ca10 (PO4)6 (OH)2, apresenta semelhança química muito grande com os tecidos duros (ossos e dentes) dos animais, tem sido empregada como reconstituinte ósseo, uma vez que vários estudos têm demonstrado ser este material altamente biocompatível. Entretanto, no Brasil,devido ao alto custo, seu uso tem sido restrito em clínicas médica e odontológica. Neste trabalho a hidroxiapatita (HAP-91®),foi sintetizada a partir do calcárioe a custo mais acessível. Essa HAP-91® obtida foi caracterizada por diferentes técnicas, tais como: difração e fluorescência de raios-X, infra vermelho (IV), complexometria, etc. Como somente a confirmação estrutural não é suficiente para garantir que um determinado produto esteja apto a ser utilizado in vivo, foram feitos testes de incompatibilidade em animais de laboratório, os quais deram resultados negativos. Para se verificar o comportamento do material em situação real foram feitos testes de esterilidade e, posteriormente, realizados implantes em cães. Num sacrifício pré programado, os locais do implante foram estudados qualitativamente por microscopia de luz, microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de difusão. Foi possível concluir que a HAP-91® é biocompatível, osteocondutora e absorvida pelo organismo, além de apresentar a vantagem de ser obtida a baixo custo.

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO I- 1 HISTÓRICO

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Registros arqueológicos marcam o início da implantologia dental com os anciões egípcios e a cultura Maia1,2. Os primeiros relatos sobre enxertos ósseos bem sucedidos datam do início do século passado, quando Walker(1820), apud Shena3 transplantou osso autógeno no homem. No início do século XX, a transplantação óssea obteve grande popularidade na medicina humana, porém com sucesso questionáve3. A Segunda Grande Guerra estimulou o interesse por enxertos autógenos, alógenos e xenógenos4. Ocorreram muitos experimentos e erros na seleção dos biomateriais, na cirurgia, na análise mecânica, na reabilitação protética e na terapia periodontal. Falhas precoces foram comuns e freqüentemente resultaram em infecção, dor, desconforto, com conseqüente perda do tecido ósseo. Como resultado, muitos clínicos da comunidade dentária e médica tornaram-se alienados de comunidade do implante5,6. Apesar dessa alienação pela grande maioria de odontólogos e médicos, o trabalho e o interesse no tratamento com implante foram continuados por alguns implantologistas7,5,8,9. No fim da década de 60 e início da de 70, Volkov, Parrish e Ottolenghi publicaram os sucessos obtidos com enxertos alógenos em humanos, utilizados no tratamento de defeitos osteoarticulares devidos à retirada de tumores, e no tratamento de osteoartrite10. Nesse mesmo período membros da comunidade científica dentária começaram a estudar implantes. Um fator importante para o desenvolvimento do implante dentário foi a redução na incidência de cáries (USA), levando os cirurgiões dessa área se dedicarem ao estudo de novas modalidades de tratamentos. Além disto, pesquisas recentes mostraram que 24% dos americanos com idade entre 35 e 74 anos possuíam falhas dentárias, o que induziu a um aumento da necessidade de estudos sobre tratamentos para a reabilitação11,desenvolvidos e testados sob várias e complexas formas12,13,14. Assim, nos últimos dez anos, devido à extensa documentação científica sobre implantes clínicos experimentais, a implantologia tem se desenvolvido tanto na odontologia como na ortopedia e novos materiais para enxertos tem sido experimentos.

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Dentre eles, podemos citar: dura mater, cartilagem, dentina, osso liofilizado e biomateriais à base de fosfato de cálcio. Entre os substitutos ósseos destacam-se os corais marinhos das famílias Poritidae e Goniopora, que,através de reações hidrotérmicas com fosfato de amônio bibásico, são convertidos em hidroxiapatita (Holmes e Roser15, Kuhne et al.16) tendo sido utilizados (nesta forma química) na correção de defeitos ósseos no homem (Arakaki et al.17; Kveton et al.18),em coelhos (Najjar et al.19); em macacos (Ripamonti et al.20); em ratos (Nagahara et al.2); em gatos (Rawlings et al.21) e em cães (Bucholz et al.55); Cook et al.22; Sartoris et al.23),os resultados obtidos indicaram esse material como alternativa para a enxertia óssea na rotina clínica. Entretanto, a hidroxiapatita natural tem limitações, tais como: pequena variação na quantidade, tamanho e forma do produto em relação ao exoesqueleto do coral original, sendo que o material produzido apresenta baixa resistência mecânica (Nelson24). Entretanto a hidroxiapatita obtida através de reação entre reagentes inorgânicos pode ser preparada por diferentes métodos e tem mostrado bons resultados, não apresentando os mesmos obstáculos da hidroxiapatita natural4,25,26. I- 2 CONSTITUIÇÃO DAS A PATITAS As apatitas são representadas geralmente pela fórmula

M102+ (BO4

3-)6 X2 -, donde:

M = Ca2+, Sr2+, Ba2+, Pb2+, Cd2+, Mg2+, Fe2+, Re3+, Na+, K+, ...

BO = PO43-, AsO4

3-, VO43-, SO4

2-, SiO44-, ...

X = F-, Cl-, OH-, Br-, O2-, ...

Elas existem dispersas na natureza como constituintes principais de rochas ígneas e metamórficas, em grandes depósitos e em vários locais do mundo. Sua forma predominante é a apatita de cálcio, Ca10 (PO4)6 X2. Substituindo-se os ânions X por OH- tem-se a hidroxiapatita, de grande interesse biológico, por ser o principal constituinte inorgânico de ossos e dentes dos seres de vertebrados27,28. A Figura 1 apresenta a estrutura da hidroxiapatita.

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A fluorapatita é considerada como o protótipo das apatitas minerais; seus aspectos cristalográficos e químicos têm sido largamente estudados desde os trabalhos feitos por Naray Szabó29 e Sudarsanan et al.30. O aproveitamento da rocha apatífera na fabricação de fertilizantes é uma das aplicações deste importante mineral. Quando o ânion X é um átomo de flúor, ela passa a ser chamada de fluorapatita; a fluorapatita sintética, dopada com Mn e Sb adquire propriedades luminescentes e tem sido utilizada como revestimento de lâmpadas fluorescentes há cerca de 40 anos.

Figura 1 - Estrutura da Hidroxiapatita I- 3 ENXERTOS ÓSSEOS

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De acordo com Fox4, enxertos ósseos podem ser definidos como: - Autógenos: o osso removido do mesmo indivíduo em que o enxerto será usado; - Isógenos: tecido ósseo removido de um indivíduo da mesma espécie, geneticamente relacionado com o receptor (i.e., gêmeos idênticos); - Alógenos: tecido removido do cadáver de indivíduo da mesma espécie, geneticamente não relacionado com o receptor; - Xenógenos ou hetero-enxertos: tecido retirado de doador de espécie diferente da do receptor (i.e., tecido animal implantado em receptor humano). I- 3.1 Autógenos e Alógenos Os enxertos autógenos são largamente utilizados para tratamentos como por exemplo: - Fraturas com perda de tecido ósseo31; - Uniões retardadas ou não-uniões, quando o uso de enxerto ósseo autógeno pode tornar mais rápida a reconstituição do local fraturado31; - Tumores ósseos: eles apresentam a tendência de destruir os ossos e invadir o tecido mole local. O tecido ósseo deverá ser reconstruído após a amputação da lesão com a retirada da parte danificada do esqueleto e de artes dos tecidos moles envolvidas. Tais lesões são prováveis de retornarem se tratadas por curetagem32,33,34. Como descrito por Urist e Adams23, a indução osteogênica pode ser então resumida como um mecanismo de diferenciação e especialização celular, devido a uma interação entre o tecido hóspede e tecido hospedeiro, induzindo:

1- suporte e proteção para o crescimento de novos vasos para restauração do fornecimento de sangue medular;

2- células para a osteogênese; 3-fator de indução óssea que estimula as células hospedeiras

pluripotenciais e 4- antigenicidade reduzida.

Conseqüentemente, a dinâmica para a formação óssea no local do

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enxerto autógeno tem três requisitos básicos: uma célula própria, uma boa nutrição e um estímulo satisfatório23. Segundo Fox31, a superioridade biológica de enxertos autógenos em cirurgia de reconstrução ortopédica baseia-se no fato de a matriz óssea enxertada ser não imunogênica. Entretanto, esses enxertos ósseos,de acordo com Ripamonti35,defrontam-se com algumas desvantagens:

- complicações no sítio doador36,35; - fornecimento limitado do osso do doador; - enxertação com sítios heterotópicos; - alta absorção durante a cicatrização e a incorporação; - métodos de estocagem temporária do enxerto podem ser

Prejudiciais14 e - incapacidade para substituir uma superfície articular36,6,30.

O mesmo não ocorre com o alógeno que usa o osso de cadáver de pessoas mortas por ferimentos ou infarto do miocárdio (pessoas que sofreram doença infectiva como hepatite e AIDS não são utilizadas)25. Em enxertos alógenos, o tamanho do osso, a configuração do esqueleto e o sexo devem ser observados: quando doadores adequados são encontrados,eles são cuidadosamente avaliados25. Entretanto, ao contrário dos enxertos autógenos frescos, são bem aceitos pelo organismo, sendo rapidamente revascularizados, induzindo completa cicatrização do defeito, Verburg e Adams observaram que os aloenxertos congelados e frescos são largamente reabsorvidos e produzem forte resposta antigênica em dois de cinco casos estudados37. Evidência radiográfica mostra imunogenicidade devida à reabsorção do enxerto ou à não-união entre tecido hóspede-tecido hospedeiro38 (cerca de 12% dos casos analisados por Volpon, apresentaram rejeição39). Há também o risco de transmissão de doenças infectivas não detectadas. Além disso o cadaver deve ser maior que 15 e menor que 45 anos40. Os cientistas têm trabalhado para facilitar a regeneração dos tecidos e órgãos de pacientes afetados, tornando possível o retorno às funções biomecânica e fisiológica. Em alguns pacientes, a total restauração das funções com tecidos normais tem sido um objetivo

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alcançado41; o problema torna-se complicado quando a quantidade de osso autógeno é insuficiente, de tal modo que há necessidade de usar osso de fonte estranha ao próprio indivíduo, como, por exemplo, enxerto alógeno. Mas, quando há grande perda de tecido ósseo pode haver necessidade de se lançar mão de implantes (material sintético21) ósseos para estimular a osteogênese42,3, sendo criados “homens biônicos”, quando próteses são biologicamente ligadas para restaurar a função41. Dessa forma, esses problemas tem estimulado experimentos para enxertos biológicos. Entretanto, enquanto nenhum biomaterial projetado pelo homem pode reproduzir o ambiente vivo, celular e extracelular do osso, uma aproximação racional para a regeneração óssea é a criação de compostos osteogênicos com materiais porosos para promover o crescimento da matriz óssea35. I- 3.2 Implantes sintéticos Embora indispensável para a sobrevivência, os mecanismos de defesa natural do corpo têm sido a dificuldade do cirurgião que utiliza prótese ou implantes41. Rigorosos estudos científicos identificaram que certos biomateriais apresentam reações limitadas pelos mecanismos de defesa do organismo. Estas reações vão desde a não-reatividade até a reatividade. Para evitar possíveis conseqüências, alguns cientistas têm proposto usar implantes ou enxertos com características químicas semelhantes às existentes no organismo43. Estudo com a hidroxiapatita, que não possui os componentes celular e indutivo de um enxerto autógeno, mostrou não ser essa característica um impedimento significante para sua incorporação10. I-4 HIDROXIAPATITA COMO CONSTITUINTE DO OSSO O osso é composto de uma matriz orgânica rígida, grandemente fortalecida por depósitos de sais de cálcio. O osso compacto médio contém, em peso, cerca de 30% de matriz e 70% de sais. Dos sais ósseos de fosfato de cálcio, os principais são denominados

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hidroxiapatita. Nestes, a proporção relativa de cálcio para fósforo (Ca/P) pode variar conforme as diferentes condições nutricionais, no que concerne ao peso, entre 1,3 e 2,044. A hidroxiapatita, Ca10 (PO4)6 (OH)2 , sendo o principal constituinte da fase mineral dos ossos e dos dentes, tem sido sintetizada e extremamente utilizada para preencher defeitos ósseos10. I- 4.1 A hidroxiapatita (HA) como implante A partir das últimas décadas, pesquisas têm sido direcionadas ao desenvolvimento e obtenção de biomateriais, visando a reparação de tecidos duros. Combinar os requisitos biomecânicos para um implante com os ambientes bioquímico e celular circundantes, tem sido um desafio formidável. Progressos significantes ocorreram no início da década de 70, quando os cientistas reconheceram a importância da porosidade45. Entre os biomateriais sintetizados, o principal tem sido a HA, uma vez que sua composição química é semelhante à do osso e à do dente46,2. Quando a HA é colocada próxima ao osso, inicialmente ela atua como uma prótese e, posteriormente, atuará como um suporte para a regeneração dos tecidos. HA obtidas por diferentes métodos têm sido avaliadas em animais e humanos31,27,47. Em todos os casos documentados, esse material tem demonstrado alto grau de biocompatibilidade com o tecido duro e mole, apontando ser um importante substituto para o enxerto ósseo46. A HA permite que os tecidos cresçam dentro de sua estrutura, devido à interconexão dos poros41, reduzindo a encapsulação, aumentando a velocidade de crescimento do tecido ósseo o que, reduz o período de recuperação. Favorece também o suporte nutricional do tecido dentro de seus poros, uma continuidade com o osso em volta48,10,41, já que os poros incentivam o crescimento celular, o crescimento fibrovascular, a formação de osteóide e o crescimento do osso mineralizado10. O pré-requisito para o crescimento ósseo é que o implante seja colocado próximo ao osso viável. A avaliação histológica sugere que o contato íntimo entre o osso e o implante produz e acelera o crescimento ósseo (características osteoindutiva e osteocondutiva,

20

respectivamente)49,50,41 e o osso desenvolvido dentro do implante apresenta aspecto normal em todos os sentidos16. Como já dito, apesar de o implante não contribuir com células vivas ou influenciar a osteoindução (estimular o osso a se formar onde ele estiver), ele dá suporte para a osteocondução (acelera a formação do tecido ósseo novo, uma vez que o osso necessita de suporte para o crescer)49,41. Ligações ósseas persistentes ocorrem com a HÁ por mecanismos ainda não elucidados. Através da microscopia eletrônica, foi evidenciada uma camada interfacial de material mineralizado, amorfo, que parece funcionar como uma estrutura de ligação muito eficiente. A natureza desse material não está ainda esclarecida, e é objeto de especulações futuras. Jarcho42 sugere que trata-se de “substância natural similar ao cimento ósseo”. Esta é uma explicação plausível, pois após sua inserção o implante torna-se rodeado por uma variedade de compostos fluidos de, fibroblastos, células livres com características semelhantes aos tecidos encontrados nos processos de cicatrização natural. No estado infectado estes componentes são digeridos pela atividade dos macrofágos. Esta hipótese sugere que a camada intermediária seja formada por mineralização dos componentes remanescentes envolvidos no processo de cicatrização, precedendo a deposição óssea e formando uma camada contínua entre o implante e o osso recém formado. Qualquer que seja a natureza exata da substância amorfa, o resultado prático mais importante é que ele liga a HA direta e fortemente ao osso alveolar33. Na odontologia, o implante de HA também é muito utilizado. A restauração de uma área mutilada é para o protodontista problema difícil. O sulco é normalmente deprimido e afundado nas direções lingual e apical, algumas vezes até três a cinco milímetros abaixo do nível alveolar adjacente. Quando isto ocorre no quadrante anterior, criam-se problemas estéticos. Optando-se pelo uso de gengivas artificiais (porcelana rosa) ou outras modificações no contorno, a aparência da prótese final é, em muitos casos, desastrosa. Áreas deprimidas dos sulcos no quadrante posterior, geram problemas estéticos e de higiene46,48,19. Em tais situações, os cirurgiões dentistas usam a HÁ como implante.

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CAPÍTULO II

TÉCNICAS EXPERIMENTALES

II- 1 TÉCNICAS EXPERIMENTALES Tabela 1: Técnicas experimentais utilizadas

Técnicas utilizadas Finalidade Referência Difração de Raios-X Determinação de fases 51

Espectrofotometria de Energia dispersiva

Determinação da raz 52

Microscopia de luz Visualização da resposta celular à interção HAP-91-osso

4,53

Microscopia eletrônica de varredura

Identificação de estruturas cristalográficas da HAP-91

53

Microscopia eletrônica de Transmissão

Visualização da resposta celular à interção HAP-91-osso

53

Microscopia eletrônica de retrodispersão

Visualização integração HAP-91-osso

54,55,52,9

Espectroscopia de Absorção atômica

Determinação das impurezas elementares

11,56,57,58

Infra Vermelho IR Confirmação da estrutura da HAP-91

51,59,11

Absorção de Nitrogênio Determinação da porosidade e da área superficial

60

Reações Titrimetricas Análise umida de cálcio e fosfato

51,61,11

Testes biológicos Verificação da existencia ou não de toxicidade e

irritabilidade na HAP-91

62,63,64,20

22

CAPÍTULO III

SINTESE, CARACTERIZAÇÃO DA HAP-91E

DISCUÇÃO DOS RESULTADOS III- 1 SINTESE DE HAP-9165,66,67,68,8

III- 1.1 Preparação da materia-prima: O constituinte mais importante da calcita é o carbonato de cálcio. Geralmente este mineral contém como impurezas o óxido de silício e silicatos de cálcio, magnésio e ferro69. O óxido de cálcio é obtido a partir da calcinação da calcita, à temperatura de aproximadamente 1100C11 e é posteriormente hidratado para a obtenção do hidróxido de cálcio (Eqs. 1 e 2). 1100

CaCO3

CaO

(sol) + CO

2 (g) (1)

CaO + H

2O Ca(OH)

2 (2)

III- 1.2 Síntese da HAP-91

A precipitação da HAP-91 foi realizada adicionando-se o ácido, H

3PO

4, sobre a base, Ca(OH)

2.

Após a filtração do precipitado, este foi seco por passagem de ar e, posteriormente, aquecido a 900C por 1 hora. 3 H

3PO

4 + 5Ca(OH)2 Ca5(PO4)3OH + 9H2O

23

III‐2CARACTERIZAÇÃODAMATÉRIAPRIMAEDA

HAP‐91O hidróxido de cálcio [Ca(OH)

2], obtido da calcita (CaCO

3), foi

analisado para a determinação dos teores de MgO, SiO2, Fe

2O

3 ,

Al2O

3 e metais pesados, utilizando-se a técnica de

Espectrofotometria de Absorção Atômica (Tab. 2). O cálcio e o fosfato constituintes da HAP-91 foram determinados por Volumetria51,61,11, a estrutura da HAP-91 pelas técnicas de Raios X e IV e suas impurezas por Raios X e Absorção Atômica (Tab. 3). Tabela 2: Análise da Calcita COMPOSTOS ABSORÇÃO ATÔMICA (%) MgO 0,22 SiO2 0,06 Fe2O3 0,11 Al2O3 0,08 M. pesados (Pb) 0,03 Ca(OH)2 99,5 Tabela 3: Análise química da HAP-91® Métodos utilizados Componentes (%)

Ca2+ PO4 Al2O3 Fe2O3 MgO SiO2 Na2O

Espectroscopia de absorção atômica 0,021 0,032 0,56 0,005 0,15 Volumetría de KMnO4 39,24 Volumetría de ácido-base 56,39 Rendimento da reação = 96,4%

24

As análises por Infra-vermelho, Difração de Raios X e Espectrometria de energia dispersiva da HAP-91 atestaram as características conhecidas das hidroxiapatitas A comparação entre os espectros na Região do IV da HAP-91® ( Figura 1) e o espectro disponível na literatura para a hidroxiapatita ( Figura 2), confirma que o material sintetizado é uma hidroxiapatita. Tabela 4: Principais absorções na região do IV da HAP-91® Referente ʎ-1 ʎ-1 ʎ-1 ʎ-1 ʎ-1 ʎ-1 ʎ-1 cm- cm- cm- cm- cm- cm- cm- H2O 3700 – 3000 1615 HPO4

2- 865 550 OH- 630 PO4

3- 600 471

25

Figura 1 Espectro de IV da HAP-91®

Figura 2 Espectro de IV da Hidroxiapatita retirado da Literatura

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MICROSCOPIA ELETRÔNICA A fotografía da HAP-91® (Figura 3) com aumento de 3500 vezes feita pela Espectroscopia de Energia dispersiva ( EDS) mostra as principais características cristalográficas das apatitas, ou seja, forma hexagonal, cristais prismáticos longos, curtos ou tabulares em águlhas. Figura 3 HAP-91 vista através de microscopia eletrônica de barredura- aumento 3500

DETERMINAÇÃO DA POROSIDADE DA HAP-91 O diamentro dos poros da HAP-91 foi determinado no aparelho Quantachrome Autosorb ( EEUFMG),e o valor encontrado foi de 110,6 A0, enquanto que a área superficial especifica de múltiplos pontos foi de 20,57m2/g

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III-3 TESTS BIOLÓGICOS Após a obtenção da hidroxiapatita a partir do calcário, é necessário confirmar se ela poderá ser utilizada em seres vivos como reconstituinte ósseo. Para tal, inicialmente foram feitos testes de toxicidade (Tabs. 5 e 6) e de irritação (Tabs. 7 e 8)63. Tabela 5: Teste de toxicidade excessiva em camundongos Extrato Efeitos anormais ou morte

5 min 24 h. 48 h72 h. Teste HAP-91®em 0,0 0,0 0,0 0,0

solução salina Controle NaCl (0,9%) 0,0 0,0 0,0 0,0 Todos os camundongos permaneceram normais e saudáveis durante e após o teste. Tabela 6: Teste de citotoxicidade“in vitro” Amostras n0 1 n0 2 n0 3 n0 4

IZ IL IR IZ IL IR IZ IL IR IZ IL IR HAP-91® 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 HAP-91® 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 HAP-91® 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Controle Negativo 0 0 0/0 0 0 0/0 0 0 0/0 0 0 0/0 Controle positivo 5 3 5/3 5 3 5/3 5 3 5/3 5 3 5/3 Controle negativo: porcelana Controle positivo: látex tóxico I.Z. (índice de zona): 0 = nenhuma zona ao redor e sob a amostra, 1 = zona limitada sob a amostra,

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2 = zona não maior que 0,2 cm, 3 = zona maior que 0,2 cm, 4 = zona entre 1-2 cm, 5 = zona maior que 2 cm. I.L. (índice de lise): 0 = nenhuma lise, 1 = menos de 20% de lise, 2 = entre 20-40% de lise, 3 = entre 40-60% de lise, 4 = entre 60-80% de lise, 5 = mais de 80% de lise. I.R. (índice de resposta): IZ / IL. As amostras não apresentaram efeito tóxico para as linhagens RC-IAL (linhagem de células fibroblásticas de rim de coelho isoladas no Instituto Adolfo Lutz) e Hela (linhagem de células epiteliais de carcinoma de colo de útero humano – ATCC – USA). Tabela 7 : Teste das reações oculares à sustância teste em coelho Extracto 24h. 48h. 72h.

O.I. O.D. O.I. O.D. O.I. O.D.

Teste HAP 91®

Em solução salina 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Controle NaCl(0,9%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 A comparação do olho após 24, 48 e 72 horas da instilação da solução de HAP-91 (3,5 mg/mL) , com o olho controle, mostrou ausência de irritação primária causada pela HAP-91.

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Tabela 8: Avaliação das reações subcutáneas em coelhos A comparação das áreas onde foi injetada a solução de HAP-91 (3,5 mg/mL) com as áreas injetadas com a solução salina, após 24, 48 e 72 horas, mostrou ausência de irritação subcutânea.

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Tempo

Puntuação

1h 0,00 24h 0,00 48h 0,00 72h 0,00

30

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CAPÍTULO IV

APLICAÇÕES DA HAP-91®

IV- 1 PRIMEIRO EXPERIMENTO Devido à alta incidência de fraturas com grande perda de tecido ósseo como conseqüência de acidentes, torna-se necessária a busca de técnicas alternativas de enxertia que acelerem a reparação óssea, visando a regeneração funcional do osso afetado. Com o objetivo de avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética ( HAP-91), como substituto ósseo na reparação de defeitos ósseos, foram utilizados quatorze cães adultos, clinicamente sadios, sem raça definida, pesando em média 12,5 Kg. Um fragmento ósseo retangular, em torno de 1,0 x 0,6 centímetros, foi retirado da metáfise proximal de cada uma das tíbias. No membro posterior direito, o defeito foi imediatamente preenchido pela HAP-91, enquanto que no membro posterior esquerdo, o defeito semelhante foi utilizado como controle. Avaliações clínica, cirúrgica e radiográfica foram feitas nos dias 8, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 pós-operatórios. Nos mesmos períodos dois animais foram sacrificados e submetidos a exame pós-morte, colhendo-se fragmentos de cerca de 3,0 centímetros, por seção transversal das áreas trabalhadas cirurgicamente, para avaliações histopatológicas por microscopia de luz, microscopia eletrônica de retrodispersão e de transmissão6.

ACOMPANHAMENTO CLÍNICO

Nesse estudo, fez-se acompanhamento clínico dos animais, após a cirurgia de implantação, como descrito em IV-1. Observou-se que todos os animais toleraram bem a cirurgia, não apresentaram sinais de infecção local ou indícios de reação de incompatibilidade com a HAP-91Assim comprovou-se, mais uma vez, ser a hidroxiapatita um produto biocompatível, como nos trabalhos citados por Arakaki et al, Cook et al, Jarcho, Najjar et al, Nelson et

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al, Piecuch et al. Provalvelmente, a similaridade química entre a hidroxiapatita e o tecido ósseoexplique tais resultados, já que a fase inorganica do osso, que representa cerca de 70% do tecido ósseo, é constituida principalmente por hidroxiapatita. A recuperação funcional dos animais operados foi satisfatória, sem diferenças entre os membros operados. Exames radiográficos seqüenciais não evidenciaram, em nenhum caso, uma linha radiotransparente característica de tecido fibroso entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, como relatado por Geesink22. Este fato sugere que a união HAP-91-osso se fez através de crescimento ósseo direto, sem interposição de tecido fibroso. Além disso, não foi observada nenhuma migração da HAP-91. Os exames radiográficos diferenciaram as áreas de tecido ósseo, de defeito ósseo e da HAP-91 pela diferença em radiopacidade. As regiões implantadas apresentam uma radiopacidade maior que as regiões de tecido ósseo, comparadas às regiões do defeito ósseo, a radiopacidade era menor. Aos 60 dias,observou-se a regeneração óssea no membro posterior direito de todos os animais, caracterizada pela semelhança de radiopacidade entre defeito e osso, observação repetida aos 90 e 120 dias. No membro posterior esquerdo, essa semelhança foi observada aos 90 dias, tendo se repetido aos 120 dias. Com base nesses resultados acredita-se que a implantação da HAP-91foi importante no processo de regeneração óssea. Após o sacrifício dos animais acompanhou-se a evolução da atuação da HAP-91 implantada em suas tíbias foi avaliada pelo uso de diferentes técnicas de análise

Exames anatomopatológicos permitiram a identificação do defeito ósseo nos animais sacrificados até 30 dias de pós-operatório; nos outros animais, houve dificuldade na identificação da região operada, devido à evolução da regeneração óssea. Além disso, observou-se uma cicatrização mais rápida que nos membros implantados do que nos não implantados, comparando-se mesmo período de pós-operatório (Fig. 1).

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A capacidade do implante de hidroxiapatita, ser rodeado por tecido fibrovascular foi confirmada neste experimento, através dos resultados histopatológicos (microscopia de luz ) de amostras processadas aos oito dias da intervenção cirúrgica, (Fig. 2 e 2’). Após 15 dias do pós-operatório, à microscopia de luz constatou-se a presença de osteoclastos e de grande quantidade de osteoblastos ativos, revelando uma neoformação óssea.

Figura 1: Vista macroscocópica da região operada das tíbias de cães ( setas). A – 8 dias após a cirurgia, B – 15 dias após a cirurgia, C – 30 dias após a cirurgia, D – 120 dias após a cirurgia.

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Figura 2: Falha óssea, com implante de HAP-91® , de um animal sacrificado 8 dias após a cirurgia (microscópio de luz, aumento de 100x). Setas: HAP-91® em tecido ósseo.

Figura 2’: Falha óssea, com implante de HAP-91de um animal sacrificado 8 dias após a cirurgia (microscópio de luz com aumento de 400 x). Seta: HAP-91 em tecido ósseo.

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Observou-se, também, que não houve uma união fibrosa entre a HAP-91 e o tecido ósseo, descrita por vários autores ao estudarem a hidroxiapatita, e, sim, uma neoformação óssea. A Figura 3 confirma a característica osteocondutora da HAP-91,que funciona como um suporte para a invasão celular. As outras preparações revelaram, de início, uma neoformação óssea mais intensa nos membros tratados com a HAP-91; e mostraram diminuição desta intensidade durante a evolução do experimento. As imagens analisadas por microscopia eletrônica de transmissão permitiram identificar a HAP-91 e o tecido ósseo, através dos distintos graus de eletrodensidade, como também descrito por Holmes et al.32, Jasty et al.39, Moy et al.59, Skedros et al.77. As imagens aos 8, 30 e 90 dias de pós-operatório (Figuras 4, 5, e 6 respectivamente), mostraram célula fagocitária contendo, no citoplasma, material eletrodenso fagocitado (HAP-91).

Figura 3: Falha óssea, com implante de HAP-91, de um animal sacrificado 15 dias após a cirurgia (microscópio de luz, aumento de 250x). Setas: A – tecido ósseo neoformado penetrando nos poros da HAP-91®, B – HAP-91®.

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Figura 4: Microscopia eletrônica de transmissão, de material animal sacrificado 8 dias após a cirurgia. Setas: A– HAP-91, B – osteoclasto.

Figura 5: Microscopia eletrônica de transmissão, de um animal sacrificado após 30 dias de pós-operatório. Setas:A – HAP-91 englobada por osteoclasto, B – osteoclasto, C – HAP-91 fora do osteoclasto.

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Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão - 90 dias de operado. Setas: A - HAP-91 dentro dos osteoclastos, B - osteoclastos, C - HAP-91 no meio externo. Estudos utilizando microscopia eletrônica de retrodispersão revelaram a evolução da HAP-91 com o tecido ósseo. A análise das imagens baseou-se no estudo comparativo das gradações de cinza para identificar tecido, defeito ósseo, e implante de hidroxiapatita. O tecido ósseo apresentou uma coloração cinza, o defeito, cor preta e a HAP-91, branca. As imagens obtidas do defeito ósseo com 8 dias (Figuras 7 e 7’) revelaram, no membro posterior direito, áreas brancas (HAP-91) e pretas (defeito ósseo e tecido conjuntivo). No membro posterior esquerdo, o defeito ósseo e o tecido conjuntivo foram expressos pela área de cor preta.

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As Figuras de 7 a 9’ mostraram a evolução da HAP-91 nos animais aos 8, 15, e 90 dias, respectivamente, após a intervenção cirúrgica. A aplicação da HAP-91 é vantajosa como se vê, o que pode ser percebido pela diferença de espessura entre a cortical regenerada do membro posterior direito e a do esquerdo, nas preparações de 90 dias (Figuras 9 e 9´). Este quadro se repetiu aos 120 dias. Enquanto o membro posterior direito apresentou uma espessura de cortical neoformada semelhante à do osso normal, o membro esquerdo revelou uma espessura de neoformação menor que a do osso normal. Este resultado sugeriu que a cortical nova do defeito ósseo, onde se implantou a HAP-91, era mecanicamente mais forte e, conseqüentemente, apresenta uma maior capacidade de suporte de peso. Estes resultados confirmaram a importância da característica osteocondutiva da HAP-91 no processo de regeneração óssea. Observou-se ainda diminuição da quantidade da HAP-91 com a evolução do experimento. Portanto, apesar de alguns autores mencionarem a ausência de biodegradação da hidroxiapatita (Cook et al.14, El Deeb19, Holmes32, Hoogendoorn et al.33, Klein et al.47,), este experimento comprova, mais uma vez, a atividade osteoclástica, tanto sobre o osso como sobre a HAP-91, desde as preparações de 15 dias de pós-operatório. Tal resultado sugere a biodegradação da mesma, caracterizando, assim, o produto como semelhante àqueles citados por, Martin et al.55 e Winter et al.91. A Figura 12 nos mostra, na tíbia direita, o local implantado de um animal sacrificado aos 90 dias do pós-operatório, onde observou-se, na superfície da cortical óssea, a presença de lacunas reabsortivas escuras, facilmente identificadas através do forte contraste com a superfície óssea mineral clara (Sasaki et al.75). Este resultado caracteriza uma lacuna de Howship, devida a um ataque osteoclástico, necessário e normal na formação óssea (Goret-Nicaise27 e Manzares54). O processo de biodegradação pode ser confirmado, ainda, pela comparação com material existente fora do local de implante (durante a cirurgia é comum ocorrer deposição acidental de pó do material de implante da HAP-91 no tecido conjuntivo subcutâneo). As imagens obtidas revelaram uma densidade distinta entre a HAP-

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91 no tecido conjuntivo e no defeito ósseo (Figs. 10 e 11). A HAP-91 mostrou-se mais densa quando fora do defeito ósseo, provavelmente pela ausência de atividade osteoblástica. Esta diferença entre as densidades pode ser atribuída, ainda, à troca de íons cálcio e fósforo na superfície do defeito ósseo ( Kitsugi et al.46), devido à sua solubilização ou dissolução (Sasaki et al.75),processo este mediado pela atividade osteoclástica. Estas imagens também nos mostram que a HAP-91 não apresenta características de osteoindução, uma vez que não foi observada neoformação óssea no tecido subcutâneo. Através de análises visuais das diferentes microscopias, pode-se avaliar, a eficiência e a grande integração da HAP-91 no organismo. Entretanto,visando-se obter uma confirmação mais rigorosa, fez-se uma avaliação estatística desta evolução, utilizando o processo de Quantificação Microestrutural, usando técnica de processamento digital (programa Quantikov desenvolvido por Pinto70). Para esta análise foram utilizadas as imagens de ambas as tíbias, com 15, 45, 90 e 120 dias. Para cada uma das imagens, selecionou-se uma área mais ou menos constante da região, onde o enxerto estivesse próximo ao osso. Na Tabela 1 foram colocados os diferentes períodos de sacrifício dos animais, a área total do corte e a área escura. Nos membros implantados a área total inclui o tecido ósseo, o defeito ósseo, o tecido mole e a HAP-91. Nos membros não implantados a área total inclui apenas o tecido ósseo, o defeito ósseo e o tecido mole. A área escura de ambos os membros corresponde ao defeito ósseo e ao tecido mole. Calculou-se a área do corte selecionado e, em função desta, determinou-se a área escura e seu percentual relativo. O programa também permitiu o cálculo da variação dos diâmetros correspondentes às áreas escuras.

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Figura 7: Tíbia direita do animal (com HAP-91) sacrificado aos 8 dias após a cirurgia. Setas: A -HAP-91, B - defeito ósseo

Figura 7’: Tíbia direita do animal (sem HAP-91) sacrificado aos 8 dias após a cirurgia. Setas: A - Tecido ósseo, B - defeito ósseo,

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Figura 8: Tíbia direita do animal (com HAP-91®) sacrificado aos 15 dias da cirurgia. Setas: A - HAP-91® (branca), B - tecido ósseo (cinza), C - defeito ósseo (preta).

Figura 8’: Tíbia esquerda do animal (sem HAP-91®), aos 15 dias da cirurgia. Setas: A - defeito ósseo (cor preta), B - tecido ósseo (cinza).

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Figura 9: Tíbia direita do animal (com HAP-91) sacrificado aos 90 dias da cirurgia. Setas: A - HAP-91, B (linha tracejada)- cortical neoformada mais espessa do que no animal da Figura 9’, C - tecido ósseo.

Figura 9’: Tíbia esquerda do animal (sem HAP-91), aos 90 dias da cirurgia. Setas: A – cortical neoformada, B – tecido ósseo.

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Figura 10: Grão de HAP-91® em tecido subcutâneo. Setas: HAP-91®. Ela se mostra mais densa do que quando está em tecido ósseo (Fig. 11), porque não sofre absorção.

Figura 11: grão de HAP-91® em tecido ósseo. Setas: HAP-91®.

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Figura 12: Tíbia esquerda (com -HAP-91®) de um animal sacrificado aos 90 dias da cirurgia. Setas: A – HAP-91®, B – tecido ósseo. Comparando-se a diferença da porcentagem da área escura do membro não implantado, com 15 e 45 dias (41,42%), com a mesma diferença do membro implantado (31%), pode-se ver claramente o efeito inibitório inicial do crescimento do tecido ósseo neoformado, relatado por alguns autores. Esta mesma comparação com a diferença entre 45 e 90 (16,33% no membro não implantado e 29,44% no membro implantado), nos mostra um crescimento maior no membro onde havia o implante, revelando que a HAP-91

apresenta características de osteocondução. A diferença, quando se compara 90 dias com 120 dias (14,14% no membro não implantado e 1,34% no membro implantado), considerando-se o baixo valor obtido no membro implantado, que com 90 dias o tecido ósseo já havia crescido seu máximo, enquanto que o membro não implantado necessitou de 120 dias para que houvesse o mesmo crescimento,

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evidenciando, mais uma vez, a característica osteocondutora da HAP-91. Tabela1 : Análise estatística Quantikov

15d 15e 45d 45e 90d 90e 120d 120e Área total (mm2) 4,120 3,410 2,667 6,310 Área escura (mm2) 4,50 5,70 1,940 1,680 0,599 1,089 0,102 0,475 % de área escura 78,08 89,76 47,09 48,29 17,56 31,94 16,16 17,81 Estes resultados confirmam, mais uma vez, que a velocidade da reconstituição óssea é maior no membro que contém a HAP-91.

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1V- 2 CASUÍSTICAS DA PROF DRA. CLEUZA DE FARIA REZENDE

1V- 2A CÃO As radiografias apresentadas nas Figuras 16 e 17 mostram o enxerto alógeno e o implante de HAP-91 realizado em um cão nascido sem o osso rádio. Pelas figuras, pode-se observar a localização da HAP-91, logo após e 60 dias após a cirurgia. Ao comparar as Figuras 4 e 5, observa-se uma diminuição da densidade na área implantada indicando uma redução na quantidade de HAP-91.

Figura 1: Radiografia tirada após a cirurgia. As setas mostram a HAP-91®implantada no osso alógeno..

Figura 2: Radiografia tirada aos 30 dias de pós-operatório. As setas indicam os locais onde foi colocada a HAP-91®

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Figura 3: Radiografia tirada após 9 mêses da cirurgia..

Figura 4: Radiografia tirada após 11 mêses da cirurgia.

Figura 5: Radiografia tirada após 15 mêses da cirurgia..

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V- 2B CÃO Cadela poodle de 10 mêses apresentou-se, no Hospital Vetrinário da Escola de Veterinária da UFMG, com dor e mancando. Feito o Raio-X da região verificou-se fratura do terço distal do femur ocorrida a 75 dias e perda óssea no fragmento distal. A redução da fratura foi feita com enxerto cortical halógeno associado a enxerto esponjoso e HAP-91halogenofixados com pinos ( Fig. 1) O Raio-X tirado 30 dias após a cirurgia ( Fig.2) nota-se a consolidação se processando.

Figura 1

Figura 2

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V- 2C CÃO Cão poodle de três anos, apresentou-se no Hospital Vetrinário da Escola de Veterinária da UFMG, com dor e mancando. Exame local indicou uma possível fratura e infecção. O Raio-X revelou uma fratura antiga, com perda parcial do rádio e infecção ( Fig.1).Neste caso utilizou-se como enxerto somente a HAP-91 A Figura 2 mostra consolidação se processando.

Figura 1

Figura 2

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V- 2D Cabra com fratura exposta Cabra com idade aproximada de 1 ano apresentando fratura exposta antiga e infectada. Após a limpeza e pré-operatório adequado, foi reduzida a fratura e associado com HAP-91

Procedeu-se a fixação com pinos percutâneos ( Fig 1), mantendo-se o curativo da ferida até a cicatrização por segunda intenção. Trinta dias pós-operatório notou-se a consolidação se processando ( Fig.2).

Figura 1

Figura 2

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V- 2E CÃO Com fratura bilateral de mandibula em consequência de doença periodontal

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CAPÍTULO V

TRABALHOS PUBLICADOS EM REVISTA E/OU APRESENTADOS EM CONGRESSOS

V. 1: AVALIAÇÃO COMPARATIVA EM VIVO DO COMPOSITO HIDROXIAPATITA-

POLIHIDROXIBUTIRATO PARA SUBSTITUIÇÃO ÓSSEA

The Journal of Craniofacial Surgery & Volume 20, Number 3, May 2009 Emily Correna Carlo DVM MSc1,Andréa Pacheco Batista Borges DVM PhD1,Ricardo Junqueira Del Carlo DVM PhD1,Mastoby Miguel Martinez Martinez DVM MSc2,Paulo Miranda Oliveira Industrial Designer MSc3Gláucia Oliveira Morato DVM1,Renato Barros Eleotério DVM1,Múcio Silva Reis Júnior BDS1 Resumo Neste estudo em coelhos foram comparadas entre si três composições de hidroxiapatita (HA) e polihidroxibutirato (PHB) a fim de avaliar-lhes a biocompatibilidade, a osteointegração e a osteocondutividade em defeitos ósseos. As proporções HA:PHB adotadas foram 10:90, compósito 1; 25:75, compósito 2; 50:50, compósito 3; e defeito sem preenchimento constituiu o grupo controle. Os membros afetados foram avaliados clinica e radiograficamente, sendo as amostras coletadas 8, 45 e 90 dias depois da cirurgia para as análises histológicas e histomorfométricas. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os quatros grupos nos 1 Departamento de Veterinária, Univesidade Federal de Viçosa, Brasil. 2 Facultad de Medicina Veterinaria e Zooetecnia, Universidade de Cordoba, Colômbia. 3 Departamento de Design, Universidade Estadual de Minas Gerais, Brasil.

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parâmetros clínicos de dor, claudicação, deiscência, infecção e edema. Também não se detectaram sinais de osteólise e de reação periosteal. Histologicamente, a regeneração óssea nos grupos 1, 2 e 3 ocorreu de forma similar à do controle. Infiltrado inflamatório não foi observado nas datas de observação. Tecidos ósseo e conjuntivo foram constatados dentro de poros nos compósitos 2 e 3. Em todas as datas de observação, significativamente mais tecido ósseo do que conjuntivo foi observado nos defeitos, sendo similar a percentagem de tecido ósseo na interface. Osteoclastos estavam presentes na interface osso-compósito aos 45 e 90 dias, quando também se encontraram células gigantes multinucleadas no tecido mesenquimal. Não houve diferença significativa, nos quatro grupos quanto ao número de osteoclastos. Assim, os compósitos podem ser considerados biocompatíveis e capazes de integração óssea; apresentaram sinais de biodegradabilidade; os compostos 2 e 3 mostraram-se osteocondutivos; e, destes, o primeiro exibiu as melhores características para a substituição óssea. Palavras-chave: compósitos; substitutos ósseos; implantes biodegradáveis. Introdução Duas ocorrências comuns em ortopedia e nos traumas craniofaciais são a perda óssea e as dificuladades na consolidação da fratura, decorrentes respectivamente de fraturas cominutivas e não-uniões atróficas. Na substituição óssea, o enxerto autógeno tem sido o padrão de referência em razão de suas propriedades osteogênicas, osteocondutivas e osteoindutivas; contudo, ainda apresenta desvantagens tais como suprimento limitado, morbidade do sítio doador e o longo tempo de cirurgia 1,2,3,4. Além disso, a utilização de implantes reabsorvíveis na estabilização de fraturas é consenso entre os cirurgiões, sabido que o uso de implantes metálicos ainda preocupa pela possível liberação de íons potencialmente citotóxicos, carcinogênicos ou sensibilizantes, e o alto módulo de elasticidade

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resultando em menor transferência de cargas para o osso adjacente e então, reabsorção óssea 3-5. Polímeros de polilactida (PLA), ácido poliglicólico (PGA) e de poli(L-láctico-co-glicólico) estão entre os mais estudados na engenharia de tecido ósseo e estabilização de fraturas. Embora tenham propiciado bons resultados, foram relatadas respostas inflamatórias relacionadas com a reabsorção rápida e o acúmulo de ácidos oriundos de produtos de degradação. Disso resultam reabsorção óssea, aumento dos riscos de infecção e cicatrização lenta6,7. Na procura de um polímero biocompatível, cujo processo degradação capaz de prevenir essa resposta inflamatória, chegou-se ao poli-hidroxibutirato (PHB), um polímero biodegradável, de ocorrência natural e com boas propriedades mecânicas8,14. Conforme um dos pré-requisitos para uso ortopédico, o de ser material biodegradável, o PHB sofre lenta biodegradação por vias metabólicas quando em ambiente biológico, e não é prontamente hidrolisado em presença de água. Além disso, mantém as suas propriedades mecânicas ao ser biodegradado e desse modo, compartilha de forma gradual com o osso as forças provenientes da carga e do movimento12-14. Cerâmicas como a hidroxiapatita (HA) e o biovidro foram estudadas como possíveis componentes de reforço da matriz de PHB a fim de se dispor de um compósito reunindo as propriedades mecânicas apropriadas à osteocondutividade e bioatividade das cerâmicas 4,10-12,15,16. Foi demonstrado que o compósito PHB-HA se funde diretamente com o osso em formação e embora este varie em suas propriedades mecânicas, tendo-se em vista o local de onde provém, estas foram consideradas semelhantes às de ossos humanos frescos. Trata-se, portanto, de material promissor para substituir o osso em locais sob tensão de carga, o que ainda não se pode dizer para outros polímeros tais como PLA e PGLA3,4,6,12,15,16. O PHB-HA tem sido objeto de estudos diversos recentemente porque pequenas variações em aspectos tais como topografia das superfícies, porosidade, conteúdo granular de HA e a distribuição destes grânulos na superfície podem influenciar a resposta do receptor 15,16 .

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Pesquisa recente conduziu a novo compósito HA-PHB, em que o polímero é derivado da fermentação da glicose oriunda de cana-de-açúcar3,17. Agrega a vantagem do baixo custo da cultura da cana, ou seja, é menor o custo para se obter PHB desta fonte do que do açúcar de beterraba. A fim de determinar-lhes as características in vivo de biocompatibilidade, integração e condutividade ósseas, no presente estudo foram comparadas três formulações do PHB proveniente da cana e reforçado com HA sintética. Este estudo apresenta resultados iniciais relacionados com aspectos biológicos das formulações, que servirão de base para pesquisa posterior abordando o propósito final, o da fabricação de próteses de cirurgia reconstrutiva por prototipagem destinado à substituição do tecido ósseo em defeitos críticos em locais sob cargas mecânicas. Material e Métodos Compósitos O PHB granular (BiocycleTM), 250.000 g/mol de massa molecular, foi fornecido pela pesquisadora Maria F. V. de Moraes, da Universidade Federal de Minas Gerais e a hidroxiapatita sintética, em pó, HAP-91TM, pela dra. Sheyla Maria C. M. Bicalho (Laboratório Químico JHS). O método de produção dos compósitos consistiu, em resumo, de três subciclos, sob compressão de 14 toneladas, das misturas secas e homogeneizadas, em matriz retangular de aço SAE 1020, seguidos de três ciclos de moldagem, sob 9 toneladas e a 1800C, na mesma matriz. Foram estudadas três proporções entre os biomateriais: a primeira consistiu de 10%(v/v) de HA e 90% de PHB; a segunda, 25% HA e 75% PHB; e a terceira, 50% de cada. Animais e Cirurgia O experimento recebeu aprovação prévia do Comitê de Ética do DVT/ UFV (Prot. 37/2007), obedecendo o Código Professional de Ética de Medicina Veterinária e os Princípios Éticos de Pesquisa Animal estabelecidos pelo Conselho Brasileiro de Experimentação

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Animal. Foram alocados para o trabalho, 30 coelhos brancos adultos da raça Nova Zelândia, pesando entre 3,0 e 3,5 kg. Dezoito desses constituíram os grupos dos compósitos e 12 o grupo-controle. Cada animal recebeu uma só dose de 0,4 mg/kg de ivermectin e em seguida foi transferido e mantido em gaiola individual, água ad libitum e com o suprimento-padrão de ração. Imediatamente antes da cirurgia cada coelho recebeu 40.000 UI/ kg de penicilina intramuscular (IM), foram sedados com levomepromazine (2 mg/kg IM) e anestesiados com tiletamine-zolazepam (30 mg/kg IM). Tricotomia foi realizada nos membros torácicos desde a porção média do úmero até o carpo, quando então bloqueio anestésico foi realizado com injeção de 1,5 ml de lidocaína a 2% no plexo axilar-braquial em cada membro. Assepticamente, procedeu-se a uma incisão curva de 3 cm, lateralmente à articulação úmero-radio-ulnar. A seguir, incisou-se o tecido subcutâneo e fáscia. A cabeça do músculo tríceps braquial foi deslocada no sentido cranial a fim de expor a cortical lateral do olecrânio. Sob irrigação constante com solução esterilizada de NaCl a 0,9%, efetuou-se defeito na região lateral do olecrânio usando-se broca trefina de 4 mm de diâmetro ligada a perfuratriz cirúrgica manual, e dessa forma expondo o osso trabecular subjacente. O compósito previsto para aquele grupo de animal foi então posicionado dentro do defeito. Náilon cirúrgico 3-0 foi utilizado a seguir na sutura dos tecidos moles. Efetuou-se todo esse procedimento nos dois membros torácicos de cada animal, cada qual recebendo um dos compósitos 1, 2 ou 3. Os defeitos foram realizados nos animais do grupo-controle mas não preenchidos. Ambos os membros torácicos de cada animal do grupo controle sofreram intervenção cirúrgica a fim de eliminar possível interferência desta nos resultados de claudicação, visto que ambos os membros foram operados nos grupos-compósito. Cada animal recebeu morfina (2 mg/kg), a cada 6 h durante dois dias, e uma dose de penicilina (40.000 UI/kg), 24 horas depois da cirurgia. Avaliações Clínicas e Radiológicas A ferida cirúrgica foi examinada considerando-se deiscência e infecção, a última considerada positiva quando ocorreu secreção

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séptica purulenta no local. A dor, manifestada ao toque na ferida cirúrgica e, ou, ao flexionar e estender o cotovelo, foi classificada em: 0, animal sem qualquer reação; 1, o animal reage ao toque ou à flexão, retraindo o membro; 2, vocaliza ou tenta mover-se, além de tentar retrair o membro em teste. A claudicação também foi avaliada em cada membro operado: 0, apoio normal sem claudicar; 1, apoio mas claudicação estava presente; 2, não apoia o membro. O critério edema foi avaliado medindo-se a circunferência do membro no local operado antes e depois da cirurgia. Todos esses dados foram obtidos diariamente nos primeiros oito dias e, depois, aos 45 e 90 dias depois da cirurgia. Kruskal-Wallis foi adotado na comparação dos dados dos quatro grupos quanto à infecção, deiscência, dor, claudicação e edema, nos dias 1, 4 e 8 pós-cirurgia. Foi considerado significante o resultado que diferisse em valor igual ou menor que P = 0,05. Ambos os olecrânios foram radiografados em posições médio-laterais e skyline logo após a cirurgia e aos 8, 45 e 90 dias. Os defeitos foram examinados a fim de constatar possíveis osteólise e reação periosteal como indicadoras de materiais não biocompatibilidade. Avaliações histológicas e histomorfométricas Quatro animais de cada grupo foram sacrificados aos oito, 45 e 90 dias depois da cirurgia, mediante injeção intravenosa com superdosagem de tiopental de sódio a 2,5% seguida de cloreto de potássio a 10%. Foram removidos fragmentos dos dois olecrânios, que foram fixados em formalina 10%, neutra e tamponada. Para os estudos de microscopia de luz, os fragmentos fixados em formalina foram descalcificados sob vácuo moderado, durante cerca de 20 dias em de ácido fórmico a 10% tamponado pH 4,5 com citrato de sódio. Foram desidratados a seguir em soluções etanólicas de concentrações crescentes, cortadas transversalmente no eixo longo da ulna, lavados durante 12 h em água corrente, mantidos por 30 min em cada uma de duas imersões em xilol e então infiltrados em parafina. Seções histológicas de 5 um foram obtidas em micrótomo

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de rotação provido com lâminas descartáveis, montadas em lâminas de microscopia e cada qual corado com azul de toluidina/borato de sódio a 1% (TB)/ hematoxilina-eosina (HE) e tricromo de Gomori (GT). Tecidos e células de toda a amostra foram caracterizados em avaliações qualitativas. Para a histomorfometria, uma grade de 100 pontos integrados foi usada a fim de estimar as proporções volumétricas dos tecidos ósseo e moles e medula óssea do defeito contando-se os pontos correspondentes a estes elementos em 10 secções, para cada animal apenas no lado medular do defeito. Os dados de cada dia de observação foram analisados segundo Mann-Whitney na busca de diferenças significantes entre a formação óssea e os tecidos moles dentro do defeito. As diferenças entre grupos e dias pós-cirurgia foram testadas utilizando-se Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparações pareadas de Dunn. Para estimar a formação de tecido dentro do compósito, a mesma grade foi sobreposta apenas à imagem do compósito, em dez secções por animal. Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn foram empregados para evidenciar diferenças significantes na formação de tecidos ósseo e moles entre dias e grupos. A proporção de tecidos ósseo e moles formados apenas na interface foi estimada contando-se somente os pontos imediatamente próximos do compósito em cada linha horizontal da mesma grade em dez seções por animal. Tornou-se possível utilizar o teste de Mann-Whitney na análise das diferenças verificadas na formação de tecidos ósseo e moles, em cada dia de observação, e o de Kruskal-Wallis, na análise dos dados para cada tecido entre os grupos. Todos os resultados foram apresentados como médias percentuais e desvios-padrão. Osteoclastos, reconhecidos pela sua morfologia, locais de ocorrência e cavidades em locais de reabsorção óssea, foram contados em 10 seções histológicas, por animal, em alta magnificação. Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações pareadas de Dunn foram usados na análise das diferenças entre os grupos controle e dos compósitos; e, a seguir, entre os dias seguintes à cirurgia, dentro de cada grupo.

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Resultados Alguns implantes do compósito 3 quebrarm durante o corte com a trefina, fato não ocorrido com os compósito 1 e 2. Entre as paredes do defeito, e em todos os membros dos grupos de compósitos, uma fenda tornou-se perceptível com o formato de linha fina contornando o compósito. Tal fenda foi imediatamente preenchida com coágulo. Nenhuma reação adversa tais como necrose, calcificação, dificuldades na cicatrizaçã, reação periosteal ou osteólise (radiografias) ocorreu no local dos compósitos. Nenhuma diferença significativa foi evidenciada entre os grupos sob os critérios de deiscência, infecção, dor, claudicação e circunferência (edema). Histologicamente, o processo de regeneração foi similar em todos os grupos aos 8, 45 e 90 dias pós-cirurgia. No 8o dia, tecido de granulação e novo osso trabecular estavam presentes, assim como pequenas áreas de tecido fibrocartilaginoso. Esse processo evoluiu até osso trabecular maduro, cuja medula óssea era perceptível no 90o dia pós-operatório. Infiltrado inflamatório não foi observado em nenhum dos grupos dos compósitos, assim como no grupo-controle, em todas as datas de observação. Nos três grupos de compósitos, fragmentos de compósito completamente separados do bloco original estavam circundados por tecidos ósseo e conjuntivo, tanto nas regiões medular como distal e proximal e, lateralmente, se apresentavam circundados por tecido mesenquimal (Fig. 1). Este tecido mesenquimal apresentava células blásticas ovóides em grande número, com núcleos e nucléolos proeminentes, fibras irregularmente orientadas e células-gigantes multinucleadas (Fig. 1). Este tecido mostrava-se contíguo ao osso e percebeu-se matriz osteóide em alguns campos microscópicos.

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Figura l. Compósito 3, 90 dias pós-cirurgia. A – Área total do bloco original (c) com osso circunjacente (b) nos lados medular (M), distal e proximal, e fragmentos (setas pequenas) completamente separados do bloco original e circundados por tecidos mesenquimal (mt) na região lateral (L). GT, 40 x. B – A, em detalhe, área marcada. Tecido mesenquimal (mt) circunda fragmentos (c) de compósito, apresentando células blásticas ovóides (setas menores) e células gigantes multinucleadas (setas maiores). GT. TABLE 1. % e valores do desvio padrão do tecido ósseo e conjuntivo no defeito ósseo produzido no experimento

DIA GRUPO TECIDO ÓSSEO TECIDO CONJUNTIVO 8 1 42.3 T 8.3 a A 13.3 T 8.8 b D 2 47.3 T 7.7 a A 10.2 T 7.0 b D 3 57.7 T 6.9 a A* 5.3 b T 9.1 D

45 1 52.7 T 3.6 a B 0.2 T 0.3 b E 2 42.0 T 10.8 a B 0.1 T 0.2 b E 3 50.7 T 7.3 a B 0.3 T 0.4 b E

90 1 38.2 T 3.7 a C 0.1 T 0.2 b F 2 41.3 T 6.7 a C 6.5 T 7.0 b F 3 38.3 T 12.9 a C* 0.2 T 0.4 b F

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As diferenças percentuais entre osso e tecido conjuntivo estão mostradas na tabela 1 e a figura 2. Ambas evidenciam percentuais maiores de osso presentes em todas as datas de observação (valor P máximo de 0,031). Similarmente, os percentuais de osso e de tecidos conjuntivos na interface estão na tabela 2 e figura 3. Tanto osso (Fig.4) quanto tecido conjuntivo participam da interface compósito-tecido, apenas variam as proporções entre ambos de acordo com grupo e dia de observação. São similares os percentuais de tecido ósseo aos 90 dias pós-cirurgia nos grupos 2 e 3 (Tab. 2).

Figura 2. Indicadas (*) as diferenças significativas entre as percentagens médias de tecidos ósseo e conjuntivo para grupo e dia de observação. Letras minúsculas indicam diferenças significativas entre dias no grupo 3.

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Figura 3. Indicadas (*) as diferenças significativas entre as percentagens médias de tecidos ósseo e conjuntivos para grupo e dia de observação. Letras minúsculas indicam diferenças significativas entre grupos quanto ao tecido ósseo, e maiúsculas, ao tecido conjuntivo. Tabela 2: % e desvio padrão de tecido ósseo e conectivo na interface com os compositos: 1( 10% de HAP-91 e 90% de PHB), 2( 25% de HAP-91 e 75% de PHB) e 3( 50% de HAP-91 e 50% de PHB) DIAS GRUPO TECIDO ÓSSEO TECIDO CONJUNTIVO

8 1 29.9 T 21.6 a A 68.7 T 21.6 a D 2 16.4 T 8.3 a A 83.6 T 8.3 b D 3 45.1 T 27.7 a A 43.2 T 34.3 a D

45 1 57.4 T 14.8 a B 24.4 T 26.5 a E 2 71.8 T 6.1 a B 0.9 T 1.6 b E 3 79.4 T 8.9 a B 4.3 T 3.7 b E

90 1 18.4 T 1.3 a C 74.3 T 2.6 b F 2 54.6 T 27.6 a CH 34 T 29.0 a FG 3 66.9 T 9.2 a H 20.0 T 13.6 b G

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Tecidos ósseo e conjuntivo foram encontrados nos poros do compósito 2 aos 45 e 90 dias pós-cirurgia e nos do compósito 3, nas três datas de observação (Fig.4). Decorridos 45 dias pós-cirurgia, eram similares as percentagens de osso nos compósitos 2 e 3, assim como as de tecido conjuntivo. Aos 90 dias, o percentual de osso era maior no compósito 3 do que em 1 e 2, mas o de tecido conjuntivo era similar. No compósito 1, os dois tipos de tecido apenas se projetavam na superfície do compósito.

Figura 4. Noventa dias pós-cirurgia. Na interface vê-se contato direto entre osso e compósito (setas maiores) e projeções (setas menores) de tecido conjuntivo no compósito. HE.

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No 80 dia pós-cirurgia, osteoclastos distribuíam-se nas margens trabeculares do tecido ósseo em regeneração, células multinucleadas e com nucléolo proeminente nas margens do osso; e, no 900, eles foram vistos na interface osso-compósito (Fig. 5). Não se encontrou diferença significativa quanto ao número de osteoclastos entre os quatro grupos, dentro de cada data de observação; no entanto, foram significativas as diferenças observadas nos dados para os dias 8 e 90, nas comparações dentro de cada grupo (valor máximo de 0,038 no grupo 3) (Tab. 3 e Fig. 6).

Figura 5. A – Osteoclasto na interface entre o tecido ósseo e o compósito 3, 90 dias pós-cirurgia. Vêem-se tecido ósseo maduro na lado medular (b), medula óssea (bm) e compósito (c). HE. B – Osteoclasto de A, mostrado em maior aumento. HE.

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Figura 6. Valores médios do número de osteoclastos com diferenças significativas (*) em cada grupo, entre o 80 e 900 dias. Discussão No modelo experimental desenvolvido neste trabalho optou-se por não efetuar defeitos na tíbia ou fêmur, que, pela nossa experiência, predispõem os animais à fratura durante a carga a que estiverem submetidos, principalmente no caso de membros pélvicos. Já se conhecem1,2,10,11,18 modelos de defeitos em radio de coelhos e em osso calvaria de camundongos, mas sem que algum reúna todas as características de: (a) contato íntimo com osso cortical circunscrevendo o implante e osso trabecular no seu lado medular; (b) permitir radiografias em posição skyline do olecrânio, com as vantagens de facilidade de posicionamento dos animais e de se efetuar análise radiográfica sem a interposição de tecido mole; e (c) de a ferida cirúrgica do olecrânio dispensar o uso do colar elisabetano. Também se escolheu esse modelo na avaliação da biocompatibilidade e da osteo- integração dos compósitos pelo

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rápido metabolismo dos coelhos, incluindo regeneração e remodelação ósseas2. Vantagens da regeneração óssea com compósitos sobre os defeitos vazios – representados pelo grupo-controle - não constituíram objeto deste estudo. A fim de efetuar tal tipo de comparação, empregando-se substâncias tal como o PHB, que exigem períodos longos para serem biodegradados, é preciso utilizar defeito “de tamanho crítico”, definido como o tamanho que impossibilita a regeneração óssea espontânea4,19. Em coelhos este tamanho foi reportado ser de 15 mm de diâmetro4. Os compósitos PHB-HA são feitos objetivando permitir a regeneração de defeitos em grandes segmentos ósseos e em locais submetidos a carga considerável, tais como a mandíbula e a diáfise de ossos longos, o que implica na necessidade não apenas de uma matriz para migração celular durante o processo de regeneração óssea, mas também que seja um material capaz de resistir forças consideráveis como as exercidas durante a mastigação e apoio1,2,4. Assim, em uma situação em que é desejável analisar a biocompatibilidade, e a osseointegração e osseocondução, seria inapropriado se compararem as possíveis vantagens de alguns grupos de compósitos sobre o grupo-controle. Avaliar a biocompatibilidade de compósitos PHB/HA constituiu a motivação principal do estudo presente. Como inflamação é uma reação local também envolvendo um componente sistêmico20, animais que receberam algum compósito não constituíram controle. A ausência de qualquer resposta inflamatória significativa em todos os grupos de compósitos, e similar ao grupo-controle, confirmou-os como biocompatíveis18,25,27,28. Isso é corroborado pela similaridade encontrada entre os dados para o controle e para os grupos de compósitos nos parâmetros clínicos de deiscência, infecção, dor, claudicação e edema8. O processo de regeneração foi similar entre o controle e os grupos de compósitos visto que todos se observou angiogêneses e migração de células osteoprogenitoras, apresentando trabéculas novas e remodelação óssea18,21, o que também comprova a biocompatibilidade dos compósitos. Estes dados podem ser deduzidos da tabela 1 e da figura 2, atestando que mais osso do que tecido conjuntivo surgiu no lado medular do defeito. Um material não biocompatível prejudicaria a formação e a remodelação ósseas,

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em consequência por exemplo13,22,27 da liberação de produtos ácidos de degradação. Um aparente decréscimo no percentual de osso associado ao grupo 3 (Fig. 2) pode ter sido causado pela remodelação óssea, processo que transforma o alto número de trabéculas pequenas dos estádios iniciais em osso mais maduro: número pequeno de trabéculas maiores associadas com a medula óssea1,2,4. Além de ter confirmado a biocompatibilidade dos compósitos, esta pesquisa também foi útil na avaliação de outra característica, a osseointegração. Compósitos são capazes de se integrarem diretamente ao tecido ósseo, propriedade influenciada pela proporção da HA, como visto em estudos in vitro de Ni & Wang15 e de Wang et al.16 (Tab. 2). Mais tecido ósseo do que conjuntivo encontrado na interface dos compósitos 2 e 3 provavelmente resultou do seu maior conteúdo de HA12,23. Os apenas 10% do compósito 1 provavelmente não propiciaram bioatividade suficiente a propiciar esse efeito desejável. Diferenças similares se verificaram na formação óssea dentro do defeito (Tab. 1). Doyle et al.10 não encontraram tal diferença nos compósitos HA-PHB com conteúdos de 20 e 40% de HA. Como resultado de sua análise, havia menos que 10% de grânulos de HA expostos na superfície do compósito, o que atesta a influência da cerâmica no processo. Todavia, a formação de osso também é pela técnica cirúrgica22. Mais tecido conjuntivo foi encontrado nos lados distal e proximal do defeito do que no medular. Naquelas áreas, a distância do compósito à parede do defeito - surgida da trefina de 4 mm usada na preparação do defeito e que cortou os compósitos - pode ter permitido o ingresso do tecido conjuntivo ao nesta região antes que ocorresse a formação de novo osso, assim, prejudicando a ossointegração. Como se sabe, o contato direto entre osso e biomaterial é pre-requisito à melhor ósseo integração1,22. O lado distal e o proximal também fazem parte da área de osso cortical, deixando disponível menos medula óssea como fonte de células osteogenitoras necessárias à regeneração óssea28; estas que são abundantes no lado medular e onde foi mais rápida a formação óssea. Como tecido ósseo foi encontrado em poros dos compósitos está implícito ter havido osteocondução; e a sua ausência no

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compósito 1, confirma que este é menos osteocondutor do que os compósitos 2 e 3. Diferenças estatisticamente significativas encontradas entre os tecidos surgidos com o compósito 3 indicam que, quanto a esta propriedade, este é o melhor dos três; portanto, maior proporção de HA influencia favoravelmente o osseocondução do compósito. Essa propriedade pode ser influenciada por maiores bioatividade e porosidade do compósito12,16,19. Aumento da fração HA12 e alterações nos métodos de preparação dos compósitos afetam a porosidade29; esta é essencial a uma matriz para engenharia óssea que permita a migração tridimensional das células osteoprogenitoras3,28,30. Relatos sobre a porosidade dos compósitos de PHB variam: este pode apresentar poros de tamanhos suficientemente grandes para ao crescimento vascular e ósseo no seu interior – dimensões que se acreditam próximas de 100 a 150µm28 – e, portanto, favoráveis à regeneração óssea30,31; mas também é possível encontrar matrizes de PHB porosas, porém seus poros são muitos pequenos para permitir a migração de células; e, ainda, há quem reporte a completa ausência de poros29. Osteoclastos são responsáveis pela degradação da HA, fato que torna este processo os mais próximo possível da remodelação natural do tecido ósseo, sabido que aquelas células são os agentes da reabsorção deste tecido8,32. Os números de osteoclastos encontrados nos grupo controle e de compósitos foram similares entre si os, o que embasa a observação de que ocorreu regeneração óssea normal associada aos compósitos. O decréscimo dos números de osteoclastos entre o 80 e o 900 dia pós-cirurgia (Tab. 3) está consistente com o osso mais maduro ter sido encontrado nas amostras desta última data. A diferença constatada aos 8 dias na localização dos osteoclastos nas margens das trabéculas e, aos 90 dias, na interface osso-compósito dentro dos compósitos (Fig. 5), dá indícios da biodegradação dos compósitos. A ocorrência da biodegradação é corroborada também pela presença de fragmentos de compósito completamente separados do bloco original, mais perceptíveis nos lados medular e lateral, e circundados por tecido mesenquimal e células gigantes multinucleadas (Fig. 1). De início, as células multinucleadas gigantes poderiam sugerir reação a um material não biocompatível; porém, a ausência de infiltrado

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linfoplasmocitário e a presença de tecido mesenquimal mostram que se trata de um processo regenerativo associado à biodegradação. Células multinucleadas gigantes têm sido reconhecidas por desempenhar papel na biodegradação da HA, do PHB e de outros polímeros ao erodir as superfícies dos implantes reabsorvívies- e sem qualquer reação adversa - estando ligadas à regeneração de tecido e a um decréscimo do peso do implante ao longo to tempo7,8,13,24,27,32. Os resultados mostrados aqui indicam semelhança entre os três compósitos no processo de regeneração óssea, embora 2 e 3 tenham se integrado melhor ao osso, fato atestado pelo maior percentual de tecido ósseo encontrado na interface de ambos em comparação com o do compósito 1. Acrescer a isso, o compósito 3 é mais osteocondutor que o 2, fato atestado pela maior quantidade de tecido ósseo em seus poros. Entretanto, pesquisa futuras com o compósito 3 no tocante à sua aplicação sob carga, serão limitadas visto que algumas amostras fraturam ao serem submetidas ao corte com trefina. Isto pode ser explicado pela maior proporção do HA no compósito, sabido que HA é um material quebradiço4. Ainda, como a proporção 10% HA: 90% PHB não se mostrou osteocondutor, ou seja, a formação profunda de tecido em seu interior não foi observada, tal compósito será adequado apenas na manufatura de implantes e não para a substituição óssea. Concluindo, os compósitos estudados atendem alguns dos requisitos básicos dentro do objetivo de seu emprego na cirurgia de reconstrução, ortopédica e maxilofacial. Os dados expostos demonstram que os compósitos são biocompatíveis, capazes de integração com o tecido ósseo e osteocondutores, além de provavelmente serem biodegradáveis. Para a aplicação de tais compósitos para a fabricação de matrizes para engenharia de tecidos que suportem cargas mecânicas, estudos adicionais precisam abordar as características mecânicas e de biodegradação do compósito 25% HA: 75% PHB antes de ele poder ser recomendo para cirurgias de reconstrução, pois que, dentre os estudados, foi o que apresentou o melhor conjunto de propriedades.

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Agradecimentos Os autores agradecem ao prof. Lissandro G. Conceição pela revisão do manuscrito e às profas. Sheyla M.C.M. Bicalho do Laboratório Química JHS, e Maria Flávia Vannuci de Moraes, que nos supriram com o HAP-91TM e o PHB, respectivamente. Bibliografia Citada 1. Boer FC, Wippermann BW, Blokhuis FJ, et al. Healing of segmental bone defects with granular porous hydroxyapatite augmented with recombinant human osteogenic protein-1 or autologous bone marrow. J Orthop Res 2003;21:521-528. 2. Macneill SR, Cobb CM, Rapley JW, et al. In vivo comparison of synthetic osseous graft materials. A preliminary study. J Clin Periodontol 1999;26:239-245. 3. Boeree NR, Dove J, Cooper JJ, et al. Development of a degradable composite for orthopaedic use: mechanical evaluation of a hydroxyapatite-polyhydroxybutyrate composite material. Biomaterials 1993;14:793-796. 4. Clokie CM, Moghadam H, Jackson MT, et al. Closure of critical sized defects with allogenic and alloplastic bone substitutes. J Craniofac Surg 2002;13:111-123. 5. Pereira APM, Gondim DGA, Gomes Júnior EC, et al. Removal of miniplates and screws of the oral and maxillofacial region: a literature review. Rev Cir Traumatol Buco-Maxilo-Facial 2005;5:17-26. 6. Ashammakhi N, Renier D, Arnaud E, et al. Successful Use of Biosorb Osteofixation Devices in Cranial and Maxillofacial Cases: A Multicenter Report. J Craniofac Surg 2004; 15:692-701. 7. Witt C, Mäder K, Kissel T. The degradation, swelling and erosion properties of biodegradable implants prepared by extrusion or compression moulding of poly(lactide-co-glycolide) and ABA triblock copolymers. Biomaterials 2000; 21:931-938. 8. Borges APB, Rezende CMF, Ribeiro MFB, et al. Synthetic hydroxyapatite as bone substitute experimentally-made defects in

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V. 2 RESPOSTA TECIDUAL AO COMPÓSITO 50% HIDROXIAPATITA: 50% POLI-HIDROXIBUTIRATO PARA SUBSTITUIÇÃO ÓSSEA EM COELHOS Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.4, p.844-852, 2009 [Tissue response to the composite 50% hydroxyapatite: 50% polyhydroxybutyrate for bone substitution in rabbits] E.C. Carlo1, A.P.B. Borges1, M.I.V. Vargas1, M.M. Martinez2, R.B. Eleotério1, A.R. Dias1, M.C.D. Rodrigues1

RESUMO Avaliaram-se a biocompatibilidade, a osseointegração, a osseocondução e a biodegradação de compósitos de 50% hidroxiapatita (HAP-91®) e 50% poli-hidroxibutirato. O compósito foi implantado em defeitos ósseos em 12 coelhos (grupo experimental), sendo comparado a defeitos não preenchidos (grupo-controle, de igual número). Os parâmetros clínicos dor, claudicação, infecção, deiscência e edema foram avaliados nos primeiros oito dias após a cirurgia e aos 45 e 90 dias. Radiografias foram realizadas aos oito, 45 e 90 dias após a cirurgia em quatro animais por grupo que, em seguida, foram submetidos à eutanásia para coleta de amostras destinadas a análises histológica e histomorfométrica. Não ocorreram diferenças entre os grupos para todos os parâmetros clínicos. Radiografias demonstraram um compósito com radiopacidade semelhante à do osso vizinho e contato direto entre osso e compósito aos 45 e 90 dias. Diferença significativa foi observada entre a porcetagem dos tecidos ósseos

1Departamento de Veterinária - UFV Av. P. H. Rolfs, s/n. 36570-000 – Viçosa, MG 2Universidade de Córdoba – Colômbia E-mail: emilycarlo@yahoo.com.br

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e conjuntivo dentro do defeito nos dias oito, 45 e 90, assim como na interface aos 45 e 90 dias. Foram observadas projeções dos tecidos ósseo e conjuntivo no interior do compósito e sinais de biodegradação na ausência de infiltrado inflamatório. Pode-se concluir que o compósito é biocompatível, osseocondutor, biodegradável e se integra ao tecido ósseo. Palavras-chave: coelho, biomateriais, substituto ósseo, compósito

ABSTRACT The biocompatibility, osseointegration, osseoconductivity, and biodegradation of a 50-50% hydroxyapatite (HAP-91®)-polyhydroxybutyrate were evaluated. The composite was implanted in bone defects of 12 rabbits (experimental group), being compared to unfilled defects (control group, 12 animals). The clinical parameters of pain, lameness, infection, dehiscence, and edema were evaluated during the first eight days and on the 45th and 90th days after surgery. Radiographs were taken in four animals per group at 8, 45, and 90 days after surgery, when animals were euthanized to collect samples for histology and histomorphometry. Significant differences between groups for all clinical parameters were not observed. Radiographs showed a similar radiopacity of the composite and bone and their direct contact. More bone than connective tissue was found within the defect at 8, 45, and 90 days and at the interface on the 45th and 90th days. Projections of bone and connective tissue were seen inside the composite. Biodegradation signs became evident, with absence of inflammatory infiltrate. Data support that such composite is biocompatible, osseoconductive, biodegradable, and integrate to bone. Keywords: rabbit, biomaterials, bone substitute, composite

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INTRODUÇÃO A perda de tecido ósseo é um importante desafio para a medicina e odontologia humanas e veterinárias, pois resulta em defeitos que necessitam de auxílio para uma adequada regeneração e restabelecimento das funções locais. Diversas afecções podem originar tais defeitos, sendo a principal delas as fraturas cominutivas, mas também a necessidade de retirada de tecido neoplasico e a reabsorção do osso alveolar na dontologia (Brandão et al.,2002; Kleiner e Silva, 2003; Walsh et al., 2003). A associação de uma cerâmica a um polímero foi sugerida para a substituição do tecido ósseo, possibilitando a fabricação de implantes em tamanhos e formas apropriados para cada paciente (Doyle et al., 1991; Luklinska e Bonfield, 1997; Scarano et al., 2006; Shishatskaya et al., 2006). Esse material tem por função ocupar o defeito, mantendo a redução apropriada e a continuidade dos fragmentos, servindo como suporte para a regeneração do tecido ósseo que gradativamente o substituirá (Boer et al., 2003). Dessa forma, o presente trabalho teve o objetivo inicial de analisar a biocompatibilidade, a osseointegração, a osseocondução e a biodegradação do compósito, associando a hidroxiapatita sintética HAP-91® ao polihidroxibutirato, e o objetivo final de disponibilizar um substituto ósseo de preço mais acessível do que os hoje existentes no mercado brasileiro, já que este material foi desenvolvido com matéria prima e tecnologia nacionais. MATERIAL E MÉTODOS Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética do DVT/UFV, em consonância com o estabelecido pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. Os compósitos com 50% de cada biomaterial, hidroxiapatita sintética1 e poli-hidroxibutirato (PHB), fornecidos com um formato retangular, foram cortados de forma asséptica com uma broca trefina de 4mm de diâmetro, para adequar o tamanho e o formato dos implantes ao defeito.

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Foram utilizados 24 coelhos adultos da raça Nova Zelândia, com pesos entre 3 e 3,5kg, alojados em gaiolas individuais, onde receberam ração duas vezes ao dia e água à vontade. Os coelhos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos com igual número de animais: o grupo-controle (C) e o grupo compósito (HP). Os animais receberam penicilina G2 na dose de 40.000UI/kg via intramuscular (IM) 30 minutos antes da cirurgia como terapia antimicrobiana profilática. Eles foram sedados com levomepromazina3 (2mg/kg, IM) e anestesiados com associação de tiletamina-zolazepam4 (30mg/kg, IM). Os membros torácicos foram tricotomizados desde a região proximal da diáfise do úmero até o carpo e, após antissepsia, utilizou-se lidocaína 2%5 (1,5ml) para realização de bloqueio anestésico do plexo braquial. Foi realizada incisão curva de pele na superfície lateral da articulação úmero-rádio-ulnar. O músculo tríceps braquial foi afastado, expondo a cortical lateral do olécrano. Foi confeccionada uma falha óssea circular de 4mm de diâmetro, com o auxílio de uma broca trefina6, acoplada a uma perfuratriz elétrica sob irrigação com solução de NaCl 0,9%. Os defeitos dos animais do grupo HP foram preenchidos com o compósito. Os defeitos dos animais do grupo C não foram preenchidos. Os tecidos foram aproximados utilizando-se

fio não-absorvível de náilon7. Os cuidados pós-operatórios incluíram

1HAP 91® - JHS Laboratório Químico LTDA. Belo Horizonte, Brasil. 2Megacilin® - União Química Farmacêutica Nacional S/A - São Paulo, Brasil. 3Neozine®- Sanofi-aventis - São Paulo, Brasil. 4Zoletil 50® - Farmavet Produtos Veterinários Ltda. – São Paulo, Brasil. 5Lidocaína 2%- Hipolabor – Sabará, Brasil. 6Neodent®- Curitiba, Brasil. 7Monofilamento preto Nylon 3-0 Technofio- Farma Brasileira - São Paulo, Brasil. 8Dimorf®- Cristália do Brasil - Itapira-SP, Brasil. 9Megacilin® - União Química Farmacêutica Nacional S/A.São Paulo, Brasil.

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a administração de morfina8 a cada seis horas, por três dias (2mg/kg, IM), e penicilina9 (40.000UI/kg, IM) a cada 24 horas, por dois dias. Imediatamente após a cirurgia, radiografias foram realizadas nas posições mediolateral, com a articulação úmero-rádio-ulnar flexionada e tangencial ao olécrano. Nesta última, o animal foi posicionado em decúbito dorsal com o úmero paralelo à mesa e a articulação úmero-rádio-ulnar em total flexão. As avaliações clínicas foram realizadas diariamente nos primeiros oito dias e depois, aos 45 e 90 dias. Cada membro foi avaliado quanto à claudicação, de acordo com o apoio da extremidade do membro com os escores: 0 – sem claudicação; 1 – apoio com claudicação; 2 – ausência completa de apoio. A ferida cirúrgica foi avaliada quanto à presença de deiscência, infecção e reação inflamatória, esta última analisada pelos parâmetros edema e dor. O edema foi avaliado quantitativamente pela mensuração da circunferência do membro no local da ferida cirúrgica. A sensibilidade dolorosa foi avaliada pela reação do animal ao toque da ferida cirúrgica e flexão e extensão da articulação úmero-rádio-ulnar, atribuindo-se os escores: 0 – quando não existiu qualquer manifestação do animal; 1 – houve retração do membro sem outra manifestação; 2 – houve retração do membro associada à vocalização ou tentativa de fuga. A deiscência de sutura foi avaliada em presente ou ausente, assim como a infecção da ferida cirúrgica, observada pela presença de secreção purulenta proveniente do local. Nos dias oito, 45 e 90 após a cirurgia, foram realizadas radiografias de quatro animais de cada grupo, repetindo os posicionamentos realizados no pós-operatório imediato. As radiografias foram analisadas quanto à presença de reação periosteal, esclerose e reabsorção óssea. Foi confeccionado um esquema em folha transparente que, sobreposto às radiografias, dividiu o defeito em quatro quadrantes. Isso permitiu analisar e classificar a radiopacidade de cada quadrante em menor, semelhante ou maior do que a do osso vizinho, observar as bordas do defeito/compósito em cada quadrante e verificar se o limite entre osso e compósito podia ser bem delimitado.

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Quatro animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia com sobredose anestésica10, em cada um dos dias oito, 45 e 90 após a cirurgia. Então, foram coletadas amostras do olécrano contendo o defeito após ressecção com serra ortopédica para processamento histológico. As amostras foram fixadas em formol 10% tamponado e, em seguida, descalcificadas em ácido fórmico a 10% tamponado com citrato de sódio para pH 4,5 sob vácuo moderado. Após a descalcificação, as amostras foram seccionadas no sentido transversal ao eixo longo da ulna, no centro do defeito, para se obter a superfície de análise. Então, foram lavadas em água corrente, desidratadas, diafanizadas e incluídas em parafina. Foram obtidos cortes de 5μm de espessura, corados pelas técnicas de hematoxilina-eosina, tricrômico de Gomori (TG) e azul de toluidina (AT), para posterior análise à microscopia de luz. À análise histológica (qualitativa), foram caracterizados os tecidos e as células presentes em toda a amostra. À histomorfometria, o número de osteoclastos presentes em 10 campos por amostra foi contado em aumento de 200X em ambos os grupos. Com auxílio de uma ocular graduada, foram quantificadas percentualmente as estruturas compósito, tecido ósseo, tecido conjuntivo e medula óssea, somente no grupo HP. Realizou-se a caracterização dos tecidos presentes na interface com o compósito, permitindo a obtenção do percentual de tecido ósseo, medula óssea e tecido conjuntivo também com uma ocular graduada, mas contando-se apenas o primeiro ponto de interseção imediatamente após o compósito em cada linha. Para analisar a formação de tecidos dentro do compósito, a mesma ocular graduada foi sobreposta somente no interior do compósito em cinco campos por amostra, procedendo-se à contagem dos pontos. Os dados clínicos e histomorfométricos foram avaliados estatisticamente, considerando significante um valor de P menor do que 0,05. As comparações entre os dias dentro de cada grupo foram realizadas 10Tiopental® - Cristália. Itapira-SP, Brasil

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utilizando-se o teste Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn’s. Para as variáveis clínicas infecção, claudicação, dor e deiscência, compararam-se os dias um, quatro e oito entre si, dentro de cada grupo. As médias dos números de osteoclastos em cada um dos dias oito, 45 e 90 foram comparadas entre si em cada grupo e, da mesma forma, os valores de porcentagem de tecido ósseo e tecido conjuntivo dentro do compósito. Para comparar os grupos C e HP, utilizou-se o teste Mann- Whitney. Assim, as variáveis infecção, claudicação, dor e deiscência foram comparadas entre os grupos em cada um dos dias um, quatro e oito após a cirurgia. Da mesma forma, a diferença entre a formação dos tecidos ósseo e conjuntivo no defeito como um todo, na interface com o compósito e dentro do compósito foi avaliada. A variável edema (circunferência do membro) foi avaliada como evolução de um mesmo animal utilizando-se o teste Wilcoxon para amostras não independentes. RESULTADOS E DISCUSSÃO O compósito mostrou-se macroscopicamente um material compacto e facilmente manipulável durante a cirurgia, apesar de ter se quebrado algumas vezes no momento do corte com a broca trefina. Esta observação está de acordo com os achados de Doyle et al. (1991), que observaram menores valores de resistência à tração e compressão com altas porcentagens de hidroxiapatita em compósitos semelhantes. A cicatrização da ferida cirúrgica cutânea se completou, em geral, até o sétimo dia. Três animais de cada grupo apresentaram dor grau 1, ocorrendo nos três primeiros dias no grupo C e no grupo HP nos dois primeiros dias. Infecção não foi observada em nenhum animal. Dois animais de cada grupo apresentaram claudicação grau 1, coincidindo com os dias de dor. Um animal de cada grupo apresentou deiscência devido à interferência na sutura. Não existiu qualquer diferença significante entre os grupos para os parâmetros dor, claudicação, infecção e deiscência, o que indica a biocompatibilidade do compósito e, ainda, que a existência desses sinais se deveu à manipulação cirúrgica e não à presença do biomaterial. Esse resultado está de acordo com

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estudos anteriores com a hidroxiapatita utilizada em cães e coelhos (Borges et al., 2000; Vital et al., 2006; Sá et al., 2007). A avaliação do edema corrobora com esses resultados, visto que não existiram diferenças significantes entre os grupos, assim como entre os valores do pós-operatório imediato e os dias oito, 45 e 90. Diferença significante foi observada entre os valores pré-operatórios da circunferência do membro em relação aos valores do primeiro e quarto dias, indicando a existência de aumento de volume em ambos os grupos. Este fato é esperado devido à manipulação cirúrgica do membro (Borges et al., 2000; Vital et al., 2006). À análise radiográfica, não foram observadas reação periosteal, esclerose ou reabsorção óssea em nenhum dos grupos. Os defeitos do grupocontrole nas radiografias obtidas no pósoperatório imediato e aos oito dias após a cirurgia se caracterizaram por radiopacidade menor do que a do osso vizinho em todos os quadrantes e bordas bem delimitadas. Nas radiografias do grupo HP nestes mesmos dias, foi observado um halo menos radiopaco ao redor do compósito, correspondendo à distância entre a parede do defeito e o compósito, observada durante a cirurgia. Sabe-se que os tecidos moles não são radiopacos devido à ausência da matriz calcificada, correspondendo, após a cirurgia, ao coágulo que se formou neste local e provavelmente aos tecidos moles, conjuntivo ou osteoide, aos oito dias, que participam da regeneração óssea (Yamamuro, 1994; Vital et al., 2006; Sá et al., 2007). O compósito apresenta radiopacidade semelhante à do osso vizinho, justificada pelo teor de hidroxiapatita que possui elementos com alto número atômico em sua constituição, portanto radiopacos (Borges et al., 2000; Duarte et al., 2006). A avaliação das radiografias do grupo-controle aos 45 dias revelou redução no tamanho do defeito e radiopacidade já semelhante à do osso vizinho em 37,5% dos quadrantes, indicando a regeneração do defeito em andamento. Aos 90 dias, 58,3% dos quadrantes tinham radiopacidade semelhante à do osso vizinho e os defeitos apresentavam-se com menor tamanho do que aos oito dias. Esse processo de regeneração óssea mais avançado neste dia, em comparação com os anteriores, era esperado, já que foram realizados defeitos de tamanho não-crítico, ou seja, onde esse processo não é

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dificultado ou impedido pelo tamanho do defeito (MacNeill et al., 1999). O halo menos radiopaco do que o osso vizinho presente aos oito dias não foi mais observado aos 45 e 90 dias no grupo HP. Nestes dias, os defeitos haviam diminuído de tamanho e não foi possível delimitar as margens de 50% dos quadrantes, observando-se o contato direto entre compósito e osso. Essas observações indicam a formação de novo osso nas bordas do compósito, reforçando a biocompatibilidade e indicando a osseointegração. Estes resultados estão de acordo com os achados de Knowles et al. (1992), Luklinska e Bonfield (1997) e Doyle et al. (1991), sendo que estes últimos observaram média de 90% de aposição direta entre osso e PHB após implantação por seis meses. Em nenhuma das amostras foi observado infiltrado inflamatório de qualquer tipo celular, o que indica a biocompatibilidade do compósito, corroborando com os dados clínicos e com estudos realizados por Cheng et al. (2006) e Shishatskaya et al. (2006). À análise histológica aos oito dias no grupocontrole, pôde-se observar processo típico de regeneração de uma falha óssea. Trabéculas novas – delgadas e numerosas com osteoclastos e grande número de osteoblastos ativos em suas margens – partindo da região medial ao defeito, entremeadas por tecido conjuntivo denso vascularizado. No grupo HP, a arquitetura dos tecidos apresentou-se muito semelhante à do grupo-controle aos oito dias. A interface com o compósito na região medial ao defeito constituiuse principalmente por trabéculas novas (Fig. 1A), mas também por tecido conjuntivo denso vascularizado, estando de acordo com os achados de Doyle et al. (1991). Não foi constatada diferença estatisticamente significante entre as porcentagens dos tecidos ósseo e conjuntivo neste dia. Tecido conjuntivo predominou na interface das regiões distal e proximal ao defeito, e tecido ósseo predominou na região medial ao defeito, provavelmente devido à influência de dois fatores. O primeiro deles é a distância observada durante a cirurgia entre a parede do defeito e o compósito. Essa distância ocorreu devido à utilização da mesma broca para fazer o defeito no osso e o corte do compósito, resultando na retirada do diâmetro externo da broca, ao corte do osso e, do diâmetro interno da broca, ao corte dos

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compósitos. Tal distância pode permitir a invaginação de tecido conjuntivo no local antes da formação de tecido ósseo (MacNeill et al., 1999). O segundo é a presença de grande quantidade de medula óssea na região medial ao defeito, origem de células osteoprogenitoras (Sá et al., 2007) responsáveis pela rápida formação de trabéculas novas nessa região. Tal fato não ocorreu de forma tão pronunciada nas regiões proximal e distal provavelmente por serem locais de predominância de osso cortical. Foram observadas projeções dos tecidos ósseo e conjuntivo para o interior do compósito, o que reforça o caráter biocompatível deste. Além disso, demonstra que o compósito auxilia o desenvolvimento tecidual, permitindo a migração de células produtoras de novo osso dentro de seus poros e a fixação delas nestes locais, ou seja, osseocondução (Borges et al., 2000; Sá et al., 2007). No grupo-controle, aos 45 dias, observou-se tecido ósseo trabecular mais organizado na região medial ao defeito, com trabéculas mais espessas e menos numerosas. Aos 90 dias, a arquitetura tecidual já se encontrava restabelecida, com osso trabecular organizado no centro do defeito e a cortical lateral do olecrano formada. Aos 45 e 90 dias, no grupo HP, o processo de regeneração associado ao compósito se deu de forma muito semelhante ao das amostras do grupo-controle. Tal fato já foi comprovado para a hidroxiapatita pura, passando pela neovascularização, diferenciação de células osteoprogenitoras, formação de novo osso e remodelação óssea (Borges et al., 2000; Walsh et al., 2003; Duarte et al., 2006). Tecido ósseo trabecular organizado predominava na interface com o compósito, associado à medula óssea (Fig.1B e 1C). Foram observadas trabéculas no interior do compósito (Fig. 1B, 1C e 1D) e também tecido conjuntivo frouxo e vasos sanguíneos. Osteoclastos encontravam-se na interface do tecido ósseo com o compósito, invaginando na direção deste último. Essas células também foram observadas na interface trabéculas-compósito (Fig. 1C e 1D) de forma semelhante ao túnel de reabsorção formado na remodelação óssea (Yamamuro, 1994). Portanto, a formação de novo osso na interface com o compósito é morfologicamente comparável a locais de remodelação óssea normais, o que está de acordo com os achados de Doyle et al. (1991) e Luklinska e Bonfield (1997).

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Nas bordas proximal, distal e medial ao defeito, puderam-se observar, aos 45 e 90 dias, fragmentos do compósito separados do bloco original em meio ao tecido ósseo adjacente (Fig. 1F), semelhante ao relatado por Sá et al. (2007) com a associação de hidroxiapatita e zircônia.Assim como observado por Luklinska e Bonfield (1997) e Shishatskaya et al. (2006), pode-se sugerir uma progressão de acontecimentos: migração celular por poros já existentes no material e formação de novo osso englobando fragmentos do compósito, ou seja, osseointegração e osseocondução. Estes, então, separam-se do bloco original, ocorrendo também a biodegradação, com a formação de novos poros e gradual substituição do biomaterial. Fragmentos de hidroxiapatita e polihidroxibutirato também foram observados no tecido que envolveu a região lateral ao compósito e continuava com o tecido ósseo adjacente. Eles eram numerosos e estavam associados a um tecido mesenquimal com grande número de células blásticas, discretas formações de matriz osteoide e células gigantes ao redor destes fragmentos (Fig. 1E). A presença de matriz osteoide sugere a formação de tecido ósseo neste local. Já as células gigantes são responsáveis pela degradação de material e restos teciduais em locais de reparação (Volova et al., 2003; Rumpel et al., 2006). Dessa forma, as características aqui observadas sugerem processo de biodegradação do compósito. Estes achados estão de acordo com os de Volova et al. (2003), que observaram a influência de enzimas da matriz extracelular dos tecidos, macrófagos e células gigantes na degradação de fibras de PHB. Eles observaram erosão na superfície do PHB, sem reações adversas como inflamação supurativa, necrose ou calcificação de tecido fibroso. Também condizem com Borkenhagen et al. (1998), ao estudarem sistemas guias para regeneração de nervos, constituídos de diferentes proporções de PHB e poli-hidroxivalerato. Observaram perda de peso de até 88% e macrófagos e células gigantes associados aos sistemas, que não interferiram no processo. Borges et al. (2000) e Rumpel et al. (2006) relataram a presença dessas células sobre os grânulos de hidroxiapatita em processo de biodegradação, semelhante ao processo natural de reabsorção do tecido ósseo,

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sugerindo sua completa biodegradação durante a remodelação óssea. Não é apropriado comparar histomorfometricamente o grupo-controle com o grupo tratado, porque significaria avaliar a eficiência do compósito na regeneração de um defeito de tamanho não-crítico. Sabe-se que a utilização de substitutos ósseos só é indicada onde não é possível que a regeneração ocorra sem sua ajuda, ou seja, defeitos de tamanho crítico, o que no coelho está próximo de 15mm (Macneill et al., 1999). Avaliar as características de osseointegração e a osseocondução de um biomaterial em defeitos de tamanho crítico poderia levar a falsos resultados, visto que essas características sofrem influência de outros fatores além do biomaterial, como o dispositivo utilizado para fixação e a estabilidade do implante (Macneill et al., 1999; Boer et al., 2003). Portanto, à análise histomorfométrica, comparou-se a formação de tecido ósseo, o desejado, com a do tecido conjuntivo. Pode-se notar que, nos dias oito, 45 e 90, o percentual de tecido ósseo foi significantemente maior do que o de tecido conjuntivo (Tab. 1). Além disso, aos 90 dias, o percentual de tecido ósseo foi maior do que aos oito dias (Tab. 1). Percebe-se, assim, que a presença dos compósitos não afetou negativamente o desenvolvimento do tecido ósseo. Na interface, o percentual de tecido ósseo foi significantemente maior do que o de tecido conjuntivo aos 45 e 90 dias (Tab. 2), indicando a osseointegração do compósito, o que pode ser um reflexo da bioatividade da HAP-91® (Borges et al., 2000; Scarano et al., 2006). Analisando-se a formação de tecidos no interior do compósito, observou-se que a proporção de tecido ósseo aos 90 dias (7,6% ± 8,3) foi significantemente maior do que aos oito dias (0,5% ± 1,4), sendo que a própria presença destes tecidos dentro dos poros do biomaterial confirma sua osseocondutividade (Borges et al., 2000; Scarano et al., 2006). Não existiram diferenças significantes no número de osteoclastos entre os grupos, mas, entre oito e 90 dias, foram observadas diferenças significantes em ambos os grupos (Tab. 3). Esses dados reforçam que o compósito não interfere negativamente no desenvolvimento do tecido ósseo ao demonstrar uma evolução semelhante ao grupo-controle.

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Tabela 1. Médias e desvios-padrão das porcentagens de tecido ósseo e tecido conjuntivo formados nos defeitos ósseos experimentais na ulna de coelhos aos oito, 45 e 90 dias após a implantação de compósitos contendo 50% de HAP-91® e 50% de poli-hidroxibutirato

Tabela 2. Médias e desvios-padrão das porcentagens de tecido ósseo e tecido conjuntivo formados na interface com compósitos contendo 50% de HAP-91® e 50% de poli-hidroxibutirato, aos oito, 45 e 90 dias após a implantação em defeitos ósseos experimentais na ulna de coelhos

Tabela 3. Médias e desvios-padrão do número de osteoclastos presentes nos defeitos ósseos na ulna de coelhos aos oito, 45 e 90 dias após a cirurgia com implantação ou não (grupo-controle) de compósitos contendo 50% de HAP-91® e 50% de poli-hidroxibutirato

CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos e nas condições deste experimento, pode-se concluir que o compósito de 50% HAP-91® e 50%

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polihidroxibutirato é biocompatível, osseocondutor, integra-se ao tecido ósseo e é degradado in vivo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Dra. Sheyla M. C. M. Bicalho, da JHS Laboratório Químico – MG e ao Prof. Paulo Miranda Oliveira, pelo apoio e fornecimento do material. Também agradecem à CAPES, pela bolsa de mestrado da Emily Correna Carlo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOER, F.C.; WIPPERMANN, B.W.; BLOKHUIS, F.J. et al. Healing of segmental bone defects with granular porous hydroxyapatite augmented with recombinant human osteogenic protein-1 or autologous bone marrow. J. Orthop. Res., v.21, p.521-528, 2003. BORGES, A.P.B.; REZENDE, C.M.F.; RIBEIRO, M.F.B. et al. Hidroxiapatita sintética como substituto ósseo em defeito experimental provocado no proximal da tíbia de cão: aspectos à microscopia de transmissão. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.52, p.616-620, 2000. BORKENHAGEN, M.; STOLL, R.C.; NEUENSCHWANDER, P. et al. In vivo performance of a new bidegradable polyester urethane system used as a nerve guidance channel. Biomaterials, v.19, p.2155-2165, 1998. BRANDÃO, A.C.; BRENTEGANI, L.G.; NOVAES, A.B. et al. Histomorphometric analysis of rat alveolar wound healing with hydroxyapatite alone or associated to BMPs. Braz. Dent. J., v.13, p.147-154, 2002. CHENG, S.; CHEN, G.Q.; LESKI, M. et al. The effect of d,l-²̭hydroxybutyric acid on cell death

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and proliferation in L929 cells. Biomaterials, v.27, p.3758-3765, 2006. DOYLE, C.; TANNER, E.T.; BONFIELD, W. In vitro and in vivo evaluation of polyhydroxybutyrate and of polyhydroxybutyrate reinforced with hydroxyapatite. Biomaterials, v.12, p.841-847, 1991. DUARTE, T.S.; BORGES, A.P.B.; LAVOR, M.S.L. et al. Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães: aspectos histológicos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.58, p.849-853, 2006. KLEINER, J.A.; SILVA, E.G. Tumores ósseos em pequenos animais. MedVep, 2003. Disponível em: <http://www.vetweb.com.br>. Acessado em 3 jul. 2007. KNOWLES, J.C.; HASTINGS, G.W.; OHTA, H. et al. Development of a degradable composite for orthopaedic use: in vivo biomechanical of two bioactive degradable composites based on the polyhydroxybutyrate polymer. Biomaterials, v.13, p.491-496, 1 LUKLINSKA, Z.B.; BONFIELD, W. Morphology and ultrastructure of the interface between hydroxyapatite-polyhydroxybutyrate composite implant and bone. J. Mat. Sci. Mat. Med., v.8, p.379-383, 1997. MacNEILL, S.R.; COBB, C.M.; RAPLEY, J.W. et al. In vivo comparison of synthetic osseous graft materials. A preliminary study. J. Clin. Periodontol., v.26, p.239-245, 1999. RUMPEL, E.; WOLF, E.; KAUSCHKE, E. et al.The biodegradation of hydroxyapatite bone graft substitutes in vivo. Folia Morphol., v.65, p.43- 48, 2006. SA, M.J.C.; REZENDE, C.M.F.; SILVA JUNIOR, V.A. et al. In vivo behavior of zirconiahydroxyapatite (ZH) ceramic implants in

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dogs: a clinical, radiographic, and histological study. J. Biom. Applic., v.22, p.5-31, 2007. SCARANO, A.; DEGIDI, M.; IEZZI, G. et al. Maxillary sinus augmentation with different biomaterials: a comparative histologic and histomorphometric study in man. Implantol. Dent., v.15, p.197-207, 2006. SHISHATSKAYA, E.I.; KHLUSOV, I.A.; VOLOVA, T.G. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation. J. Biom. Sci. Polymer Ed., v.17, p.481-498, 2006. VITAL, C.; BORGES, A.P.B.; FONSECA, C.C. et al. Biocompatibilidade e comportamento de compósitos de hidroxiapatita em falha óssea na ulna de coelhos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.58, p.175-183, 2006. VOLOVA, T.; SHISHATSKAYA, E.; SEVASTIANOV, V. et al. Results of biomedical investigantions of PHB and PHA/PHV fibres. Bioch. Eng. J., v.16, p.125-133, 2003. WALSH, W.R.; SHEATH, P.J.C.; CAIN, S. et al. A resorbable porous ceramic composite bonegraft substitute in a rabbit metaphyseal defect model. J. Orthop. Res., v.21, p.655-661, 2003. YAMAMURO, T. Bone bond behavior and clinical use of A-W glass-ceramic. In: URIST, M.M.; O'CONNOR, B.T.; BURWELL, R.G. (Eds.). Bone grafts derivate and substitutes. Cambridge: Butterworth-Heinemann, 1994.p.245-259.

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V. 3:ESTUDO DA OSTEOCONDUÇÃO E OSTEOINDUÇÃO ATRAVÉS DA ASSOCIAÇÃO DE BIOCERÂMICA E COLÁGENO PARA FIXAÇÃO INTERNA DA ÓRBITA.

Publicado do V CONFIAM outubro 2009 Study of Bone Conduction and Osteoinduction Through the

Association of Bioceramics and Collagen for Internal Fixation of The Orbit.

Antonio Henrique M. Magalhães1*; Elifas Levy Nunes2; Silvana A. Schellini3.; Carlos Roberto Padovani4; Cláudia Helena Pellizzon5.

1Aluno de Graduação em Física Médica, IBB-UNESP 2Pós doutorando da FMB UNESP

3Depto de Oftal, Otorrinl e Cir Cabeça e Pescoço, FMB- UNESP. 4Depto de Bioestatistica, IBB-UNESP. 5Depto de Morfologia, IBB-UNESP.

*Autor correspondente: ahmmagalhaes@gmail.com

Resumo Pacientes vítimas de fraturas craniofaciais envolvendo a órbita e o zigomático, com perda do globo ocular apresentam, conseqüentemente ,deformidades faciais. Biomateriais podem ser utilizados como substitutivos ósseos e para facilitar a reparação óssea a medida que permitam osteogênese, osteoindução e osteocondução. O objetivo deste trabalho foi verificar histologicamente o efeito da associação entre hidroxiapatita associada ao colágeno na reparação de fraturas ósseas induzidas cirurgicamente no zigomático de coelhos.

Abstract

Patients suffering from craniofacial fractures involving the orbit and zygomatic arch, with loss of the eye therefore present facial deformities. Biomaterials can be used as bone substitute and to facilitate bone repair as to enable osteogenesis, osteoinduction and bone conduction. The objective of this study was to evaluate histologically the effect of the combination of hydroxyapatite

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combined with collagen in the repair of bone fractures surgically induced in rabbit zygomatic. Introdução Pacientes vítimas de fraturas craniofaciais envolvendo a órbita e o zigomático, com perda do globo ocular apresentam, consequentemente, deformidades faciais de grau relativo ao trauma sofrido, pois o complexo zigomático orbitário maxilar dá sustentação à tecidos moles suprajacentes. Intervenções cirúrgicas vão desde implantes e enxertos à procedimentos de estímulo ao crescimento facial (quando em crianças e adolescentes). [9] A Reconstituição dos pilares de sustentação facial pode ser realizada através de osteotomias com enxertos ósseos autógenos, retirados do próprio paciente, que embora possuam compatibilidade biológica tecidual, trazem consigo várias desvantagens como a absorção do enxerto a longo prazo e aumento da morbidade do ato cirúrgico. [9] Neste ponto, os Biomateriais podem ser utilizados como substitutivos ósseos e para facilitar a reparação óssea a medida que permitam osteogênese, osteoindução e osteocondução. Então, os biomateriais sintéticos ganham importância em biocompatibilidade, facilidade de aplicação e acondicionamento e podendo ainda favorecer o crescimento ósseo. [4] Hoje existem diversos estudos sobre a hidroxiapatita sintética (HAP) e embasam seu uso, em detrimento do enxerto ósseo, na correção de defeitos ósseos no homem e em várias outras espécies. Diversos autores relatam a biocompatibilidade da hidroxiapatita por possuir mesma estrutura química e cristalina do osso vivo, o que não ocorre com o colágeno, cujo efeito na substituição óssea, seja sozinho ou em associação não é totalmente elucidado, Vale ressaltar que o composto não possui propriedades osteoindutivas, sendo considerada um biomaterial osteocondutor.[4]

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Objetivo O objetivo deste trabalho foi verificar histologicamente o efeito da associação entre hidroxiapatita associada ao colágeno na reparação de fraturas ósseas induzidas cirurgicamente no zigomático de coelhos. Materiais e Métodos Por se tratar de um experimento com animais, primeiramente obtivemos junto ao Conselho de Ética na Experimentação Animal (CEEA-IBBUNESP) Protocolo 31/08. Foi utilizada hidroxiapatita em associação com colágeno na proporção de 75% de HAP e 25% de colágeno, devidamente esterilizadas em óxido de etileno. O estudo experimental foi realizado em 10 coelhos machos albinos adultos da espécie Orictolagus cuniculus com peso médio de 2,5 kg, clinicamente sadios, provenientes do biotério da Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina da Unesp. A cirurgia foi precedida por anestesia geral utilizando-se o anestésico Zoletil 50, associação de Tiletamina e Zolazepam. Os animais anestesiados foram posicionados para a tricotomia da face, onde foi procedida a incisão para exposição do osso zigomático, no qual foi induziu uma fratura longitudinal utilizando uma broca de 1 mm, e enxertou o material associado de hidroxiapatita e colágeno, cobrindo homogeneamente toda a extensão da fratura. P ara controle foi realizado o mesmo procedimento e sem estabilização da fratura. Os animais foram sacrificados após 30 dias de pós operatório com sobre dose do anestésico Zoletil 50 e amostras da região da fratura foram recolhidas e processadas para análise histológica, onde foram descalcificadas durante 48 horas (ácido fórmico 10% e tampão de citrato). Após ente procedimento as amostras foram lavadas em água corrente e incluídas em parafina para proceder-se os cortes histológicos em micrótomo de rotação posteriormente corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina. As análises procederam-se em microscópio de luz (marca LEICA).

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Nas amostras foi feito análise quantitativa medindo-se a espessura do osso regenerado e qualitativa avaliando a presença de tecido fibroso nas amostras. Resultados e Conclusão As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HAP) são bem documentadas na literatura, tendo sido utilizada na correção de defeitos ósseos em várias espécies [1], [5], [7], [10]. Em coelhos observamos que durante o período experimental não houve perda de peso ou qualquer alteração comportamental que comprometesse a integridade física dos animais, conforme ilustra a figura 1.

Figura 1: Evolução do peso das amostras ao longo do período de recuperação.

Com 30 dias de estabilização da amostra notamos que há uma nova formação do tecido ósseo, com grande deposição de matriz óssea e muitos osteócitos com aspectos morfológicos de síntese de matriz óssea, conforme a figura 2.

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Figura 2: Lâmina em H.E da região da fratura, após 30 dias. Comparado com as amostras dos animais controle, isto é, sem estabilização da lesão óssea, o material testado mostra-se bastante eficiente no processo de reparação óssea. Acreditamos que o processo de estabilização feito com hidroxiapatita em associação com colágeno na proporção de 75% de HAP e 25% de colágeno é bastante efetivo como observado na Tabela 1, com Média e Desvio padrão da espessura do osso segundo grupo. Tabela 1: Estatísticas, Média e desvio padrão dos grupos. Tratamento Controle Valor -p 1316,68 976,52 P = 0,033 (+/-)232,23 (+/-)244,13 Do exposto, no nível 5% de significância, utilizando a Metodologia Teste T de student para amostra independente [11], pode-se concluir que os grupos diferenciais quanto a espessura média do

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osso, que a reparação foi normal. Pelo descrito na literatura que esse material não tem efeito osteoindutor. [3], [6], [2] e [8]. Referências [1] ARAKAKI, M., YAMASHITA, S., MUTAF, M. et al. “Onlay silicone and hydroxyapatitetricalciumphosphate composite (HAP-TCP) blocks interfere with nasal bone growth in rabbits.” Cleft Palate-Craniof. J., v.32, p.282-289, 1995. [2] BORGES, A.P.B. “O efeito da hidroxiapatita sintética na regeneração óssea de defeito provocado experimentalmente no terço proximal da tíbia, de cães (Canis familiares). Estudo clínico-cirúrgico, radiológico e histológico por microscopia de luz e microscopia eletrônica de retrodispersão.” Belo Horizonte: Escola de Veterinária da UFMG, 1998. 112p. (Tese, Doutorado). [3] CALLAN, D.P., ROHRER, M.D. “Use of bovine-derived hydroxyapatite in the treatment of edentulous defects: a human clinical and histologic case report.” J. Periodontol., v.64, p.575-582, 1993. [4] FRANCO, K.L. et al . “Hidroxiapatita sintética pura, hidroxiapatita sintética associada ao colágeno e hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia de cães: aspectos da osteointegração à microscopia de luz transmitida.” Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 53,n. 4,Aug. 2001. [5] GEESINK, R.G.T., HOEFNAGELS, N.H.M. “Six-year results of hydroxyapatite-coated total hip replacement”. J. Bone Joint Surg. Br., v.77, p.534- 547, 1995. [6] HEIKKILA, J., AHO, A.J., YLI-URPO, A. et al. “Bioactive glass versus hydroxylapatite in reconstruction of osteochondral defects in rabbit”. Acta Orthop. Scand., v.64, p.678-682, 1993.

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[7] KVETON, J.F., FRIEDMAN, C.D., COSTANTINO, P.D. “Indications for hydroxyapatite cement reconstruction in lateral skull base surgery”. Am. J. Otology., v.16, p.465- 469, 1995. [8] REZENDE, C.M.F., BORGES, A.P.B., BERNIS, W.O. et al. “Aspectos clínico-cirúrgicos e radiográficos da hidroxiapatita sintética na diáfise proximal da tíbia de cães”. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.50, p.537-545, 1998. [9] TURRER, Clarissa Leite et al. “O uso de implantes de compósito bioativo de biocerâmica em matriz polimérica na reconstrução do complexo zigomático orbitário: novas perspectivas em biomateriais”. Arq. Bras. Oftalmol., São Paulo, v. 71, n. 2, Apr. 2008 . [10] YAMAGUCHI, K., HIRANO, T., YOSHIDA, G. et al. “Degradation-resistant character of synthetic hydroxyapatite blocks filled in bone defects”. Biomaterials, v.16, p.983-985, 1995. [11] ZAR, J.H. 1999. Biostatiscal analysis. Prentice-Hall, New Jersey.

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V.4: COMPÓSITO PARA FABRICAÇÃO DE IMPLANTES REABSORVÍVEIS PARA OSTEOSSÍNTESE: AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE EM COELHOS Ciência Rural, v.38, n.9, dez, 2008. Composite for the fabrication of resorbable implants for osteosynthesis: biocompatibility evaluation in rabbits Emily Correna Carlo1 Andrea Pacheco Batista BorgesI Luiz Gonzaga PompermayerI Mastoby Minguel Martinez Martinez2 Renato Barros EleotérioI Renata Castro NehmeI Gláucia Oliveira MoratoI RESUMO A biocompatibilidade, a osseointegração e a reabsorção de compósitos contendo 10% de hidroxiapatita (HAP-91®) e 90% de olihidroxibutirato foram analisadas após implantação em defeitos ósseos em coelhos. Foram obtidos dados clínicos, radiográficos, histológicos e histomorfométricos aos oito, 45 e 90 dias após a realização da cirurgia, sendo os resultados comparados aos de defeitos não-preenchidos. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos para os parâmetros clínicos avaliados. Radiografias demonstraram o compósito em contato direto com osso aos 45 e 90 dias. Tecido ósseo se formou normalmente no defeito e na interface com o material, quando comparado ao controle. Não foi observado infiltrado inflamatório. Em todos os dias, a porcentagem de tecido ósseo foi maior que a de tecido conjuntivo (P=0,001 aos 8 e 45 dias e 0,022 aos 90 dias) dentro dos defeitos. Foram observados tecidos ósseo e conjuntivo na interface com o compósito, sendo o último significativamente maior que o primeiro aos 90 dias (P=0,004). Foram observados sinais de reabsorção do compósito: células gigantes na superfície de fragmentos do compósito separados do bloco original.

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Portanto, pode-se concluir que o compósito é biocompatível em coelhos, reabsorvível e se integra ao tecido ósseo. Palavras-chave: biomateriais, implantes reabsorvíveis, fraturas ósseas, hidroxiapatita, polihidroxibutirato. ABSTRACT Biocompatibility, osseointegration, and resorption of a 10% hydroxyapatite (HAP-91®) - 90% polyhydroxybutyrate composite were analyzed after implantation in rabbits´ bone defects. Clinical, radiographic, histologic and histomorphometric data were collected on the 8th, 45th, and 90th days after surgery and the results were compared to those of unfilled defects. No significant differences between groups for the evaluated clinical parameters existed. Radiographs showed bone-composite direct contact. Bone tissue was formed normally in the defect and at the compositetissue interface when compared to the control. No inflammatory infiltrated was observed. For each sampling day, the percentages of bone were greater than those of connective tissues (P=0.001 on the 8th and 45th days and 0.022 on the 90th day) inside the defect. Bone and connective tissues were seen at the interface with the composite, being the last one significantly greater than the first on the 90th day (P=0.004). Composite’s resorption signs were evident: giant cells on the surface of composite fragments separated from the original bloc. Data support that such composite is biocompatible in rabbits, resorbable and integrate to bone. Key words: biomaterials, resorbable implants, bone fractures, hydroxyapatite, polyhydroxybutyrate. 1-Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa (UFV). Av. P.H. Rolfs, s/n, 36570-000, Viçosa, MG, Brasil. Tel.: (31) 9204-8050. Fax: 3899-2317. 2-Universidade de Córdoba, Córdoba, Colômbia. E-mail:emilycarlo@yahoo.com.br. Autor para correspondência

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INTRODUÇÃO

Atualmente, os implantes ortopédicos mais utilizados para estabilização de fraturas são placas e parafusos fabricados a partir de ligas metálicas, tais como as de titânio e aço inoxidável. A vantagem desses materiais é a grande resistência às diversas forças exercidas sobre eles. Contudo, esses materiais apresentam desvantagens, tais como propriedades mecânicas muito diferentes das do osso, que podem afetar a consolidação e a remodelação ósseas e a liberação de detritos citotóxicos responsáveis por hipersensibilidades, respostas inflamatórias contínuas e até mesmo neoplasias (ITO et al., 2005; RASSE et al., 2007). No mercado internacional, existem implantes ortopédicos biodegradáveis fabricados por diferentes processamentos e proporções de ácido poliláctico e ácido poliglicólico. Além disso, também há estudos relativos à implantação desses implantes. No entanto, podem ser citadas limitações como alto custo e baixa resistência mecânica, além de não permitir osteointegração e de existirem relatos de inflamação asséptica e osteólise associadas aos debris produzidos durante a degradação, (AN et al., 2000; RASSE et al., 2007). Este estudo investigou a resposta ao compósito associando a hidroxiapatita sintética HAP-91® ao polihidroxibutirato (PHB) desenvolvido com matérias-primas e tecnologia nacionais (OLIVEIRA, 2005) quando implantado em defeitos ósseos em coelhos, analisando características de biocompatibilidade, reabsorção e osseointegração. A HAP-91®, semelhante ao principal constituinte mineral do tecido ósseo, é bioativa, porém, friável. As características mecânicas do PHB são compatíveis com as do osso, mas este não é bioativo, importante para osteointegração. A associação desses biomateriais visou unir a bioatividade da hidroxiapatita às características mecânicas do PHB (BORGES et al., 2000; CHENG et al., 2006).

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MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia, pesando entre 3 e 3,5kg. Os animais estavam alojados em gaiolas individuais e recebiam dose única de ivermectina (0,4mg kg-1) por via intramuscular (IM) no dia de chegada, ou seja, 60 dias antes da realização das cirurgias. Eles receberam ração duas vezes ao dia e água ad libitum e foram separados aleatoriamente em dois grupos com igual número de animais, os grupos controle e teste. Os animais receberam penicilina G (40.000UI kg-1, IM) trinta minutos antes da cirurgia, foram sedados com levomepromazina (2mg kg-1, IM) e anestesiados com associação de tiletamina-zolazepam (15mg kg-1 de cada substância, IM). A região da diáfise do úmero até o carpo foi tricotomizada e foi realizado bloqueio anestésico do plexo braquial com 1,5ml de lidocaína a 2% após a anti-sepsia com povidine tópico. Foi realizada incisão de pele na superfície lateral da articulação úmero-rádio-ulnar e o músculo tríceps braquial foi afastado, expondo a superfície lateral do olécrano. Foi confeccionada uma falha óssea circular de 4mm de diâmetro na cortical lateral do olécrano, com o auxílio de uma broca trefina acoplada a uma perfuratriz elétrica sob irrigação com solução fisiológica estéril. Os compósitos com 10% de hidroxiapatita sintética (HAP 91® - JHS Laboratório Químico LTDA) e 90% de PHB, fornecidos com um formato retangular, foram cortados com a mesma broca trefina usada na confecção do defeito (4mm de diâmetro) para adequar o tamanho e o formato dos compósitos ao defeito. Os animais do grupo teste receberam o compósito dentro do defeito e os do grupo controle não tiveram os defeitos preenchidos. Os tecidos foram aproximados com fio de náilon. No pós-operatório imediato, foram realizadas radiografias nas posições mediolateral com a articulação úmero-rádio-ulnar. A medicação pósoperatória consistiu de morfina (2mg kg-1, IM) em dose única ou a cada seis horas, de acordo com o exame clínico, e a penicilina (40.000UI kg-1) a cada 24 horas por dois dias. Diariamente, nos primeiros oito dias e após 45 e 90 dias, foram realizadas avaliações clínicas a partir dos seguintes parâmetros:

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a) claudicação, de acordo com o apoio da extremidade do membro com os escores: 0 - sem claudicação, 1 - apoio com claudicação e 2 - ausência completa de apoio; b) presença ou ausência de infecção da ferida cirúrgica e deiscência; c) reação inflamatória, avaliando o edema quantitativamente pela mensuração da circunferência do membro no local da ferida cirúrgica e d) sensibilidade dolorosa, avaliada pela reação do animal ao toque da ferida cirúrgica e flexão e extensão da articulação úmero-rádio-ulnar, atribuindo-se os escores: 0 - quando não existiu manifestação do animal, 1 - retração do membro sem outra manifestação e 2 - retração do membro associada à vocalização ou à tentativa de fuga. A avaliação estatística para as variáveis infecção, claudicação, dor e deiscência consistiu na comparação entre os dias um, quatro e oito dentro de cada grupo e na comparação entre os grupos utilizandose, respectivamente, os testes estatísticos de Kruskal- Wallis e Mann-Whitney. A variável edema foi avaliada com teste de Wilcoxon. As médias das diferenças de circunferência foram comparadas entre os grupos com teste de Kruskal-Wallis. Em toda a análise estatística realizada no presente trabalho, o valor de P menor que 0,05 foi considerado significante. Compósito para fabricação de implantes reabsorvíveis para osteossíntese: avaliação da biocompatibilidade em coelhos. Nos dias oito, 45 e 90, foram realizadas duas radiografias de quatro animais de cada grupo na posição mediolateral. Esquemas em folhas de transparência foram confeccionados com círculos do exato tamanho dos defeitos, divididos em quatro quadrantes. Os esquemas sobrepostos às radiografias resultaram em defeitos com quatro quadrantes, avaliando-se separadamente a radiopacidade de cada um deles, caracterizada em menor, semelhante ou maior que a do osso vizinho. Foram observadas também as bordas do defeito/compósito, caracterizando se o limite entre o osso e o compósito podia ser bem estabelecido. Quatro animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia com sobredose anestésica em cada um dos dias oito, 45 e 90 após a

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cirurgia quando foram coletadas amostras do olécrano contendo o defeito. As amostras foram fixadas em formol 10% tamponado por três dias, descalcificadas em ácido fórmico a 10% tamponado com citrato de sódio para pH 4,5 sob vácuo moderado por 20 dias. Em seguida, as amostras foram seccionadas no sentido transversal ao eixo longo da ulna, no centro do defeito, para se obter a superfície de análise. Posteriormente elas foram lavadas em água corrente e então desidratadas, diafanizadas e incluídas em parafina (Laboratório de Patologia, DVT-UFV). Foram obtidos cortes de cinco ìm de espessura, que foram corados com azul de toluidina (AT) para análise à microscopia de luz. Em análise qualitativa, foram caracterizados os tecidos e as células presentes em toda a amostra. À histomorfometria, o número de osteoclastos presentes em 10 campos por amostra foi contado em aumento de 200X em ambos os grupos. Utilizando o teste estatístico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn’s, analisou-se a diferença entre os dias e Mann-Whitney para a diferença entre os grupos. Para analisar a formação do tecido ósseo na presença do compósito, foram quantificados percentualmente o compósito, o tecido ósseo, o tecido conjuntivo e a medula óssea presentes no interior do defeito com auxílio de ocular graduada em aumentos de 40X somente no grupo teste, utilizando para comparação apenas os tecidos ósseo e conjuntivo. Para analisar qual tecido predominou apenas na interface com o compósito, realizou-se a caracterização dos tecidos presentes na interface com uma ocular graduada em aumentos de 200X. Para tanto, foram considerados apenas os primeiros pontos de interseção imediatamente após o compósito em cada linha, permitindo a obtenção do percentual de tecido ósseo, medula óssea e tecido conjuntivo. A porcentagem média dos tecidos ósseo e conjuntivo presentes no defeito e na interface foram comparadas pelo teste de Mann-Whitney. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em quatro animais (três controles e um teste) houve necessidade de administrar outras duas doses de morfina durante o primeiro dia do pósoperatório, pois os pacientes demonstraram sinais clínicos de dor

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e claudicação. A partir dessas observações e considerando a natureza do procedimento ortopédico realizado, estudos futuros dessa natureza na espécie envolvida deverão ser acompanhados de rígido controle analgésico. Em duas amostras (45 e 90 dias), o compósito se separou do tecido adjacente no momento da microtomia, fato que pode ser explicado a partir de observações semelhantes de DOYLE et al. (1991) e LUKLINSKA & BONFIELD (1997). À microscopia eletrônica de transmissão e varredura, esses últimos autores observaram uma matriz de PHB em degradação na interface, responsável pela fratura e separação, atribuindo o problema ao início da reabsorção do material e não à quebra do implante. Essa hipótese foi confirmada à histologia como descrito a seguir. Além disso, após a descalcificação, o material ainda era rígido, o que dificultou a microtomia, permitindo a atuação das forças de arrasto desse procedimento no PHB em degradação (DOYLE et al., 1991). A contração dos tecidos durante o processamento histológico (DENISSEN & GROOT, 1990) também pode ter atuado no PHB em degradação na interface, contribuindo para a separação. Dor e claudicação foram observadas no primeiro dia após a cirurgia, ambas classificadas em grau 1. Foram observadas deiscência e infecção sem diferenças significativas entre os grupos. Houve diferença significativa entre os valores préoperatórios da circunferência do membro em relação aos valores do primeiro e quarto dias, com valores de P iguais a 0,01 e 0,039 no grupo controle e 0,002 e 0,039 no grupo teste, respectivamente, indicando a existência de aumento de volume em ambos os grupos. Não existiram diferenças significativas entre os valores do pós-operatório imediato e os dias oito, 45 e 90, assim como entre as médias das diferenças de circunferência dos membros entre os grupos. Esses dados sugerem que o compósito seja biocompatível e que a existência desses sinais se deveu à manipulação cirúrgica e não à presença do biomaterial (BORGES et al., 2000). Os defeitos no controle apresentaram radiopacidade menor que a do osso vizinho em todos os quadrantes no pós-operatório imediato e aos oito dias, com bordas bem delimitadas evoluindo para radiopacidade semelhante à do osso próximo ao defeito em 58,3%

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dos quadrantes aos 90 dias. Apesar do compósito apresentar radiopacidade inferior à do osso, era facilmente identificado a partir da observação de um halo menos radiopaco ao seu redor, nas radiografias do pós-operatório imediato e aos oito dias, correspondendo à distância entre a parede do defeito e o compósito. Esse halo foi resultado da utilização da mesma broca para fazer o defeito no osso e o corte do compósito, retirando do osso o diâmetro externo da broca e deixando o compósito com o diâmetro interno da mesma. Os tecidos presentes nesse halo menos radiopaco correspondiam ao coágulo imediatamente após a cirurgia e provavelmente aos tecidos moles, conjuntivo ou osso imaturo, aos oito dias, que participam da regeneração do tecido ósseo (BORGES et al., 2000). Nesses mesmos dias, as bordas foram bem delimitadas em todos os quadrantes. Aos 45 e 90 dias, não era possível delimitar 37,5 e 31,25% das margens dos quadrantes, respectivamente, onde não mais existia o halo menos radiopaco que o osso próximo ao defeito e os defeitos diminuíram de tamanho. Portanto, foi constatada a neoformação óssea nas bordas do compósito, reforçando a biocompatibilidade e indicando a osseointegração (DOYLE et al., 1991; KNOWLES et al., 1992; LUKLINSKA & BONFIELD,1997). A biocompatibilidade do compósito também foi confirmada pela histologia, já que em nenhuma das amostras foi observado infiltrado inflamatório, o que está de acordo com resultados de CHENG et al. (2006) e SHISHATSKAYA et al. (2006). Nas amostras do grupo controle, observou-se o processo normal de reparação óssea com numerosas trabéculas novas partindo da região medial ao defeito, com grande número de osteoblastos ativos e osteoclastos em suas margens, entremeadas por tecido conjuntivo denso vascularizado. Aos 45 dias o tecido ósseo apresentou-se mais organizado e aos 90 dias a cortical lateral do ólecrano estava restabelecida, com tecido ósseo trabecular organizado no centro. Os tecidos observados nos defeitos do grupo teste aos oito dias foram muito semelhantes ao grupo controle, também com intensa formação de tecido ósseo trabecular novo partindo da região medial ao defeito (Figura 1A), entremeado por tecido conjuntivo denso

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vascularizado, evoluindo aos 45 e 90 dias para um tecido ósseo trabecular mais organizado. À análise histomorfométrica, pode-se notar que em todos os dias o percentual de tecido ósseo formado foi significativamente maior que de tecido conjuntivo (Tabela 1), valor de P igual a 0,001 aos 8 e 45 dias e 0,022 aos 90 dias. Portanto, a presença dos compósitos não afetou negativamente o desenvolvimento do tecido ósseo, considerando: a neovascularização, a diferenciação de células osteoprogenitoras, a formação de novo osso e o remodelamento ósseo (BORGES et al., 2000; WALSH et al., 2003). Esses dados poderão embasar novos estudos referentes às características mecânicas in vivopara posterior fabricação de implantes. Não existiram diferenças significativas no número de osteoclastos entre os grupos. Foram observadas diferenças significativas no número dessas células entre oito e 90 dias dentro de cada grupo (teste: P=0,023 / controle: P=0,032). Esses dados reforçam que o compósito não interfere negativamente no desenvolvimento do tecido ósseo, já que os osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea, importante para a formação e a remodelação desse tecido (WALSH et al., 2003). A interface com o compósito constituiu tanto de tecido ósseo (Figura 1B) como conjuntivo (Figura 1C). Não existiu diferença significativa entre as porcentagens desses tecidos aos oito e 45 dias. O percentual de tecido conjuntivo foi significativamente maior que o percentual de tecido ósseo aos 90 dias (P=0,004) (Tabela 1). Esses dados podem ter sido influenciados por diferentes fatores, já que o tecido conjuntivo predominou na interface das regiões distal e proximal ao defeito e o tecido ósseo na região medial. A distância entre a parede óssea do defeito e o compósito pode ter permitido a invasão de tecido conjuntivo, fato que retarda ou até impede a formação do tecido ósseo (MACNEILL et al., 1999). A presença de grande quantidade de medula óssea na região medial ao defeito, origem de células osteoprogenitoras (BROWN & KRAMERS, 1996), pode ter influenciado a formação de tecido ósseo nessa região, o que não ocorre de forma tão pronunciada nas regiões proximal e distal, local de predominância de osso cortical.

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Fragmentos de compósito separados do bloco original em meio ao tecido ósseo adjacente estavam presentes nas bordas proximal, distal e medial ao defeito aos 90 dias, sugerindo a reabsorção do mesmo com separação de fragmentos do bloco original e sua possível e gradual substituição, corroborando os resultados de estudos anteriores (LUKLINSKA & BONFIELD, 1997; SHISHATSKAYA et al., 2006). Na região lateral ao compósito, os fragmentos estavam em meio a tecido mesenquimal com grande número de células blásticas, que apresentava continuidade com o tecido ósseo adjacente. Células gigantes foram observadas ao redor desses fragmentos e também osteóide, sugerindo a possibilidade de formação de tecido ósseo neste local. Células gigantes são responsáveis pela reabsorção de material e restos teciduais em locais de reparação, observadas tanto na reabsorção da hidroxiapatita como do PHB separadamente (BORKENHAGEN et al., 1998; BORGES et al., 2000; VOLOVA et al., 2003; SHISHATSKAYA et al., 2005). Desse modo, as características observadas sugerem o processo de reabsorção do compósito. Esse processo, observado aos 90 dias, é de grande importância, visto que um material para osteossíntese não deve ser reabsorvido antes da consolidação óssea, condição já observada em outros materiais reabsorvíveis, tais como o PGA puro (AN et al., 2000).

CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que o compósito de HAP-91® associado ao PHB nas condições descritas é biocompatível, se integra ao tecido ósseo e é reabsorvido in vivo, podendo-se prosseguir com novos estudos para posterior fabricação de implantes reabsorvíveis.

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a JHS Laboratório Químico, Sabará - MG, na pessoa da Dra. Sheyla Maria de Castro Máximo Bicalho, pelo apoio e fornecimento do material, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado de Emily Correna Carlo.

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COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA A metodologia deste trabalho foi aprovada pela Comissão de Ética do DVT / UFV, em consonância com o estabelecido pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), aprovada em 01/03/2007 e protocolada como processo no 37 / 2007.

Figura 1 - Fotomicrografias de regiões do defeito ósseo realizado no olécrano de coelho, após a implantação do compósito contendo 10% de HAP-91® e 90% de PHB. A - Região de interface medial ao defeito oito dias após a cirurgia. Notar a ausência de infiltrado inflamatório e tecido ósseo trabecular novo (tb). Medula óssea (mo). Azul de toluidina (AT), 100X. B - Região de interface medial ao defeito aos 90 dias após a cirurgia. Contato direto (seta) entre tecido ósseo (o) e compósito (c). AT, 100X. C - Região de interface proximal ao defeito aos 90 dias após a cirurgia. Tecido conjuntivo (seta) em contato com o compósito (c). Medula óssea (mo) e tecido ósseo (o). AT, 100X.

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Tabela 1 - Dados histomorfométricos da região de defeitos experimentais na ulna de coelhos aos oito, 45 e 90 dias após a implantação de compósitos contendo 10% de HAP-91® e 90% de PHB. Médias e desvios-padrão das porcentagens de tecido ósseo e tecido conjuntivo formados no interior dos defeitos ósseos e na interface (região de contato entre compósito e tecidos).

Dentro do defeito Interface Dia Tec. ósseo Tec. conjuntivo Tec. ósseo Tec.conjuntivo 8 42,3 ± 8,3 a 13,3 ± 8,8 b 29,9 ± 21,6 c 68,7 ± 21,6 c 45 52,7 ± 3,6 a 0 b 57,4 ± 14,8 c 24,4 ± 26,5 c 90 38,2 ± 3,7 a 0 b 18,4 ±1,3 c 74,3 ± 2,6 d Letras diferentes na mesma linha dentro de cada análise sinalizam diferença significativa pelo teste de Mann-Whitney, P<0,05.

REFERÊNCIAS

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CHENG, S. et al. The effect of d,l-²?hydroxybutyric acid on cell death and proliferation in L929 cells. Biomaterials, v.27, n. 20, p.3758-3765, 2006. DENISSEN, H.W.; GROOT, K. Immediate dental root implants from synthetic dense calcium hydroxyapatite. Journal of Prosthetic Dentistry, v.42, n.5 p.551-555, 1990. DOYLE, C. et al. In vitro and in vivo evaluation of polyhydroxybutyrate and of polyhydroxybutyrate reinforced with hydroxyapatite. Biomaterials, v.12, n.9, p.841-847, 1991. ITO, Y. et al. A composite of hydroxyapatite with electrospun biodegradable nanofibers as a tissue engineering material. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.100, n.1, p.43-49, 2005. KNOWLES, J.C. et al. Development of a degradable composite for orthopaedic use: in vivo biomechanical of two bioactive degradable composites based on the polyhydroxybutyrate polymer. Biomaterials, v.13, n.8, p.491-496, 1992. LUKLINSKA, Z.B.; BONFIELD, W. Morphology and ultrastructure of the interface between hydroxyapatitepolyhydroxybutyrate composite implant and bone. Journal of Material Science: Materials in Medicine, v.8, n.6, p.379-383, 1997. MACNEILL, S.R. et al. In vivo comparison of synthetic osseous graft materials. A preliminary study. Journal of Clinical Periodontology, v.26, n.4, p.239-245, 1999. OLIVEIRA, P.M. Desenvolvimento e caracterização de compósitos de matriz polimérica de PHB reforçados com HAP-91®. 2005. 148f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Materiais) - Curso de Pós-graduação em Engenharia de Materiais, Universidade Federal de Ouro Preto.

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RASSE, M. et al. Resorbable poly(D, L)lactide plates and screws for osteosynthesis of condylar neck fractures in sheep. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, v.45, n.1, p.35-40, 2007. SHISHATSKAYA, E.I. et al. Degradation of P(3HB) and P(3HB-co-3HV) in biological media. Journal of Biomaterial Science Polymer Edition, v.16, n.5, p.643- 57, 2005.

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V.5 :HIDROXIAPATITA ASSOCIADA À LIGNINA NO PREENCHIMENTO DE FALHA ÓSSEA

EXPERIMENTAL NA TÍBIA DE COELHOS r e v i s t a Ceres Jan/Fev 2008

HYDROXYAPATITE ASSOCIATED WITH LIGNIN IN THE FILLING OF EXPERIMENTAL BONE DEFECT

IN RABBIT’S TIBIA Cristiane Carneiro Vital1, Andréa Pacheco Batista Borges2

Cláudio César Fonseca2, Breno Gonçalves Camacho1 Renner Maia Negreiros1

ABSTRACT The objective of this work was to evaluate synthetic hydroxyapatite associated with lignin in solid form as substitute in bone regeneration. Twenty rabbits were divided into two groups of 10 animals each. Group one was treated with hydroxyapatite associated with lignin, whereas group two did not receive the implant. After routine anesthesia and surgical protocol, a circular bone fragment, 4.5 mm in diameter, was excised from the tibia from all animals of both groups. In the group one, the defect was filled with hal, but group two did not receive any treatment. The animals were clinically and radiographically examined daily immediately after the surgery and at four, eight, 15, 30 and 60 days after surgery to evaluate bone healing. At same time, two animals per time period were sacrificed and bone fragments were collected for histopathological evaluations. The results showed normal evolution 1Estudante de pós-graduação em Medicina Veterinária. Universidade Federal de Viçosa.CEP 36570-000 Viçosa, MG. E-mails: crisvital@gmail.com,brenocamacho@yahoo.com.br, ennermaia@hotmail.com 2 Departamento de Veterinária, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde/UFV. Av. P.H. Rolfs, s/n. CEP 36570-000 Viçosa, MG-Brasil. E-mails: andrea@ufv.br, fonseca@ufv.br

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in bone regeneration in both groups, although it was earlier in the group receiving hidroxyapatite up to the 30th day of observation. The use of hidroxyapatite associated with lignin as bone substitute was proven efficient, without inflammatory reaction and demonstrating to be biocompatible. Key words: hydroxyapatite, lignin, bone regeneration. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a hidroxiapatita sintética, associada à lignina (HAL), em forma de bloco, como substituta na regeneração óssea. Para tanto, foram utilizados 20 coelhos, divididos em dois grupos, com 10 animais cada. Após a realização de protocolo anestésico e cirúrgico rotineiro, foi retirado da tíbia direita um fragmento ósseo circular de 4,5 mm de diâmetro em todos os animais. No grupo I, o defeito foi preenchido com hidroxiapatita, o grupo II não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. Os tecidos foram incisados de maneira rotineira. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e radiográfica imediatamente após o procedimento cirúrgico e aos 4, 8, 15, 30 e 60 dias do pós-operatório. Nas mesmas datas, exceto no dia da cirurgia, dois animais de cada grupo foram sacrificados, objetivando a coleta de material para histologia. Os resultados mostraram evolução normal no processo de regeneração óssea nos dois grupos; entretanto, nos coelhos tratados o processo de reparação óssea mostrou-se mais adiantado nas observações de 15 e 30 dias, não havendo diferença entre os grupos na análise subseqüente. Com isso, conclui se que a hidroxiapatita associada à lignina como substituto ósseo é eficiente, não causando reação inflamatória e mostrando-se biocompatível. Palavras chave: hidroxiapatita, lignina, reparação óssea

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INTRODUÇÃO As enfermidades ósseas e as fraturas são um sério problema de saúde que afeta significantemente a qualidade de vida de seus portadores. Em muitos casos, o tratamento de falhas ósseas requer implantes (Kokubo et al., 2003). O emprego de biomateriais no reparo de partes danificadas do tecido ósseo tem revolucionado a ortopedia e odontologia atuais (Legeros, 2002, Duarte, 2003). O grupo de biomateriais que mais se assemelha à composição do osso é o das cerâmicas de fosfato de cálcio (Rezende et al., 1998, Legeros, 2002); dentre as quais a mais difundida é a hidroxiapatita (HAP), cuja estrutura química é representada pela fórmula C10(PO4)6(OH)2. A HAP tem sido produzida sinteticamente desde o início dos anos 1970 e tem sido usada clinicamente desde o início de 1980 (Legeros, 2002). As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética são bem documentadas na literatura. Ela tem sido estudada por se tratar de uma substância bioativa não tóxica que provoca pouca reação tecidual (Moreira et al., 2003). A hidroxiapatita já foi utilizada na correção de defeitos ósseos no homem e em várias espécies animais, com resultados satisfatórios o suficiente para ser indicada como alternativa para a enxertia óssea na rotina clínica de ambos (Franco et al., 2001; Legeros, 2002; Rezende et al., 1998). Por ter excelente capacidade osteocondutora e ser altamente biocompatível, a hidroxiapatita é ótima alternativa aos enxertos de osso esponjoso homólogo e autógeno em falhas ósseas tanto no ser humano como em animais domésticos (Rodrigues et al., 2003). A HAP é esterilizável e relativamente não-absorvível (Orr et al., 2001), é vantajosa por causa de sua composição uniforme, alta biocompatibilidade, segurança (não é tóxica, nem alergênica ou carcinogênica) e pelo fato de sua microestrutura (tamanho dos poros) ser completamente controlável (Nilson et al., 2004; Orr et al., 2001). A estrutura porosa da hidroxiapatita funciona como suporte passivo para a neoformação vascular, o que leva à proliferação de fatores indutores da aposição óssea (Borges et al., 2000). Segundo Orr et al. (2001), a superfície porosa da hidroxiapatita parece

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fornecer um substrato adicional à proliferação do tecido ósseo. Além de ser importante com relação à resistência do material, a porosidade da hidroxiapatita também regula mecanicamente os crescimento celular e vascular. Poros maiores favorecem a invasão de células e vasos, permitindo o crescimento ósseo (Orr et al., 2001). A hidroxiapatita possui pequena resistência mecânica, por esse motivo sua aplicação clínica é limitada a áreas onde não há suporte de peso ou há cavidades ósseas (Yasunaga et al., 1999). A lignina é um componente da parede celular das plantas lenhosas que lhes fornece rigidez e age como agente permanente de ligação entre as células. É um polímero complexo de elevado peso molecular constituído de unidades de fenil-propano. A lignina ocorre na maioria das plantas, mas sua composição não é idêntica em todas elas, já que apresenta variações em sua estrutura básica. A função biológica da lignina nas plantas vivas é formar, juntamente com a celulose e outros carboidratos da parede celular, um tecido de excelente resistência e durabilidade. Ela também reduz a permeabilidade da parede celular à água (Sjöström, 1993). Acredita-se que a associação da hidroxiapatita com a lignina resulte em um material com maior capacidade de aderência ao osso sem que haja desprendimento de calor, problema que ocorre quando se utilizam outros polímeros. O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência e a biocompatibilidade da hidroxiapatita sintética (HAP-91)3, associada à lignina em forma sólida, como substituto ósseo em falha provocada na tíbia de coelhos pela valiação de sua osseointegração, por meio de exames clínicos, radiológicos e histológicos.

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MATERIAL E MÉTODOS Para realização deste experimento, foram utilizadas 20 coelhas adultas, clinicamente sadias, da raça Nova Zelândia, provenientes do setor de cunicultura do Departamento de Zootecnia da UFV. Foram constituídos dois grupos aleatoriamente com 10 animais cada. Os coelhos do grupo I receberam hidroxiapatita associada à lignina (grupo tratado) e os animais do grupo II não receberam tratamento (grupo controle). Após a preparação adequada do campo cirúrgico e contenção anestésica dos animais, fez-se a sedação com acepromazina4 1% na dose de 0,2 mg/kg por via intravenosa e os anestesiaram com Bubivacaína5 a 0,5%, na dose de 0,5 mL/kg, por via epidural. Pelo espaço intervertebral lombo-sacro, foi feita incisão na face medial no terço médio do membro pélvico direito, expondo a tíbia por meio de incisão longitudinal da pele e afastamento do tecido muscular. Em seguida, foi produzido um orifício na cortical, na área da metáfise tibial proximal, utilizando-se uma broca trefina de 4,5 mm de diâmetro, no qual foi introduzido, então, um bloco circular de diâmetro igual ao da broca de HAL nos animais do grupo I. No grupo II esse defeito provocado não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. Os tecidos incisados foram suturados, utilizando-se náilon cirúrgico e padrão simples contínuo. Os animais foram submetidos a observações diárias da ferida cirúrgica durante uma semana, avaliando-se o grau de reação inflamatória baseado na presença de edema e dor, através de inspeção visual e pressão digital da área operada. Avaliou-se, ainda, também visualmente, a presença de hemorragia, de secreção purulenta e de deiscência de sutura. Para análise radiográfica foram realizadas radiografias dos membros operados nas posições mediolateral e craniocaudal em todos os 3 JHS Laboratório Químico LTDA. 4 Acepramâ Univet S.A., São Paulo, Brasil 5 BubiAbbottâ Abbott Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil

129

animais, imediatamente após a cirurgia e aos 4, 8, 15, 30 e 60 dias do pós-operatório. As radiografias foram analisadas quanto à radiopacidade e classificadas em diferentes graus, sempre comparando a falha óssea à cortical do osso circunvizinho, considerado normal (Tabela 1). Os resultados foram interpretados com auxílio de análise de variância não paramétrica, empregando-se o teste de Kruskal-Wallis. Tabela 1. Classificação do grau de radiopacidade na região da falha óssea de coelhos do grupo controle e do grupo tratado com hidroxiapatita associada à lignina Grau Caracterização Radiográfica

0

Radiopacidade intensamente menor do que a cortical do osso circunvizinho

1 Radiopacidade discretamente menor do que a cortical do

osso circunvizinho

2

Radiopacidade igual à cortical do osso circunvizinho

3 Radiopacidade maior do que a cortical do osso circunvizinho

Para análise histológica, dois animais do grupo controle e dois do grupo tratado foram sacrificados aos 4, 8, 15, 30 e 60 dias do pós-operatório com super dosagem de pentobarbital sódico, a fim de se coletarem amostras da região operada. Para tanto, o membro operado foi amputado na articulação coxofemoral e, em seguida, fixado em solução de formol 10% tamponado por 24 horas, após o que foi realizada a coleta de material de aproximadamente 1,0 cm3 na região em que se trabalhou cirurgicamente. As amostras foram processadas segundo técnicas rotineiras de histologia e coradas em

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H-E e foram examinadas ao microscópio óptico. Os resultados histológicos foram interpretados por meio de análise descritiva. RESULTADOS E DISCUSSÃ0 Algumas horas após a cirurgia, todos os animais apresentaram deambulação normal, estando esse fato de acordo com o observado por Rezende et al. (1998) e Franco et al.(2001), mesmo se considerando o fato de que foram utilizados modelos experimentais diferentes nestes trabalhos. Em dois animais do grupo controle e em um do grupo tratado observou-se secreção purulenta, um dia após a cirurgia, no local da incisão. O fato de tanto os animais do grupo controle quanto os do grupo tratado terem apresentado sinais locais de infecção atribui-se ao trauma tecidual causado pela técnica cirúrgica, ou mesmo pela ocorrência de infecção no período pós-cirúrgico, já que não se utilizou nenhum tipo de medicação preventiva e não à reação ao implante, como descrito por Borges et al.(2000). A presença de secreção foi controlada com a simples limpeza da ferida cirúrgica, tendo essa não interferido no processo cicatricial da pele e desaparecido espontaneamente após alguns dias. Os resultados radiográficos dos animais do grupo controle obtidos imediatamente após a cirurgia revelaram radiopacidade grau 0 na região do defeito, uma vez que a falha óssea experimentalmente produzida foi mantida sem qualquer preenchimento. Essa radiopacidade foi gradualmente aumentando até apresentar grau 3, aos 60 dias de pós-operatório (Fig. 1A, B e C). Já no grupo tratado, observou-se, no mesmo período, radiopacidade semelhante à cortical do osso vizinho, ou seja, grau 2. Nas radiografias feitas aos 4, 8, 15, 30 e 60 dias, a radiopacidade da hidroxiapatita foi gradualmente diminuindo até apresentar grau 1 (Fig. 2A, B e C). Esse fenômeno era esperado e foi descrito por Borges et al. (2000), devido à invasão de tecido conjuntivo no processo normal de reparação óssea. Deve-se considerar ainda que não há alteração na densidade da hidroxiapatita, uma vez que seu número atômico não se altera.

131

Entretanto, o crescimento dos tecidos conjuntivo e ósseo ao longo do tempo e ao redor das partículas de hidroxiapatita contribui para diminuição de sua radiopacidade (Rezende et al., 1998). Ao mesmo tempo em que acontecia a diminuição da radiopacidade da hidroxiapatita, o osso em formação tornava-se cada vez mais radiopaco, apresentando radiopacidade semelhante à do osso normal aos 60 dias de pós-operatório (Fig. 2C). Considerando-se somente os aspectos radiográficos, não parece ter havido diferença na velocidade da reparação óssea entre os grupos controle e tratado, o que também foi observado por Franco et al. (2001). A lignina não pareceu interferir negativamente no processo de reparação, já que aos 60 dias observaram-se indícios radiográficos de que a falha óssea estava completamente preenchida por tecido de reparação semelhante ao tecido ósseo em todos os animais do grupo tratado. Este fato está de acordo com o descrito por Borges et al. (2000), que aos 60 dias de pós operatório observaram reparação óssea completa na tíbia dos animais tratados com hidroxiapatita pura. Os resultados dos exames histológicos revelaram que nos locais em que foram produzidas as falhas ósseas, nos dois grupos, não foi observada infecção pós-cirúrgica, apesar de ter sido verificada secreção purulenta no local da incisão no período pós-operatório de alguns animais. Esse fato indica que a reação inflamatória observada no período pós-operatório limitou-se à pele e aos tecidos subcutâneos. Além disso, no grupo tratado não se observou reação de rejeição ao implante, estando esses resultados de acordo com o descrito por Yasunaga et al. (1999) e Cehreli et al. (2003), indicativos da biocompatibilidade da HAL.

132

Figura 1. Radiografia da tíbia de coelhos do grupo controle em posicionamento mediolateral. A - 4 dias, radiopacidade grau 0; B - 30dias, radiopacidade grau 1; e C - 60 dias, radiopacidade grau 2. A seta evidencia o defeito ósseo.

Figura 2. Radiografias da tíbia de coelhos tratados com hidroxiapatita associada à lignina em posicionamento craniocaudal (B) e mediolateral (A e C). A, dia 0, radiopacidade grau 2; B, 15 dias, radiopacidade grau 1; e C, 60 dias, radiopacidade grau 1. Seta: HAL preenchendo o defeito ósseo.

133

Aos quatro dias do pós-operatório, tanto no grupo controle quanto no tratado não havia qualquer indicação de formação óssea, porém tinha grande quantidade de osteoblastos nas bordas da lesão. No oitavo dia de pós-operatório, foram observados nos animais do grupo controle início de reabsorção das bordas do defeito e tecido conjuntivo frouxo na sua superfície (Fig. 3A), assim como descrito por Franco et al. (2001) e Duarte (2003). Já no grupo tratado, aos oito dias observou-se tecido conjuntivo frouxo, desorganizado nas bordas do defeito, e tecido conjuntivo fibroso ao redor das partículas de hidroxiapatita (fig. 3B). Foi verificada pequena área de neoformação óssea circundando o implante. O atraso no grupo tratado, quando comparado ao grupo controle, pode ser devido à inibição inicial da formação óssea pela presença da hidroxiapatita, que em primeiro momento atua como barreira física, assim como descrito por Duarte (2003).

Figura 3. Fotomicrografias da tíbia de coelho dos grupos controle (A) e tratado (B) aos oito dias de pós-operatório. HAL: hidroxiapatita associada à lignina; OT: osso trabecular; e TG: tecido de granulação No grupo tratado foi observado, aos 15 dias de pósoperatório, que a hidroxiapatita estava praticamente envolvida por osso trabecular (fig. 4F), o que também foi por Lopes et al. (2000), e havia a presença de tecido conjuntivo denso e intensa vascularização. Nos animais do grupo controle também se observou formação de tecido

134

ósseo trabecular a partir das bordas da lesão. Entretanto, o tecido ósseo formado nos animais do grupo tratado, aos 15 dias, mostrou-se mais organizado e com trabéculas ósseas mais espessas do que o tecido formado nos animais do grupo controle (fig. 4A e B). Aos 30 dias após a cirurgia, os animais de ambos os grupos mostraram tecido ósseo trabecular preenchendo toda a falha (fig. 4C e D), como descrito por Lopes et al. (2000) e Franco et al. (2001). Na observação de 30 dias pôde-se constatar, assim como descrito aos 15 dias, formação óssea mais evidente no grupo tratado, evidenciando-se trabéculas ósseas mais espessas e sistemas de Havers mais organizados, fato este indicativo da característica osteocondutora da HAL, sugerindo um processo de reparação óssea mais adiantado. Aos 60 dias, tanto no grupo controle quanto no tratado observou-se extensa formação óssea, tendo esse tecido se mostrado mais desenvolvido do que aos 30 dias (Fig. 4E e F). Embora na presença do implante a resposta óssea tenha sido mais evidente nas observações de 15 e 30 dias, o tempo necessário para a regeneração óssea foi o mesmo tanto no grupo controle quanto tratado.

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Figura 4. Fotomicrografias da tíbia de coelho dos grupos controle (A, C e E) e tratado (B, D e F). A, 15 dias; 35x. B, 15 dias; 37x. C, 30 dias; 35x. D, 30 dias; 31x. E, 60 dias; 57x; F, 60 dias; 50x. HAL: hidroxiapatita associada à lignina; OC: osso compacto; OT: osso trabecular; e TG: tecido de granulação CONCLUSÃO Com base nos resultados clínico-cirúrgicos, radiográficos e histológicos, pôde-se obter as seguintes conclusões. • A hidroxiapatita, associada à lignina, mostrou-se biocompatível, sendo um substituto ósseo eficiente, não provocando qualquer tipo de reação inflamatória ou de rejeição do implante, não alterando o tempo necessário para que ocorresse a reparação óssea. • Na presença do implante, a resposta óssea foi mais evidente nas observações de 15 e 30 dias, tendo, portanto, acelerado o processo de regeneração. AGRADECIMENTOS À JHS Laboratório Químico Ltda. pelo fornecimento do produto testado REFERÊNCIAS Borges APB, Rezende CMF, Ribeiro MB, Melo, EG, Nobrega Neto PIN. (2000) Hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo em defeito experimental provocado no terço proximal da tíbia em cão: aspectos à microscopia eletrônica de transmissão. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, 52:616-620. Cehreli MC, Sahin S, Kesenci K. (2003) Biological reactions to a poly (L-lactide)-hidroxiapatite composite: A study in canine mandible. Journal of Biomaterials Application, 17:265-276. Duarte TS (2003) Osseointegração da hidroxapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães. Tese de Mestrado. Viçosa, Universidade Federal de Viçosa. 58p.

136

Franco KL, Borges AB, Vilória, MIV, Fernandes, ES; Felberg, AF (2001) Hidroxiapatita sintética pura, hidroxiapatita associada ao colágeno e hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia de cães: aspectos da osteointegração à microscopia de luz transmitida. Arquivos Brasileiros de Medicina Veterinária e Zootecnia, 53:431-436. Kokubo T, Kim H & Kawashita M (2003) Novel bioactive materials with different mechanical properties. Biomaterials, 24:2161-2175. Legeros RZ (2002) Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates. Clinical Orthopaedics and Related Research, 395:81-98. Lopes MA, Santos JD, Monteiro FJ (2000) Push-out testing and histological evaluation of glass reinforced hydroxyapatite composites implanted in the tibia of rabbits. Journal of Biomedical Material Research, 54:734-740. Moreira ASB, Pastorelli MT, Damasceno LHF (2003) Estudo experimental da influência das dimensões dos grânulos de hidroxiapatita na integração óssea. Acta Ortopédica Brasileira 11:240-250. Nilson M, Wang JS, Wielanek L (2004) Biodegradation and biocompatibility of a calcium sulphate-hydroxyapatite bone substitute. Journal of Bone and Joint Surgery (British Volume), 86-B:120-125. Orr TE, Villars PA, Mitchell SL (2001) Compressive properties of cancellous bone defects in a rabbit model treated with particles of natural bone mineral and synthetic hydroxyapatite. Biomaterials, 22:1953-1959. Rezende CMF, Borges APB, Bernis, WB, Melo, EG, Nobrega Neto, PI (1998) Aspectos clínicos-cirúrgicos e radiográficos da hidroxiapatita sintética na diáfise proximal da tíbia de cães.

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V. 6 :OSSEO INTEGRAÇÃO: CLÍNICA-RADIOLÓGICA DO COMPÓSITO HIDROXIAPATITA-LIGNINA ENTRE IMPLANTE METÁLICO E TECIDO ÓSSEO EM COELHO

Arq.Brasl.de Med e Zootec [Clinical-radiographic osseointegration of hydroxyapatite-lignin

composite between metallic implant and bone tissue in rabbit]

M.M. Martinez1,2, A.P.B. Borges3*, L.G. Pompermayer3, E.C. Carlo1, L. M. Vilela1, D.M. Rates4,

G.O. Morato4, R.B. Eleotério4, S.M.C.M. Bicalho5

1Aluno de pós-graduação - UFV – Viçosa, MG 2Universidade de Córdoba – Córdoba, Colômbia

3Departamento de Veterinária - UFV Av. P.H. Rolfs, s/n

36570-000 – Viçosa, MG 4Aluno de Graduação - UFV – Viçosa, MG

5JHS Laboratório Químico Ltda – Belo Horizonte, MG

RESUMO Para avaliar o compósito hidroxiapatita-lignina na osseointegração entre implante metálico e o tecido ósseo, foram utilizados 20 coelhos adultos, nos quais foi realizada uma falha óssea na face lateral proximal de ambas as tíbias. Na tíbia esquerda, introduziu-se, no canal medular, um pino intramedular de Schanz revestido com o compósito em sua parte rosqueada, após o preenchimento daquele com 1000mg do compósito. A falha cortical foi preenchida com o compósito. O mesmo foi feito na tíbia direita, porém sem a utilização do compósito, servindo como controle. A avaliação clínica baseou-se na deiscência, claudicação, sensibilidade dolorosa e circunferência tibial. Foram realizadas radiografias imediatamente após a cirurgia e aos oito, 30, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório. A

Recebido em 28 de março de 2008 Autor para correspondência (corresponding author) E-mal: andréa@ufv.br

139

maioria dos animais apresentou evolução clínica normal. Nas radiografias do grupo tratado, houve decréscimo da radiopacidade no defeito e no espaço medular até tornar-se semelhante à do osso circunvizinho, quadro inverso ao do grupo-controle. Conclui-se que o compósito hidroxiapatita-lignina não mostrou indícios clínicos de rejeição e que o tecido visualizado na altura da falha óssea e ao redor do pino intramedular tinha radiopacidade semelhante à do osso circunvizinho, o que sugere que o material promoveu a integração com o tecido ósseo. Palavras-chave: coelho, osseointegração, compósito, implante, hidroxiapatita, lignina

ABSTRACT

This study evaluated a sinthetic hydroxyapatite-lignin composite for osseoingration between metallic implant and bone tissue. Twenty New Zealand rabbits were used. A defect was made a the proximal region of lateral surfaces of both tibias. An intramedullary pin was inserted in the medullary cavity of the left tibia after filling the cavity with 1,000mg of the composite and covering the thread part of the pin with the composite. The same procedure was made in control tibias without the composite. Clinical evaluation was based on inflammatory reaction, dehiscence, lameness, pain, and tibial circumference. Radiographs were made immediately after surgery and then on days eight, 30, 60, 90, and 120. Most of the animals presented normal clinical progression. Radiographies of treated group showed decrease in the defect and medullary cavity radiopacity to the same pattern of the surrounding bone, while the contrary happened in control group; but, in this group, the medullary cavity remained radioluscent at the last observation date. It can be concluded that the hydroxyapatite-lignin composite did not show clinical signs of rejection and that radiopacity of the tissue in the bone defect and surrounding the pin was similar to bone radiopacity, suggesting that the material promoted osseointegration.

140

Keywords: rabbit, osseointegration, composite, implant, hydroxyapatite, lignin

INTRODUÇÃO O afrouxamento de pinos em fraturas e os efeitos adversos sobre o tecido ósseo de algum biomaterial utilizado na fixação de próteses articulares levam à procura de alternativas no campo da implantologia e ortopedia veterinária e humana. Por esse motivo os implantes metálicos estão sendo revestidos com hidroxiapatita para conseguir fixação adequada no menor tempo possível (Furlong, 1998), mas as técnicas de revestimento encarecem os custos e, sobretudo, podem modificar a estrutura da hidroxiapatita e afetar sua biocompatibilidade. A estrutura porosa da hidroxiapatita funciona como suporte passivo para a angiogênese, que leva fatores indutores da aposição óssea. Sua superfície porosa parece fornecer um substrato adicional à proliferação do tecido ósseo, permitindo a junção, proliferação, migração e expressão fenotípica de células ósseas, o que resulta em formação de novo osso, em oposição direta ao biomaterial. (Franco et al., 2001; Legeros, 2002; Perez et al., 2005; Vital et al., 2006). A lignina é um componente da parede celular das plantas lenhosas que fornece a elas rigidez e atua como agente permanente de ligação entre as células. É um polímero complexo de elevado peso molecular, constituído de unidades de fenil-propano (Sjöström, 1993). Um compósito de hidroxiapatita sintética associada à lignina poderia unir a bioatividade da primeira com as propriedades ligantes celulares do último. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da hidroxiapatita associada à lignina (HAP-91®-L) no processo de osseointegração entre um implante metálico e o tecido ósseo em coelhos adultos da raça Nova Zelândia, utilizando como recursos a avaliação clínico-cirúrgica e radiográfica.

MATERIAL E MÉTODOS

A metodologia deste trabalho utilizando animais experimentais foi analisada pela Comissão de Ética do DVT/UFV, aprovada em

141

03/05/2007 e protocolada como processo n.°58/2007. Utilizaram-se 20 coelhos machos da raça Nova Zelândia, com idades entre 10 e 12 meses e pesos entre 4 e 5kg. Os animais selecionados foram alojados em gaiolas individuais onde receberam uma dose única de

0,2mL ivermectina1 a 1% pela via subcutânea, ração comercial duas vezes ao dia e água ad libitum. O compósito foi constituído por 99% de hidroxiapatita sintética

(HAP-91)2 e 1% de lignina, em forma de blocos de 4,5mm de diâmetro e 200mg de peso. No pré-operatório, os animais foram mantidos em jejum hídrico e sólido de 12 horas e receberam

40.000UI/kg de penicilina3 sódica e procainica, por via intramuscular, 30 minutos antes da indução anestésica.

Posteriormente, foram sedados com levomepromazina4 na dose de

2mg/kg e anestesiados com tiletamina e zolazepam5 na dose de 20mg/kg, ambos também pela via intramuscular. A região dos membros pélvicos, do terço proximal do fêmur até o terço distal da tíbia foi tricotomizada e desengordurada com éter. A anestesia dissociativa se complementou com a técnica epidural lombossacra

utilizando-se lidocaína6 a 2% em associação com a epinefrina7 na dose de 1mL/4kg. Em seguida, os animais foram posicionados em decúbito lateral direito. A abordagem cirúrgica, baseada na técnica descrita por Piermattei et al. (2006) para animais de pequeno porte e adaptada para coelhos, constou dos seguintes tempos cirúrgicos: incisão cutânea, tecido subcutâneo e fascia lata, parapatelar lateral desde o terço distal do fêmur até a diáfise proximal da tíbia, afastamento

1Mogimec 1%® - Mogivet Produtos Agro Veterinários Ltda. - São Paulo, Brasil. 2HAP 91® - JHS Laboratório Químico - Sabará, Brasil. 3Megacilin® - Agener União - Embu-Guaçú, Brasil. 4Neozine® - Sanofi- Aventis - São Paulo, Brasil. 5Zoletil 50® - Virbac do Brasil - São Paulo, Brasil. 6Lidocaína 2%® - Hipolabor - Sabará, Brasil. 7Adren®- Hipolabor - Sabará, Brasil.

142

caudal da musculatura craniolateral da tíbia e exposição do periósteo. Logo após, realizou-se uma falha óssea na parte central da face lateral proximal da tíbia de, aproximadamente, 4mm de diâmetro e profundidade suficiente para atingir o canal medular, com o auxílio de uma furadeira manual e broca de igual diâmetro. Em um mesmo animal, considerou-se a tíbia esquerda como tratada com o compósito HAP-91–L e a tíbia direita como controle. No grupo tratado foi introduzido pelo defeito cortical um pino

intramedular de Schanz em aço F 1389 de calibre de 1mm com o intuito de descolar a medula óssea e irritar o endósteo por meio de movimentos de fricção repetitivos. Ainda, para favorecer a retirada da medula óssea, injetaram-se 10cm de ar dentro do canal medular com o auxílio de uma seringa descartável e um cateter vênular de calibre 16, retirando-a na maior quantidade possível. Em um recipiente, cinco comprimidos (1000mg) do compósito HAP-91–L foram amolecidos com solução fisiológica 0,9% numa relação de duas gotas por comprimido, resultando em massa de consistência fluida a qual foi introduzida no canal medular por meio de seringa e cateter calibre 16 (Fig. 4B). Parte dessa massa foi usada também para revestir a extremidade rosqueada do pino intramedular de Schanz em aço F 138 de diâmetro 2,5mm para osso cortical. O pino foi medido, por meio da radiografia prévia da tíbia, desde o local determinado para se fazer o orifício até a epífise distal tibial, mantendo o comprimento de 7cm em todos os animais. Logo após o pino ter sido cortado, ele foi introduzido pelo defeito cortical, e o seu calibre foi suficiente para ocupar, aproximadamente, 90% da cavidade medular. Em seguida, o mesmo compósito em forma de bloco (400mg) foi utilizado para preencher o defeito ósseo. O grupo-controle foi submetido aos mesmos procedimentos que o grupo tratado, com exceção da introdução do compósito de HAP-91®–L no canal medular e no defeito cortical. Os tecidos incisados foram suturados de maneira rotineira.

9Kalmedica Ltda. - Belo Horizonte, Brasil.

143

No pós-operatório, os animais, submetidos à antissepsia da ferida cirúrgica, receberam morfina10, 3mg/kg a cada 12 horas, durante dois dias, pela via subcutânea, e 40.000UI/kg de penicilina a cada 24 horas, durante dois dias, por via intramuscular, como analgésico e antibiótico terápico, respectivamente. Para avaliação clínica, os animais foram observados por 15 dias. Avaliou-se o grau da claudicação na marcha, considerando como grau 0 quando não claudicava; grau I (claudicação moderada) quando se apoiava na planta do pé e grau II (claudicação intensa) quando o apoio se dava em abdução, com sustentação do peso no membro contralateral e nos membros anteriores. Para avaliar a dor e o desconforto, procedeu-se à palpação da área operada com as seguintes observações: classificada como grau 0, com ausência de dor e nenhum tipo de reação ao toque digital da área operada; grau I para animais que manifestaram dor caracterizada pela presença de alguns sinais como vocalização, dilatação pupilar e/ou aumento dos movimentos respiratórios, sem retração do membro pélvico após o toque digital; e grau II, quando, além das características de dor grau I, o animal puxava a extremidade ao toque digital e mostrava-se indiferente ao ambiente e sem interesse pelo alimento. Para determinar o aumento e a diminuição de edema, mediu-se a circunferência da região tibial com o auxílio de uma fita métrica no ponto médio entre as articulações do joelho e a articulação tibiotarsal. A deiscência da ferida e a secreção purulenta foram analisadas descritivamente e classificadas como ausente ou presente. Os resultados da claudicação, da dor e circunferência da diáfise da região tibial foram interpretados comparando-se cada data de observação entre os grupos tratados e controle com a análise estatística realizada pelo teste de Friedman, significância fixada em P<0,05. A evolução foi analisada comparando-se as datas dentro de cada grupo pelo teste de Dunn, também com significância estatística fixada em P<0,05. O comportamento da claudicação e da

10Dolo moff injetavel 10mg/mL - União Química. - Pouso Alegre, Brasil.

144

circunferência da diáfise da região tibial para ambos os grupos foi representado por meio de uma linha de tendências. Para análise radiográfica do defeito cortical e o redor do pino intramedular, foram realizadas radiografias da região tibial nas projeções mediolateral e craniocaudal, imediatamente após a cirurgia e aos oito, 30, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório. A técnica radiográfica foi padronizada (45Kv, 100mA e 0,03s), e as radiografias analisadas quanto à radiopacidade, classificando-as em diferentes graus, sempre comparando os locais de implantação com o osso circunvizinho. Os resultados foram interpretados comparando-se cada data de observação entre os grupos tratados e controle com análise estatística realizada pelo teste de Friedman, significância fixada em P<0,05. As datas dentro de cada grupo foram analisadas pela análise de variância, também com significância estatística fixada em P<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos primeiros cinco dias pós-operatórios, todos os animais operados apresentaram claudicação e dor à palpação, começando um processo de regressão a partir do sexto dia, fato que difere de Borges (1998), Rezende et al. (1998), Franco et al. (2001) e Vital et al. (2006), que observaram apoio normal dos membros operados poucas horas após a cirurgia. Ao final do período de observação, todos os animais apresentaram recuperação do processo, com exceção de um coelho, que continuou claudicando, possivelmente devido à formação de um tecido granulomatoso em resposta ao náilon de sutura. Não houve diferença perceptível entre os animais dos dois grupos, o que sugere uma possível biocompatibilidade do compósito, demonstrada também por Vital et al. (2006). A análise estatística indicou que não ocorreram diferenças entre o grupo-controle e o tratado. Comparando-se as datas de observação dentro de um mesmo grupo, não houve diferença desde o primeiro até o quinto dia de avaliação, nem do sexto ao 15º dia, de acordo com o teste de Dunn.

145

A tendência da claudicação dos membros pélvicos, tal como se mostra na Fig. 1, seguiu um comportamento linear decrescente em função do tempo, explicado pela seguinte equação linear: y = - 1,7679x + 25,276 (R2 = 0,9282), em que: y = número de coelhos claudicantes; x = unidades em dias.

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Dias de pós-operatório

Nº

de c

oelh

os

Figura 1. Linha de tendências da claudicação dos coelhos do grupo tratado com hidroxiapatita sintética-lignina e do grupo-controle, avaliados clinicamente durante 15 dias de pós-operatório. O coeficiente de determinação indicou que este comportamento da claudicação dos membros pélvicos no período do tempo estudado, para os dois grupos, está explicado em 92% pela equação linear. A tendência de o edema desaparecer ao final da avaliação deu-se em ambos os grupos e está de acordo com as observações clínicas de Borges (1998) e de Vital et al. (2006), que não verificaram diferença entre os grupos testados. Esse fato é sugestivo de que o compósito não influiu negativamente na resposta inflamatória. A similaridade química entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, provavelmente, contribuiu para isso.

146

A tendência da circunferência da região tibial, tal como se mostra na Fig. 2, seguiu um comportamento linear decrescente em função do tempo, explicado pela seguinte equação quadrática: y = 0,0082X2 – 0,1849X + 9,0269 (R2 = 0,99), em que: y = média da diáfise da região tibial em cm; x = unidades em dias. Figura 2. Linha de tendências da diáfise da região tibial (cm) de coelhos do grupo tratado com hidroxiapatita sintética-lignina e do grupo-controle, avaliados clinicamente durante 15 dias de pós-operatório.

O coeficiente de determinação indicou que esse comportamento da circunferência da diáfise da região tibial no período de tempo estudado para os dois grupos, está explicado em 99% pela equação quadrática. Em apenas nove membros operados ocorreu deiscência da ferida (22,5%), dos quais cinco (55%) eram do grupo tratado e quatro do grupo-controle (44%), sendo que, em todos eles, observou-se

7,9

8

8,1

8,2

8,3

8,4

8,5

8,6

8,7

8,8

8,9

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tempo (Dias)

cm

147

secreção purulenta procedente dos tecidos moles mais superficiais e com tendência a desaparecer ao final da avaliação clínica. Estes resultados assemelham-se aos obtidos por Vital et al. (2006) e diferem dos descritos por Moraes (2002) e Cehreli et al. (2003), que não observaram este sinal no pós-operatório. A ocorrência de deiscência da ferida, tanto em animais do grupo-controle quanto em animais do grupo tratado, se deveu, provavelmente, ao local da cirurgia, onde as tensões pelos movimentos de flexão e extensão, tanto na estática como na dinâmica, causaram a deiscência da ferida com posterior complicação infecciosa do local cirúrgico, e não a uma possível reação ao compósito. Um dos animais do grupo tratado apresentou reação do tipo corpo estranho, em resposta ao fio de sutura (náilon) utilizado, com a retirada do fio, houve regressão e cicatrização. Os resultados radiológicos dos animais do grupo-controle obtidos imediatamente após a cirurgia revelaram radiopacidade menor do que o osso circunvizinho nas regiões do defeito tibial e na superfície ao redor do pino intramedular. No grupo tratado (Fig. 3A), observou-se no defeito cortical, no mesmo período, radiopacidade maior do que a da cortical do osso circunvizinho, o que está de acordo com o descrito por Borges (1998), Duarte (2003), Rodriguez (2004) e Vital et al. (2006). A radiopacidade ao redor do pino intramedular (Fig. 3A) foi discretamente maior do que a da cortical do osso circunvizinho. Deve-se ressaltar que a distribuição do compósito foi maior na metade proximal do canal medular correspondente à diáfise proximal da tíbia. Assim como o descrito por Yamamoto et al. (2000) e Vital et al. (2006), as radiografias obtidas imediatamente após o procedimento cirúrgico mostraram que o compósito foi bem colocado no osso receptor (Fig. 3A). Isso sugere que, apesar de ter ocorrido sangramento em todos os animais no momento da cirurgia, ele não foi suficiente para remover grande quantidade do compósito dos locais receptores, mas houve deslocamento médio proximal do compósito ao redor do pino, provavelmente favorecido por seu amolecimento com solução fisiológica. A não remoção da

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HAP-91®–L pelo sangramento ocorrido no local da falha óssea foi, provavelmente, devido ao fato de ter-se usado uma forma sólida, em comprimido, o que facilitou sua colocação e ajuste no sítio receptor, obtendo-se preenchimento ótimo do defeito, sem lacunas entre o compósito e o osso. A estabilidade primaria inicial conseguida com o compósito assegura uma união efetiva com o osso circundante, o que é um requisito à hora da colocação de próteses (Furlong, 1998). Nas radiografias feitas aos oito, 30, 60, 90 e 120 dias no grupo tratado (Fig. 3), a radiopacidade do compósito diminuiu gradualmente com cada avaliação, até apresentar radiopacidade semelhante à do osso circunvizinho, em ambos os locais de implantação. Esse comportamento foi descrito por Borges et al. (2000) e Vital et al. (2006), que atribuíram essa diminuição de radiopacidade à invasão de tecido conjuntivo como parte do processo normal de reparação óssea. Deve-se considerar, ainda, que não houve alteração na densidade da hidroxiapatita, uma vez que seu número atômico não se altera. Entretanto, acredita-se que o crescimento de tecido conjuntivo e de tecido ósseo ao redor das partículas de hidroxiapatita com a evolução do processo contribui para a diminuição da radiopacidade do compósito (Rezende et al., 1998). Os dois locais implantados apresentaram semelhança com o osso circunvizinho, embora se tenha observado diferença na sua tonalidade de cinza, que é menor no canal medular. Esse fato pode ser devido à: 1- quantidade do compósito por unidade de área, que é menor no canal medular, fato favorecido por ter-se diluído com solução fisiológica para facilitar sua introdução no canal medular;2- velocidade de absorção parcial, que talvez tenha sido mais rápida no canal medular, por ter maior quantidade de sangue por unidade de área; 3- a invasão de tecido mole à velocidade e quantidade maior junto com o processo normal de regeneração medular 4- combinação das razões anteriores

149

Figura 3. Radiografias da tíbia de coelhos do grupo tratado com hidroxiapatita sintética-lignina em projeção mediolateral. A, B e C: imediatamente após a cirurgia e aos oito e 30 dias do pós-operatório, respectivamente, nota-se radiopacidade maior ao ossocircunvizinho nos dois locais de implantação do compósito (seta larga); D, E e F: aos 60, 90 e 120 dias do pós-operatório, respectivamente, nota-se radiopacidade semelhante ao osso circunvizinho nos dois locais de implantação do compósito defeito cortical (seta fina).

B C D E F A

150

. Com a observação detalhada em cada uma das datas de avaliação, aos oito dias a análise radiográfica dos defeitos tratados não mostrou sinais de redução de radiopacidade ou quaisquer sinais de reação óssea e de absorção do compósito, entretanto, ao redor do pino, observou-se diminuição da radiopacidade passando a ser discretamente maior ao osso circunvizinho (Fig. 4B). No grupo-controle, para a mesma data (Fig. 4A), a falha permaneceu com radiopacidade menor ao osso circunvizinho porque, nesse mesmo período, o tecido presente na falha ainda não possuía radiopacidade suficiente para ser registrada no exame radiológico. Segundo Borges (1998) e Fehlberg (2001), em todo processo de reparação óssea, inicialmente, desenvolve-se tecido conjuntivo no foco da lesão, cuja radiopacidade é insuficiente para ser perceptível ao exame radiográfico, pelo fato de os constituintes do tecido neoformado possuírem baixo número atômico. A superfície ao redor do pino também teve radiopacidade menor que o osso circunvizinho (Fig. 4A). Aos dias 30, 60, 90 e 120 de avaliação (Fig. 3C, D, E, F), observaram-se diminuição progressiva da radiopacidade e do tamanho do compósito no defeito das tíbias tratadas e uma pequena mudança na forma de suas bordas, dando a impressão de remodelação. Esse fato foi observado por Duarte (2003) e Vital et al. (2006) e foi atribuído a um processo de absorção da hidroxiapatita na periferia do defeito. Ou, ainda, isto pode sugerir a invasão de tecido conjuntivo precedendo a formação óssea na periferia do defeito após a absorção da hidroxiapatita (Fehlberg, 2001; Vital et al., 2006). No mesmo período de tempo, a radiopacidade ao redor do pino no grupo tratado assemelhou-se à do osso circunvizinho. No grupo-controle (Fig. 4), para o mesmo período de tempo (30, 60, 90 e 120), observou-se, na falha óssea, aumento progressivo da radiopacidade até adquirir semelhança com a do osso circunvizinho. A radiopacidade ao redor do pino intramedular manteve-se menor do que a do osso circunvizinho (Fig 4).

Figura 4. Radiografias da tíbia de coelhos do grupo-controle em projeção mediolateral. A, B e C aos oito, 30 e 60 dias após a cirurgia, respectivamente, nota-se radiopacidade menor tanto no defeito cortical como ao redor do pino intramedular (seta fina); D, E, aos 90 e 120 dias após a cirurgia, respectivamente, notar radiopacidade semelhante ao osso circunvizinho no defeito cortical (seta larga) e menor ao redor do pino intramedular (seta fina).

B C D EA

152

Pode-se presumir que, para os dias 30, 60, 90 e 120, ocorreu crescimento ósseo em ambos os grupos, caracterizado pelo aumento da radiopacidade do defeito da periferia para o centro no grupo-controle, paralelamente à diminuição da radiopacidade do compósito no grupo tratado. No teste de Friedman e ao comparar as datas de estudo entre os grupos, observou-se que somente aos 90 e 120 dias de avaliação não houve diferença significativa na radiopacidade do defeito cortical (P>0,05). Esse fato indica que a radiopacidade do defeito para esses dias de avaliação entre ambos os grupos foi semelhante e, possivelmente, deveu-se ao ganho de radiopacidade do defeito cortical controle, pelo processo reparativo ósseo, e ainda evidencia que o grupo tratado perdeu radiopacidade na medida em que o compósito foi absorvido e invadido por tecido de menor radiopacidade. Na análise do teste de Friedman e ao se comparar as datas de estudo entre os grupos, observou-se diferença significativa na radiopacidade da superfície ao redor do pino intramedular (P<0,05), exceção da última avaliação. Esse fato indica que o espaço do canal medular ocupado pelo compósito manteve radiopacidade sempre maior ao ser comparado com o espaço correspondente no grupo-controle, exceto aos 120 dias de avaliação. Na análise estatística entre datas para o defeito cortical e a superfície ao redor do pino intramedular do grupo tratado, não houve diferença (P>0,05), de acordo com a análise de variância, apesar de observarem-se diferenças biológicas caracterizadas pela diminuição de radiopacidade com a evolução do tempo, de acordo com os escores de classificação. Conclui-se que o compósito de hidroxiapatita sintética e lignina não mostrou indícios clínicos de rejeição e que o tecido que cresceu na altura da falha óssea e na superfície ao redor do pino intramedular implantado, ao final do experimento, tinha radiopacidade semelhante à do osso circunvizinho, o que sugere que o material promoveu a integração com o tecido ósseo.

153

AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao laboratório JHS, por proporcionar o compósito testado, e à Universidade de Córdoba – Colômbia.

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V.7 :HIDROXIAPATITA SINTÉTICA ASSOCIADA A FATORES DE CRESCIMENTO EM SUBCUTÂNEO DO PAVILHÃO

AURICULAR DE COELHOS (Oryctolagus cuniculus) DA RAÇA NOVA ZELÂNDIA

Synthetic hydroxyapatite associated to a growth factor in external ear subcutaneous in rabbits (Oryctolagus cuniculus) of New Zeland race.

Vet. Not., Uberlândia, v. 13, n. 1, p. 31-37, jan./jun. 2007

Juliana Martins da Silva1, Hudson Armando Nunes Canabrava2,

Marcelo Emílio Beletti3, Fernanda Mandim Crestana1, Sabrina Vaz dos Santos e Silva4, Tânia Berbet Ferreira Lima5

RESUMO Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a eficácia da hidroxiapatita sintética (HAP-91), como carreadora de proteína morfogenética óssea bovina (BMP), plasma rico em plaquetas (PRP) e medula óssea (MO), na formação óssea ectópica, num modelo experimental no pavilhão auricular de coelho. Dois túneis longitudinais subcutâneos foram feitos em cada face externa da orelha dos animais, abrindo, no seu final, uma loja levemente escarificada para a inserção de 5 combinações desses biomateriais: HAP-91+BMP, HAP-91+MO, HAP-91+BMP+MO, HAP-91+PRP e HAP-91+BMP+PRP. Biópsias foram feitas aos 30 e 45 dias pós-implantação para exame em microscopia de luz. A análise histológica demonstrou abundante reação de corpo estranho, caracterizada pela presença de células gigantes multinucleares, em contato direto com o biomaterial, além de pouca neovascularização, bem como mínima reação inflamatória e baixa antigenicidade. Aos 30 e 45 dias pós implante, houve formação de tecido ósseo ectópico nas associações de HAP-91MP+PRP e HAP-91+BMP, respectivamente. Concluiu-se que as associações de HAP-91+BMP+PRP e HAP-91+BMP foram capazes de formar osso ectópico no subcutâneo do pavilhão auricular de coelhos. Palavras-chave: Pavilhão auricular, BMP, células gigantes, medula óssea, osso ectópico, PRP, coelho.

157

ABSTRACT

The aim of this research was to evaluate the synthetic hydroxyapatite as a carrier of bovine bone morphogenetic protein (BMP), platelet-rich plasm (PRP) and bone marrow (BM) in the ectopic bone formation in a rabbit model. Two tunnels were made in the external face of the subcutaneous tissue of each ear in the rabbit, opening in the end a scarified large room to insert five types of associations of biomaterials: HAP-91+BMP, HAP-91+BM, HAP-91+BMP+BM, HAP-91+PRP and HAP-91+BMP+PRP. In 30 and 45 days post-implantations, biopsies were made for evaluation using light microscopy. The histologycal analysis, showed plentiful reaction of foreign body, characterized by the presence of giant multinucleus cells in direct touch with those biomaterials, as well as a few inflammatory reactions and low antigenicity. In the 30 and 45 days post-implantation occurred formation of ectopic bone tissue in the associations of HAP-91+BMP+PRP an HAP-91+BMP, respectively. It was possible to conclude that associations of HAP-91+BMP+PRP and HAP-91+BMP could produce ear tissue of rabbits.

INTRODUÇÃO

O osso representa o principal elemento de sustentação do corpo. É um tecido mineralizado que possui propriedades mecânicas e capacidade de regeneração. Para a reparação de fraturas ou defeitos ósseos há produção 1 Médica Veterinária. Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Faculdade de Medicina Veterinária/FAMEV. Universidade Federal de Uberlândia/UFU, Uberlândia-MG. 2 Médico Veterinário. Professor Adjunto Doutor. Instituto de Ciências Biomédicas, UFU. 3 Médico Veterinário. Professor Associado. Doutor. Instituto de Ciências Biomédicas, UFU. 4 Médica Veterinária. Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica. Instituto de Genética e Bioquímica, UFU. 5 Odontóloga. Mestre em Ciências Veterinárias, UFU.

158

de novo tecido com a mesma organização estrutural do original. No entanto, esta característica é limitada pelo tamanho da lesão, assim defeitos ósseos extensos, provocados por traumas, infecções, neoplasias e anomalias de desenvolvimento que, deixadas ao seu livre curso, não regenerariam ou o faria muito lentamente e de forma incompleta. O reparo destes defeitos representa um desafio em cirurgias ortopédicas e na odontologia (DUARTE DA SILVA et al., 2000; CALIXTO et al., 2001; DONG et al., 2001; HERCULIANI et al., 2000). Para reconstrução, substituição ou preenchimento dos defeitos ósseos a solução pode ser obtida com a utilização de enxertos ósseos de origens autógena, homógena e heterógena. O primeiro mostra disponibilidade limitada de material do local doador, além de que muitas vezes requer hospitalização do paciente, aumentando, assim, os custos. Enquanto os dois últimos apresentam riscos de transmitir infecção e ativar reações imunológicas ao hospedeiro (SCHENK, 1996; TONG et al., 1998; BAUER; MUSCHLER, 2000; DONG et al., 2001; LINDSEY, 2001; ANDRADE et al., 2002). Em vista das limitações de enxertia óssea têm-se intensificado pesquisas para o desenvolvimento de materiais aloplásticos que apresentem características adequadas de biocompatibilidade e osseointegração (CALIXTO et al., 2001; DONG et al., 2001; LINDSEY, 2001; BAUER; SMITH, 2002). As hidroxiapatitas (HA) puras ou em combinação com outros materiais estão sendo usadas como biomaterial para implantes ósseos. Estas não necessitam de um segundo local cirúrgico, além de serem biocompatíveis. Entretanto não apresentam características osteoindutoras e não contêm células osteoprogenitoras (DONG et al., 2001; BAUER; SMITH, 2002). Uma alternativa para auxiliar no reparo dos defeitos ósseos seria a utilização de fatores de crescimento (FC) aliados a biomateriais aloplásticos (BARBANTI et al., 2005). Estes são mediadores biológicos que ocorrem naturalmente e regulam a estimulação, proliferação, migração, quimiotaxia, diferenciação e síntese da matriz, via ligação aos receptores específicos de superfície celular. Essas substâncias são liberadas ou ativadas quando da necessidade de divisão celular, ação que ocorre durante eventos como a cicatrização de feridas ou regeneração de tecidos ósseos (GIONNOBILE, 1996; BARTOLD et al., 1992). Dentre os FC mais usados em estudo experimental, estão o fator de crescimento

159

derivado de plaquetas (PDGF), o fator de crescimento transformador beta (TGF-â) e o fator de crescimento semelhante a insulina (IGF) (FENNIS et al., 2004), que estão presentes em alta concentração no plasma rico em plaquetas (PRP) (MARX et al., 1998), e a proteína morfogênica óssea (BMP) . A medula óssea (MO) apresenta em sua constituição células primordiais indiferenciadas, as células-tronco, que desempenham papel importante na osteogênese; por terem capacidade de autorenovação e potencial para diferenciarem-se em várias linhagens (BARROS et al., 2001; CONNOLLY, 1995). Esta pesquisa teve como objetivo avaliar, de formas comparada e controlada, em ensaios casualizado e cego, a eficácia da hidroxiapatita sintética obtida da calcita (HAP-91), como carreadora de BMP, PRP e MO, na formação óssea ectópica, num modelo experimental no pavilhão auricular de coelho, bem como avaliar a interação destes biomateriais neste sistema biológico. MATERIAL E MÉTODOS Utilizou-se 51 coelhos (Oryctolagus cuniculus),machos, da raça Nova Zelândia, brancos, com idade entre 3 e 5 meses e pesando entre 1,5 a 2,5kg. Estabeleceu-se cinco grupos de dez (10) animais cada, excetuando-se o último formado por onze (11), submetidos aos seguintes implantes: Tratamento 1 – HAp-91 + BMP Tratamento 2 – HAP-91 + MO Tratamento 3 – HAP-91 + BMP + MO Tratamento 4 – HAP-91 + PRP Tratamento 5 – HAP-91 + BMP + PRP A hidroxiapatita sintética foi extraída a partir do calcário, preparada com granulometria média de 50 mesh (grânulos de 200 a 300 mm) e constituída de 70% de hidroxiapatita e 30% de βtrifosfato de cálcio (ANDRADE et al., 2002). A BMP é um conjunto de proteínas originárias do osso cortical fetal bovino, obtidas pela técnica de Taga; Mulatinho (1999). Aspirou-se 1,0 mL de medula óssea no tubérculo maior do úmero, com o auxílio de uma agulha hipodérmica 18G, acoplada a uma seringa de 10 mL, contendo 0,5mL (1000 U/mL) de heparina sódica.

160

O plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido pela coleta de 4,5 mL de sangue a partir da veia jugular externa, num tubo estéril contendo 0,5mL do anticoagulante citrato de sódio, que posteriormente foi centrifugado, em uma centrífuga de bancada, conforme protocolo proposto por Sonnleitner et al.(2000). Após anestesia geral dos animais, com o auxílio de uma agulha peridural Tuohy 18G estéril e descartável foram feitos dois túneis longitudinais subcutâneos, medindo aproximadamente 2,5 cm de comprimento, em cada face externa do pavilhão auricular dos coelhos, sendo um medial e outro lateral a artéria auricular média, e abriu-se, em seu final, uma loja levemente escarificada. Com o subsídio de um cateter intravenoso 10G, também estéril e descartável (BD, São Paulo – SP, Brasil), introduzido pelo túnel subcutâneo, implantou-se em sua porção final ±0,01 mg dos biomateriais sólidos, HA ou HA + BMP e 0,2 ml dos líquidos (MO ou PRP), de acordo com o que foi preconizado para cada tratamento. A coleta do material foi realizada aos 30 e 45 dias pós-implante, em ambiente cirúrgico, seguindo-se as técnicas de assepsia. Após anestesia geral, usou-se um trépano com diâmetro 0,5cm, para excisar um fragmento, o qual continha pele externa, material, cartilagem e pele interna da orelha. Para padronização das coletas das amostras, os implantes laterais foram retirados com 30 dias e os mediais com 45 dias. Os fragmentos do pavilhão auricular coletados foram fixados em formol a 10%, processados em parafina, cortados com 5 ìm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE) para analise em microscopia de luz. O estudo dos fragmentos consistiu da contagem de células inflamatórias (polimorfonucleares (PMN), linfócitos e plasmócitos), células gigantes multinucleares tipo corpo estranho (CGMCE) e células de reparação como os fibroblastos. Além da observação quanto a presença (1) ou ausência (0) de formação óssea ectópica (FOE), tecido conjuntivo com fibras colágenas desorganizadas semelhante a osso primário (OP) e cápsula fibrosa, bem como a mensuração da intensidade da angiogênese (SANADA et al., 2003; FERREIRA et al., 2004). Foram analisados 16 campos por corte, ou seja, analisou-se todo o fragmento da orelha.

161

Os dados foram submetidos ao teste estatístico não paramétrico de Wilcoxon Signed Rank- Sum Test, conforme descrito por Doria Filho (1999), e fixou-se em 0,05 o nível para rejeição da hipótese de nulidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise histológica demonstrou abundante reação de corpo estranho caracterizada pela presença de CGMCE, em contato direto com o biomaterial, aliado a hipercelularidade do tecido conjuntivo na região circunvizinha com presença de células semelhantes a fibroblastos, além de pouca neovascularização, mínima reação inflamatória e baixa antigenicidade, as últimas foram caracterizadas pela presença de PMN, linfócitos e plasmócitos. Houve formação óssea ectópica na associação de HAP-91+BMP (Tratamento 1), no período de 45 dias pós-implantação dos biomateriais. Observou-se também, o desenvolvimento de tecido conjuntivo hipercelularizado com fibras colágenas desorganizadas, semelhante a osso primário, intensa quantidade de CGMCE e maior quantidade de PMN aos 45 dias, além de menor angiogênese quando comparados aos outros biomateriais. Porém, Lima (2003) ao correlacionar os efeitos causados em subcutâneo com o uso de HAP-91 sintética pura e em agregação à BMP verificou que as reações destes biomateriais foram muito parecidas, com pouca neovascularização, moderada reação CGMCE, pequena reação inflamatória, alta quantidade de cápsula fibrosa circundando os implantes e ausência de formação óssea ectópica, aos 30 dias. Aparentemente, a pequena neoformação de capilares é uma característica da HAP-91, que pode ser notada ao se comparar o presente trabalho com a os dados de Lima (2003). Talvez, devido a uma pequena diferença de metodologia empregada nesse estudo, que foi a construção de uma loja levemente escarificada no final do túnel, conseguiu-se obter uma menor formação de cápsula fibrosa, pois os biomateriais tiveram maior espaço e menor comprometimento vascular para se alojarem. Verificou-se que a mistura de HAP-91+MO (Tratamento 2) revelou presença de tecido conjuntivo hipercelularizado com fibras colágenas desorganizadas, semelhante a osso primário, aos 45 dias pós-implante. Maiores quantidades de linfócitos e plasmócitos, aos 30 e 45 dias, respectivamente, caracterizaram uma pequena reação local de antígeno-

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anticorpo. As CGMCE mantiveram-se em grandes quantidades durante os períodos analisados, o que demonstrou uma bioreabsorção lenta. Isto confere com os achados de Oliveira et al.(2004); Barbanti et al. (2005); Carneiro et al. (2005), porém estes autores responsabilizaram a hidroxiapatita sintética por tal efeito. Tecido conjuntivo hipercelularizado com fibras colágenas desorganizadas, semelhante a osso primário, também foi observado no período de 45 dias pós-implante, na associação de HAP-91+BMP+MO (Tratamento 3). Esta composição teve maior angiogênese do que a HAP-91+MO (Tratamento 2), sem a proteína BMP, o que faz supor que a adição de BMP promova um acréscimo da neovascularização (MA et al., 2000; MORAN; TOURRET, 2001; CROCI et al., 2003; GRANJEIRO et al., 2005; ZAMBUZZI et al., 2005). Notou-se que os linfócitos e plasmócitos, aumentaram, também, aos 30 e 45 dias, respectivamente, causando uma leve reação imunogênica. Isso, provavelmente, pode ter ocorrido em virtude da presença de MO, que, segundo Krebsbach; Robey (2002), é responsável pela hematopoese e precursora dessas células. Não foi verificada a presença de formação óssea ectópica nos tratamentos 2 e 3 que continham medula óssea em sua composição, o que não concorda com observações feitas por Lucarelli et al. (2003). Estes autores citaram que os enxertos carregados com células mesenquimais originárias da medula óssea, quando implantados em subcutâneo, mostraram formar osso em poucas semanas pós-implantação. A HAP-91 integrado ao PRP, apresentou menor quantidade de PMN, aos 30 dias, e aumento do número de linfócitos, aos 45 dias, revelando intensificação da reação inflamatória crônica. A angiogênese presente nesta associação foi numericamente, maior, que nos outros implantes durante os períodos pesquisados, o que confere com achados de Marx (2001); Lucarelli et al. (2003). Menores quantidades de CGMCE e fibroblastos foram observados, porém com maior freqüência de cápsula fibrosa aos 45 dias pós-implante. O tecido conjuntivo hipercelularizado com fibras colágenas desorganizadas, semelhante a osso primário, também foi observado no período de 45 dias. O efeito da associação de HAP-91+BMP+PRP foi benéfico, pois formou osso ectópico aos 30 dias (Figura 1), e promoveu uma reparação tecidual mais rápida quando comparada aos outros tratamentos, provavelmente devido a maior concentração de fatores de crescimento (DAVIES, 2003; TÖZÜM; DEMIRALP, 2003; FERREIRA, 2004). A agregação desses

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biomateriais promoveu aumento da angiogênese, aos 45 dias. Observou-se presença de pouquíssimas cápsulas, mas estas estavam em maior quantidade, quando comparadas aos outros enxertos. O processo de bioreabsorção tecidual obteve resultado satisfatório, considerando-se a existência de menor presença de biomateriais, CGMCE e fibroblastos, com moderada quantidade de fibras colágenas, entremeados com o enxerto, aos 45 dias.

Figura 1. Fotomicrografia em microscopia de luz do pavilhão auricular de coelho visualizando a formação óssea ectópica (FOE). OP = osso primário, CE = cartilagem elástica. HE. 72X. Os resultados sugerem ausência de reações de rejeição aos implantes, mas sim uma intensa reabsorção destes, uma vez que a rejeição é caracterizada pela reabsorção da periferia do implante sem a substituição por tecido reparador, resposta inflamatória com predominância de linfócitos e tecido fibroso encapsulando o implante, além de ocluir de neovasos com necrose

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progressiva, bem como pela dor, edema e vermelhidão (ZILIOTO et al., 2003). Semelhante a citações de Silva et al. (1998), os biomateriais implantados no material que compuseram presente trabalho, mostraram boa biocompatibilidade entre si e com o meio, a pesar da presença de reação de corpo estranho. A bioreabsorção foi satisfatória, apesar de lenta, pois o processo ainda era intenso aos 45 dias de pós-implantação. Provavelmente esse foi um fator que pode ter gerado atraso na formação óssea como sugeriram Sykaras; Opperman (2003); Salgado et al. (2004), onde foram visualizados tecidos conjuntivos hipercelularizados, semelhantes a osso primário, em maior quantidade aos 45 dias pós-implante. A HAP-91 associada a fatores de crescimento pode formar osso em sítio ectópico, como no pavilhão auricular de coelhos. Esta cerâmica ofereceu uma aceitável armação para o crescimento ósseo, e juntamente com a BMP e o PRP mostraram-se como substitutos ósseos razoáveis, pois foram biocompatíveis, biodegradáveis, osteoindutivos e de natureza osteogênica. CONCLUSÃO Houve formação de tecido ósseo ectópico com os implantes de hidroxiapatita e proteína morfogenética bovina (BMP), bem como com a HAP-91, BMP e plasma rico em plaquetas (PRP) no pavilhão auricular de coelho da raça Nova Zelândia. REFERÊNCIAS ANDRADE, A.L.; BORGES, A.P.B.; BICALHO, S.M.C.M. HAP-91: síntese, caracterização e aplicações.3. ed. Belo Horizonte: JHS Laboratório Químico, 2002. 146p. BARBANTI, S.H.;. ZAVAGLIA, C.A.C.; A. R.; DUEK, E.A.R. Polímeros bioreabsorvíveis na engenharia de tecidos. Polímeros: Ciência e Tecnologia, Bauru, v. 15, n. 1, p. 13-21, 2005. BARROS, S.V.S.G.; CARLO, R.J.D.; VARGAS, M.I.; GALVÃO, S.R.; MAIA FILHO, A. Auto-enxerto percutâneo de medula óssea. II. Reparação de falhas segmentares produzidas no rádio de coelhos. Ciência Rural, Santa Maria, v 31, n. 4, p. 627-632, 2001.

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V.8 :OSTEOINTEGRAÇÃO DA HIDROXIAPATITA SINTÉTICA

NO PROCESSO ALVEOLAR DA MANDÍBULA DE CÃES: ASPECTOS CLÍNICOS E RADIOGRÁFICOS

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.59, n.1, p.114-118, 2007

T.S. Duarte1, A.P.B. Borges2*, M.S.L. Lavor1, R. Filgueiras1, A.C. Tsiomis1 G. Fófano1, M.E. Odenthal1, K.C.S. Pontesl1

1Alumno de postgrado – UFV – Viçosa, MG 2Departamento de Veterinária – UFV

Av. P.H. Rolfs, s/n 36570-000 – Viçosa, MG

RESUMO

Avaliou-se o efeito da hidroxiapatita sintética na regeneração do osso alveolar e o efeito no tecido vivo de cães. Em dois grupos de 14 cães adultos hígidos, pesando entre 10 e 15kg, foram criados defeitos de 6 x 5mm na superfície vestibular do processo alveolar mandibular direito até atingir a raiz do quarto pré-molar. Em um grupo (tratado), o defeito foi preenchido com hidroxiapatita sintética; o grupo sem tratamento foi usado como controle. Efetuaram-se avaliações clínicas diárias durante uma semana, avaliações radiográficas após a cirurgia e aos oito, 21, 42, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório. Vinte e quatro cães apresentaram inflamação, sendo a recuperação no grupo tratado mais lenta. Todos os animais tiveram sangramento com a hidroxiapatita. No grupo-controle houve aumento crescente da radiopacidade dos defeitos, no entanto, aos 120 dias do pós operatório, os defeitos ainda eram visíveis. No grupo tratado, inicialmente a radiopacidade foi maior que a do osso normal, com diminuição gradual até se tornar semelhante à do osso vizinho, 60 dias após a cirurgia. A hidroxiapatita T290800-1 acelerou o preenchimento do defeito provocado no processo alveolar e acarretou inflamação hemorragia gengival, o que, no entanto, não contra-indicou o seu uso. Palavras-chave: hidroxiapatita, processo alveolar, radiopacidade

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ABSTRACT The effect of the synthetic hydroxyapatite on the regeneration of the alveolar bone of dogs and on the alive tissue were evaluated. In two groups of 14 adult healthy dogs, weighing from 10 to 15kg, some defects around 6 x 5mm were provoked on the vestibular surface of the right jaw alveolar process until reaching the root of the forth premolar. In one group, the defect was infilled with synthetic hydroxyapatite. The no treated group dogs were used as control. Clinical evaluations were daily performed over one week, as well as radiographic evaluations after surgery, and on 8, 21, 42, 60, 90 and 120 days after surgery. Twenty-four dogs showed inflammation and the recovery in the treated group was slower than in the control group. Bleeding at the presence of hydroxyapatite was observed in all the animals. The radiographic examination presented an increasing radiopacity in the control group; however, this defect was still visible on day 120 after operation. Initially, in the treated group, radiopacity was higher than that of the normal bone and a gradual decrease occurred until becoming similar to the adjacent bone on day 60 days after surgery. The hydroxyapatite T290800-1 accoerated the infilling of the defect provoked in the alveolar process and caused gingival inflammation and hemorrhage; however, this does not contraindicate its use. Keywords: dog, hydroxyapatite, alveolar process, radiopacity

INTRODUÇÃO A doença periodontal, os traumas acidentais e os traumas cirúrgicos provocados pela extração de dentes são algumas das causas da perda do osso alveolar. Cerca de 85% dos cães e gatos com mais de três anos de idade apresentam algum grau de enfermidade periodontal, e essa é, sem dúvida, a principal causa da perda do osso alveolar e das perdas dentais (Emily et al., 1999). O processo alveolar é um dos componentes do periodonto e, portanto, contribui para a inserção dos dentes na maxila e na mandíbula (Terranova et al., 1997). O processo é formado pela junção do osso alveolar, que consiste em uma fina faixa de osso cortical, com o alvéolo (Emily et al., 1999). O osso alveolar funde-se com as placas corticais nas faces vestibular e lingual, através de trabéculas de osso esponjoso. A porção

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esponjosa do processo alveolar é contínua com a porção esponjosa da maxila e da mandíbula (Terranova et al., 1997). Os auto-enxertos ósseos são bastante requeridos em cirurgias maxilofaciais, craniofaciais, orais e em cirurgias plásticas. No entanto, o principal problema relacionado a esse procedimento é a morbidade que acomete o local doador (Orr et al., 2001). Os aloenxertos possuem como desvantagem o risco de transmissão de doenças e rejeição (Jensen et al., 1996). Com isto, a necessidade de utilizar implantes como forma de tratamento para várias doenças ósseas torna fundamental o entendimento da interação do biomaterial com o ambiente vivo. A partir desse conhecimento, é possível a produção de implantes compatíveis com a saúde. Cerâmicas como a hidroxiapatita sintética têm sido avaliadas em defeitos intra-ósseos humanos com resultados clínicos positivos (Yukna et al., 2000) e com o intuito de substituir os autoenxertos ósseos em cirurgias ortopédicas (Oonishi et al., 1997). O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da hidroxiapatita sintética na regeneração do osso alveolar e na resposta do tecido vivo ao implante por meio de análises clínico-cirúrgicas e radiológicas.

MATERIAL E MÉTODOS Em dois grupos de 14 cães adultos hígidos, pesando entre 10 a 14kg, foram criados defeitos de aproximadamente 6 x 5mm na superfície vestibular do processo alveolar. Os cuidados no momento do pré e pós-operatório, o protocolo anestésico e os procedimentos cirúrgicos para a criação do defeito e implantação da hidroxiapatita foram descritos por Duarte et al. (2006). Na avaliação diária da ferida cirúrgica, nos primeiros sete dias do pós-operatório, foram aferidos o grau de reação inflamatória, baseado na presença de edema e dor, e o grau de hemorragia. Todas as variáveis foram classificadas em intensa, moderada, leve e ausente. Foram realizadas radiografias da região operada com filme intra-oral, utilizando a técnica do paralelismo, com posicionamento oblíquo ventrolateral-dorsomedial direito após a cirurgia e aos 8, 21, 42, 60, 90 e 120 dias de pósoperatório, visando avaliar o processo de reparação óssea. Os animais foram sedados com acepromazina 1%(1) na dose de 0,1mg/kg,

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por via intravenosa, e anestesiados com pentobarbital 3%(2) em dose suficiente para permitir o procedimento. Os filmes dentais utilizados foram fixados em um suporte e posicionados na região lingual do quarto pré-molar direito. As radiografias foram analisadas quanto à radiopacidade em diferentes graus, comparandose o defeito provocado com o osso vizinho, considerado normal. O grau de radiopacidade foi quantificado por meio de escores, variando de 0 a 4, em que: 0= ausente; 1= intensamente abaixo da radiopacidade do osso vizinho; 2= discretamente abaixo da radiopacidade do osso vizinho; 3= semelhanete à radiopacidade do osso vizinho; 4= acima da radiopacidade do osso vizinho. Os resultados foram estudados por análise descritiva. Foram avaliados os graus de radiopacidade, nas diferentes datas, dos diferentes grupos. A análise dos resultados clínico-cirúrgicos comparou, de maneira descritiva, a presença e a evolução da resposta inflamatória e da hemorragia.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Vinte e quatro animais apresentaram edema leve a moderado nos dois primeiros dias do póscirúrgico. Cinco do grupo tratado e um do grupo controle continuaram apresentando edema leve até o último dia de avaliação. Os demais não apresentaram edema a partir do terceiro dia do pós-operatório. As alterações associadas à dor foram de intensidade leve em oito cães do grupo tratado e em seis do grupo-controle nos primeiros dois dias. Apenas um cão do grupo tratado apresentou dor moderada no primeiro dia após a cirurgia. A partir do terceiro dia, nenhum animal, de ambos os grupos, manifestou dor. Embora, segundo Yamamoto et al. (2000), a idroxiapatita possa provocar irritação mecânica, não houve diferença em relação à intensidade da dor nos dois grupos. Apesar de Alliot et al. (1999) atribuírem a inflamação gengival no pós-operatório à ausência de higienização da cavidade oral em cães, a dor e o 1Acepran 0,1% -Univet S.A. – Industria Veterinaria. 2Pentobarbital sódico 3% - Cristália Productos Químicos y Farmacéuticos Ltda. edema encontrados neste experimento pareceram ser decorrentes da

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manipulação dos tecidos moles, durante o procedimento cirúrgico, e da presença da hidroxiapatita, uma vez que todos receberam higienização diária. Todos os animais tratados apresentaram sangramento intenso no momento em que o biomaterial entrou em contato com a gengiva e com as bordas do defeito periodontal. Seis cães tratados apresentaram hemorragia variando de leve a moderada imediatamente após o procedimento cirúrgico, perdurando até o sétimo dia de avaliação clínica. Quatro animais do grupo-controle tiveram hemorragia leve durante, no máximo, dois dias após a cirurgia. Ao contrário do esperado, apenas em dois cães, um de cada grupo, contatou-se a presença de secreção purulenta na ferida cirúrgica a partir do quinto dia do pós-cirúrgico, perdurando até o sétimo dia de avaliação clínica. Segundo Brown et al. (1998), a contaminação bacteriana nos poros de hidroxiapatita pode impedir o crescimento ósseo no seu interior. No entanto, não foi observado qualquer atraso na regeneração óssea daqueles que apresentaram infecção. A deiscência de sutura encontrada em cinco animais do grupo tratado e em seis do grupo controle foi atribuída à grande tensão no local associada à presença de edema e hemorragia gengival. Após a cirurgia, o grau de radiopacidade do grupo-controle foi zero e o do grupo tratado foi quatro (Fig. 2A). Em conseqüência do elevado número atômico dos seus constituintes químicos, a hidroxiapatita apresenta radiopacidade maior que a do osso (Rawlings et al., 1998). No oitavo dia do pós-cirúrgico nos cães do grupo-controle,o grau de radiopacidade ainda era zero (Fig. 1A). O grupo tratado apresentou pontos de radiopacidade três ao centro e zero em toda a periferia do defeito periodontal (Fig. 2B). Segundo Cullun et al. (1988) e Borges (1998), em todo processo de cicatrização óssea, inicialmente desenvolve-se tecido fibrovascular no foco da lesão, cuja radiopacidade é insuficiente para ser perceptível no exame radiográfico. Portanto, não se pode descartar a possibilidade de ocorrer regeneração óssea, nesse período no grupo-controle. No grupo tratado, houve, provavelmente, reabsorção da hidroxiapatita na periferia do defeito, com deposição de tecido fibrovascular precedendo a formação óssea. Um animal deste grupo teve radiopacidade zero em todo o defeito nesta data. Nele, houve hemorragia moderada até o último dia de avaliação, o que, possivelmente, resultou na perda da hidroxiapatita e na ausência de radiopacidade.

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As radiografias subseqüentes do processo alveolar tratado revelaram diminuição da radiopacidade com o passar do tempo. Aos 21 dias, a radiopacidade atingiu grau dois no centro e grau zero na periferia do defeito. Com 42 dias, a radiopacidade voltou a aumentar, apresentando-se com grau dois até atingir grau três em todo o defeito, 60 dias após a cirurgia (Fig. 2C). Tal fato se repetiu aos 90 e 120 dias. Portanto, aos 60 dias, já se pôde observar, radiograficamente, a reparação óssea completa do processo alveolar de todos os cães tratados com a hidroxiapatita T290800-1. No grupo-controle, houve aumento gradativo da radiopacidade dos defeitos. Aos 21 dias do póscirúrgico, a radiopacidade foi de grau um (Fig. 1B). Com 42 dias, o defeito ainda era perceptível, no entanto observou-se arredondamento das bordas com radiopacidade dois na periferia e um no centro. Com 60, 90 e 120 dias, os defeitos ainda eram visíveis, apresentando radiopacidade dois (Fig. 1C).

Figura 1. Radiografias obtidas da mandíbula de um cão do grupo-controle. (A) 8 dias, (B) 21 dias e (C) 120 dias após a confecção de um defeito no processo alveolar do quarto pré-molar direito (setas). Observa-se o arredondamento progressivo das bordas dos defeitos e o aumento da radiopacidade com o passar do tempo. Filme intra-oral utilizando a técnica do paralelismo.

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Figura 2. Radiografias obtidas da mandíbula de um cão do grupo tratado. (A) imediatamente após cirurgia, (B) 8 dias e (C) 60 dias após a confecção de um defeito no processo alveolar do quarto prémolar direito. Notar a evolução da radiopacidade do defeito ósseo (setas). Inicialmente ocorre uma diminuição da radiopacidade (com oito dias) e posteriormente um aumento gradual da densidade óssea (8 e 60 dias). Filme intra-oral utilizando a técnica do paralelismo.

CONCLUSÕES

Os resultados permitiram concluir que a hidroxiapatita T290800-1 acelera o preenchimento do defeito provocado no processo alveolar com um tecido de radiopacidade semelhante ao do osso e acarreta inflamação e hemorragia gengival, o que, no entanto, não contra-indica o seu uso.

AGRADECIMIENTOS

A JHS Laboratório Químico, Belo Horizonte, MG.

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V. 9 : OSTEOINTEGRAÇÃO DA HIDROXIAPATITA SINTÉTICA NO PROCESSO ALVEOLAR DA MANDIBULA

DE CÃES: ASPECTOS HISTOLÓGICOS

T.S. Duarte1 , A.P.B. Borges2*, M.S.L. Lavor1, R. Filgueiras1, A.C. Tsiomis1, F.L. Oliveira1, K.C.S. Pontes1 1Aluno de pós-graduação – UFV – Viçosa,MG

2Departamento de Veterinária – UFV Av. P.H.Rolfs, s/n

36570-000 – Viçosa, MG

RESUMO Avaliou-se a hidroxiapatita sintética como substituto ósseo na regeneração do processo alveolar, utilizando-se 28 cães adultos hígidos, pesando entre 10 e 15kg, divididos em dois grupos. Foram criados defeitos de aproximadamente 6 x 5mm na superfície vestibular do processo alveolar até atingir a raiz do quarto pré-molar mandibular direito. Em um grupo, o defeito foi totalmente preenchido com hidroxiapatita sintética; o outro, sem tratamento, foi usado como controle. Aos 8, 15, 21, 42, 60, 90 e 120 dias, foram coletados fragmentos ósseos para a análise histológica sob microscopia óptica. Observou-se crescimento ósseo e vascular no interior dos poros de hidroxiapatita, intensa proliferação de osteoblastos e neovascularização na presença do implante. A biocompatibilidade da hidroxiapatita permitiu a sua integração com o processo alveolar por meio da formação direta de um osso lamelar. Ocorreu neoformação óssea à medida que a hidroxiapatita foi degradada. Palavras-chave: cão, regeneração óssea, hidroxiapatita, steocondução, osteoindução

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ABSTRACT The synthetic hydroxyapatite was evaluated as bone substitute in the regeneration of the alveolar process. Twenty-eight healthy adult dogs weighing from 10 to 15kg were divided into two groups. Defects around 6 x 5mm were provoked on the vestibular surface of the alveolar process until reaching the root of the fourth right mandibular premolar tooth. In one group the defect was totally infilled with synthetic hydroxyapatite, whereas the other untreated one was used as control. On days 8, 15, 21, 42, 60, 90 and 120, bone fragments were collected for the histological analysis under optical microscopy. The following results were observed: both bone and vascular growth inside the hydroxyapatite pores, intense osteoblast proliferations and neovascularization at the presence of the implant. The biocompatibility of the hydroxyapatite allowed its integration with the alveolar process by direct formation of a lamellar bone. The bone neoformation occurred as the hydroxyapatite was degraded. Keywords: dog, bone regeneration, hydroxyapatite, osteoconduction, osteoinduction

INTRODUÇÃO Materiais à base de fosfato de cálcio foram testados nos últimos anos e encontram-se disponíveis para uso clínico, com o intuito de substituir o auto-enxerto ósseo em cirurgias ortopédicas (Oonishi et al., 1997). Dentre estes, encontra-se a hidroxiapatita, que tem sido empregada em tratamentos maxilofaciais e orais para aumento do rebordo alveolar e preenchimento do alvéolo após a extração do dente (Shareef et al., 1993). O substituto ósseo ideal deve ser biocompatível e gradualmente substituído por novo tecido ósseo, além de possuir propriedade osteoindutiva ou osteocondutiva (Jensen et al., 1996). A hidroxiapatita sintética é biocompatível, não é carcinogênica e nem alergênica (Gonzalez, 1993;Oonishi et al., 1997). É um material seguro e clinicamente aceitável na obliteração de vários defeitos periodontais (Brown et al., 1998). A hidroxiapatita atua como um substrato para a osteogênese, sendo classificada como um material osteocondutivo (Nagahara et al., 1992; De Vicente et al., 2000; Orr et al., 2001; Vital et al., 2006). No entanto, Kurashina et al. (2002) afirmam que ela possui propriedade

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osteoindutora quando implantada na musculatura de coelhos. Os objetivos deste trabalho foram estudar o efeito provocado pela hidroxiapatita sintética na regeneração do osso alveolar, avaliar seu potencial osteocondutor e sua biocompatibilidade e determinar sua capacidade de acelerar o preenchimento da falha óssea com tecido ósseo neoformado.

MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 28 cães adultos e hígidos, pesando de 10 a 15kg. Sete dias antes de serem operados, foram everminados com ivermectina1 (0,3mg/kg) e foram mantidos em baias individuais, onde receberam ração comercial(2). Todos receberam espiramicina e metronidazol (3) (1 comprimido para cada 10kg) por via oral, uma vez ao dia, três dias antes e três dias após o procedimento cirúrgico. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos eqüitativos. O grupo 1 foi tratado com hidroxiapatita sintética4, e o grupo 2 não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. A hidroxiapatita denominada de T290800-1 é a mistura de hidroxiapatita pura de 30 mesh (HAP91) com lipossoma do tipo DRV (reidratação de vesícula), obtendo-se um compósito de hidroxiapatita absorvível. Após sedação com acepromazina5 (0,1mg/kg), indução e manutenção com pentobarbital (6)(15mg/kg) por via intravenosa, a área a ser operada foi infiltrada com lidocaína(7) 2%, e a cavidade oral foi higienizada com solução de clorexidine 2%. Realizou-se um retalho mucoperiosteal de 1,5 x 1,5cm a 0,5cm da margem gengival do quarto pré-molar mandibular direito, que foi deslocado ventralmente, expondo a superfície vestibular do processo alveolar. Um defeito ósseo de aproximadamente 6 x 5mm foi provocado no processo alveolar, até atingir as raízes do quarto pré-molar, com o auxílio de um motor de baixa rotação8 e broca esférica para peça-de-mão número oito, com irrigação constante de solução salina isotônica. O defeito ósseo provocado no grupo 1 foi completamente preenchido com a hidroxiapatita sintética previamente homogeneizada com sangue, enquanto o grupo 2 permaneceu sem tratamento. Em ambos os grupos, o retalho mucoperiosteal foi reposicionado sobre o osso alveolar e suturado 1 Ivomec 1% - Merial Ltda. 2 Selection Special Croc – Royal Canin Ltda. 3 Stomorgyl 10 – Merial Ltda.

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com pontos simples separados com fio absorvível de poliglactina. Os animais foram mantidos em baias individuais por 14 dias e alimentados, duas vezes ao dia, com ração comercial amolecida e água à vontade. Posteriormente, passaram para baias coletivas e receberam ração comercial, porém, em sua forma natural, até o final do experimento. No pós-operatório, receberam morfina(10), por via oral (5mg/kg), imediatamente após a recuperação anestésica, e ketoprofeno11 (0,1mg/kg) por via subcutânea, a cada 24 horas, durante três dias. Dois cães de cada grupo foram sacrificados aos 8, 15, 21, 42, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório para a obtenção de uma amostra contendo defeito ósseo provocado. Esses animais seriam sacrificados para controle populacional, e tal procedimento foi realizado com sobredosagem anestésica com pentobarbital sódico intravenoso. As amostras foram fixadas em formol tamponado a 10% e descalcificadas em solução contendo ácido fórmico a 8% e ácido clorídrico a 8%, em vácuo moderado. Adicionalmente, foram processadas pela técnica rotineira de desidratação, diafanização e inclusão em parafina, cortadas com espessura de quatro micrômetros e coradas pela técnica de hematoxilina e eosina (Luna, 1968). Nos cortes histológicos, foram avaliados o padrão de reparação óssea, qualificando o tecido ósseo neoformado e a osteointegração, e a biocompatibilidade da hidroxiapatita. RESULTADOS E DISCUSSÃO No oitavo dia do pós-cirúrgico, os animais do grupo-controle apresentaram início de reabsorção das bordas do defeito com formação de matriz óssea acelular, tecido de granulação pouco vascularizado e grande proliferação de tecido fibrovascular. 4- Hidroxiapatita T290800-1 – J.H.S. Laboratório Químico Ltda. 5 Acepran 1% - Univet S.A. – Indústria Veterinária. 6 Pentobarbital Sódico 3% - Cristália Produtos Químicos e Farmacéuticos 7 Lidovet – Bravet Ltda. 8 Motor de suspensión – Fava Ltda. 9 Vicryl 4-0. -Ethicon.

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formação de matriz óssea, notando-se apenas o preenchimento do defeito por coágulo. De acordo com Donohve e Mascres (1993), a hidroxiapatita inibe, inicialmente, a formação óssea, o que pode justificar a ausência de matriz óssea neste grupo oito dia após a implantação. Aos 15 dias, aproximadamente 90% da borda do defeito foi reabsorvida no grupo-controle, e houve formação de novo tecido ósseo caracterizado por trabéculas espessas. No grupo tratado, as partículas de hidroxiapatita mostradas como material amorfo, acelular e bem delimitado eram rodeadas por um novo osso (Fig. 1), que também estava presente em toda a superfície do defeito, permitindo a osteointegração. Em outro ponto do defeito, na mesma data, foram vistas partículas de hidroxiapatita rodeadas apenas por tecido fibrovascular, sem formação óssea. De acordo com Callan e Rohrer (1993), o tecido fibrovascular é precursor do novo tecido ósseo. Com 21 dias após a implantação da hidroxiapatita, a borda do defeito de um cão tinha sido parcialmente reabsorvida, havendo a formação de matriz óssea acelular e a deposição de tecido conjuntivo hemorrágico sobre a sua superfície. Além disso, a hidroxiapatita não foi encontrada. Outro animal do grupo tratado e um do grupo-controle apresentaram formação de trabéculas ósseas.

Figura 1. Partículas de hidroxiapatita (seta grossa) rodeadas por osso trabecular e osteoblastos (seta fina) 15 dias após a sua implantação no defeito provocado no processo alveolar direito da mandíbula de cão. HE. 400X. HE. 400X.

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Aos 42 dias, houve formação óssea no grupo tratado, com início de diferenciação de osso trabecular em osso lamelar, caracterizado por amplos canais de Havers. No entanto, ainda foram encontrados osso trabecular não remodelado e áreas de grande neovascularização e hemorragia, partículas de hidroxiapatita rodeadas por tecido ósseo trabecular e capilares no interior dos seus poros (Fig. 2).

Figura 2. . Partículas de hidroxiapatita (seta) rodeadas por tecido ósseo trabecular, 42 dias após a sua implantação no defeito provocado no processo alveolar direito da mandíbula de cão. HE. 100X. No grupo controle, houve apenas aumento na formação de osso trabecular na periferia do defeito, com algumas regiões ainda não-reabsorvidas, sem a organização em osso lamelar. Ao comparar o grupo tratado com o grupo controle, a partir do décimo quinto dia do pós cirúrgico, percebeu-se que a formação de osso jovem com intensa atividade de osteoblastos e a neovascularização foram mais evidentes na presença da hidroxiapatita. Segundo Jensen et al. (1996) e De Vicente et al. (2000), a hidroxiapatita funciona como um suporte para a migração de células osteoprogenitoras originadas no receptor e nos túneis vasculares, permitindo a aposição óssea. De acordo com White e Shors (1986), o tamanho e o grau de conexão entre os poros do biomaterial são fundamentais para o crescimento vascular e ósseo no seu interior. A porosidade da hidroxiapatita, utilizada neste experimento, permitiu o crescimento de tecido fibrovascular e a migração de células no seu interior. Tal fato induziu a formação óssea e, conseqüentemente, a regeneração óssea do

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processo alveolar de cães, evidenciando a propriedade osteocondutora da hidroxiapatita. A manutenção do volume e da estrutura porosa do implante, na fase inicial de regeneração óssea,é um fator importante para a função osteogênica das biocerâmicas (Jensen et al.,1996; Ripamonti,1996; Kurashina et al., 2002). A hidroxiapatitaT290800-1, usada neste experimento, manteve volume constante até 60 dias de implantação no defeito periodontal e, onde a biocerâmica estava presente, a formação óssea e a neovascularização foram mais intensas.Segundo White e Shors (1986), a degradação da hidroxiapatita pode ocorrer por reabsorção mediadapor osteoclastos ou dissolução química. De acordo com Oonishi et al. (1997), o mecanismo de reabsorção da hidroxiapatita pode envolver a fratura das partículas à medida que ocorre a formação do novo osso no interior dos poros intragranulares. Como não foram vistos osteoclastos, é possível que tenha sofrido dissolução química ou fraturas no decorrer da formação óssea.Aos 90 dias, tanto no grupo tratado quanto no grupo-controle, a periferia do defeito foi totalmente preenchida por osso lamelar e apenas o centro apresentou osso trabecular. Cento e vinte dias após o procedimento cirúrgico, não havia mais limite entre as margens do defeito e o novo osso formado em ambos os grupos, e o defeito estava completamente preenchido com osso lamelar compacto. No grupo tratado, foram verificadas áreas hemorrágicas ainda aos 120 dias do pós-operatório, possivelmente devido à intensa angiogênese apresentada. A ração dura foi suficiente para causar microlesões nos vasos recém-formados durante a mastigação e provocar hemorragia. Neste estudo, ao contrário do encontrado por Borges (1998), ao se implantar hidroxiapatita sintética na tíbia de cães, não foram observadas células que indicassem reação de corpo estranho, nem foram reveladas necrose óssea, desintegração da matriz, osteoclasia e formação tipo sarcomatosa. Apesar de Brown et al. (1998) afirmarem que a estabilidade do implante é essencial para promover a angiogênese precoce e a osteointergração, a instabilidade provocada pelo sangramento e pelas forças de oclusão parecem não ter influenciado a regeneração óssea.

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CONCLUSÕES A hidroxiapatita T290800-1 apresentou propriedade osteocondutora, revelou-se biocompatível e acelerou o preenchimento de defeitos provocados no processo alveolar da mandíbula de cães.

AGRADECIMENTOS A JHS Laboratório Químico, Belo Horizonte - MG

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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V. 10: BIOCOMPATIBILIDADE E COMPORTAMENTO DE COMPÓSITOS DE HIDROXIAPATITA EM FALHA ÓSSEA NA

ULNA DE COELHOS [Biocompatibility and behavior of hydroxyapatite on bone defect on

rabbit’s ulna]

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.58, n.2, p.175-183, 2006

C.C. Vital1, A.P.B. Borges2*, C.C. Fonseca2, A.C. Tsiomis1, T.B. Carvalho1,

E.B. Fontes3, M.P. Sena1, G. Fófano1 1Aluno de Pós-Graduação - UFV – Viçosa, MG

2Departamento de Veterinária – UFV Avenida P.H. Rolfs, s/n

36570-000 – Viçosa, MG 3Aluna de graduação – UFV – Viçosa, MG

RESUMO

Avaliaram-se os compósitos de hidroxiapatita sintética e carbono (HAC) e hidroxiapatita sintética, carbono e fosfato biácido de sódio (HACF), ambos na forma sólida, como substituto ósseo em 36 coelhos adultos. Após protocolos anestésico e cirúrgico habituais, retirou-se um fragmentode aproximadamente 2cm de comprimento no terço médio da ulna esquerda. Os animais do grupo 1 receberam, em cada falha provocada, blocos de HAC e HACF, e os do grupo 2 somente HAC. Os do grupo 3 não receberam tratamento. Os animais foram submetidos a avaliações clínicas e radiológicas nos dias 8, 15, 30, 60, 120 e 180 de pós-operatório. Nas mesmas datas, dois animais de cada grupo foram sacrificados e deles colheuse material para histologia. Observou-se evolução normal da regeneração óssea em todos os animais, sendo mais precoce nos dos grupos que receberam os compósitos. O uso de HAC e HACF na ulna de coelho mostrou-se um método eficiente, não apresentando sinais de infecção e nem evidência de rejeição. Palavras -chave: coelho, biomaterial, hidroxiapatita, substituto ósseo

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ABSTRACT

Composites of synthetic hydroxyapatite and carbon (HAC) and synthetic hydroxyapatite, carbon and sodium biacid phosphate (HACF), both of them in solid form, as substitute in bone regeneration were studied. Thirty-six rabbits divided in three groups were used. After routine anesthetic and surgical procedure, a bone fragment with two-centimeter in length was taken from the middle part of the left ulna. Animals from group 1 received one block of HAC and HACF, from group 2 received only HAC, in the criated bone defect, and animals from group 3 did not receive any treatment. They were submitted to clinical and radiographic examinations at 8, 15, 30, 60, 120 and 180 days after surgery to evaluate bone healing. At the same dates, two animals of each group were enthanised and bone fragments were collected for histological evaluations. The results showed normal evolution of bone regeneration in all groups but faster in animals that received the composites. The use of HAC and HACF showed to be efficient and biocompatible, and not caused rejection. Keywords: rabbit, biomaterial, hydroxyapatite, bone substitute

INTRODUÇÃO

A utilização de biomateriais no reparo de partes danificadas do tecido ósseo tem revolucionado a ortopedia e a odontologia atuais. O emprego de substâncias químicas que facilitem a reparação óssea, através da osteogênese, osteoindução e osteocondução, é alvo de pesquisas constantes (Borges, 1998; Franco et al., 2001; Legeros,2002). Os biomateriais podem ser definidos como substâncias de origem natural ou sintética, tolerados de forma transitória ou permanente pelos diversos tecidos que constituem os órgãos dos seres vivos (Moraes, 2002). Eles devem ser inertes, degradáveis e absorvíveis e favorecerem o crescimento ósseo por condução e, se possível, por indução. Essas características dependem das propriedades físicas e químicas do material, que devem ser compatíveis com as reações fisiológicas do osso (Borges, 1998). O grupo de biomateriais que mais se assemelham à composição do osso é o das cerâmicas de fosfato de cálcio (Legeros, 2002), dentre as quais a mais difundida é a hidroxiapatita (HAP), cuja estrutura química é representada

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pela fórmula C10(PO4)6(OH)2. A HAP, produzida sinteticamente desde o início dos anos 70, tem sido usada clinicamente desde o início dos anos 80 (Schmitz et al., 1999). As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HAP) são bem documentadas na literatura. Ela já foi utilizada na correção de defeitos ósseos no homem e em várias espécies animais, com resultados satisfatórios o suficiente para ser indicada como alternativa para a enxertia óssea na rotina clínica (Franco et al., 2001; Legeros, 2002). Segundo Schmitz et al. (1999), Franco et al. (2001) e Legeros (2002), a HAP é biocompatível com o osso pelo fato de possuir a mesma estrutura cristalina, sendo assim considerada como o sólido inorgânico mais importante em biologia. A HAP é esterilizável e relativamente não absorvível (Pollick et al., 1995; Ono et al., 2000). É vantajosa por causa de sua composição uniforme, alta biocompatibilidade, segurança (não é tóxica, nem alergênica ou carcinogênica) e pelo fato de sua microestrutura (tamanho dos poros) ser completamente controlável (Ono et al., 2000). A estrutura porosa da hidroxiapatita funciona como suporte passivo à neoformação vascular, o que leva à proliferação de fatores indutores da aposição óssea (Borges, 1998). Segundo Vidigal Jr. e Goisman (2003), a superfície porosa da hidroxiapatita parece fornecer um substrato adicional à proliferação do tecido ósseo. A hidroxiapatita permite a junção, proliferação, migração e expressão fenotípica de células ósseas, o que resulta em formação de novo osso, em aposição direta ao biomaterial (Sakano et al.,2001; Legeros, 2002). O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética associada apenas ao carbono e associada ao carbono e ao fosfato biácido de sódio no preenchimento de defeito ósseo na ulna de coelhos, pela avaliação de sua osteointegração, por meio de estudos clínicos, radiológicos e histológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se 36 coelhos adultos, clinicamente sadios, da raça Nova Zelândia, com média de peso de 3kg. Os animais foram alojados em gaiolas individuais, onde receberam ração comercial uma vez ao dia e água à vontade. Antes de serem confinados nas gaiolas, receberam uma dose única de 0,2ml de ivermectina1. Foram constituídos três grupos com 12 animais

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cada. Os do grupo 1 receberam hidroxiapatita associada ao carbono e ao fosfato biácido de sódio, os do grupo 2 receberam hidroxiapatita associada apenas ao carbono e os do 3 não receberam tratamento. Em todos os animais, produziu-se uma falha óssea no terço médio da ulna esquerda, conforme procedimento descrito a seguir: após tricotomia e desengorduramento do membro torácico esquerdo, os animais foram sedados com acepromazina2 1%, na dose de 0,2ml/kg e anestesiados com associação de tiletamina e zolazepam3, na dose de 0,4ml/kg, ambos pela via intravenosa. Fez-se uma incisão na face lateral no terço médio do membro torácico esquerdo, expondo a ulna por meio de incisão longitudinal da pele e afastamento do tecido muscular, produzindo uma falha óssea de, aproximadamente, 2cm em todo o seu diâmetro, com auxílio de um martelo ortopédico e um osteótomo. Introduziu-se, então, um bloco de aproximadamente 1,8×1,8×1,8 de hidroxipatita associada ao carbono e ao fosfato biácido de sódio e outro de hidroxiapatita, associada ao carbono, nos animais dos grupos 1 e 2, respectivamente. No grupo 3, o defeito provocado não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. Os tecidos incisados foram suturados de maneira rotineira. As avaliações clínicas e da ferida foram diárias, observando-se presença de reação inflamatória, sensibilidade à dor e deiscência da ferida. Não se utilizaram antibiótico e antiinflamatório durante o experimento. Foram realizadas radiografias dos membros operados nas posições mediolateral e craniocaudal, imediatamente após a cirurgia e aos 8, 15, 30, 60, 120 e 150 dias do pósoperatório, visando à comparação entre osso controle e osso tratado. Para análise histológica, de dois animais de cada grupo, sacrificados com super-dosagem de tiletamina e zolazepam, desarticulou-se o membro torácico esquerdo na articulação umeroradioulnar, nas mesmas datas de realização das radiografias. Para histologia, coletou-se material, de aproximadamente 2,5×2,5×2,5cm, sobre a região do implante das hidroxiapatitas. Fragmentos de mesmas dimensões foram retirados dos animais do grupo-controle. As amostras foram fixadas em formol a 10%, tamponado, por aproximadamente 20 dias. 1 Mogimec® Mogivet 2 Acepram® Univet

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Completada a fixação, as amostras foram descalcificadas em ácido fórmico a 10%, tamponado com citrato de sódio para pH 4,5 sob vácuo moderado, com duração média de 15 dias. A seguir, foram lavadas em água corrente, desidratadas em álcool 70, 80, 90 e 100% por, aproximadamente, 12 horas em cada etapa, com repetição, e diafanizadas em dois banhos de xilol, por duas horas cada. Os fragmentos foram embebidos em parafina e mantidos em estufa a 58oC durante uma noite e, então, incluídos em parafina. A seguir, cortes de 7μm foram obtidos em um micrótomo rotativo e montados em lâmina de vidro. De cada bloco de parafina foram obtidas, pelo menos, duas lâminas para que fossem submetidas à técnica de coloração pela hematoxilina-eosina, visando à identificação e análise histológica da amostra. Nas seções histológicas analisaram-se o padrão de regeneração do tecido com base nos graus de proliferação e diferenciação celular no tecido cicatricial, a neoformação óssea e sua maturação, a incorporação da hidroxiapatita ao osso, a formação de medula óssea e o nível de degradação do material investigado. Usou-se análise qualitativa descritiva e comparação entre os grupos tratados e controle.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Logo após a cirurgia, os animais não apoiaram o membro operado. Tanto no grupo-controle quanto nos grupos tratados, o retorno completo à função do membro ocorreu em aproximadamente sete dias, diferente dos resultados encontrados por Borges (1998), Rezende et al. (1998) e Franco et al. (2001), nos quais os animais não apresentaram nenhum grau de claudicação após o procedimento cirúrgico. A demora em apoiar o membro, provavelmente, deve-se ao tamanho do defeito ósseo, que resultou em maior trauma. Os animais apresentaram evolução clínica normal, não se observando quaisquer sinais de infecção ou complicação. A cicatrização da ferida cirúrgica ocorreu por primeira intenção, sendo os pontos retirados no oitavo dia, sem que houvesse indícios de rejeição da hidroxiapatita. Estes resultados clínicos levam a acreditar na biocompatibilidade das hidroxiapatitas testadas, estando de acordo com Oonishi et al. (1997), Yamamoto et al. (2000), Schmitz et al. (1999) e Legeros (2002). Após a cirurgia, nos grupos tratados, observou-se que o implante preencheu a falha óssea, sendo sua radiopacidade maior do que a do osso normal. Contudo, não diferiu, visualmente, entre os grupos. Isto pode ser

191

explicado pela fórmula química da hidroxiapatita, que, em função de seus constituintes químicos, apresenta elevado número atômico (Ono et al., 2000). Portanto, a imagem radiográfica é representada por radiopacidade. Nas radiografias feitas imediatamente após a cirurgia e aos 8, 15 e 30 dias do pós-operatório (Fig. 1), a radiopacidade do implante ainda foi superior

A B

C D

E

F

Figura 1. Radiografias de ulna de coelho tratado com hidroxiapatia (A, C, e E, grupo 1; B, D e F, grupo 2). A-oito dias após a cirurgia; B-15 dias após a cirurgia; C-30 dias após a cirurgia; D-60 dias após a cirurgia; E- 120 dias após a cirurgia; F- 120 dias após a cirurgia; seta- hidroxiapatita

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à do osso normal. Ela diminui gradativamente e, aos 60 dias, já era menor que a do osso (Fig. 1). Esse aspecto, já esperado, e descrito por Borges et al. (2000), pode ser atribuído à invasão de tecido conjuntivo junto ao processo normal de regeneração óssea. Deve-se considerar, ainda, que não há alteração na densidade da hidroxiapatita, uma vez que seu número atômico não se altera. Entretanto, o crescimento do tecido conjuntivo e do tecido ósseo, ao longo do tempo e ao redor das partículas de hidroxiapatita, contribui para diminuir sua definição (Rezende et al., 1998). No oitavo dia, nos animais dos dois grupos tratados, não havia sinais de qualquer reação óssea. No 15o dia, em todos os animais, pôde-se notar o começo de crescimento ósseo, notado pelo aumento da radiopacidade do defeito, que ocorria paralelamente à diminuição da radiopacidade da hidroxiapatita. O aumento de radiopacidade do defeito deve-se, provavelmente, ao começo da formação óssea que ocorreu no local. Aos 60 dias, a radiopacidade unia as extremidades da ulna, sugerindo a formação de uma ponte óssea. Em um dos animais foi observado crescimento ósseo deslocando a HAP. Aos 120 e 150 dias (Fig. 1), a hidroxiapatita ainda era visível, mas ocorreu a formação de duas corticais ósseas envolvendo o implante. Em apenas um animal, a massa radiopaca característica de hidroxiapatita, do grupo HAC, deslocou-se do lugar original, provavelmente por crescimento ósseo entre as extremidades fraturadas da ulna. Nos animais do grupo-controle, após a cirurgia, foi constatada a presença de falha óssea radiotransparente (Fig. 2). Segundo Fehlberg (2001), em todo processo de reparação óssea, desenvolve-se, inicialmente, tecido conjuntivo no foco da lesão, cuja radiopacidade é insuficiente para ser perceptível ao exame radiográfico, pelo fato de os constituintes químicos do tecido neoformado serem de baixo número atômico.

193

A B

C D

Figura 2. Radiografias de ulna de coelho do grupo-controle evidenciando o defeito ósseo (seta) produzido na ulna e sua evolução de radiopacidade. A-imediatamente após a cirurgia; B-15 dias após a cirurgia; C-30 dias após a cirurgia; D-60 dias após a cirurgia. Aos oito dias do pós-operatório, nos animais do grupo-controle, a imagem radiográfica foi semelhante à imagem obtida imediatamente após a cirurgia, indicando que aparentemente ainda não havia sinais de regeneração óssea. Aos 15 dias, observou-se em todos os animais início de radiopacidade da periferia para o centro da falha óssea. Aos 30 dias, na periferia do defeito, pôde-se notar radiopacidade semelhante à do osso normal, o que também foi observado por Rezende et al. (1998), Borges (1998) e Fehlberg (2001). Aos 60 dias, o defeito encontrava-se quase que em sua totalidade radiopaco como osso normal (Fig. 2). Aos 120 e 150 dias, o defeito ainda era visível, porém com a presença de uma ponte óssea. O defeito estava praticamente preenchido por tecido radiopaco, sugerindo a formação de tecido ósseo. A caracterização da presença de hidroxiapatita foi evidenciada por meio de análise histológica do grupo tratado, que se apresentou sob a forma de

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material amorfo, acelular, bem delimitado e com maior afinidade pela hematoxilina, já descrita por Borges (1998). Em todos os grupos, aos oito dias de pósoperatório, observou-se atividade osteoclástica nas bordas da fratura. Tal atividade sugere o início do processo de regeneração óssea, que é caracterizada pelo debridamento das bordas da lesão. Este achado é compatível com a descrição de Borges (1998), Franco (2000) e Fehlberg (2001). Percebeu-se intensa formação óssea com o esboço de cartilagem sendo substituído por tecido conjuntivo. O tecido condróide induziu a formação conjuntiva que será substituída pelo tecido ósseo (Fig. 3A e B). Foram observadas, ainda, áreas de medula óssea com ossificação intramembranosa, característico de processo de ossificação normal, como o descrito por Junqueira e Carneiro (1998), Slatter (1998), Flach et al. (2002) e Fossum (2002). No grupo-controle, aos oito dias de pósoperatório, foram identificados osteócitos encerrados em osso trabecular (Fig. 3) e osteoblastos localizados nas bordas das trabéculas ósseas, seguindo um processo normal de reparação óssea, conforme o descrito por Flach et al (2002) (Fig. 4A). Aos 15 dias de pósoperatório, observou-se predomínio de tecido cartilaginoso desorganizado e, ainda, presença de osso trabecular bem definido (Fig. 4B). A presença de tecido cartilaginoso desorganizado pode ser explicada pelo grande tamanho do defeito provocado, levando à maior instabilidade no foco da fratura. Essa instabilidade predispõe à formação de tecido cartilaginoso conforme descreveu Flach et al. (2002). Nos grupos com hidroxiapatita, aos 15 dias de pós-operatório, observou-se que a hidroxiapatita estava praticamente toda circunscrita por osso trabecular. Havia a presença de tecido conjuntivo desorganizado, agregados de tecido cartilaginoso na periferia da falha e intensa vascularização. Como foi descrito por Borges (1998), Borges et al. (2000) e Franco (2000), evidenciou-se grande aporte sangüíneo para a área, o que é um fator importante nos processos de reparação óssea. Aos 30 dias de pós-operatório, os animais do grupo-controle apresentaram formação de osso novo a partir das bordas da lesão, mas com a falha óssea preenchida por tecido conjuntivo frouxo, o que, segundo Fehlberg (2001), é característico de um processo de reparação normal. Havia a presença de projeções de tecido conjuntivo denso e restos de cartilagem, e, ainda, esboço de medula óssea e predomínio de osso trabecular. Nos grupos

195

tratados, observou-se maior formação óssea ao redor da hidroxiapatita, fato comprovado pelos resultados radiográficos. Na região da falha óssea, verificou-se a presença de osso trabecular (Fig. 3D e 3E). Aos 60 dias de pós-operatório, no grupo-controle, observou-se maior grau de substituição de tecido cartilaginoso por tecido ósseo quando comparado ao grupo de 30 dias. Porém, a formação óssea era mais evidente no grupo tratado, no qual o osso apresentava trabéculas mais espessas, tendendo a osso compacto (Fig. 3F), confirmando os achados de Oonish et al. (1997), Borges et al. (2000) e Franco et al. (2001), ao citarem a característica osteocondutora da hidroxiapatita. Aos 120 dias de pós-operatório, os achados histológicos mostraram um tecido ósseo denso bem mais desenvolvido nos grupos tratados do que no grupo-controle. A hidroxiapatita estava bem incorporada pelo tecido ósseo, havendo ainda presença de tecido conjuntivo na falha óssea e presença de osso se organizando em fase adiantada de regeneração (Fig. 4C). O processo de reparação óssea nos grupos tratados mostrou-se mais adiantado que no grupo-controle até as observações de 120 dias. A partir daí, e na observação seguinte, não houve diferença qualitativa entre os grupos. Esse fato reforça a afirmação de vários autores, como Oonish et al. (1997), Rezende et al. (1998), e Legeros (2002), os quais atribuem o efeito osteocondutor da hidroxiapatita como um favorecedor da regeneração óssea. A

196

Figura 3. Fotomicrografias de ulna de coelho aos 8, 30, 60 e 120 dias após confecção de defeito ósseo e adição de hidroxiapatita (A, B, C e D, grupo 1; E, F, G, H e I, grupo 2). A- oito dias, 40×; B- oito dias, 30×; C- oito dias, 50×; D- 30 dias, 40×; E- 30 dias, 260×; F- 60 dias, 60×; G- 120 dias, 20×; H- 120 dias, 80×; 120 dias, 40×. HE. TC: tecido cartilaginoso; OC: tecido ósseo compacto; OT: tecido ósseo trabecular; HAP: hidroxiapatita. Aos 150 dias, tanto nos grupos tratados quanto no grupo-controle, já existia medula óssea e, praticamente, não se notava mais a presença de tecido cartilaginoso. Nos dois grupos havia tecido ósseo maduro na região da falha, mostrando processos de reparação óssea bem adiantados, o que é compatível com os resultados de Franco (2000). Conclui-se que ambos os tipos de hidroxiapatitas usadas mostraram-se biocompatíveis, por não ter havido, em nenhum dos animais, qualquer indício de rejeição do implante ou de reação inflamatória. Nos animais tratados, o processo de regeneração óssea ocorreu mais cedo do que nos animais do grupo-controle, o que comprova a capacidade osteocondutora da hidroxiapatita.

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Figura 4. Fotomicrografias de ulna de coelho aos 8, 15, 120 e 150 dias após produção de defeito ósseo. A-8 dias, 600×; B- 15 dias, 40×; C- 120 dias, 30×; D- 150 dias. 30×. HE. OC: tecido ósseo compacto; M: matriz óssea; OT: tecido ósseo trabecular. Seta: osteócito encerrado em lacuna; seta larga – osteoblasto.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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200

V. 11 : O EFEITO DA HIDROXIAPATITA SINTÉTICA (HAP-91) NA REGENERAÇÃO ÓSSEA DE DEFEITO

PROVOCADO EXPERIMENTALMENTE NA REGIÃO DE FURCA EM DENTES DE CÃES

Tânia Berbert Ferreira Lima, Saulo Fernandes Mano de

Carvalho, Marco Túlio Pereira Carrijo, Hudson Armando Nunes Canabrava, Duvaldo Eurides ( Universidade Federal de

Uberlandia)

INTRODUÇÃO

As hidroxiapatitas vêm sendo estudadas como materiais para substituição ou remodelação óssea por apresentarem composição e estrutura semelhantes ao tecido ósseo. A HAP-91* é uma hidroxiapatita sintética utilizada para melhorar, aumentar, ou substituir parcialmente ou integralmente o tecido ósseo.

O objetivo deste trabalho foi investigar a HAP-91 na reparação de defeitos ósseos provocados na região de furca dental em cães.

201

Fez-se avaliação clínica e radiográfica de 5 cães, sem raça definida, com idade de 6 a 13 anos e peso variando de 3,5 a 15 Kg. Após anestesia os animais passaram por uma profilaxia oral. Defeito ósseo de pré molar inferior dos 5 cães foi provocado na furca dental com broca dental no 6 para baixa rotação. Estes defeitos foram preenchidos com HAP-91*. Os animais foram avaliados periodicamente para observação da ferida cirúrgica com relação a reação inflamatória e sensibilidade dolorosa. A avaliação radiográfica da região foi realizada antes do procedimento, imediatamente após e nos 11o, 21o e 71o dias, com os animais sedados.

Na avaliação clínica não foi observada fístula ou abcesso. A gengiva apresentava-se estável e fixa às estruturas subjacentes. Na sondagem realizada no 71o dia a profundidade do sulco gengival variava de 1 a 2mm na face vestibular do dente (Tabela 1). Radiograficamente constatou-se estabilidade do material e características normais do espaço periodontal. A densidade, porosidade e o tamanho das partículas da HAP-91â foram importantes para a implantação do material.

DIA 0 DIA 11 DIA 21 DIA 71

202

Día 0 Día 11 Día 21 Día 71

Tabela 1. Profundidade em milímetros do sulco gengival em três pontos da face vestibular dos dentes de cães com defeitos de furca após 71 dias de enxerto com HAP-91.

Vestíbulo Vestíbulo Vestíbulo CÃO Mesial Bucal Bucal Média I 1 2 2 1,66 II 1 1 1 1 III 1 1 1 1,33 IV 1 1 1 1 V 2 1 1 1,33

CONCLUSÃO

Este estudo demonstra a viabilidade da utilização da HAP-91 em defeitos ósseos em furca dental de cães.

203

V.12: AVALIAÇÃO DA RUGOSIDADE, CRISTALINIDADE E DISSOLUÇÃO IN VITRO DE RECOBRIMENTOS DE HIDROXIAPATITA PRODUZIDOS POR PLASMA SPRAY COM QUATRO DIFERENTES ESPESSURAS

S. N. da Silva1 ; M. M. Pereira1; J. R. Branco2 ; S.M.C.M.Bicalho3

1 – Escola de Engenharia-UFMG, 2- CETEC, 3- JHS Lab. Quim. Ltda INTRODUÇÃO No Brasil o número de pacientes que recebe implantes para corrigir defeitos ósseos acarretados por doenças ou traumatismos vem aumentando anualmente. Há uma grande demanda para procedimentos restaurativos como em implantes dentários, de quadris, joelhos ou ainda para outros procedimentos clínicos nos quais são utilizados biomateriais metálicos em reparos de partes do esqueleto humano. Atualmente, são mais de 150.000 implantes somente de joelho ou quadril a um custo médio de R$ 1500,00/implante (totalizando cerca de R$ 200 Milhões/ano), onerando o SUS - principal comprador nacional e comprometendo a balança de pagamentos uma vez que a maioria destes biomateriais é importada de países desenvolvidos. As principais causas internas que alimentam esta demanda são:

1. acidentes de trabalho urbano (650.000 casos) e de acidentes de trânsito em estradas federais (100.000 ocorrências);

2. população em envelhecimento (expectativa de vida - 70 anos);

3. Traumatismos desportivos, crimes com projéteis ou artefatos explosivos

Entre os vários problemas a serem abordados destaca-se a melhoria do desempenho dos biomateriais utilizados no país através do aumento da expectativa de vida-útil destas próteses (hoje girando em torno dos 10-15 anos). Sabe-se que as intervenções cirúrgicas para troca de implantes são caros e o seu financiamento pela sociedade tende aumentar em escala geométrica. O atual Estado da Arte é o recobrimento dessas próteses/implantes metálicos com a hidroxiapatita (cerâmica bioativa)

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agregando conteúdos tecnológicos e também inúmeras vantagens competitivas ao novo material. Estes implantes recobertos por spray a plasma já foram homologados em vários países (FDA, EMEA etc) do mundo. Contudo, a literatura mostra que cerca de 10% do total dessas próteses recobertas podem apresentar falhas (delaminação, desgaste triboquímico etc) devido a alterações na estrutura do recobrimento em meio fisiológico, diminuição da aderência e comprometimrnto da estabilidade mecânica. Neste trabalho foram estudadas alterações na cristalinidade e rugosidade em recobrimentos com espessuras de 25, 50, 75 e 100 mm e usando hidroxiapatita de dois diferentes fornecedores (USA e Brasil). Procurou-se usar tecnologia de ponta para a confecção de implantes recobertos com insumos nacionais; e assim, foi empregado um pó (Calcitek) que tem homologação pelo FDA há mais de 15 anos e um outro nacional (HAP-91, da JHS).

MATERIAIS E MÉTODOS: RECOBRIMENTOS Foram utilizados o pó de hidroxiapatita da Calcitek (USA) homologado pelo FDA (USA) há mais de 15 anos para aplicações em recobrimentos (Spray a plasma) e um outro pó nacional (HAP-91) com 70% de hidroxiapatita + 30% de - trifosfato de cálcio (-TCP)– produzido pela JHS. Os recobrimentos foram produzidos por plasma spray em um canhão METCO - 3MBII sobre placas da liga de titânio - Ti6Al4V (22x22x2mm) com índice de cristalinidade inicial em torno de 45%. As amostras foram previamente jateadas com alumina e desengraxadas com solução ácida diluída. Os parâmetros de spray a plasma (PSP) foram os seguintes: Distância tocha/substrato: 150 mm ; Corrente ionização: 400 A; Gás primário – Argônio: Vazão – 100 SCFH (47 l/min) e Gás secundário – Hidrogênio: Vazão – 10 SCFH (4,7 l/min); Vazão do pó: 4g/min. A espessura foi controlada através do número de passes sobre o substrato. A cristalinidade foi medida por difração de raio-X (DRX) com índice cristalinidade (IC) calculado pela proporção da área sob a curva. A rugosidade foi medida com um rugosímetro portátil Surtronic 3+, sendo feitas 5 leituras por amostra. TESTE IN VITRO – Foram realizados em solução que simula fisiológica (SBF – protocolo da Universidade Kyoto/Japão). As amostras recobertas foram imersas em SBF por 10, 20 e 30 minutos, temperatura de 37oC e pH 7,35.

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RESULTADOS E DISCUSSÕES As amostras após recobrimento apresentaram uma proporção semelhante de fosfato de cálcio amorfo (ACF). O percentual da fase -TCP presente no pó nacional (HAP-91) transformou-se no ambiente do spray a plasma em ACF, acarretando uma uniformização na distribuição desta fase não cristalina e também possivelmente estabilizando a hidroxiapatita ao longo da camada do revestimento. A figura 1 mostra o espectro de difração de raio-X (DRX) do pó da Calcitek e a figura 2 apresenta o formato característico da DRX do recobrimento para ambos os pós utilizados.

Figura 1. Difração de raio-X do pó da Calcitek 99,5% hidroxiapatita. Picos cristalinos – Equação Lorentz.

O índice de cristalinidade e (IC) do recobrimento foi determinado utilizando-se o seguinte cálculo: IC = área dos picos cristalinos do recobrimento / área dos picos do pó Calcitek

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A área dos picos cristalinos é área total do DRX (25 a 35) menos a área do álamo amorfo, para a deconvolução da curva foram empregadas funções matemáticas de Lorentz e Gauss.

Figura 2. Difração de raio-X do recobrimento sobre a liga de titânio. O percentual amorfo é representado pelo álamo (background) – Equação de Gauss

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Figura 3. Índice de cristalinidade dos recobrimentos com pó da Calcitek em função da espessura de 25, 50, 75 e 100 m, após dissolução em SBF.

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Figura4. Índice de cristalinidade dos recobrimentos com pó da JHS (HAP-91) em função da espessura de 25, 50, 75 e 100 m, após dissolução em SBF.

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Figura 5 Rugosidade média aritmética (Ra) em microns, dos recobrimentos com pó da Calcitek em função da espessura

de 25, 50, 75 e 100 m.

Figura 6. Rugosidade média aritmética (Ra) em mícron dos recobrimentos com pó da JHS (HAP-91) em função da

espessura de 25, 50, 75 e 100 m, após dissolução em SBF.

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CONCLUSÃO Após o recobrimento observou-se que as amostras de menor espessura (25 e 50 m) apresentavam uma tendência de maior IC e menor rugosidade (Ra) do que amostras mais espessas. Isto faz que a rugosidade do recobrimento acompanha a rugosidade inicial da liga de titânio jateada com alumina. Quanto ao IC do recobrimento, o substrato funcionaria como um sorvedor de temperatura o que induz também a um tratamento térmico local no filme depositado, aumentando a cristalinidade do recobrimento. Com a variação do tempo em SBF ocorreu um aumento da cristalinidade e uma diminuição da rugosidade. Este resultado está concatenado à dissolução ACF in vitro. Observou-se uma maior uniformidade na dissolução in vitro para os recobrimentos com pó nacional, provavelmente devido à presença de -TCP no pó. Esta fase, ao que tudo indica, funciona como um catalisador térmico, uniformizando a microestrutura do recobrimento. Conclui-se, portanto, que o pó da nacional (HAP-91 da JHS) é apropriado para uso em processos de recobrimentos por plasma spray. AGRADECIMENTOS FAPEMIG (pela bolsa de doutorado) e aos pesquisadores e colaboradores da Escola de Engenharia e do CETEC/MG pelo apoio.

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V.13: ESTUDO DA HIDROXIAPATITA SINTÉTICA ASSOCIADA AO COLÁGENO (COL.HAP-91) COMO VEÍCULO

DE ANTIMICROBIANO NA PROFILAXIA DA INFECÇÃO ÓSSEA PÓS-TRAUMÁTICA EXPERIMENTAL EM COELHOS

(Oryctolagus cuniculus)*

Tese de Doutorado Escola de Veterinária - UFMG - 2001

   A study of synthetic hydroxyapatite plus collagen as a local administration system of antibiotic in prophylaxis of experimental post‐traumatic bone infection in rabbits (Oryctolagus cuniculus) 

Hudson Armando Nunes Canabrava1, Cleuza Maria de Faria

Rezende2

RESUMO 

O objetivo deste trabalho foi estudar a hidroxiapatita sintética associada ao colágeno (COL.HAP-91) como veículo de antimicrobiano na profilaxia da infecção óssea pós-traumática experimental. Utilizaram-se 24 coelhos machos, raça Califórnia, e peso médio de 2,5 kg. Foi feita a osteotomia no terço médio do rádio direito, produzindo-se um fragmento de cerca de um centímetro de comprimento, inoculado com Staphylococcus aureus (106 UFC/0,01mL), oriundo de isolado clínico, e imediatamente recolocado no local de origem. Utilizando-se estudos radiográficos,macroscópicos e histológicos, além de determinações microbiológicas qualitativas e quantitativas, procurou-se avaliar comparativamente o efeito da administração local de cefazolina (50mg) agregada à COL.HAP-91 e da administração sistêmica de quatro doses (50mg), de oito em oito horas, do mesmo antibiótico, sobre a evolução da

1 Médico Veterinario. Profesor Adjunto. Doctor. Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade Federal de Uberlândia. Av. Pará,1720. Bloco 2A. Campus Umuarama. 38400902. Uberlândia, MG. Brasil. 2 Médica Veterinaria. Profesora Adjunta. Doctora. Departamento de Clínica y Cirurgia Veterinária. Escola de Veterinária/UFMG.

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Infecção óssea experimental. Após 30 dias de inoculação as amostras foram analizadas.As avaliações microbiológicas, radiográficas e anatomohistopatológicas mostraram que, tanto a administração local veiculada pela COL.HAP-91, como, a parenteral da cefazolina, contribuiramn para a profilaxia da infecção óssea postraumática experimental. Verificou-se eficacia similar entre o protocolo de administração local e a administração sistémica do antibiótico. Os resultados obtidos, associados as características biológicas positivas da hidroxiapatita e do colágeno, permitieram concluir que a COL.HAP-91 foi satisfatoria como veículo antimicrobiano na profilaxia da infecção óssea postraumática experimental. Palavras-Chave: Infecção óssea postraumática, profilaxia, hidroxiapatita, colágeno, cefazolina.

ABSTRACT

This study evaluated a composite of synthetic hydroxyapatite associated with collagen (COL.HAP-91) as a local administration system of antibiotic in prophylaxis of experimental post-traumatic bone infection in rabbits, using males rabbits (N=24) weighting 2,5 kg (mean weight). Osteotomy were done in the middle third of the right radio, in a way to obtain a bone fragment about one centimeter of length, and Staphylococcus aureus was inoculated at 106 UFC/0,01mL into its medulla. The fragment was replaced in anatomical site. Through the radiographic, macroscopic and histological studies, beside qualitative and quantitative microbiological determinations, the effect of local administration of cefazolin (50 mg) associated to COL.HAP-91 was compared to the administration of four fractional doses (50mg) by systemic route. After 30 days of inoculation the samples were collected and the analyses were done. The microbiological, radiographic, macroscopic and microscopic evaluations showed that the local plus COL. HAP-91 or systemic administration of cefazolin, contributed to the prophylaxis of the experimental post-traumatic bone infection. It showed the similar efficacy between the local and systemic administration protocols of the antibiotic. In conclusion, COL.HAP-91 plus cefazolin may be efficient in the prophylaxis of the posttraumatic osteomyelitis. Keywords: Post-traumatic osteomyelitis, prophylaxis, hydroxyapatite, collagen, cefazolin.

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V. 14: HIDROXIAPATITA SINTÉTICA PURA (HAP-91®), HIDROXIAPATITA SINTÉTICA ASSOCIADA AO COLÁGENO (COL.HAP-91®) E HIDROXIAPATITA SINTÉTICA ASSOCIADA A LIPOSSOMA (INT.HAP-91®) COMO SUBSTITUTOS ÓSSEOS EM DEFEITOS PROVOCADOS NA TÍBIA DE CÃES: ASPECTOS DA OSTEOINTEGRAÇÃO À MICROSCOPIA DE LUZ TRANSMITIDA

Artigo publicado na revista Arq Brasil. de Med. Vet. e Zoot., Belo Horizonte, v. 53, n. 4, p. 431-436, 2001.

KÁTIA LINHARES FRANCO1 ANDRÉA PACHECO BATISTA

BORGES2 MARLENE ISABEL VARGAS VILÓRIA3 EDILAINE SARLO FERNANDES1 ANDRESSA DE FARIAS

FEHLBERG1

Utilizaram-se 40 cães clinicamente sadios com o objetivo de avaliar histologicamente o efeito da hidroxiapatita sintética pura (HAP-91®), da HAP-91® associada ao colágeno (COL.HAP-91®) e da HAP-91® associada ao lipossoma (INT.HAP-91®) como substitutos ósseos em defeitos provocados na tíbia dos animais. Após protocolo anestésico, o procedimento cirúrgico constou de incisão na face medial e no terço proximal da tíbia esquerda, com retirada de um fragmento ósseo com cerca de 10 x 6 mm de tamanho. Os animais foram separados em quatro grupos de dez cada. No grupo 1 a falha óssea foi preenchida com HAP-91, no grupo 2 com COL.HAP-91 e no grupo 3 com INT.HAP-91. O grupo quatro não recebeu tratamento. Dois animais de cada grupo foram sacrificados nos dias 8, 30, 60, 120 e 180 de pós–operatório para 1 Especialista em Clínica e Cirurgia Veterinária – Departamento de Veterinária – UFV 2 Professor Adjunto – Setor de Cirurgia –Rua P.H.Rolfs s/n Campus Universitário - Departamento de Veterinária – UFV – 36 571 000 – andrea@mail.ufv.br - Autor para correspondência 3 Professor Adjunto – Setor de Patologia - UFV

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coleta de material para histopatologia,. Observou-se, aos oito dias, neoformação óssea no grupo controle e ao redor do implante nos grupos tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 Aos 30 dias, notou-se preenchimento do defeito, nos mesmos grupos, fato não observado no grupo COL.HAP-91. Portanto, conclui-se que a cicatrização óssea ocorreu nos grupos controle, tratados com HAP- 91 e INT.HAP-91, mais precoce neste grupo. Nos animais tratados com COL.HAP-91 não houve cicatrização completa.

Palavras chave – Hidroxiapatita Sintética, Substituto Ósseo, Cão.

SUMMARY

The objective of this work was to evaluate histologically the sinthetic hydroxyapatite (HAP-91), associated to collagen (COL.HAP-91) and associated to lipossome (INT.HAP-91), as bone substitutes. Fourty dogs clinically healthy were studied. After costume anaesthesic protocol, the surgical procedure consisted in skin incision on medial surface in the left tibial third middle. A bone fragment with 10 X 06 mm size was retreated in all animals, which were divided into four groups with ten animals each one. Group one received treatment with HAP-91, group two with COL.HAP-91, group three with INT.HAP-91and group four hasn’t received any treatment, it has been used as a control. Histological material was collected sacrificing two animals from each group on eight, 30, 60, 120 180 days after the surgery. Bone neoformation was observed on the 8th day, in control group and around the implant in group treated with HAP-91 and INT.HAP-91. On the 30th day, the defect has been filled up in same groups, fact was not observed in COL.HAP-91 group. Our conclusion is that the bone repair was complete in control group, HAP-91 group and INT.HAP-91 group (more premature). In the animals treated with COL.HAP-91it was not observed complet regeneration.

INTRODUÇÃOO uso de substâncias químicas que facilitem a reparação óssea, permitindo rápida osteogênese, osteoindução e osteocondução vem sendo vislumbrado como uma opção viável. Então, os biomateriais sintéticos

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adquirem importância, uma vez que são biocompatíveis, de fácil aplicação e acondicionamento, além de favorecerem o crescimento ósseo, seja por ação osteoindutora ou osteocondutora. As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HAP) são bem documentadas na literatura, tendo sido utilizada na correção de defeitos ósseos no homem e em várias espécies (Arakaki et al., 1995; Geesink & Hoefnagels, 1995; Kveton et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995), com resultados suficientes para indicá-la como alternativa para a enxertia óssea na rotina clínica. Nelson et al. (1993), Arakaki et al. (1995), Borges (1998) e Rezende et al.(1998) relatam a biocompatibilidade da HAP com o osso, baseada no fato de possuir a mesma estrutura cristalina e química do osso vivo, sendo considerada, portanto, como o sólido inorgânico mais importante em biologia (Heikkilla et al., 1993; Saalfeld et al.,1994). Ela não tem capacidade osteoindutiva,mas atua como matriz passiva para o crescimento ósseo, razão pela qual é considerada como um material osteocondutor (Callan & Rohrer, 1993; Heikkilla et al., 1993; Borges, 1998; Rezende et al., 1998). O efeito do uso do colágeno como substituto ósseo, seja sozinho ou associado a outro material, ainda não é bem elucidado. Porém, ele pode ser utilizado associado às biocerâmicas como forma de prevenir a migração de partículas do material, antes que seja incorporado ao tecido hospedeiro (Bell & Beirne, 1988). Os estudos histológicos realizados por Najjar et al. (1991) evidenciaram atividade osteoblástica com formação de osso imaturo duas semanas após o implante. Com quatro semanas, notou-se tecido ósseo circundando partículas de HAP e início de remodelação óssea. Geesink & Hoefnagels (1995), observaram tecido periosteal, osteoblastos e osteócitos maduros em contato com a hidroxiapatita, sem interferência de tecido fibroso em implantes de hidroxiapatita colocados no fêmur de cães após seis semanas de pós-operatório. Heikkilla et al. (1993) relataram reação inflamatória branda ao redor do implante, estando presente apenas linfócitos e macrófagos, à semelhança do que era observado no grupo controle. Ainda, após três semanas havia fibrose ao redor do implante, enquanto que às seis e 12 semanas já havia osso lamelar recobrindo-o. Callan & Rohrer (1993) acreditam que o tecido ósseo formado em contato com a hidroxiapatita seja originário do tecido fibroso circunvizinho às partículas de HAP.

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Estudos de Borges (1998), mostraram tecido fibrovascular circundando a HAP-91e tecido ósseo novo na região endosteal aos oito dias após o implante, tanto no grupo controle como no tratado. Observou-se evolução da reparação óssea e aos 120 dias o defeito possuía característica de osso normal. O exame histológico revelou, ainda, em alguns casos, reação tipo corpo estranho caracterizada por células gigantes, macrófagos e presença de tecido conjuntivo ao redor da HAP-91. Pissiotis & Spangberg (1990), em estudo de implante de HAP-91 e HAP-91 associada ao colágeno na mandíbula de cobaias, não observaram alteração da biocompatibilidade em nenhum dos dois tratamentos. Estes autores observaram que, no período de oito semanas de pós-operatório, o grupo implantado com HAP-91 associada ao colágeno não apresentava indícios de reparação óssea, ao contrário do grupo tratado somente com a HAP-91. Bell & Beirne (1988) descreveram tecido fibroso, ocasionais macrófagos e células gigantes circundando implantes de HAP e HAP associada ao colágeno, sugerindo uma resposta inflamatória mínima. As observações foram feitas com quatro e 12 semanas, sem alterações no padrão de reparação óssea em ambos os grupos. O objetivo deste trabalho foi comparar histologicamente o efeito da hidroxiapatita sintética pura (HAP-91), associada ao colágeno (COL.HAP-91) e associada a lipossoma (INT.HAP-91), na reparação de defeitos ósseos provocados na diáfise proximal da tíbia de cães.

MATERIAIS E MÉTODOS

No presente trabalho foram utilizados três tipos de

hidroxiapatita, produzidas segundo Andrade et al. (1997): a hidroxiapatita

sintética pura (HAP-91)4, foi acondicionada em frascos de vidro e

esterilizada em autoclave; a INT.HAP-912 (98,69% de HAP-91 e 1,31%

de lipossoma) e a COL.HAP-913 (75% de HAP-91 e 25% de colágeno), as quais foram esterilizadas em ambiente de óxido de etileno. 4 HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda 2 INT.HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda 3 COL.HAP-91 JHS Laboratório Químico Ltda

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O estudo experimental foi realizado usando-se 40 cães adultos clinicamente sadios, sem raça definida, com peso corporal médio de 15 kg, provenientes do canil experimental do Departamento de Veterinária da UFV. Foram constituídos quatro grupos, cada um com 10 animais. Os animais do grupo um foram tratados com HAP-91, os do grupo dois com COL.HAP-91, os do grupo três receberam INT.HAP-91 e o grupo quatro não recebeu nenhum tratamento, sendo utilizado como controle. Em todos os animais utilizou-se o mesmo protocolo anéstesico, que constou de sedação com acepromazina (0,1mg/kg/IV) e anestesia geral com pentobarbital sódico (15mg/kg/IV). Nos membros pélvicos esquerdos dos animais, devidamente preparados para cirurgia, fez-se uma incisão de pele na face medial do terço proximal da tíbia esquerda, segundo Piermattei & Greeley (1988). Em seguida, a musculatura foi afastada e o periósteo incisado e descolado do osso. Posteriormente, delimitou-se, com o auxílio de perfurador ortopédico e brocas de 1,5 mm, um fragmento ósseo retangular de aproximadamente 10 x 6 mm de tamanho, até atingir o canal medular. Este fragmento foi retirado da tíbia com o auxílio de osteótomo e a falha preenchida ou não com o substituto ósseo correspondente. Não foram utilizados antibióticos e antiinflamatórios em nenhuma fase do experimento. Para as análises histológicas, dois animais de cada grupo foram sacrificados aos oito, 30, 60, 120 e 180 dias de pós-operatório e amostras transversais do defeito ósseo foram colhidas, fixadas em formol neutro a 10% durante 48 horas e em seguida descalcificadas (ácido fórmico a 10% em tampão citrato). Após total descalcificação, os fragmentos foram lavados em água corrente durante 24 horas, processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina e cortados em micrótomo de rotação obtendo-se cortes histológicos com 5mm de espessura. Estes cortes foram corados pela técnica de hematoxilina e eosina e observados ao microscopio de luz transmitida (Luna, 1968). Análise qualitativa descritiva foi feita nas secções histológicas, avaliando-se o padrão de regeneração tecidual.

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RESULTADOS E DISCUÇÃO

Os resultados obtidos pelo uso de hidroxiapatita sintética pura ou associada, em procedimentos ortopédicos e em diferentes espécies, indicam-na como substituto ósseo, considerando-se suas características vantajosas (Saalfeld et al., 1994; Arakaki et al, 1995; Geesink & Hoefnagels, 1995; Kveton et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995; Rezende et al., 1998) são também atribuidos os resultados positivos à capacidade osteocondutora da hiodroxiapatita sintética, fator importante em ortopedia. Nelson et al. (1993) relatam que pela histologia de secções descalcificadas não se consegue visualizar o estágio inicial da reparação óssea. Entretanto neste estudo o uso dessas secções, permitiu a análise detalhada do processo de reparação óssea, principalmente com relação a resposta celular. As análises histológicas do defeito ósseo dos animais dos grupos tratados mostraram, aos oito dias de pós-operatório, um material amorfo, acelular e bem delimitado, correspondendo aos produtos utilizados para preenchimento do defeito, o que está de acordo com os resultados descritos por Heikkilla et al. (1993) e Borges (1998) observou-se ainda a presença de tecido de granulação preenchendo o defeito ósseo, foi mais exuberante nos animais dos grupos tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 , caracterizado principalmente por maior número de vasos sangüíneos. Embora na literatura não tenham sido encontrados dados que descrevam este achado, ela sugere- um efeito angiogênico destes materiais. Ainda nos animais que receberam INT.HAP-91, observou-se formação de osso trabecular ao redor do implante, com numerosos osteoblastos na superfície trabecular e ostéocitos aparentemente viáveis (Fig.2). Najjar et al (1991) descrevem tecido ósseo circundando as partículas de HAP a partir de quatro semanas e Heikkilla (1993) e Geesink & Hoefnagels (1995) depois de seis semanas de pós-operatório. A presença deste tecido aos oito dias neste experimento, no grupo supracitado, sugere uma maior capacidade osteocondutora da INT.HAP-91, provavelmente por ação quimiotática do lipossoma sobre osteoblastos e angioblastos. Aos 30 dias após implantação os animais do grupo controle e os que foram tratados com HAP-91 e com INT.HAP-91 mostraram tecido ósseo trabecular preenchendo toda a falha, como descrito por Najjar (1991) e Borges (1998), não sendo observado nos animais do grupo tratado com COL.HAP-91. Este grupo mostrou formação de osso novo a partir das

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bordas da falha (Fig.1) e o centro da mesma manteve-se com presença de tecido fibro-vascular, o que caracteriza um retardo no processo de cicatrização óssea quando comparado aos outros grupos. Nos animais dos grupos controle e tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 observou-se, aos 60 dias de pós-operatório, início de remodelação do tecido ósseo lamelar que preenchia o defeito, porém nos animais que receberam INT.HAP-91 já era possível observar a formação de ósteons secundários. Por outro lado, nos animais que receberam COL.HAP-91, observou-se trabéculas ósseas delgadas e tecido fibrocartilaginoso, a partir do qual iniciava-se a formação de osso novo (Fig.3). Entretanto, Pissiotis & Spangberg (1990) não constataram indícios de reparação óssea no mesmo período de pós-operatório quando utilizaram a hidroxiapatita associada ao colágeno. Aos 120 e 180 dias de pós-operatório, todos os animais dos grupos controle e os que receberam HAP-91 e INT.HAP-91 mostraram tecido ósseo maduro. Entretanto, aos 180 dias, este tecido ósseo era semelhante somente entre os animais do grupo controle e os que receberam INT.HAP-91, estando constituído principalmente por ósteons secundários. Os animais que receberam HAP-91 ainda mostraram numerosos ósteons primários com atividade de remodelação óssea. Nos animais tratados com COL.HAP-91, observou-se preenchimento incompleto do defeito ósseo, com presença de tecido fibroso. Ao contrário desta observação, Bell & Berne (1988) não encontraram alterações no padrão de reparação óssea, quando compararam a hidroxiapatita pura e a hidroxiapatita associada ao colágeno. Contudo, Pissiotis & Spangberg (1990) constataram que o tecido ósseo de reparação mostrava-se mais imaturo quando o implante se constituía de colágeno associado à hidroxiapatita. Baseados nestas observações, pode-se inferir que a associação do colágeno com a hidroxiapatita parece diminuir a capacidade osteocondutora do material na reparação óssea. Observou-se, ainda, num animal tratado com HAP-91, após 30 dias de cirurgia, a presença do material no tecido mole adjacente ao defeito ósseo, estando rodeado por fina cápsula de tecido fibroso e numerosos mononucleares, sugerindo reação do tipo corpo estranho, como o encontrado por Borges (1998). Em outro animal do mesmo grupo, aos 60 dias de pós–operatório, também observou-se hidroxiapatita encapsulada no tecido adjacente, porém sem reação inflamatória do tipo corpo estranho. Estes resultados sugerem, mais uma vez, a

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biocompatibilidade da HAP-91. Próximo à região periosteal não houve crescimento de tecido ósseo ao redor do produto localizado no tecido subcutâneo,o que sugere efeito não osteoindutor, estando de acordo com as observações de Callan & Rohrer (1993), Heikkilla et al. (1993), Borges (1998) e Rezende et al. (1998).

Figura 1- Espécime tratada com COL.HAP-91, 30 dias após a cirurgia. Início do crescimento ósseo a partir da borda do defeito (setas). Tecido de granulação (TG), osso velho (OV). HE. 100X.

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Figura 2- Espécime tratada com INT.HAP-91®, oito dias após a

cirurgia. A- Osso trabecular ao redor da INT.HAP-91® (seta). HE. 63X. B- Detalhe. Osteócitos (OT) e osteoblastos (setas). HE.400X.

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Figura 3- Espécime tratada com COL.HAP-91®, 60 dias após a cirurgia. A- Crescimento tipo endochondral. HE. 100x. B- Detalhe do tecido cartilaginoso HE.400X.

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Portanto, com base nos resultados histológicos observados no experimento, conclui-se que o processo de reparação óssea observada nos animais tratados com HAP-91 e INT.HAP-91 foi semelhante e normal à dos animais do grupo controle. A hidroxiapatita sintética associada ao lipossoma (INT.HAP-91) apresentou melhor reparação óssea e a hidroxiapatita associada ao colágeno parece possuir menor capacidade osteocondutora.

AGRADECIMENTOS Agradecemos à JHS – Laboratório Químico Ltda, na pessoa da Professora Sheyla M. C. Máximo Bicalho, pela valiosa colaboração científica prestada durante a elaboração deste trabalho e pelo financiamento parcial para a execução do mesmo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, A. L.; MACHADO, H.B.; BICALHO, S.M. et al. Síntese da hidroxiapatita (HAP-91) a partir da calcita. 20 Reunião Anual da S.B.Q. Poços de Caldas, MG.1997. ARAKAKI, M., YAMASHITA, S., MUTAF, M., et al. Onlay silicone and Hydroxyapatite-Tricalciumphosphate composite (HAP-TCP) blocks interfere with nasal bone growth in rabbits. Cleft Palate-Craniof. J., v. 32, n. 4, p. 282-289, 1995. BELL, R. & BEIRNE, O. R. Effect of Hydroxylapatite, Tricalcium Phosphate, and Collagen on the Healing of Defects in the Rat Mandibule J Oral Maxillofac Surg., v. 46, p. 589-594, 1988. BORGES, A.P.B. O efeito da hidroxiapatita sintética na regeneração óssea de defeito provocado experimentalmente no terço proximal da tíbia, de cães (canis familiares). Estudo clínico-cirúrgico, radiológico e histológico por microscopia de luz e microscopia eletrônica de retrodispersão. Belo Horizonte: UFMG, Escola de Veterinária, 1998. 112p. Tesis (Doctorado en Ciencia Animal). CALLAN, D. P. & ROHRER, M.D. Use of bovine-derived hydroxyapatite in the treatment of edentulous defects: a human clinical and histologic case report. J Periodontol., v. 64, n. 6, p. 575-582, 1993. HEIKKILA, J., AHO, A. J., YLI-URPO, A., et al. Bioactive glass versus hydroxylapatite in reconstruction of osteochondral defects in rabbit Acta Orthop Scand., v. 64, n. 6, p. 678-682, 1993.

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225

V. 15: HIDROXIAPATITA SINTÉTICA HAP-91 COMO SUBSTITUTO ÓSSEO EM DEFEITO EXPERIMENTAL PROVOCADO NO TERÇO PROXIMAL DA TÍBIA EM CÃO: ASPECTOS À MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO

Arq.Brasil. de Med. Vet e Zoot, Belo Horizonte, v. 52, n. 6, p. 616-

620, 2000.

Andréa Pacheco Batista Borges1, Cleuza Maria de Faria Rezende2, Múcio Flávio Barbosa Ribeiro2, Eliane Gonçalves Melo2, Pedro

Isidro Nobrega Neto3

 

RESUMO

Com o objetivo de estudar a hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo, foram utilizados oito cães adultos, sem raça definida, clinicamente sadios. Após protocolo anestésico e cirúrgico habituais, foi provocado um defeito ósseo na diáfise proximal das tíbias esquerda e direita, sendo implantada a HAP-91 apenas na tíbia direita. Os animais, dois de cada vez, foram sacrificados aos oito, trinta, sessenta e cento e vinte dias após a cirurgia, quando foram obtidas amostras do local da lesão, que foram fixadas, lavadas, polimerizadas, cortadas e submetidas à dupla coloração em solução aquosa de acetato de uranila a 1% e em solução de citrato de chumbo. Estas secções foram avaliadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Os componentes tissulares na tíbia tratada e na e na controle foram similares. A absorção da HAP-91 foi caracterizada pela presença de células multinucleadas na interface entre HAP-91 e osso, morfologicamente consideradas como osteoclastos

1 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa. AV. P. H. Rolfs s/n. Viçosa. MG Brasil.36.571.000. andrea@mail.ufv.br. 2 Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais. Av. Antônio Carlos 6627. Cx. P 567. Belo Horizonte. MG. 30.161-970 3 Escola de Veterinária. Universidade de Paraíba – Patos.

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Ainda, encontrou-se a presença de grânulos de HAP-91 no interior de células morfologicamente caracterizadas como macrófagos. Portanto, ao microscópio eletrônico de transmissão, os componentes tissulares, na tíbia tratada e na controle foram similares. A absorção da HAP-91 foi caracterizada pela presença de células multinucleadas na interface entre HAP-91 e osso, morfologicamente consideradas como osteoclastos. Ainda, encontrou-se a presença de grânulos de HAP-91 no interior de células morfologicamente caracterizadas como macrófagos. Portanto, a absorção celular de grânulos de HAP-91, concomitante com a formação adjacente de osso novo, sugere que a osteointegração da HAP-91 seja análoga ao processo normal de reabsorção - aposição óssea.

Palavras chaves: Hidroxiapatita sintética, substituto ósseo, cão.

ABSTRACT

With the objective of studying the synthetic hydroxyapatite (HAP-91) as a bone substitute, it were used eight healthy mongrel adult dogs. Following the habitual anesthetic and surgical protocol, a bone defect was provoked in the proximal diafisis of the left and right tibias, being implanted the graft of HAP-91 just in the right tibia. The animals, two at each time, were sacrificed at the eight, thirty, sixty and one hundred and twenty days after the surgery, when it were obtained samples of the place of the lesion, that were fixed, washed, embedded, polymerized, cut and submitted to the double coloration in solution of uranil acetate at 1% and in solution of lead citrate. These sections were examined and photographed in electronic transmission microscope. The tissue components were identified as they are found in the normal bone of dogs, as well in the control tibia and the treated tibia. It was still found the simultaneous presence of HAP-91, with the adjacent formation of new bone, which suggests that the osseointegration of HAP-91 is similar to the normal process bone reabsorption-apposition. Key words: Synthetic hydroxyapatites, bone substitutes, dog.

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INTRODUÇÃO A utilização de técnicas histológicas que evidenciam fatores ultraestruturais permite estudar o processo de formação e reabsorção óssea associado a substitutos ósseos, bem como a biodegradação dos mesmos. A hidroxiapatita sintética é um material biocompatível, não imunogênico e biodegradável (Nagahara, et al., 1992, Overgaard et al., 1997 e Borges, 1998). Entretanto, o mecanismo responsável por sua biodegradação ainda não é claro. Gomi et al. (1993) mostraram a presença de células multinucleadas na interface hidroxiapatita e osso depois da implantação, que podem ser caracterizadas morfologicamente como osteoclastos, responsáveis pela biodegradação da hidroxiapatita. Hemmerle et al. (1997) encontraram cristais de hidroxiapatita separados e espalhados em citoplasma de células com fatores ultraestruturais semelhantes a macrófagos. Borges (1998) encontrou osteoclastos ativos sobre a HAP-91 e alguns grânulos do produto no interior de macrófagos. Donath (1990) relacionou o nível de reabsorção da hidroxiapatita com a sua sintetização. Nagahara, et al. (1992) relataram que a hidroxiapatita sintetizada a 950oC, quando implantada em fêmur de ratos, foi reabsorvida lentamente com uma notável separação do material e substituição por células mesenquimais com fatores ultraestruturais semelhantes a células osteogenitoras. Li et al. (1995) e Edwards et al. (1997) observaram que a reabsorção celular de grânulos de hidroxiapatita ocorre concomitante com a formação adjacente de osso novo. Apesar da hidroxiapatita não induzir neoformação óssea, normalmente utiliza-se o termo osteogênese (Nagahara et al., 1992). A reação de células osteogênicas com hidroxiapatita “in vivo” (Edwards et al., 1997 e Borges, 1998) e “in vitro” (Bagambisa & Schilli, 1990) mostrou que a sua superfície é osteocondutiva. O resultado desta atividade foi a deposição de tecido ósseo diretamente sobre a superfície da hidroxiapatita implantada, sem nenhuma evidência de encapsulação ou tecido de granulação (Bagambisa & Schilli, 1990). Entretanto, mesmo não sendo osteoindutora, a hidroxiapatita estimula a síntese de colágeno (Zambonin & Grano, 1995). Davies & Baldan (1997) mostraram que a neoformação óssea na interface osso-hidroxiapatita é morfologicamente comparável aos locais normais de remodelação óssea. As fibras colágenas na matriz óssea, podem ser orientadas paralela ou perpendicularmente à superfície da hidroxiapatita, de acordo com o tipo de tecido presente na interface osso-

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implante (Edwards et al., 1997). Para Louise et al. (1992) as fibras colágenas intimamente associadas com a superfície da hidroxiapatita ou localizadas em áreas de deposição de osteóide são orientadas de maneira perpendicular a estes grânulos. Em contraste, o tecido conjuntivo rodeando a cápsula fibrosa apresentam camadas estratificadas de fibras colágenas e fibroblastos arranjados paralelamente à superfície do grânulo. A presença de uma camada eletrodensa, a nível ultraestrutural, na interface osso- implante, algumas vezes observada, pode ser uma lâmina limitante de matriz óssea orgânica não mineralizada (Lange et al., 1990) ou pode ser uma reação patológica causada pela implantação do substituto “in vivo” (Oguchi et al., 1995). Entretanto, Daculsi et al. (1990) reportaram que esta camada eletrodensa foi observada somente em secções descalcificadas e sugeriram a possibilidade de artefato, talvez representando restos de proteínas absorvidas na superfície do implante. Já Yamamoto et al. (1997) revelaram a presença de mineralização nesta camada eletrodensa. Ainda, o processamento histológico, especialmente a desidratação, induz contração das estruturas biológicas. Como não ocorre contração do implante, as forças atuam entre a interface osso- implante podendo levar até a fratura, dependendo do tamanho da força de contração (Denissen & Groot, 1990). O objetivo deste trabalho foi o de avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo, na correção de defeito da diáfise proximal da tíbia de cães, por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET). O estudo baseou-se na caracterização dos tipos de células que participam do processo de osteointegração do material. MATERIAL E MÉTODOS Para realizar o presente estudo, foram utilizados oito cães adultos, entre dois a quatro anos de idade, sem raça definida, seis machos e duas fêmeas, clinicamente sadios, pesando em média 12.0 kg, oriundos do serviço de controle de Zoonoses da Secretaria de Saúde Municipal de Belo Horizonte. A HAP-911 usada neste experimento, foi produzida segundo Andrade et al. (1997) e para seu uso, no presente trabalho, ela foi acondicionada em frascos de vidro, em quantidades pré determinadas e colocadas em autoclave a 120-130ºC, sob 1.5 pressão atmosfera, durante 30 minutos.

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Seguindo o protocolo anestésico e cirúrgico habitual, foi provocado um defeito cortical, em todos os animais, de aproximadamente 1.0 x 0.6 cm na diáfise proximal medial das tíbias esquerda e direita, implantando-se o enxerto de HAP-91 apenas na tíbia direita. Na tíbia esquerda não foi feito preenchimento do defeito provocado, utilizando-a como controle. Os tecidos incisados foram suturados de maneira convencional. Dois animais, de cada vez, foram sacrificados aos oito, 30, 60 e 120 dias de pós-operatório, onde foram obtidas, por secção transversal, amostras do local do defeito ósseo, de ambas as tíbias, com cerca de 1,0mm3. Os fragmentos colhidos foram fixados em glutaraldeído a 2,5%. Estes permaneceram no fixador durante 3 horas e então foram lavados em solução tampão cacodilato, por três vezes, refixados em solução de tetróxido de ósmio a 2%, em tampão cacodilato, pH 7.2, à temperatura ambiente, por 1 hora. As peças foram, então, lavadas duas vezes em tampão cacodilato, e submetidas à desidratação em álcool etílico, em concentrações crescentes. Após desidratação, o material foi infiltrado com uma mistura de acetona e araldite, em partes iguais, durante doze horas. Finalmente, procedeu-se a inclusão na mistura plena de araldite, recém preparada. O material incluído foi incubado a 400 C, por 1 hora, e posteriormente transferido para estufa a 600 C durante 24 horas, para polimerização da resina e consequente endurecimento. Após inclusão, as amostras foram cortadas no ultramicrôtomo2 utilizando-se navalha de diamante. Os cortes semifinos foram corados pelo azul de toluidina com o objetivo de escolher a melhor região para se fazer os cortes ultrafinos, também com navalha de diamante.Secções ultrafinas, de 60 a 90 nm de espessura, foram colocadas em telas de cobre de 300 “mesh”, e submetidas à dupla coloração, utilizando-se solução aquosa de acetato de uranila a 1%, por 30 minutos e em solução de citrato de chumbo, por 5 minutos, em atmosfera de NaOH. Estas secções foram examinadas e fotografadas em microscópio eletrônico de transmissão1 operado a 50 KV. O material utilizado para documentação foi fotografado com filme2 especial. Após revelado, as fotografias foram analisadas GEESINK, R. G. T. & HOEFNAGELS, N. H. M. Six-year results of hydroxyapatite-coated total hip replacement. J. Bone Joint Surg. Br., v. 77, n. 4, p. 534-547, 1995. 1 JHS - Laboratorio Químico Ltda.

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qualitativamente considerando o padrão de regeneração tecidual com base no tipo de células encontradas na osteointegração da hidroxiapatita sintética.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise das amostras examinadas, neste experimento, confirmam a biocompatibilidade da HAP-91, citada por Borges (1998). Esta foi avaliada pela ausência de células caracterizadas morfologicamente como linfócitos e células plasmáticas, responsáveis por um fenômeno imunológico ou pela ausência de reação do tipo corpo estranho caracterizada por células gigantes, em todos os períodos de observação. Nas observações realizadas aos oito dias, notou-se a presença de células caracterizadas morfologicamente como precursoras, provavelmente de osteoblastos, tanto nas amostras tratadas, como nas amostras usadas como controle, em grau não diferente da regeneração óssea normal. Aos 60 dias, observou-se, em algumas amostras, provenientes da tíbia tratada, a presença de células na interface entre hidroxiapatita e osso, morfologicamente caracterizadas como osteoclastos (Fig. 1), o que leva a crer na absorção da HAP-91 (Nagahara et al., 1992 e Overgaard et al., 1997), sem evidência de encapsulação ou tecido de granulação como o encontrado por Bagambisa & Schilli, (1990) e Gomi et al. (1993). Ainda, em outras amostras deste estudo, encontrou-se a presença de HAP-91 no interior de células morfologicamente caracterizadas como macrófagos (Fig. 2). Este quadro foi também encontrado por Hemmerle et al. (1997) e Borges (1998). Portanto, a absorção celular de grânulos de HAP-91, neste estudo, ocorreu por meio de osteoclastos e macrófagos, como o citado por Borges (1998). Acredita-se que a grande quantidade de fluido intersticial presente no tecido conjuntivo facilita a absorção da HAP-91 por macrófagos. Mesmo assim, a absorção do produto, neste estudo, foi lenta. Este fato se baseia na sua presença em amostras processadas aos 120 dias após a implantação do substituto ósseo. Portanto, acredita-se que a absorção lenta tenha sido devida a sinterização a 900°C da HAP-91

61 Sorvall Porter Blum MT2D. 2 Zeiss EN 10 3 Cronalar HS-7-DuPont (chapa 8,0 x 10 cm)

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(Andrade et al., 1997) como o sugerido por Donath (1990) e observado em outros estudos citados na literatura.

Figura 1: Imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão em

preparações após 60 dias de cirurgia experimental com implantação de hidroxiapatita sintética (HAP-91). Osteoclasto contendo no citoplasma material eletrodenso. 5.000 x.

Nas amostras provenientes das tíbias não tratadas, encontrou-se células caracterizadas morfologicamente como osteoclastos, não saindo do padrão da regeneração óssea normal. Aos 120 dias, foram observados, neste experimento, dois padrões diferentes da interface hidroxiapatita-osso. Primeiro, a hidroxiapatita pareceu estar no contato direto com o osso (Fig. 3), fato observado na grande maioria das amostras processadas aos 30 e 60 dias. Esta relação de células osteogênicas com a HAP-91, em todas as fases do experimento, caracteriza a sua superfície como osteocondutiva. O outro padrão encontrado, em algumas partes da interface, foi a hidroxiapatita separada do osso por uma camada de material elétron-denso, podendo ser artefato como sugerido por Daculsi et al. (1990) e Denissen & Groot (1990). Entretanto, as observações de Lange et al. (1990) e Oguchi et al. (1995),

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Figura 2 - Imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão em preparações após 60 dias de cirurgia experimental com implantação de hidroxiapatita sintética (HAP-91).Célula fagocitária contendo no citoplasma material eletrodenso 5.000x. acreditando que a camada eletrodensa na interface hidroxiapatita-osso seja devida a presença de tecido conjuntivo, devem ser consideradas, mesmo que Yamamoto et al. (1997) a considere mineralizada. Como as amostras não foram descalcificadas e a presença de macrófagos participando da biodegradação, encontrada neste experimento, podem ser sugestivos de tecido conjuntivo não mineralizado, em determinadas áreas das amostras. Em algumas amostras deste estudo, a partir de 30 dias de observação, as fibras do colágeno, na interface osso-HAP-91, se encontraram paralelas à superfície da hidroxiapatita. Em outras, as fibras de colágeno, na região da interface, aderiram perpendicularmente à superfície da hidroxiapatita. A TB

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Figura 3 - Imagem de interface osso-hidroxiapatita sintética (HAP-91)

obtida por microscopia eletrônica de transmissão de preparações após 120 dias de cirurgia experimental. Hidroxiapatita sintética (HA) parece estar em contato direto com o osso trabecular (TB). 2.000 x.

No grupo controle, as fibras de colágeno também foram orientadas paralela e perpendicularmente ao tecido cicatricial. Isto sugere que a orientação diferente das fibras de colágeno é possível de ocorrer no processo normal de consolidação óssea, como o encontrado por Louise et al. (1992), Zambonin & Grano, (1995) e Edwards et al. (1997). A afirmação de Zambonin & Grano (1995) que a hidroxiapatita estimula a síntese de colágeno, não pode ser avaliada, neste experimento, uma vez que a presença de colágeno foi qualitativamente semelhante, tanto na tíbia tratada quanto na tíbia controle. Observou-se, neste estudo, pelos fatores ultraestruturais morfológicos, reabsorção celular de grânulos de hidroxiapatita concomitante com a formação adjacente de osso novo, como o sugerido por Nagahara, et al. (1992), Li et al. (1995) e Davies & Baldan (1997). Portanto, acredita-se que este fenômeno seja análogo ao processo normal de reabsorção -

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aposição óssea, provavelmente, com a mineralização ocorrendo nas fibras colágenas como no processo de ossificação normal

AGRADECIMENTOS Agradecemos à JHS – Laboratório Químico Ltda, na pessoa da Professora Sheyla M. C. Máximo, pela valiosa colaboração científica prestada durante a elaboração deste trabalho e pelo financiamento parcial para a execução do mesmo.

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V. 16: HAP-91, INT.HAP-91 E COL.HAP-91 COMO SUBSTITUTOS ÓSSEOS NA REGENERAÇÃO ÓSSEA EM CÃES: AVALIAÇÃO CLÍNICO-CIRÚRGICA E RADIOLÓGICA

Trabalho apresentado e Publicado no IV Congresso de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária- Goiânia - 2000 FRANCO, K. L.1 ; BORGES, A. P. B.2 ; DUARTE, T. S.1; FERNANDES, E. S.3 ; FEHLBERG, A. F1 O objetivo deste trabalho foi comparar clínica e radiologicamente o efeito da hidroxiapatita sintética pura (HAP-91), associada ao colágeno (Col-HAP-91) e associada a lipossomo (INT.HAP-91), como substitutos ósseos na reparação de defeitos ósseos provocados experimentalmente na diáfise proximal da tíbia de cães. O estudo experimental foi realizado utilizando-se 40 cães, sem raça definida, clinicamente sadios. Os animais foram separados em quatro grupos de dez cada, onde o grupo um recebeu tratamento com a HAP-91, o grupo dois foi tratado com COl-HAP-91, o grupo três com INT.HAP-91 e o grupo quatro não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. Após protocolo anestésico rotineiro, o procedimento cirúrgico constou de uma incisão na face medial e no terço proximal da tíbia esquerda. Retirou-se um fragmento ósseo com cerca de 10 x 6 mm de tamanho, em todos os grupos, e a falha óssea provocada foi preenchida imediatamente conforme o grupo. Os animais foram submetidos a exame clínico diário e a avaliação radiográfica logo, após a cirurgia e nos dias oito, 30, 60, 120 e 180 de pós-operatório. Logo após o preenchimento do defeito com o substituto correspondente, observou-se, em todos os animais, consistência firme ao toque digital. Todos os animais apresentaram claudicação leve e secreção sero-sanguinolenta no local da cirurgia nos primeiros três dias de pós-operatório, sendo mais intenso no grupo tratado com COl-HAP-91. À palpação, percebeu-se 1 Especializanda em Clínica e Cirurgia Veterinária – Departamento de Veterinária – UFV 2 Professor Adjunto – Setor de Cirurgia - Departamento de Veterinária – UFV 3 Aluna de Mestrado – Medicina Veterinária –Departamento de Veterinária – UFV

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aumento de volume na região trabalhada cirurgicamente, em todos os grupos, porém, mais exuberante no grupo tratado com INT.HAP-91. A cirurgia, caracterizou-se por maior radiopacidade nos grupo tratados com HAP-91 e INT.HAP-91. No grupo tratado com COl-HAP-91 e no grupo controle observou-se o defeito ósseo radiotransparente se comparado ao osso normal. As radiografias subsequentes revelaram evolução da opacidade nos grupos dois e quatro, e diminuição da mesma nos grupos um e três. A radiopacidade do defeito ósseo assemelhou-se à do osso normal nos grupos um, três e quatro, enquanto que no grupo dois, o defeito ósseo era mais radiotransparente, quando comparado ao osso normal. Não observou-se um processo que caracterizasse, radiograficamente, reação por corpo estranho ou reação de rejeição nos animais tratados com HAP-91, COl-HAP-91 e INT.HAP-91.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados clínicos e radiológicos observados no experimento, chegou-se às seguintes conclusões: O processo de reparação óssea observada nos animais tratados com HAP-91® e INT.HAP-91 foi semelhante e normal à dos animais do grupo controle. A hidroxiapatita sintética associada a lipossoma (INT.HAP-91) teve melhor reparação óssea. A hidroxiapatita associada ao colágeno parece possuir menor capacidade osteocondutora.

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V. 17: ASPECTOS CLÍNICOS-CIRÚRGICOS E

RADIOGRÁFICOS da HIDROXIAPATITA SINTÉTICA NA DIÁFISE PROXIMAL DA TÍBIA DE CÃES.

Arq. Brasil. de Med. Vet e Zoot, Belo Horizonte, v.50, p.537-545,

1998.

CLEUZA MARIA DE FARIA REZENDE2 , ANDRÉA PACHECO

BATISTA BORGES1 ,WALTER OTAVIANO BERNIS3 , ELIANE

GONÇALVES MELO2, PEDRO ISDRO NOBREGA NETO4 , MARIA

CRISTINA DA SILVA2.

RESUMO Com o objetivo de avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo na reparação de defeitos ósseos, foram utilizados 14 cães adultos, clinicamente sadios, sem raça definida, pesando em média 12,5 Kg. Após anestesia geral, todos os animais tiveram as tíbias direita e, posteriormente, a esquerda expostas, no seu terço proximal. Um fragmento ósseo retangular, foi retirado da metáfise proximal de ambas as tíbias. Na direita, o defeito foi imediatamente preenchido pela HAP-91 e, na esquerda este defeito foi utilizado como controle. Avaliações clínico-cirúrgica e radiográfica foram feitas logo após a cirurgia e nos dias 8; 15; 30; 45; 60; 90 e 120 pós-operatórios. Em todos os animais, observou-se estímulo ao sangramento na presença de HAP-91 e seu preenchimento mostrou consistência firme à palpação digital. O exame radiográfico caracterizou-se por radiotransparência no local do defeito esquerdo com evolução da opacidade nos exames subsequentes e radiopacidade superior, na tíbia direita, com diminuição da mesma, assemelhando-se ao osso normal aos 120 dias. 1 Universidade Federal de Viçosa. Departamento de Veterinária. Av. P.H.Rolfs s/n. Viçosa. MG. 36570000. 2 Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. AV. Antônio Carlos. Pampulha. BH. MG.

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3 Universidade de Alfenas. Escola de Veterinária. 4 Universidade Federal de Patos. Escola de Veterinária. Patos. Paraiba. Não foi observada reação inflamatória, nem processo que caracterizasse, radiograficamente, reação por corpo estranho. Portanto, a presença de HAP-91 osteointegrada, a indica como substituto ósseo.

Palavras-chaves: Hidroxiapatita, Substituto Ósseo, Cão. ABSTRACT

Synthetic hydroxyapatite (HAP-91) was used as a substitute for the reparation of bone defects in 14 healthy adult mongrel dogs, weighting 12,5 Kg in average. After general anesthesia, all animals right tibia, and then their left tibias, were exposed in their proximal third. A rectangular bone fragment was removed from the tibial proximal metaphisis. In the right hindlimb, the bone defect was immediately filled with HAP-91 and, in the left hindlimb, this defect was left empty as control. Radiographs in the craniocaudal and mediolateral exposures were taken at 0, 8, 15, 30, 45, 60, 90 and 120 days after surgery to evaluate bone healing. A bleeding stimulation in the presence of HAP-91 was observed in all animals and the HAP-91 filling was consistent at touch. Radiographs taken just after surgery showed radioluscence in the site of the defect in the left limb, and increased radiopacity in the right limb. Subsequent radiographs revealed increasing opacity in the left limb and decreasing opacity in the right. At the day of the last observation radiopacity resembled normal bone. During the whole experiment no inflammation was observed in the surgical incision, and, radiographically, no process similar to foreign body reaction to HAP-91, was observed. Key words: Hydroxyapatite, bone implant, bone.

INTRODUÇÃO

Atualmente, em consequência do desenvolvimento social e urbano, os traumatismos têm sido cada vez mais frequentes, levando os ortopedistas a se depararem com fraturas com perda de quantidade substancial de tecido ósseo, sendo necessário, em alguns casos, a utilização de substitutos ósseos. As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética permitem considerá-la como um excelente produto para utilização como implante ortopédico. Ela é biocompatível e bem tolerada pelo paciente

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(Frame et al., 1987; Inove et al.,1993; Nelson et al., 1993 e Arakaki et al., 1995) não produz toxicidade local e sistêmica e não é carcinogênica nem alergênica (Jarcho, 1992). Suas propriedades químicas lembram aquelas dos minerais ósseos, mas, possui pequena resistência mecânica (Kitsugi et al., 1988; Geesink, 1993 e Arakaki et al., 1995),sendo sua aplicação clínica limitada a áreas onde não há suporte de peso ou em cavidades ósseas. Martin et al. (1989) observaram rápida integração da hidroxiapatita sintética em osso esponjoso de cães, mas consideraram o material pouco adequado para tratar defeito cortical devido a pequena resistência mecânica.

A mais notável característica da hidroxiapatita, devido a sua afinidade e condutividade ósseas, é a habilidade de se unir diretamente ao tecido ósseo (Kitsugi et al., 1988; Jarcho, 1992 e Arakaki et al., 1995). Ela não tem capacidade osteoindutiva, mas atua como matriz passiva para o crescimento ósseo devido a osteocondução, sendo classificada como um material osteocondutivo (Callan & Rohrer, 1993). Para Green et al. (1995) a hidroxiapatita sintética possui efeito osteoindutivo. É claro para D’Antonio et al. (1992) o estimulo à formação óssea e a aceleração da consolidação, quando do uso clínico da hidroxiapatita, baseado na firme união óssea com o tecido hospedeiro. Entretanto, Redondo et al. (1995) citaram o efeito inibidor da osteoindução de autoenxerto, quando da associação com hidroxiapatita sintética. Suominen et al. (1995) consideraram a ausência de células osteogenitoras e fatores de indução no implante de hidroxiapatita, mas estes elementos são oriundos da medula óssea circunvizinha e do trauma causado na cortical óssea. A integridade do periósteo, quando se utiliza hidroxiapatita, é importante para evitar o crescimento de tecido fibroso e prevenir a migração de seus grânulos (Wiese & Merten, 1993), pela tendência em penetrar em tecido mole (Frame et al., 1987). Radiograficamente, o neocrescimento ósseo entre o substituto e o osso é reconhecido por radiopacidade. A presença de uma linha radiotransparente na interface é sinal de integração através de tecido fibroso (Geesink, 1993). O implante de hidroxiapatita, sem retenção mecânica, avaliado por Geesink (1993) e Inove et al. (1993), com seis e dez semanas, respectivamente, encontrou-se fixado ao osso, sem formação de linha radiotransparente e com evidências de neoformação óssea. Cullun et al. (1988) utilizando hidroxiapatita em fenda alveolar de cães, demonstraram a radiopacidade do produto, em radiografias iniciais,

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ocorrendo alterações discretas nas radiografias subsequentes. Frame et al. (1987) mostraram que radiografias feitas após 24 semanas de implantação de hidroxiapatita,em mandíbula de cães, revelaram as partículas pouco definidas, possivelmente devido ao crescimento de tecido conjuntivo e tecido ósseo. Patka et al. (1985), estudando a hidroxiapatita sintética porosa, em fêmur de cães, por dois anos, não observaram alteração na densidade radiográfica do implante. Bloebaum & Dupont (1993) reportaram a possibilidade de osteólise como uma reação a particulas que eventualmente podem migrar. D’Antonio et al. (1996), em estudos similares, citaram a ausência de osteólise e concluiram que partículas de hidroxiapatita não são osteolíticas.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética (HAP-91)5 como substituto, na correção de defeito ósseo na metáfise tíbial de cães, pela avaliação de sua osteointegração, por meio de estudos clínico-cirúrgicos e radiográficos.

MATERIAL E MÉTODOS

A hidroxiapatita sintética (HAP-91) foi produzida segundo

Andrade et al. (1997). Para a sua utilização no presente trabalho, foi acondicionada em frascos de vidro, em quantidades pré-determinadas e esterilizada, em autoclave, a 120 e 130ºC, sob 1,5 atmosferas de pressão, durante trinta minutos.

Os animais utilizados foram 14 cães adultos, entre dois e quatro anos de idade, sendo oito machos e seis fêmeas, sem raça definida, pesando em média 12,5 Kg, provenientes do Serviço de Controle de Zoonoses da Secretaria Municipal de Saúde de BH. Em todos os animais, foi provocado um defeito ósseo na metáfise proximal das tíbias esquerda e direita, implantando-se o enxerto de HAP-91 apenas na tíbia direita, conforme procedimento descrito a a seguir: Após jejum alimentar e hídrico de doze horas, os membros posteriores devidamente preparados para cirurgia e os animais anestesiados, a exposição da metáfise medial das tíbias, uma de cada vez, ocorreu através de incisão longitudinal da pele e tecido subcutâneo da região (Piermattei e Greeley, 1988), evidenciando, desta maneira, a metáfise tibial. No terço proximal, foi retirado, de cada uma das metáfises, um fragmento ósseo retangular de aproximadamente 1,0 x 0,6 cm (Tab. 1) com o auxílio de perfurador ortopédico manual e brocas de 1,5 mm. A lesão foi preenchida

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na tíbia direita com hidroxiapatita sintética. Na tíbia esquerda não houve tratamento. Os tecidos incisados foram suturados de maneira convencional. Os animais foram submetidos a avaliações clínicas durante os dez primeiros dias do pós-operatório. O exame clínico local constou de observação diária da ferida cirúrgica, avaliando-se a presença de reação inflamatória, de claudicação e de sensibilidade dolorosa. Foram obtidas radiografias da região operada, nas posições crâniocaudal (CC) e médiolateral (ML) antes da cirurgia, imediatamente após e nos dias 8, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 do pós-operatório, visando a comparação entre osso testemunha e osso tratado com a HAP-91. A radiopacidade foi graduada, quando comparada ao osso normal, em máxima, intensa, média, moderada, discreta e inexistente (Tab. 2 e 3).

RESULTADOS E DISCUSSÃO ASPECTOS CLÍNICO-CIRÚRGICOS

Os animais apresentaram, no pós-operatório, evolução clínica

normal, não se observando quaisquer sinais de infecção ou de complicação. A cicatrização da ferida cirúrgica ocorreu por primeira

intenção, sendo os pontos retirados no 8º dia, não havendo indícios de

reação de rejeição, provocada pela HAP-91, podendo-se caracterizar, desta maneira, o produto como biocompatível, fatos também apontados por Frame et al. (1987), Jarcho (1992), Inove et al. (1993), Nelson et al. (1993) e Arakaki et al.. (1995). A similaridade química entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, provavelmente, contribuiu para isso. A única complicação observada foi, no oitavo dia de pós-operatório, quando o animal nº 10 apresentou fratura completa no local do defeito ósseo da tíbia esquerda. Considerando o tamanho dos fragmentos retirados (Tab. 1), a diminuição da resistência óssea local provocada pelo defeito ósseo e o apoio precoce deste membro, pode-se sugerir que a fratura ocorreu devido à concentração de forças em um espaço inicialmente vazio, favorecendo, desta maneira, o aparecimento de fratura. A recuperação funcional dos animais foi satisfatória e sem diferenças entre os membros operados. Mas, decorridas 12 horas após a cirurgia, observou-se uma leve tendência da maioria dos animais para

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claudicar com o membro posterior direito apoiando, normalmente, o esquerdo. Acredita-se que este fato esteja relacionado com a presença de material químico no defeito ósseo, mesmo sendo biocompatível, associado, ainda, ao maior tempo cirúrgico(Tab.1)naquele membro, induzindo um maior trauma local. Como o instrumental utilizado não permitiu uma uniformidade das lesões ósseas provocadas, os fragmentos ósseos retirados foram medidos (Tab. 1) e adotou-se o critério de empregar a quantidade de HAP-91 necessária para preencher o defeito ósseo (Tab. 1). Foi fácil aplicar o produto e logo no início de sua aplicação sobre a lesão, parece ter havido um estímulo ao sangramento. Entretanto, a hemostasia por compressão foi eficiente quando do preenchimento do defeito ósseo pela HAP-91. Após esta manobra e, comprovado pela palpação digital, notou-se consistência firme do implante.

Mesmo não sendo recomendada por Martin et al. (1989) em defeito cortical, acredita-se que o tipo de lesão produzida, neste trabalho, não tenha interferido com os resultados obtidos. Em primeiro lugar, este defeito foi adequado aos propósitos deste estudo e, em segundo lugar, a ausência de movimento facilitou a permanência da HAP-91 no defeito ósseo, não sendo necessária a sua retenção mecânica como sugerido por Wiese e Merten (1993). A metáfise proximal medial da tíbia foi eleita como modelo experimental, pois é de fácil exposição (Piermattei & Greeley, 1988) e devido à constituição anatômica o traumatismo cirúrgico é menor. Por outro lado, a região é sede de reabsorção e de propriedades osteogênicas da medula óssea (Suominen et al., 1995) sendo, inclusive, metabolicamente, a mais ativa deste osso. Estes aspectos contribuem para uma resposta fisiológica mais rápida.

ASPECTOS RADIOGRÁFICOS

Logo após a cirurgia, nas tíbias com a HAP-91, notou-se elevada radiopacidade do defeito ósseo quando comparado ao osso, sendo classificada como grau máximo (Tab. 2 e Fig. 1), mas nas tíbias esquerdas, observou-se ausência de radiopacidade, classificada como zero (Tab. 3 e Fig. 1). A radiopacidade máxima dada pela hidroxiapatita é justificada pela sua fórmula, pois, em função dos seus constituintes químicos, ela apresenta um elevado peso molecular.

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Apesar de Frame et al. (1987) e Wiese & Merten (1993) citarem a possibilidade de migração da hidroxiapatita para o tecido mole, no presente experimento, isto não pode ser dito, já que, em todos os animais, ao primeiro exame radiográfico, notou-se a presença da HAP-91 no tecido subcutâneo, próximo ao defeito ósseo (Fig. 2), permanecendo durante todo o experimento,uma quantidade visualmente homogênea. O que observou-se nas radiografias feitas aos oito dias do pós-operatório, na tíbia direita, foi a diminuição da radiopacidade (Tab. 2), já descrita por Cullun et al. (1988), que atribui este fato à invasão de tecido conjuntivo junto ao processo normal de regeneração óssea,o que contribui para a diferença da radiopacidade. É importante considerar, ainda, que não há alteração na densidade da hidroxiapatita, uma vez que o peso molecular da mesma não se altera (Patka et al, 1985). Entretanto, o crescimento do tecido conjuntivo e do tecido ósseo, ao longo do tempo e ao redor de partículas de hidroxiapatita (Frame et al., 1987) contribuiram para diminuir sua definição.

Na tíbia esquerda, aos oito dias, observou-se quadro semelhante àquele apresentado após a cirurgia (Tab. 3). É bom lembrar, no entanto, que, em todo processo de cicatrização, inicialmente se desenvolve tecido conjuntivo no foco da lesão, cuja radiopacidade é insuficiente para ser perceptível ao exame radiográfico.

As radiografias subsequentes da tíbia direita, de todos os animais, revelaram diminuição gradativa da radiopacidade e, na tíbia esquerda, aumento (Tab. 2 e 3). O tecido ósseo neoformado apresentou menor radiopacidade do que a HAP-91 e maior do que a do tecido conjuntivo, devido ao peso molecular dos constituintes químicos tissulares e do produto utilizado. Portanto, acredita-se que o crescimento ósseo foi caracterizado, neste estudo, pela evolução crescente da radiopacidade no defeito ósseo, sugestivo de osso neoformado.

Aos 60 dias, já se pode observar reparação óssea completa na tíbia direita de todos os animais (Fig. 2), caracterizada pela identidade de radiopacidade entre o defeito e osso, fato que se repetiu aos 90 e 120 dias (Fig. 3 ). Na tíbia esquerda esta identidade só foi observada aos 90 dias (Fig. 3), repetindo-se aos 120 dias (Fig. 4). Assim, acredita-se, pelo exame radiográfico, que a implantação de HAP-91 foi importante para abreviar o processo de reparação óssea, não havendo manifestação de instabilidade e mantendo a característica de condutividade citada na literatura (Callan &Rohrer, 1993).

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Em todos os animais, o exame radiográfico revelou evidência de reparação óssea, mas o grau de ossificação não foi quantificado. Portanto, as observações de D’Antonio et al. (1992) e Green et al. (1995) que qualificam a hidroxiapatita como osteoindutiva não puderam ser avaliadas neste estudo. Tal afirmativa, entretanto, só poderia ser feita através de um estudo histomorfométrico, se bem que Redondo et al. (1995), utilizando-se dele, não comprovaram a capacidade osteoindutiva da hidroxiapatita sintética. Mesmo que ela não possua esta característica, baseado em suas propriedades físico-químicas e, ainda, na ausência de componentes biológicos, responsáveis pela osteoindutividade (Suominen et al., 1995), pode-se sugerir, pelos resultados aqui obtidos, que a HAP-91 tem ação na osteocondução.

Uma rigorosa exploração radiográfica na interface defeito-osso, destinada a observação de linha radiotransparente ao redor da lesão óssea e a pesquisa de fenômenos osteolíticos, possibilitaria um diagnóstico simples e confiável de um processo de rejeição ou de bioincompatibilidade. A partir do 30º dia do pós-operatório, as radiografias da tíbia direita, revelaram uma interface HAP-91-osso, com radiopacidade crescente, sugerindo a fixação do implante no osso, através de crescimento ósseo, como descrito por Kitsugi et al. (1988), Jarcho (1992) e Arakaki et al. (1995). Segundo Geesink (1993) e Inove et al. (1993), esta fixação torna-se nítida, radiologicamente, com 6 e 10 semanas, respectivamente. A diferença de tempo, encontrada neste estudo, provavelmente foi devida a resposta tissular, dependente do tamanho do defeito ósseo, da resposta biológica do paciente, da composição química e da estabilidade rígida do implante.

Em nenhum dos animais foi observada linha radiotransparente, característica de tecido fibroso entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, como citado por Geesink (1993). Isto leva a crer que a união HAP-91-osso se fez através de crescimento ósseo direto, sem interposição de tecido fibroso. A ocorrência de osteólise, através da diminuição de radiopacidade, em áreas delimitadas (Bloebaum e Dupont, 1993), não foi observada neste experimento. Neste estudo, o tempo de manutenção e observação do experimento foi diferente daqueles empregados pelos autores citados, mas pode-se afirmar que até o 120º dia de pós-operatório não houve evidência de osteólise.

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Como não houve migração da HAP-91 utilizada para preencher defeito ósseo metafisário, em cães, fato este associado à diminuição da radiopacidade e a similaridade radiopaca do defeito ósseo com o tecido ósseo, a partir do 60º até o 120º dia, sugere-se uma total integração do produto utilizado, inclusive na possibilidade de sua biodegradação.

CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que, clinicamente, a HAP-91 (hidroxiapatita sintética) pode ser indicada no tratamento de defeitos ósseos de cães, por não alterar o processo de consolidação e não produzir reações colaterais e, radiograficamente, a integração da HAP-91 ao osso se faz através de crescimento ósseo direto, sem interposição de tecido fibroso.

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Tabla 1 - Tiempo quirúrgico total, en minutos, tamaño del defecto óseo provocado en la tibia, en milímetros y cantidad de HAP-91, en gramos, utilizada en el miembro posterior derecho de perros. ANIMAL TEMPO TAMANHO DO QUANTIDADE

CIRÚRGICO DEFEITO DE HAP-91® (minutos) (mm) (g)

MPD MPE MPE MPD

1 27 20 11 x 7 10 x 6 0,8 2 27 15 11 x 7 11 x 7 1,0 3 29 24 12 x 6 11 x 7 0,4 4 30 20 13 x 7 12 x 6 0,5 5 39 23 10 x 6 9 x 5 0,5 6 30 23 10 x 6 11 x 7 0,5 7 37 20 9 x 5 9 x 6 0,6 8 29 22 11 x 6 11 x 6 0,5 9 35 25 10 x 6 10 x 6 0,9 10 51 30 11 x 6 11 x 6 0,5 11 32 20 10 x 5 10 x 5 0,3 12 43 35 10 x 6 10 x 5 0,4 13 35 28 15 x 8 15 x 8 1,8 14 42 25 12 x 7 11 x 5 1,0 MPD - Membro posterior direito MPE - Membro posterior esquerdo

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Figura 1: Evolução da radiopacidade no defeito ósseo (seta): Radiografias, na posição mediolateral, na tíbia tratada (D) com hidroxiapatita sintética (HAP-91) e na tíbia controle (E) de cão submetido à cirurgia experimental. A - logo após a cirurgia, B - 8 dias de pós-operatório, C - 30 dias de pós-operatório, D - 45 dias de pós-operatório.

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Tabela 2 - Resultado dos exames radiográficos de defeito ósseo, produzido na tíbia direita de cães e imediatamente preenchido por hidroxiapatita (HAP-91).

ANIMAL TIEMPO DEPOIS DA CIRURGIA (Días) 0 8 15 30 45 60 90 120 1 DRM DIR 2 DRM DIR 3 DRM DIR DMR 4 DRM DIR DMR 5 DRM DIR DMR MMR 6 DRM DIR DMR MMR 7 DRM DIR DMR MMR DDR 8 DRM DIR DMR MMR DDR 9 DRM DIR DMR MMR DDR RO 11 DRM DIR DMR MMR DDR RO RO 12 DRM DIR DMR MMR DDR RO RO 13 DRM DIR DMR MMR DDR RO RO RO 14 DRM DIR DMR MMR DDR RO RO RO DRM-Defeito ósseo com radiopacidade máxima, quando comparada à do osso normal. DIR-Defeito ósseo com intensa radiopacidade, maior que à do osso normal. DMR-Defeito ósseo com média radiopacidade, maior que à do osso normal. MMR-Defeito ósseo com moderada radiopacidade, maior que à do osso normal. DDR-Defeito ósseo com discreta radiopacidade,maior que à do osso normal. RO-Regeneração óssea, expressa por radiopacidade semelhante ao osso normal.

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Figura 2: Evolução da radiopacidade no defeito ósseo (setas): Radiografias, na posição mediolateral, na tíbia tratada (D) com hidroxiapatita sintética (HAP-91) e na tíbia controle (E), de cão submetido à cirurgia experimental. A _ 60 dias de pós-operatório.

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Figura 3: Evolução da radiopacidade no defeito ósseo (setas):Radiografias na posição mediolateral, na tíbia tratada (D) com hidroxiapatita sintética (HAP-91) e na tíbia controle (E), de cão submetido à cirurgia experimental 120 dias de pós-operatório.

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Tabela 3 - Resultado dos exames radiográficos do defeito ósseo, produzido na tíbia esquerda de cães, utilizado como controle. ANIMAL RADIOGRAFIA APÓS CIRURGIA (Dias) 0 8 15 30 45 60 90 120 1 DRZ DRZ 2 DRZ DRZ 3 DRZ DRZ DRD 4 DRZ DRZ DRD 5 DRZ DRZ DRD MDR 6 DRZ DRZ DRD MDR 7 DRZ DRZ DRD MDR IMR 8 DRZ DRZ DRD MDR IMR 9 DRZ DRZ DRD MDR IMR DRI 11 DRZ DRZ DRD MDR IMR DRI RO 12 DRZ DRZ DRD MDR IMR DRI RO 13 DRZ DRZ DRD MDR IMR DRI RO RO 14 DRZ DRZ DRD MDR IMR DRI RO RO DRZ-Defeito ósseo com radiopacidade zero DRD-Defeito ósseo com discreta radiopacidade, menor que à do osso normal. MDR-Defeito ósseo com moderada radiopacidade, menor que à do osso normal. IMR-Defeito ósseo com média radiopacidade, menor que à do osso normal. DRI-Defeito ósseo com intensa radiopacidade, menor que à do osso normal. RO-Regeneração óssea, expressa por radiopacidade semelhante ao osso normal.

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V.18: HIDROXIAPATITA SINTÉTICA NA DIÁFISE PROXIMAL DA TÍBIA, DE CÃES (Canis familiares). Avaliação histológica por microscopia eletrônica de retrodispersão. Trabalho apresentado: VI JORNADAS INTERNACIONALES DE LA SOCIEDAD ESPANOLA DE CIRUGIA., 1997

ANDRÉA PACHECO BATISTA BORGES1 , JORDI FRANCH2 , MARIA CRISTINA MANZANARES3 , MARIA ISABEL CALEROS3,

CLEUZA MARIA DE FARIA REZENDE4 , WALTER OTAVIANO BERNIS5

RESUMO

A utilização de técnicas histológicas que preservem a natureza calcificada dos ossos permite uma diferenciação clara entre os tecidos que participam na evolução da osteointegração da hidroxiapatita sintética (HAP-91). Com o objetivo de avaliar esta osteointegração, utilizou-se de microscopia eletrônica de retrodispersão em amostras provenientes de 14 cães adultos, machos e fêmeas, clinicamente sadios, sem raça definida, pesando em média 12,5 kg, previamente operados. A cirurgia constou de retirada de um fragmento ósseo retangular de 1,0 x 0,6 cm de ambas diáfises proximais das tíbias. Na tíbia direita, o defeito foi imediatamente preenchido pela HAP-91 e, na tíbia esquerda, o defeito ósseo não recebeu tratamento, sendo utilizado como controle. Os animais, dois de cada vez, foram sacrificados aos 8; 15; 30; 45; 60; 90 e 120 dias após a cirurgia. As amostras foram coletadas por secção transversal exatamente sobre o defeito ósseo, e, então, fixadas em formol a 10%, desidratadas em banhos crescentes de GMA e de Technovit 7200. Em seguida, foram incluídas, polimerizadas,polidas, recobertas por carbono e examinadas em um microscópio eletrônico de varredura provido de um detetor de elétrons 1Universidade Federal de Viçosa. Departamento de Veterinária. Av. P.H.Rolfs s/n. Viçosa. MG. Brasil - 36570000. 2 Facultad de Veterinaría - Universitad de BellaTerra - Barcelona - España 3 Faculdade de Odontología

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4 Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. Av. Antônio Carlos. Pampulha. BH. MG. 5 Escola de Veterinária - Universidade de Alfenas. retrodispersos. Os resultados obtidos revelaram uma evolução normal da consolidação óssea, com a presença de tecido condróide, osso fibrorreticular e osso lamelar, em ambos os membros. Foi notada, ainda, atividade osteoclástica sobre o produto. A presença da HAP-91 integrada a neoformação óssea justifica a sua indicação como substituto ósseo. Palavras chaves - Hidroxiapatita sintética, substituto ósseo, cão.

INTRODUÇÃO

A microscopia eletrônica de retrodispersão (MER) é um método moderno e indicado para análise do neocrescimento ósseo, nos casos da reparação óssea (Jasty et al., 1992). A técnica oferece alta resolução, fácil preparação e as imagens obtidas são independentes da espessura das amostras, acusando diferença entre tecido ósseo e não ósseo (Caja et al., 1994). A hidroxiapatita sintética apresenta-se de coloração branca, o tecido ósseo apresenta vários tons de cinza de acordo com o tipo e maturidade (Bloebaum et al., 1994) e o tecido mole apresenta-se escuro (Holmes et al., 1987). A escala de densidade intermediária entre a hidroxiapatita e o tecido conjuntivo permite a identificação do tecido calcificado (Moy et al., 1993). Os tecidos calcificados que participam do processo de regeneração óssea podem ser identificados em tecido condróide, cartilagem calcificada, osso fibrorreticular e osso lamelar, sendo a identificação do tecido condróide possível somente com técnicas que preservam a natureza calcificada dos tecidos (Dhem et al, 1989; Franch, 1994). O osso lamelar é o tecido ósseo que forma lamelas facilmente reconhecíveis, com lacunas celulares já com a forma madura, ou seja, pequenas e fusiformes (Hiltunen et al., 1993). O osso fibrorreticular é o tecido ósseo cujas lacunas celulares, arredondadas, não seguem um padrão arquitetural reconhecível (Goret-Nicaise, 1986). O tecido condróide, possui estrutura semelhante ao tecido fibrorreticular, porém com lacunas maiores, irregulares e conectadas entre si. A taxa e velocidade de calcificação é muito superior à do tecido cartilaginoso e do tecido ósseo

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(Goret-Nicaise, 1986 e Dhem et al, 1989). Hiltunen et al (1993) descrevem a cartilagem calcificada com aspecto tipicamente esponjoso, com lacunas celulares grandes e arredondadas. Pesquisadores como Finn et al. (1980) e Zerweth et al. (1992), estudando a regeneração óssea, em cães, com a utilização de hidroxiapatita, descreveram a presença de osso fibrorreticular e osso lamelar com três e doze meses, respectivamente, após a implantação. Já Jasty et al. (1992) e Suominen et al. (1995) encontraram osso fibrorreticular com três semanas e osso lamelar com seis semanas, após a implantação, em cães e coelhos, respectivamente. Estes autores não observaram, na interface hidroxiapatita-osso, a presença de tecido conjuntivo fibroso. Concluíram que a presença de um componente osteocondutivo favorece o crescimento ósseo nas fases iniciais do pós operatório. Franch (1994) pela utilização de MER, identificou, na reparação óssea em ossos longos, a existência de tecido condróide até então referido apenas na regeneração de fraturas de ossos cranianos. Concluiu que a presença de maior quantidade de tecido condróide é indicador de consolidação mais avançada, fundamentado no fato de que o tecido ósseo maduro necessita de um substrato calcificado que atue como suporte para sua aposição. Um aspecto ainda controverso é a biodegradação da hidroxiapatita sintética. Alguns estudos não evidenciam sinais de reabsorção ou biodegradação (El Deeb & Holmes, 1989). Outros observam algum sinal de biodegradação do material implantado (Van Blitterswijk et al, 1986; Eggli et al., 1988; Martin et al., 1993 e Suominen et al., 1995). Esta controvérsia, segundo Van Blitterswijk et al. (1986), pode ser devida, em parte, a procedimentos diferentes na preparação da hidroxiapatita sintética e segundo Eggli et al (1988), devido ao desprendimento mecânico de partículas superficiais, durante a implantação. Já Martin et al. (1993) observaram muitas lacunas de Howship na superfície da hidroxiapatita, e a sua diminuição com o tempo. Os autores atribuíram a este fato, sua absorção por osteoclastos e substituição por osso, num processo similar à remodelação normal. objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da hidroxiapatita sintética (HAP-91) como substituto ósseo, na correção de defeito na diáfise proximal tíbial de cães, pela avaliação da osteointegração da HAP-91, através de estudos histológicos por microscopia eletrônica de retrodispersão.

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MATERIAL E MÉTODOS

Para realizar o presente estudo, foram utilizados 14 cães adultos, entre dois e quatro anos de idade, sendo oito machos e seis fêmeas, sem raça definida, pesando em média 12,5 kg, provenientes do Serviço de Controle de Zoonoses da Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte. Seguindo o protocolo anestésico e cirúrgico habitual, praticou-se um defeito cortical de aproximadamente 1,0 x 0,6 cm na diáfise medial proximal das tíbias esquerda e direita, implantando-se o enxerto de HAP-91 apenas na tíbia direita. Na tíbia esquerda não houve tratamento. Os tecidos incisados foram suturados de maneira convencional. A hidroxiapatita sintética (HAP-91)6 utilizada neste experimento, foi produzida segundo Andrade et al. (1997) e para a sua utilização, no presente trabalho, foi acondicionada em frascos de vidro, em quantidades pré-determinadas, e colocada em autoclave a 120-130ººC, sob 1,5 atmosferas de pressão, durante 30 minutos. Foram sacrificados dois animais nos dias 8, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 do pós-operatório, dos quais foram obtidas, por secção transversal, amostras do sítio do defeito ósseo, com cerca de 1,0 cm de extensão que foram fixadas em formol a 10% por uma semana e processadas segundo a técnica de Donath (1985). Uma vez desidratadas por banhos crescentes de GMA7 e Technovit 7.2008 , foram incluídas em Technovit 7.200. A polimerização foi concluída pela introdução das amostras no fotopolimerizador, sendo submetidas a luz branca, durante duas horas e luz ultra violeta, durante seis horas, para a polimerização. Em seguida foram colocadas, uma de cada vez, na fotopolidora9 , utilizando-se papel de lixa cada vez mais fino, até alcançar o grau de polimento desejado. Todas as amostras foram recobertas com carbono10 , e fixadas em prata coloidal11 . A leitura foi feita em microscópio eletrônico de varredura12 , equipado com detetor de elétrons retrodispersos. Cada campo foi observado, utilizando-se em média 20 KV, 1 nA, distância de trabalho de 16 mm e contraste e brilho entre 40 e 50. As imagens de interesse foram fotografadas e digitalizadas, obtendo-se, fotos comparáveis entre si e 6 HAP-91 - J.H.S. Laboratório Químico Limitada 7 GMA - 2 hidroxietil metacrilato - Sigma Chemical Company

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8 Sigma Chemical Company utilizadas para identificar os distintos tecidos calcificados e o implante de hidroxiapatita. Os resultados obtidos foram estudados por análise qualitativa descritiva da distribuição arquitetônica, caracterizando, desta maneira , o tipo de tecido calcificado encontrado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As imagens obtidas permitiram distinguir a hidroxiapatita sintética e o tecido ósseo, através dos distintos graus de eletrodensidade, como descrito por Holmes et al. (1987); Moy et al. (1993); Skedros et al. (1993) e Bloebaum et al. (1994). A disposição arquitetônica e estrutural dos tecidos (Caja et al. 1994) possibilitou, neste estudo, a observação de núcleos de hidroxiapatita, de tamanhos variados, em cada campo examinado, integrados com zonas de tecido condróide, osso fibrorreticular ou osso lamelar, em função do tempo de consolidação do defeito ósseo.

As imagens do defeito ósseo, nas preparações de oito dias, revelaram, na tíbia direita, áreas claras e áreas escuras. Na tíbia esquerda, o defeito ósseo foi expresso apenas por área escura. Isto se explica pela presença da HAP-91 (tonalidade branca) e de tecido conjuntivo (tonalidade escura), o que é normal no processo de regeneração óssea, em sua fase inicial. Como não houve implante na tíbia esquerda, o local do defeito mostrou-se como área escura, em função da dispersão reduzida do tecido conjuntivo participante do processo de cicatrização, fato também apontado por Holmes et al. (1987).

Em ambos os membros, observou-se, na superfície da cortical circunvizinha ao defeito, a presença de lacunas escuras de reabsorção, facilmente identificadas pelo contraste com a fração óssea mineralizada

9 Exakt-Kulizer Apparatebau. Robert-Kock-Stra��y, 5.D-2000 Norderstedt. Germany 10 Edwards 12EG/1266. Edwards High Vacum Ltd. Crawley.Sussex.Great Britam. 11 Acherson Coloides. Barcelona. 12 Stereoscan LC360. Leica/Cambridge Intruments. England.

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clara (Martin et al., 1993), evidenciando, assim, reação osteoclástica necessária à neoformação óssea (Goret-Nicaise, 1986 e Manzanares, 1988), mas não uma possível reação de bioincompatibilidade do implante, já que eram lacunas comuns aos dois membros. As preparações de 15 dias, em ambos os membros, revelaram a presença de tecido condróide no local do defeito ósseo, caracterizado por lacunas grandes, irregulares e conectadas entre si, confirmando o padrão morfológico descrito por Goret-Nicaise (1986) e Dhem et al. (1989). caracterizando a biocompatibilidade do produto utilizado neste experimento (Fig 1). A sua presença na tíbia controle (Tab. 1), já encontrada por Franch (1994), atribui a sua participação no processo de regeneração dos ossos longos. Na tíbia tratada (Tab. 1) este tecido condróide estava integrado à HAP-91 (Fig 1), caracterizando a biocompatibilidade do produto utilizado neste experimento.Aos 30 dias, em ambas as tíbias, o quadro foi semelhante ao período anterior porém com tecido condróide ocupando uma área maior do defeito ósseo. O tecido ósseo (fibrorreticular ou lamelar) necessita de um substrato calcificado que atue como suporte para sua aposição (Franch, 1994) e o tecido condróide apresenta uma velocidade e taxa de calcificação muito mais elevadas que a do tecido cartilaginoso (Goret-Nicaise, 1986). Tabela 1 - Atividade de osteoclastos e ocorrência dos tipos de tecidos calcificados observados na osteointegração da HAP-91, na tíbia tratada, e da regeneração óssea, na tíbia controle.

Días de Atividade Tecido Osso Osso Pós operatorio osteoclástica condroide fibrorreticula laminar MPB MPE MPD MPE MPD MPE MPD MPE 8 + + - - - - - - 15 + + + + - - - - 30 + + + + - - - - 45 + + + + + + - - 60 + + + + + + + + 90 + + + + + + + + 120 + + + + + + + +

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Desta maneira, quanto maior a quantidade de tecido condróide, maior a aposição e mais rápida a remodelação em osso osteônico.

As amostras preparadas após 45 dias de cirurgia revelaram neoformação óssea ocupando todo o defeito, em ambas as tíbias, sendo observado, além de tecido condróide, osso fibrorreticular (Tab. 1), caracterizado por lacunas celulares arredondadas, sem um padrão arquitetural reconhecível (Fig. 2), de acordo com o descrito por Goret-Nicaise (1986).

O osso lamelar foi observado nas preparações de 60 dias de pós-operatório (Fig. 3), tanto na tíbia tratada quanto na controle (Tab. 1), preenchendo o defeito ósseo. Foi caracterizado por lacunas celulares pequenas e fusiformes e lamelas facilmente reconhecíveis, igual ao padrão morfológico descrito por Hiltunen et al. (1993). Foram observados, ainda, nestas preparações, osso fibrorreticular e tecido condróide que, na tíbia tratada, integravam-se à hidroxiapatita. Estes dados diferem dos de Finn et al. (1980), Jasty et al. (1992), Zerwekh et al. (1992) e Suominen et al. (1995) que encontraram estes tecidos calcificados, porém em períodos de observação distintos. Isto ocorreu, provavelmente, devido à diferença nas características físicas da hidroxiapatita, sintetizada em laboratórios diferentes. Deve-se lembrar, ainda, que os fatores biológicos citados por El Deeb & Holmes (1989) também podem ter tido influência.

A hidroxiapatita como componente osteocondutivo, favorecendo a consolidação inicial, só poderia ser confirmada por meio de estudo histomorfométrico, comparando a quantidade de tecido neoformado em ambas as tíbias (Jasty et al., 1992). Entretanto, acredita-se que a HAP-91, como o tecido condróide, é suporte para a aposição óssea. Este fato pode ser comprovado pela íntima ligação do produto com os tecidos calcificados, encontrada neste experimento. Pelo exame da Tabela 1 verifica-se que, tanto na tíbia tratada quanto na controle, estavam presentes, a partir dos 60 dias, a atividade de osteoclastos e os tipos de tecido calcificado (tecido condróide, osso fibrorreticular e osso lamelar). Este fato é sugestivo de que a HAP-91, nas condições deste trabalho, não provocou qualquer interferência negativa no processo de regeneração óssea.

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Nas preparações de 90 dias, bem como nas de 120 dias do pós-operatório, pode-se perceber que a tíbia tratada apresentou cortical neoformada com espessura superior a do osso normal; na tíbia controle, entretanto, a espessura da cortical foi menor (Fig.23). Assim, a aplicação da HAP-91 possibilitou neste tempo, uma cortical mais espessa do que a do controle, o que, teoricamente, poderia supor maior resistência, possibilitando, assim, suporte de peso e, consequentemente, atividade funcional do membro operado. Deve-se considerar, ainda a possibilidade de remodelação óssea mais avançada na tíbia controle do que na tíbia tratada, isto pela caracterização de seu canal medular refeito (Fig.4).

A presença de cartilagem calcificada, mencionada por Dhem et al (1989) e descrita por Hiltunen et al. (1993), não foi vista neste estudo, provavelmente devido às condições microambientais de vascularização e estabilidade do implante ósseo que determinam a diferenciação tissular global no foco da lesão.

Apesar de alguns autores citarem a ausência de biodegradação da hidroxiapatita (Hoogendoorn et al., 1984; Cook et al., 1988 e El Deeb & Holmes, 1989), neste experimento observou-se atividade de osteoclastos sobre ela, já nas preparações de 15 dias de pós-operatório (Fig. 5). Portanto, a atividade osteoclástica observada sobre a HAP-91 é indicativo de sua biodegradação, caracterizando o produto entre aqueles citados por Shimazaki & Mooney (1985), Van Blitterswijk et al. (1986), Eggli et al. (1988), Martin et al. (1993) e Suominen et al. (1995). Outro fato igualmente importante, sugestivo de um processo de biodegradação da HAP-91, é a diferença na quantidade relativa de hidroxiapatita entre as amostras analisadas, com tendência à diminuição, de acordo com a evolução do experimento. Ainda, durante a cirurgia, inevitavelmente alguma HAP-91 foi acidentalmente depositada no tecido subcutâneo e esta deposição pode ser utilizada para confirmar a biodegração, baseado nas imagens obtidas, que revelaram maior densidade da HAP-91 no tecido conjuntivo do que no defeito ósseo, provavelmente devido à ausência de atividade osteoclástica naquele local. Esta densidade distinta pode ser atribuída, ainda, à troca de ions cálcio e fosfato da superfície da HAP-91 com o defeito ósseo (Kitsugi et al., 1988), por sua solubilização ou

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dissolução, processo este, segundo Sasaki et al. (1993), mediado pela atividade de osteoclastos. Acredita-se, pelos resultados obtidos, que a osteointegração da HAP-91 ocorreu sem a interferência do tecido conjuntivo fibroso, identificado como áreas eletrotransparentes (Holmes et al., 1987). Pode-se mesmo, afirmar que a osteointegração se deu através de neocrescimento de tecidos calcificados. Entretanto, a observação desses tecidos nas datas preestabelecidas e nos vários campos examinados, sugere que o processo de reparação óssea na presença do implante seja heterogêneo. Em adição, este processo depende de fatores ambientais, como microvascularização ou micromovimentação, comandando o tipo de tecido calcificado a aparecer em determinada área e em determinado período.

CONCLUSÕES

Nas condições da presente pesquisa e com base nos resultados histológicos pela microscopia eletrônica de retrodispersão, as seguintes conclusões foram obtidas. A integração da HAP-91 ao osso se faz através de crescimento ósseo direto, sem interposição de tecido fibroso. Portanto, o grau de calcificação e a presença de tecido condróide, associados à presença da HAP-91, permitiram rápida justaposição óssea e, consequentemente, rápida reparação .A biodegradação da hidroxiapatita ocorre por uma ação osteoclástica sobre ela, observada desde as amostras processadas a partir do 15º dia do pós-operatório. Os tipos de tecido ósseo, encontrados na osteointegração da hidroxiapatita (tecido condróide, osso fibrorreticular e osso lamelar) indicam-na como substituto ósseo.

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CAPÍTULO VI

RELATOS CLÍNICOS E PUBLICAÇÕES DO USO DA HAP-91® E DA COL-HAP-91®

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ORTOPEDIA

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VI- 1: USO DA BIOCERÂMICA NO PREENCHIMENTO DE FALHAS ÓSSEAS*

Use of the biological ceramic in filling bone defects

Revista Brasileira de Ortopedia Julho/Agosto 2010 pag 433 - 438

Carlos Antônio Garrido1, Tania Clarete Fonseca Vieira Sales Sampaio3

RESUMO Objetivo: Apresentar os resultados encontrados com o uso da biocerâmica no preenchimento das falhas ósseas decorrentes de lesões traumáticas ou ortopédicas. Material e Método: Foram avaliados 36 pacientes, portadores de falhas ósseas de etiologia traumática ou ortopédica, 19 pacientes do sexo masculino (52,8%) e 17 do sexo feminino (47,2%). A idade variou de 19 a 84 anos, com média de 45,7 anos e mediana de 37 anos. Foram incluídos apenas os pacientes com falhas que necessitaram no mínimo cinco gramas de biocerâmica. Foram classificadas como ortopédicas, total de 18 casos, as falhas ósseas observadas nas revisões de artroplastias totais do quadril, 11 casos, artroplastia total do quadril, primária, por coxartrose, 1 caso, osteotomias de fêmur ou tíbia de cunha aberta, 5 casos, e artrodese do tarso, 1 caso. Como falhas traumatológicas, 18 casos, as pseudoartroses não infectadas, 8 casos, fraturas recentes do planalto tibial com compressão do osso esponjoso, 3 casos, fraturas expostas tratadas com fixadores externos, 7 casos. A técnica cirúrgica utilizada foi o de curetar e desbridar a lesão até se encontrar osso de aspecto viável a enxertia, a seguir utilizou-se a biocerâmica para preenchimento da falha e algum tipo de fixação. * Realizado no Hospital São Bento – Belo Horizonte - MG 1 Médico ortopedista, Doutor e Mestre em ortopedia e traumatologia, Universidade Federal de São Paulo. 2 Médica, residente R1 em ortopedia e traumatologia do Hospital São Bento; Doutora em patologia geral, Universidade Federal de Minas Gerais; Mestre em reabilitação, Universidade Federal de São Paulo.

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Resultado: Dos 36 pacientes avaliados, observou-se que 35 (97,2%) apresentaram integração óssea da biocerâmica, 1 caso de fratura exposta tratada com fixador externo apresentou osteointegração deficiente da biocerâmica.

Conclusão: O tratamento de falhas ósseas de etiologia traumatológica ou ortopédica com o uso da cerâmica fosfocálcica composta de hidroxiapatita, se revelou um método prático, eficaz e seguro.

Descritores – Biocerâmica, falhas ósseas, hidroxiapatita ABSTRACT Objective: To present the results with the use of biological ceramic in filling bone defects resulting from traumatic or orthopedic injuries. Material and Methods: We evaluated 36 patients with bone defects caused by trauma or orthopedic injury, 19 patients were male (52.8%) and 17 females (47.2%). The age ranged from 19 to 84 years, with a mean of 45.7 years and median of 37 years. We included only patients with defects which who required at least five grams of biological ceramic. Were classified as orthopedic, total of 18 cases, the bone defects observed in the revisions of total hip arthroplasties, 11 cases, total hip arthroplasty, primary by coxarthrosis, 1 case, osteotomies of the femur or tibia wedge open 5 cases, and tarsal arthrodesis, 1 case. How trauma related defects, 18 cases, uninfected pseudarthroses, 8 cases, recent fractures of the tibial plateau with compression of the cancellous bone, 3 cases, fractures treated with external fixators, 7 cases. The surgical technique used was curetting and debriding the injury until viable bone for grafting was found, and then used the biological ceramic for filling the gap and some kind of fixation. Results: Of the 36 patients evaluated, we observed that 35 (97.2%) had bone integration of biological ceramic, 1 case of fracture treated with external fixation had poor osteointegration of biological ceramic. Conclusion: The treatment of bone defects of orthopedic or trauma etiology, with the use of ceramics fosfocalcium composed of hydroxyapatite, has been proved as practical, effective and safe.

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Keywords – Biological ceramic, bone defects, hydroxyapatite INTRODUÇÃO

Os enxertos são muitas vezes necessários para correção de falhas ósseas, seja para dar suporte, preencherem espaços vazios ou acelerar a reparação biológica dos defeitos do arcabouço ósseo. Diante de um quadro que requer a substituição do osso, o cirurgião ortopédico pode utilizar o enxerto autógeno, autólogo ou autoenxerto; o enxerto homógeno, alogênico ou homoenxerto; o heteroenxerto, xenoenxerto, ou heterólogo e o aloplástico. Quanto à classificação dos enxertos(1), os enxertos autógenos são definidos quando o tecido é transferido de uma posição para outra, de um mesmo indivíduo, não provocando, consequentemente, reação imune, podendo ser osso, cortical ou medular, quando é transplantado. Os enxertos homógenos são tecidos enxertados entre indivíduos da mesma espécie com genes não idênticos, como o osso fresco, ou pode ser conservado em banco de osso. Estes enxertos são tratados por congelamento-secagem, autoclave, preservação química ou irradiação para que fiquem livres da atividade celular(2). Os heteroenxertos(1) são enxertos realizados entre indivíduos de espécies diferentes, sendo que, neste caso, se encontra o osso bovino. No caso de enxerto aloplástico, um corpo estranho e inerte, é utilizado para implantação nos tecidos, como fosfato de cálcio, hidroxiapatita, biocerâmica, além de outros tipos. A biologia de cada um desses enxertos varia e pode fornecer um ou mais componentes essenciais: osteogênese, osteoindução e osteocondução(3). O termo osteogênese denota os elementos celulares do enxerto que sobreviveram ao transplante e estão ativamente produzindo osso novo. Entretanto, embora algumas células do enxerto possam sobreviver à transferência, as principais fontes de células para esta fase são as células osteogênicas e osteoprogenitoras do hospedeiro. Na osteoindução, todo material é capaz de induzir à transformação das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos ou condroblastos,

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aumentando, assim, o crescimento ou podendo formar osso onde não é esperado. Esse mecanismo foi reconhecido como dependente de vários fatores, que incluem as proteínas específicas, proteína óssea morfogenética – BPM. Tanto o enxerto cortical como o esponjoso contém BPM em sua matriz(4). Uma matriz osteocondutora atua como um arcabouço, que ocorre quando um material, frequentemente inorgânico, permite aposição óssea sobre osso pré-existente, requerendo a presença de osso e células mesenquimais diferenciadas. Um material osteocondutivo sob tecido mole não produzirá neoformação óssea. O enxerto ideal deve apresentar uma característica conhecida como osteointegração, que é a capacidade química de aderência à superfície do osso, sem uma camada intermediária de tecido fibroso(5). O enxerto ósseo autógeno esponjoso é considerado o padrão-ouro por causa de sua osteocondutividade, osteoindutividade, potencial osteogênico, não possuir diferença quanto à histocompatibilidade e não transmitir doenças infecciosas. Este enxerto padrão tem sua própria quota de problemas como quantidade inadequada, especialmente em crianças, a morbidade do local doador e potenciais complicações como dor, hematoma e infecção(6,7). Para superar esses problemas, alternativas biológicas, principalmente homoenxertos e heteroenxertos têm sido utilizados. Mas a limitação da pronta disponibilidade, alto custo, transmissão de doenças e problemas de imunogenicidade têm acelerado a procura por sintéticos, biomateriais inertes como uma alternativa. Hidroxiapatita de cálcio (HA) e β tricálcio fosfato (β-TCP), que pertencem à família da cerâmica de fosfato de cálcio, são materiais osteocondutivos biocompatíveis que oferecem um ambiente químico e uma superfície propícia para formação de osso novo(8,9,10,11). Sua eficácia como substitutos para o enxerto autólogo no preenchimento de defeitos ósseos tem sido provado por vários estudos clínicos e experimentais(12,13,14). O objetivo deste estudo foi apresentar os resultados encontrados com o uso da biocerâmica no preenchimento das falhas ósseas decorrentes de lesões traumáticas e em situações de etiologia ortopédica. CASUÍSTICA E MÉTODO

Foi realizado um estudo prospectivo, em que foram avaliados 36 pacientes, portadores de falhas ósseas de etiologia traumática ou

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ortopédica. As cirurgias foram realizadas no período de maio de 2007 e novembro de 2008, tempo médio de seguimento clínico e radiológico de 2 anos e mínimo de 1 ano. Todos os pacientes foram submetidos a tratamento cirúrgico com uso de biocerâmica no Hospital São Bento Cardioclínica, Belo Horizonte/MG.

Foram 19 pacientes do sexo masculino (52,8%) e 17 do sexo feminino (47,2%); a idade variou de 19 a 84 anos, com média de 45,7 anos e mediana de 37 anos. Foram incluídos apenas os pacientes com falhas que necessitaram no mínimo cinco gramas de biocerâmica.

As falhas ósseas foram divididas em dois grupos distintos; ortopédicas (O) e traumatológicas (T). Foram classificadas como ortopédicas, total de 18 casos, as falhas ósseas observadas nas revisões de artroplastias totais do quadril, 11 casos, artroplastia total do quadril, primária, por coxartrose, 1 caso, osteotomias de fêmur ou tíbia de cunha aberta, 5 casos, e artrodese do tarso, 1 caso. Como falhas traumatológicas, 18 casos, as pseudoartroses não infectadas, 8 casos, fraturas recentes do planalto tibial com compressão do osso esponjoso, 3 casos, fraturas expostas tratadas com fixadores externos, 7 casos.

A técnica cirúrgica utilizada no grupo de falhas ortopédicas (O) foi o de curetar e desbridar a lesão até se encontrar osso de aspecto viável a enxertia, a seguir utilizou-se a biocerâmica para preenchimento da falha. Este procedimento foi realizado nas cirurgias de revisões de artroplastia. Nas osteotomias de cunha aberta, a abertura da cunha foi preenchida com biocerâmica e fixada com placa angulada. Na artrodese do tarso, após introdução da biocerâmica, usou-se imobilização gessada. Nas cirurgias do grupo de falhas traumatológicas (T), os casos de fraturas do planalto tibial, no qual houve afundamento, após a redução da fratura, a biocerâmica foi colocada como enxerto para sustentar a redução conseguida e preencher o espaço vazio; as fraturas foram fixadas com placa em L e parafusos. No tratamento das pseudoartroses, as deformidades foram corrigidas, retirando-se a fibrose do foco e a falha óssea preenchida com biocerâmica. Em geral, foi usado placa e parafuso para fixação.

As falhas ósseas, independentemente da causa etiológica, foram cavitárias e segmentares. As falhas ósseas segmentares foram descritas nos exames radiográficos, como as falhas em que houve solução de continuidade do osso.

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A biocerâmica utilizada foi a cerâmica fosfocálcica composta de hidroxiapatita porosa, absorvível, com granulometria média ≤ 10 MESH (MESH é igual ao número de furos que possuem uma polegada linear), o diâmetro do grão é em torno de 2,5mm, encontrada no mercado com o nome de HAP-91®, (JHS laboratório químico Ltda.).

Todos os casos analisados foram radiografados no pré-operatório, pós-operatório imediato e pós-operatório tardio, mínimo de seis meses. Como critério de avaliação radiológica final foi considerado dois pontos, conforme QUADRO 1.

Quadro 1 – Avaliação Radiológica

Avaliação Radiológica 

Osteointegração deficiente da biocerâmica 

Osteointegração da biocerâmica 

RESULTADO

Dos 36 prontuários analisados, observou-se que 35 pacientes (97,2%) apresentaram integração óssea da biocerâmica, 1 caso de fratura exposta tratada com fixador externo apresentou osteointegração deficiente da biocerâmica, sendo necessária nova cirurgia e associação de enxerto da crista ilíaca.

As figuras 1, 2, 3 e 4 ilustram o processo de osteointegração da biocerâmica.

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Figura 1 – Correção de deformidade na tíbia com uso de biocerâmica.

Fonte: Foto do arquivo do Hospital São Bento Cardioclínica – BH/MG.

Figura 2 – Correção de deformidade no fêmur com uso de biocerâmica, retirada placa em 14/07/2009.

Fonte: Foto do arquivo do Hospital São Bento Cardioclínica – BH/MG.

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Figura 3 – Sequela de afroxamento de prótese total do quadril, foi necessário retirada da prótese e correção de falha óssea acetabular com biocerâmica e espaçador, após 9 meses confirmou-se formação óssea e nova prótese foi colocada.

Fonte: Foto do arquivo do Hospital São Bento Cardioclínica – BH/MG.

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Figura 4 – Tratamento de pseudoartrose da tíbia com uso de biocerâmica.

Fonte: Foto do arquivo do Hospital São Bento Cardioclínica – BH/MG.

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DISCUSSÃO

As falhas ósseas, em ortopedia, estão sendo cada vez mais frequentes, principalmente devido ao aumento da incidência dos acidentes de alta energia e das revisões de artroplastias, representando, assim, um desafio para as suas correções(15). Várias são as alternativas para o tratamento destes defeitos ósseos, desde a utilização de enxerto ósseo autógeno ou homógeno, combinando com o desenvolvimento e pesquisas de materiais substitutos do tecido ósseo, que apresentam como principal vantagem a não necessidade de se fazer uma segunda cirurgia para obter enxerto e de diminuir o custo do armazenamento em bancos ósseos específicos.

O enxerto autógeno é o padrão de referência devido às suas características básicas e às suas propriedades osteocondutora, osteoindutora e osteogênica, porém suas limitações são decorrentes da morbidade da área doadora, risco de infecções razoáveis e outros aspectos limitadores, tais como dor, reabsorção, perda de volume, necessidade de nova intervenção, maior tempo de cirurgia, maior sangramento e quantidade limitada.

Os homoenxertos e heteroenxertos são alternativas, entretanto, geram riscos de transmissão de doenças e rejeição tecidual.

Uma das alternativas que parece cada dia mais promissora é a utilização de materiais aloplásticos que, além da função de preenchimento, sejam capazes de levar à estruturação da área pelo tempo necessário, conduzindo o processo de regeneração óssea. Para tanto estes materiais devem ter certas características arquitetônicas tridimensionais, topografia de superfície, rugosidade, porosidade, entre outras, visto que o processo de indução é geométrico dependente(16).

A hidroxiapatita tem sido considerada para o uso no reparo de defeitos ósseos nos últimos 20 anos. Os desenvolvimentos recentes levaram ao interesse no potencial de hidroxiapatita porosa como um enxerto ósseo sintético(17). Neste estudo utilizou-se um biomaterial de cerâmica fosfocálcica totalmente metabolizado, também conhecido como hidroxiapatita porosa, absorvível. Os sais cristalinos depositados na matriz orgânica do osso são compostos principalmente de cálcio e fosfatos e sua estrutura é essencialmente de hidroxiapatita. Este material, colocado junto

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ao osso, funciona como suporte para regeneração do tecido ósseo. Assim sendo, permite que o tecido de regeneração cresça dentro de sua estrutura física pela presença de poros evitando a encapsulação por tecido conjuntivo fibroso e aumentando a velocidade de crescimento dos tecidos. O enxerto ósseo sintético de fosfato de cálcio tem ambas as propriedades, osteointergrativa e osteocondutora. A osteointegração resulta da formação de uma camada de hidroxiapatita após implantação. Os íons de Ca+2 e PO4 -2 necessários para estabelecer esta camada são derivados do implante e do osso ao redor. Os caminhos de ambos os íons de Ca+2 e PO4

-2 foram marcados em soro e urina, sem qualquer elevação significativa dos níveis séricos, a partir do qual se pode concluir que eles são tratados como parte do o pool de íons normal do corpo. Eles têm um excelente registro de biocompatabilidade sem relatos de toxicidade sistêmica(18). As propriedades mecânicas da hidroxiapatita não a torna apropriada para aplicações de resistência à carga, sendo necessário o uso de fixação e um período de proteção(16). Todos os pacientes com falha óssea de causa ortopédica evoluíram bem, sem intercorrências, e houve integração da biocerâmica. Dos 18 pacientes com falhas ósseas traumatológicas, apenas 1 apresentou osteointegração deficiente da biocerâmica, sendo necessária nova cirurgia e associação de enxerto da crista ilíaca.

O uso da hidroxiapatita combinada com aspirado de medula óssea, pela sua propriedade osteogênica, tem sido utilizado em vários estudos de regeneração óssea e bons resultados têm sido demonstrados(13,14,19).

As cerâmicas oferecem características desejáveis, tais como biocompatibilidade para utilização como implantes ósseos como a inércia química em meio biológico e dureza, porém, baixa resistência à tração(20). CONCLUSÃO

O tratamento de falhas ósseas de etiologia traumatológica ou ortopédica, como mostrado neste estudo, com o uso da cerâmica fosfocálcica composta de hidroxiapatita, se revelou um método prático, eficaz e seguro.

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REFERÊNCIAS

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VI- 2: Tratamento de ESCOLIOSE utilizando a Hidroxiapatita

HAP-91®: relato de um caso realizado pelos Drs. Weslei Rezende Paim, Roberto Sakamoto Falcon e Marlon Sudario no Hospital SOCOR - Belo Horizonte - MG - 2006 ESCOLIOSE A paciente D.M.D.S., sexo feminino,faioderma, teve sua primeira consulta em julho de 2004 aos treze anos e onze meses. Ela apresertava Escoliose Toracolombar T5 - L1 com uma curvatura de 29 º para a direita. ( Figuras 1e 2). Sem controle prévio e menarca zero, somente após um ano, julho de 2005, retornou para o controle. Foi solicitada radiografia panorâmica da coluna vertebral e esta mostrou um importante aumento da curva Toracolombar direita de 40º(Figuras 3 e 4 ) A paciente apresentava boa flexibilidade com correção de mais de 50% da curva a inclinação direita (Figura 5). Esta grande evolução da curva no peródo de um ano demonstra um comportamento progressivo e o tratamento sugerido foi cirúrgico. A cirurgia foi realizada em 11 de fevereiro de 2006, quando a paciente apresentava 15 anos de idade. Foi realizada Artrodese Intersomática posterolateral da coluna utilizando auto enxerto misturado com a HAP-91 e parafusos transpediculares de T5 - L1( Figuras 6, 7, 8 e 9). A paciente apresentou boa evolução sem qualquer complicação no Pós operatório. Com consolidação completa da Artrodese comquatro meses após a cirurgia.

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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Figura 7 Figura 8

Figura 9

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VI -3: Tratamento de FRATURA utilizando a Hidroxiapatita HAP-

91®: relato de um caso realizado pelos Drs. Weslei Rezende Paim, e Marlon Sudario no Hospital SOCOR - Belo Horizonte - MG

FRATURA A paciente A.P.P , sexo feminino, leucoderma de 35 anos que possui grande deficiência visual, insufic|ência renal cronica e displasia de quadril,( Figura 1) em 14/03/2006 caiu de uma altura de 1,5metros. Ocorrendo, consequentemente fratura da coluna lombar - explosão do corpo da primeira vertebra lombar - L1 com comprometimento de aproximadamente 45% do canal medular e repercussão leve na função esfincteriana. Foi solicitado radiografia, TAC ( Tomografia Axial Computadorizada) e RMN ( Ressonancia Magnética Nuclear)( Figuras 2 a 9). Após, um estudo detalhado destes exames concluiu que o melhor tratamento seria o cirúrgico. Em 19/03/2006 a paciente foi submetida ao tratamento cirúrgico com a descompressão medular e artrodese posterolateral com enxerto de osso autólogo misturado ao sintético HAP-91 e parafusos transpediculares de T11 a L1. A paciente apresentou boa evolução pós operatória. Com 22 de P.O. (Figuras 10 a 12) e com 50 dias de P.O ( Figuras 13 a 16). Após 6 meses da cirugia ocorreu consolidação completada da artrodese. Devemos ainda ressaltar que a paciente apresentava osteoporose devido à patologia base o que fez com que tivesse um tratamento todo especial porem sem complicações.

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Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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Figura 7 Figura 8

Figura 9 Figura 10

Figura 11 Figura 12

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Figura 13 Figura 14

Figura 15 Figura 16

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VI -4 : Recuperação do Fêmur distal com a Hidroxiapatita HAP-

91®: relato de um caso realizado pelos Drs. Ruy Rocha Gusman e Alceuleir Cardoso de Souza.

INTRODUÇÃO

Dentre os inúmeros materiais aloplásticos utilizados atualmente a hidroxiapatita vem ocupando lugar de destaque entre as pesquisas científicas, nas suas mais diversas formas.

Apresentaremos aqui caso clínico tratado no Hospital Dório Silva na cidade de Vitória, Estado do Espirito Santo, utilizando a HAP-91, com resultado extremamente satisfatório.

HAP-91®

Utilizou-se esta hidroxiapatita sintética, disponibilizada em nosso serviço pela JHS Laboratório Químico Ltda.

De posse de material informativo produzido em 2001, a partir de teses de Doutorado e Mestrado, orientadas pelas doutoras Cleuza M.F. Rezende e Sheyla M.C. Máximo Bicalho, pudemos observar que este material, em diversos estudos científicos, apresentou excelente biocompatibilidade. Além disso, trata-se de material osteoindutor e reabsorvível.

Segundo Andrade A. L. et. al. , exames radiográficos sequenciais não evidenciaram em nenhum dos casos estudados, linha radiolúcida característica de tecido fibroso entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, sugerindo que a união entre HAP-91 e o osso se faz por crescimento ósseo direto

.

O CASO CLÍNICO

Paciente L.M.., do sexo feminino, 36 anos, foi internada no Hospital Santa Rita para extração de um tumor de células gigantes no fêmur distal . Foi realizada a ressecção do tumor, curetagem do foco, termoterapia ( com bisturi elétrico ) e o preenchimento da cavidade com cimento ortopédico.

287

Após dois anos a paciente compareceu ao Hospital Dório Silva apresentando um quadro de dor intensa na região da antiga lesão tumoral.

Exames radiográficos revelaram, não a recidiva do tumor, mas que o cimento ortopédico havia se soltado do local.

Após extensa discussão do caso em reuniões clínicas, onde aventou-se a possibilidade da introdução no local ( por sinal muito extenso ) de enxerto ósseo alopático, optou-se pelo implante do material aloplástico, no caso a hidroxiapatita HAP-91, disponível para uso no serviço, e sua inserção seria feita por técnica cirúrgica extremamente conservadora. Foi realizada a cirurgia com a colocação de osso sintético em cubo associado ao osso sintético em pó.

Figura 1 Figura 2

CONCLUSÕESNeste caso observou-se uma boa integração da hidroxiapatita HAP-91, o que pode ser demostrado nas radiográfias (fig. 1 e 2 ). A paciente possui um deficit funcional do joelho ( Flexão 60o ), devido às multiplas cirúrgias a que foi submetida.

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NEUROCIRURGIA

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VI -1: Eficácia do uso de cerâmica fosfocálcica HAP-19 na artrodese de cirurgia de coluna: Avaliação de 26 pacientes submetidos a tratamento cirúrgico de patologia discal da coluna vertebral, no período de marco a novembro de 2006, no serviço de cirurgia de coluna do Hospital Bandeirantes- SP-SP. Dr. Newton Paes: Neurocirurgião Chefe de Equipe Cirurgia de

Coluna - Hospital Bandeirantes- SP

INTRODUÇÃO

As cirurgias da coluna vertebral nas ultimas duas décadas apresentaram grande evolução, quer no diagnóstico por imagem quer pelo melhor entendimento da dinâmica da coluna vertebral com conceitos de estabilidade, alem da melhora sensível dos implantes utilizados na cirurgia da coluna vertebral. No entanto, a efetividade do uso de implantes é conseguida quando se obtém a fusão óssea do segmento operado. Entende-se por artrodese cirúrgica a formação de pontes ósseas que produzem imobilização de determinado segmento, com conseqüente perda da mobilidade segmentar. Deformidades, má formações, tumores e mais frequentemente doenças degenerativas, podem, dependendo de sua evolução determinar a atuação cirúrgica onde haja necessidade de artrodese de um ou mais níveis com o intuito de promover a estabilidade do segmento afetado. Vários autores, através de diferentes métodos, definiram o que seria instabilidade da coluna, quer do ponto de vista radiológico, quer do ponto de vista funcional. O conceito de White e Panjabi, abaixo citado, resume do ponto de vista fisiológico o conceito de instabilidade, que na verdade é o conflito continente / conteúdo causado pela hipermobilidade de determinado segmento causando estreitamento funcional por redução de diâmetros do canal raquídio. Assim, a instabilidade reflete a incapacidade funcional dinâmica da

290

manutenção dos diâmetros do canal raqueano com relação às estruturas nervosas contidas em seu interior.

Instabilidade clínica é a perda da capacidade da coluna de,

em condições fisiológicas, manter a relação anatômica entre as

vértebras, não, permitindo lesão ou irritação á medula espinhal e

raízes, e, alem disso, não desenvolver deformidades ou dor

incapacitante devido á alterações estruturais. (White e Panjabi)

Na ultima década, vários autores, discutirem a validade e os

benefícios da fusão da coluna, e apresentam alternativas de fixações

que permitem algum nível de mobilidade. Tais procedimentos

cirúrgicos, denominados fixação dinâmica apresentam alternativas

que podem aproximar-se da fisiologia mecânica da coluna vertebral

por permitir alguma movimentação do segmento operado, no

entanto, os procedimentos de fusão segmentar da coluna através da

artrodese, mantêm seu espaço no arsenal terapêutico.

O objetivo do presente texto é apenas avaliar a efetividade

da obtenção de artrodese com o uso de cerâmica fosfocálcica HAP-

19 e não a discussão das vantagens ou desvantagem da fusão ante as

novas técnicas de estabilização dinâmica da coluna vertebral.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisados os resultados referentes à obtenção ou não de

fusão em um total de 26 casos pacientes submetidos a tratamento

cirúrgico de patologia discal da coluna vertebral, no período de marco a

novembro de 2006, no serviço de cirurgia de coluna do Hospital

Bandeirantes.

Todos os pacientes apresentaram quadro radiológico

evidenciando compressão radicular / medular, resistente a tratamento

291

conservador por mais de 08 semanas, sendo todos os pacientes virgens de

tratamento cirúrgico anterior.

Tendo o objetivo de avaliar a eficácia da cerâmica fosfocálcica HAP-19

na fusão, reduziram-se as variáveis com a seleção de pacientes portadores

apenas de doenças discais aonde nenhum paciente da série era fumante

ou apresentava osteoporose, doença óssea, neoplasia, desnutrição

obesidade ou anemias. Nenhum paciente fazia uso crônico de

corticosteróide ou esteve submetido a tratamento quimioterápico. Estudou-se 07 casos de patologia cervical e 19 casos de patologia lombar. A idade dos pacientes variou de 21 a 56 anos com idade média de 39 anos. As patologias cervicais sempre foram utilizadas o mesmo tipo de prótese e sempre com acesso cirúrgico por via anterior utilizando-se 3cc de cerâmica fosfocálcica HAP-91 por segmento operado (figuras 1 e 2). As patologias lombares foram tratadas com laminectomia e fixação por parafusos pediculares em todos os casos, com utilizados 12cc de cerâmica fosfocálcica HAP-91. (figura 3). A técnica antes da colocação da cerâmica fosfocálcica HAP-91 objetivando a formação de artrodese óssea seguiu a técnica cirúrgica clássica de escarrificação óssea previa a adição do material e após a realização de fixação com próteses de titânio. Todos os pacientes foram analisados por radiologista independente e na analise das radiografias de raios-x simples da região operada, a única questão a ser respondida era se havia ou não evidencia radiológica de fusão com artrodese. A avaliação radiológica no controle de 06 meses após o procedimento cirúrgico,evidenciou fusão óssea em 19 dos 26 pacientes estudados perfazendo uma média de 73%, o que esta de acordo com a literatura. Discussão

292

As técnicas de fusão na cirurgia da coluna possuem como padrão de excelência a utilização de enxerto ósseo do próprio paciente como a melhor alternativa para a produção de artrodese. No entanto, a retirada de enxerto ósseo implica em ampliação do tempo de cirurgia, uma vez que o sítio de retirada do enxerto constitui outro campo cirúrgico. Frequentemente o paciente refere dor no local de retirada do enxerto, muitas vezes com desconforto álgico superior e mais duradouro do que o sítio da cirurgia principal. Deve-se ainda ter em conta que o enxerto ósseo retirado do paciente resulta em osso cuja qualidade esta na dependência dos fatores biológicos do próprio paciente fumante, portadores de osteoporose, doença óssea, desnutridos, obesos, anêmicos, usuários crônicos de corticosteróide apresentam arcabouço ósseos de má qualidade e o enxerto retirado destes pacientes é de qualidade discutível quando o objetivo é a fusão óssea segmentar da coluna. As dificuldades acima exposta levaram a buscas de materiais alternativos quer pudessem estimular a cascata fisiológica de estimulo de células mesenquimais que proporcionassem níveis adequados e uniformes de artrodese. Atualmente existem vários elementos como BMP, sais de cálcio, concentrado de plaquetas, entre outros que objetivam o mesmo fim. A analise dos resultados obtidos, na presente série mostrou que o uso de cerâmica fosfocálcica HAP-19, em período pós-operatório de 06 meses apresentou eficiência superior a 70% dos casos estudados, alem de possuir baixo custo e grande facilidade de utilização. Não foram observados clinicamente efeitos adversos e o padrão de fusão foi uniforme nos pacientes que obtiveram a fusão. Conclusão A cerâmica fosfocálcica HAP-91 mostrou em estudo preliminar ser material efetivo na produção de fusão óssea nas

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cirurgias de coluna utilizadas com instrumentação, sendo alternativa bastante válida neste tipo de procedimento cirúrgico.

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Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4 Ressonância magnética de controle mostra a presença de neoformação óssea nos espaços L4/L5 e L5/S1

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VI - 2: Relatos de casos clínicos da COL.HAP-91® em enxertos ósseos na reconstituição da calota craniana sobre tela de titânio realizados na CLINICA NEUROCIRURGICA LEOPOLDO MORAIS FILHO - BOTAFOGO - RIO DE JANEIRO - RJ

2A- RESSECÇÂO DE TUMOR E RECONSTITUIÇÂO DA CALOTA CRANIANA FRONTO PTELIONAL ESQUERDA

A paciente selecionada é uma senhora clara ( Leucoderma) de 58 anos que apresentava dor intensa e progressiva deformidade fronto pterional à esquerda. . Uma tomografia computadorizada revelou a presenca de um tumor acometendo a calota craniana. COL.HAP-91® A Figura1 mostra a paciente no pré-operatório e a figura 2 mostra a área demarcada para a cirurgia. Observem a não realização de tricotomia do couro cabeludo face aos efeitos protetores dos pelos sobre a cicatrizaçãoo e proteção às infecções. A Figura 3 mostra tumoração infiltrando-se na tábua óssea. A ressecção do tumor confirmou o comprometimento da dura mater e parênquima cerebral ( figura 4) de aspecto normal. A Dura mater foi substituída por PPS ( Path de Pericárdio), uma tela de titânio tensionada e fixada com mini parafusos ( Figura 5) e sobre a tela de titânio colocou-se o composito de colágeno e hidroxiapatita a COL.HAP-91®

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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2B: RECONSTITUIÇÃO DO RETALHO FRONTAL A paciente de 28 anos, é portadora de tumor pineal tratado com radioterapia e derivação ventriculo pterional. Desenvolveu pneuencéfalo por hipertensão intracraniana crônica. Submetida à abordagem transesfenoidal e a seguir reforço galeal da rinobose. Tardiamente apresentou osteomielite, sendo necessário retirar o retalho frontal bilateral. Após 6 meses ( Figuras 1 e 2), foi submetida à cranioplastia com tela de titanio e enxertos de colágeno e hidroxiapatita (COL.HAP-91).( Figura 6) As Figuras 1 e 2 demostram a deformidade decorrente da raniiectomia. As Figuras 4, 5 e 7, mostram o posicionamento da tela de titânio tensionada e fixada com 28 miniparafusos. A Figura 7 mostra a tela de titânio sendo recoberta com o composito de colágeno e hidroxiapatita a COL.HAP-91®

A Figura 8 mostra o resultado imediato, paciente ainda anestesiada, com tubo orotraqueal e fronte lisa.

CONCLUSAO

Nestes dois casos pode-se concluir que o composto de colágeno hemostático com a hidroxiapatita absorvível (COL.HAP-91®) usada como material ósseo condutor foi altamente eficaz nas cirurgias reparadoras, principalmente na substituição do flap ósseo bifrontal, restringindo o aspecto quadriculado da tela de titânio sobre pele a glaba e lisa.

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Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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Figura 7 Figura 8

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OTORRINO

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VI-1 TRATAMENTO CIRÚRGICO DA RINITE ATRÓFICA: DESCRIÇÃO DO USO DE IMPLANTES NASAIS COM COL-HAP-91® EM UMA NOVA VIA DE ACESSO - 2007

Dr. Dário Antunes Martins Introdução A rinite atrófica é uma doença nasal crônica caracterizada pela atrofia progressiva da mucosa nasal, reabsorção óssea dos cornetos, presença de secreção viscosa, formação de crostas e por odor fétido característico, algumas vezes chamado ozena. A doença foi inicialmente descrita como entidade clínica isolada por Fraenkel em 1876. Parece ser mais comum em mulheres que em homens, numa proporção de 1:6. A rinite atrófica primária (idiopática) ocorre em um nariz previamente normal. A forma secundária ocorre mais comumente como complicação pós-operatória tardia de cirurgia nasal. Ambas apresentações cursam com ampla cavidade nasal, com epitélio metaplásico, pobre em cílios e elementos glandulares, coberta por crostas espessas e de odor desagradável. O diagnóstico é clínico. O objetivo do tratamento é acabar com a infecção secundária, diminuir a quantidade de crostas e aliviar o cheiro ruim. Quando o tratamento medicamentoso não mostra resposta satisfatória, a intervenção cirúrgica é indicada. As técnicas empregadas visam estreitar as fossas nasais para tornar a passagem de ar mais fisiológica. Implantes de tecidos vivos como gordura, osso ou cartilagem foram tentados, no entanto, com sua absorção gradual os sintomas tendem a recorrer. O principal inconveniente com enxertos sintéticos, como o silicone, é sua freqüente extrusão.

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Caso Clínico Paciente C.A.M., de 47 anos de idade, foi atendido no Ambulatório Melo Alvarenga pela equipe de Otorrinolaringologia da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte. Informava ressecamento nasal importante, com formação de crostas e odor desagradável, evoluindo de longa data. Sem passado cirúrgico ou comorbidades. Tanto a história clínica, exame físico, como a propedêutica posterior, apontaram para o diagnóstico de rinite atrófica. Após a falha do tratamento clínico, com antibóticos orais e sprays nasais, foi indicada cirurgia. Submetido a duas intervenções cirúrgicas com uso de cartilagem costal como enxerto nasal. O resultado não foi satisfatório, com queixa de dor importante no período pós-operatório e reabsorção parcial do material. Neste caso, programou-se nova cirurgia com uso do composto de colágeno hemostático com hidroxiapatita absorvível (COL-HAP-91®), aplicada como material ósseo condutor. Tal composto já foi utilizado em diversos trabalhos científicos na área da saúde, apresentando boa biocompatibilidade, além do fácil manuseio. Materiais e Métodos A técnica cirúrgica foi realizada sob anestesia geral, com via de acesso endonasal por endoscópio rígido de 0º, alternado com visão direta por rinoscopia anterior. A mucosa nasal é infiltrada com solução de Lidocaína 2% com Adrenalina na concentração de 1:80.000. Executou-se a técnica de inclusão endonasal, com descolamento da mucosa do assoalho, septo e parede lateral do nariz após incisão. O compartimento único e amplo criado é, então, preenchido por COL-HAP-91®, mantendo-se contado ósseo em

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pelo menos uma margem. A seguir, foi feita sutura, com sangramento mínimo. . Resultados Não foram observadas complicações pós-operatórias. A fibronasolaringoscopia flexível realizada dois meses após a cirurgia mostrou estreitamento adequado das fossas nasais e ausência de crostas ou mau-cheiro. Não houve extrusão do enxerto. O paciente encontra-se muito satisfeito com a evolução até o momento atual. Discussão Apesar de sua incidência ter diminuído significativamente nos países desenvolvidos,a rinite atrófica permanece como um problema comum nos países em desenvolvimento. Não se conhece cura. Todas as medidas descritas na literatura, clínicas ou cirúrgicas, têm efeito paliativo curto ou duradouro. Considerando-se todas as técnicas cirúrgicas descritas e as modificações nos tipos de enxertos utilizados nos últimos 50 anos, fica claro que a rinite atrófica tem atraído interesse de vários investigadores em diversos países. Nosso trabalho foi realizado com a intenção de apresentar uma nova via de acesso nasal para a colocação de enxertos com COL-HAP-91®, hidroxiapatita sintética. Conclusão O procedimento cirúrgico apresentado é relativamente simples de ser realizado. A escolha de enxertos com COL-HAP-91® para tratamento da rinite atrófica mostrou resultados encorajadores. O material aparece como uma alternativa à reconstrução com enxertia óssea com fragmento de costela, permitindo cirurgias menos complexas e menor morbidade pós-operatória.

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Referencias bibliográficas 1- JHS Laboratório 2002 2- Dutt SN: The etiology and management of atrophic rhinitis, The Journal of Laryngology d Otology, 2005 3- Goldenberg D: Plastipore implants in the surgical treatment of atrophic rhinitis – Technique and results. Otolaryngology Head and Neck Surgery, 2000 4- Garcia GJM, Martins DA: Atrophic rhinitis – A CFD study of air conditioning in the nasal cavity. J. Appl. Physiol. In press, 2007

Figura 1- Aspecto inicial da Figura 2- Incisão para vía cavidade nasal – costras de acesso nasal

Figura 3- Aspecto após Figura 4 Colocação da deslocamento - compartimento COL-HAP-91® - submucoso único e amplo manipulação

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Figura 5 Posição final do enxerto Figura 6 Sutura – Osteoconductor sangramento mínimo

Figura 7 Aspecto final da fossa nasal Dr. Dário Antunes Martins é médico especialista em Otorrinolaringologia, título conferido pela Associação Médica Brasileira e pela Sociedade Brasileira de Otorrinolaringologia. Membro do corpo clínico da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte / MG, onde atua como preceptor da especialização em ORL.

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BUCO MAXILO

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VI -1 Reconstrução de Osso Frontal e Redução dos Ossos

Próprios do Nariz

Hospital Maria Amélia Lins, pela equipe Dra. Maria Tercilia Zuccheratte ,Dr. Renan Di Mingo , Dra. Thaline Coelho,Dr. Daniel

Trivelato Paciente: M.S.M.,Sexo: Masculino, Idade: 19 anos, Leucoderma, Vítima de acidente automobilístico com impacto frontal no volante, Queixa estética do frontal, OPN e da perfusão nasal, evoluiu com fraturas frontal, OPN (com rinodesvio). Procedimento realizado no 30 DPT.

• Solicitado: – RX – TC – Exames laboratoriais – Risco cirúrgico.

Solicitado ao Laboratório JHS, a doação do material COL. HAP 91, usado como material enxertante Trans-operatório

• Delimitação do defeito ósseo • Assepsia • Aposição dos campos • Anestesia local (xylocaína 2% com vaso) + bloqueio do

supra-orbitário. • Incisão no supercílio (+ ou – 2cm) • Descolamento do periósteo • Preenchimento com enxerto aloplástico

Sutura • Anestesia local (xylocaína 2% com vaso) • Redução incruenta da Fratura nasal

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• Tamponamento nasal anterior • Calha gessada

Curativo

Figura 1

Figura 2

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Figura 3

Figura 4

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Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura8

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Figura 9 Figura 10

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VI -2 Reconstrução frontal com hidroxiapatita HAP-91®: relato de tres casos realizados pelo Dr. Adriano do Valle Fernandes.

INTRODUÇÃO

A reabilitação estético-funcional representa tema de grande importância, tanto em traumatologia buco-maxilo-facial quanto em cirurgia de cabeça e pescoço, visto que em ambas especialidades a perda de substância óssea é fator relevante.

Em ambos os casos o objetivo terapêutico principal é reconquistar desempenho funcional e aparência socialmente aceitáveis, devolvendo ao indivíduo sua dignidade e auto-estima.

Na presença de defeitos ósseos pós-traumáticos ou produzidos por mutilações cirúrgicas, o cirurgião pode lançar mão de ampla variedade de técnicas de reconstrução. Modernamente, opta-se pela utilização de enxertos autógenos ou implantes aloplásticos. Cada uma das modalidades apresenta suas peculiaridades, vantagens e desvantagens. (1)

Dentre os inúmeros materiais aloplásticos utilizados atualmente, a hidroxiapatita vem ocupando lugar de destaque entre as pesquisas científicas, nas suas mais diversas formas. Apresentaremos aqui 2 ( dois) casos clínicos tratados no Hospital Maria Amélia Lins da Fundação Hospitalar do Estado de Minas Gerais, utilizando a HAP-91 e um caso no Hospital Publico Regional de Betim , usando COL.HAP-91(colágeno associado à HAP-91, com resultados extremamente satisfatórios.

A HAP-91®

Utilizamos esta hidroxiapatita sintética, na sua forma granular, disponibilizada em nosso serviço pela A.M.G.S., na época fornecedor da FHEMIG.

Utilizando material informativo produzido em 1999, a partir de teses de Doutorado e de Mestrado orientadas pelas doutoras Cleuza M.F. Rezende e Sheyla M.C. Máximo Bicalho, pudemos observar que tal material, em diversos estudos científicos

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apresentou excelente biocompatibilidade. Além disso, trata-se de material osteoindutor e ainda, reabsorvível2

Segundo Andrade A. L. et. al. , exames radiográficos sequenciais não evidenciaram em nenhum dos casos estudados, linha radiolúcida característica de tecido fibroso entre a hidroxiapatita e o tecido ósseo, o que sugere união entre HAP-91 e o osso realizada por crescimento ósseo direto2

2A: PRIMEIRO CASO CLÍNICO

Paciente C.S.V., do sexo masculino, 24 anos, leucoderma, vítima de acidente desportivo com trauma por chute na região frontal, atendido inicialmente no ambulatório do Hospital Maria Amélia Lins da FHEMIG em 09/03/99. Suas principais queixas eram, naquele momento, perda de acuidade visual do olho esquerdo e defeito estético traduzido por afundamento na região supra-orbitária esquerda(Fig 1)

No exame inicial o paciente apresentou-se deambulando, verbalizando bem, orientado, corado e hidratado. Além do referido afundamento na região frontal, mostrava ainda equimose periorbitária bilateral e ptose palpebral esquerda. Os testes não evidenciaram oftalmoplegia. O paciente negava presença de diplopia. O diagnóstico foi fratura de tábua externa de osso frontal na região medial do arco supra-orbitário esquerdo.

Tomografias computadorizadas comprovaram tratar-se de lesão restrita à tabua externa do seio frontal, portanto sem comunicação com a cavidade craniana.

Após extensa discussão do caso em reuniões clínicas, onde aventou-se a possibilidade de correção do contorno ósseo da região com enxertos ósseos ou de gordura, optou-se pelo implante de material aloplástico, no caso a hidroxiapatita HAP-91, disponível

314

para uso no serviço, e cuja inserção se faria por técnica cirúrgica extremamente conservadora. Em 26/11/99 o referido paciente foi admitido no bloco cirúrgico do HMAL/FHEMIG onde submeteu-se à delineação do defeito ósseo com caneta de marcação sobre a pele(Fig 2). O ato cirúrgico consistiu em incisão de cerca de 0,5cm na região de canto superior e medial da órbita esquerda, logo abaixo do supercílio(Fig 3), e posterior descolamento subperiósteo por toda a extensão delineada do defeito(Fig 4), seguido da implantação de aproximadamente 30g de hidroxiapatita granular HAP-91(Fig 5) e sutura por dois pontos interrompidos com nylon 5-0 (Figuras 6a,6b), que foram removidos 1 semana depois no primeiro controle ambulatoria ( Figura 7).

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

315

Figura 5 Figura 6a

Figura 6b Figura 7 Nesta época o paciente se queixava de dor local de baixa

intensidade, apresentando ainda equimose periorbitária à esquerda. O contorno facial estava restabelecido e o paciente extremamente satisfeito com a cirurgia.

Cerca de 7 meses após a cirurgia solicitou-se tomografia computadorizada de controle, a qual não revelou qualquer complicação, e sugeriu algum grau de neoformação local. Controle de 1 ano pós-operatório indicava ótima evolução do caso, com o contorno frontal preservado e excelente grau de satisfação do paciente. Não havia até então sinais clínicos ou

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radiográficos de complicações, que foi confirmado no controle de 2 anos pós-operatório, tendo o paciene recebido alta. 2B: SEGUNDO CASO CLÍNICO Paciente A.G.S., do sexo masculino, 41 anos, melanoderma, vítima de acidente de trabalho com trauma na região frontal por choque contra uma pe dra (Figura1), atendido inicialmente no ambulatório do Hospital Maria Amélia Lins da FHEMIG em 26/07/01. Suas principais queixas eram, naquele momento, cefaléias freqüentes e dor na região supra-orbitária esquerda. No exame inicial o paciente apresentou-se deambulando, verbalizando bem, orientado, corado e hidratado. Exibia afundamento na região frontal esquerda (supra-orbitária), além de ferida corto-contusa suturada na região e obstrução nasal parcial esquerda. Os testes não evidenciaram oftalmoplegia. O paciente negava presença de diplopia, queixando-se porém de embaçamento da visão esquerda, o que mais tarde involuiu. O diagnóstico foi fratura de tábua externa de osso frontal na região supra-orbitária esquerda e fratura dos ossos próprios do nariz. Tomografias computadorizadas comprovaram tratar-se de lesão restrita à tabua externa do seio frontal , sem portanto comunicação com a cavidade craniana. Em 17/08/01, o referido paciente foi admitido no bloco cirurgico do HMAL/FHEMIG onde submeteu-se à delineação do defeito ósseo com caneta de marcação sobre a pele. Fez--se incisao de cerda de 0,5cm na região do canto superior e medial da órbita esquerda, logo abaixo do supercílio, e posterior deslocamento subperiósteo por toda a extensão delineada do defeito, seguido da implanção de aproximadamente 4g de Hidroxiapatita granular HAP-91 e sutura por dois pontos interrompidos de nylon 4-0, que foram removidos 13 dias depois durante controle ambulatorial. Optou-se por tratamento conservador ( preservação) da fratura do nariz.

317

Até o último controle pós-operatório, de 120 dias, o contorno facial estava restabelecido e o paciente extremamente satisfeito com a cirurgia. Porém queixas visuais intermitentes e subjetivas levaram-no a nova avaliação oftalmológica, não tendo retornado até o momento.

A Figura 3a é a HAP-91 numa cuba e a Figura 3b é a HAP-91 numa seringa.

Figura 1 Figura 2

Figura 3a Figura 3b

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Figura 4a Figura 4b

Figura 5a Figura 5b

2C: TERCEIRO CASO CLÍNICO USANDO A COL.HAP-91®

Utilizou-se esta hidroxiapatita sintética, na sua forma de uma manta, disponibilizada em nosso serviço por doação da JHS Laboratorio Quimico Ltda.

Material informativo produzido, a partir de teses de Doutorados e de Mestrados tendo como orientadoras as doutoras Cleuza M.F. Rezende, Sheyla M.C. Máximo Bicalho e Andrea Borges Pacheco relata que tal material utilizado em diversos estudos científicos apresentou excelente biocompatibilidade. Além disso, trata-se de material osteoindutor, reabsorvível(2e)e de facil manuseio.

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Paciente A.S, do sexo masculino, 28 anos, melanoderma, vítima de agressão com trauma na região frontal (Figura1, 2 , 3 e 4), atendido inicialmente no ambulatório do Hospital Maria Amélia Lins da FHEMIG em 16/01/2003. No exame inicial o paciente mostrando afundamento na região frontal central,foi admitido no bloco cirurgico do HMAL/FHEMIG onde submeteu-se à delineação do defeito ósseo com caneta de marcação sobre a pele (Figura5). Produziu-se incisão de cerca de 0,5cm na região do canto superior e medial da órbita direita, logo abaixo do supercílio, e posterior deslocamento subperiósteo por toda a extensão delineada do defeito (Figura 6), seguido de implantação do composito de Colágeno com Hidroxiapatita granular COL.HAP-91 ( Figura 6, 7 , 8 , 9, 10 e11) e sutura por dois pontos interronpidos de nylon 4-0 (Figura 12). Aspecto final ( Figura 13)

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8

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Figura 9 Figura 10

Figura 11 Figura 12

Figura 13

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CONCLUSÕES

Nos casos em questão pode-se observar que a hidroxiapatita

HAP-91 granular e a COL.HAP-91 se prestam muito bem à reconstrução de pequenos defeitos, permitindo cirurgias menos complexas do que, por exemplo, para reconstrução por enxertia óssea, levando portando a uma menor morbidade.

REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS

1. Oral and Maxillofacial Trauma. FONSECA, R.J.; WALKER, R.V. ;

BETTS, N.J. and BARBER, H.D. 2ed. , W.B. Saunders, 1997.

2. HAP-91: Síntese, Caracterização, Testes e Aplicações. ANDRADE, A. L. ; BORGES, A.P.B. ; BICALHO,S.M.C.M. et. al. . JHS Laboratório Químico Ltda., 1999.

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ODONTOLOGÍA

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VI-1: Relato de um caso clínico com o uso de HAP-91® e COl-HAP-91® Cirurgia realizada: Dr. João de Paula dos Santos Membro Titular do Colégio Brasileiro de CTBMF

Histórico A paciente W.M.C, feoderma, fumante e do sexo fenminino com 37 anos, residente no meio rural. Ao exame clínico apresentava-se com uma tumoração no palato,sem queixas de sintomatologia , sem linfadenopatia submandibular e sem ucerações porém, com múltiplos dentes cariados na região adjacente 11, 12, 13, 14, 21 e 22. Foi solicitado um exame rediográfico panorámico em 19/01/2010 o qual revelou imagens sugestivas de cisto dentígero.( Fig. 1 e 2) Tratamento Proposto Levando em conta que a paciente não teria um bom prognóstico periodontal e endôdontico devido limitações sócio económicas e pelo agravante de relatar que não iria parar de fumar ou se quer mudar os seus hábitos quanto a utilização de escova e fio dental ou seja não estaría disposta a tratar seus dentes( Fig 3 e 4) e melhorar seus habitos foi proposto: -A exodontia multipla por solicitação da paciente -A extração do cisto e o enxerto com a COL.HAP-91 Base Piramidal e HAP-91 10 mesh ( Fig 12) Procedimento Cirúrugico A paciente foi operada no dia 01/03/2010. Inicialmente, fez-se a asepsia intrabucal e extrabucal seguida de anestesia loco regional dos nervos alveolares superiores, anteriores e médios bilaterais com complementação anestésica do nervo nasopalatino. Foi feita a exérese de todos os remanescentes dentários e da lesão cística. ( Fig.5, 6, 7, 8, e 9). O cisto (Fig 11 ) foi enviado para exame patológico que confirmou tratar-se de cisto dentígero. Primeiro colocou-se a COL.HAP-91 ( Fig.12 ) e completou com a HAP-91 (Fig 14 e 15). Suturado ( Figura 18)

325

Pós Operatório 03/03/2010 exame clínico aspecto saldável ainda com aumento volumétrico na área enxertada e sem uso de protese.(Fig 21 e 22) 22/04/2010 solicitação de exame radiogáfico (Fig 23) 29/06/2010 O aspecto cicatricial definitivo em palato sem qualquer tumeração ou evidencia de irregularidades ou seqüelas na região operada ( Figura 24) já com as próteses totais superior e inferior. ( Figura 26) As Imagens radiográficas concluidas evidenciam a neoformação óssea na área cística. ( Figura 25)

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

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Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8

Figura 9 Figura 10

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Figura 11 Figura 12

Figura 13 Figura 14

Figura 15 Figura 16

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Figura 17 Figura 18

Figura 19 Figura 20

Figura 21 Figura 22

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Figura 23 Figura 24

Figura 25

Figura 26

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VI- 2: : Relato de um caso clínico com o uso de HAP-91® e COl-HAP-91® Cirurgia realizada: Dr. Carlos Alberto

Bittencourt Belo Horizonte - MG - 2007 Tentativa de Recuperação dos Incisivos Centrais com movimentação Ortodontica IntempestivaHistórico Histórico A paciente L.A.G, leucoderma, do sexo feminino com 42 anos jornalista por possuir vestibulo versão incisivos centrais superiores por volta de 2000 procurou um tratamento Ortodontico. Após algum tempo do tratamento, começou a ocorrer uma movimentação com o deslocamento no sentido palatino. Como resultado desta movimentação ocorreu perda óssea nos dentes 12, 11 e 21 ( Figuras 1, 2, 3 , 4 ,5, 6, e 7 ) e um processo inflamatório infecciosos endodontico com supuração via periodontal. Tratamento Proposto Foi proposto um tratamento endodontico ( Figura 8 ) com pré medicação de antibiotico e antoinflamatório e pósterior tratamento cirúrgico com a utilização de material aloplástico, especificamente hidroxiapatita HAP-91® e COL-HAP-91® ( Figura 9 )para a regularização do tecido ósseo. Procedimento Cirúrugico Inicialmente, fez-se uma assepsia intrabucal e extrabucal seguida de anestesia infiltrativa na região a ser operada.Foram feitas as incisões e deslocamento do retalho muco-periósteo.Todo tecido de granulação da área foi removido.( Figuras 10 e 11) Os incisivos centrais, seguindo a orientação da arcada, foram colocados de volta à sua posição normal e ferulizados com tiras de fibra de vidro impregnadas com resina composta foto trançada e foto polimerizável.(Figura 12,13, 14 e 15 )

331

Uma vez dos dentes fixados iniciou-se a colocação do enxerto HAP-91® finalizando com a COL.HAP-91para melhor acabamento e proteção. (Figuras 16, 17 e 18 ) Para a sutura utilizou-se fio reabsorvível de número 4 ( Figura 19, 20 e 21 ) e como proteção foi utilizado cimento cirúrgico COE.PAC ( Figura 22). Após duas semanas foi trocado o curativo o notou-se o inicio da cicatriazação com reabsorção da sutura. Dois meses depois pela radiografia ( Figura 23 )pode-se observar o inicio da neoformação óssea dos dentes 11 e 21. Com quatro mêses ( Figura 17, 18 e 19) pode-se observar a arquitetura do periodonto em arco com receção gengival indicando a restauração da saúde periodontal no local, os dentes continuam ferulizados. O proximo passo será realizar o planejamento estético para toda a região da bateria labial superior.

Figura 1

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Figura 2 Figura 3

Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7

333

Figura 8

Figura 9 Figura 10

ura 11 Figura 12

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Figura 13 Figura 14

Figura 15 Figura 1

Figura 17 Figura 18

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Figura 19 Figura 20

Figura 21 Figura 22

Figura 23

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VI- 4: Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91® cirurgia realizada na clínica da São Leopoldo Mandic – CPO SL-Mandic, Campinas, São Paulo, no curso de mestrado em periodontia em 2006 pelos profissionais DR. WILLIAM DE SIMONE E DR. WILLIAM BUELAU Cirurgia plástica periodontal para correção de defeito ósseo com o uso de biomaterial, aplicando-se a técnica da regeneração tecidual guiada (RTG). Paciente genero feminino, melanoderma, 28 anos, com significativa perda óssea bilateral localizada entre canino e primeiro pré-molar superior direito e esquerdo (fig. 1 e 2) com queixa de comprometimento estético do sorriso.

Figura 1 Figura 2

HISTÓRICO

Usualmente a reabilitação estética do local é realizada pelo profissional com a utilização de enxerto de tecido conjuntivo, sendo a área doadora o palato para aumento do volume tecidual, técnica esta, que tem como desvantagem, um tempo cirúrgico maior, uma maior morbidade e um desconforto pós-cirúrgico significativo.

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A técnica proposta no caso apresentado, foi a utilização de material aloplástico, específicamente hidróxiapatita COL. HAP-91 Ravioli (fig. 3) em função de sua textura e entrelaçamento, material este de comprovação científica para regularização do volume ósseo. Após devidamente esclarecida sobre o procedimento, a paciente concordou com sua realização, sendo devidamente medicada.

Figura 3

SEQUÊNCIA CIRÚRGICA Após anestesia, realizou-se uma incisão em fundo de saco e duas incisões relaxantes, técnica de Newman (fig. 4), deslocando-se o tecido juntamente com o periósteo provocando um afrouxamento total do tecido, expondo o osso maxilar (fig. 5A e 5B). .

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Figura 4 Figura 5A Em seguida confeccionou-se uma matriz com papel de fio de sutura (estéril) para se cortar o ravióli de hidroxiapatita no tamanho necessário (fig. 6).

Figura 5B Figura 6 . Uma vez descorticalizado o osso maxilar para aporte sangüíneo do enxerto, posicionou-se a COL.HAP-91 (fig. 7 e 8).

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Figura 7 Figura 8 Após confirmada a posição e volumes corretos, realizou-se a

sutura com fio vycril 5-0 (fig. 9).

Figura 9 Figura 10

Para a preservação do leito cirúrgico, foi solicitado à paciente evitar compressão da região bem como manter higienização e escovação cuidadosa.

CONCLUSÃO

A correção do defeito ósseo apresentou resultados satisfatórios após 5 meses (lado direito fig. 10) (lado esquerdo fig. 11), e após 11

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meses (lado direito fig. 12) (lado esquerdo fig 13). Evitou-se o uso de área doadora, no caso o tecido palatino, causando dessa forma uma menor morbidade e diminuindo consideravelmente o tempo cirúrgico com um pós-operatório menos complicado.

Figura 11 Figura 12

Figura 13

341

VI-5: - Relato de um caso clínico com o uso de HAP-91® e COl-HAP-91® Levantamento de seio maxilar bilateral usando HAP-91 e COl-HAP-91® para posterior colocação de implantes

- Cirurgia realizada: Dr. William de Simone e Dr. Anderson Muller -2006-

O paciente do sexo masculino, leucoderma, 46 anos, apresenta atrofia da crista alveolar bilateral por pneumatização do seio maxilar após perda dos elementos superiores posteriores.

Caso clínico Foi realizada uma radiografia panorâmica onde constatou-se a atrofia da crista alveolar em região de seio maxilar bilateral (fig. 1) impossibilitando a colocação de implantes. O paciente foi informado sobre a cirurgia que deveria ser submetido, e o material a ser utilizado seria osso autógeno ou HAP-91. O paciente optou pela HAP-91, por não necessitar de outro cirurgia para remoção de osso autógeno, com isso foi possível a cirurgia em um único local. Realizou-se uma incisão de relaxamento na região canina e uma incisão em crista alveolar (fig. 2D e 2E), o descolamento com afastamento do periósteo até a visualização da parede lateral do seio maxilar (fig. 3). Foi realizada a janela para acesso ao seio maxilar com broca diamantada esférica de baixa rotação e resfriamento com soro fisiológico (fig. 4). Após o acesso do seio maxilar através da janela, foi cuidadosamente descolada a parede da janela e a membrana sinusal para o interior do seio maxilar (fig. 5D e 5E), abrindo assim espaço para colocação da HAP-91 associado ao plasma rico em plaquetas (P.R.P.). (fig. 6D e 6E). A mistura HAP-91 mais o PRP foi cuidadosamente comprimida para o preenchimento dos espaços existentes no seio maxilar. Após o preenchimento foi colocado uma membrana de COL.HAP-91) (fig. 7D e 7E ), para vedar a janela de acesso ao seio maxilar e, realizada a sutura (fig.8 e 9). Na prótese existente foi realizado um alívio para utilização durante o período de espera, de aproximadamente 8 meses.(fig. 10) Foi realizada uma radiografia panorâmica após a cirurgia (fig. 11), onde verificou-se a distribuição do material empregado no interior do seio maxilar.

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Oito meses após a primeira cirurgia, foi realizada uma nova radiografia panorâmica (fig. 12), e com a constatação radiográfica de formação óssea, foi realizada a cirurgia para colocação de implantes. Inicialmente com uma trefina de 3 mm de diâmetro foi retirado do interior do seio maxilar um bloco para exame (fig. 13), e foi constatado que os fragmentos em ambos os lados de tecido ósseo com traves ósseas, continham HAP de permeio às traves ósseas e acúmulos de material amorfo basofílico com caractéres sugestivos de cristais, que por vezes estão incorporados às traves osteóides. Foram colocados 5 implantes do lado direito superior (fig. 14) e 4 implantes dos lado esquerdo superior (fig. 15); todos com boa estabilidade. Após 6 meses foi realizada uma panorâmica para verificar a qualidade óssea formada em torno dos implantes (FIG. 16). Constatou-se uma imagem duvidosa apenas em um implante em região de tuber lado direito superior.

Conclusão A cirurgia para enxerto seio maxilar bilateral com HAP-91 associada ao uso de Plasma Rico em Plaquetas foi eficaz formando osso suficiente para suportar a colocação de implantes osteointegrados

Figura 1

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Figura 2D Figura 2E

Figura 3 Figura 4

Figura 5D Figura 5E

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Figura 6D Figura 6E

Figura 7D Figura 7E

Figura 8 Figura 9

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Figura 10

Figura 11

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Figura 12

Figura 13

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Figura 14 Figura 15

Figura 16

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VI 6: - Relatos de casos clínicos com o uso de HAP-91® Realizado na Faculdade de Odontologia da UFMG pelo Prof. Dr. Ivan Doche Barreiros - 2005 a 2006 6A Primeiro Caso Paciente do sexo masculino procurou a clinica da FOUFMG para tratamento. Após exame radiográfico, (Figura 1 e 2 ) foi constatado a fratura do elemento dental 22, e com pequenas fístulas. Foi feito o planejamento para a exodontia ( Figura 3)e imediatamente foi instatalada uma prótese provisória removível, para manutenção do espaço e estética( Figura 4). Sessenta dias depois, após novo exame radiográfico ( Figura 5), foi feita uma anestésia infiltrativa na região a ser operada, foram feitas incisões com o deslocamento do periósteo expondo completamente o tecido ósseo (Figura 6) a vista vestibular da área receptora mostra o defeito causado pela lesão(Figura 5 e 7). Para a reconstituição da fossa formada na área pelo processo inflamatório foi feito o preenchimento com a Hidroxiapatita HAP-91 protegida com a membrana COL.HAP-91 (Figura 8) e a região suturada ( Figura 9), a (figura 10) mostra o aspecto da região após duas semanas. No setimo mese de operado s estudo radiográfico ( Figura 11) mostra o aumento da densidade óssea no local, a figura 12 mostra o aspecto clínico. No nono mês foi efetuada a abertura do campo onde se vê o defeito ósseo preenchido (Figura13) e instalado um implante ( Figura 14) de plataforma 3.3 mm e hexágono externo. Após mais sete meses ( Figuras 15, 16 e 17) mostram vista palatina da provisória de acrílico sobre UCLA metálico, cicatrização do tecido mole e a formação de papila após cicatrização e com a provisória fixada.

349

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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Figura7 Figura 8

Figura 9 Figura 10

Figura 11 Figura 12

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Figura 13 Figura 14

Figura 15 Figura 16

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Figura 17 Abutment metálico

Prova do abutment em boca Prova do coping de In Ceramica

(Zircônia)

Caso final com coroa metal free

(In Ceram) fixada sobre o

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6B Segundo Caso Histórico Paciente J.E.S. sexo masculino, após fratura da prótese fixa anterior procurou a FOUFMG para tratamento. Foi planejado a confecção de provisórias de acrílico para os dentes 13 e 23, e uma prótese parcial removível anterior. Ao exame clínico é visível o defeito existente, causado pela perda dos órgãos dentais, com formação de uma grande depressão óssea (fossa). Um enxerto utilizando HAP-91 foi realizado, e 09 meses após quatro implantes endósseos foram fixados.

Vista anterior evidenciando Vista incisal evidenciando

o defeito ósseo o defeito ósseo

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Incissão Deslocamento do retalho

Preenchimento com HAP-91

Preenchimento com HAP-91

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Região suturada

Nove meses depois Abertura

Colocação dos implantes Aspecto depois de 30 días

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6C Terceiro Caso

Paciente sexo masculino, 44 anos de idade com fratura do elemento dental 21( Figura 1 e 2), foi submetido a uma intervenção cirúrgica para avulsão dental ( Figura 3) procurando preservar as papilas interdentais, pensando na futura prótese que o paciente irá receber. Imediatamente após a remoção do dente, foi fixado um implante de 4,0 mm de diâmetro ( Figura 4), e os espaços existentes ao redor do mesmo foram preenchidos com hidroxiapatita HAP-91( Figura 5 e 6). Para evitar defeito em tecido mole com incisões verticais e horizontais, foi feito um“gabarito” com papel estéril com o formato do alvéolo, e feito um enxerto ( Figura 7 e 8 ) livre gengival, evitando desta maneira que a hidroxiapatita fosse removida, procurando preservar tanto o contorno ósseo como o gengival. Figura 9

Figura 1 Figura 2

357

Figura 3

Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7

358

Figura 8 Figura 9

359

6D Quarto Caso Depois de tentar por duas vezes o retratamento endodôntico sem sucesso do dente 22, a paciente N.A.B., foi submetida a uma intervenção cirúrgica para remoção de lesão periapical circunscrita, e regularização do ápice radicular. A loja cirúrgica formada foi grande e para evitar a formação de fibrose, foi feito o preenchimento com HAP-91 com tamanhos variando de 10 MESH a 30 MESH.

360

361

6E Quinto Caso Paciente sexo feminino, 58 anos com edema na região mesial entre os dentes 11 e 12, que após exame radiográfico foi diagnosticada a fratura do elemento 12. Imediatamente após a remoção da coroa e do fragmento, um implante endósseo foi fixado em posição, e a hidroxiapatita HAP-91 foi colocada ao redor do implante fazendo o preenchimento dos espaços vazios..

362

363

6F Sesto Caso Paciente com perda óssea vestibular Tomografia mostrando a perda óssea

Visão Tri dimensional da perda óssea vestibular

Abertura cirúrgica

364

Preenchimento com HAP-91 e COL.HAP-91

Provisória de acrílico confeccionada sobre UCLA de titânio

. COROA DE “IN CERAM” FIXADA

SOBRE ABUTMENT PERSONALIZADO

365

Tomografia mostando o aumento conseguindo com HAP-91

366

VI -7: Relato de caso clínico e histopatologia realizado pelo Dr. Alexsander Ribeiro Pedrosa ,e Dr.Glácio Ribeiro Junior - B.Hte - MG

Cirurgia de enxerto inlay em rebordo alveolar atrófico na maxila, usando hidroxiapatita absorvível HAP-91,como preparação para colocação de implantes.

Exame clinico inicial:

O paciente J.B.S, 52 anos, leucoderma, apresentou-se ao consultório sob indicação, para avaliação dos maxilares, relatando perda dos órgãos dentais há aproximadamente 15 anos. Durante esse período,usou prótese parcial removível, superior e inferior, opção dos CD(s), visto que a condição dos rebordos alveolares e dos dentes remanescentes não eram favoráveis. O paciente possuía no maxilar os elementos 23,24 e13, e na mandíbula, 33, 43, 44, 45,48 (Fig.1A,1B e 1C), apresentando Ppr(s) com características estéticas e biomecânicas desfavoráveis, além de doença periodontal avançada.

Exames secundários: Foram solicitadas radiografias panorâmicas (Fig.1A,1B e

1C), e Tomografia Computadorizada (T.C) de maxila, além de exames laboratoriais (hemograma e glicemia TGO,TGP...)

A radiografia panorâmica mostra áreas atróficas de maxila e mandíbula com extensa perda óssea bilateral. Nos aspectos tomográficos os cortes evidenciaram redução do diâmetro vestíbulo lingual na área da cortical oclusal (Fig.2).O osso estava significativamente côncavo anteriormente, e em outras áreas mantinha-se a atrofia do tecido alveolar com redução de altura (Fig.3 e 4) .

367

Os modelos de estudos obtidos comprovaram a deficiência óssea e sugeriam uma extensão do defeito (Fig.8 e 9). Após avaliação dos exames clínicos e radiográficos associados à historia medica conclui-se como favorável a execução de enxertia. Mas, o paciente não estava disposto a reconstruções ósseas extensas por razões de trabalho e optou-se por um esquema simplificado .

Planejamento: Foi proposta a exodontia dos elementos remanescentes e

enxerto inlay de maxila utilizando bio-material alógeno, Hidroxiapatita absorvível HAP-91(Fig.12) na área côncava anterior.Depois de decorridos 10 meses, implantação de 4 implantes travados bicorticalmente . Exodontia gradativa dos elementos inferiores e também implantação de mais quatro implantes na mandíbula (Fig.14 A,14B e 14C) para futuras próteses em over-denture ou protocolo de Branemark .

Procedimentos cirúrgicos: A anestesia foi precedida de assepsia intrabucal e extrabucal,

sendo bloqueados bilateralmente os nervos alveolares superiores anterior e médio, com complementação do n. naso palatino. Foram realizados incisão portiman (na crista do rebordo ósseo, seguida de duas incisões verticais de alívio, posterior aos caninos remanescentes) e deslocamento do retalho muco-periósteo.Observou-se grande aderência do periósteo e áreas de fibroses conjuntivas.

Após visualizar a parede anterior do rebordo da pré-maxila e a extensão do defeito ósseo, procedeu-se à exodontia dos elementos e curetagem do leito receptor e alvéolos . Com auxílio de uma broca maxicut n.10, refrigerada, foi realizado acerto ósseo das arestas.

O leito receptor foi perfurado, sob irrigação abundante, em sua porção mais apical, próximo à fossa nasal, com fresa lança n.2, para estimulação de sangramento e exposição dos fatores de crescimento plaquetários, dentre outros.

368

A hidroxiapatita foi depositada no leito receptor, sem hidratação, e comprimida com auxílio de compressa cirúrgica umedecida com solução salina a 09%. Procedeu-se então à fenestração do periósteo em sentido horizontal à ferida cirúrgica, aliviando assim o retalho mucogengival para sua porção

A prótese total superior foi condicionada com material resiliente em toda a sua extensão e adaptada ao novo perfil do rebordo.

A medicação foi prescrita conforme protocolo terapêutico. O acompanhamento do paciente foi feito com radiografias periódicas (Fig.05). Segunda Fase Cirúrgica (Avaliação do enxerto e instalação dos implantes osteointegraveis):

Antes da cirurgia foi feita Tomografia em espiral da região

do enxerto, onde era notória a presença de área radiopaca bem delimitada com densidade compatível à do tecido ósseo, embora ainda visualizada delimitação da cortical anterior da pré-maxila(Fig.6 A ,6B e7).

Depois de decorridos 10 meses (Fig.15) e após abertura da área, observou-se ainda a presença de material enxertado (Hidroxiapatita HAP-91) não absorvido, integrado ao osso e ao tecido mole do muco periósteo(Fig.10B).

Entretanto, com uso de guia cirúrgico (Fig.10A), procedeu-se à fresagem, expansão óssea, e então percebeu-se boa consistência para instalação de quatro implantes SIN de 3,75x13 com superfície tratada (Fig.13). Os implantes obtiveram sua estabilidade primaria pela cortical óssea do assoalho da cavidade nasal e ancoragem palatina do osso remanescente original(Fig.11A e 11B)

O protocolo de sutura foi realizado, após alivio do retalho.

369

Terceira Fase Cirúrgica (Reabertura dos implantes, e biopsia do enxerto) Decorridos seis meses, a maxila foi novamente (Fig.15) exposta para instalação dos cicatrizadores dos implantes(Fig.16).Com auxílio de contra ângulo e de uma trefina de diâmetro 04 mm (Fig.17A), removeu-se uma porção do enxerto na altura da linha média, seguindo o eixo caudal maxilar anterior, almejando-se obter peça anatomopatológica em toda a extensão do enxerto (Fig.17B). A peça foi recolhida em formoaldeido tamponado e dirigida à fixação e análise histológica.

Em laboratório constataram-se os seguintes resultados: Macroscopia: O fragmento de tecido duro apresentava

coloração castanha, formato irregular, medindo 08x05x03 mm. Um fragmento de tecido duro foi desmineralizado e incluído Fig.17B).

Microscopia: Os cortes histológicos mostraram depósitos de material compatível com cristais de hidroxiapatita induzindo neoformação óssea periférica.Em algumas áreas observou-se remodelação óssea com formação de osso lamelar. As trabéculas ósseas mostravam-se permeadas por tecido conjuntivo fibroso vascularizado. Relatório analisado pelos Dr. Martinho Campolina e Ricardo Santiago/lab. Orallab(Fig.19A,19B e 19C).

Clinicamente os implantes estavam firmes, com percussão timpânica aguda, indicando sucesso na osteointegração primária. Colocaram-se cicatrizadores de 4.1x4 mm de altura e sutura (Fig.18), e procedeu-se à reabilitação proposta.

Comentários:

Devemos reconhecer queem principio a idéia não era a instalação de implantes devido à pouca experiência com material aloplástico. Entretanto ficamos espantados com os resultados histológcos e clínicos obtidos nos casos. Referencias: 1-McKINNEY,et all .B.B The Scientific Basis For Dental Implant

370

Therapy, J.Dental Education,v.52,n.12p.696-705,1988. 2-NAGAHARA,K.,et all.Ostegenesis of hydroxyapatite and tricalcium phosphate used as a Bone substitute.Int.J.Oral Maxillofac.Implants.v.7,p.72-79,1992. 3-JHS Laboratório Químico Ltda, 2002. 4-ANDRADE,A.L.;BORGES,A.P.B.:Bicalho,S.M.C.M.et HAP-91: Síntese, Caracterização, Testes y Aplicações. 5-MOY,P.K.:et all.Maxillary sinus augmentotion: hitomorhometric analisis of graft materials for maxillary sius floor augmentation. Journal Oral Maxillofac.surg.v51,p.857,1993.

Figura 1A Panorámica Figura 1B Panorámica

Figura. 1C Figura 2: Tomografia Computadorizada.

371

Fig.3: Cortes Sagitales Fig.4:Corte Sagital con

marcador T.

Figura 5

Figura 6A Figura 6B

372

Figura 7

Figura 8: Vista Lateral Figura 9: Vista Anterior

Figura 10A Figura 10B

373

Figura 11A Figura 11B

Figura 12: HAP-91 Figura 13: Implante SIN

374

Figura 14A Figura 14B

Figura 14C Figura 15: Maxilar depois

10 meses Figura 16: Reabertura Figura 17A: Biopsia da região

375

Figura 17B Figura 18

Figura 19 A Figura 19B

Figura 19C

376

VI- 8: Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91® e HAP-91® realizado pelo Cirúrgião Dentista Dr. Mauro Fonseca de Freitas – CRO-MG – 17.166 em 20 de setembro de 2000.

A paciente selecionada foi uma senhora de 71 anos, saúde

boa, com perda óssea horizontal severa na face vestibular

correspondente aos premolares superiores do lado esquerdo, o que

causava um desconforto estético muito grande.

Materiais e Métodos 

Inicialmente fez-se uma anestesia infiltrativa na região a ser operada e no local, com bisturi, uma incisão, estendida até dois dentes adjacentes, tanto para mesial como para distal. A incisão foi feita com bisturi número 15 na crista do rebordo e uma relaxante na região distal do primeiro molar. O descolamento do retalho foi feito com espátula número 7. Após o deslocamento, a região do enxerto foi toda perfurada com broca esférica número 1 com profundidade suficiente apenas para transpor, com segurança, a região cortical. Em seguida, no leito do enxerto, colocou-se uma camada de HAP- 91, recoberta com a COL.HAP-91®, atingindo um volume vestibular maior que o volume normal da região adjacente. Terminada a colocação do enxerto, foram realizadas pequenas incisões relaxantes na parte interna do retalho para que a reposição do mesmo fosse feita de maneira passiva, reduzindo o risco de exposição do enxerto. Em seguida fez-se uma sutura com pontos individuais, usando-se fio de sutura montado da marca ecth-,número 4,0.

377

RESULTADOS Após seis meses, o enxerto havia sido parcialmente reabsorvido, o remanescente permaneceu bastante satisfatório, apenas ligeiramente menos volumoso que as paredes vestibulares naturais adjacentes.A paciente mostrou-se satisfeita e não achou necessária uma nova intervenção para corrigir as pequenas falhas.

COMENTÁRIOS A idéia inicial era apenas a de realizar uma correção estética, mas em vista dos resultados animadores pensou-se na colocação local de implantes. Entretanto, como havia um fragmento de implante bicortical fraturado e sua remoção implicaria em procedimento cirúrgico, possivelmente doloroso, optou-se pela confecção de uma ponte fixa convencional.

CONCLUSÕES O resultado obtiido, embora único, sugere ser a HAP-91® material adequado para a correção de defeitos ósseos.

378

VI-9: Relato de Casos Clínicos com uso da HAP-91® realizados pelo Dr. Murilo Gomes Batista - Belo Horizonte - MG

9A Procedimento de levantamento de seio maxilar usando a HAP-91®como preparação para colocação de implantes dentários.

A paciente não tinha osso disponível em altura (profundidade) segundo avaliação prévia verificada através de tomografia computadorizada.

A CIRURGIA Fez-se uma incisão na crista óssea, com duas incisões verticais de relaxamento. O muco periósteo foi descolado superiormente ao fundo do saco vestibular. Visualizada a parede lateral do seio maxilar, abriu-se uma janela de acesso usando uma ponta diamantada esférica com alta rotação e irrigação para resfriamento.Foi então cuidadosamente descolada a membrana sinusal, incluindo a parte da membrana que cobre a parede medial do seio.Todo espaço ósseo foi preenchido com a HAP-91® ligeiramente umedecida com soro fisiológico. O material foi cuidadosamente comprimido para se preencher todos os espaços na cavidade sinusal. O muco periósteo foi recolocado em posição, sem nenhuma membrana (Goretex-Tetseu, Colágeno, etc.) cobrindo a janela óssea. Oito meses após, a área de enxerto sinusal teve novamente o muco periósteo elevado. No local onde foi feita a janela, o enxerto se mostrou firme e partículas da HAP-91® podiam ser visualizadas integradas ao osso e ao tecido mole do muco periósteo. Procedeu-se à osteotomia até a broca de 3 mm de diâmetro, percebendo-se boa consistência óssea, mesmo na parte mais apical da osteotomia, no âmago do seio maxilar enxertado.

379

Três implantes (superfície porosa) foram colocados, obtendo-se boa estabilidade primária .

Seis meses após o procedimento o muco-periósteo foi novamente aberto, verificando-se integração óssea dos três implantes.

Um mês após, juntamente com outros três implantes colocados no lado oposto, sem necessidade de enxerto no seio maxilar, foram feitas estruturas metálicas para suporte de uma overdenture, sem palato. A prótese já está em funcionamento por 4 meses, não tendo ocorrido nenhum problema com os implantes colocados na área enxertada.

Figura 1: Panorâmica inicial Figura 2 : Janela óssea aberta para colocação da HAP-91

380

Figura 3: HAP-91 colocada Figura 4: Osteotomía para la no seio maxilar depois colocação dos 3 implantes descolamento da membrana 8 meses depois do enxerto

Figura 5: Raio-X com Figura 6: Over-denture os Implantes colocada

381

9B : Procedimento de levantamento de seios maxilares usando a HAP-91® como preparação para colocação de implante total da arca superior .

O paciente selecionado foi um senhor de 45 anos que fazia uso de prótese total superior desde os 22 anos, com queixa de falta de estabilidade e retenção da prótese, alem da insatisfação com a cobertura total do palato. No exame clínico intra oral foi constatada atrofia da crista alveolar.

CASO CLÍNICO

Fez-se uma tomografia computadorizada para estudo da crista alveolar remanescente e seios maxilares, em caso de necessidade de enxerto dos mesmos. A tomografia constatou a presença de uma crista óssea alveolar extremamente reabsorvida e em forma de lâmina de faca ( Fig.1a e 1b), o que inviabiliza a colocação de implantes dentais em qualquer posição da arcada superior. Informou-se ao paciente a possibilidade de se fazer o enxerto do seio maxilar, e posterior colocação de implantes dentais para retenção de uma “over denture” Ele foi também informado a respeito do procedimento cirúrgico e possíveis materiais de enxerto.O enxerto autógeno de crista ilíaca foi prontamente descartado pelo paciente, já submetido a este procedimento por motivo ortopédico (acidente de motocicleta). O paciente relatou ter feito a reconstituição de osso do braço direito usando a crista ilíaca, obtendo resultando desanimador, visto que a recuperação do braço foi mais lenta que a do defeito corrigido. Foi ainda mencionada a existência de materiais alográficos, a experiência do profissional com este tipo de material e o suporte da literatura especializada em relação a estes materiais.

382

Com a concordância do paciente foram feitas as duas cirurgias de levantamento dos seios maxilares, e o material usado foi a HAP-91 de 20 mesh. Devido ao grande volume de material de enxerto a ser colocado, o uso de materiais importados inviabilizaria o tratamento em termos de custos. As cirurgias foram feitas em duas etapas, com espaço de três semanas, mantendo-se sempre a prótese total antiga logo após as cirurgias, por vontade expressa do paciente. Esta exigência inviabilizou a possibilidade de correção e enxerto para a crista alveolar atrofiada.

Não utilizou-se nenhum tipo de membrana para fechamento da janela óssea aberta para acesso aos seios maxilares, apenas o material de enxerto foi colocado em excesso para evitar a penetração de tecido mole. O pós-operatório do lado esquerdo transcorreu sem problemas, tendo o do lado direito manifestado sintoma de sinusite, tratada com antibiótico (amoxicilina- clavulanato de potássio) durante duas semanas. O sintoma regrediu completamente e não houve reincidiva.

Oito meses depois foram colocados os implantes, três de cada lado (fig.2, 3, 4,). Durante o ato da colocação dos implantes, basicamente todo o osso alveolar em forma de lâmina de faca foi removido até se obter largura suficiente para alojar os implantes. Em outras palavras, os implantes foram colocados apenas no osso formado a partir do enxerto. Seis meses depois os implantes foram abertos e constatou-se osseointegração em todos. Um mês depois foram iniciados os procedimentos de confecção da prótese, ficando o paciente totalmente satisfeito com o resultado, tanto o estético quanto o funcional ( fig 5 e 6 ).

383

Figura 1a Figura 1b

Figura 2 Figura 3

Figura 4 Figura 5

384

Figura 6 Figura 7 Após 10 anos o paciente retornou ao consultorio para consulta de rotina, sem nenhuma queixa referente a parte implantada, apenas se queixando do desgasate antiestético da over denture ( fig. 7). Foi solicitada uma nova radiografia panorámica ( Fig. 8), a qual constatou o nivel ósseo peri-implantar normal, assim como mucosa perimplantar sadia.. Foi feita nova Overdenture ( fig.9) com plena satisfação do paciente (fig, 10).

Figura 8

385

Figura 9

Figura 10 Conclusão: Logo após o termino do tratamento inicial foram colocados 4 implantes na arcada inferior com protese fixa para a reposição dos dentes que faltavam. Temos aquí um caso de dentes naturais inferiores ( exceto 4 implantes e protese fixa) ocluindo com uma a protese superior implanto suportada. Este quadro implica em excesso de carga sobre os implantes, confirmada pelo excessivo desgaste dos dentes da overdenture, mas ao mesmo tempo demonstra a confiabilidade da colocação de implantes em seios maxilares enxertados com a HAP-91.

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9C: Procedimento de levantamento de seios maxilares usando a HAP-91® como preparação para colocação de implante parcial na arca superior .

A paciente selecionada foi a A.M.P. leucoderma de 50 anos, apresentando quadro clínico de diabete. No exame clínico intra oral constatou-se atrofia da crista alveolar.

CASO CLÍNICO

Foi pedida uma tomografia computadorizada para estudo da crista alveolar remanescente e seios maxilares, em caso de necessidade de enxerto dos mesmos. A tomografia constatou a presença de uma crista óssea alveolar extremamente reabsorvida e em forma de lâmina de faca ( Fig.1, 2 e 3), o que inviabiliza a colocação de implantes dentais no local da arcada superior. O enxerto autógeno de crista ilíaca foi prontamente descartado pelo fato de a paciente ser diabética. Informou-se à paciente sobre a possibilidade de se fazer o enxerto do seio maxilar com a HAP-91®, e posterior implante de quatro (4) dentes. Procedeu-se a uma incisão na crista óssea, com duas incisões verticais de relaxamento. O muco periósteo foi descolado até uma região bem superior ao fundo do saco do vestíbulo. Visualizada a parede lateral do seio maxilar, abriu-se uma janela de acesso usando uma ponta diamantada esférica de alta rotação e irrigação para resfriamento. Foi então cuidadosamente descolada a membrana sinusal, incluindo a parte da membrana que cobre a parede medial do seio.Todo o espaço ósseo foi preenchido com a HAP-91®. O material foi cuidadosamente comprimido para preenchimento de todos os espaços na cavidade sinusal. O muco periósteo foi recolocado em posição, sem nenhuma membrana (Goretex-Tetseu, Colágeno, etc.) cobrindo a janela óssea.

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Oito meses após, a área de enxerto sinusal teve novamente o muco periósteo elevado. No local onde foi feita a janela, o enxerto mostrou-se firme e partículas da HAP-91® podiam ser visualizadas integradas ao osso e ao tecido mole do muco periósteo. Foi feita osteotomia com uma broca de 3 mm de diâmetro, sentindo-se boa consistência óssea, mesmo na parte mais apical da osteotomia, no âmago do seio maxilar enxertado( Fig4). Quatro implantes (superfície porosa) foram colocados e percebeu-se boa estabilidade primária ( Fig.5)

Seis meses após, o muco-periósteo foi novamente aberto, sendo que um dos implantes ( Fig. 6 - seta) não se osseointegrou e como os outros três implantes mostraram -se totalmente osseointegrados optou-se por encerrar o caso. ( Fig.7, 8 e 9). Após dois anos do tratamento, a paciente decidiuu fazer o mesmo tratamento no lado oposto. Pela Figura 10 pode-se observar o crescimento ósseo e a perfeita ósseointegração dos implantes com 3 anos. Conclusão: Apesar da paciente ser diabética insulino-dependente, o acompanhamento de lono prazo ( 10 a 8 anos) demonstrou através de exame clínico e radiografia panoramica ( Fig 10), a eficiência da HAP-91 para este tipo de tratamento. Aspecto da prótese do lado esquerdo com 10 anos ( Fig. 11) e aepecto da protese do lado direito com 8 anos (Fig. 12)

Figura 1 Figura 2

388

Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

389

Figura 7 Figura 8

Figura 9

390

Figura 10

Figura 11 Figura 12

391

9 D: Acompanhamento de próteses sobre implantes colocados em seios maxilares enxertados somente com HAP-91 Dr.Murilo Gomes Batista – 2005 Foram feitos levantamentos de seios maxilares, segundo a técnica de abertura de janela na parede lateral do seio maxilar, semelhante à técnica proposta por Tatum, com levantamento da membrana sinusal e colocação de hidroxiapatita inorgânica HAP-91 ( JHS) com granulometria de 30 mesh. Dezoito implantes tipo Branemark de superficie porosa foram colocados após oito meses de enxerto nos seios maxilares.Dos dezoito implantes somente três não se ósseointegraram, correspondendo a uma taxa de sucesso de 83,3%. 159Todos os implantes foram colocados em osso formado basicamente pela HAP-91, já que em todos os casos as tomografias mostraram 2 a 3 mm de osso original, como pode ser visto em alguns dos casos citados 2b e 2c. Durante a cirurgia de colocação de implantes, em alguns pacientes todo o osso original teve de ser removido, devido à delgada espessura da crista óssea, não atingindo a largura óssea necessária para o alojamento dos implantes. A taxa de sucesso foi próxima à esperada em osso tipo IV. Do total de implantes colocados somente três não se osseointegraram, e destes três, dois foram recolocados com sucesso. Em uma paciente optou-se por não recolocar o implante, devido ao fato de a mesma ser diabética e os implantes osseointegrados eram suficientes para a conclusão do trabalho. Estes casos têm sido acompanhados com bastante frequência, pois é necessária a troca dos aneis de retenção dos O’rings com intervalo de alguns meses, o que obriga o retorno dos pacientes ao consultório. Quanto à sobrevivência destes implantes em pleno funcionamento, nenhum foi perdido até o presente, radiografias recentes não

392

mostram alteração ou problemas decorrentes da função mastigatória. Convem salientar que em todos os pacientes, os dentes implanto suportados têm como antagônicos dentes naturais, implantes e próteses parciais removíveis, que geram uma força oclusal muito maior que contra próteses totais removíveis. CONCLUSÃO A técnica de enxerto de seio maxilar usando osso autógeno apresenta uma série de vantagens tais como:

-menor tempo de espera para colocação dos implantes. -melhor qualidade óssea.

-material 100% biocompatível, custo menor.. Mas também é necessário levar em consideração: - O potencial de morbidade do uso de osso autógeno. - O enxerto bilateral do seio maxilar não conta com volume suficiente de osso removível de local doador intra-oral. - Necessidade de recorrer a locais extra-orais (crista ilíaca), procedimento de alta complexidade, alto custo e pós operatório sofrido (doloroso). - O mais importante é a aceitabilidade do paciente. O uso da HAP-91 embora relativamente recente em relação ao uso de osso autógeno e outros alógenos, nos leva a refletir a respeito dos prós e contras aqui apresentados. A HAP-91 é: - um material inorgânico biocompatível. - a cirurgia é realizada no proprio consultório. - baixa complexidade - preço accessível. - pós operatório praticamente indolor - se transforma-se em osso de boa qualidade em cerca de 8 meses. Resultados de casos posteriores mostraram que a espera de 12 meses possibilita formação de osso de qualidade superior aos 8 meses, sendo provavelmente este o melhor período de espera.

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VI -10- Relatos de três casos clínicos com o uso da HAP-91® e PRP e HAP-91® pura realizados pelo Cirurgião Dentista Dr.

Gustavo Ribeiro Gontijo CRO - MG 15025 Mestrando em Periodontia pela UNICASTELO- CAMPINAS S.P.

10A: ABCESSO PERIODONTAL O paciente selecionado é um senhor moreno ( Melonoderma) de 54 anos, iniciais L.M.F., de saúde boa, apresentando fístula na região palatina correspondente à região entre o pré molar e o molar superior esquerdo, com ausência de sintomatologia dolorosa e mobilidade.

Exames clínico e radiológico indicaram a presença de área radiolúcida na região acima indicada e periapical do primeiro pré molar superior esquerdo e uma fístula correspondendo à área do abcesso. Como tratamento foi realizada uma cirurgia com retalho total por palatino e vestibular, feito o debridamento do abcesso; sendo a cavidade

preenchida com o enxerto inorgânico HAP-91® associada com PRP ( Plasma rico em plaquetas). De acordo com o controle radiográfico houve o desaparecimento da área radiolúcida, bem como da fístula palatina.

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10B:PERIODONTITE CRÔNICA A paciente selecionada é uma senhora clara ( Leucoderma) de 41 anos, A.M.S.F., de saúde boa, apresentando sangramento à escovação e ao uso de fio dental na região mesial do primeiro molar inferior direito.

O exame clínico da região detectou uma bolsa periodontal de 6mm abrangendo a face mesial e lingual do primeiro molar inferior direito.

O exame radiológico mostrou uma área radiolúcida sugerindo perda óssea de aspecto angular na mesial do primeiro molar inferior direito. omo tratamento foi realizada uma cirurgia com retalho total e remoção da reação de granulação, constatando-se defeito ósseo de 3 (três) paredes. Optou-se pelo preenchimento do local com o enxerto inorgânico HAP-91® puro. De acordo com o controle radiográfico, figuras 1 e 2, pode-se observar que houve uma resolução com o desaparecimento da área radiolúcida.

Figura 1 Figura 2

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10C: ENVOLVIMENTO ENDODÔNTICO PERIODONTAL O paciente selecionado é um senhor claro ( Leucoderma) de 61 anos, S.O.G., de saúde boa, apresentando uma mobilidade e supuração no canino superior direito.

Exame clínico confirmou a mobilidade do elemento dentário e à pressão digital observou-se presença de supuração. O exame radiológico mostrou perda óssea severa e profunda (sondagem de 10mm nas faces vestibular e mesial e 5mm nas faces distal e palatina).Ssolicitou-se exame endodôntico do referido elemento, que constatou ausência de vitalidade pulpar. O tratamento endodôntico foi realizado antes do procedimento periodontal. Como tratamento foi feita uma imobilização dos caninos superior direito ao superior esquerdo e realizada uma cirurgia com retalho total e remoção da reação de granulação; a cavidade foi preenchida com 50% de DFDBA ( osso bovino liofilizado) com PRP e 50% com o enxerto inorgânico HAP-91® com PRP. Através do controle radiográfico (Figuras 1 e 2) observou -se o desparecimento total da área radiolúcida, bem como, ao exame clínico, ausência de profundidade à sondagem .

Figura 1 Figura 2

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VI- 11: Relatos de casos clínicos da HAP-91® em enxertos ósseos na implandontia oral realizados pela equipe de Cirurgiões Dentistas * DAVID SERSON, **WANDERLEY DONÁ, **JOSÉ THEODORO PINTO e **JEFFERSON KEN MORIOKA Procuramos neste capítulo mostrar a utilização da hidroxiapatita reabsorvível ( HAP-91® ) como biomaterial utilizado em casos de enxertos ósseos maxilares. Apresentaremos casos associados ao osso autógeno, plasma rico em plaquetas e implantes dentários.

11A:PRIMEIRO CASO CLÍNICO

Paciente M.L.L.S., sexo feminino, 34 anos, edêntula superior, chegou à clínica de Pós-graduação da F.D.C.T.O, na Universidade de São Paulo, à procura de tratamento reabilitador, com a necessidade de colocação de implantes. Após avaliação clínica, radiográfica e confecção de modelos de estudo, verificou-se a indicação de cirurgia de levantamento do seio maxilar bilateral. A técnica operatória realizada é derivada da descrita por Boyne (BOYNE & JAMES, 1980). A opção de material para o preenchimento das cavidades sinusais foi a coleta de osso autólogo realizada pelo aparelho “Autogenous”, associado à hidroxiapatita reabsorvível HAP 91 e Plasma Rico em Plaquetas que momentos antes da cirurgia foi extraído do sangue do paciente pelo método de Afèrese. “Autogenous®”, asociado a la hidroxiapatita reabsorbible HAP 91® Plasma Rico en Plaquetas que momentos antes de la cirugía fue extraído de la sangre del paciente por el método de Aféresis. Figura 1: Abertura e deslocamento do periósteo Figura 2: Retirada do osso Autólogo com o aparelho Autogenous Figura 3: Osso retirado da sínfisis da mandidula Figura 4: Sutura realizada na região doadora Figura 5: Aspecto do osso autólogo, misturado com a HAP-91 Figura 6: Processo de retirada das plaquetas pelo método Afêrese Figura 7: Homogeneização do osso autólogo, HAP-91 e PRP

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Figura 8: Aspecto final da mistura de enxertos Figura 9: Colocação do enxerto na cavidade sensual Figura 10: Cavidade sinsual preenchida Figura 11:Membrana de Colágeno instalada sobre o enxerto

Figura 1

Figura 2 Figura 3

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Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7

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Figura 8 Figura 9

Figura 10 Figura 11

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11B: SEGUNDO CASO CLÍNICO Paciente M.L.L.S., sexo feminino , 34 anos,edêntula, apresentando atrofia maxilar superior anterior, sem suporte labial , com necessidade de enxerto ósseo. Após exame clínico, tomográfico e confecção de modelos de estudo, optou-se pela instalação de seis implantes cilíndricos ósseointegrados juntamente com enxertíase óssea na região O material eleito para o enxerto foi o osso autógeno misturado com hidroxiapatita reabsorvível HAP 91Figura 1:Aspecto ósseo após a abertura e deslocamento da fibromucosa Figura 2: Guía cirúrgico em posição para o preparo dos alvéolos artificiais Figura 3: Instalação de seis implantes osseointegrados Figura 4: Colocação do material de inxerto, remodelando o maxilar anterior Figura 5: Vista final da plastia óssea concluida Figura 6: Aspecto do caso depois de 8 meses Figura 7: Neoformación óssea conseguida, e colocação dos cicatrizadores Figura 8: Cicatrizantes instalados Figura 9: Rehabilitação oral emporcelana Figura 10: Vista frontal do trabalho concluido

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

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Figura 7 Figura 8

Figura 9 Figura 10

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11C: TERCEIRO CASO CLÍNICO Paciente S.C.P., sexo feminino, 38 anos, com falta de elementos dentários anteriores, necessitando de implantes na região e enxerto ósseo para regularização de rebordo e aumento da tábua óssea vestibular. Após análise dos modelos de estudo e radiografias panorâmica e periapical, decidiu-se pela instalação de implantes de ativação imediata com pilares rosqueáveis (CERRUTINHOS), assim como se optou pela colocação de osso autólogo misturado com hidroxiapatita reabsorvível HAP 91 e membrana de colágeno reabsorvível Figura 1: Aspecto depois da abertura e deslocamento da fibromucosa Figura 2: Implantes de ativação imediata com pilares rosqueáveis (CERRUTINHOS) posicionados Figura 3:Colocação de enxerto ósseo autólogo e hidroxiapatita reabsorvivel HAP 91 Figura 4: Colocação da membrana de colágeno reabsorvível sobre o enxerto Figura 5:Vista frontal dos implantes depois da sutura e implantes personalizados para receber prótese provisória Figura 6: Aspecto radiográfico dos implantes e enxerto ósseo Figura 7: Provisorios instalados logo depois da cirugía Figura 8:Trabalho terminado com a instalação de coros em porcelana

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8

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11D: QUARTO CASO CLÍNICO Paciente E.S., sexo masculino , 18 anos, com perda óssea importante na região dos dentes 22 e 23, com necessidade de enxerto ósseo e instalação de implantes. Optou-se pelo enxerto autógeno obtido da região de sínfise mandibular com o auxílio do aparelho Autogenousâ e hidroxiapatita reabsorvível HAP91â, com a finalidade de aumentar a área de suporte para futura instalação de implantes. Após 8 meses da primeira cirurgia, foram realizados 2 implantes de ativação imediata com pilares rosqueáveis. Figura 1:Aspecto da região depois da abertura e deslocamento da fibromucosa. Notar espesura óssea existente Figura 2: enxerto ósseo colocado e suportado por membrana de titanio Figura 3: Aspecto depois da sutura Figura 4:Vista do enxerto depois de 8 meses de sua instalação. Notar a exposição da membrana Figura 5: Aspecto do novo osso já em condição de receber implante Figura 6: Notar a espessura óssea conseguida. Figura 7: Instalação de 2 implantes de ativação imediata com pilares rosqueaveis (CERRUTINHOS). Figura 8: Aspecto final com os implantes em posição

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6

Figura 7 Figura 8

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11E: QUINTO CASO CLÍNICO Paciente A.R.S, 34 anos, médica, apresentando ausência de incisivo central superior direito (dente 11) por trauma automobilístico, com prótese fixa na região apoiada sobre os dentes incisivos central superior esquerdo ( dente 21 ) e lateral superior direito (dente 12), descontente esteticamente, com dificuldade para higienização.Solicitou um planejamento em implantologia. Após avaliação clínica e radiológica, indicou-se a técnica do implante de ativação imediata com pilar rosqueável, e por razão estética, enxerto ósseo na região do dente 11. Foi retirado osso autógeno do ramo mandibular esquerdo com auxilio do “Autogenous”, sendo a quantidade óssea necessária completada com a HAP-91( hidroxiapaptita reabsorvível). Esta mistura foi acondicionada, preenchendo a área receptora previamente preparada (figura 1). Sobre o enxerto foi colocada uma membrana reabsorvível (figura 2). Nas suturas, tanto na região doadora quanto na receptora, para uma cicatrização bem sucedida, os bordos do retalho foram adaptados sem tensão (figura 3 ). No pós-operatório a paciente relatou ausência de dor e edema, demonstrando satisfação quanto ao tratamento. Foram instaladas coroas provisórias ( figura 4 e 5) Após 3 mês de acompanhamento pós cirúrgico, verificou-se a formação de papilas (figura 6) e a estabilidade do implante.

Figura 1 Figura 2

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Figura 3 Figura 4

Figura 5 Figura 6 CONCLUSÃO Esta técnica mostra-se adequada para aplicação em local com reduzida espessura óssea e: - possibilita o paralelismo imediato

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- é realizada em tempo cirúrgico único, com instrumental reduzido e instalação imediata de prótese provisória sobre o implante - forma perfil de emergência - permite correção dos insucessos nos implantes ósseointegráveis convencionais -é de baixo custo - permite a colocação de enxertos e membranas e pela sua versatilidade não necessita de grandes estoques. Esperamos com esse capítulo ter apresentado de forma comprobatória, aplicação dos enxertos com osso autólogo , assim como demonstrar a eficácia da hidroxiapatita reabsorvível HAP 91 como material ósseocondutor de eleição nas cirurgias de reconstrução de defeitos ósseos.

*Foi Professor coordenador e ministrador dos cursos de implantes osseointegrados na Fundação Para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico da Odontologia. FUNDECTO – USP até 11/02 ** Professores assistentes da equipe Serson , nos cursos de Implantodontia na Fundação Para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico da Odontologia . FUNDECTO – USP.

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VI- 12 Relato de um caso clínico com o uso de COl-HAP-91® realizado pelo Cirúrgião Dentista Dr. Ricardo Lúcio Bicalho Megale – CRO-MG – 16.444 .

O paciente J.R.B. de 54 anos, estatura mediana, cor clara ,

apresentava uma mobilidade acentuada no dente 3.7 ( 2o molar inferior esquerdo ) devido a uma lesão de furca e uma grande perda óssea na raiz mesial (Fig.1)

Materiais e Métodos 

Foram realizadas duas sessões de raspagem que eliminaram a inflamação gengival e redução significativa da secreção. A cirurgia iniciou-se na terceira sessão, com anestesia infiltrativa na região a ser operada e no local da incisão. Foram feitas duas incisões com bisturi número 15: uma na crista do rebordo e outra relaxante na região distal do primeiro molar. O descolamento do retalho foi feito com espátula número 7. Após a realização do deslocamento, raspou-se rigorosamente toda a superficíe radicular, bem como a área de furca, removendo-se todo o tecido de granulação e cimento de dentina contaminado (a raspagem foi realizada com rigoroso critério). O local foi irrigado com tetraciclina e após a irrigação perfurou-se a cortical óssea com exposição dos espaços medulares, preenchendo-se toda a loja óssea com a COl-HAP-91® . Terminada a colocação do enxerto foram realizadas pequenas incisões relaxantes na parte interna do retalho para que sua reposição fosse feita de maneira passiva, diminuindo o risco de exposição do enxerto. Em seguida fez-se a sutura com pontos individuais.

Resultados 

Oito meses após o procedimento cirúrgico o dente se apresentava clinicamente com profundidade de sondagem normal, sem bolsa, sem secreção e sem mobilidade. de un difuminado próximo Pela radiografia ( Fig. 2 ) pode-se observar um preenchimento total

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de toda a área da lesão, bem como a presença de um esfumaçado próximo do ápice radicular da raiz mesial..Comentário A presença deste esfumaçado está provavelmente relacionado ao trauma oclusal ou à área de insucesso do enxerto, devido talvez, à não desinfecção total da área.

Conclusão 

O resultado obtido com a escolha da COL-HAP-91® como material para correção de lesões de furca indica-a como boa opção, porém mais casos clínicos devem ser realizados para que tal resultado se confirme.

Figura 1 Figura 2

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VI -13: Relato de um caso clínico com o uso da HAP-91® realizado pelo Cirúrgião Dentista Dr. Jose Carlos M. Sousa Lima - B.Hte A paciente selecionada foi a Senhora M.C.O. de 32 anos que apresentava um quadro de fratura reticular do elemento 26, perfuracao reticular da raiz mesial, com lesao periapical ( Figura 1). Foi indicada uma exodontia e posterior colocacãode implante. Feita a exodontia do elemento 26, o alvéolo foi imediatamente preenchido

com HAP-91® (Hidroxiapatita absorvível) 17/07/02. Em 14/08/02 radiografia da área, mostra claramente as bordas do alvéolo ( Figura 2) Na figura 3, de 1/10/02 pode-se observar a neoformação óssea Na radiografia (Figura 4) tirada em 18/12/02 nota-se osso formado, bem condensado e já radiopaco na área do alvéolo. Em 14/03/04 (Figura 5) oberva-se a formação ossea alveolar com osso circndante. Em 28/07 foi colocado um implante rosqueável da SYN de 11,5 x 5,0. Na figura 6, de15/04/04, pode-se notar a perfeita integração osso-implante.

Figura 1 Figura 2

Figura 3 Figura 4

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Figura 5 Figura 6

CONCLUSÃO Neste caso podemos concluir que a Hidroxiapatita absorvível

HAP-91® foi altamente eficaz como material ósseo condutor , permitindo cirurgias bem menos complexas.

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Agradecimentos

A empresa JHS Laboratório Químico Ltda agradece a colaboração de todos os profissionais que gentil e prontamente dispuseram-se às experiências aqui descritas e documentadas.