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Glicerol de biodieselEstratégias biotecnológicas para o aproveitamento do glicerol gerado da produção de biodiesel

Juan Daniel Rivaldi*Engenheiro Químico, Mestre emBiotecnologia IndustrialEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de SãoPaulo(USP)*Autor para correspondência:danielrivaldi@gmail.com

Boutros Fouad SarrouhLicenciado em Química;Mestre em Análise de Processos naIndústria Química;Doutor em BiotecnologiaIndustrialEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de São Paulo(USP)

Rodolfo FioriloEngenheiro QuímicoGerente Industrial � DAFFERQuímica Ltda.

Silvio Silvério da SilvaEngenheiro de Alimentos;Mestre em Ciência e Tecnologia deAlimentos;Doutor em TecnologiaBioquímico- FarmacêuticoEscola de Engenharia de Lorena(EEL), Universidade de São Paulo(USP)

RESUMO

A intensiva busca por fontes alternativas de ener-gia e processos sustentáveis visando a reduçãoda poluição ambiental e o aquecimento globaldo planeta tem estimulado o mercado mundialde combustíveis limpos. Os biocombustíveis,como o biodiesel, representam uma alternativarenovável e ambientalmente segura aos com-bustíveis fósseis. Sua produção encontra-se emcrescimento acelerado, e como conseqüência,a quantidade de subprodutos gerados de suaprodução, principalmente o glicerol bruto. Como objetivo reduzir os futuros problemas ambi-entais por acumulação de glicerol e tornar aprodução de biodiesel mais rentável, a imple-mentação de estratégias biotecnológicas que uti-lizam o glicerol como única fonte de carbonopara obtenção de produtos de maior valor agre-gado, vem sendo estudado como uma promis-sora alternativa e solução. Este trabalho des-creve estudos bem documentados sobre o me-canismo metabólico de glicerol por microrga-nismos e pertinentes com a proposta de utiliza-ção do glicerol em processos microbianos. Damesma forma são apresentadas novas estratégi-as que podem ser exploradas visando o apro-veitamento deste material e sua bioconversãoem bioprodutos de alto valor agregado.

Palavras-chave: glicerol, fermentação,bioproduto.

Biotechnological strategies for glycerolutilization derived from biodiesel produc-tion

ABSTRACT

The claim for reducing environment pollutionstimulates the world market of clean fuels. Bi-ofuels as biodiesel, represents a renewable andenvironmentally safety alternative to fossil fuel.Nonetheless, its production is increasing consi-derably, and as a consequence, the amount ofraw glycerol (byproduct) generated is growingexponentially. With the aim to reduce envi-ronment problems due to accumulation of glyce-rol, biotechnological strategies for its biocon-version in value-added products are being im-plementing. This work presents detailed argu-ments on the metabolic mechanisms of glyce-rol assimilation by microorganisms, as well as,a description of the most recent biotechnologi-cal processes applied to obtain bioproducts fromglycerol.

Keywords: glycerol; fermentation; bioproduct.

INTRODUÇÃO

A utilização de fontes alternativas de energiaé umas das grandes prioridades atuais, quevem contribuir significativamente para con-tornar os graves problemas ocasionados pelodesenvolvimento tecnológico. A preocupaçãoatual pela redução da poluição e a crise ener-gética têm estimulado o mercado mundial debiocombustíveis. A economia global mantém-se em crescimento e a demanda por energialimpa e recursos renováveis encontra-se emcontínuo aumento (BILGEN et al., 2006).Neste sentido, a busca intensiva por combus-tíveis alternativos ao petróleo, como o biodi-esel, apresenta grande importância principal-mente para os países emergentes, uma vezque sua produção auxilia à conservação domeio ambiente, mediante a redução dos ga-ses responsáveis pelo aquecimento global, econtribui para o desenvolvimento social me-diante a geração de empregos (OLIVEIRA etal., 2006). No Brasil, a produção e comerci-alização de biodiesel possui importantes van-tagens devido à grande disponibilidade dematéria-prima para sua produção e ao cresci-mento contínuo da indústria de óleos vege-tais e etanol (OLIVEIRA et al. 2006, OISTI,2006).A produção de biodiesel está significativamenteacelerada, uma vez que o governo brasileiroestabeleceu a obrigatoriedade da adição debiodiesel ao combustível de petróleo medi-ante a lei 11097/2005. No ano 2013, a quan-tidade de biodiesel a ser adicionado deveráalcançar 5 % do volume total de diesel utili-zado (ANP, 2007). O glicerol é o principalsubproduto gerado na produção de biodie-sel, sendo que aproximadamente 10 % dovolume total de biodiesel produzido corres-pondem a glicerol (DASARI et al., 2005). Es-tima-se que com o incremento do volume debiodiesel, o glicerol co-produzido aumentaráde 83 para 330 milhões L/ano até o ano 2010(MME, 2007). Com o intuito de evitar futurosproblemas derivados da acumulação de gli-cerol e para tornar a produção de biodieselmais competitiva, torna-se necessário a buscade alternativas para o uso do glicerol brutogerado nesta produção. Este subproduto, naforma pura, possui inúmeras aplicações indus-triais (aditivos para a indústria de alimentos,química e farmacêutica). O glicerol obtido re-sultante da transesterificação de triglicerídioscom álcool apresenta impurezas como água,sais, ésteres, álcool e óleo residual, que lheconferem um baixo custo (OOI et al.,2004).A rentabilidade de vários processos químicos

Ilustrações cedidas pelos autores

Pesquisa

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depende em parte, da venda dos subpro-dutos, permitindo a redução dos custos deprodução e conseqüentemente, do preçofinal do produto. Dessa forma, existe umgrande interesse na purificação do glicerolou no seu reaproveitamento direto, semtratamento, o que proporcionará à viabili-zação do processo de produção de biodie-sel, permitindo que este se torne competi-tivo no crescente mercado de biocombus-tíveis. Os processos para sua purificaçãoincluem filtração, destilação a vácuo, des-coloração e troca de íons para a remoçãoprincipalmente de K+ e Na+ utilizados comocatalisadores (YONG et al. 2001). No en-tanto, os tratamentos de purificação são decusto excessivamente elevados para peque-nos e médios produtores nacionais de bio-diesel. Devido a este fato, uma maior quan-tidade de efluentes contendo glicerol po-derá ser descartada no meio ambiente semnenhum tratamento, aumentando conse-qüentemente os problemas e riscos ambi-entais.A conversão microbiana de glicerol por pro-cessos biotecnológicos em produtos demaior valor agregado como biomassa e bi-omoléculas, é uma alternativa relevante paraa maior valorização da produção de biodi-esel (ITO et al., 2005). Neste sentido, abiotecnologia moderna, com todo seu avan-ço trará grandes contribuições e permitiráa obtenção de biomoléculas e produtos comimportantes propriedades.

NATUREZA E CARACTERÍSTICASDO GLICEROL

Glicerol é o nome comum do compostoorgânico 1,2,3-propanotriol, descoberto porCarl W. Scheele em 1779 durante a separa-ção de uma mistura aquecida de PbO pre-parada com óleo de oliva. Os seus sinôni-mos são glicerina, trihidroxipropano, glicilálcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano.Na natureza, o glicerol existe em vegetais(soja, mamona, babaçu, girassol, palma, al-godão, coco, dendê, pinhão manso) e ani-mais em formas combinadas de glicerinacom ácidos graxos. O glicerol é tambémum composto considerado fundamental den-tro do sistema metabólico de microrganis-mos; onde atua como precursor de nume-rosos compostos; e como regulador de vá-rios mecanismos bioquímicos intracelulares(LAGES, SILVA-GRAÇA, LUCAS, 1999).Em microrganismos eucarióticos, o glicerolconstitui o principal composto formado pararegular as variações de atividade de águaem ambientes altamente osmofíl icos(WANG et al., 2001).Em humanos, o glicerol participa na ter-mo-regulação do corpo, resistência a altastemperaturas, na resistência dos músculosem atividades físicas e na resposta neuralda variação da glicemia (YANG et al., 1999).O glicerol na sua forma pura apresenta-secomo um líquido viscoso, incolor, inodoroe higroscópico, com sabor doce, solúvelem água e álcool, insolúvel em éter e emclorofórmio.Devido às suas características físicas e quí-

micas e ao fato de ser inócuo, o glicerolpuro apresenta diferentes aplicações na in-dústria de cosméticos, farmacêutica, deter-gentes, na fabricação de resinas e aditivose na indústria de alimentos. Apesar de oglicerol apresentar estas aplicações na for-ma pura, poucos estudos estão sendo dire-cionados para a utilização de glicerol brutona forma direta.

OBTENÇÃO E TRATAMENTODO GLICEROL BRUTO

Subproduto natural do processamento deóleos e gorduras, o glicerol pode ser obti-do mediante reação de saponificação de áci-dos graxos (óleos, azeites ou sebo) comhidróxido de sódio ou hidróxido de potás-sio, como co-produto da fabricação de bio-diesel e em menor proporção, mediantesíntese microbiana. A produção sintética deglicerina a partir de cloreto de alil via epi-cloridrina encontra-se em declínio devidoao excesso no mercado de glicerol do pro-cesso de biodiesel. Dentro deste contexto,o glicerol constitui o maior subproduto ge-rado no processo de produção do biodieselvia esterificação de ácidos graxos vegetaisou gordura animal com álcool (metanol ouetanol) para produzir ésteres e glicerol napresença de catalisador (KOH ou NaOH)(DIECKELMANN e HEINZ, 1988)A equação global de transesterificação éapresentada na Figura 1a, onde são neces-sários três moles de álcool por cada mol detriglicerídeo utilizado. Esta reação global éconseqüência de um número de reaçõesreversíveis e consecutivas mostradas na Fi-gura 1b. A primeira consiste na conversãode triglicerídeos em diglicerídeos, seguidada conversão destes diglicerídeos em mo-noglicerídeos, e finalmente de glicerídeosa glicerol, rendendo uma molécula de és-

ter de álcool por cada glicerídeo em cadaetapa da reação.No final da etapa de transesterificação, oglicerol e ésteres formam uma massa líqui-da de duas fases, que são facilmente sepa-ráveis por decantação ou centrifugação. Afase superior, a mais leve ou menos densa,contém os ésteres metílicos ou etílicos cons-tituintes do biodiesel. A fase inferior oupesada encontra-se composta de glicerolbruto e impurezas.O valor do glicerol bruto obtido da produ-ção de biodiesel encontra-se entre 0,2 a0,4 R$/kg. Este baixo valor é atribuído aoconteúdo de aproximadamente 30 % (p/p)de impurezas e ao grande volume desteco-produto gerado pelas indústrias. O gli-cerol bruto apresenta-se na forma de líqui-do viscoso pardo escuro, que contém quan-tidades variáveis de sabão, álcool (metanolou etanol), monoacilglicerol, diacilglicerol,oligômeros de glicerol, polímeros e água(OOI et al., 2004). A porcentagem de gli-cerol na mistura varia entre 65 a 70 % (p/p), sendo a maior parte das impurezas sa-bão formado pela reação dos ácidos graxoslivres com excesso de catalisador (saponi-ficação). Dessa forma, o aspecto do glice-rol bruto encontra-se estreitamente relaci-onado ao conteúdo de sabão, que propor-ciona aparência de viscoso e escuro. Parareduzir o sabão gerado, recomenda-se con-duzir a reação de transesterificação commatérias primas (triglicerídeos) com baixoconteúdo em ácidos graxos livres e água,ao mesmo tempo de reduzir a quantidadede catalisador (OOI et al., 2004).A mistura residual resultante é submetidoao processo de acidulação com ácido con-centrado (HCl, H

2SO

4, ou H

3PO

4) para a se-

paração de glicerol e ácidos graxos do sa-bão (Figura 2a). No entanto, a maior partedos processos de tratamento de glicerol éconduzida utilizando HCl ou H

2SO

4, sendo

Figura 1. (a) Reação global e (b) Reações consecutivas detransesterificação de triglicerídeos. R

1, R

2, R

3 e R representam grupos alquilas

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o H3PO

4 restrito pelo alto custo. Durante a

acidulação, forma-se certa quantidade desal (reação do ácido inorgânico com íon dosabão) que se deposita na fase inferior deum líquido de três fases, estando a fase su-perior constituída pelos ácidos graxos li-vres, e a fase intermédia composta princi-palmente por glicerol e álcool (Figura 2b).O glicerol recuperado alcança concentra-ções superiores a 80 % (p/p), com quanti-dades variáveis de água, corantes e álcool.Posteriormente, o glicerol com excesso deácido é neutralizado com solução de NaOHe submetido a tratamento térmico (70oC)para eliminar os componentes voláteis (re-cuperação de álcool)(OOI et al., 2004;FUKUDA, KONDO, NODA, 2001). Nestaforma, parcialmente livre de impurezas, oglicerol pode ser utilizado como substratode fermentação por várias espécies de mi-crorganismos. As características físicas, químicas e nutri-cionais do glicerol bruto dependem do tipode ácido graxo (gordura animal ou óleovegetal) e do tipo de catálise empregadana produção de biodiesel. No entanto, aprocura pela glicerina purificada é muitomaior, devida ao seu valor econômico. A

aplicação do glicerol na indústria está con-dicionada ao grau de pureza, que deve serigual ou superior a 95%. Para obter graude pureza superior a 95% (p/p)(grau ali-mentício ou farmacêutico), o glicerol deveser submetido a destilação, mas sob custoelevado .Por outro lado, de acordo com a Tabela 2,o glicerol bruto contém elementos nutrici-onais, como, fósforo, enxofre, magnésio,cálcio, nitrogênio e sódio, e que são factí-veis de serem utilizados por microrganis-mos para o seu crescimento durante pro-cessos fermentativos (THOMPSON, HE,2006).

ASSIMILAÇÃO, METABOLISMO ECONVERSÃO MICROBIOLÓGICA DO

GLICEROL.

O glicerol é considerado uma fonte de car-bono altamente reduzida e assimilável porbactérias e leveduras sob condições aeró-bicas e anaeróbicas19 para a obtenção deenergia metabólica, como regulador do po-tencial redox e para a reciclagem de fosfa-to inorgânico dentro da célula (DILLIS etal., 1980).

Vários estudos foram desenvolvidos visan-do a utilização de glicerol como fonte decarbono por microrganismos, especialmen-te por bactérias. Muitos deles apontam prin-cipalmente a mecanismos de assimilação deglicerol por estes microrganismos para aprodução de compostos intermediários depolímeros, resinas e aditivos para combus-tíveis (PAPANIKOLAOU et al., 2002; ITOet al., 2005; CHENG et al 2007).O transporte do glicerol através da mem-brana celular constitui a primeira etapa parao seu metabolismo. De uma forma geral, aassimilação de glicerol por parte dos mi-crorganismos envolve o transporte passivo(GANCEDO, GANCEDO, 1968) e transporteativo (LAGES, SILVA-GRAÇA, LUCAS, 1999)através da membrana plasmática.O transporte passivo inclui a difusão sim-ples (permeação não específica) e a difu-são facilitada mediada por proteínas locali-zadas nas camadas mais internas da mem-brana plasmática (MIP), as permeases. Adifusão simples, sendo ATP não dependen-te, requer um gradiente de concentraçãopara o transporte do substrato através damembrana. Conseqüentemente, a concen-tração do substrato no interior da célula não

supera aquela encontrada no meio decultura(MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002).Na levedura Saccharomyces cerevisiae, es-tudos desenvolvidos por Luyten et al.(1995), assinalaram a existência de perme-ases FPS1, específicas para transporte deglicerol (Figura 3).O glicerol é um dos poucos substratos queatravessa a membrana celular por difusãofacilitada nas células procarióticas. Em bac-térias como Escherichia coli, a proteína do

Figura 2.(b)- Separação do glicerol apóstratamento com ácido concentrado,a fase superior corresponde aácidos graxos, fase intermédia:glicerol, fase inferior: glicerol + sais

Figura 2.(a) - Fluxograma de produção de biodiesel e tratamento de purificação do glicerol

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tipo poro-canal-G1pF atua por sensibilida-de mecânica sem gasto energético na pre-sença de glicerol. Este facilitador permite aassimilação, além de glicerol, de pequenasmoléculas de polihidroxi álcoois, uréia eglicina, mas exclui moléculas carregadascomo gliceraldeído-3-fosfato e dihidroxia-cetona fosfato(HOLST et al., 2000). E mquanto aos mecanismos genéticos, foramdescritos três genes responsáveis pela as-similação e regulação do conteúdo interce-lular de glicerol em Saccharomyces cerevi-siae, o GUP1 e GUP2 (HOLST et al., 2000)e FPS1(LUYTEN et al.,1995) associados di-retamente com o transporte facilitado e quesão expressas conforme estímulos provoca-dos nas células, como o estresse osmótico.Por outro lado, mecanismos de transporteativo simporte glicerol/H+ e simporte gli-cerol/Na+ (dependentes de ATP) foram des-critos em numerosas espécies de levedu-ras, entre elas Debaryomyces hansenii, Pi-chia sorbitophila, Saccharomyces cerevisi-ae, Zygosaccharomyces rouxii (LAGES, SIL-VA-GRAÇA, LUCAS, 1999). Tanto as acu-mulações de glicerol por estresse, como aexistência de mecanismos ativos, são co-muns em grande variedade de leveduras(LAGES, LUCAS, 1997).Após a passagem do glicerol através damembrana plasmática pelos possíveis me-canismos, o glicerol pode ser catabolisadopor várias rotas metabólicas independen-tes, apresentado na Figura 4.Uma das rotas, provavelmente a principalpara a oxidação de glicerol por leveduras,consiste na fosforilação do glicerol pela en-zima glicerol-quinase para formar glicerol-3-fosfato, que é reduzido a dihidroxiaceto-na fosfato pela enzima mitocondrial glice-rol fosfo-ubiquinona oxidoreductase (FADdependente)(GANCEDO, SERRANO, 1989).

Estudos demonstraram que, os genes quecontrolam a síntese das enzimas glicerol-quinase e fosfo-ubiquinona oxidoreductasesão GUT1 e GUT2, respectivamente (GRAU-SLUND, LOPES, RONNOW, 1999). A ex-pressão dessas enzimas é reprimida duran-te o crescimento celular em substratos fer-mentescíveis como glicose, mas desregula-do quando glicerol ou etanol é utilizadocomo a principal fonte de carbono (GRAU-SLUND, RONNOW, 2000).

Outra possível via catabólica do glicerol cor-responde à oxidação de glicerol e conseqüenteformação de dihidroxiacetona pela enzimaglicerol desidrogenase. Após, a dihidroxiace-tona é fosforilada a dihidroxiacetona fosfatopela enzima dihidroxiacetona quinase depen-dente de Adenosina Trifosfato (ATP). Gance-do e Gancedo (1968) reportaram que leve-duras da espécie Schizosaccharomyces pom-be, por exemplo, oxida glicerol mediante essavia sob condições de �stress� osmótico.A dihidroxiacetona fosfato é considerada umaimportante molécula intermediária para a gli-coneogênese (síntese de hexoses), assim comopara a obtenção de numerosos compostos atra-vés das vias oxidativas, incluindo, ácido cítri-co, ácido succínico, ácido acético, ácido fór-mico, ácido lático, etanol e outros compostosde interesse comercial (MOAT, FOSTER, SPEC-TOR, 2002). O crescimento de microrganis-mos em fontes de carbono alternativas aoscarboidratos, como L-malato, acetato, ou gli-cerol, requer a capacidade de sintetizar he-xoses necessárias para a produção de muco-peptideos da parede celular, armazenagem deglicogênio, e outros compostos derivados dehexoses, como as pentoses, envolvidos na bi-osíntese de ácidos nucléicos (MOAT, FOSTER,SPECTOR, 2002).Também, Hauge, King e Cheldelin (1955),fazem referência sobre a capacidade de algu-mas bactérias, entre elas Acetobacter suboxy-dans, de oxidar a molécula de dihidroxiace-tona fosfato pela via pentose-fosfato, incre-mentando o número de bioprodutos possíveisde serem obtidos por via biotecnológica a par-tir de glicerol.Em espécies de leveduras do gênero Yarro-wia sp., e em bactérias como Klebsiella pneu-moniae, Clostridium pasteurianum, Citrobac-ter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostri-dium pasteurianum, Clostridium butyricum,Enterobacter agglomerans, Lactobacillus bre-vis, Lactobacillus buchneri and Bacillus wel-chii (ZHAO, CHEN, YAO, 2006; GONZÁLEZ� PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007),observa-se que sob condições de anaerobio-se, o glicerol sofre desidratação pela enzimaglicerol desidratase para produzir 3-dihidro-xipropionaldeído.Posteriormente, este intermediário é transfor-mado pela enzima NADH dependente 1,3-propanodiol oxido-reductase para gerar 1,3-propanodiol, principal intermediário para pro-dução de polímeros, resinas e aditivos de im-portantes aplicações industriais (GONZÁLEZ� PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007).Uma vez que o glicerol é assimilado no inte-rior da célula, numerosos compostos são pro-duzidos como conseqüência do seu metabo-lismo.

BIOPRODUTOS OBTIDOS PORFERMENTAÇÃO MICROBIANA

DO GLICEROL

A extraordinária expansão da indústria de bi-odiesel no Brasil e no mundo vem originan-do grandes volumes do principal co-produto,o glicerol. A superprodução de glicerol afetanegativamente o preço do biodiesel no mer-cado, tornando imperiosa a busca de novas

Tabela 1. Composição do glicerol bruto obtido durante a produção de biodieselem função de diferentes matérias prima. (Adaptado de: THOMPSON, HE ,2006)

Figura 3. Tipos de transporte para aassimilação de glicerol pela leveduraSaccharomyces cerevisiae. FPS1 eYFLO54c são proteínas de transporte,GUT1 e GUT2 são genes para expressãode enzimas de assimilação de glicerol.(Baseado em: NEVES, LAGES, LUCAS,2004)

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aplicações para este co-produto. Neste con-texto, o glicerol vem sendo investigadocomo a futura fonte de carbono em proces-sos microbianos para a obtenção de bio-produtos de alto valor agregado.A continuação, detalham-se os recentes pro-cessos fermentativos aplicados nos labora-tórios de pesquisa científica para a obten-ção de bioprodutos a partir do glicerol, in-dependente do seu origem.

1,3-Propanodiol

O propanodiol é um composto intermediá-rio para a síntese de compostos cíclicos emonômeros para poliésteres, poliuretanos

e polipropileno tereftalato. É conhecido queos processos químicos tradicionais de pro-dução são altamente nocivos devido ao com-postos tóxicos formados. As pesquisas maisimportantes na utilização biotecnológica doglicerol bruto apontam principalmente àprodução do composto intermediário 1,3-propanodiol (GONZALEZ-PAJUELO et al.,2006; XIU et al., 2007). Atualmente, estescompostos são produzidos quase exclusiva-mente a partir de um derivado do petró-leo, o óxido de propileno, mediante pro-cessos químicos convencionais (SULLIVAN,2003).O campo de aplicação do composto 1,3-propanodiol é considerado amplamente

abrangente, diferentes setores comerciais, desdea produção de polimeros, tintas, resinas de poli-éster, lubrificantes, anti-cogelante, até produçãode cosméticos. Mediante fermentação de glicerolbruto por Klebsiella pneumoniae foram obtidosconcentrações de até 56 g/L em escala de labora-tório. No entanto, a produção de 1,3-propanodiola escala industrial encontra-se limitado devido aque os a maioria dos microrganismos produtores,Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium,Propionibacterium and Anaerobiospirillum, sãoconsiderados patogênicos e requerem de condi-ções estritas de anaerobiose e nutrientes específi-cos para seu desenvolvimento (BARBIRATO et al.,1997). Uma solução futura para o scale-up consis-tiria na utilização de ferramentas da engenhariagenética para inserir genes que expressem enzi-mas geradoras de 1,3-propanodiol em microrga-nismos mais adaptados a condições industriais, comopor exemplo, a bactéria Escherichia coli (DHAR-MADI, MURARKA, GONZÁLEZ, 2006). Notoriamente, muitas espécies apresentam a ca-pacidade de fermentar o glicerol produzindo 1,3-propandiol, entre elas podem ser citadas Citro-bacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridiumpasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobac-ter agglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobaci-llus buchneri and Bacillus welchii (BARBIRATO etal., 1997; GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIUet al., 2007) . Atualmente, as bacterias Clostri-dium butyricum e Klebsiella pneumoniae são con-sideradas as de maior utilização e provavelmentesejam as melhores produtoras deste composto (XIUet al., 2007). Recentemente, González-Pajuelo etal. (2005) comparando uma espécie natural deClostridium butyricum VPI 3266 com outra gene-ticamente modificada Clostridium acetobutylicumDG1(pSPD5) (contendo genes para produção de1,3-propanodiol), observaram que no tempo de47 h de fermentação em batelada alimentada, acepa modificada alcançou maior produtividade(0,65 mol/mol de glicerol, 1,7 g/L h) que a cepanatural (0,69 mol/mol, 1,21 g/L.h). Em fermenta-ção contínua de glicerol bruto e comercial (pure-za: 80-90% ) em uma taxa de diluição (D) de 0,05h-1 (pH 6,5; 35 oC) com a mesma cepa modificada,foram obtidos valores de rendimento e produtivi-dade similares aos observados em batelada ali-mentada (0,61-0,64 mol/mol glicerol, 1,49-1,56g/L.h). Os mesmos autores reportaram alta produ-tividade em 1,3-propanodiol (10,3 g/L.h) em cul-tivo contínuo da bactéria Clostridium butyricum(GONZÁLEZ-PAJUELO, ANDRADE, VASCONCE-LOS, 2005).Outro aspecto considerado de importância é aimobilização de células em diferentes polímerospara sua re-utilização em fermentações consecuti-vas. O encapsulamento de células de Klebsiellapneumoniae em celulose-sulfato de sódio e poli-cloreto de metil dialil amônia desenvolvido porZhao, Chen e Yao (2006), permitiu executar fer-mentações em batelada repetida, batelada alimen-tada e processo contínuo para a obtenção de 1,3-propanodiol sob concentrações de glicerol tão ele-vadas quanto 120 g/L. A quantidade de produtoobtido foi de 63,1 g/L (5,7 g/L.h), 51,86 g/L(1,08g/L.h) e 13,6 g/L (4,5 g/L h) para fermentação embatelada simples, batelada alimentada e fermenta-ção contínua, respectivamente. Apesar dos valo-res de produtividade na fermentação por bateladaalimentada serem menores que na batelada sim-ples, os resultados sugerem a potencialidade da

Figura 4. Vias metabólicas de assimilação de glicerol pormicrorganismos e seus possíveis produtos. (Adaptado de: GANCEDO,GANCEDO, 1968; HAUGE, KING, CHELDELIN, 1955; XIU et al., 2007)

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reutilização de células imobilizadas, principal-mente por fornecer um ambiente estável paraa célula frente a altas concentrações de subs-trato. A co-fermentação de glicerol e glicosefoi avaliada por Xiu et al. (2007) para a pro-dução de 1,3-propanodiol por Klebsiella pneu-moniae DSM2026. Na relação glicose-glice-rol igual a 0,2 e sob condições de micro-aeração foram alcançados valores de produti-vidade igual a 1,95 g/L.h.Os primeiros estudos tecnológicos para o au-mento de escala foram desenvolvidos porCheng et al. (2007), utilizando reator em pro-cesso por batelada alimentada de 5000 L devolume total. Sob condições de baixo poten-cial de oxidação, alcançado mediante fluxode nitrogênio gás (0,15 vvm), foram fermen-tados 4000 L de meio contendo 40 g/L deglicerol a pH 6,8 ; 90 rpm e 37oC. Aconcentração máxima de produto foi de 58,8g/L, mas com uma produtividade ainda baixade 0,92 g/L.h. Estes resultados iniciais de-monstram a factibilidade da produção de 1,3-propanodiol a escala piloto, mas novas tenta-tivas deverão ser conduzidas para a sua oti-mização visando a projeção industrial.

Etanol

Etanol, butanol, e outros compostos são co-produzidos durante a fermentação de glicerol(DABROCK, BAHL, GOTTSCHALK, 1992). Itoet al. (2005) demonstraram a possibilidadede produzir etanol e hidrogênio por Entero-bacter aerogenes HU-101 utilizando efluentesda indústria de biodiesel contendo ate 41%(p/p) de glicerol. Convenientemente diluído(7,3 g/L), o efluente foi fermentado em formadescontínua em frascos anaeróbicos e em for-ma contínua utilizando reator de coluna em-pacotada. Na fermentação descontínua, os ren-dimentos em hidrogênio e etanol foram de0,89 mol/mol de glicerol e 1 mol/mol glice-rol, respectivamente. Rendimentos acima de10 g/L foram obtidos em processo contínuoempregando cerâmica porosa como suportede microrganismos. Neste processo, compa-rando meios contendo efluente de biodiesele glicerol comercial, os mesmos autores ob-servaram que produção de hidrogênio foimaior naquele meio com glicerol parcialmentepurificado (60 mmol/L.h) que utilizando eflu-ente (30 mmol/L h). Aparentemente, as im-purezas que acompanham o efluente aumen-taram a fragilidade dos flocos de microrganis-mos, facilitando o wash- out das células doreator na mesma taxa de diluição.Em outros trabalhos, etanol e ácido fórmicoforam os principais produtos da fermentaçãode glicerol pela bactéria Klebsiella plantico-la, em concentrações equimolar acima de 2g/L (JARVIS, MOORE, THIELE, 1997). Estesresultados estimulam a procura de novos mi-crorganismos para a fermentação de glicerolvisando a produção de etanol e hidrogênio.

Ácidos orgânicos

Também, existem numerosos trabalhos dire-cionados para a produção de ácido cítrico eácido succínico por fermentação de glicerol.Estes compostos são de ampla aplicação na

indústria de alimentos e constituem impor-tantes intermediários para a indústria de po-límeros e produção de compostos químicoscomo o 1,2-butanodiol e 2,4-butanodiol.Papanikolaou et al. (2002) obtiveram con-siderável quantidade de ácido cítrico, deordem de 35 g/L, mediante fermentaçãode glicerol por Yarrowia lypolitica. Por suaparte, Rymowicz et al. (2006) publicaramestudos de assimilação de glicerol desen-volvidos com três cepas mutantes de Yar-rowia lypolitica, obtendo concentrações deaté 124,5 g/L de ácido cítrico. A produçãode ácido succínico e ácido acético a partirde glicerol por Anaerobiospirillum succi-niciproducens resultou em concentrações6,5 vezes superiores a aquelas obtidas uti-lizando glicose como única fonte de carbo-no (LEE et al., 2001).A síntese de ácido propiônico por célulasde Propionibacteria acidipropionici e Pro-pionibacteria freudenreichii ssp. shermaniiimobilizadas em alginato de cálcio foi re-portado por Bories et al. (2004). Sob con-dições de alta concentração de glicerol ob-tiveram-se concentrações de ácido propio-nico de até 42 g/L.

Polihidroxialcanoatos

A preocupação pela redução dos contami-nantes ambientais vem acelerando novaspesquisas para a produção de polímerosbiodegradáveis. Espécies de Pseudomonasproduzem naturalmente polihidroxialcano-atos (PHA), poliésteres lineares de compa-tível com uma ampla faixa de potenciaisaplicações devido a suas propriedades físi-cas e biodegradabilidade (ASHBY, SOLAI-MAN, FOGLIA, 2005).Muitos microrganismos acumulam PHA sobcondições de estresse, principalmente quan-do submetidos à falta de nitrogênio, fósfo-ro ou oxigênio, e utilizam esse polímeroquando a fonte externa de carbono é limi-tada. Historicamente, os ácidos graxos fo-ram utilizados extensivamente para a sín-tese de PHA (ASHBY, SOLAIMAN, FO-GLIA, 2005). Glicerol proveniente da pro-dução de biodiesel apresenta-se como umaopção de substrato econômico para a pro-dução deste tipo de biopolímeros. Bormane Roth (1999) utilizaram Methylobacteriumrhodesianum para produzir polihidroxibu-tirato (PHB) na concentração de 10,5 g/Lem fermentação por batelada com meio con-tendo 5 g/L de glicerol e caseína peptona.Koller et al. (2005) obtiveram polihidroxi-alcanoatos numa concentração máxima de16,2 g/L, mediante fermentação em batela-da alimentada de soro de queijo e glicerolbruto por uma cepa selvagem de levedura.Para estressar as células, o cultivo foi con-duzido sob tensão de oxigênio (taxa de 10mL/min) e sem outra fonte de fósforo alémdaquela fornecida pelos 2,5 g/L de extratode levedura. Um ponto interessante nestapesquisa foi a capacidade da cepa selva-gem de produzir simultaneamente 3-hidro-xivalerato (8-10 % do total de PHA) semnecessidade dos precursores ácido propió-nico ou ácido valérico.

Ashby, Solaiman e Foglia (2005) utilizaramduas cepas, Pseudomonas oleovorans B-14682e Pseudomonas corrugata 388 para a produ-ção de PHA. Partindo de concentrações má-ximas de 50 g/L glicerol, as cepas P. oleovo-rans e P.corrugata produziram 0,97 g/L dePoli 3-hidroxibutirato (P3HB) e 0,67 g/L deacido hidroxidodecenóico, respectivamente.De igual forma, foi observada a capacidadede produção de blend de P3HB and PHA emdiferentes proporções por cultura mista dosmicrorganismos estudados.

Ácido graxo poliinsaturado ômega-3

De conhecidas propriedades terapêuticas con-tra numerosas enfermidades cardiovasculares,câncer e Alzheimer, os ácidos graxos poliin-saturados ômega-3 (AGPI ù-3) são geralmen-te obtido a partir de fontes naturais como óle-os vegetais ou de peixes.Recentemente foram desenvolvidos trabalhospara a produção de AGPIù-3 a partir da mi-croalga heterotrófica Schizochytrium limaci-num que possui capacidade produzir altos ní-veis de ácido docosahexaenóico (DHA). Pylee Wen (2007) observaram que após 5 dias decrescimento em frascos Erlenmeyer (pH 8,20 oC, 170 rpm), aproximadamente 18 g/L decélulas da microalga se formavam em meiosindependentes contendo glicose, glicerol puroe glicerol bruto na concentração de 90 g/L.Foram analisados alguns parâmetros cinéticoscomo a velocidade específica de crescimentoµ, 0,685/ h; rendimento em biomassa, 0,284g/g glicerol bruto; rendimento de DHA, 171,27mg/g glicerol bruto e rendimento volumétri-co de 3,08 g/L. Também, foi estudado o efei-to de diferentes concentrações de glicerolbruto contendo sabão sobre o crescimento damicroalga. Concentrações superiores a 40 g/Ldeste glicerol, influenciaram negativamenteno crescimento da microalga, sendo que naconcentração de 90 g/L observou-se a mortedas células após 2 dias de cultivo. Estes resul-tados podem ser considerados ótimos, desdeque não se necessitaria de uma etapa de pré-tratamento do glicerol para a separação dosabão, etapa geralmente longa e de custo ele-vado. O trabalho demonstra que um leque deoportunidades pode ser aberto com pesquisasutilizando exclusivamente algas heterotrófi-cas e glicerol como fonte de carbono.

Avanços tecnológicos noaproveitamento do glicerol no Brasil

Recentemente, no XVI Simpósio Nacional deBioprocessos (SINAFERM 2007) foram apre-sentados numerosos trabalhos na busca desoluções biotecnológicas para a utilização deglicerol originado da produção de biodiesel.Por exemplo, Meinicke, Vendruscolo e Ni-now (2007) compararam diferentes meioscontendo concentrações variáveis de glicerole glicose como fonte de carbono para a pro-dução de corantes naturais pelo fungo filma-mentoso Monascus ruber. A máxima produ-ção de pigmentos vermelhos em frascos Er-lenmeyer foi de 5,2 UDO

480 nm (1 unidade UDO

(Abs) corresponde a 15 mg/L de pigmento) eprodutividade de (0,0596 UDO

480nm./h) utili-

50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37

zando fonte de carbono mista (5 g/L deglicose e 15 g/L de glicerol). Os autoresobservaram que variações no valor de pHpodem regular a proporção do tipo de pig-mentos encontrado no meio. Valores de pHinferiores a 5,5 encontram-se associados àformação de pigmentos amarelos, sendo queos valores superiores favorecem a produ-ção de pigmentos vermelhos.Também, o glicerol resultante da transes-terificação de óleo de mamona demons-trou ser uma fonte de carbono apropriadapara produção de biosurfactante ramnolipí-deo (uma ou duas moléculas de ramnose eácido graxo de cadeia longa) por Pseudo-mona aeruginosa59. A concentração da fon-te de nitrogênio (NaCO

3) representou ser

um fator preponderante na produção do bi-osurfactante, comprovado pela redução datensão superficial da água maior a 45,7 % eíndice emulsificação às 24 h superior a 56,1% para os diferentes hidrocarbonetos testa-dos (querosene, hexadecano e isso-octa-no). Prieto et al 2007 obtiveram resultadossimilares na produção de ramnolipídeos,comprovando a maior influência do NaNO

3

na produção de biosurfactante pela mesmaespécie de microrganismo, seguido porNH

4NO

3, uréia e NH

4SO

4.

Recentemente, em trabalhos de pesquisavisando a seleção de leveduras aptas paraa assimilação e crescimento em glicerol co-mercial, verificamos que algumas espéci-es, incluindo Kluyveromyces marxianus eCandida batistae, apresentaram elevada ca-pacidade de crescimento neste substrato.Dentre as leveduras estudadas, Hansenulaanomala e Candida tropicalis mostraramcapacidade de produzir etanol em concen-trações de 3,5 e 6,1 g/L, respectivamen-te61. Estes resultados, ainda preliminares, sãopromissores para produção de etanol a par-tir de glicerol por esses microrganismos.Por outro lado, Volpato et al (2007) isola-ram de ambientes amazônicos diferentescepas de Bacillus com capacidade de pro-duzir lípases utilizando glicerol como fontede carbono. A máxima atividade lipolíticaem glicerol (24,3 U/L) foi obtida com oisolado BL74.Destaca-se também a possibilidade da fer-mentação de glicerol de biodiesel por Strep-tomyces clavuligerus para a produção deácido clavulânico, potente inibidor de beta-lactamases, que junto com a penicilina ecefalosporina são utilizados contra infecci-ones bacterianas. O trabalho desenvolvidopor Gutierrez e Costa Araújo (2007) com-parou a suplementação continua de meiosde cultura contendo concentrações variá-veis de fonte de aminoácidos e glicerol paraa produção de ácido clavulânico. Após 120h de fermentação, a máxima concentraçãode ácido clavulânico obtido foi de 60 mg/L.Na busca de novas cepas fermentadoras deglicerol, Silva e Contiero (2007) isolaram abactéria GLC29 produtora de 10,8 g/L de1,3-propanodiol a partir de 20 g/L de gli-cerol. Este estudo soma-se às numerosaspesquisas desenvolvidas em outros paísespara a produção deste glicol com impor-

tantes aplicações industriais (GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007).Estes e outros estudos demonstraram a po-tencialidade da utilização do glicerol, pro-veniente da produção de biodiesel, comofonte de carbono para a produção de com-postos químicos de interesse comercial.Embora, em etapas iniciais, novas linhas depesquisas estão sendo definidas para obtercompostos de maior valor agregado, queincluam principalmente moléculas bioati-vas, como proteínas e ribonucleotídeos, paraa indústria alimentícia e farmacêutica.A utilização de biorefinarias para conver-são de glicerol bruto apresenta-se como umaestratégia promissora para evitar futuros pro-blemas de acumulação deste subproduto,ao tempo de aumentar a rentabilidade daprodução de biodiesel.

Aspectos econômicos

O excesso de glicerol proveniente da pro-dução de biodiesel associado à baixa de-manda mundial (0,5 bilhões ton/ano) e baixocusto, projetam um desequilíbrio econômi-co nas indústrias oleoquímicas e de refinode glicerol, ao tempo de pôr em risco asustentabilidade econômica de usinas de bi-odiesel no mundo (HGCA, 2007). No Bra-sil, a maioria das plantas industriais de bio-diesel não valoriza efetivamente o glice-rol. A projeção do volume de glicerol nopaís para o ano 2013 é de 488 milhões eas perspectivas, nesse sentido, não são aus-piciosas, devido a que poucas apresentamplanos futuros para sua conversão em pro-dutos de maior valor agregado.O uso intensivo deste co-produto é essen-cial para a sustentabilidade econômica daindústria de biodiesel no país. A queda brus-ca do preço do glicerol no cenário interna-cional nos últimos 5 anos tem obrigado àparalisação da produção da glicerina sinté-tica a partir de propileno. O excesso devolume de glicerol, o alto preço do propi-leno e as vantagens de produzir compostosderivados da indústria petroquímica demaior valor, conspiraram para o severodeclínio das indústrias de glicerina sintéti-ca (HGCA, 2007). Nos Estados Unidos, ovalor do glicerol diminuiu de 1048 R$/tem 2004 para aproximadamente 125 R$/tno ano 2006 (YAZDANI, GONZALEZ,2007). No Brasil, atualmente o preço FOB(Free on Board) do glicerol bruto varia de200 a 400 R$/t, sendo o valor do glicerolloiro (parcialmente tratado para remoçãode impurezas) de 600 a 800 R$/t. Estima-se que na próxima década, sempre que semantenha a tendência favorável para o bi-odiesel, o preço do glicerol co-produzidopoderia diminuir ainda mais.

Considerando a situação e a proje-ção para os próximos anos, a utilização doglicerol como substrato para fermentaçãopoderia torna-se vantajoso em relação aopreço de outros resíduos tradicionalmenteutilizados como fonte de carbono para aobtenção de bioprodutos. Por exemplo, opreço do melaço de cana de açúcar no mer-cado internacional varia entre os 120 e 170

R$/t, outro exemplo corresponde ao va-lor do bagaço de cana que oscila entre9,5 e 24 R$/t. Neste último caso, o baga-ço deve ser submetido a tratamentos físi-cos, químicos ou enzimáticos para dispo-nibilizar a glicose, o que elevaria o preçofinal do substrato. A produção industrialde biomoléculas por fermentação de gli-cerol economizaria custos de processos tra-dicionais que requerem etapas de eleva-do consumo energético para extração eacondicionamento do substrato (sacarosede cana de açúcar ou glicose de amido demilho).

O grande desafio no Brasil seráincentivar as pesquisas biotecnológicas que,timidamente, vem sendo desenvolvidas nopaís. Alem disso, facilitar a imediata trans-ferência tecnológica dessas descobertas naprópria usina de biodiesel, permitindo re-duzir custos de transporte para convertero biodiesel em um biocombustível de altarentabilidade econômica.

CONCLUSÃO

Desde que alguns governos estipularamnormativas que obriga a adição de biodi-esel ao combustível de petróleo, grandequantidade de glicerol vem sendo gera-da, tornando-se necessária a busca de al-ternativas para sua utilização. Numerosaspesquisas estão sendo desenvolvidas nes-se sentido, no entanto, os esforços aindaconstituem uma solução em longo prazopara a acumulação de glicerol. A biotec-nologia apresenta alternativas para a ob-tenção de produtos de alto valor agrega-do como bio-pesticidas, pigmentos, aro-mas, polímeros, antibióticos e proteínas re-combinantes. No entanto, é preciso estu-dar com maior detalhe aspectos de enge-nharia bioquímica como agitação, aeração,cinética de crescimento e obtenção de pro-dutos, e transferência de massa e energia.Estes parâmetros são considerados essen-ciais para entender os mecanismos de uti-lização de microrganismos assim como paraa otimização de processos, objetivando afutura ampliação de escala. Estratégias maisdetalhadas para a utilização biotecnológi-ca do glicerol são esperadas em poucosanos, de forma a reduzir os impactos am-bientais e tornar o biodiesel um produtoaltamente competitivo no mercado mun-dial de biocombustíveis.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiroda CAPES e o CNPq para o desenvolvi-mento de projetos de pesquisas.

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