GISELE DE FÁTIMA DIAS DINIZ ISOLAMENTO DE FUNGOS … · O fungo FA8 descoloriu parcialmente o meio...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL

BACHARELADO INTERDISCIPLINAR EM BIOSSISTEMAS

GISELE DE FÁTIMA DIAS DINIZ

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SOLO DA ANTÁRTICA

CONTAMINADO COM ÓLEO DIESEL

DE CRESCIMENTO E

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL

CAMPUS DE SETE LAGOAS




CONTAMINADO COM ÓLEO DIESEL E ANÁLISE DO POTENCIAL

CRESCIMENTO E DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

Sete Lagoas - MG

Fevereiro de 2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI



E ANÁLISE DO POTENCIAL

DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS




DE CRESCIMENTO E DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

Monografia apresentada como requisito

parcial para a obtenção do título de Bacharel

em Biossistemas pela Universidade Federal

de São João Del- Rei

Orientador: Prof. Dr. Juliano de Carvalho Cury

Sete Lagoas - MG

Fevereiro de 2014




DE CRESCIMENTO E DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

Monografia apresentada como requisito

parcial para a obtenção do título de Bacharel

em Biossistemas pela Universidade Federal

de São João Del- Rei

Aprovada em: __/__/____. ________________________________ _________________________________ Prof. Cléber José da Silva Prof. Leonardo Henrique França Lima (Membro da banca) (Membro da banca)

_________________________________ Prof. Juliano de Carvalho Cury

(Orientador)

AGRADECIMENTOS

A todos os professores que contribuíram para minha formação acadêmica, em especial

aos professores do Bacharelado Interdisciplinar em Biossistemas (BIB) da Universidade

Federal de São João de Del-Rei campus Sete Lagoas.

Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Antártico de Pesquisas Ambientais

(INCT-APA) pela concessão da bolsa de iniciação científica.

Ao meu orientador Juliano de Carvalho Cury que acreditou em mim desde o início e

abriu todos os caminhos para que esse e outros trabalhos se realizassem. Agradeço pelo

incentivo e pelos conhecimentos adquiridos durante o desenvolvimento da minha carreira

acadêmica.

A banca examinadora: Prof. Cléber José da Silva e Prof. Leonardo França Lima por

aceitarem o convite e por cederem uma parte de seu tempo na contribuição do meu trabalho.

A professora Ana Paula Coelho pela ajuda com as análises estatísticas dos resultados.

Aos meus colegas pelo apoio e companheirismo durante todo esse tempo de curso.

Aos meus pais por todo o amor, dedicação e amparo.

A todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho e

para o meu crescimento profissional e pessoal.

SUMÁRIO

RESUMO _________________________________________________________________ 5

ABSTRACT_______________________________________________________________ 6

1 | INTRODUÇÃO _________________________________________________________ 7

2 | OBJETIVOS ____________________________________________________________ 8

3 | REVISÃO DE LITERATURA

3.1 | Petróleo e seus derivados ________________________________________________ 8

3.2 | Contaminações em ambiente antártico ______________________________________ 9

3.3 | Efeitos dos hidrocarbonetos sobre a microbiota do solo_________________________ 10

3.4 | Biorremediação de hidrocarbonetos de petróleo _____________________________ 11

3.5 | Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos ___________________________ 13

3.6 | Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos__________________ 14

4 | MATERIAL E MÉTODOS________________________________________________ 16

5 | RESULTADOS_________________________________________________________ 19

6 | DISCUSSÃO___________________________________________________________ 20

7 | CONCLUSÕES_________________________________________________________ 22

8| REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS________________________________________ 23

9 | ANEXOS______________________________________________________________ 28

RESUMO

A contaminação do meio ambiente com hidrocarbonetos constitui um grave problema e tem

se tornado mais frequente nos últimos anos devido ao aumento da utilização de petróleo e

seus derivados. Contaminações no ambiente antártico ocorrem principalmente devido a

vazamentos dos tanques que armazenam o óleo diesel para geração de energia nas estações de

pesquisa. Microrganismos que apresentam capacidade de utilizar hidrocarbonetos como fonte

de energia são importantes ferramentas biotecnológicas para remediação de ambientes

contaminados com esses poluentes. Com o objetivo de isolar fungos do solo contaminado da

Antártica foram utilizadas técnicas de diluição seriada e meios de cultura com diferentes

concentrações. Amostras do solo foram coletadas no entorno da Estação de Pesquisa

Brasileira na Antártica (EACF- Estação Antártica Comandante Ferraz). Diluições seriadas

(100 a 10-5) do solo foram adicionadas, em triplicada, a dois meios de cultura, Sabouraud

Dextrose Agar (SDA) e Potato Dextrose Agar (PDA) em concentrações de 1× e 0,1×. Com

essa metodologia foi possível isolar doze macromorfotipos de fungos. Posteriormente, foi

analisado o crescimento de quatro fungos filamentosos em contato com o óleo diesel utilizado

na EACF e analisado o potencial de biodegradação de hidrocarbonetos por onze destes

fungos. Para o teste de crescimento dos fungos na presença do contaminante, diferentes

concentrações de óleo diesel (0%, 2%, 5% e 10%) foram adicionadas ao meio de cultura. A

quantificação do crescimento se deu pelo método de peso seco da biomassa microbiana. Para

avaliar a capacidade dos fungos em degradarem os hidrocarbonetos presentes no óleo foi

adicionado ao meio mineral o indicador DCPIP, que promove a mudança na coloração do

meio de azul para incolor em caso positivo. Os resultados do primeiro teste mostraram que

não houve interrupção no crescimento dos fungos nas diferentes concentrações de óleo, sendo

que maiores taxas de crescimento de dois isolados (FA6 e FA12) ocorreram na presença desse

composto. Concentrações mais elevadas de óleo diesel (5% e 10%) reduziram o crescimento

de um dos fungos (FA2). O fungo FA7 não apresentou diferença de crescimento em nenhum

dos tratamentos empregados. Dos onze fungos testados quanto ao potencial de degradação,

cinco deles descoloriram o meio contendo o indicador DCPIP. A descoloração ocorreu em 96

horas pelos fungos FA2 e FA7 e em sete dias pelos fungos FA5, FA6 e FA12. Nenhuma

descoloração do meio inoculado com os fungos FA1, FA3, FA4, FA9 e FA11 foi observada.

O fungo FA8 descoloriu parcialmente o meio de cultura após sete dias.

Palavras-chave: fungos, hidrocarbonetos, Antártica, solos

ABSTRACT

The environmental contamination by hydrocarbons is a current environmental problem that

become more frequent in recent years due to the increasing use of oil and its derivatives.

Contamination on the Antarctic environment are mainly due to leaks from tanks that store

diesel fuel for power generation at the research stations. Microorganisms that use

hydrocarbons as energy source are important for remediation of contaminated environments

with these pollutants. In order to isolate fungi from oil-contaminated Antarctic soil, we used

serial dilution techniques and culture media with different concentrations. Soil samples were

collected in the vicinity of the Brazilian Research Antarctic Station (EACF – Estação

Antártica Comandante Ferraz). Serial dilutions (100 to 10-5) of soil were added in triplicate to

two culture media, Sabouraud Dextrose Agar (SDA) and Potato Dextrose Agar (PDA)

concentrations of 1× and 0.1×. With this methodology it was possible to isolate twelve

morphotypes of fungi. Subsequently, we analyzed the growth of four filamentous fungi in

contact with diesel oil used in EACF and analyzed the potential for biodegradation of

hydrocarbons by eleven of these fungi. To test the growth of fungi in presence of the oil,

various concentrations of diesel (0%, 2%, 5% and 10%) were added to the culture media. For

the quantification of the growth we used the method of the microbial biomass dry weight. To

evaluate the ability of the fungi to degrade the hydrocarbons present in oil, we added the

DCPIP to the media. The DCPIP indicator change in color from blue to colorless if

hydrocarbon oxidation occurs. The results of the first test showed the no interruption of the

growth of fungi in various oil concentrations. Two of the isolates presented higher growth

rates (FA6 and FA12) in the presence of the oil. Higher concentrations of diesel oil (5% and

10%) reduced growth of the FA2 fungus. The growth of the FA7 fungus showed no difference

between treatments. Five of the eleven fungi tested were capable to discolor the media

containing DCPIP. Discoloration occurred within 96 hours for fungi FA2 and FA7 and within

seven days for fungi FA5, FA12 and FA6. No discoloration of the medium inoculated with

fungi FA1, FA3, FA4, FA9 and FA11 was observed. The FA8 fungus bleached the culture

media containing DCPIP in seven days.

Keywords: fungi, hydrocarbons, Antarctic soils

7

1. INTRODUÇÃO

Com o aumento da utilização de petróleo e seus derivados, maiores são os riscos de

derramamentos no solo em decorrência do armazenamento, transporte e utilização desses

compostos (Jacques et al., 2007). Mesmo as regiões remotas do planeta, como a Antártica,

estão sujeitas a essas contaminações devido às atividades de pesquisa e turismo, que

dependem do uso de combustíveis derivados de petróleo para a geração de energia. As

contaminações em ambiente antártico ocorrem principalmente em decorrência do vazamento

de tanques de combustíveis que estão localizados no entorno das estações de pesquisa

(Aislabie et al., 2004). Diante desses acontecimentos, surgiu a necessidade de maiores

investimentos para a prevenção e para o desenvolvimento de práticas mais eficientes na

remoção desses poluentes.

A biorremediação pode ser considerada como uma boa alternativa para a correção

desses solos por se tratar de uma técnica simples e de eficiência comprovada. Microrganismos

que apresentam capacidade de degradar hidrocarbonetos podem ser encontrados em diferentes

ecossistemas, incluindo ambientes extremos como a Antártica. Dentre os microrganismos que

apresentam a capacidade de transformar esses compostos em formas menos tóxicas estão as

bactérias e os fungos leveduriformes e filamentosos. Diversos trabalhos tem comprovado o

potencial de bactérias e leveduras em degradar esses hidrocarbonetos. No entanto, menos

atenção tem sido dada a essa capacidade de degradação por fungos filamentosos (Singleton,

2001).

Os fungos, como organismos decompositores na natureza, são eficientes em degradar

diversos compostos, entre eles compostos tóxicos e de grande recalcitrância no ambiente

(Malaviya & Rathore, 2007; Gadd, 2007). Alguns autores têm demonstrado através de seus

trabalhos que esses microrganismos apresentam capacidade de degradar hidrocarbonetos de

petróleo através de suas enzimas extracelulares. Os fungos apresentam capacidade de

localizar nutrientes a maiores distâncias através da extensão de suas hifas (Vidali, 2001).

Diante disso, trabalhos envolvendo fungos na degradação de hidrocarbonetos de petróleo se

tornam uma área atrativa e promissora.

O isolamento de microrganismos diretamente do solo contaminado é uma estratégia

eficaz para selecionar fungos com potencial para degradar os hidrocarbonetos, já que alguns

estudos têm mostrado que após um derrame de derivados de petróleo no solo ocorre um

enriquecimento de microrganismos que utilizam esses compostos como fonte de energia,

8

geralmente refletindo o grau de contaminação do ecossistema (Korda et al., 1997). Da mesma

forma, testes posteriores de crescimento dos fungos isolados em meio rico em óleo diesel são

eficientes para selecionar estirpes tolerantes ao óleo e que apresentam potencial para serem

utilizadas em processos futuros de biorremediação.

2. OBJETIVOS

Obter isolados de fungos a partir do solo da Antártica contaminado com óleo diesel

utilizando diferentes meios de cultura em diferentes concentrações.

Testar os fungos isolados quanto à capacidade de crescer na presença do óleo diesel.

Testar os fungos isolados quanto à capacidade de utilizar hidrocarbonetos de óleo

diesel como fonte de carbono e energia.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Petróleo e seus derivados

De acordo com os dados da agência internacional de energia (AIE - http://www.iea.org),

87% de todo o combustível consumido no mundo é de origem fóssil: carvão mineral, gás

natural e petróleo. Dentre esses combustíveis, o petróleo é o mais explorado e utilizado.

Mesmo com o surgimento de tecnologias alternativas de utilização de recursos renováveis,

como uma nova perspectiva para a produção de energia, o petróleo ainda é o recurso que

predomina devido aos fatores econômicos e políticos (Timmis & Pieper, 1998).

O petróleo é constituído, essencialmente, de carbono e hidrogênio (90% dos óleos crus),

com quantidades relativamente pequenas de compostos orgânicos sulfurados, nitrogenados,

oxigenados e organometálicos (Oliveira et al., 2008). Predominam os hidrocarbonetos como

os alcanos (hidrocarbonetos de cadeia aberta), os cicloalcanos (os quais incluem todos os

hidrocarbonetos cujos átomos estão arranjados em forma de anel) e os hidrocarbonetos

aromáticos (caracterizados pela presença de ao menos um anel de benzeno) (Planckaert,

2005).

Toda a energia utilizada no continente antártico é proveniente de derivados de petróleo,

sendo o diesel ártico DFA (Diesel Fuel Arctic) o combustível mais utilizado. Esse

combustível é constituído principalmente por hidrocarbonetos alifáticos saturados (64%) e

9

hidrocarbonetos aromáticos (35%), além dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs)

(Yergeau et al., 2009).

Os HAPs são hidrocarbonetos aromáticos com dois ou mais anéis de benzeno fundidos

em arranjos lineares. Eles são formados como subprodutos da combustão de combustíveis

fósseis, sendo introduzidos no ambiente em grandes quantidades devido às atividades

relacionadas à extração, ao transporte, ao refino, à transformação e à utilização do petróleo e

de seus derivados. Devido às suas propriedades tóxicas, mutagênicas e carcinogênicas os

HAPs são motivo de grande preocupação ambiental (Cerniglia, 1993).

Ao longo dos últimos anos, derramamentos e acidentes com óleo e derivados de

petróleo têm contribuído para o aumento da contaminação ambiental. Por se tratar de

substâncias relativamente estáveis e recalcitrantes no solo, são mais difíceis de serem

removidos por tratamentos que são empregados com sucesso na remoção de outros compostos

tóxicos (Wilson & Jones, 1993). O grau de persistência e a biodegradabilidade dos

hidrocarbonetos no ambiente são influenciados por diversos fatores como a natureza do

contaminante, a concentração desses compostos no solo, além das características físicas,

químicas e biológicas do solo (Balachandran et al., 2012).

3.2 Contaminações em ambiente antártico

O crescimento das atividades antrópicas na Antártica tem aumentado

significativamente a utilização de derivados de petróleo nesse ambiente. As principais

atividades no continente antártico são a pesquisa, o turismo e a pesca, que dependem da

utilização de combustíveis fosseis para o fornecimento de energia. Estima-se que

aproximadamente 90 milhões de litros de combustíveis são utilizados a cada ano para as

atividades de pesquisas científicas na Antártica, sendo o óleo diesel o combustível mais

utilizado (Cripps & Shears, 1997). Esse elevado consumo aumenta o risco de derramamentos

de hidrocarbonetos no solo, representando uma ameaça à vida marinha e à biota terrestre da

região (Aslaibie et al.,1998).

Embora se tenha um grande número de investigações sobre o efeito das contaminações

por hidrocarbonetos nos ecossistemas marinhos da Antártica, pouco se sabe ainda sobre esses

efeitos sobre os solos da região. O que se sabe é que as contaminações nesses ecossistemas se

apresentam como um problema ainda maior, já que a recuperação do solo em regiões frias

ocorre bem mais lentamente que nas regiões mais quentes. Isso ocorre devido aos efeitos da

10

temperatura sobre o metabolismo microbiano e a natureza do óleo derramado. As baixas

temperaturas tornam o óleo mais viscoso e reduzem a volatilização de compostos de baixa

massa molecular, retardando o processo de biodegradação (Aslaibie et al., 2001).

Os derramamentos sobre o solo antártico ocorrem em torno das estações científicas,

onde os combustíveis ficam armazenados e são utilizados para o abastecimento de veículos e

aeronaves (Cripps & Priddle, 1991). O número de casos de contaminação por hidrocarbonetos

nas áreas próximas às estações de pesquisa na Antártica tem crescido nos últimos anos

(Mazzera et al.,1999).

No ano de 1986 ocorreu um vazamento dessa natureza na estação brasileira de

pesquisa na Antártica, Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF). O vazamento de um

dos tanques de combustível que abastece o local causou o derramamento de mais de 20 mil

litros de óleo diesel, contaminando o solo na área frontal da Estação. Vinte e sete anos após

esse ocorrido o óleo diesel ainda é perceptível no solo onde ocorreu o derramamento. A

persistência do óleo na área provavelmente se deve às limitações que a região impõe sobre o

processo de degradação natural promovida pelos microrganismos degradadores.

3.3 Efeito dos hidrocarbonetos sobre a microbiota do solo

Entender os efeitos dos hidrocarbonetos sobre o solo e sua microbiota é fundamental

para qualquer tentativa de controlar ou remediar o solo contaminado. Esses efeitos dependem

principalmente da composição química do óleo e das espécies de microrganismos presentes

no solo (Al-Nasrawi, 2012). Após um derramamento de óleo o solo impactado sofre

alterações na estrutura de suas comunidades microbianas, ocorrendo a eliminação de

microrganismos sensíveis aos hidrocarbonetos e um aumento no número de microrganismos

com capacidade de degradar tais poluentes, elevando a atividade microbiana nesse local. Esse

efeito indica que os hidrocarbonetos do solo podem servir como substrato para o crescimento

microbiano (Aislaibie et al., 2004). Em solos não contaminados as populações nativas de

microrganismos degradadores constituem menos de 1% da comunidade microbiana total. No

entanto, quando o solo é contaminado por derivados de petróleo ocorre um aumento de 10%

da comunidade total desses microrganismos (Atlas, 1995).

Após um derramamento de óleo em solos de regiões frias ocorrem alterações na

microbiota natural de psicrotolerantes, havendo uma redução na abundância e diversidade

desses microrganismos e um aumento no número de organismos degradadores (Ruberto et al.,

11

2008).

Em um trabalho sobre os efeitos do óleo sobre os microrganismos, Ferrari et al. (2011)

analisaram o aumento das concentrações de óleo diesel sobre a diversidade de fungos isolados

de uma ilha subantártica e obtiveram um aumento de espécies em concentrações inferiores de

óleo e uma diminuição da diversidade em concentrações mais elevadas.

A seleção de microrganismos através de testes sucessivos de crescimento em meio de

cultura rico em petróleo e derivados é uma estratégia eficiente para avaliar a adaptação e

sobrevivência de estirpes tolerantes às diferentes concentrações de óleo. Os resultados desses

testes indicam quais os microrganismos podem estar utilizando os hidrocarbonetos como

fonte de energia e que apresentam potencial para serem aplicados em processos de

biorremediação (Rivera-Cruz et al., 2002).

3.4 Biorremediação de hidrocarbonetos de petróleo

Diferentes técnicas são empregadas atualmente para a recuperação de áreas

contaminadas com hidrocarbonetos. Após um derramamento de óleo, normalmente é feita a

remoção mecânica dos resíduos pela lavagem do solo, extração com vapor, dispersão e

aterramento do material contaminado. No entanto, essas práticas apresentam custos elevados e

nem sempre resultam na decomposição completa do contaminante (Das & Chandran, 2010).

Para a remediação dos solos em ambientes como a Antártica, é importante que as técnicas

adotadas apresentem baixo consumo de energia e requisitos de infraestrutura, sejam fáceis de

instalar e operar e, principalmente, não gerem impactos ainda maiores sobre o meio ambiente

(Aislabie et al., 2004).

Diante disso, novas alternativas vêm sendo utilizadas com sucesso no tratamento

desses ambientes contaminados, entre elas a biorremediação, técnica que consiste em utilizar

microrganismos com capacidade de modificar ou decompor os poluentes alvos através de

processos bioquímicos. Essa tecnologia aplicada à remediação dos hidrocarbonetos parte do

princípio de que grande parte dos componentes do petróleo é degradada na natureza, onde

microrganismos utilizam esses compostos como fonte de carbono para seus processos

metabólicos em condições aeróbicas e anaeróbicas (Atlas, 1981, 1995). A biorremediação

explora a diversidade genética e metabólica dos microrganismos para a tranformação dos

contaminantes em formas menos tóxicas, que poderão ser integradas nos ciclos

biogeoquímicos naturais (Alexander, 1994).

12

A eficácia do processo de biorremediação depende da capacidade dos microrganismos

utilizados em metabolizar os compostos tóxicos do local a ser tratado, bem como das

condições ambientais que irão favorecer o desenvolvimento adequado da comunidade

microbiana local. Essas condições incluem temperatura, pH e umidade adequada, aeração do

solo e disponibilidade de nutrientes (Thiele & Brümer, 2002).

A biorremediação pode ser realizada por dois métodos: bioestímulo e bioaumento

(Bento et al., 2003). O benefício desses processos é a mineralização do poluente, isto é, a

transformação em gás carbônico, água e biomassa, que pode ser assimilada com segurança na

cadeia alimentar (Atlas, 1995).

O processo de bioestímulo busca principalmente favorecer as atividades da população

microbiana local através do condicionamento do habitat natural desses microrganismos. Para

isso, é feita a correção do local a ser tratado incorporando-se nutrientes, corrigindo-se a

umidade e a concentração de oxigênio, o que permite aumentar a taxa de crescimento e as

atividades metabólicas dos microrganismos. Para que esse processo seja eficiente é

importante que os microrganismos indígenas sejam capazes de degradar o poluente alvo. O

bioestímulo, quando utilizado, é capaz de acelerar o processo natural e diminuir o tempo de

descontaminação no local, oferecendo custos mais baixos quando comparados às demais

técnicas de biorremediação (EPA, 2004).

O processo de bioaumento consiste em introduzir no local contaminado

microrganismos com potencial de degradação dos hidrocarbonetos. Esses microrganismos

podem ser isolados diretamente dos solos contaminados ou podem ser obtidos a partir de um

estoque de microrganismos que tiveram seu potencial de degradação comprovado

anteriormente (Sarkar et al., 2005). Esse método é adotado principalmente quando se deseja a

biodegradação rápida do poluente e a redução no período de adaptação que antecede a

degradação pelos microrganismos. Para que o processo de bioaumento seja eficaz é

importante que os microrganismos apresentem características como capacidade de degradar a

maior parte dos contaminantes e de competir com a população intrínseca do solo, estabilidade

genética e um alto grau de atividade enzimática. Além disso, não devem produzir qualquer

substância tóxica durante o processo de biodegradação (Leahy & Colwell, 1990).

A técnica de biorremediação é amplamente aceita e de eficiência comprovada em

regiões de clima tropical e temperado e atualmente vem se tornando uma solução para a

descontaminação de solos de climas frios (Sanscartier et al., 2009). Se comparada aos

métodos físicos e químicos utilizados na remoção de hidrocarbonetos de petróleo, a

13

biorremediação apresenta vantagens como simplicidade na implantação e manutenção, baixo

custo, aplicação em grande escala e possibilidade da remoção completa dos contaminantes.

No entanto, o sucesso dessa técnica depende de inúmeros fatores como o conhecimento

acerca dos microrganismos utilizados e seu potencial de biodegradação, além do

conhecimento sobre o histórico da área e a natureza do poluente (Bento et al., 2005).

A aplicação de técnicas de biorremediação em ambiente antártico requer a utilização

de microrganismos nativos, uma vez que o Protocolo do Tratado da Antártida (ANTARCTIC

TREATY CONSULTATIVE PARTIES, 1991) proíbe a introdução de organismos estranhos

àquele ambiente. Além disso, os microrganismos nativos da Antártica estão adaptados a

crescer e sobreviver em meio às condições existentes nos solos da região, que quando

descongelados no verão são pobres em nutrientes, secos, frios e frequentemente alcalinos

(Aslaibie et al., 1998). Assim, é importante que se realizem trabalhos de isolamento,

caracterização e avaliação do potencial de degradação de microrganismos já presentes no

solo.

3.5 Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos

A biodegradação por populações naturais de microrganismos constitui um dos

mecanismos primários pelos quais o petróleo e seus derivados podem ser eliminados do

ambiente (Das & Chandran, 2010). Em muitos ecossistemas existe uma comunidade de

microrganismos autóctones capazes de degradar esses hidrocarbonetos. Essa habilidade não é

restrita apenas a alguns gêneros de microrganismos, pois vários grupos de bactérias e fungos

têm demonstrado essa capacidade (Kataoka, 2001).

Alguns trabalhos sobre derramamentos de hidrocarbonetos em regiões polares

mostram que microrganismos degradadores estão amplamente distribuídos nessas regiões e

seus números são geralmente elevados após um derramamento de óleo (Atlas, 1986). No

entanto, a grande maioria dos estudos se concentra na biodegradação de hidrocarbonetos por

bactérias e leveduras. Menos atenção tem sido dada à capacidade de degradação dos

derivados de petróleo por fungos filamentosos (Oudot et al.,1993).

Os fungos, como organismos decompositores, possuem a capacidade de degradação de

diversos compostos orgânicos, incluindo xenobióticos. Por isso, podem ser utilizados em

processos de biorremediação de solos contaminados com diferentes poluentes (Gadd, 2007),

entre eles os hidrocarbonetos de petróleo. Em particular, os fungos filamentosos têm sido

14

empregados com sucesso na degradação de hidrocarbonetos de petróleo (Hugnes & Bridge,

2010). Esses microrganismos apresentam potencial em degradar hidrocarbonetos de alta

massa molecular e outros compostos orgânicos persistentes através de suas enzimas

extracelulares, se apresentando como uma área atrativa para investigação (Atagana et al.,

2006). Em vantagem às bactérias, os fungos conseguem expandir suas hifas possibilitando

localizar os nutrientes a distâncias maiores, além de serem capazes de crescer sob condições

adversas, com baixa disponibilidade de água e nutrientes e em baixos valores de pH,

condições que normalmente seriam limitantes ao crescimento bacteriano (Davis & Westlake,

1978). Ao contrário das bactérias e leveduras, que apresentam capacidade reduzida de

degradação com o aumento do tamanho da cadeia carbônica dos compostos, os fungos

filamentosos parecem ser mais hábeis em degradar hidrocarbonetos de estrutura complexa e

cadeia longa (Walker et al., 1975).

Os principais fungos já descritos na literatura capazes de metabolizar os

hidrocarbonetos de petróleo são pertecentes aos gêneros Acremonium, Aspergillus, Candida,

Chrysosporium, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Mortierella, Penicillium,

Rhodotorula, Saccharomyces, Trichoderma, Trichosporon, Mucor, Rhizopus e Phanerochaete

(Bartha & Atlas, 1987).

Em um trabalho, April et al. (2000) isolaram 64 espécies de fungos filamentosos de

um solo no Canadá. Esses fungos foram crescidos em meio de cultura contendo óleo cru

como única fonte de carbono. Os resultados indicaram que entre os fungos testados, espécies

representantes de seis ordens do filo Ascomycota apresentaram boa capacidade para degradar

os hidrocarbonetos. Aislabie et al. (2001) conseguiram isolar a partir do solo contaminado de

três locais diferentes da Antártica números elevados de Phialophora sp. Nas amostras do solo

sem contaminação, Chrysosporium sp. e Geotrichum sp. foram os microrganismos

dominantes. Os resultados desse trabalho indicam que possivelmente Phialophora sp.

apresenta capacidade de degradação de hidrocarbonetos.

3.6 Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos por fungos

Para que ocorra o processo de degradação e os hidrocarbonetos sejam utilizados como

fonte de carbono e energia é importante que os microrganismos possuam enzimas específicas

para transformar as complexas moléculas desses compostos em intermediários comuns das

suas rotas metabólicas (Jacques et al.,2007).

15

As vias envolvidas nesse processo podem ser aeróbicas ou anaeróbicas. Na via

aeróbica o oxigênio atua como receptor de elétrons e os contaminantes são utilizados pelos

microrganismos como fonte de carbono (doador de elétrons). Para que essa reação ocorra e os

hidrocarbonetos atuem como doadores de elétrons é necessário que haja oxigênio dissolvido

suficiente no meio (Aelion & Bradley, 1991). Nesse processo são originados como produtos

finais dióxido de carbono, água e biomassa celular. Em caso de ausência ou em condições

limitadas de oxigênio a degradação microbiana pode ocorrer em condições anaeróbicas. Neste

caso, os microrganismos utilizam outras substâncias disponíveis no meio tais como nitrato,

ferro, sulfato, manganês e dióxido de carbono como receptores de elétrons, produzindo

dióxido de carbono e metano como produtos finais (Gan et al.,2009).

A biodegradação anaeróbica dos hidrocarbonetos aromáticos é um processo lento e

seu mecanismo bioquímico ainda não foi bem descrito (Coates et al., 1996). As vias

metabólicas de degradação dos hidrocarbonetos melhores descritas são do metabolismo

aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos degradadores de lignina (lignolíticos) e pelos

fungos não-lignolíticos (Jacques et al., 2007).

Após a assimilação dos hidrocarbonetos pelos fungos, a degradação é iniciada por uma

reação de hidroxilação pela via enzimática citocromo P-450 monooxigenase. Através desse

processo ocorre a oxidação do anel aromático com a formação de óxidos arenos (epóxidos).

Os óxidos podem sofrer ação das enzimas epóxido hidrolases formando trans-dihidrodióis ou

pode ocorrer o rearranjo de um dos anéis a fenol e ser conjugado, originando compostos como

O-glicosídeos e O-glicoronídeos (Cerniglia, 1984). As reações ocorridas em qualquer uma

dessas fases podem ser consideradas como medidas de desintoxicação se os produtos gerados

forem menos tóxicos que os hidrocarbonetos originais (Cerniglia et al., 1985) (Figura 1).

Os fungos lignolíticos possuem vias alternativas para a degradação dos compostos

aromáticos. Essa degradação ocorre pela ação de enzimas extracelulares de baixa

especificidade, sendo a lignina peroxidase (Lip), a manganês peroxidase (Mnp) e a lacase as

principais enzimas envolvidas (Leonowicz et al., 1999). Nesse processo os hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos são degradados, havendo principalmente a formação de quinonas.

Alguns fungos lignolíticos apresentam capacidade de metabolizar os HPAs quinonas pela

clivagem dos anéis aromáticos com posterior quebra e formação de dióxido de carbono

(Hammel, 1995) (Figura 1).

16

Figura 1- Vias metabólicas de degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos por fungos.

Fonte: adaptado de Cerniglia (1997).

Devido ao grande número de enzimas envolvidas no processo de degradação dos

hidrocarbonetos, a maioria dos microrganismos presentes no solo não é capaz de degradar

esses compostos individualmente. Diante disso, é necessário isolar e selecionar um consórcio

de microrganismos que apresentem essa capacidade para serem utilizados em processos de

biorremediação (Alexander, 1999).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta das amostras do solo

A amostra de solo da Antártica utilizada no isolamento dos fungos foi coletada em

Janeiro de 2012 em uma área próxima à Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) cujo

solo está contaminado com óleo diesel. A coleta foi feita com espátula esterilizada e o solo foi

colocado em quatro frascos de polipropileno estéreis de 50 ml cada um. Os frascos foram

transportados refrigerados até o Laboratório de Microbiologia Molecular do Campus Sete

Lagoas- UFSJ e mantidos sob esta condição até o momento do processamento das amostras.

4.2 Crescimento, isolamento e manutenção dos fungos

Para a obtenção dos fungos, 20 gramas da amostra de solo foram adicionados a 200 ml

de solução salina autoclavada (NaCl 0,9%), em um erlenmeyer que foi posteriormente

17

mantido sob agitação de 250 rpm por 10 minutos. Posteriormente, 2 ml da solução foi

transferida para um tubo contendo 18 ml de solução salina autoclavada para, sem seguida, se

realizar as diluições seriadas (100 a 10-5). De cada diluição foi retirado 1 ml e espalhado em

placas de petri grandes (150x21mm), em triplicata, contendo meio de cultura sólido para

crescimento de fungos onde foi previamente espalhado na superfície 100 µl do antibiótico

amoxicilina (25 mg.ml-1) para inibir o crescimento de bactérias (Figura 2).

Os meios de cultura utilizados foram o SDA (Sabouraud Dextrose Agar) e o PDA

(Potato Dextrose Agar) nas concentrações de 1× e 0,1×. Após a inoculação com a solução do

solo, as placas foram seladas e armazenadas em BOD a 15°C durante 21 dias. Durante este

período foi feito o isolamento de diferentes macromorfotipos.

O isolamento foi feito transferindo-se discos de 5 mm de diâmetro da cultura para o

centro de uma placa contendo o meio sólido. A manutenção dos isolados em meio SDA foi

feita através de repicagens consecutivas e armazenamento a 15°C.

Para cada isolado foi dada uma identificação provisória de FA (fungo da antártica) e

numeração crescente.

Figura 2 - Metodologia utilizada para o isolamento dos fungos do solo contaminado da Antártica.

18

4.3. Crescimento dos fungos em contato com óleo diesel utilizado na EACF

Para avaliar a capacidade dos fungos isolados de crescerem na presença do óleo diesel

utilizado na EACF, foram selecionados quatro fungos (FA2, FA6, FA7 e FA12) que

apresentaram crescimento mais acelerado em meio SDA. Um disco de 5mm de diâmetro da

borda do micélio do fungo crescendo nesse mesmo meio foi inoculado, em triplicata, em

papéis de filtro estéreis colocados sobre a superfície do meio SDA enriquecido com o óleo

diesel utilizado na EACF nas concentrações de 0% (controle), 2%, 5% e 10%. O óleo foi

anteriormente filtrado em membrana de 0,22 µm de poro. A incubação foi realizada em

temperatura de 15ºC até o momento em que as hifas dos fungos começaram a atingir a borda

da placa. Posteriormente, os filtros com as hifas associadas foram secos em estufa a 60ºC por

48 horas e em seguida pesados. Os pesos foram obtidos subtraindo-se o peso do filtro após o

crescimento dos fungos. Os dados gerados nesse teste foram analisados por meio do programa

estatístico SISVAR e as médias comparadas pelo teste de Skott-Knott a 5% de probabilidade.

4.4 Avaliação do potencial de degradação de hidrocarbonetos

Para a análise do potencial de degradação dos fungos crescidos em meio com óleo

diesel foi utilizada a metodologia de Hanson et al. (1993), que consiste em adicionar ao meio

de cultura o indicador redox 2,4 diclorofenol-indofenol – DCPIP. Durante a oxidação

microbiana dos hidrocarbonetos, elétrons são transferidos até aceptores como o oxigênio,

nitrato e sulfato. Ao incorporar um aceptor de elétron como o DCPIP ao meio de cultura, é

possível avaliar a capacidade dos microrganismos em utilizar hidrocarbonetos como substrato

pela observação da mudança de cor do meio de azul (oxidado) para incolor (reduzido).

Para esse teste, foram preparados frascos contendo 3ml do meio mineral de Bushneel

Haas (BH) (1g de KH2PO4, 1g de K2HPO4, 1g de NH4NO3, 0,2g de MgSO4.7H2O, 0,05g de

FeCl3, 0,02g de CaCl2.2H2O, para 1L de H2O) autoclavado por 15min a 121ºC. Foi

adicionado em cada frasco o óleo diesel utilizado na EACF na concentração de 1% e o

indicador DCPIP. Posteriormente, em cada frasco foi adicionado um disco de 5mm de

diâmetro da borda do micélio de onze fungos crescidos no meio Bushneel Haas sem fonte de

carbono. Foram utilizados dois tipos de controle negativo: um abiótico (sem o inóculo) e um

19

controle biótico (sem o óleo diesel). A incubação dos frascos foi feita em temperatura de 15ºC

por sete dias e a mudança de cor no meio de cultura foi monitorada diariamente.

5. RESULTADOS

5.1 Fungos isolados

A partir das amostras do solo contaminado da Antártica foram obtidos doze

morfotipos de fungos, sendo dez fungos filamentosos e dois leveduriformes. Esses fungos

foram identificados inicialmente como FA1 a FA12 e estão sendo mantidos em uma pequena

coleção no Laboratório de Microbiologia Molecular do Campus Sete Lagoas - UFSJ. Os

fungos FA1, FA2, FA3 e FA4 foram isolados do meio PDA 0,1× na diluição 10-1. Os fungos

FA5, FA6 e FA7 foram isolados do meio PDA 0,1× na diluição 10-2. Os fungos FA8 e FA9

foram isolados do meio PDA 1× na diluição 10-2. Os fungos FA10 e FA11 foram isolados do

meio PDA 1× na diluição 10-1. O fungo FA12 foi isolado do meio SDA 1× na diluição 10-1. A

Figura 1 dos anexos mostra a característica macromorfológica de cada fungo.

5.2 Crescimento dos fungos em meio contendo óleo diesel

Não foram observadas interrupções no crescimento de nenhum dos fungos expostos às

diferentes concentrações do óleo diesel (Figuras 2, 3, 4 e 5 dos anexos). Diferenças no

crescimento e na tolerância ao óleo diesel foram observadas nos diferentes isolados. Os

resultados referentes ao crescimento desses fungos estão apresentados na Tabela 1.

O fungo FA2 apresentou maior crescimento no tratamento controle (0%) e na

concentração de 2% de óleo. Menor crescimento desse fungo foi observado nas concentrações

de 5% e 10% do óleo diesel.

O fungo FA6 apresentou crescimento significativamente maior na concentração de

10% de óleo diesel, comparando-se ao tratamento controle e as demais concentrações.

O fungo FA7 não apresentou diferença significativa de crescimento entre os

tratamentos, indicando que o óleo diesel adicionado ao meio de cultura não favoreceu e nem

inibiu o crescimento desse fungo.

20

O fungo FA12 apresentou crescimento significativamente maior na presença do óleo

diesel comparando-se ao controle. No entanto, esse crescimento não diferiu entre as diferentes

concentrações de óleo utilizadas.

Tabela 1. Valores médios de peso de biomassa seca de fungos isolados de solo da Antártica contaminado com hidrocarbonetos crescidos em meio BH contendo óleo diesel.

Concentração de óleo Peso seco da biomassa (mg) (%) FA2 FA6 FA7 FA12

0 354,3 a 180,8 a 167,2 a 151,8 a

2 426,4 a 163,8 a 185,8 a 221,6 b

5 268,8 b 160,4 a 215,8 a 225,0 b

10 244,3 b 319,3 b 167,2 a 209,9 b

Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância.

5.3 Avaliação do potencial de degradação de hidrocarbonetos

Dos onze fungos analisados, dois deles (FA2 e FA7) promoveram a oxidação

biológica do indicador DCPIP após 96 horas em contato com o óleo diesel, evidenciada pela

mudança da coloração do meio de azul para incolor. Os fungos FA5, FA6 e FA12

descoloriram o meio após sete dias de incubação. O fungo FA8 descoloriu parcialmente o

meio após sete dias. Cinco fungos (FA1, FA3, FA4, FA9 e FA11) não apresentaram

descoloração do meio no período de sete dias de teste. Os tratamentos de controle biótico e

abiótico permaneceram com a coloração azul durante todo o período do teste, como mostrado

na figura 6 dos anexos.

6. DISCUSSÃO

Nesse trabalho, a utilização de concentrações altas e baixas de nutrientes (1× e 0,1×)

na preparação do meio, bem como meios de culturas diferentes (PDA e SDA) se mostraram

uma estratégia eficiente para a recuperação de diferentes morfotipos de fungos a partir do solo

contaminado da EACF. Como foi proposto por Ferrari et al. (2011), a adoção de novas

metodologias para o isolamento de diferentes fungos a partir de um solo contaminado com

hidrocarbonetos devem ser adotadas afim de recuperar espécies que apresentam potencial para

serem utilizados em processos de biorremediação. Essas técnicas são eficientes para isolar

21

espécies que apresentam diferenças no tempo de crescimento e a capacidade de crescer em

meios com altos e baixos teores de nutrientes.

Os fungos isolados nesse trabalho foram capazes de tolerar o óleo diesel adicionado ao

meio de cultura. Nenhuma interrupção no crescimento dos diferentes morfotipos foi

observada nas diferentes concentrações de óleo utilizadas. Esse efeito se deve possivelmente

ao fato de que os fungos analisados foram isolados a partir do solo da EACF que apresenta

longo histórico de contaminação com derivados de petróleo. Em um trabalho similar que

avaliou a tolerância de fungos da Antártica aos hidrocarbonetos, Hugnes et al. (2006)

obtiveram um resultado que mostra que os fungos isolados de um solo menos contaminado

com hidrocarbonetos apresentaram-se menos tolerantes do que os fungos isolados a partir de

um solo altamente impactado. O autor explica que esse efeito pode ocorrer devido ao

enriquecimento do solo com microrganismos que degradam os hidrocarbonetos durante

derramamentos anteriores de óleo.

A biomassa de dois fungos isolados, FA6 e FA12, aumentou na presença do óleo

diesel adicionado ao meio de cultura. Esse resultado indica a possibilidade desses fungos

estarem utilizando esse composto como fonte de carbono e energia, o que deve ser melhor

estudado em trabalhos posteriores. Através de enzimas extracelulares esses microrganismos

podem promover a quebra das moléculas dos hidrocarbonetos, convertendo esses compostos

em produtos que podem ser absorvidos para o seu crescimento (Adekunle & Adebambo,

2007). No teste de degradação esses mesmos fungos com maior crescimento na presença de

óleo apresentaram capacidade de descolorir o indicador DCPIP, o que indica o potencial de

degradação dos hidrocarbonetos por esses microrganismos.

O aumento na concentração de óleo diesel de 2% para 5% e 10% provocou uma

redução no crescimento do fungo FA2, o que pode ter ocorrido devido a um possível efeito

tóxico das altas doses do óleo sobre esse microrganismo. Durante o teste de degradação que

utilizou o óleo na concentração de 1%, esse fungo promoveu a oxidação do indicador, o que

leva a crer que a capacidade de degradar os hidrocarbonetos desse fungo deve ocorrer em

condições de baixa concentração desses compostos. Podemos considerar ainda a hipótese de

degradação parcial de hidrocarbonetos com a consequente produção de metabólitos tóxicos.

Uruhahy et al. (1998), estudando a biodegradação de resíduos oleosos de petróleo, obtiveram

maior eficiência de degradação em meio de cultura líquido contendo 5% de resíduo do que em

meio onde foi empregada a concentração de 10%. Essa redução na capacidade de degradar os

resíduos oleosos ocorreu possivelmente devido à inibição dos microrganismos pela toxicidade

22

desses compostos.

A técnica do indicador DCPIP foi eficiente para a seleção de microrganismos que

apresentam capacidade de degradar óleo diesel. O tempo necessário para a mudança de cor do

meio depende da habilidade dos microrganismos utilizados em atuar nesse processo (Hanson

et al., 1993). Assim, dois fungos isolados nesse trabalho promoveram a oxidação do indicador

após 96 horas em contato com o óleo adicionado ao meio mineral, enquanto outros dois

fungos promoveram a descoloração do meio após sete dias do início do experimento. Al-

Nasrawi (2012) realizou ensaios de degradação de óleo cru utilizando o mesmo método e

observou que quatro de dezesseis cepas fúngicas isoladas a partir de amostras de areia

contaminada em uma praia no Golfo do México foram capazes de biodegradar o derivado de

petróleo testado. A mesma técnica foi utilizada por Ferrari et al. (2011) para selecionar

microrganismos com capacidade de degradação de hidrocarbonetos. Os resultados mostraram

que dos doze fungos capazes de crescer em meio líquido, nove fungos apresentaram atividade

de degradação comprovada pela mudança na coloração do meio de cultura durante três

semanas de teste.

7. CONCLUSÕES

A técnica empregada para a obtenção de diferentes morfotipos de fungos a partir do

solo contaminado da EACF se mostrou eficiente, sendo possível o isolamento de doze

morfotipos de fungos provenientes dos diferentes meios de cultura e das diferentes

concentrações de nutrientes utilizadas.

A adição de óleo diesel ao meio de cultivo não ocasionou a inibição no crescimento da

maioria dos fungos isolados testados. A tolerância e as variações de crescimento na presença

do óleo foram dependentes dos fungos isolados e da concentração desse poluente no meio de

cultura.

Cinco fungos apresentaram capacidade de oxidar o indicador DCPIP, enquanto que

outros cinco fungos não apresentaram esta capacidade.

Trabalhos subsequentes para otimizar a capacidade de degradação desses isolados,

através da variação das condições que afetam a taxa de biodegradação desses microrganismos

em solos da Antártica devem ser realizados a fim de selecionar microrganismos com maior

potencial para serem aplicados em processos futuros de biorremediação.

23

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADEKUNLE, A. A.; ADEBAMBO, O. A. Petroleum Hydrocarbon Utilization by Fungi Isolated From Detarium Senegalense (J. F Gmelin) Seeds. Journal of American Science, 3: 69-76, 2007. AELION, C. M.; BRADLEY, P. M. Aerobic biodegradation potential of subsurface microorganisms from a jet fuel-contaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology, 57: 57-63, 1991. AISLABIE, J. M.; MC LEOD, M.; FRASER, R. Potencial for biodegradation of hydrocarbons in soil from the Ross Dependency, Antarctica. Applied Microbiology Biotechnology, 49: 210-214, 1998. AISLABIE, J. M.; FRASER, R.; DUNCAN, S.; FARRELL, R. L. Effects of oil spills on microbial heterotrophs in Antarctic soils. Polar Biology, 24: 308-313, 2001. AISLABIE, J. M.; BALKS, M. R.; FOGHT, J. M.; WATERHOUSE, E. J. Hydrocarbon spills on Antarctic soils: effects and management. Environmental Science & Technology, 38: 1265-1274, 2004. ALEXANDER, M. Biodegradation and Bioremediation. Academic Press, San Diego, 1994. ALEXANDER, M. Biodegradation and bioremediation, second ed. Academic Press, San Diego, 1999. AL-NASRAWI, H. A. Biodegradation of Crude Oil by Fungi Isolated from Gulf of Mexico. Journal of Bioremediation and Biodegradation, 03:147, 2012. ANTARCTIC TREATY CONSULTATIVE PARTIES. Protocol on Environmental Protection to the Antarctic Treaty. CM 1960. Her Majesty’s Stationery Office, London, 1991. APRIL, T. M.; FOGHT, J. M.; CURRAH, R. S. Hydrocarbon degrading filamentous fungi isolated from flare pit soil in northern and western Canada. Canadian Journal of Microbiology, 46: 38-49, 2000. ATAGANA, H. I.; HAYNES, R. J.; WALLIS, F.M. Fungal bioremediation of creosote-contaminated soil: a laboratory scale bioremediation study using indigenous soil fungi. Water, Air and Soil Pollution, 172: 201-219, 2006. ATLAS, R. M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microbiological Reviews, 45: 180-209, 1981. ATLAS, R. M. Fate of petroleum pollutants in Arctic ecosystems. Water Science & Technology, 18: 59-67, 1986. ATLAS, R. M. Bioremediation of petroleum pollutants. International Biodeterioration and Biodegradation, 35: 317-327, 1995.

24

ATLAS, R. M. Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation. Marine Pollution. Bulletin, 31: 178-182, 1995. BALACHANDRAN, C.; DURAIPANDIYAN, V.; BALAKRISHNA, K.; IGNACIMUTHU, S. Petroleum and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degradation and naphthalene metabolism in Streptomyces sp. (ERI-CPDA-1) isolated from oil contaminated soil. Bioresource Technology, 112: 83-90, 2012. BARTHA, R.; ATLAS, R. M. R. Transport and Transformations of Petroleum. Biological Processes. In: D. BOESCH; N. RABALAIS, Editors, Long-term Effects of 64 Petroleum on the Marine Environment, Elsevier Applied Science, London, 287-341, 1987. BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O.; OKEKE, B. Bioremediation of soil contaminated by diesel oil. Brazilian Journal of Microbiology, 34: 65-68, 2003. BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O.; OKEKE. B. C.; FRANKENBERGER, W. T. Comparative bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation. Bioresource Technology, 96: 1049-1055, 2005. CERNIGLIA, C. E. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. Advances in Applied Microbiology, 30: 31-7, 1984. CERNIGLIA, C. E.; WHITE, G. L; HETTICH, R. H. Fungal metabolism and detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons. Archives of Microbiology, 143: 105-110, 1985. CERNIGLIA, C. E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Current Opinion in Biotechnology, 4: 331-338, 1993. CERNIGLIA, C. E. Fungal metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: past, present and future applications in bioremediation. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 19: 324-333, 1997. COATES, J. D.; ANDERSON, R. T.; WOODWARD, J. C.; PHILLIPS, E. J. P.; LOVLEY, D. R. Anaerobic hydrocarbon degradation in petroleum contaminated harbor sediments under sulfate-reducing and artificially imposed iron-reducing conditions. Environmental Science Technology, 30: 2784-2789, 1996. CRIPPS, C. G.; PRIDDLE, J. Hydrocarbons in the Antarctic environment. Antarctic Science, 3: 233-250, 1991. CRIPPS, C. G.; SHEARS, J. The fate in the marine environment of a minor diesel fuel spill from an Antarctic Research Station. Environmental Monitoring Assessment, 46: 221-242, 1997. DAS, N.; CHANDRAN, P. Microbial degradation of petroleum hydrocarbon contaminants: an overview. Biotechnology Research International, doi:10.4061/2011/941810, 2010. DAVIS, J. S.; WESTLAKE, D. W. S. Crude oil utilization by fungi. Canadian Journal of Microbiology, 25: 146-156, 1978.

25

EPA: ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, UNITED STATES. How to Evaluate Alternative Cleanup Technologies for Underground Storage Tank Sites: A Guide for Corrective Action Plan Reviewers. Chapter XII – Enhanced Aerobic Bioremediation, EPA 510-B-94-003; EPA 510-B-95-007 and EPA 510-R-04-002, 73p, 2004. FERRARI, B. C.; CHENGDONG, Z.; VAN DORST, J. Recovering greater fungal diversity from pristine and diesel fuel contaminated sub-Antarctic soil through cultivation using both a high and a low nutrient media approach. Frontiers in Microbiology, 217:1-14, 2011. GADD, G. M. Geomycology: biogeochemical transformations of rocks, minerals, metals radionuclides by fungi, bioweathering and bioremediation. Mycological Research, 111: 3-49, 2007. GAN, S.; LAU, E. V.; NG, H. K. Remediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Journal of Hazardous Materials, 172: 532-549, 2009. HAMMEL, K. E. Mechanism for polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by ligninolytic fungi. Environmental Health Perspectives, 103: 41-43, 1995. HANSON, K. G.; DESAI, J. D.; DESAI, A .J. A rapid and simple screening technique for potential crude oil degrading microorganisms. Biotechnology Techniques. 7: 745-748, 1993. HUGNES K. A.; BRIDGE P.; CLARK M. S. Tolerance of Antarctic soil fungi to hydrocarbons. Science of the Total Environment, 372: 539-548, 2006. HUGHES, K. A.; BRIDGE, P. Tolerance of Antarctic soil fungi to hydrocarbons and their potential role in soil bioremediation in Microbiology: The Ecology Biodiversity and Bioremediation Potential of Microorganisms in Extremely Cold Environments, eds A. K. Bej, J. Aislabie, and R.M.Atlas (BocaRaton, FL: Taylor and Francis), 277–300, 2010. JACQUES, R. J. S.; BENTO, F. M.; ANTONIOLLI, Z. I.; CAMARGO, F. A. O. Biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Ciência Rural, Santa Maria, 37: 1192-1201, 2007. KATAOKA, A. P. A. G. Biodegradação de resíduo oleoso de refinaria de petróleo por microrganismos isolados de “landfarming”. Tese. Instituto de Biociências, Unesp Rio Claro, 2001. KORDA, A.; SANTAS, P.; TENENTE, A.; SANTAS, R. Petroleum hydrocarbon bioremediation: sampling and analytical techniques, in situ treatments and commercial microorganisms currently used. Applied Microbiology and Biotechnology, 48: 677-686, 1997. LEAHY, J. G.; COLWELL, R. R. Microbial degradation of Hydrocarbons in the environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 54: 305-315, 1990. LEONOWICZ, A.; MATUSZEWSKA, M.; LUTEREK, J.; ZIEGENHAGEN, D.; WOJTAS-WASILEWSKA, M.; CHO, N. S.; HOFRICHTER, M.; ROGALSKI, J. Biodegradation of Lignin by White Rot Fungi. Fungal Genomics and Biology, 27: 173-183, 1999.

26

MALAVIYA, P.; RATHORE, V. S. Bioremediation of pulp and paper mill effluent by a novel fungal consortium isolated from polluted soil. Bioresource Technology, 98: 3647 -3651, 2007. MAZZERA, D.; HAYES, T.; LOWENTHAL, D.; ZIELINSKA, B. Quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil at McMurdo station Antarctica. Science of the Total Environment, 229: 65-71, 1999. OLIVEIRA, S. D.; LEMOS, J. L. S.; BARROS, C. A.; LEITE, S. G. F. Emprego de fungos filamentosos na biorremediação de solos contaminados por petróleo: Estado da arte. Rio de Janeiro: CETEM/MCT. 67p, 2008. PLANCKAERT, M. Oil Reservois and Oil Production. In: Petroleum Microbiology. B. Ollivier & M. Magot (ed.) 1st ed., Washington, ASM Press, 1-20, 2005. OUDOT, J.; DUPONT, J.; HALOUI, S.; ROQUEBERT, M. F. Biodegradation potential of hydrocarbon-assimilating tropical fungi. Soil Biology Biochemistry, 25: 1167-1173, 1993. RIVERA-CRUZ, M. C.; FERRERA-CERRATO, R.; HALLER, V. V.; VAZQUEZ, R. R.; LINARES, L. F. Adaptación y selección de microorganismos autóctonos en medios de cultivo enriquecidos con petróleo crudo. Terra, 20: 423-434, 2002. RUBERTO, L. A. M., VAZQUEZ, S. C., CORMACK, W. P. M. Bacteriology of Extremely Cold Soils Exposed to Hydrocarbon Pollution. Soil Biology, 13: 247-274, 2008. SANSCARTIER, D.; ZEEB, B.; KOCH, I.; REIMER K. Bioremediation of diesel-contaminated soil by heated and humidified biopile system in cold climates. Cold Regions Science and Technology, 55: 167-173, 2009. SARKAR, D.; FERGUSON, M.; DATTA, R.; BIRNBAUM, S. Bioremediation of petroleum hydrocarbons in contaminated soils: comparison of biosolids addition, carbon supplementation, and monitored natural attenuation. Environmental Pollution, 136: 187-195, 2005. SINGLETON, I. Fungal remediation of soils contaminated with persistent organic pollutants. In G.M. Gadd (ed.). Fungi in bioremediation, 23: 79-96, 2001. THIELE, S.; BRÜMER, G. W. Bioformation of polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Soil Under oxygen Deficient Conditions. Soil Biology and Biochemistry, 34: 733-735, 2002. TIMMIS, K. N.; PIEPER, D. H. Bacteria designed for Bioremediation. Trends in Biotechnology, 17: 201-204, 1998. URURAHY, A. F. P. Biodegradação de Resíduo Oleoso Proveniente de Refinaria de Petróleo. Tese. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 344p, 1998. WALKER, J. D.; COLWELL, R. R.; VAITUZIS, Z.; MEYER, S. A. Petroleum degrading achlorophyllous alga Prototbeca zopfi. Nature, 254: 423-434, 1975.

27

WILSON, S. C.; JONES, K. C. Bioremediation of soil contaminated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs): a review. Environmental Pollution, 81:229-249, 1993. VIDALI, M. Bioremediation. An overview. Pure and Applied Chemistry, 73: 1163-1172, 2001. YERGEAU, E.; ARBOUR, M., BROUSSEAU, R.; JUCK, D.; LAWRENCE, J.R.; MASSON, L.; WHYTE, L.G.; GREER, C. W. Microarray and real-time PCR analyses of the responses of high Arctic soil bacteria to hydrocarbon pollution and bioremediation treatments. Applied Environmental Microbiology, 19: 6258-6267, 2009.

28

ANEXOS

Figura 1: Morfotipos de fungos isolados do solo da Antártica contaminado com óleo diesel.

29

Figura 2: Crescimento do fungo FA2 em meio com óleo diesel nas concentrações de 0% (A), 2% (B), 5% (C) e 10% (D).


30



31

Figura 6: Teste de degradação de hidrocarbonetos. À esquerda: fungo inoculado em meio BH contendo óleo diesel 1%, no centro: controle abiótico (sem inoculo), à direita controle biótico (sem o óleo).

32

Figura 6 (continuação)

GISELE DE FÁTIMA DIAS DINIZ ISOLAMENTO DE FUNGOS … · O fungo FA8 descoloriu parcialmente o meio...

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