Gláucya de Figueiredo Mecca - USP€¦ · AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do alimento
larval na determinação de castas em Melipona scutellaris
(Hymenoptera: Apidae: Meliponini)”
Gláucya de Figueiredo Mecca
RIBEIRÃO PRETO - SP
2015
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do alimento
larval na determinação de castas em Melipona scutellaris
(Hymenoptera: Apidae: Meliponini)”
Gláucya de Figueiredo Mecca
Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento
Co-orientador: Prof. Dr. Hipólito F. Paulino Neto
Versão Corrigida
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para a obtenção do
título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia.
RIBEIRÃO PRETO – SP
2015
AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE
ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Figueiredo-Mecca, Gláucya.
“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do
alimento larval na determinação de castas em Melipona scutellaris
(Hymenoptera: Apidae: Meliponini).” Ribeirão Preto, 2015.
80 p.: 23 il. 30 cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP. Área de
concentração: Entomologia.
Orientador: Nascimento, Fábio Santos.
1. Abelha sem Ferrão. 2. Desenvolvimento larval. 3.
Alimento larval. 4. Pólen. 5. Casta.
Ao meu pai Braz.
Que me olhava com aqueles olhos azuis
cheios de ternura.
E que nos deixou tão cedo...
À minha avó Letícia.
Que me chamava de “flor de maracujá”.
E que está nos deixando aos pouquinhos...
Dedico
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fabio Santos do Nascimento por aceitar o desafio desta orientação, mesmo
sabendo das limitações de tempo impostas pelas minhas atividades docentes.
Ao Prof. Dr Hipolito Paulino Netto pela co-orientação, sempre precisa e incentivadora
mesmo nos momentos mais difíceis.
Ao Prof. Dr. Lucas Matheus da Rocha por aceitar a parceria mesmo em prazo tão reduzido e
se dedicar intensamente às análises palinológicas.
Ao Dr. Sidnei Mateus, amigo e companheiro de trabalho, que não mediu esforços para que
tudo desse certo, pelas longas conversas, pelos conselhos e pelas fotos da capa.
Ao Sr. Edvaldo Biscaro que se dispôs a dirigir até a Bahia para buscar minhas abelhas com
todo o cuidado, e que se sensibilizou ao “tirá-las do paraíso”.
Aos colegas e parceiros de trabalho:
Katia Paula que me ensinou e me acompanhou na preparação das lâminas de palinologia
com toda sua disposição;
Ayrton Vollet que participou da modelagem dos bioensaios e dividiu comigo a
responsabilidade da “criação” das larvinhas, mesmo à distância; e
Tulio Nunes que providenciou as análises das glândulas.
À Bruna Leite Mecca e Jefferson Luiz da Silva que durante um estágio breve e produtivo, me
apresentaram o Prof. Lucas Matheus.
Ao Cristiano Menezes pelas dicas preciosas sobre os testes desenvolvimento.
À Denise Alves pelo empréstimo de colônias em momentos críticos.
À Aline Borba, companheira de sala, de “bandejão”, de eventos científicos e
confraternizações... Sempre disponível para acertar um gráfico, uma formatação... essas
coisas chatas de se fazer. E principalmente, pra rir comigo quando as coisas desandavam,
já que chorar não resolveria.
À Yara Roldão, pela ajuda com as colônias no início, por ter me oferecido a rainha na
divisão da colônia, pelas informações precisas e pelo socorro na reta final.
À todos os colegas do laboratório, que de alguma forma colaboraram com a realização
deste trabalho. Pela solidariedade nos momentos difíceis e pelas boas risadas nos
momentos de descontração. Aos “filhotes biológicos” que me adotaram e me contaminaram
com esse jeito jovem de ser, cheios de planos e de energia para realiza-los.
À todos os amigos, próximos ou distantes, que me acompanharam e me encorajaram nesta
jornada.
À Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras - Ribeirão Preto e ao
Programa de Pós Graduação em Entomologia, pela oportunidade.
À CAPES/PROAP pelo auxílio financeiro.
E especialmente à minha família
Ao meu marido Pedro. Pela compreensão e por apoiar minhas decisões.
Aos meus filhos:
Pedro Lucas, que desta vez ficou só na torcida; e
Fernando, pelas sugestões, críticas e help com o inglês.
Às norinhas Giselle e Monique pelo apoio e carinho.
Ao meu irmão Ed, que sempre me incentivou; e que formou uma linda família com a Dayane
e a Lina enquanto esta tese tomava forma.
À minha mãe Dalci, por tudo. Porque o tudo de uma mãe é imensurável...
À todos que se interessaram, incentivaram, curtiram, tentaram entender, entenderam, ou
não... poder contar com vocês (mesmo que a distância) fez toda a diferença.
Em meio a livros, artigos e textos; planilhas,
tabelas e gráficos; pipetas, frascos e reagentes... de
repente me vi pensando em minhas origens. Talvez eu
venha a ser a primeira doutora da família. E então
lembrei-me de meu avô, um agricultor de origem simples,
praticamente sem estudos, que sabiamente dizia:
“Vou deixar aos meus filhos uma coisa que
ninguém rouba e que o tempo não leva - um diploma”.
E assim se fez.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Colônia de M. scutellaris mantida no interior do laboratório. Conexão para
a área externa (A); abertura central para coleta de amostras (B)..............................14
Figura 2- Tubos de entrada (área externa) ...............................................................15
Figura 3- Parâmetros utilizados para determinação das condições internas da
colônia........................................................................................................................16
Figura 4- Favos de cria destruídos por operárias após manipulação (A e B)............20
Figura 5- Favo de cria com células abertas para coleta de alimento larval e larvas
(A- ovo; B- larva deitada; C- larva em pé)..................................................................28
Figura 6- Transferência de larvas para a Placa de Elisa (A). Larvas recém
transferidas (B)...........................................................................................................28
Figura 7- Placa de Elisa mantidas em Placa de Petri com água (A) e com solução
salina (B)....................................................................................................................29
Figura 8- Experimento com solução salina no 2º dia e alimento
desidratado.................................................................................................................30
Figura 9- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris entre colônias
ao longo dos meses...................................................................................................34
Figura 10- Variação do teor proteico do alimento larval entre as colônias de M.
scutellaris....................................................................................................................36
Figura 11- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris ao longo dos
meses.........................................................................................................................38
Figura 12- Relação entre o teor proteico do alimento larval e as condições das
colônia........................................................................................................................39
Figura 1- Alguns dos grãos de pólen encontrados nas amostras de alimento
larval...........................................................................................................................40
Figura 14- Ocorrência dos diferentes tipos polínicos nas amostras de alimento larval
ao longo do ano..........................................................................................................42
Figura 15- Relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e sua ocorrência ao
longo dos meses (R2 = 0,0658)..................................................................................43
Figura 16- Comparação entre os valores proteicos do alimento larval (vermelho) e
dos valores proteicos dos tipos polínicos das espécies de plantas (verde)...............44
Figura 17- Correlação entre os valores proteicos do alimento larval e os valores
proteicos dos tipos polínicos das espécies vegetais..................................................45
Figura 18- Análise histoquímica de Glândula Salivar de Melipona scutellaris (imagem
em aumento de 400x).................................................................................................46
Figura 19- Análise histoquímica de Glândula Hipofaríngea de Melipona scutellaris
(imagem em aumento de 400x)..................................................................................47
Figura 20- Pupas de operárias e rainhas em desenvolvimento após 36 dias (as setas
indicam as rainhas). Teste 6, tratamento com 150µl de alimento com suplementação
proteica.......................................................................................................................48
Figura 21- Variação de sexo e castas entre os indivíduos sobreviventes em cada
tratamento..................................................................................................................53
Figura 22- Ocorrência de Rainhas nos diferentes testes ao longo dos meses..........55
Figura 23- Ocorrência de rainhas nos diferentes tratamentos. Indices de significância
entre os tratamentos controle e com suplementação proteica em diferentes volumes
de alimento.................................................................................................................56
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1- Colônias utilizadas a cada mês para coleta das amostras de alimento
larval no período de estudo (abril/2012 a março/2013)..............................................18
Tabela 2- Colônias utilizadas a cada mês para coleta de material para os testes de
desenvolvimento in vitro.............................................................................................26
Tabela 3- Média mensal e desvio padrão ( DP) do teor proteico do alimento larval
em porcentagem de peso seco nas colônias de Melipona scutellaris (Apidae,
Meliponini) estudadas.................................................................................................35
Tabela 4- Graus de significância da variação do teor proteico do alimento larval entre
as diferentes colônias.................................................................................................37
Tabela 5- Graus de significancia da variação do teor proteico entre os meses do
ano..............................................................................................................................38
Tabela 6- Resultados da regressão linear mostrando a relação entre o valor proteico
e a ocorrência dos tipos polínicos..............................................................................43
Tabela 7- Resultados obtidos nos diferentes tratamentos utilizados nos testes de
desenvolvimento in vitro.............................................................................................50
Tabela 8- Testes que apresentaram rainhas e suas respectivas porcentagens em
relação às operarias (*)..............................................................................................54
X
Resumo
Melipona scutellaris (Apidae: Meliponini) é uma espécie de abelha sem ferrão
popularmente conhecida como abelha Uruçu. Como outros meliponíneos, forma
colônias perenes e apresenta diferenciação de castas. É encontrada na zona litorânea
do Sul da Bahia ao Ceará, e em regiões do interior da Bahia e Pernambuco. Os ninhos
são construídos somente em troncos ocos de árvores e apresentam arquitetura
elaborada. As células de cria são verticais, arranjadas em favos horizontais formando
placas que se sobrepõe. Seus principais recursos alimentares são pólen e néctar. A
quantidade de alimento estocada nos potes está relacionada com a manutenção e
produção de operárias, rainhas virgens e machos. Por não apresentar células de cria
diferenciadas para o desenvolvimento de rainhas e operárias, não é possível
estabelecer seguramente os fatores responsáveis pela determinação das castas neste
grupo de abelhas. Estudos indicam que mecanismos genéticos e tróficos, incluindo a
qualidade do alimento larval, somados a fatores ambientais interferem na produção
de rainhas. Este estudo avaliou a variação do teor proteico e composição polínica do
alimento larval ao longo de um ano. Os resultados mostraram que o valor proteico do
alimento larval variou de forma equivalente para todas as colônias em todos os meses,
com elevação significativa no mês de julho. O valor proteico do alimento larval não
apresentou correlação com o valor proteico dos tipos polínicos. O valor proteico dos
tipos polínicos não apresentou relação significativa com sua ocorrência no alimento
larval, o que indica hábitos generalistas para a coleta de recursos alimentares. Através
de bioensaios, foi testada a interferência do volume e da suplementação proteica do
alimento larval na determinação de rainhas, cujos resultados demonstraram uma
ocorrência de rainhas significativamente maior nos tratamentos com suplementação
proteica. Conclui-se que embora os tipos polínicos não influenciem diretamente o teor
proteico do alimento larval, os resultados encontrados sugerem que a alteração do
valor proteico do alimento larval depositado nas células seja um fator importante na
determinação de castas nesta espécie.
Abstract
Melipona scutellaris (Apidae: Meliponini) is an indigenous stingless bee species. Like
other Meliponine, colonies are perennial and have female caste differentiation. This
species is found from the cost area of Bahia to Ceará states. The nests are built only
in hollow trees and have an elaborate architecture. The brood cells are vertical,
arranged in horizontal overlapping combs. Pollen and honey are the main food source.
The quantity of food stored in the pots is associated with the maintenance and
production of workers, queens and males. Since there are no differences between the
cells that queens and workers are reared, the factors responsible for caste
determination are still unknown. Studies suggest that both genetic and trophic
mechanisms, including the larval food quality, combined with environmental factors,
interfere in the production of queens. This study evaluated the variation protein content
and the pollinic composition of larval food among colonies of M. scutellaris across a
year. The results showed that the protein content of the larval food varied equivalently
for all the colonies at all months, but presenting an elevation on the protein content in
July. The protein content in the larval food had no correlation with the pollen types. The
protein content of the pollen types showed no significant relation with the pollen types
occurring in the larval food, indicating that the species M. scutellaris presents
generalist habits for food gathering. The interference of volume and protein
supplementation of larval food on queen rearing determination was tested via
bioassays, which results showed a significantly higher occurrence of queens in the
treatments with protein supplementation. We concluded that although the pollen types
did not influence directly the protein content of the larval food, the results obtained
suggest that the variation of protein content of the larval food deposited in the cells
may be an important factor in caste determination in this species.
SUMÁRIO
Introdução geral...........................................................................................................1
Meliponíneos: Apresentação e distribuição geográfica.....................................2
Melipona scutellaris...........................................................................................4
Forrageamento, Estoque de Alimento e Produtividade da Colônia...................4
Castas................................................................................................................7
Justificativa......................................................................................................12
Objetivos..........................................................................................................12
Materiais e métodos...................................................................................................13
1. Determinação dos fatores internos que regulam a produtividade das
colônias...........................................................................................................15
2. Coleta do alimento larval e acompanhamento dos favos de cria................17
3. Teor Proteico do Alimento...........................................................................20
4. Análise Polínica...........................................................................................21
4.1. Valor proteico dos tipos polínicos..................................................22
5. Análise Histoquímica de Glândulas Salivares e Hipofaríngeas...................22
6. Teste de Desenvolvimento in vitro...............................................................23
6.1. Coleta do alimento larval e montagem do experimento.................25
7. Análises estatísticas ...................................................................................30
Resultados..................................................................................................................32
1. Teor proteico do alimento larval..................................................................33
2. Análise Polínica...........................................................................................40
3. Análise das glândulas salivares e hipofaringeas.........................................45
4. Teste de desenvolvimento in vitro...............................................................47
Discussão...................................................................................................................57
1. Teor proteico do alimento larval..................................................................58
2. Análise Polínica...........................................................................................60
3. Teste de desenvolvimento in vitro...............................................................62
Conclusões.................................................................................................................67
Referências bibliográficas..........................................................................................70
Introdução
2 Introdução
Meliponíneos: Apresentação e distribuição geográfica.
Segundo Michener (2000), as diversas famílias de abelhas estão agrupadas na
superfamília Apoidea, entre as quais encontra-se a Família Apidae, que está
geograficamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais. Nas regiões tropicais,
a Família Apidae representa o grupo de abelhas mais abundante, onde apresenta
grande diversidade. Estão presentes também na Austrália, Ásia tropical e África, em
menor número em Madagascar e de maneira dispersa nas Antilhas. Formam o grupo
de abelhas mais comum da América Tropical, e provavelmente o principal polinizador
das espécies vegetais dessa região (Wille & Michener 1973). Segundo Roubik (1989)
principalmente as espécies de ocorrência tropical são na sua maioria sociais, e
provavelmente evoluíram como parte integrante deste ecossistema, de tal forma que
sua alta representatividade torna-se uma regra.
A Família Apidae subdivide-se em várias subfamílias. Destas, a subfamília
Apinae compreende diversas tribos, entre elas a Tribo Euglossini, Tribo Bombini, Tribo
Apini e Tribo Meliponini, da qual a espécie em estudo faz parte (Michener 2000).
As abelhas pertencentes à tribo Meliponini (ou grupo dos Meliponíneos), são
popularmente conhecidas como abelhas indígenas ou abelhas sem ferrão, por terem
um ferrão atrofiado e nunca poderem usá-lo como arma de defesa. Entretanto o termo
“abelha sem ferrão” foi consagrado internacionalmente como por exemplo “stingless
bees” e “stachellose Bienen” (Nogueira-Neto 1970).
Os meliponíneos são eussociais, formam colônias perenes, com população que
pode variar de poucas dúzias a 100.000 operárias ou mais. Apresentam diferenciação
de castas com indivíduos comportamental e morfologicamente distintos. A rainha é
incapaz de sobreviver sozinha principalmente por não forragear, assim como as
operárias não são capazes de manter uma colônia sem rainha, por não produzirem
3 Introdução
fêmeas férteis. Possuem sistemas eficientes de comunicação, armazenamento de
alimento e termorregulação (Sakagami 1982; Michener 2000; 2007).
Os ninhos de meliponíneos apresentam arquitetura elaborada. Geralmente
ocupam cavidades pré-existentes encontradas pelas abelhas, que variam desde
pequenas tocas de besouros abandonadas a grandes cavidades em troncos de
árvores ou cavidades no solo (Michener 2000). O material utilizado na construção é
principalmente o cerume, uma mistura de cera e própolis, e nas espécies do gênero
Melipona ocorre o batume, uma mistura de barro e própolis (também denominada por
Nogueira-Neto 1997, de geoprópolis), como é o caso de Melipona scutellaris. A
entrada do ninho pode ser constituída por um orifício situado no centro de raias de
barro ou geoprópolis ou apresentar-se sob a forma de um tubo de cera, que
normalmente se projeta tanto para o exterior como para o interior, e em geral
desemboca próximo às células de cria (Nogueira-Neto 1970). O alimento, pólen e mel,
é armazenado em potes ovalados construídos de cerume, agrupados nas laterais do
ninho. As células de cria são verticais, com abertura na parte superior que é
operculada após a oviposição. Essas células ou alvéolos, como também podem ser
chamadas, são na maioria das espécies, arranjadas em favos horizontais formando
placas que se sobrepõem, apoiadas por pilastras de cerume, permitindo a passagem
de abelhas por entre as placas. Os favos de cria são frequentemente envolvidos por
lamelas de cerume que formam o invólucro. Algumas espécies, entretanto,
apresentam células de cria isoladas em forma de cachos. (Nogueira-Neto 1970;
Michener 1974; Kerr et al. 1996). A calefação da colônia é feita com cerume,
frequentemente muito rico em própolis (Nogueira-Neto 1970).
4 Introdução
Melipona scutellaris
Segundo Nogueira-Neto (1970), esta espécie é encontrada na zona litorânea
do Sul da Bahia ao Ceará, porém há referências de sua ocorrência em localidades no
interior da Bahia e Pernambuco (Moure & Kerr 1950 apud Nogueira-Neto 1970) e
estudos demonstram que a espécie habita a região úmida do Nordeste (Lamartine
1962 apud Nogueira-Neto 1970). A espécie Melipona scutellaris é popularmente
conhecida como Abelha Uruçu, porém como esta denominação refere-se também à
outras espécies, pode ser identificada como “Uruçu do Litoral Baiano e Nordestino”
(Nogueira-Neto 1970), ou simplesmente Uruçu do Nordeste (Kerr et al. 1996).
Na natureza esta espécie nidifica somente em ocos de troncos de árvores, e
apresenta a entrada do ninho típica, localizada no centro de raias convergentes de
barro, guardada por uma única sentinela. Segundo Lindauer e Kerr (1960) a
população de uma colônia de M. scutellaris compreende aproximadamente 400 a 600
abelhas.
Forrageamento, Estoque de Alimento e Produtividade da Colônia
Devido à grande quantidade de materiais envolvidos nas coletas, raramente se
conhece as características estruturais e bioquímicas dos produtos utilizados pelas
abelhas, além do que, sabe-se muito pouco sobre os mecanismos que atuam na
escolha. A composição, qualidade e facilidade de coleta podem variar entre os tipos
de pólen utilizados pelas abelhas. Alguns contém menor quantidade de proteína, mas
por outro lado, menor teor de água, o que não exigiria um forrageamento tão intensivo
(Roubik 1989). Para Imperatriz-Fonseca et al. (1985), em algumas espécies, a
5 Introdução
atividade de forrageamento pode depender, principalmente, da viabilidade floral,
porém conjugada a outros fatores abióticos.
As abelhas forrageiras coletam produtos variados para a construção e defesa
do ninho, para a manutenção de seu metabolismo e alimentação das larvas. Esses
recursos englobam produtos vegetais como resinas, madeira apodrecida, sementes,
folhas, tricomas, fragrâncias, pólen, néctar, esporos, ceras, entre outros. Alguns
produtos animais também são coletados por algumas espécies, como: fezes, carniça,
urina e pelos. Entretanto, o pólen e o néctar são os principais materiais coletados e
utilizados para a alimentação das abelhas (Roubik 1989).
Experimentos realizados por Castilho-Hyodo (2001) mostraram uma ampla
variedade de concentração de proteína no alimento larval para praticamente todas as
colônias em estudo, e em todas as estações do ano, supostamente relacionada à
disponibilidade de pólen, ou a qualidade proteica do pólen como recurso disponível
em cada estação do ano.
Em Melipona beecheii, Moo-Valle e colaboradores (2001) constataram que a
quantidade de reservas de alimento das colônias tem uma forte influência na produção
de indivíduos reprodutivos, visto que colônias privadas de alimento produzem uma
pequena quantidade de rainhas virgens, e uma proporção reduzida de machos, que
pode apresentar uma queda de 23,4% nas colônias bem alimentadas para 0,7% nas
colônias com restrição alimentar. Morais e colaboradores (2006) verificaram em
Melipona compressipes fasciculata que a produção de machos ocorre somente em
colônias fortes, nas quais houve também um aumento na produção de rainhas em
relação às colônias fracas. Segundo Oster & Wilson (1978) esta redução na produção
de sexuados dá condições à colônias fracas de gastar seus recursos alimentares
6 Introdução
primeiramente para produzir operárias que cumpram tarefas diretamente ligadas à
sobrevivência da colônia.
Interessantemente, há uma estratégia que implica na habilidade que as
colônias têm de modular a produção de machos em relação à quantidade de estoque
de alimento acumulado. Deve haver uma ligação entre as condições de reservas de
alimentos e as condições comportamentais e/ou fisiológicas individuais na produção
de machos. Esta ligação pode prover tanto um feedback estimulador quando as
reservas alimentares são grandes, quanto um feedback inibidor as reservas de
alimento são pequenas (Moo-Valle et al. 2001).
Segundo Bego (1977), a produção de machos em Scaptotrigona aff.
depilis (citada como Nanotrigona postica) também está mais diretamente ligada às
condições internas da colônia (quantidade de alimento e população) do que à variação
dos fatores climáticos, apesar de vários autores terem estabelecido épocas
determinadas para a produção de machos em Meliponíneos. Embora as chuvas e
altas temperaturas sejam fatores extrínsecos importantes para determinar as floradas,
não estão diretamente relacionados à alta produtividade das colônias, inclusive de
machos. Segundo o estudo, a idade fisiológica e cronológica da rainha não influencia
na produção de machos, entretanto tanto a rainha como as operárias controlam sua
produção através da ingestão de ovos funcionais. As questões relacionadas à razão
sexual de indivíduos reprodutivos em insetos sociais são bem difíceis de serem
estimadas devido aos vários fatores que interagem e controlam toda a população da
colônia; é possível que, em colônias de insetos sociais, as frequências de fêmeas e
machos variem em ciclos anuais distintos. A produção de rainhas em S. depilis ocorre
durante o ano todo, não ocorrendo somente em colônias muito fracas. Quando
aumenta o crescimento dos favos, as células reais também tendem a aumentar,
7 Introdução
existindo uma correspondência entre a produção de machos uma maior produção de
rainhas. As rainhas virgens são comumente observadas andando pela colônia, até
que seu corpo seja coberto por cerume e ela provavelmente morra por inanição.
Quando ocorre o processo de substituição da rainha, pode-se sugerir que deva existir
uma falta de atratividade por parte da rainha velha, que induz as operárias a matá-la
ao surgir uma nova rainha atrativa, como já foi levantado por outros autores.
Para Bego (1998), a compreensão dos mecanismos reprodutivos nos
meliponíneos, principalmente no que diz respeito à produção de machos, requer
estudos mais aprofundados, necessitando de observações realizadas a longo prazo,
correlacionando-se diversos parâmetros como: sazonalidade, produção da cria,
estoque de alimento, estado fisiológico da rainha, além de observações do
comportamento das operárias e rainha nas colônias.
Por oferecerem uma boa indicação do estado da colônia, o estoque de alimento,
a quantidade e o tamanho dos favos de cria e o número de células em construção,
são critérios utilizados por diversos autores para determinar os padrões das colônias
em seus estudos, como Bego (1977, 1982 e 1990) em Scaptotrigona depilis, Hilário
et al. (2000) em Melipona bicolor, Paxton et al. (2003) em S. depilis, Pereira (2003)
em Melipona scutellaris, Morais et al. (2006) em Melipona compressipes e Figueiredo-
Mecca et al. (2013) em S. depilis.
Castas
Durante décadas uma série de trabalhos tem sido realizados com o objetivo de
elucidar as várias questões que envolvem a determinação de castas nas diferentes
espécies de abelhas.
8 Introdução
A primeira sugestão de que as castas (operárias e rainhas), nas espécies do
gênero Melipona seriam predeterminadas geneticamente, foi feita por Ihering (1903)
apud Kerr (1948). O autor não admitia que condições externas determinassem o sexo
e a casta dos indivíduos, pois logo após a postura a célula era fechada, portanto a
evolução da larva já estaria determinada, assim como não aceitava a suposição de
que dependeria da quantidade de alimento, tendo em vista que rainhas e operárias
recebiam quantidades iguais de alimento por não haver células diferenciadas para
uma ou outra.
Segundo Campos (1979) em Apis as larvas que originam rainhas ou operárias
são geneticamente iguais, porém a quantidade e a qualidade do alimento oferecido
influenciam na sua diferenciação. As larvas que originam rainhas recebem maior
quantidade de alimento, este em forma de geleia real, enquanto as que originam
operárias recebem uma mistura de mel e própolis, e em menor quantidade em relação
às que originarão rainhas. Nos “Trigonini”, as larvas que se diferenciam em rainhas
ou operárias seriam geneticamente iguais, porém as larvas de rainha se desenvolvem
em uma célula de tamanho maior e recebem uma quantidade maior de alimento que
as larvas de operária, o que sugere ser este o mecanismo de diferenciação de castas
neste gênero, já que aparentemente o alimento é o mesmo. Em Melipona a
diferenciação seguiria um mecanismo genético alimentar através do qual as larvas
geneticamente pré-dispostas a se desenvolverem em rainhas devem receber alimento
em quantidade suficiente para tal.
Observando alguns registros comportamentais do processo de
aprovisionamento e oviposição (POP) em espécies de abelha sem ferrão, nota-se que
o fato das células produtoras de rainhas virgens receberem menos descargas de
alimento larval do que as células produtoras de operárias pode indicar que elas
9 Introdução
receberam mais alimento (Van Veen 2000). Este fato pode ser explicado, pois a
quantidade de alimento depositado nas células é inversamente relacionada com o
número de operárias que realizam a deposição (Kerr et al. 1966).
O processo de aprovisionamento e oviposição (POP) e cuidado com a cria
ocorrem de formas diferentes nos diferentes grupos de abelhas sociais. Em Apis a
oviposição ocorre em uma célula vazia e cerca de três dias após a oviposição as larvas
começam a ser alimentadas de maneira progressiva, por cerca de cinco dias, quando
então a célula é fechada. Nos Meliponíneos ocorre o provisionamento em massa, ou
seja, a postura é realizada pela rainha em uma célula já preenchida com alimento
larval, que logo em seguida é operculada (Sakagami 1982).
Durante a existência de uma colônia de abelhas sociais, a rainha pode morrer
ou ser morta. Em caso de orfandade, a colônia só sobreviverá se a rainha for
substituída. A ausência da rainha ou sua senilidade pode ser percebida pelas
operárias devido a diminuição de seus feromônios ou de outros sinais relacionados à
sua presença (Michener, 1974). Nunes e colaboradores (2014) demonstraram que
hidrocarbonetos cuticulares específicos são responsáveis pela manutenção das
funções biológicas da rainha em uma colônia, uma vez que esses compostos causam
um acionamento neuronal sobre as operárias e exercem controle fisiológico e
comportamental sobre estes indivíduos. Oi e colaboradores (2015) mostraram que
hidrocarbonetos cuticulares são os principais compostos químicos responsáveis pela
sinalização reprodutiva da rainha em uma colônia. Esses compostos podem sinalizar
a presença de uma rainha produtiva e, desta forma, inibir a reprodução de ovos
haploides destinados a produzir machos em abelhas, formigas e vespas. Segundo
Michener (1974) em Apis a orfandade funciona como sinalização para a produção de
10 Introdução
uma nova rainha e sua substituição, já em Melipona as rainhas são produzidas
continuamente.
Estudos demonstram que existem três processos pelos quais larvas de abelhas
podem se desenvolver em rainhas (Michener, 1974; Sakagami,1982):
1- Determinação trófica através da qualidade de alimento;
2- Determinação trófica através da quantidade de alimento;
3- Determinação trofo-genética;
Para Velthuis & Sommeijer (1991) a variação na concentração de proteínas do
alimento larval pode estar relacionada ao desenvolvimento das glândulas
hipofaringeanas das operárias ou ao conteúdo proteico dos grãos de pólen ingeridos
que influenciaria na composição do alimento regurgitado nas células de cria.
A análise da secreção das glândulas salivares de algumas espécies de abelhas
sociais mostrou a presença de proteínas, lipídeos e polissacarídeos em quantidades
variáveis, dependendo da idade do indivíduo e do tipo de glândula, predominando
lipídeos nas glândulas salivares da cabeça e proteínas no tórax (Cruz-Landim 1968;
Cavasin-Oliveira 1995; Meirelles et al. 2001, Moraes 2002).
Estudo realizado por Morais et al. (2006) em Melipona compressipes sugere
que a proporção na produção de indivíduos de diferentes castas é afetada
primeiramente pelas condições internas da colônia, seguida pela disponibilidade dos
recursos alimentares. Verificou-se que rainhas virgens foram produzidas ao longo de
todo o ano, independente da idade da rainha fisogástrica, corroborando outros
trabalhos (Kerr 1948; Darchen & Delage-Darchen 1975; Moo-Valle et al. 2001;
Sommeijer et al. 2003; Wenseleers et al. 2004).
Após muita investigação e debate, ainda não se determinou o mecanismo que
dispara o desenvolvimento de rainhas em Melipona. Em M. beecheii, Jarau et al.
11 Introdução
(2010) identificaram a presença de geraniol como principal componente da secreção
das glândulas labiais das operárias (nurses), como um fator exógeno na determinação
de castas. Segundo os autores, o destino das castas em Melipona é definido tanto
geneticamente, como por um fator associado ao alimento larval. Larvas de fêmeas
geneticamente predispostas a se tornarem rainhas, somente seguirão este padrão de
desenvolvimento se receberem quantidades suficientes de um determinado
composto, que no caso desta espécie, seria o geraniol. O geraniol foi a primeira
substância do alimento larval identificada como um sinal químico exógeno para o
desenvolvimento de rainhas, portanto mais estudos são necessários para melhorar o
conhecimento sobre o assunto.
Para Van Veen (2000) a importância dos fatores alimentares e dos fatores
genéticos na determinação das castas pode ser compreendida se forem levados em
consideração os fatores ambientais e os aspectos reprodutivos da colônia. Somente
sob condições alimentares favoráveis ocorre a expressão gênica, resultando na
produção de rainhas virgens, condições estas relacionadas com o período de floração,
proporcionando maiores possibilidades de forrageamento.
12 Introdução
Justificativa
O presente trabalho teve como finalidade analisar a composição proteica do
alimento larval como fator do processo de determinação de castas em Melipona
scutellaris. Além disso, verificamos a necessidade de um estudo mais aprofundado
sobre as questões que envolvem fatores ecológicos como a variabilidade polínica
disponibilizada no ambiente. Desta forma, um estudo sobre a variação sazonal, as
condições intrínsecas das colônias (fatores internos) e a qualidade nutricional do
alimento larval fornece informações importantes sobre essa questão que vem sendo
discutida há quase um século.
Objetivo
Verificar se a produção de rainhas é afetada pela variabilidade do alimento
depositado nas células de cria de Melipona scutellaris; tal variabilidade é impingida
pela proporção relativa de proteína, sua relação com os tipos polínicos encontrados
neste alimento, sazonalidade e sua influência na produção de rainhas. Além disso,
neste estudo foi testada se a suplementação experimental das proporções proteicas
incrementa a produção de rainhas.
Materiais e
Métodos
14 Materiais e Métodos
O estudo foi realizado no Laboratório de Comportamento e Ecologia de
Insetos Sociais, Campus de Ribeirão Preto, FFCLRP, Universidade de São Paulo –
USP.
Foram utilizadas 23 colônias da espécie Melipona scutellaris, mantidas em
laboratório, em caixas de madeira específicas para criação racional de abelhas
indígenas (figura 1), com abertura para o exterior (figura 2) permitindo o trânsito das
operárias forrageadoras.
Para a análise proteica e polínica do alimento larval, foram utilizadas inicialmente
cinco colônias, denominadas B, C, D, E e F. Este número não se manteve constante
devido ao enfraquecimento ou a perda de algumas dessas colônias e,
posteriormente, sua consequente substituição. No decorrer do período de trabalho
foram utilizadas ainda as colônias denominadas: G, H, I, J, K, L e M para a coleta de
alimento larval para análise.
Figura 1- Colônia de M. scutellaris mantida no interior do laboratório com conexão para a
área externa (A) e abertura central para coleta de amostras (B).
A
B
B
15 Materiais e Métodos
Figura 2- Tubos de entrada (área externa).
1- Determinação dos fatores internos que regulam a
produtividade das colônias.
A produtividade e as condições internas das colônias foram determinadas
através de censo mensal, durante todo o período de pesquisa.
As estruturas apontadas na figura 3 a seguir, foram utilizadas como
parâmetros, para esta avaliação.
1 - número de potes de pólen;
2 - número de potes de mel;
3 - número de células em construção;
4 - número de favos de cria;
5 - diâmetro do favo de cria.
A B
16 Materiais e Métodos
Figura 3- Parâmetros utilizados para determinação das condições internas da colônia.
O censo mensal foi realizado durante o momento da abertura das colônias
para a coleta das amostras do alimento larval, tomando-se o cuidado em minimizar
as interferências que pudessem afetar ou interromper qualquer comportamento
dentro da população colonial. Pelos parâmetros analisados, pôde-se acompanhar as
condições em que as colônias se apresentavam durante o período de estudo.
Aquelas que apresentaram enfraquecimento, ausência ou irregularidade na postura,
ou outras anormalidades tiveram a coleta de amostras suspensa até que voltassem
às condições normais.
1 2
3
4
5
17 Materiais e Métodos
2- Coleta do alimento larval e acompanhamento dos favos de cria
As amostras foram coletadas de abril de 2012 a março de 2013. Ao final do
período foram utilizadas um total de 12 colônias, porém não concomitantemente,
como mostra a tabela 1 a seguir.
Foram coletadas mensalmente 10 amostras de alimento larval de cada
colônia, durante um período de doze meses, procurando manter um mínimo de três
colônias ao mês. A coleta mensal das amostras foi evitada nas colônias que
apresentavam condições fracas, porém o número de amostras coletadas em cada
colônia utilizada se manteve constante. Com o cuidado de não coletar amostras em
colônias órfãs, as coletas foram realizadas em colônias cujas rainhas estivessem
presentes, com única exceção ocorrida no mês de maio. Entretanto, embora a
rainha da colônia B não tenha sido visualizada, a colônia não aparentava estar órfã e
os resultados das análises proteicas não apresentaram valores discrepantes dos
demais. Inicialmente foram utilizadas cinco colônias, porém algumas colônias
enfraqueceram ou mesmo morreram, levando à necessidade de utilizar novas
colônias, como descrito anteriormente e apresentado na tabela 1.
18 Materiais e Métodos
Tabela 1- Colônias utilizadas a cada mês para coleta das amostras de alimento larval no período de estudo (abril/2012 a março/2013).
Colônia/Mês Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar
B X X X X X X X X X X - -
C X X X X - - - - - - - -
D X X - X X - - - - - - -
E X X - X - - - - - - - -
F X X X X X - X - - - - X
G X X X - X -
H X - - -
I X X - -
J X - -
K X -
L X X
M X
19 Materiais e Métodos
As colônias foram abertas uma por vez, o invólucro retirado deixando o favo
de cria mais novo exposto e as operárias de cria (de preferência envolvidas no
aprovisionamento das células) foram coletadas. Assim que a agitação das abelhas
diminuía, as amostras de alimento larval foram coletadas. Dez células de cria da
borda do favo (recém operculadas) foram escolhidas, desoperculadas, os ovos
foram removidos e o alimento larval coletado com micropipeta calibrada para 140µl
para garantir que todo o alimento larval fosse coletado, considerando um o volume
médio de aproximadamente 120µl por célula de cria. As amostras de alimento larval
foram mantidas em geladeira até o término da coleta diária, quando cada uma delas
foi homogeneizada em vórtex. Em seguida foram retirados de cada amostra:
- 20µl depositado em eppendorf, levados à estufa para desidratação e
posterior análise proteica – Bradford.
- 20µl em Tubo Falcon, à qual foram adicionando 3ml de álcool 70% para
posterior análise polínica.
O restante da amostra foi congelada em freezer comum à temperatura
aproximada de -20oC para possíveis necessidades ou utilização futura.
No início dos estudos, para a realização da coleta do alimento larval, o favo
foi retirado com cuidado, colocado em placa de Petri e a amostra coletada fora da
colônia. A seguir o favo (com a placa) foi recolocado na colônia e acompanhado até
que se pudesse identificar os indivíduos (operárias, rainhas e machos) o que é
possível na fase de “pupa de olho preto”. Após cerca de 26 a 30 dias pôde-se iniciar
a verificação dos favos. Entretanto, como este período pode variar, os favos foram
colocados na estufa para garantir que não ocorresse a emergência das abelhas até
que fosse possível a verificação do número de operárias e rainhas.
O acompanhamento dos favos de cria foi realizado somente durante os
20 Materiais e Métodos
meses de abril a agosto, pois estes favos foram frequentemente destruídos pelas
próprias operárias figura 4, causando o enfraquecimento ainda maior das colônias.
Portanto, para reduzir os danos e obter os resultados, as amostras de alimento larval
para a análise passaram a ser retiradas diretamente dos favos, no interior da
colônia.
Figura 4- Favos de cria destruídos por operárias após manipulação (A e B).
3- Teor Proteico do Alimento
A quantificação proteica do alimento depositado nas células de cria foi
realizada de acordo com protocolo baseado no método de ligação de corante de
Bradford proposto por Paulino-Neto et al. (submetido).
A amostra destinada para análise proteica foi desidratada em estufa a 40ºC
por pelo menos 8 a 10 dias para secagem e análise subsequente. Algumas
amostras foram mantidas em estufa por períodos maiores, até que estivessem em
condições de desidratação consideradas adequadas para a realização da pesagem.
A B
21 Materiais e Métodos
Para a análise proteica foi pesado 0,001g de cada amostra de alimento seco
que é moído no próprio eppendorf utilizando um bastão de vidro. Posteriormente, foi
adicionado quantidade semelhante de alumínio em pó para facilitar a pulverização
do alimento e 50µl de NaOH a 0,1 mol/L para umidificar. Após macerada, cada
amostra de pólen é recuperada em 200µl de NaOH a 0,1 mol/L e mantida em
refrigerador por pelo menos 24h para a quebra da parede do pólen e liberação da
proteína. Posteriormente, cada amostra foi fervida em banho-maria por 5 min e
centrifugada a 10.000 rpm por outros 5 minutos à temperatura de 5°C. 30µl do
sobrenadante foi retirado e colocado em eppendorf. A esta solução foi adicionado
0,5ml de solução de Bradford. Foram pipetados em Placa de Elisa a albumina para a
curva padrão e 200µl de cada amostra, em duplicata e lidas em espectrofotômetro
para quantificação da proteína.
Para a construção da curva padrão foi utilizada albumina sérica bovina (BSA).
A quantificação das amostras foi realizada por leitura utilizando comprimento de
onda de 595 nm em espectrofotômetro Beckman® Coulter DXT-880-multimode
detector. Os teores proteicos foram calculados em porcentagem de peso seco.
Três amostras com valores proteicos muito discrepantes foram eliminadas da
análise final dos dados, portanto o número amostral mensal pode apresentar
variação.
4- Análise Polínica
As amostras foram acetolisadas seguindo o método proposto por Erdtman
(1960). Após a acetólise, o pólen foi acondicionado em glicerina 50% por, pelo
menos, 24h. Posteriormente, foi preparada uma lâmina por amostra.
22 Materiais e Métodos
A análise palinológica e identificação do material polínico foi realizada por
meio de parceria firmada com o Professor Dr. Lucas Matheus da Rocha. Para tal, as
lâminas com o material amostral foram enviadas para o Laboratório de Botânica da
Faculdade de Ciências Integradas do Pontal - Universidade Federal de Uberlândia –
UFU – Campus de Ituiutaba.
A identificação dos tipos polínicos presentes nas lâminas foi realizada por
comparação em microscópio binocular EasyPath modelo EP31-05121, com aumento
até 1000x, utilizando o Catálogo Polínico (Silva, 2014) disponível e palinoteca
própria.
A análise foi feita mediante a contagem dos primeiros 400 grãos de pólen
encontrados nas lâminas, como sugerido por Montero & Tormo (1990). Em seguida
será determinado as porcentagens e classes de ocorrência de acordo com a
classificação de Barth (1970) e Louveaux et al. (1970, 1978): pólen dominante (>
45% do total de grãos da lâmina), pólen acessório (de 15 a 44,99%), pólen isolado
importante (3 a 14,99%) e pólen isolado ocasional (< 3%).
4.1- Valor proteico dos tipos polínicos
Para a análise dos dados, foram utilizados os valores proteicos do pólen das
espécies vegetais obtidos de Paulino-Neto et al. (submetido) para as famílias
Annonaceae, Bignoniaceae e Arecaceae; para as demais espécies vegetais Paulino-
Neto et al. (2010), Paulino-Neto et al. (2012a); Paulino-Neto et al. (2012b).
23 Materiais e Métodos
5- Análise Histoquímica de Glândulas Salivares e Hipofaríngeas
A cada coleta mensal de alimento larval, foram capturadas seis operárias
forrageiras e seis operárias de aprovisionamento de cada colônia. Estes indivíduos
foram submetidos à dissecção e análise do conteúdo glandular para investigação de
sua importância na secreção de proteínas no alimento larval.
A análise investigativa do material foi realizada no Laboratório de Microscopia
Eletrônica e Confocal do Instituto de Biociências da UNESP, Rio Claro, SP pelo Dr.
Pablo Henrique Nunes por meio da técnica de Xilidine Ponceau (Junqueira, 1983). O
material previamente fixado em paraformaldeído 4% foi desidratado em soluções
crescentes de etanol, transferido para resina de embebição, incluído e seccionado. A
embebição e a inclusão foram efetuadas em historesina Leica. Os cortes, com uma
espessura de 3 m, foram então recolhidos em lâminas de vidro, e corados por 30
minutos com solução de Xilidine Ponceau, depois passados em tampão acetato de
sódio pH 3,5 por 1 minuto e em seguida lavado em água destilada. Na sequência,
após a secagem, foi feita a montagem com bálsamo do Canadá para observação ao
microscópio e documentação fotográfica.
6- Teste de Desenvolvimento in vitro
Para avaliar a influência da concentração proteica do alimento larval no
desenvolvimento das abelhas e possível determinação de castas, foram realizados
bioensaios utilizando-se técnica descrita por Menezes (2010) com algumas
modificações conforme apresentado a seguir.
24 Materiais e Métodos
Para a suplementação proteica do alimento larval foi utilizada Albumina
Bovina Sérica (BSA), por apresentar em sua composição (Peters 1995) os
aminoácidos essenciais para a nutrição de abelhas melíferas, conforme apresentado
por Somerville (2011).
Inicialmente o teste foi realizado com dois grupos. O primeiro recebeu
alimento larval homogeneizado e água mineral (grupo controle) e o segundo recebeu
o alimento larval com suplementação proteica. Para tal foi utilizada albumina sérica
bovina, usada no preparo das amostras para leitura da curva padrão para Bradford,
diluída em água mineral cuja marca foi escolhida aleatoriamente, porém mantida por
todo o estudo para padronização.
Para os cálculos de suplementação com albumina foram utilizados os valores
obtidos nas análises de alimento larval realizadas até a época do início dos testes.
Determinou-se que para cada µl de alimento larval seria adicionado 1,5µg de
albumina, valor este que corresponde ao valor máximo encontrado em uma célula,
subtraído do valor médio do quartil superior (75% dos valores mais altos).
Nos testes de 1 a 4 foi utilizada albumina cristalizada diluída em água mineral,
portanto para o controle adicionou-se água mineral (de mesma marca) em
quantidade correspondente à de proteína utilizada para suplementação das
amostras experimentais, para evitar a influência da mesma nos tratamentos com
albumina. A partir do Teste 5 foi utilizada albumina líquida. Como não havia
necessidade de diluição em água, o controle passou a ser realizado com alimento
puro.
Inicialmente decidiu-se utilizar 120µL por célula, media do volume de alimento
larval encontrado para esta espécie (Menezes, 2007) e 15 células por vez, sendo
necessários 1800uL de solução final para cada tratamento. Por garantia, foi
25 Materiais e Métodos
preparada uma solução de 2100µL, quantidade suficiente para verificação do teor
proteico do alimento puro e após a suplementação, e eventual perda por aderência
nas paredes do frasco. Portanto, para cada 2100µl de alimento foram adicionadas
16µl albumina (ou água dependendo do tratamento). Esta proporção entre os
volumes de alimento e albumina foi tomada como padrão para todos os testes
realizados durante o experimento, já que não havia referências para tal
procedimento. Posteriormente foram adicionados tratamentos com 150 µL e 180 µL
por célula, utilizando alimento puro e com suplementação proteica em
concentrações equivalentes aos respectivos volumes.
6.1- Coleta do alimento larval e montagem do experimento
Durante a manipulação dos favos para retirada do alimento e larvas a sala foi
mantida úmida para evitar que o alimento, os ovos e larvas desidratem. Para isso foi
utilizado um recipiente com água mantida em fervura por dois ebulidores elétricos
(em substituição ao umidificador).
As colônias foram selecionadas de acordo com a posição e tamanho dos
favos de cria, presença de células em construção e quantidade suficiente de células
recém operculadas, das quais foram retirados o alimento larval e posteriormente as
larvas a serem transferidas. Os favos selecionados foram retirados das colônias para
facilitar a manipulação e evitar a saída excessiva de operárias. Os ovos tendem a
tombar durante a manipulação dos favos, portanto quando utilizados foram retirados
dos favos nas próprias colônias.
A princípio foram utilizadas para os testes o alimento larval e as larvas
provenientes de três colônias (L, M e N). Posteriormente novas colônias foram
adquiridas e sua utilização está demonstrada na Tabela 2 a seguir.
26 Materiais e Métodos
Tabela 2- Colônias utilizadas a cada mês para coleta de material para os testes de
desenvolvimento in vitro.
Colônia/Mês Mar Abr Mai Jun Ago Set Out Nov Dez Jan Fev
L x x x x x
M x x x x x
N x x x
435 x
484 x x x
501 x x
505 x x
524 x x
528
530 x
532 x x
534 x x x x
543
Para a montagem do experimento, inicialmente os favos removidos das
colônias tiveram suas células de cria mais novas abertas, os ovos retirados e
descartados. O alimento larval foi então coletado em quantidades semelhantes de
cada colônia (quando possível), utilizando uma micropipeta 20/200µl ou pipeta
Pasteur descartável. O alimento foi revolvido antes da remoção, sugando e
devolvendo com a própria pipeta duas ou 3 vezes antes da retirada e em seguida
depositado em tubo Falcon graduado ou frasco de vidro em quantidade suficiente
para todos os tratamentos. Posteriormente o alimento foi homogeneizado em vórtex
e dividido em tubos destinados aos diferentes tratamentos. Neste momento o
material foi homogeneizado novamente e foram retiradas amostras de 20 µl de cada
tipo de tratamento para análise proteica através do método de Bradford (alimento
27 Materiais e Métodos
com suplementação proteica, alimento com adição de água e alimento larval puro).
O alimento foi depositado em cavidades de placas de Elisa devidamente
identificadas de acordo com o tipo de tratamento.
Para o desenvolvimento das larvas foram utilizadas placas de acrílico (Placas
de Elisa) com 96 orifícios de 7mm de diâmetro e 10 mm de profundidade. As Placas
de Elisa foram utilizadas seguramente por apresentarem cavidades com dimensões
e formato semelhantes às células de cria naturais de M. scutellaris e, portanto,
adequadas ao desenvolvimento das larvas desta espécie. Só então os ovos ou
larvas foram transferidos. As células de cria foram desoperculadas uma a uma, os
ovos ou larvas foram retirados com o auxílio de um alfinete entomológico dobrado
em forma de gancho e depositados cuidadosamente nas cavidades das placas de
Elisa que já se encontram com o alimento larval. Foram utilizadas preferencialmente
as larvas de ovos recém eclodidos “larvas em pé” e as “larvas deitadas” mais
próximas dos ovos e das bordas da célula de cria, por serem mais jovens (Figuras 5
e 6).
28 Materiais e Métodos
Figura 5- Favo de cria com celulas abertas para coleta de alimento larval e larvas (A- ovo; B-
larva em pé; C- larva deitada).
Figura 6- Transferência de larvas para a Placa de Elisa (A). Larvas recém transferidas (B).
A
B
C
A B
29 Materiais e Métodos
As larvas mais próximas foram distribuídas entre os diferentes tratamentos
para evitar que um tratamento receba as larvas mais jovens e outro as mais velhas,
ou que “clusters” de rainhas como descritos por Koedam (1999) em M. favosa e
Ferreira-Caliman (2012) em M. scutellaris, fossem transferidos para um único
tratamento interferindo no resultado final.
As Placas de Elisa foram mantidas sem tampa, dentro de placas de Petri
(150x30mm) tampadas. Após o 6º dia, foi adicionada uma solução salina saturada
de NaCl para controlar a umidade relativa (UR) (figura 7), que foi mantida em
75%UR (Menezes 2013). O 6º dia foi considerado como referência, entretanto, a
solução salina somente foi adicionada à Placa de Petri após a total ingestão do
alimento pelas larvas, para evitar que o mesmo desidratasse e as levasse à morte
(figura 8).
Figura 7- Placa de Elisa mantidas em Placa de Petri com água (A) e com solução salina (B).
Solução salina
A B
30 Materiais e Métodos
Figura 8- Experimento com solução salina no 2º dia e alimento desidratado.
Os tratamentos foram mantidos em Estufa Incubadora B.O.D. Cientec modelo
CT 703 à 28°C e acompanhados diariamente durante o período larval e de três em
três dias durante o período de pupa com o objetivo de identificar possíveis
adversidades na técnica e para a retirada dos indivíduos que viessem a morrer.
O número de alvéolos utilizados foi determinado de acordo com a
disponibilidade de alimento nas colônias, procurando perfazer um número amostral
significativo e mantido constante nos testes subsequentes.
7- Análises estatísticas
Os dados amostrais obtidos até o momento foram analisados de forma
descritiva calculando-se a média e desvio padrão para o teor de alimento larval das
colônias ao longo do ano. Os resultados das análises realizadas foram avaliados
utilizado o programa Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA, 2007) com nível
de 5% de probabilidade.
31 Materiais e Métodos
Para comparação do teor proteico do alimento larval entre colônias e ao longo
dos meses os dados foram analisados estatisticamente utilizando Modelos lineares
de análise de variância para comparar a importância dos fatores meses e colônias
sobre a variável (teor proteico). Para verificar se as colônias diferiram entre si em
termos de teor proteico foi realizado o teste Tukey a posteriori.
Para análise comparativa da produção de rainhas entre o tratamento controle
e o tratamento com suplementação proteica para cada volume de alimento, foi
aplicado o teste exato de Fisher devido a frequência inferior a cinco.
As análises realizadas para relacionar o valor proteico dos diferentes tipos
polínicos com a ocorrência destes no alimento larval ao longo dos meses foram
realizadas por meio do programa Statistica 9.0. De acordo com os dados obtidos foi
realizado teste de regressão linear simples, utilizando o teor proteico das espécies
de plantas como variável independente e a média mensal de ocorrência de cada tipo
polínico como variável dependente.
Para verificar a relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e o valor
proteico do alimento larval foi realizado o teste de correlação de Spearman por meio
do programa Sigmastat 3.5. A distribuição dos dados e elaboração dos gráficos
foram realizadas utilizando o programa Sigmaplot 10.
Resultados
Resultados
33
Resultados
1- Teor proteico do alimento larval
As análises realizadas indicam uma variação no teor proteico do alimento
larval ao longo do ano. De maneira geral, os menores valores ocorreram nos meses
de setembro e março, apresentando respectivamente valor médio mensal de 3,86%
(n = 10) e 4,72% (n = 30). Entretanto o menor valor de teor proteico foi de 0,29% (n
= 30) que ocorreu em outubro. As amostras que apresentaram os teores proteicos
mais elevados ocorreram em julho, com valor médio mensal de 19,74% (n = 47) e
maior valor amostral geral, alcançando 32,98% (Figura 9). Com altos índices
proteicos, os meses de junho e julho são os únicos a apresentarem diferença
significativa em relação a todos os outros meses, inclusive entre si (tabela 5).
A tabela 3 apresenta os dados relativos aos valores médios de teor proteico
do alimento larval de cada colônia, a cada mês (abril/2012 a março/2013) e os
respectivos valores de desvio padrão.
34 Resultados
Figura 9- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris entre colônias ao longo dos meses.
0
5
10
15
20
25
30
35
abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev mar
Teo
r p
rote
ico
(%
)
Colônia B Colônia C Colônia D Colônia E Colônia F Colônia G Colônia H Colônia I Colônia J Colônia K Colônia L Colônia M
35
Resultados
Tabela 3- Média mensal e desvio padrão ( DP) do teor proteico do alimento larval em porcentagem de peso seco nas colônias de Melipona scutellaris
(Apidae, Meliponini) estudadas.
X
COLONIA Abril Maio Junho Julho Agosto Setembro Outubro Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro Março
B 7,80 ± 4,32 12,31 ± 2,05 13,13 ± 1,18 25,02 ± 2,15 3,84 ± 2,27 3,86 ± 1,59 6,90 ± 1,85 7,54 ± 1,52 10,93 ± 2,02 8,97 ± 1,84 - -
C 14,16 ± 4,63 7,99 ± 2,72 15,23 ± 1,83 29,05 ± 7,30 - - - - - - - -
D 8,30 ± 1,86 7,61 ±3,11 - 29,61 ± 0,62 7,01 ± 2,48 - - - - - - -
E 5,92 ± 1,86 3,69 ± 2,64 - 6,91 ± 3,63 - - 6,11 ± 3,24 - - - - -
F 5,80 ± 1,76 8,53 ± 0,86 15,85 ± 1,51 6,45 ± 2,84 5,10 ± 2,50 - - - - - - 3,68 ± 1,77
G - - - - - - 8,47 ± 3,12 10,20 ± 1,76 6,08 ± 2,15 - 5,97 ± 1,14 -
H - - - - - - - - 7,37 ± 1,78 - - -
I - - - - - - - - 9,36 ± 1,04 5,93 ± 1,27 - -
J - - - - - - - - - 5,06 ± 0,49 - -
K - - - - - - - - - - 5,33 ± 0,53 -
L - - - - - - - - - - 4,88 ± 1,45 6,42 ± 2,00
M - - - - - - - - - - 4,05 ± 1,52
36
Resultados
Resultados
Os resultados mostraram que os níveis de teor proteico encontrado nas
amostras das colônias C e D se assemelham entre si e diferem de todas as outras
colônias, enquanto a maioria delas (B, E, F, G, H, I, J, K, L, M) apresentam
semelhanças significativas entre si, podendo ser consideradas como um grande
grupo representativo. Os níveis de teor proteico da colônia C, apresentou diferença
significativa entre todas as demais, exceto D (Figura 10 e tabela 4). Embora não se
possa afirmar se esta diferença realmente ocorra devido à falha na amostragem
decorrente da variação no número de colônias utilizadas em cada mês, pois
algumas delas foram perdidas durante o processo, possivelmente devido à intensa
manipulação, aliada às condições ambientais (baixa temperatura ambiente e
umidade relativa do ar) e escassez de recursos, características desse período do
ano.
Figura 10- Variação do teor proteico do alimento larval entre as colônias de M. scutellaris.
Mediana
25%-75%
Variância
OutliersB C D E F G H I J K L M
Colônias
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Te
or
Pro
teic
o (
%)
37 Resultados
Resultados
Tabela 4- Níveis de significância da comparação da proporção do teor proteico (em %) do
alimento larval entre as diferentes colônias estudadas.
Col B C D E F G H I J K L M
B
C 0,000018
D 0,187109 0,377512
E 0,262071 0,000018 0,000605
F 0,106046 0,000018 0,000053 1,000000
G 0,616167 0,000018 0,002519 0,999972 1,000000
H 0,972840 0,001131 0,208334 1,000000 1,000000 1,000000
I 0,894749 0,000022 0,036580 0,999997 1,000000 1,000000 1,000000
J 0,329428 0,000022 0,007063 0,999765 0,995448 0,985353 0,999393 0,993959
K 0,419233 0,000026 0,011377 0,999957 0,998592 0,994006 0,999815 0,997692 1,000000
L 0,107683 0,000018 0,000291 0,999964 0,996449 0,985340 0,999860 0,996319 1,000000 1,000000
M 0,099946 0,000018 0,000975 0,984616 0,914574 0,856436 0,985019 0,923903 1,000000 0,999998 0,999929
O gráfico oriundo da comparação do teor proteico entre os meses (Figura 11
e tabela 5) revela diferença estatística no teor proteico do alimento larval quando
analisado independente das colônias, apresentando uma flutuação ao longo do ano,
com uma acentuada elevação nos meses de junho e julho. Após o aumento
expressivo registrado no mês de julho, foi verificado um novo declínio nos valores
proteicos (agosto e setembro) seguido de uma pequena elevação nos meses
seguintes (outubro, novembro e dezembro) e nova queda nos meses de janeiro,
fevereiro e março.
38 Resultados
Resultados
Figura 11- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris ao longo dos meses.
Tabela 5- Níveis de significância da variação do teor proteico (em %) entre os meses do ano.
Meses Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar
Abr
mai 0,999963
Jun 0,000024 0,000018
Jul 0,000018 0,000018 0,001506
Ago 0,127731 0,424774 0,000018 0,000018
Set 0,175872 0,383783 0,000018 0,000018 0,999695
Out 0,976812 0,999842 0,000018 0,000018 0,954035 0,801356
Nov 1,000000 0,999964 0,002364 0,000018 0,343679 0,268390 0,989155
Dez 1,000000 1,000000 0,000025 0,000018 0,272219 0,269081 0,996022 1,000000
Jan 0,837317 0,989126 0,000018 0,000018 0,996520 0,926757 1,000000 0,924798 0,943418
Fev 0,152204 0,473915 0,000018 0,000018 1,000000 0,999493 0,966498 0,379822 0,310780 0,997977
Mar 0,026794 0,141770 0,000018 0,000018 0,999999 0,999999 0,749269 0,136063 0,079006 0,935978 0,999996
Mediana
25%-75%
Variância
Outliers
abril
maio
junho
julho
agosto
setembro
outubro
nov embro
dezembro
janeiro
f ev ereiro
março
Meses
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Te
or
Pro
teic
o (
%)
39 Resultados
Resultados
Os dados indicam que os meses de abril, maio, outubro, novembro, dezembro
e janeiro não apresentaram diferença estatística quanto ao teor proteico do alimento
larval mantendo valor mediano entre 5% e 10% do peso seco. Os meses de junho e
julho apresentam diferença significativa entre eles e todos os demais em relação ao
teor proteico do alimento larval. Somente os meses de setembro e março
apresentaram valores de mediana abaixo de 5%, entretanto também não
apresentam diferença significativa com todos os demais (figura 11 e tabela 5).
A comparação entre as colônias considerando suas condições (fraca, média e
forte) não mostrou diferenças significativas, indicando que a variação do teor
proteico independe da condição da colônia utilizada (Kruskal-Wallis = H; p>0,05)
(figura 12).
Figura 12- Relação entre o teor proteico do alimento larval e as condições das colônias.
Mediana
25%-75%
Variância
Outliersboa f orte f raca
Condições das Colônias
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Te
or
Pro
teic
o (
%)
média
40 Resultados
Resultados
2- Análise Polínica
Através da análise dos grãos de pólen presentes nas 81 amostras de alimento
larval, foram identificadas 75 diferentes espécies de plantas das quais 40 com valor
proteico conhecido (Paulino-Neto, 2010; 2012a; 2012b; submetido). Alguns desses
grãos de pólen estão apresentados na figura 13.
Figura 13- Grãos de pólen encontrados nas primeiras lâminas analisadas. (A) Handroanthus
vellosoi; (B) Anadenanthera peregrina; (C) Eucalyptus moluccana; (D) Poincianella pluviosa
e (E) Caesalpinia pulcherrima.
Os valores de teor proteico variaram de 37,7% do peso seco do pólen em
Eucalyptus citriodora, que ocorreu apenas oito vezes nas 81 amostras, a 3,88% em
Cecropia pachystachya que ocorreu três vezes em todo o período estudado.
Caesalpinia pulcherrima, presente em todas as amostras, mostrou valor
proteico de 10,96% enquanto Brunfelsia uniflora e Handroanthus heptaphyllus que
Fo
tos:
Lucas M
ath
eus d
a R
ocha
41 Resultados
Resultados
ocorreram em apenas uma amostra revelaram valores proteicos de 12,84% e
11,92%, todas elas com valores abaixo do valor médio de 16,35%.
Diferente do esperado, as análises de regressão não mostraram uma relação
significativa entre o valor proteico dos tipos polínicos com sua ocorrência no
alimento larval ao longo dos meses. Várias plantas se repetem nas diferentes
amostras, independente de seu valor proteico e com porcentagens de ocorrência
variadas, o que pode ser observado a seguir (figuras 14 e 15; tabela 6).
42 Resultados
Valores proteicos: (Paulino‐Neto et al, 2010; 2012a; 2012b; submetido) Figura 14- Ocorrência dos diferentes tipos polínicos nas amostras de alimento larval ao longo do ano. As cores mais intensas indicam maior ocorrência do pólen nas amostras mensais.
43 Resultados
Resultados
Figura 15- Relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e sua ocorrência ao longo dos
meses (R2 = 0,0658).
Tabela 6- Resultados da regressão linear mostrando a relação entre o valor proteico e a
ocorrência dos tipos polínicos.
Soma dos Quadrados
Graus de Liberdade
Quadrado da Media
F P
Intercepto 4326,02 1 4326,021 35,50960 0,000000
Ocorrência 1837,69 11 167,063 1,37131 0,194001
Valor Proteico 1635,47 1 1635,475 13,42459 0,000361
Ocorrência vs Valor Proteico 1539,24 11 139,931 1,14861 0,329556
Erro 15715,66 129 121,827
Embora os grãos de pólen sejam parte constituinte do alimento larval, não
houve correspondência em relação sua ocorrência e a variação de seus respectivos
valores proteicos. Pode-se notar na figura 16 que o valor proteico dos tipos
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Ocorrência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
40P
rote
ína
Ocorrência (%):Proteína: y = 17,8574 - 0,1535*x; r2 = 0,0658
Va
lor
pro
teic
o d
o p
óle
n
44 Resultados
Resultados
polínicos não apresentou grande variação (correspondendo entre 10% e 20% do
peso seco), enquanto nas amostras de alimento larval este valor apresentou uma
variação elevada (de 0,3% a 35% aproximadamente).
Figura 16- Comparação entre os valores proteicos do alimento larval (vermelho) e dos
valores proteicos dos tipos polínicos das espécies de plantas utilizadas (verde).
A análise não mostrou correlação significativa entre os valores proteicos dos
tipos polínicos e do alimento larval (P = 0,861), apresentando coeficiente de
correlação (r) de - 0,0198 (figura 17).
Amostras
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Va
lor
pro
teic
o (
%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Alimento larval
Tipos polínicos
45 Resultados
Resultados
Figura 17- Correlação entre os valores proteicos do alimento larval e os valores proteicos
dos tipos polínicos das espécies vegetais.
3- Análise das glândulas salivares e hipofaringeas
As análises histoquímicas realizadas indicaram alta atividade metabólica nas
células das glândulas hipofaríngeas. Essa atividade é evidenciada pelo grande
núcleo celular e acumulo de proteínas junto à membrana nuclear. Apesar do alto
metabolismo em uma das glândulas, a coloração clara das células mostra ausência
de secreção proteica pelas glândulas analisadas. A pequena quantidade de proteína
presente nas células, que aparece em forma de grânulos mais escuros, é típica do
metabolismo basal das células (Figuras 18 e 19). Embora este método apresente
Valor proteico do alimento larval (%)
0 5 10 15 20 25 30 35
Va
lor
pro
teic
o d
os
tip
os
po
lín
ico
s (
%)
10
12
14
16
18
20
22
46 Resultados
Resultados
alto grau de confiabilidade, seriam necessários outros métodos de análise para
confirmação dos resultados.
Figura 18- Análise histoquímica de glândula salivar de Melipona scutellaris (imagem em
aumento de 400x).
47 Resultados
Resultados
Figura 19- Análise histoquímica de glândula hipofaríngea de Melipona scutellaris
(imagem em aumento de 400x).
4- Teste de desenvolvimento in vitro
Os experimentos foram realizados inicialmente através da transferência de
ovos, que vieram a tombar impedindo que eclodissem. Portanto este teste (T1) não
produziu resultados. Em uma segunda tentativa (T2), foram transferidas larvas
recém-eclodidas, o que resultou em taxas de sobrevivência satisfatórias, com valor
médio alcançando 68,75%. Apesar dos primeiros testes (T2, T3 e T4) terem
apresentado um bom índice de sobrevivência, alcançando 68,75%, 84,44% e
21,67% respectivamente, por não apresentarem o desenvolvimento de rainhas em
nenhum dos tratamentos, nem mesmo no controle, a partir do teste seguinte (T5)
foram adicionados quatro novos tratamentos com volumes de 150µl e 180µl,
48 Resultados
Resultados
seguindo o mesmo padrão dos anteriores e que foram mantidos nas demais
repetições como pode ser observado na tabela 7 a seguir. Portanto, somente os
resultados de T5 e dos testes subsequentes foram considerados para as análises de
dados.
Embora nenhuma rainha tenha sido produzida em T5, os mesmos
tratamentos foram mantidos para os testes seguintes para que houvesse uma
padronização. Em T6 foram produzidas as primeiras 6 rainhas em dois tratamentos
cujos volumes eram de 150µl (3 rainhas) (figura 20) e 180µl (3 rainhas) ambos com
suplementação proteica.
Figura 20- Pupas de operárias e rainhas em desenvolvimento após 36 dias (as setas
indicam as rainhas). Teste 6, tratamento com 150µl de alimento com suplementação
proteica.
49 Resultados
Resultados
Em T7 foram produzidas um total de 8 rainhas em quatro tratamentos. Nos
tratamentos com volume de 120µl com suplementação proteica (2), 150µl com
suplementação (3), 180µl com suplementação (2) e 180µl controle (1). Em T8 não
houve rainha novamente, entretanto foram produzidos 13 machos, distribuídos por
todos os tratamentos exceto em 120µl controle. Em T9 foi produzida somente uma
rainha no tratamento com 120µl com suplementação proteica. Em T10 e T11 não
surgiram rainhas.
Machos vieram a ocorrer somente em T8, representando 19,4% do total de
sobreviventes com 13 machos para 67 sobreviventes, conforme demonstrado na
tabela 7.
50
Resultados
Tabela 7- Resultados obtidos nos diferentes tratamentos utilizados nos testes de desenvolvimento in vitro.
TRATAMENTOS Nº
AMOSTRAL SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) MACHOS SOBREVIVÊNCIA (%) % R
T1 - 19/03/2014 (TOTAL) 30 - - - - - -
120 Controle (água 16ul) 15 - - - - - -
120 Albumina (16ul) 15 - - - - - -
T2 - 23/04/2014 (TOTAL) 32 22 - 22 - 68,75 -
120 Controle (água 16ul) 10 9 - 6 - 90 -
120 Albumina (16ul) 10 7 - 7 - 70 -
120 Controle 2 (água 16ul) 6 6 - 9 - 100 -
120 Albumina 2 (16ul) 6 - - 0 - - -
T3 - 08/05/2014 (TOTAL) 45 38 - 38 - 84,44 -
120 Controle (água 16ul) 15 13 - 13 - 86,67 -
120 albumina (16ul) 15 13 - 13 - 86,67 -
120 albumina 2x (32ul) 15 12 - 12 - 80,00 -
T4 -17/06/2014 (TOTAL) 60 13 - 13 - 21,67 -
120 Controle (água) 15 2 - 2 - 13,33 -
120 albumina (16ul) 15 4 - 4 - 26,67 -
120 albumina 2x (32ul) 15 2 - 2 - 13,33 -
120 albumina 4x (64ul) 15 5 - 5 - 33,33 -
T5 -15/08/2014 (TOTAL) 90 64 - 64 - 71,11 -
120 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -
120 albumina 16ul 15 13 - 13 - 86,67 -
150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -
51
Resultados
TRATAMENTOS Nº
AMOSTRAL SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) MACHOS SOBREVIVÊNCIA (%) % R
150 albumina 16ul 15 10 - 10 - 66,67 -
180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
180 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -
T6 -19/09/2014 (TOTAL) 90 63 6 57 - 70,00 9,52
120 controle (puro) 15 11 - 11 - 73,33 -
120 albumina 16ul 15 14 - 14 - 93,33 -
150 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
150 albumina 16ul 15 10 3 7 - 66,67 30
180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
180 albumina 16ul 15 6 3 3 - 40,00 50
T7 -10/10/2014 (TOTAL) 105 71 8 63 - 67,62 11,27
120 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
120 albumina 16ul 15 11 2 9 - 73,33 18,18
150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -
150 albumina 16ul 15 13 3 10 - 86,67 23,08
180 controle (puro) 15 8 1 7 - 53,33 12,50
180 albumina 16ul 15 8 2 6 - 53,33 25,00
T8 -28/11/2014 (TOTAL) 105 67 - 54 13 63,81 -
120 controle (puro) 15 11 - 11 0 73,33 -
120 albumina 16ul 15 10 - 9 1 66,67 -
150 controle (puro) 15 10 - 7 3 66,67 -
150 albumina 16ul 5 11 - 9 2 73,33 -
180 controle (puro) 15 9 - 5 4 60,00 -
52
Resultados
TRATAMENTOS Nº
AMOSTRAL SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) MACHOS SOBREVIVÊNCIA (%) % R
180 albumina 16ul 15 9 - 7 2 60,00 -
T9 - 16/12/2014 (TOTAL) 105 90 1 89 - 85,71 1,11
120 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -
120 albumina 16ul 15 14 1 13 - 93,33 7,14
150 controle (puro) 15 14 - 14 - 93,33 -
150 albumina 16ul 15 13 - 13 - 86,67 -
180 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -
180 albumina 16ul 15 10 - 10 - 66,67 -
T10 - 28/01/2015 (TOTAL) 105 68 - 68 - 64,76 -
120 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -
120 albumina 16ul 15 11 - 11 - 73,33 -
150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -
150 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -
180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
180 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -
T11 - 11/02/2015 (TOTAL) 105 50 - 50 - 47,62 -
120 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -
120 albumina 16ul 15 8 - 8 - 53,33 -
150 controle (puro) 15 8 - 8 - 53,33 -
150 albumina 16ul 15 6 - 6 - 40,00 -
180 controle (puro) 15 5 - 5 - 33,33 -
180 albumina 16ul 15 7 - 7 - 46,67 -
53
Resultados
Resultados
Foi transferido um total de 630 larvas, das quais 421 sobreviveram
resultando em 15 rainhas, 394 operárias e 13 machos. Em termos percentuais,
foi obtida uma taxa de 66,83% de sobrevivência, cujo rateio representa 3,56%
de rainhas, 93,59% de operárias e 2,85% de machos (figura 21).
Figura 21- Variação de sexo e castas entre os indivíduos sobreviventes em cada
tratamento.
Considerando-se somente as Rainhas e Operárias, a partir das mesmas
630 larvas transferidas foram obtidas 64,92% de sobreviventes, das quais
3,67% rainhas e 96,33% operárias, distribuídas em diferentes tratamentos de
apenas três testes, referentes aos meses de setembro, outubro e dezembro,
conforme demonstrado na tabela 8 e figura 22, a seguir.
82%
84%
86%
88%
90%
92%
94%
96%
98%
100%
Controle Albumina Controle Albumina Controle Albumina
120µl 150µl 180µl
Operária Rainha Macho
54
Resultados
Tabela 8- Testes que apresentaram rainhas e suas respectivas porcentagens em relação às operarias (*).
(*) Considerando os indivíduos sobreviventes, excluindo os machos.
TRATAMENTOS SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) % SOBREVIVÊNCIA % Rainha % Operária
T6 -19/09/2014 (TOTAL) 60 6 54 66,67 10,00 90,00
150 albumina 16ul 10 3 7 66,67 30 70,00
180 albumina 16ul 7 3 4 46,67 42,86 57,14
T7 -10/10/2014 (TOTAL) 71 8 63 67,62 11,27 88,73
120 albumina 16ul 11 2 9 73,33 18,18 81,82
150 albumina 16ul 13 3 10 86,67 23,08 76,92
180 controle (puro) 8 1 7 53,33 12,50 87,50
180 albumina 16ul 8 2 6 53,33 25,00 75,00
T9 - 16/12/2014 (TOTAL) 90 1 89 85,71 1,11 98,89
120 albumina 16ul 14 1 13 93,33 7,14 92,86
55
Resultados
Resultados
Figura 22- Ocorrência de Rainhas nos diferentes testes ao longo dos meses.
A análise comparativa por volume de alimento considerando os
tratamentos controle e com suplementação, mostraram que a produção de
rainhas em volumes de 150µl foi significativamente maior nos tratamentos com
suplementação proteica (p=0,0016). Em volumes 180µl a ocorrência de rainhas
nos tratamentos com suplementação proteica também apresentou significância
positiva (p=0,02). Em volumes de 120µl a produção de rainhas nos tratamentos
com suplementação não foi significativa, embora tenha apresentado índice
próximo ao limite (p=0,06) (figura 23).
64
54
63
54
89
68
50
0
6
8
0
1
0
0
T5 ago
T6 set
T7 out
T8 nov
T9 dez
T10 jan
T11 fev
Rainha Operária
56 Resultados
Resultados
Figura 23- Ocorrência de rainhas nos diferentes tratamentos. Indices de significância
entre os tratamentos controle e com suplementação proteica em diferentes volumes de
alimento.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 120 ul
Operárias
Rainhas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 150 ul
Operárias
Rainhas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 180 ul
Operárias
Rainhas
Tratamento Rainhas Operárias
Controle 0 100
Suplementação 3,75 96,25
Fisher exact P=0.06
Tratamento Rainhas Operárias
Controle 0 100
Suplementação 8,57 91,43
Fisher exact p=0.0016
Tratamento Rainhas Operárias
Controle 1,72 98,28
Suplementação 8,77 91,23
Fisher exact p=0.02
120µl
180µl
150µl
Controle Suplementação
Controle Suplementação
Controle Suplementação
Discussão
58 Discussão
1- Teor proteico do alimento larval
O alimento larval dos Meliponineos é constituído por grande quantidade de
pólen. Em Melipona marginata este componente alcança 50% do volume do
alimento larval como verificado por Rensi (2006). Em Melipona scutellaris 31%
(Menezes et al. 2010) e em Scaptotrigona depilis 16,7% (Menezes 2010).
No presente estudo, a análise do teor proteico do alimento larval apresentou
uma variação perceptível ao longo dos meses, variações entre as colônias em cada
mês, e entre as amostras de uma mesma colônia. Considerando o pólen como
principal fonte proteica do alimento larval, estes dados foram previamente
confirmados por Rensi (2006), que constatou em Melipona marginata, haver
variação significativa no volume e na proporção de pólen do alimento larval em duas
colônias estudadas. Na presente análise os dados das colônias puderam ser
agrupados e comparados de forma aleatória mês a mês, pois os resultados não
parecem ser influenciados pela colônia utilizada. Isto pode ser demonstrado pois nos
meses de abril, maio e julho, os únicos meses em que foram utilizadas as mesmas
colônias (B, C, D, E e F) para a coleta das amostras, houve uma disparidade entre
os valores proteicos registrados. Nos meses de abril e maio, o teor proteico foi
similar na maioria das colônias, apresentando valores entre 5% e 10%, enquanto no
mês de julho (período seco e inverno) ocorreu uma elevação considerável,
registrando-se a maioria dos valores proteicos em torno de 25% e os valores
máximos atingindo aproximadamente os 33%. Já nos meses de abril, maio, outubro,
novembro, dezembro e janeiro não foi observada uma diferença significativa entre os
valores proteicos analisados. Nas colônias estudadas por Rensi (2006) a proporção
de pólen encontrada no alimento larval foi maior no inverno, o que poderia explicar o
59 Discussão
aumento dos valores proteicos registrado nos meses de junho e principalmente de
julho.
A análise dos dados, considerando as condições das colônias, reforçam a
afirmação de que a variação do teor proteico independe da condição da colônia,
tendo em vista que tenham sido utilizadas preferencialmente colônias fortes e
médias no presente estudo. Entretanto não houve diferença significativa entre os
valores proteicos encontrados e as condições internas das colônias. Ao analisar em
pares colônias fortes, médias e fracas de Schwarziana quadripunctata, Castilho-
Hyodo (2001) encontrou diferenças significativas somente entre fortes e fracas e
entre médias e fracas, sugerindo que a distinção entre as colônias fortes e médias
não seja tão clara como para as fracas. Entretanto, Cremonez et al. (1998) afirma
que em Apis mellifera baixos teores de proteína na hemolinfa dos adultos podem
comprometer a manutenção e o crescimento da colônia. Brodschneider & Crailsheim
(2010) acrescentam que as larvas são extremamente dependentes da proteína
presente no alimento larval e uma baixa quantidade de proteína pode levar a colônia
ao enfraquecimento. Para Vollet-Neto e colaboradores (2010) as larvas de
meliponíneos se alimentam de uma grande quantidade de pólen, cujo teor proteico
afeta tanto indivíduos adultos como imaturos. O fato de termos utilizado colônias
fracas em poucas ocasiões poderia explicar o fato da variação proteica não estar
relacionada às condições das colônias. Portanto apesar do forte desbalanceamento
entre o número de colônias amostradas em cada mês, a variação na escolha destas,
permitiu um resultado confiável. A variação significativa encontrada quanto ao teor
proteico do alimento larval analisado é corroborada pelas afirmações de Velthuis &
Sommeijer (1991) de que não se espera encontrar em nenhuma espécie, os
componentes do alimento larval nas mesmas proporções em cada célula de cria.
60 Discussão
Menezes e colaboradores (2007) também verificaram uma variação tanto na
concentração quanto no perfil proteico, ao analisar a camada superior do alimento
larval de diferentes alvéolos de cria em M. scutellaris. Estudos realizados por
Castilho-Hyodo (2001) em seis colônias de S. quadripunctata revelaram que além de
diferenças significativas na concentração de proteínas entre as colônias, há também
uma grande variação sazonal no teor proteico do alimento larval. Hartfelder & Engels
(1989) encontraram uma especificidade entre a composição proteica do alimento
larval e as diferentes espécies de abelhas sem ferrão. Entretanto, provavelmente a
composição de aminoácidos do alimento larval não seja controlada pelas abelhas
nutridoras, já que o néctar e pólen presentes no alimento contribuem para o conjunto
de aminoácidos (Weaven & Kuiken, 1951; Hartfelder & Engels, 1989). Desta maneira
estes aminoácidos específicos a cada espécie podem ser resultantes de diferentes
estratégias de forrageio ou de preferências de recursos polínicos para cada espécie
de abelhas (Johnson & Hubbell, 1974; Imperatriz-Fonseca et aI. 1984).
2- Análise Polínica
Nas abelhas sem ferrão, as operárias forrageiras saem à procura de flores
para coletar pólen e néctar que serão utilizados como recurso alimentar na colônia
(Kerr et al. 1996). O pólen representa a única fonte natural de proteína em Apis
(Brodschneider & Crailsheim, 2010) e nos Meliponini representa o recurso principal,
representando a maior fonte de nitrogênio para a maioria das espécies de abelhas
(Roulston et al. 2000).
As análises polínicas realizadas no alimento larval de Melipona scutellaris
indicaram 75 diferentes tipos polínicos, com ocorrência variável ao longo do ano não
demonstrando correlação significativa com seu valor proteico. Alguns autores
61 Discussão
afirmam a capacidade de “escolha” das abelhas por tipos polínicos mais nutritivos,
mais próximos das colônias, ou por questões espaço-temporais como verificado por
Faria et al. (2012) em Scaptotrigona aff. depilis que concentram-se suas coletas em
um grupo limitado de plantas quando muitos recursos estão disponíveis e exploram
fontes mais variadas em períodos de menor disponibilidade.
Outros autores afirmam que a coleta esteja relacionada simplesmente com a
disponibilidade do pólen oferecido pelas espécies vegetais (Roubik 1982; Bismeijer
et al. 1999). Por não ter encontrado diferenças qualitativas na composição de
aminoácidos do pólen nas diferentes estações do ano, Negrão (2014) considera a
presença do pólen das mesmas três famílias botânicas em todas as estações do
ano, um indício de que as abelhas concentram a coleta de recursos de acordo com a
disponibilidade das plantas nas estações.
Entretanto, deve-se notar o fato de que o pólen coletado é armazenado na
colônia em potes, aos quais são adicionadas substâncias glandulares regurgitadas
pelas operárias para que ocorra a fermentação do mesmo antes de sua utilização
(Kerr et al. 1996). Portanto a presença dos tipos polínicos em determinados períodos
pode não estar diretamente relacionada com a fenologia do referido período.
Neste estudo foi verificado que o mês de julho apresentou os mais altos
índices proteicos no alimento larval e a maior diversidade de tipos polínicos. Como
estas variáveis não apresentaram correlação entre si, este resultado pode ser um
indício de que neste mês a quantidade de pólen (proporção em relação aos outros
componentes) no alimento tenha sido maior. Deve-se considerar também a
possibilidade de haver um desvio nos resultados no que se refere ao teor proteico do
pólen a cada mês, devido a ausência deste dado para algumas espécies vegetais,
62 Discussão
pois estudos realizados por Negrão (2014) mostraram um maior teor proteico total
no pólen no período do inverno.
De acordo com Velthuis & Sommeijer (1991), ao transportar alimento (polén e
mel) às células de cria, o pólen pode passar do papo para o ventrículo da operária,
onde ocorre sua degradação. A proteína atinge a hemolinfa e pode ser transportada
para as glândulas hipofaríngeas onde a secreção proteinácea que compõe o terceiro
componente do alimento larval é produzida. As funções desta secreção não são
completamente conhecidas; sabe-se que possui valor nutritivo em Apis além de
propriedades nutritivas e enzimáticas em Meliponini. Portanto, embora as análises
das glândulas hipofaríngeas não tenham indicado armazenamento de proteínas,
outra questão a ser considerada seria a possibilidade de que esta secreção
contenha proteína proveniente de outras fontes e não somente do pólen.
3- Teste de desenvolvimento in vitro
Um século de pesquisa não foi suficiente para elucidar os mecanismos que
desencadeiam o desenvolvimento de rainhas no gênero Melipona. Com o intuito de
acrescentar novas informações à esta discussão, foram realizados bioensaios
envolvendo aspectos quantitativos e qualitativos da composição nutricional do
alimento das larvas de Melipona scutellaris, no que se refere ao seu valor proteico.
No segundo teste (T2), foram transferidas larvas recém-eclodidas. Com um
índice de sobrevivência de 68,75%, os resultados do referido teste foram
considerados satisfatórios quando comparados aos 51,04% alcançados por
Menezes (2006) nas mesmas condições. Portanto todos os testes subsequentes
passaram a ser realizados através da transferência de larvas recém-eclodidas.
63 Discussão
Os primeiros testes (T2, T3 e T4) apresentaram índices de sobrevivência de
68,75%, 84,44% e 21,67% respectivamente, entretanto não resultaram no
desenvolvimento de rainhas em nenhum dos tratamentos, nem mesmo no controle.
Considerando a possibilidade do volume de alimento larval utilizado (120µl) estar
agindo como fator limitante para o desenvolvimento de rainhas, conforme proposto
por Maciel-Silva & Kerr (1991) assim como por (Engels & Imperatriz-Fonseca, 1990;
e por Velthuis & Sommeijer, 1991) que afirmaram existir um limite na quantidade de
alimento, abaixo do qual todos os indivíduos se desenvolvem em operárias, a partir
do quinto teste (T5) foram adicionados tratamentos com maior volume de alimento
(150µl e 180µl). O maior volume, entretanto não excedeu volume máximo
encontrado para a espécie, para não ocasionar a morte das larvas como constatado
por Menezes (2006) em tratamentos com 240µl de alimento. Em T5 embora 71,11%
das larvas tenham se desenvolvido até a idade adulta, não houve produção de
rainhas em nenhum dos tratamentos, entretanto em testes posteriores surgiram
rainhas em dois tratamentos com 120µl (T7 e T9), colocando em dúvida a questão
da quantidade de alimento como fator limitante.
Em T6 surgiram as primeiras rainhas, que continuaram a ser produzidas nos
testes seguintes. Diferentemente de Menezes (2006), que obteve uma porcentagem
maior de rainhas no grupo controle em relação ao grupo com alimento rico em pólen
(supostamente mais proteico), foram encontradas rainhas com maior frequência e
em maior porcentagem nos tratamentos com suplementação proteica, entretanto
não foi possível determinar os teores de proteína, pois as amostras foram perdidas
em um incidente ocorrido na estufa onde eram mantidas para desidratação.
Seguindo a hipótese de Kerr (1946,1948) a diferenciação de castas em
Melipona ocorre por meio de uma combinação entre mecanismos genéticos e
64 Discussão
alimentares, e ainda segundo Kerr (1966) fatores externos, que incluem a
quantidade de alimento poderia interferir nesta diferenciação, Embora Sakagami
(1982) afirme que todas as larvas de Melipona recebam alimento em quantidades
semelhantes e Hartfelder & Engels (1989) não terem detectado variações
relacionadas a determinação de castas nas análises realizadas em alimento larval
de Melipona, até o momento das 15 rainhas produzidas 14 delas se desenvolveram
em tratamentos com suplementação proteica e 12 em tratamentos com volume igual
ou superior a 150µl de alimento larval.
Kerr (1948) observou uma variação na porcentagem de rainhas na colônia em
dois períodos distintos. Um período considerado normal, que compreende os meses
de setembro a abril, quando a colônia apresenta o máximo de atividade devido às
condições ambientais e apresenta alta produção de rainhas, e o período de inverno,
de maio a agosto, quando a porcentagem de rainhas é menor. Os resultados destes
estudos estão próximos das segregações mendelianas (7:1 e 3:1), correspondendo
aos valores teóricos propostos por Kerr (1950).
Embora a porcentagem de rainhas obtidas através destes bioensaios (3,67%
de rainhas para 96,33% de operárias) tenha ficado muito aquém dos valores
propostos pelo autor, os meses em que elas ocorreram (setembro, outubro e
dezembro) coincidem com o período considerado de alta produção.
Apesar de alguns autores terem descrito uma flutuação nas taxas de
produção de rainhas, a sua continuidade ao longo do ano é um fato comum em
colônias do gênero Melipona, conforme observado por Moo-Valle et al. (2001);
Sommeijer et al. (2003); Van Veen et al. (2004); Morais et al. (2006); Alves (2010).
Este fato não foi observado nestes estudos, possivelmente em função do pequeno
número amostral.
65 Discussão
Durante os testes realizados, foi observado que as rainhas de Melipona
scutellaris se desenvolvem mais precocemente se comparadas às operárias e
machos. Em geral as rainhas atingiram o estágio final de desenvolvimento (desde a
transferência até a emergência) em torno de 2 a 3 dias antes das operárias, que se
desenvolvem em aproximadamente 57 dias (embora tenham sido registrados
períodos de 51 a 61 dias para o desenvolvimento total destas). Estudos realizados
por Kerr et al. (1996) mostraram que em Melipona compressipes fasciculata o ciclo
de desenvolvimento completa-se em aproximadamente 45 dias para a operária e 40
dias para a rainha, em Melipona quadrifasciata dura em média 39,5 dias para
operária, 36,8 para rainha e 39,8 dias para machos, e em Melipona rufiventris 42
dias para operária, 39,4 dias para rainha e 45,5 dias para machos. Segundo o autor,
o desenvolvimento total é influenciado pela temperatura e pela quantidade de
operárias na colônia. Estes dados corroboram a afirmação de Cruz-Landim (2004),
de que além da duração do estágio pupal ser variável entre as diferentes espécies,
nas abelhas eussociais existem diferenças no tempo de desenvolvimento entre os
sexos e as castas.
Segundo Velthuis et al. (2003) e Cruz-Landim (2004), para atingir os
diferentes tamanhos encontrados nos adultos de algumas espécies do gênero
Melipona, as larvas ingerem diferentes quantidades de alimento contido nas células
de cria. Entretanto a metamorfose não ocorre em resposta à quantidade de alimento
ingerida, mas a um mecanismo temporal que regula o período em que ocorrem as
mudas, comum às várias espécies. Isto provavelmente explicaria o resultado obtido
nestes testes, nos quais as larvas que receberam maior quantidade de alimento (180
µl) foram maiores, mas os adultos originados apresentaram tamanho semelhante e
66 Discussão
se desenvolveram no mesmo período de tempo que os dos tratamentos com
quantidade menor de alimento.
A produção de machos ocorreu somente nos dois últimos testes, e de acordo
com Bego (1990, 1998) e demais autores como Roubik (1982), Van Veen et al.
(1992), Koedam (1999), Moo-Valle et al. (2001), Sommeijer et al. (2003), Tóth et al.
(2004), Velthuis et al. (2005), Morais et al. (2006), Alves & Imperatriz-Fonseca
(2010), sua compreensão necessita de observações a longo prazo e depende da
correlação entre uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos à colônia, que não
foram averiguados neste estudo, como variações climáticas, estoque de alimento,
condições gerais da colônia e recente substituição da rainha.
Conclusões
68 Conclusões
As análises mostraram uma diferença significativa no valor proteico do alimento
larval entre as colônias estudadas, que apresentou variação mensal relativamente
uniforme quando avaliado independentemente da colônia. Exceto no mês de julho,
quando o alimento larval apresentou teor altamente proteico em todas as colônias
estudadas. Entretanto, a hipótese de que a disponibilidade de recursos florais
representasse fator determinante para esta variação não foi confirmada, tendo em
vista não haver correlação positiva entre os teores proteicos do alimento larval e os
teores proteicos dos tipos polínicos encontrados nas amostras.
Apesar de terem sido identificadas 75 espécies vegetais, não houve uma
relação significativa entre o valor proteico dos tipos polínicos contidos no alimento
larval com sua ocorrência ao longo dos meses, sugerindo que Melipona scutellaris
seja uma espécie generalista.
A possibilidade de haver armazenamento de proteínas nas glândulas salivares
e hipofaríngeas não foi confirmada. No entanto, não se pode descartar definitivamente
se os fatores que regulam a concentração proteica do alimento larval são
determinados pelas operárias.
Os bioensaios apresentaram índice de 64,82% de sobrevivência considerando
somente rainhas e operárias. Destes, somente 3,67% rainhas, produzidas nos meses
de setembro, outubro e dezembro, considerados meses de maior atividade das
colônias.
69 Conclusões
Houve produção de rainhas em todos os volumes de alimento utilizados (120µl,
150µl e 180µl), embora em 120µl tenha ocorrido somente em tratamentos com
suplementação proteica. Portanto para este teste a quantidade de alimento não
parece ter sido fator limitante. Contudo, a produção de rainhas foi significativamente
maior nos tratamentos com suplementação proteica.
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